AFKORTINGEN 3’UTR
3’ onvertaalde regio
3C
chromosome conformation capture
5’UTR
5’ onvertaalde regio
AMD
ouderdomsgebonden maculaire degeneratie
Anti-VEGF
anti-vascular endothelial growth factor
AON
antisense oligonucleotide
ASC
apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
ASIP
agouti signaling protein
BAC
Bacterieel artificieel chromosoom
BPES
blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndroom
BRE
B-recognition element
CC
coilled coil
CEP290
centrosomal protein 290kDa
ChIP
chromatin immunoprecipitation
CMGG
Centrum voor Medische Genetica Gent
CNE
conserved non-coding element
CNV
copynumber variaties
COL4A3
collagen, type IV, alpha 3
COL4A4
collagen, type IV, alpha 4
CYP1B1
cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1
CZS
centraal zenuwstelsel
dbSNP
single nucleotide polymorphism database
DCDC1
doublecortin domain containing 1
DCDC5
doublecortin domain containing 5
DCE
downstream core element
DCT
dopachrome tautomerase
DNA
desoxyribonucleïnezuur
DNase
deoxyribonuclease
DPH4
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 24
DRR
downstream regulatory region
dsRNA
dubbelstrengig RNA
ECF1
evolutionair geconserveerd fragment 1
EE
ectodermal enhancer
ELP4
elongation protein 4 homolog (S. cerevisiae)
ENCODE
Encyclopedia of DNA Elements
ey
eyeless
FAIRE
formaldehyde-assisted identification of regulatory elements
FLG
filaggrin
FOX
forkhead box
FOXC1
forkhead box C1
FOXL2
forkhead box L2
GA
geografische atrofie
GUCY2D
guanylate cyclase 2D
GWAS
genome wide association studie
HD
homeobox domain
hECF1
humaan evolutionair geconserveerd fragment 1
HEMn
humane epidermale melanocyten van neonatale oorsprong
HEMn-DP
humane
epidermale
melanocyten
van
neonatale
oorsprong,
donker
gepigenteerd HEMn-LP
humane
epidermale
melanocyten
van
neonatale
oorsprong,
gepigmenteerd HERC2
HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2
HGP
Humaan Genoom Project
HLTF
helicase-like transcription factor
HPS1
Hermansky-Pudlak syndrome 1
HPS6
Hermansky-Pudlak syndrome 6
IL-18
interleukine-18
IL-1β
interleukine-1 beta
IMMP1L
IMP1 inner mitochondrial membrane peptidase-like (S. cerevisiae)
INPPL1
inositol polyphosphate-5 phosphatase-like 1
IRES
internal ribosome entry sites
IRX3
iroquois homeobox 3
ITGB4
integrin beta 4
LCA
Leber congenital amaurosis
LEF1
lymphoid enhancer-binding factor 1
LINE
long interspersed elements
LTR
long terminal repeat
licht
MATP
Membrane Associated Transporter Protein
MC1R
melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte stimulating hormone receptor)
MIM
Mendelian Inheritance in Man
miRISC
miRNA-induced silencing complex
miRNA
microRNA
miRNA*
microRNA Passenger strand
MITF
microphthalmia-associated transcription factor
MLPA
multiplex ligatie-depente probe amplificatie
MPPED2
metallophosphoesterase domain containing 2
mRNA
messenger RNA
MRPS22
mitochondrial ribosomal protein S22
MTE
motif ten element
MYD88
myeloid differentiation factor 88
MYO5A
myosin VA (heavy chain 12, myoxin)
NAHR
niet-allelische homologe recombinaties
NLRP3
NLR family, pyrin domain containing 3
OA1
osteoarthritis QTL 1
OCA2
oculocutaneous albinism II
OMIM
Online Mendelian Inheritance in Man
PAX6
paired box gene 6
PD
paired box domain
PFOXic
promotor FOXL2 inverse complementary
PIC
pre-initiatie-complex
PIS
polled intersex syndrome
PISRT1
polled intersex syndrome regulated transcript 1
PITX2
paired-like homeodomain transcription factor 2
PITX3
paired-like homeodomain transcription factor 3
POF
prematuur ovarieel falen
polyAla
polyalanine tract
POMC
proopiomelanocortin
PST
proline-serine-threonine
RAB27A
RAB27A, member RAS oncogene family
RNA
ribonucleïnezuur
RNAi
RNA-interferentie
RNAPII
RNA polymerase II
ROS
reactive oxygen species
RPE
retinaal gepigmenteerd epitheel
RT-PCR
reverse transcript polymerase chain reaction
SCC
squamous cell carcinoma
sey
small eye
SHIP2
SH2-domain containing phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 5phosphatase 2
SILV
silver locus protein homolog
siRNA
small interfering-RNA
SNP
single nucleotide polymorphism
SOD1
superoxide dismutase 1, soluble
SRO
shortest region of deletion overlap
TE
transposable element
TF
transcriptiefactor
TFIID
transcriptie factor II D
TGFB1
transforming growth factor, beta 1
TYR
tyrosinase
TYRP1
tyrosinase-related protein 1
UTR
untranslated region
VEGF
vascular endothelial growth factor
VSX1
visual system homeobox 1
wt
wild-type
XCPE1
X-core promotor element 1
Y589
YAC589
Y593
YAC593
YAC
yeast artificial chromosome
ZEB1
zinc finger E-box binding homeobox 1
INHOUDSTAFEL Abstract ..............................................................................................................................................1 Inleiding..............................................................................................................................................3 Doelstelling en overzicht van de studie ...............................................................................................5 Methodologie .....................................................................................................................................7 HOOFDSTUK 1: OVERZICHT VAN NIET-CODEREND DNA .......................................................................8 1. Niet-coderend RNA .........................................................................................................................9 1.1 MicroRNA................................................................................................................................ 10 1.1.1 De miRNA-biogenese ........................................................................................................ 10 1.1.2 De verstoring van microRNA ............................................................................................. 10 1.2 Small interfering RNA (siRNA) .................................................................................................. 11 2. Cis-regulatorische elementen ........................................................................................................ 11 2.1 Promotor ................................................................................................................................ 11 2.1.1 Alternatieve splicing ......................................................................................................... 11 2.2 Enhancer ................................................................................................................................. 12 2.3 Silencer ................................................................................................................................... 12 2.4 Insulator.................................................................................................................................. 12 2.5 Cis-ruptie ................................................................................................................................ 12 3. De 5’ untranslated regio (5’UTR) ................................................................................................... 14 3.1 Verstoring van de 5’UTR .......................................................................................................... 14 4. Intronen ........................................................................................................................................ 14 4.1 Verstoring van intronen........................................................................................................... 15 5. De 3’ untranslated regio (3’UTR) ................................................................................................... 15 5.1 Verstoring van de 3’UTR .......................................................................................................... 15 6. Transposable elements (TE’s) ........................................................................................................ 15 6.1 Retrotransposons .................................................................................................................... 16 6.1.1 Long interspersed elements (LINE) .................................................................................... 16 6.1.2 Alu-sequenties.................................................................................................................. 16 6.2 Transposons als verstorende elementen ................................................................................. 16 HOOFDSTUK 2: ANIRIDIE ................................................................................................................... 18 1. Het fenotype aniridie .................................................................................................................... 18 2. PAX6 als enige gen verantwoordelijk voor aniridie ........................................................................ 19
2.1 Een breed klinisch spectrum ten gevolge van PAX6-mutaties................................................... 19 3. Dierenmodellen voor aniridie ........................................................................................................ 19 4. PAX6-mutaties .............................................................................................................................. 20 4.1 PAX6 als transcriptiefactor ...................................................................................................... 20 4.2 Karakterisatie en functionele studie van het regulatorisch domein van PAX6 .......................... 20 4.2.1 Algemene structuur van gen en eiwit................................................................................ 20 4.2.2 Vier promotors ................................................................................................................. 21 4.2.3 Cis-regulatoren ................................................................................................................. 22 4.3 Het arsenaal aan oorzakelijke mutaties ................................................................................... 23 4.3.1 Niet-coderende mutaties .................................................................................................. 23 4.4 Cis-ruptie als oorzaak van aniridie ........................................................................................... 24 4.4.1 Reciproke translocaties..................................................................................................... 24 4.4.2 Regulatorische deleties..................................................................................................... 25 4.4.3 Een sequentievariant in de SIMO enhancer....................................................................... 26 4.5 Mutaties binnen intronen als oorzaak van aniridie .................................................................. 27 4.6 MicroRNA................................................................................................................................ 27 5. Discussie ....................................................................................................................................... 28 HOOFDSTUK 3: BLEPHAROPHIMOSIS-PTOSIS-EPICANTHUS INVERSUS SYNDROOM ........................... 29 1. Het fenotype BPES ........................................................................................................................ 29 2. FOXL2 als enige gen verantwoordelijk voor BPES ........................................................................... 30 3. Dierenmodellen met een BPES-analoog ........................................................................................ 30 4. Mutaties in FOXL2 ......................................................................................................................... 31 4.1 Gebalanceerde translaties (1999) ............................................................................................ 31 4.2 Vijf microdeleties (2005) ......................................................................................................... 32 4.3 Afbakening van SRO tot 7,4 kb (2009) ...................................................................................... 32 5. Discussie ....................................................................................................................................... 33 HOOFDSTUK 4 : OUDERDOMSGEBONDEN MACULAIRE DEGENERATIE .............................................. 34 1. Het fenotype AMD ........................................................................................................................ 34 2. De pathogenese van AMD ............................................................................................................. 35 2.1 Het belang van het retinal pigmented epithelium .................................................................... 35 2.2 Drusenafzettingen als eerste teken van AMD .......................................................................... 35 2.3 Het verloop van AMD .............................................................................................................. 35 3. De multifactoriële etiologie omvat transposable elements ............................................................ 36 3.1 Alu-retrotransposons .............................................................................................................. 36 3.2 Oxidatieve stress ..................................................................................................................... 37
3.3 Het immuunsysteem ............................................................................................................... 37 4. Overzicht AMD pathogenese ......................................................................................................... 38 5. Discussie ....................................................................................................................................... 40 HOOFDSTUK 5: LEBER CONGENITAL AMAUROSIS .............................................................................. 41 1.
Het fenotype LCA ...................................................................................................................... 41
2. CEP290 als belangrijkste gen ......................................................................................................... 42 2.1 Functie .................................................................................................................................... 42 2.2 Fenotypes geassocieerd met CEP290-mutaties ........................................................................ 42 2.3 Frequentste mutatie is diep intronisch .................................................................................... 43 3. Therapeutische perspectieven ...................................................................................................... 45 4. Discussie ....................................................................................................................................... 46 HOOFDSTUK 6: KERATOCONUS ......................................................................................................... 47 1. Het fenotype keratoconus ............................................................................................................. 47 2. Oorzakelijke factoren .................................................................................................................... 47 2.1 MicroRNA................................................................................................................................ 48 2.1.1 Ontdekking van de associatie............................................................................................ 48 2.1.2 De werking van miR-184 ................................................................................................... 48 2.1.3 Mutaties in miR-184 als oorzaak van keratoconus ............................................................ 51 3.
Discussie ................................................................................................................................... 54
HOOFDSTUK 7: BLAUWE OGEN ......................................................................................................... 55 1. De oogkleur als fenotypisch kenmerk ............................................................................................ 55 2. OCA2 als voornaamste gen voor de oogkleur ................................................................................ 56 2.1 Mutaties binnen intronen van OCA2........................................................................................ 56 2.2 Mutaties binnen het naburige gen HERC2 ............................................................................... 57 2.2.1 Mechanisme achter allel-specifieke enhancer ................................................................... 57 3. Een praktische toepassing ............................................................................................................. 58 4.
Discussie ................................................................................................................................... 59
Conclusie .......................................................................................................................................... 60 Bibliografie ....................................................................................................................................... 62 Bijlagen............................................................................................................................................. 73
ABSTRACT Probleemstelling Niet-coderende
regio’s
in
het
genoom
zijn
cruciaal
voor
de
controle
over
genexpressiepatronen en bij uitbreiding voor celdifferentiatie en embryonale ontwikkeling. In plaats van enkel uit evolutionair afval te bestaan – zoals vroeger gedacht werd en hetgeen aanleiding gaf tot de term “ junk DNA” – omvat het niet-coderend DNA tal van diverse regulatorische elementen. Verstoring van deze elementen kan aanleiding geven tot erfelijke aandoeningen en fenotypische kenmerken. Niet-coderende DNA-elementen vormen een onderzoeksgebied dat volop in ontwikkeling is. De toevloed aan nieuwe ontdekkingen en hypotheses is enorm en de nood aan een globaal overzicht dringt zich op.
Doelstelling en methode De algemene doelstelling van deze masterproef is om aan de hand van een literatuuronderzoek na te gaan op welke manier niet-coderend DNA een rol kan spelen in erfelijke aandoeningen en fenotypische kenmerken bij de mens. De specifieke doelstelling is om deze onderzoeksvraag te beantwoorden met het oog als model. Hierbij wordt ernaar gestreefd om aan de hand van een selectie van paradigma-genloci een voldoende ruim overzicht te geven waarin de belangrijkste mechanismen aan bod komen.
Resultaten De werking van cis-regulatorische elementen en cis-ruptie-mechanismen wordt bestudeerd aan de hand van ontwikkelingsgenen PAX6 en FOXL2 en van de congenitale aandoeningen waartoe hun verstoring respectievelijk aanleiding geeft: aniridie en het blepharophimosisptosis-epicanthus inversus syndroom. De invloed van cis-elementen wordt ook geïllustreerd voor het fenotypische kenmerk oogkleur waarbij in de Kaukasische populatie een sequentievariant als een allel-specifieke enhancer fungeert voor OCA2. De regulatie door microRNA wordt besproken naar aanleiding van de associatie tussen miR-184 en keratoconus. Aberrante splicing in het niet-coderend DNA rond CEP-290 wordt beschreven in het kader van Leber congenital amaurosis. Transposable elements kunnen via verscheidene wegen tot verstoringen leiden. In het kader van de multifactoriële aandoening age related
1
macular degneration werd een accumulatie van Alu-sequenties als één van de oorzakelijke factoren geïdentificeerd.
Besluit Kennis en inzicht over de regulatorische elementen in het niet-coderend DNA zijn nodig om genregulatie te begrijpen, zowel in gezonde als in pathologische omstandigheden. Dit vormt een grote uitdaging voor de toekomst. Bemoedigend is dat de inspanningen reeds beloond worden met enkele praktische toepassingen en therapeutische perspectieven.
2
INLEIDING Het menselijk lichaam bevat ongeveer 200 verschillende celtypes. Deze bevatten allemaal – op enkele uitzonderingen na (zoals de geslachtscellen) – hetzelfde constitutioneel DNA. Toen de resultaten van het Humaan Genoom Project (HGP) gepubliceerd werden in 2001 was de verbazing groot dat men ongeveer 22.000 genen gevonden had. De complexiteit van het menselijk organisme had immers doen vermoeden dat het er veel meer zouden zijn. Sommige voorspellingen rekenden op 100.000 genen. Toen later de genomen van andere species in kaart werden gebracht, bleek dat het aantal proteïne-coderende genen relatief constant is, ondanks grote verschillen in de grootte van deze genomen. Dit werd de complexiteitsparadox genoemd: er kon geen correlatie gevonden worden tussen de complexiteit van organismen en het aantal genen dat hun genomen bevat (1)(2).
Eiwitcoderende genen hebben zeer lang centraal gestaan in de genetica, maar in relatieve cijfers bleken ze niet meer dan 1,5% van het humane genoom uit te maken. Het nietcoderende gedeelte werd “junk DNA” genoemd: het leek immers vooral uit transposable elements te bestaan en geen enkele rol te vervullen. Er waren echter aanwijzingen dat er functionele eenheden verscholen zaten in het niet-coderende deel van het genoom. Zo was uit een vergelijkende sequentie-analyse tussen mens- en muisgenoom gebleken dat niet enkel genen, maar ook stukken niet-coderend DNA evolutionair geconserveerd waren: zogenaamde conserved non-coding elements (CNEs). Dat bepaalde sequenties 75 miljoen jaar ongewijzigd bleven, deed vermoeden dat ze een functie hadden. Verdere evidentie werd geleverd door studies naar genetische risicofactoren voor complexe aandoeningen. Uit grootschalige genome wide association studies (GWAS) voor complexe aandoeningen bleek dat 40% van de susceptibiliteitsloci buiten de genen gelegen was (3)(4).
Het identificeren van genen naar aanleiding van het HGP bleek achteraf bekeken slechts een eerste stap. Het Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) project werd in het leven geroepen, met als doel een overzicht te krijgen van de functionele elementen in ons genoom en hun functie te doorgronden. In 2007 werd een belangrijk pilootproject afgerond. Hoewel nog maar 1% van kandidaat functionele elementen geanalyseerd werden, konden al een aantal conclusies getrokken worden. Een van de meest belangwekkende is dat 80% van het genoom overgeschreven wordt tot minstens een primair RNA-transcript. Verder werd activiteit ontdekt 3
in regio’s die men vroeger als silent beschouwde. Overigens bleek dat voor 40% van de evolutionair geconserveerde sequenties nog geen enkele indicatie gevonden was die op functionaliteit wees (5)(6).
Wat het duidelijkst naar voor kwam uit het ENCODE-pilootproject was de complexiteit van het humane genoom. Om terug te komen op de complexiteitsparadox: niet het aantal genen, maar wel de relatieve hoeveelheid niet-coderend DNA blijkt te correleren met de complexiteit van hogere diersoorten. In plaats van enkel uit evolutionair ‘afval’ te bestaan, vervullen bepaalde delen van het niet-coderend DNA fundamentele functies binnen ons genoom. Ze dirigeren gen-netwerken opdat expressie correct kan plaatsvinden in tijd en ruimte. De nood aan minutieuze regulatie is het hoogst in ontwikkelingsgenen. Zij sturen immers de differentiatie van een brede waaier aan menselijk celtypes tijdens de embryonale ontwikkeling. Voor deze strikte controle maken ze gebruik van een veelheid aan regulatorische elementen. Wanneer deze regulatorische elementen verstoord worden, kunnen ze – net als intragenische mutaties – aanleiding geven tot ontwikkelingsstoornissen (5)(7).
4
DOELSTELLING EN OVERZICHT VAN DE STUDIE De algemene doelstelling van deze masterproef is aan de hand van een literatuuronderzoek na te gaan op welke manier niet-coderend DNA een rol kan spelen in erfelijke aandoeningen en fenotypische kenmerken bij de mens. De specifieke doelstelling is om deze onderzoeksvraag te beantwoorden met het oog als als model. Hierbij wordt ernaar gestreefd om een voldoende ruim overzicht te geven, waarin de belangrijkste mechanismen aan bod komen.
Hoofdstuk 1 : Alvorens in te gaan op processen waarbij niet-coderend DNA een rol speelt, zal een overzicht gegeven worden van de belangrijkste groepen niet-coderend DNA. Hoofdstuk 2 : PAX6 codeert voor één van de voornaamste transcriptiefactoren van het oog en wordt bovendien beschouwd als een paradigma voor genregulatie door cis-elementen. De expressie staat onder invloed van verschillende weefselspecifieke promotors en enhancers en wanneer deze verstoord worden (cis-ruptie) kunnen ze tot aniridie leiden, hetzelfde fenotype als in het geval van intragenische mutaties of deleties. Dit kan gebeuren via verscheidene cisruptie-mechanismen en aberrante splicing. Dit maakt PAX6 tot een zeer handig model-gen in het kader van deze masterproef. Hoofdstuk 2 is dan ook dieper uitgewerkt dan de overige hoofdstukken, met bijzondere aandacht voor de karakterisatie van het regulatorisch domein en de diverse geïdentificeerde cis-ruptie-mechanismen. Hoofdstuk 3 : Het blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndroom is het gevolg van een afwijkende FOXL2 expressie, waarbij intragenische mutaties en deleties hetzelfde fenotype tot gevolg hebben als cis-ruptie-mechanismen. Hoofdstuk 4 : Age related macular degeneration is een multi-factoriële aandoening die recent in verband werd gebracht met de accumulatie van Alu-transcripten. Een reductie van het Dicer-enzyme zou verantwoordelijk zijn voor de accumulatie van deze cytotoxische sequenties. Hoofdstuk 5 : Afwijkingen in het CEP290-gen en zijn regulatorisch landschap worden gekenmerkt door pleiotropie. Het oculaire fenotype is Leber congenital amaurosis (LCA) en wordt in de Europese bevolking frequent veroorzaakt door aberrante splicing binnen een intron van CEP290. De studie van deze gevallen is met name belangrijk omdat de kennis die eruit verworven wordt, ingezet wordt in de zoektocht naar een therapie voor LCA. 5
Hoofdstuk 6 : Mutaties in microRNA geven ondermeer aanleiding tot keratoconus. Wijzigingen in de bindingsplaats van miR-184 interfereren met de competitieve inhibitie om doelwitgenen. Hoofdstuk 7 : Tot slot wordt het fenotypische kenmerk oogkleur besproken. Een nietcoderende sequentievariant (SNP) gedraagt zich als allel-specifieke enhancer voor het OCA2 gen in melanocyten. Dit SNP laat toe de oogkleur van personen te voorspellen en vond een praktische toepassing in de forensische geneeskunde.
Om de lezer een overzicht te bieden, is aan het begin van elk hoofdstuk een overzichtstabel te vinden. In deze tabel zullen onder meer het fenotype, de verantwoordelijke genen en de onderliggende moleculaire mechanismen vermeld staan.
6
METHODOLOGIE De eerste stap in dit literatuuronderzoek bestond eruit een globaal beeld te bekomen van het te onderzoeken veld. Dit gebeurde aan de hand van lesmateriaal van professor De Baere en editorials over “junk-DNA”, het HGP en het ENCODE-project. Na een eerste kennismaking kon overgestapt worden op reviews over niet-coderend DNA en vervolgens over de link met humane aandoeningen en kenmerken. Volgende reviews werden aangereikt door professor De Baere en werden doorheen het verdere proces als leidraad gebruikt: -
Kleinjan D-J, Coutinho P. Cis-ruption mechanisms: disruption of cis-regulatory control as a cause of human genetic disease.BRIEFINGS FUNCTIONAL GENOMICS PROTEOMICS 2009; 8(4):317–32.
-
Klopocki E, Mundlos S. Copy-number variations, noncoding sequences, and human phenotypes. ANNUAL REVIEW OF GENOMICS AND HUMAN GENETICS 2011; 12:53–72.
PAX6 is een gen dat steeds naar voor komt als paradigma en het wordt gekozen om verder uit te diepen. Vervolgens werd in samenspraak met mijn promotor besloten het oog te kiezen als modelorgaan. Het onderzoek naar aandoeningen ten gevolge van verstoord niet-coderend DNA staat immers al relatief ver voor dit orgaan. Bovendien is PAX6 een belangrijke speler binnen de ontwikkeling van het oog. Als bijkomend voordeel is de onderzoeksgroep van mijn promotor gespecialiseerd in oogaandoeningen. In overleg met professor De Baere worden nog vijf andere genen en/of fenotypes geselecteerd met een functie binnen het oog die toelaten een verscheidenheid van topics te behandelen: FOXL, CEP290, age-related maculaire degeneratie, keratoconus en blauwe ogen. De ‘Pubmed’ en ‘Web of Science’ databanken werden doorzocht aan de hand van volgende zoektermen: [naam gen/fenotype] AND noncoding OR cis-ruption OR position effect. Er werd getracht recente reviews te bekomen en aan de hand van hun referentielijst verder te zoeken naar relevante artikels. De gevonden artikels werden geïnventariseerd in Mendeley. Voor aanvullende informatie omtrent genen of aandoeningen werden volgende websites geraadpleegd: -
Genetics home reference (http://ghr.nlm.nih.gov/) van de U.S. National Library of Medicine;
-
The National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) van de U.S. National Library of Medicine.
7
HOOFDSTUK 1: OVERZICHT VAN NIET-CODEREND DNA Om in de volgende zes hoofdstukken in te kunnen gaan op verstoringen van “junk DNA”, zal in dit eerste, overkoepelende hoofdstuk een overzicht gegeven worden van de verschillende soorten niet-coderend DNA. De volgende topics zullen in dit hoofdstuk als volgt behandeld worden en komen ook terug in Figuur 1: 1. niet-coderend RNA; 2. cis-regulatorische elementen; 3. 5’ untranslated regio (5’UTR); 4. intronen; 5. 3’ untranslated regio (3’UTR); 6. transposable elements (TE). Er zal ook aangestipt worden op welke manieren deze regio’s het vaakst ontregeld worden. Indien het mechanisme verder in de masterproef uitgewerkt wordt, zal hier reeds naar verwezen worden.
8
Figuur 1. De regulatie van een eukaryoot gen door de untranslated regios en andere niet-coderende elementen. De centrale afbeelding stelt een typisch eukaryoot gen voor. De exonen zijn grijs, de oranje blokjes stellen intronische enhancers voor (7). A) De promotor regio bevat cis-regulatorische elementen zoals enhancers, maar ook minder gekende elementen zoals B-recognition element (BRE), motif ten element (MTE), downstream core element (DCE) en X-core promotor element 1 (XCPE1). B) Naast cis-elementen bevat de 5’UTR ook regulatorische componenten zoals de 5’ cap en IRES. Het mRNA zal secundaire structuren bevatten die eveneens invloed hebben op de translatie. C) Naast secundaire structuren bemerken we in de 3’UTR AU-rijke elementen, bindingsplaatsen voor miRNA en de polyadenylatie.
1. Niet-coderend RNA De laatste 10 jaar is gebleken hoe alomtegenwoordig en complex transcriptie van het humaan genoom werkelijk is. Ongeveer 80 % van de basenparen die ons DNA opmaken, geven aanleiding tot minstens één primair RNA-transcript. Aangezien slechts 1,5% van onze DNAsequentie codeert voor eiwitten, betekent dit dat het merendeel van ons genoom tot expressie komt onder de vorm van niet-coderend RNA (5). Niet-coderend RNA wordt opgedeeld in verschillende klassen en nog steeds worden nieuwe soorten ontdekt. De belangrijkste soorten die tot nog toe geïdentificeerd zijn, komen in deze paragraaf aan bod. De nadruk wordt gelegd op microRNA, aangezien dit momenteel één van de meest bestudeerde klassen is en er later in deze masterproef naar teruggegrepen wordt.
9
1.1 MicroRNA De term microRNA (miRNA) verwijst naar korte (19-25 nucleotiden groot), enkelstrengige RNA-sequenties, die niet voor proteïnen coderen, maar wel een belangrijke regulerende functie hebben: posttranscriptionele regulatie van genexpressielevels door de translatie van specifieke messengerRNA’s (mRNA’s) te onderdrukken, ook RNA-interferentie (RNAi) genoemd. Het miRNA draagt hiertoe bij door het miRNA-induced silencing complex (miRISC) te gidsen naar het doelwit-mRNA (8)(9). De specificiteit van deze regulatie is belangrijk en wordt bekomen door een sterk bewaarde sequentie aan het 5’ uiteinde van het miRNA: de seed regio. Deze regio beslaat 6 tot 8 nucleotiden en is perfect complementair met een sequentie in het 3’UTR van het doelwitmRNA (8)(9).
Naar schatting wordt ongeveer 60% van onze genen gereguleerd door miRNA. Eén miRNA kan honderden mRNA’s aansturen, omgekeerd kan één mRNA beïnvloed worden door meerdere miRNA’s. Ze zijn van belang voor de ontwikkeling en differentiatie, maar spelen ook een rol in cellulaire stress en kanker. MiRNA’s presenteren zich veelal specifiek in een bepaald weefsel of tijdens een specifiek differentiatiestadium (10). 1.1.1 De miRNA-biogenese
Omdat in verdere hoofdstukken teruggegrepen wordt naar de spelers uit de biogenese van miRNA, wordt dit proces eerst besproken. In de nucleus worden lange primaire transcripten afgeschreven: pri-miRNA. Het pri-miRNA wordt verwerkt en gesplitst door Drosha ribonuclease III tot kleinere precursoren (premiRNA) van ongeveer 70 nucleotiden lang. Pre-miRNA’s worden naar het cytoplasma gebracht, waar ze door Dicer ribonuclease afgewerkt worden tot de 19-55 nucleotiden lange miRNA-duplex. Slechts één streng wordt matuur miRNA en zal deel uitmaken van het miRNA-induced silencing complex
(miRISC). De antisense streng, die bekend staat als
miRNA*, wordt gedegradeerd (11).
1.1.2 De verstoring van microRNA
Mutaties in miRNA of in de target sites van hun doelwit-transcripten, maar ook verstoringen van de miRNA-biogenese kunnen resulteren in een groot aantal aandoeningen, waaronder kanker. In hoofdstuk 6 zal behandeld worden hoe een mutatie in de seed regio van miRNA tot erfelijke keratoconus en cataract kan leiden.
10
1.2 Small interfering RNA (siRNA) Small interfering RNA (siRNA) lijkt zeer sterk op miRNA en kan eveneens tot RNAi leiden. Het belangrijkste onderscheid tussen beide schuilt erin dat siRNA naar exogeen RNA verwijst, typisch door virussen binnengebracht in de cel, terwijl miRNA endogeen is (12).
2. Cis-regulatorische elementen Een cis-element is een DNA-regio die de expressie van genen regelt die op hetzelfde chromosoom gelegen zijn. Tegenover de cis-elementen staan de trans-regulatorische elementen zoals transcriptiefactoren (TF). TF’s kunnen inwerken op genen die veraf en op andere chromosomen gelegen zijn (7). De belangrijkste elementen zijn promotors, enhancers, insulators en silencers en deze worden hieronder besproken. Met uitzondering van de promotors - die steeds stroomopwaarts gelegen zijn - kunnen cis-elementen zich stroomopwaarts, in intronen of stroomafwaarts van de genen bevinden die ze beïnvloeden. Naast deze vier hoofdrolspelers zijn ook andere cis-elementen bekend zoals B-recognition element (BRE), motif ten element (MTE), downstream core element (DCE) en X-core promotor element 1 (XCPE1). Deze zijn tot op heden minder goed beschreven en worden verder niet meer behandeld in deze masterproef (7).
2.1 Promotor De promotor is een regulatorische regio stroomopwaarts van het gen. Door binding met transcription factor II D (TFIID) initieert deze de transcriptie. Bij zoogdieren zijn veel genen bekend die gebruik maken van meerdere promotoren. Het gebruik van een alternatieve promotor kan tot een isovorm van het eiwit leiden. Hoe de promotorselectie bepaald wordt, is nog niet volledig begrepen. Onder andere epigenetische modificaties zouden meespelen. Het gebruik van meerdere promotoren biedt organismen enerzijds de flexibiliteit om te reageren op variërende omgevingsfactoren en op cellulaire signalen. Anderzijds laat het ook een zeer nauwkeurige controle toe, wat met name cruciaal is tijdens cellulaire differentiatie. Alternatieve promotoren zijn dan ook typisch aanwezig bij genen betrokken in de embryonale ontwikkeling. Genen met slechts één promotor zullen vaker actief zijn in alle weefsels en instaan voor algemene cellulaire processen (zoals DNA-herstel en eiwitsynthese) (7). 2.1.1 Alternatieve splicing
Alternatieve splicing zorgt ervoor dat verschillende isovormen van een proteïne gevormd kunnen worden op basis van één gen. De superpositie van meerdere transcripten verleent een 11
veel hogere informatiedichtheid aan coderende sequenties. Alternatieve splicing kan op verschillende manieren gebeuren. In hoofdstuk 2 komt aan bod hoe dit kan gebeuren: ofwel door de keuze van een alternatieve promotor (voor PAX6 werden er tot nog toe vier gevonden: P0, P1, P-alfa en P1’), ofwel door een deel van een intron mee tot translatie te brengen (wat in het geval van PAX6 aanleiding geeft tot het eiwit PAX6(5a)) (13).
2.2 Enhancer DNA-segmenten die de trancriptie bevorderen worden enhancers genoemd. Enhancers bevatten meerdere TF-bindingsplaatsen alwaar ze TF’s en RNA polymerase II (RNAPII) rekruteren. Ze lijken te fungeren als assemblage-centra voor het pre-initiatie-complex (PIC) dat vervolgens aan de promotor wordt ‘aangeboden’ (14). Enhancers kunnen zich echter stroomop- of stroomafwaarts van de promotor bevinden, eventueel gelegen in de 5’UTR, 3’UTR of binnen intronen. Bovendien werken ze niet per se in op de dichtstbijzijnde promotor. Van de PAX6 -locus (hoofdstuk 2) is bijvoorbeeld geweten dat enkele cruciale enhancers zich binnen intronen van een naburig gen bevinden. Daarom zijn ze gedwongen het DNA dat hen scheidt van hun promotor te overbruggen door middel van chromatine looping (15)(16).
2.3 Silencer Silencers doen het omgekeerde van enhancers: ze zorgen voor de negatieve regulatie van genexpressie (15).
2.4 Insulator Een insulator werkt als een begrenzend element. Het scheidt hetero- en euchromatine van elkaar af en wanneer het zich tussen twee cis-elementen bevindt, voorkomt het interactie tussen beide (15). Een aantal recente studies stellen voorop dat het genoom georganiseerd is in grote genomische domeinen met elk hun eigen regulatorische activiteit en men vermoedt dat onder andere insulatoren en bepaalde retrotransposons hier een actieve rol in spelen (14)(17).
2.5 Cis-ruptie Cis-elementen kunnen op verschillende manieren verstoord worden. Kleinjan et al. stelden de verzamelterm “cis-ruptie” voor en deze heeft sindsdien ingang gevonden in de wetenschappelijke literatuur. Voorts gaf diezelfde onderzoeksgroep ook een overzicht van de
12
uiteenlopende mechanismen, die hier ook opgesomd worden (18). De cijfers in de opsomming verwijzen naar Figuur 2.
Figuur 2. Schematische representatie van de uiteenlopende cis-ruptie-mechanismen die tot genetische aandoeningen kunnen leiden. De centrale afbeelding stelt een hypothetisch gen voor (rode balk) met zijn promotor (zwarte cirkel) en een enhancer op afstand (groene cirkel). Het transcriptieniveau wordt voorgesteld door de dikte van de rode pijl. Rondom deze centrale figuur staan acht cis-ruptie-mechanismen afgebeeld. De cijfers verwijzen naar de opsomming in de tekst (18).
Het meest voor de hand liggende mechanisme is een deletie van een cis-element (zie pijl 1 Figuur 2.). Veruit het meest frequent zijn de deleties van enhancers, maar in theorie kan het verdwijnen van een silencer of insulator evengoed tot een aandoening leiden. Het is dan ook opmerkelijk dat deze twee laatste situaties haast nooit gezien worden (zie Conclusie). Voorbeelden van gedeleteerde enhancers worden behandeld in de hoofdstuk 2 en 3. Het defect dat het vaakst opgemerkt wordt is de fysische scheiding van een cis-element en zijn promotor(s) ten gevolge van translocaties of inversies (zie pijl 2 Figuur 2.). Dit mechanisme komt aan bod in hoofdstuk 2 en 3. Een mutatie in een cis-element kan ervoor zorgen dat het niet langer functioneel is (zie pijl 3 Figuur 2.). Nochtans moet vermeld worden dat deze wijze van ontregeling nog niet frequent beschreven werd (zie Conclusie). Voorbeelden worden behandeld in hoofdstuk 2 en 7. Uit onderzoek naar hemoglobinopathieën kwamen twee andere mechanismen naar voor: de epigenetische silencing van een promotor door de foutieve read-through transcriptie van een naburig gen (zie pijl 4 Figuur 2.) en het verschijnen van een nieuwe promotor die de normale enhancer-promotor communicatie verstoort (zie pijl 5 Figuur 2.). 13
Een wijziging van de regionale chromatinestructuur kan de transcriptie van genen op die locus sterk beïnvloeden (zie pijl 6 Figuur 2.). Een dergelijke gewijzigde chromatinestructuur zou onder meer bekomen kunnen worden door het verschijnen of net verliezen van een insulator. Een andere mogelijkheid is dat een translocatie de genen zelf verplaatst naar een regio met een gewijzigde chromatinestructuur. Facioscapulohumerale dystrofie is een aandoening die het gevolg is van epigenetische wijzigingen. Onder kopij veranderingen (CNV’s) verstaan we een deletie of duplicatie van stukken genoom. CNV’s van cis-elementen vallen onder de cisruptie-mechanismen. Deleties werden reeds behandeld, maar duplicaties van cis-elementen kunnen eveneens pathogeen zijn (zie pijl 7 Figuur 2.), zoals het geval is bij radiale polydactylie. Ten slotte kan een translocatie het coderende deel van een gen in cis brengen met de promotor of enhancer van een ander gen, waardoor het gen een ongeschikt expressiepatroon verwerft (zie pijl 8 Figuur 2.). Op deze wijze kan bijvoorbeeld een non-hodgkinlymfoom tot stand komen.
3. De 5’ untranslated regio (5’UTR) De 5’UTR is de regio die zich meteen stroomopwaarts bevindt van de coderende regio en als taak heeft controle uit te oefenen over de translatie-initiatie en de stabiliteit van mRNA. Typisch voor deze regio zijn specifieke verrijkingen zoals de 5’ cap1 en IRES2 (internal ribosome entry sites), maar er worden ook cis-elementen in teruggevonden (7).
3.1 Verstoring van de 5’UTR Variaties van specifieke 5’-elementen (zoals de 5’ cap) hypothekeren de translatie-initiatie van een gen. Aangezien cis-elementen zich eveneens in deze regio kunnen bevinden, vormen ook de cis-ruptie-mechanismen een mogelijke bedreiging voor de translatie. In hoofdstuk 2 is sprake van een 5’ UTR variant die waarschijnlijk aanleiding geeft tot alternatieve splicing (19).
4. Intronen Intronen staan bekend als de niet-coderende delen van een gen. Ze bevinden zich tussen de exonen en worden wel overgeschreven tot precursor-mRNA, maar vervolgens verwijderd 1
Onder normale omstandigheden is 5’cap herkenning nodig voor de samenstelling van het PIC. IRES laat toe dat ribosomen met de translatie starten vanop een alternatieve locatie op het mRNA (in tegenstelling tot de gangbare start aan het 5’ uiteinde). Het IRES-mechanisme wordt vooral gezien in genen die betrokken zijn in celoverleving en reacties op stressvolle situaties. 2
14
door RNA-splicing tijdens de maturatie. Intussen is bekend dat sommige intronen toch coderen voor proteïnen of na hun splicing herwerkt worden tot niet-coderend functioneel RNA. Sommige intronen zijn in feite mobiele elementen (7). Er worden tal van functies toegeschreven aan intronen. Eerst en vooral drijven ze de evolutie doordat ze meïotische crossing over tussen coderende gebieden bevorderen. Ze zijn echter ook een bron van niet-coderend RNA en cis-elementen. Overigens dragen ze evenzeer bij tot alternatieve splicing en zouden ze betrokken zijn in een slecht begrepen mechanisme, ‘intron mediated enhancement’ genaamd. Het belang van intronen werd onder meer bewezen door experimenten waarin de expressie van genen niet kon plaatsvinden als een intron verwijderd was, ondanks de aanwezigheid van een intacte promotor (7).
4.1 Verstoring van intronen Elke functie die een intron bezit kan verstoord worden, maar splice-fouten zijn het meest frequent. Dit wordt geïllustreerd door voorbeelden in hoofdstuk 2, 5 en 7 (7).
5. De 3’ untranslated regio (3’UTR) Stroomafwaarts van de eiwit-coderende sequentie ligt de 3’UTR. Waar de 5’UTR typisch de elementen bevat voor transcriptie-initiatie, is de 3’UTR meer gericht op posttranscriptionele modificatie (zoals polyadenylatie) en de interactie met tal van regulatorische eiwitten alsook met microRNA (7)(19).
5.1 Verstoring van de 3’UTR 3’UTR’s bevatten enkele van de sterkst geconserveerde regio’s van het humaan genoom. Het is dus niet verwonderlijk dat mutaties in die regio’s op verschillende manieren aanleiding kunnen geven tot pathologieën. Wanneer bijvoorbeeld de polyadenylatie misgaat, komt de stabiliteit van het mRNA in het gedrang. Voorts zullen mutaties in de bindingsplaatsen voor miRNA de controle die deze elementen uitoefenen, bemoeilijken of zelfs onmogelijk maken (19).
6. Transposable elements (TE’s) Transposable elements (TE’s) of ‘springende genen’ zijn sequenties die doorheen het genoom van plaats kunnen veranderen. TE’s maken bijna 50% van het menselijk genoom uit. Het onderscheid wordt gemaakt tussen TE’s die reverse transcriptase nodig hebben om zich te 15
verplaatsen (DNA transposons) en TE’s die er niet afhankelijk van zijn (retrotransposons). In het humaan genoom zijn de retrotransposons veel abundanter aanwezig (3)(20).
6.1 Retrotransposons De retrotransposons worden nog verder opgesplitst in long terminal repeats (LTR’s) en nietLTR retrotransposons. Onder de niet-LTR retrotransposons bevinden zich onder andere LINE en Alu-elementen. Bij mensen zijn enkel deze niet-LTR retrotransposons actief (20)(21).
6.1.1 Long interspersed elements (LINE)
LINE staat voor long interspersed elements. Ze zijn ongeveer 6 kb lang en coderen het reverse transcriptase (21).
6.1.2 Alu-sequenties
Alu-elementen zijn slechts een 300-tal bp lang en vormen het meest abundante TE in het humaan genoom: ze maken er bijna 11% van uit. Alu is evolutionair gezien een zeer recent element: enkel aanwezig in primaten, maar nu al sterk geëxpandeerd tot gemiddeld één miljoen kopieën per cel bij de mens (21).
6.2 Transposons als verstorende elementen Transposons zijn een drijvende kracht achter evolutie, maar op korte termijn worden we vooral geconfronteerd met de genetische aandoeningen die ze induceren. Het feit dat de excisie van TE’s niet altijd perfect gebeurt, zorgt ervoor dat ze soms hele sequenties met zich meenemen wanneer ze zich verplaatsen, dit fenomeen wordt exon shuffling genoemd. Wanneer exon shuffling resulteert in het bij elkaar brengen van twee exonen die voorheen niets met elkaar te maken hadden, kunnen nieuwe genproducten ontstaan. Bovendien vormt de aanwezigheid van zoveel repetitieve elementen een bron voor nietallelische homologe recombinaties (NAHR) (22).
Alhoewel transposons een destructieve invloed kunnen hebben, zijn de meeste silent zodat ons genoom relatief stabiel is ondanks hun abundante aanwezigheid. De meeste TE’s zijn inactief ten gevolge van mutaties, maar andere zijn nog intact en bovendien perfect in staat zich te verplaatsen binnen het genoom. Zij worden echter inactief gehouden door epigenetische beschermingsmechanismen en microRNA. Bovendien dragen de 16
TE’s ook zelf bij tot hun silencing. siRNA-molecules kunnen transpositie voorkomen. De 5’ UTR van LINE geeft aanleiding tot siRNA’s die net met de LINE-activiteit interfereren. Ze leggen zichzelf dus het zwijgen op. Hoewel veel minder actief dan ze ooit geweest zijn, vinden er toch ook vandaag nog nieuwe inserties plaats: gemiddeld eens per tweehonderd geboortes (23). Een minder gekend effect van TE’s is het feit dat de accumulatie van Alu-transcripten cytotoxisch kan zijn (zie hoofdstuk 4).
17
HOOFDSTUK 2: ANIRIDIE Fenotype Prevalentie Penetrantie Fenotypische expressie Overervingspatroon
Verantwoordelijk(e) gen(en) Chromosomale locatie Opbouw gen Opbouw eiwit
Type(s) niet-coderende variatie
Aniridie MIM 106210 1:40.000 tot 1:100.000 Volledig Variabel Autosomaal dominant 2/3 familiaal 1/3 sporadisch Paired box gene 6 (PAX6) 11p13; 22 kb 14 exonen Twee evolutionair sterk geconserveerde domeinen: the paired box en homeobox - Cis-ruptie: translocatie, deletie en mutatie van enhancers, zowel stroomop- als stroomafwaarts - Intronische verandering: gewijzigde splicing
1. Het fenotype aniridie Aniridie is een zeldzame congenitale oogaandoening die meestal beide ogen treft. Het meest opvallende kenmerk is de gedeeltelijke tot volledige afwezigheid van de iris, doch de waaier aan klinische manifestaties is bijzonder breed (zie Figuur 3). Naast de irisafwijking is in de meeste gevallen hypoplasie van de fovea centralis aanwezig, resulterend in een afname van het gezichtsvermogen. Progressieve aandoeningen zoals cataract, keratopathie en glaucoom ontstaan op latere leeftijd en vormen een verdere bedreiging voor het zicht (24)(25)(26)(27). In uitzonderlijke gevallen beperkt het klinisch beeld zich tot enkel een irisafwijking, waarbij de gezichtsscherpte nagenoeg onaangetast is (28).
18
Figuur 3. Foto's van patiënten uit een Chinese familie met aniridie weerspiegelen het breed fenotypisch spectrum (29). A) Patiënt I heeft een quasi afwezige iris. De lens is transparant. B) Patiënt II vertoont irishypoplasie, lens opaciteiten en een overigens normaal anterieur segment. C) Foveale hypoplasie bij patiënt II. D) De fundus van patiënt III toont eveneens foveale hypoplasie.
2. PAX6 als enige gen verantwoordelijk voor aniridie Paired box gene 6 (PAX6) is tot dusver het enige gen waarvan geweten is dat heterozygote mutaties dit fenotype veroorzaken. PAX6-expressie is aangetoond in alle embryonale structuren van het oog, heeft een regulerende functie en is onmisbaar voor de ontwikkeling van retina, lens, cornea en iris; het wordt soms “the master control gene” voor het oog genoemd (30).
2.1 Een breed klinisch spectrum ten gevolge van PAX6-mutaties Hoewel PAX6 momenteel het enige gen lijkt te zijn dat aniridie veroorzaakt, uiten PAX6mutaties zich niet enkel in aniridie. Ze zijn ook aangetroffen in andere – zij het gelijkaardige – congenitale ontwikkelingsdefecten van het oog, waaronder Peters anomalie, cataract, foveale hypoplasie en keratitis (31)(32)(33). Naar aanleiding hiervan stellen Lim et al. voor om de term aniridie te erkennen als een breder begrip dan enkel de strikte betekenis van het woord: de afwezigheid van de iris. Het begrip zou intussen eerder verwijzen naar een verzameling van congenitale ontwikkelingsaandoeningen van het oog (34).
3. Dierenmodellen voor aniridie Lang voor de ontdekking van het PAX6-gen werd een Drosophila fenotype beschreven als eyeless (ey). Onafhankelijk hiervan werd tien jaar later het small eye (sey) omschreven in muizen. In homozygote vorm bleek de mutatie lethaal. Heterozygote muizen werden gekenmerkt door een minder ontwikkelde lens. Later werd duidelijk dat beide fenotypes (ey 19
en sey) en aniridie bij de mens veroorzaakt worden door mutaties in orthologe genen. In Drosophila bevindt het PAX6-ortholoog zich op chromosoom 4, in muizen op chromosoom 2. Sindsdien konden ook orthologen van PAX6 gekloneerd worden in zebravissen en kwartels. Diermodellen zijn van onschatbare waarde gebleken voor het verder onderzoek naar deze aandoening (35)(36). Ectopische expressie van humaan PAX6 in Drosophila-embryo’s brengt de ontwikkeling van misplaatste, doch overigens schijnbaar functionele ogen teweeg. Dit wijst erop dat er een sterk bewaard signalisatiepad moet bestaan dat door PAX6 getriggerd kan worden (35).
4. PAX6-mutaties In het jaar 1991 werd voor het eerst de associatie aangetoond tussen aniridie en PAX6 haploinsufficiëntie, zoals bleek uit gevallen met premature stopcodons en deleties van het gen (37).
4.1 PAX6 als transcriptiefactor PAX6 is een transcriptiefactor met een zeer complexe werking: het dirigeert de weefselspecifieke expressie van diverse moleculen, hormonen en structurele eiwitten (25)(27). Om deze taak te volbrengen, interageert het op eiwitniveau met tal van andere (ontwikkelings-)genen en zichzelf (31). Het genetisch netwerk dat de embryonale ontwikkeling van de retina en iris drijft - en waarvan het falen aan de oorzaak van aniridie ligt - is nog lang niet uitgeklaard (30).
4.2 Karakterisatie en functionele studie van het regulatorisch domein van PAX6 Vooraleer ingegaan kan worden op de mutationele mechanismen, zullen eerst de structuur en werking van het gen uitgelegd worden. Het merendeel van de kennis die we vandaag hebben over de PAX6-locus en zijn cis-regulatorische elementen, is afkomstig uit onderzoek naar cisruptie als oorzaak van aniridie. 4.2.1 Algemene structuur van gen en eiwit
Het PAX6-gen van zoogdieren omvat zestien exonen. Veertien exonen zijn genummerd van 0 tot 13 en de twee recenter ontdekte exonen heten a en 5a (zie Figuur 4). Het PAX6-eiwit is opgebouwd uit twee sterk geconserveerde DNA-bindende domeinen (zie Figuur 5): het paired box domain (PD) en homeobox domain (HD), verbonden door een glycine-rijke linker. Aan zijn C-terminus is het eiwit verrijkt door proline-serine-threonine (PST) residu’s die gevoelig zijn voor fosforylatie. Dit laatste domein is van belang voor transactivatie (35). Er zijn verschillende transcripten mogelijk van de PAX6-locus. Twee grote mechanismen laten dit toe: enerzijds het gebruik van uiteenlopende promotors en anderzijds door 20
alternatieve splicing. Beide worden gereguleerd door cis-elementen (zie Figuur 4. en Legende 1.) (35).
Figuur 4. Genomische structuur van de de PAX6-locus bij de muis (niet op schaal afgebeeld). De coderende exonen zijn gekleurd, de eerste vier niet-coderende zijn zwart. De grijze trapeziums stellen de regulerende elementen voor die in Legende 1. staan opgelijst. De transcriptie-startplaatsen zijn aangeduid door gebogen pijltjes. Merk op dat promotor P1’ nog niet opgenomen is in de figuur, deze is gelegen tussen P0 en P1 (35).
4.2.2 Vier promotors
Voor de PAX6-locus zijn tot nog toe vier promotors omschreven : P0, P1, P-alfa en P1’. Dit laat toe dat PAX6 codeert voor diverse transcripten en eiwitten. De promotors zijn onderzocht door middel van reverse transcript PCR (RT-PCR) en in situ gen expressie studies. P0 en P1 reguleren twee verschillende transcripten, doch deze resulteren in een identiek polypeptide: de ‘canonicale’ vorm van PAX6. Dit wordt verklaard doordat de eigenlijke translatie begint vanaf exon 4 (zie Figuur 4.). De transcripten worden echter op een andere manier gereguleerd tijdens de embryonale ontwikkeling. Men ziet immers een verschillend expressiepatroon voor deze alternatieve transcripten in het oog en het CZS: P0-transcripten blijken belangrijk te zijn voor de lensplacode en de conjunctiva van het oog en P1wordt met name gezien in de optische vesicel en het CZS. Het gebruik van twee promotors voor hetzelfde eiwit laat waarschijnlijk een meer ingewikkelde regulatie toe. Elke promotor kan namelijk afzonderlijk geregeld worden door zijn eigen set regulatorische elementen (35). De ‘canonicale’ vorm van PAX6 bestaat uit twee DNA-bindende domeinen PD en HD (zie Figuur 5.), onderling verbonden door een glycine-rijke regio. Dit is de vorm die in de meeste cellen voorkomt. Bij zoogdieren wordt het PD gecodeerd door exon 4 tot 7 en het HD door exonen 8 tot en met 10. Door middel van alternatieve splicing kan echter een transcript bekomen worden dat het exon 5a bevat, het PAX6(5a). Het gaat om een insertie van veertien aminozuren aan de N-terminale zijde van het PD. Het gevolg is dat PAX6 en PAX6(5a) twee verschillende bindingsplaatsen bevatten. De ratio tussen het normale PAX6 en PAX6(5a) verschilt van weefsel tot weefsel.
Beide vormen van PAX6 moeten toch een duidelijk
verschillende functie vervullen, aangezien patiënten bij wie de verhouding tussen beide PAX6-vormen verstoord is, aan aniridie leiden (35)(38). 21
Figuur 5. Globale structuur van het PAX6/PAX6(5a) eiwit De kleur van de domeinen correleert met de kleur van de oorspronkelijke exonen op Figuur 4. Het PD is rood, de glycine-rijke linker groen, het HD paars en het PST domein lichtblauw. Het PAX6(5a) eiwit bevat een extra sequentie die lichtroze is afgebeeld. De typische fosforylatie-plaatsen zijn aangeduid door sterretjes (35).
Een derde transcriptie-startplaats is gelegen in het intron tussen exon 4 en 5, genaamd promotor P-alfa (zie Figuur 4.). Het transcript dat hieruit voortkomt, leidt tot een afgeknot proteïne: PAX6DPD. Dit eiwit mist het HD. Er is slechts weinig bekend over deze vorm en zijn functie, maar een overexpressie is schadelijk en resulteert in microftalmie (30)(39). Recent werd een vierde promotor gevonden gelegen tussen P0 en P1. Het kreeg de naam P1’ en komt sterk tot expressie in retinale ganglion cellen en in mindere mate in het lensepitheel en de cornea. Over dit element is overigens nog niet veel geweten (40). 4.2.3 Cis-regulatoren
De dynamiek en complexiteit van de PAX6-expressie zoals eerder beschreven, schrijven we toe aan de werking van een uitgebreid regulatorisch netwerk. Inmiddels werd reeds een aanzienlijke hoeveelheid regulatoren geïdentificeerd (zie Legende 1.). De cis-elementen die zich stroomopwaarts en binnen de intronen bevinden, werden ontdekt door evolutionaire conservatie te bestuderen. Ze werden vervolgens bevestigd in transgene rapporteerstudies. De downstream enhancers kwamen aan het licht door onderzoek naar chromosomale herschikkingen in aniridie-patiënten (zie paragraaf 4.4.1). De verste bevinden zich op enkele honderden kilobases van het gen (35).
22
Legende 1. Oplijsting van de weefselspecifieke PAX6-enhancers, De lettercodes in de laatste kolom verwijzen naar de elementen in Figuur 4. (35) letterlijk vertaald. Referenties Expressiepatroon Code in Figuur 4. a Kammandel et al., 1999 Eilandjes van Langerhans b Kammandel et al., 1999; ectodermal enhancer (EE): cornea, lens, conjunctiva, traanklier Williams et al., 1998 eilandjes van Langerhans, retinale progenitor cellen c Xu et al., 1999b d Kammandel et al., 1999 dorsaal telencephalon, rhombencephalon, ruggenmerg progenitorcellen fotoreceptoren e Xu et al., 1999b distale retina α, amacriene cellen, corpus ciliare, iris f Xu et al., 1999b; Plaza et al., 1995a; Kammandel et al., 1999 late oogontwikkeling f Kleinjan et al., 2004 diencephalon h rhombencephalon i area pretectalis, neurale retina en olfactorische regio f,k,l Griffin et al., 2002 lens, diencephalon, rhombencephalon, proximale retina, m Kleinjan et al., 2006, cerebellum 2001 telencephalon, neuroretina, retinaal gepigmenteerd epitheel n Kleinjan et al., 2001 prosencephalon, diencephalon, epifyse o Kleinjan et al., 2006
De diverse transcriptionele elementen die in Legende 1. staan opgelijst bepalen de weefselspecifieke expressie van PAX6. Deze elementen zijn in staat tot zeer fijne afstemming, een voorbeeld hiervan is dat de deletie van een bepaalde lens enhancer (element b in Legende 1. en Figuur 4.) een afname - geen volledig verlies - van de PAX6-expressie in de lens teweeg brengt. Dit is enkel mogelijk doordat de regulatorische elementen overlappend werken. Het overlappen van de werkingspatronen verleent een zekere ‘robuustheid’ aan het gen, waardoor het verlies van een element niet steeds tot het meest ernstige fenotype leidt (14)(39).
4.3 Het arsenaal aan oorzakelijke mutaties Sinds de associatie tussen aniridie en PAX6 ontdekt werd, kwamen steeds meer PAX6mutaties aan het licht en er werd besloten ze op te lijsten in de The Human PAX6 Mutation Database (41). De teller staat momenteel op meer dan 300 unieke PAX6-mutaties (33). 4.3.1 Niet-coderende mutaties
Ongeveer 80 tot 90% van de aniridie-gevallen kunnen verklaard worden door een intragenische PAX6-mutatie (31). Voor de resterende aniridie gevallen werden volgende hypotheses vooropgesteld: 1) Mutaties in andere genen kunnen eveneens aniridie veroorzaken. Tot nu toe was het onderzoek naar andere kandidaatgenen gefocust op FOXC1, PITX2, PITX3, IRX3 en CYP1B1. Ze staan immers bekend om hun betrokkenheid in de 23
oogontwikkeling. Tot nog toe konden geen nieuwe verbanden gelegd worden, doch het dient opgemerkt te worden dat de mogelijkheden binnen dit onderzoeksluik nog niet uitgeput zijn. Het blijft mogelijk dat andere, minder voor de hand liggende kandidaten een rol spelen, maar voorlopig blijft PAX6 het enige gen waarvoor aangetoond is dat mutaties aniridie veroorzaken (2)(3)(6)(12).
2) Defecten in essentiële, regulatorische elementen buiten de transcriptie-eenheid van PAX6 kunnen verantwoordelijk zijn voor aniridie. De vaststelling dat in een aanzienlijk deel van de onverklaarde aniridie-patienten een translocatie gevonden werd met breukpunten buiten het PAX6-gen, ondersteunt de hypothese dat een verstoring van cis-regulatorische elementen van PAX6 verantwoordelijk kan zijn voor de aandoening (42).
4.4 Cis-ruptie als oorzaak van aniridie PAX6 was één van de eerste genen waarvoor overtuigend bewijs gevonden werd voor cisruptie. Enerzijds waren er de aniridie-patiënten met twee intacte PAX6-genen en stroomafwaartse chromosomale herschikkingen (42). Anderzijds toonden Lauderdale et al. aan dat een volkomen intacte PAX6-transcriptie-eenheid niet volstaat voor expressie als deze niet ingebed zit in zijn gebruikelijke regio op humaan chromosoom 11 (43). Hierna zullen de cis-ruptiemechanismen die van toepassing zijn op PAX6 besproken worden. 4.4.1 Reciproke translocaties
Zoals reeds eerder aangehaald is er een stevige bewijslast voor het veroorzaken van aniridie door PAX6 haplo-insufficiëntie. Deze duidelijke associatie kwam goed van pas toen aniridiepatiënten opdoken met intacte coderende regio’s doch in combinatie met chromosomale herschikkingen stroomafwaarts van het gen (44). Het verste breekpunt bevond zich op bijna 125 kb stroomafwaarts van de PAX6 polyadenylation sites en werd SIMO genoemd (45)(46). Het bevindt zich binnen het laatste intron van het naburige gen ELP43 (zie Figuur 6.) (43)(45). Nochtans toonden Kleinjan et al. aan dat ELP4 niet betrokken is in de pathogenese (47). De herschikkingen werden ervan verdacht positief inwerkende cis-elementen te verwijderen die nodig zijn voor een correcte expressie. De verstoring van de cis-regulatorische regio zou aldus aan de oorzaak liggen van de aniridie in deze patiënten. Om deze hypothese te testen 3
Het ELP4 proteïne is een subunit van elongator, een eiwitcomplex dat bijdraagt tot de verlenging van RNA polymerase II.
24
werden transgene muizen gegenereerd door middel van yeast artificial chromosomes (YACs) transgenese. YAC589 (Y589) is een humane YAC die zich 160 kb stroomopwaarts en 150 kb stroomafwaarts van de PAX6-promotor P1 uitstrekt (in totaal 310kb). Y593 is langs beide zijden iets langer (420 kb) (45).
Figuur 6. Representatie van de PAX6-locus op chromosoom 11p13 PAX6 en ELP4 hebben een omgekeerde oriëntatie. Gebogen pijlen tonen de locaties van promotors. Zwarte balkjes boven de as vertolken exonen. De breekpunten van twee distale herschikkingen zijn aangeduid door SGL en SIMO. SGL bevindt zich op 125kb stroomafwaarts van P0, SIMO op 150kb. De enhancers die op beide locaties geïdentificeerd werden, kregen de naam van de breekpunten. Ze zijn ook opgenomen in Legende 1. De locaties van enkele oog-specifieke regulerende elementen zoals bepaald in transgenische reporter assays zijn aangeduid. Se staat voor surface ectoderm, nr voor neural retina, l voor lens en r voor retina. De 3’ uiteinden van YAC’s Y593 en Y589 zijn eveneens zichtbaar. In transgenische muizen is enkel Y593 in staat het heterozogyte en homozygtoe fenotype te redden. Het verschil tussen beiden levert de DRR (38).
In de aldus gefabriceerde muismodellen bleek Y593 in staat om het heterozygote smalleye fenotype evenals de homozygote letale variant te corrigeren. De andere YAC, Y589, faalt hierin. Op basis hiervan wist men dat de 110kb die het verschil uitmaakten (waarvan 80 kb stroomafwaarts), essentiële elementen moesten bevatten. Verspreid over een regio van ongeveer 25 kb werden verschillende regulatorische elementen gevonden door een combinatie van evolutionaire sequentievergelijking en DNase hypersensitiviteitsstudies. Kleinjan et al. noemden dit de PAX6 ‘downstream regulatory regio’ (DRR). Het 5’ uiteinde van DRR bevindt zich in intron 9 van ELP4, terwijl het 3’ uiteinde in intron 3 gelegen is. Uit nader onderzoek met transgene rapporteerstudies bleek dat de vermeende regulatorische elementen de rol van weefselspecifieke enhancers vervullen (39)(45). 4.4.2 Regulatorische deleties
Zoals reeds in hoofdstuk 1 vermeld werd, vormen deleties van enhancers het frequentste cisruptiemechanisme. Voor PAX6 zouden voorbeelden gekend zijn van deleties zowel stroomopals stroomafwaarts van de transcriptie-eenheid. De upstream deletie is een recente ontdekking van het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG). 4.4.2.1Stroomafwaarts
Stroomafwaartse deleties zijn reeds uitvoerig beschreven. In een Poolse familie met milde aniridie bleken zieke familieleden drager van een heterozygote deletie van ongeveer 0,6 Mb stroomafwaarts van PAX6. De gedeleteerde regio bevat vier genen: ELP4, IMMP1L, DPH4 en 25
DCDC1 (48). Door het CMGG werd door middel van multiplex ligatie-depente probe amplificatie (MLPA) een patiënt gevonden met een deletie van dezelfde vier genen. Eerder werd ook een 1,3 Mb deletie gevonden in een patiënt met aniridie, autisme en mentale retardatie. Zes genen waren verwijderd: ELP4, DPH4, DCDC1, DCDC5, MPPED2 en IMMP1L (48). Mogelijks is er een nog onbekende promotorregio van PAX6 gelegen voorbij de DRR.
4.4.2.2 Stroomopwaarts
Opmerkelijk is dat alle aniridie-geassocieerde breekpunten en deleties zich tot dusver stroomafwaarts van PAX6 bevonden. Dit doet vermoeden dat controle-elementen voor het gen een sterke voorkeur aan deze zijde vertonen. Tot voor kort was slechts één mogelijke uitzondering gekend: een patiënt met een complex fenotype en een grote deletie stroomopwaarts van PAX6. De meeste fenotypische manifestaties konden verklaard worden door een aandeel van de gedeleteerde genen. De patiënt vertoonde echter ook specifieke oogkenmerken (ptsosis en cataract) die mogelijks het gevolg zouden kunnen zijn van een PAX6-misregulatie (14). Zeer recent echter werd door het CMGG een ‘5 UTR variant gevonden tijdens een routine PAX6 onderzoek. Het gaat over c.-56T>G., een sequentievariant die nog niet beschreven is in de The Human PAX6 Mutation Database of in dbSNP. Volgens in silico voorspellingen zou deze verandering aanleiding kunnen geven tot een alternatieve donor splice site waardoor een nieuw open leesraam gevormd zou kunnen worden. De klinische betekenis van deze variant is op dit moment nog niet duidelijk, maar er loopt verder onderzoek. Deze nieuwe ontdekking staat tegenover het feit dat tot nog toe geen oculaire enhancers gevonden zijn in de stroomopwaartse regio van PAX6 (14). 4.4.3 Een sequentievariant in de SIMO enhancer
Tot voor kort leken alle PAX6-cis-ruptie gevallen veroorzaakt te zijn door een verstoring van grote regio’s, maar ook subtielere mutaties kunnen ziekte veroorzaken. De sequenering van een aantal cis-regulatorische elementen leverde een sequentievariant op in de SIMO-sequentie van een aniridie patiënt. Zeer opmerkelijk is dat deze mutatie een PAX6-bindingsplaats verstoort, wijzend op een mechanisme van autoregulatie (zie Figuur 7.). Transgene experimenten bevestigden deze zelfregulerende feedback loop. In de aanwezigheid van de bewuste mutatie start de expressie normaal om vervolgens af te nemen en volledig uit te doven tijdens latere stadia van de oogontwikkeling. Doordat er geen positieve feedback door
26
PAX6 kan gebeuren, treedt er geen enhancer-activiteit meer op, wat schijnbaar volstaat om tot een volledig verlies van PAX6-expressie te leiden (49).
Figuur 7. Model voor de werking van de autoregulerende PAX6-bindingsplaats in de SIMO enhancer. Er is nood aan een positieve feedback loop om PAX6-expressie te onderhouden tijdens de embryonale ontwikkeling van het oog. Ongedefinieerde enhancers, waaronder mogelijks EE (zie Legende 1.), initiëren de PAX6-transcriptie in de voorloper van de lens. Vervolgens activeert het PAX6-eiwit de SIMO enhancer, die de PAX6-concentratie op peil houdt gedurende de daaropvolgende stadia van de ontwikkeling (49).
4.5 Mutaties binnen intronen als oorzaak van aniridie Door Hingorani et al. werden zes individuen beschreven met aniridie en (vermoedelijke) intronische mutaties (zie Bijlage 1.). Vier verschillende splice site mutaties bevonden zich in intron 6. Twee van deze mutaties leiden tot het gebruik van een alternatieve splice donor site (gelegen in exon 6). In dat proces gaan 36 aminozuren verloren van het PD, waardoor diens DNA-bindende capaciteit zwaar geschaad wordt. Er wordt ook een geval beschreven (patiënt 4/4, zie Bijlage 1.) waarvoor op basis van RT-PCR eenzelfde eiwitverandering voorspeld wordt, maar waarvoor de onderliggende mutatie nog niet gevonden is. Een zesde patiënt met een sequentievariant binnen een sterk geconserveerde regio van intron 8, leed waarschijnlijk eveneens aan de gevolgen van een splicing defect, maar de effecten op de structuur van het transcript en eiwit, zijn nog niet bekend (50). Het CMGG kon onlangs een intronische mutatie aantonen in een familie : c.357+136G>A.
4.6 MicroRNA In 2012 werd vastgesteld dat PAX6 onder de inhibitie staat van miR-450b-5p in het cornea epitheel. Zoals vermeld in de inleiding, is de 3’UTR een regio waarop microRNAs typisch inwerken om de expressie te beïnvloeden in trans (35). In maart 2014 verscheen een artikel over de associatie tussen colorectale maligniteiten en de modulatie van PAX6 door
27
microRNA-7 (51). Over de impact van microRNA-regulatie op PAX6 is tot op heden nog maar weinig bekend.
5. Discussie PAX6 verdient het om te worden beschouwd als een paradigma voor variaties in het nietcoderend DNA. Gezien er verstoringen gelegen zijn in zowel stroomop- als stroomafwaartse en intronische regio’s en aangezien recent ook de regulatie door miRNA vastgesteld werd, biedt dit gen een summier overzicht van het regulatorisch én pathogeen potentieel van “junk DNA”. De lijst met nieuwe allelen groeit nog steeds aan en wordt nu ook aangevuld door de interacties met miRNA. Wat de cis-ruptie betreft, is het plausibel aan te nemen dat reeds een belangrijke fractie van de mechanismen aan het licht gekomen is, maar met name de paden via dewelke niet-coderend RNA tot ziekte zou kunnen bijdragen, zouden nog exponentieel kunnen toenemen. Momenteel is dit spoor voornamelijk onderzocht in het kader van maligniteiten, doch het is niet ondenkbaar dat het ook grote invloed heeft op ontwikkelingsaandoeningen van het oog. Verder onderzoek naar de onderlinge beïnvloeding tussen miRNA en PAX6 is dus aangewezen. Er wordt in dit werk niet verder ingegaan op de vele interacties van PAX6 op eiwitniveau, maar er dient opgemerkt te worden dat PAX6 een centrale speler is in tal van signalisatiepaden. De zeer recente ontdekking van de autoregulatie door PAX6 is hier een voorbeeld van en toont aan dat deze netwerken eveneens om verdere uitklaring vragen.
28
HOOFDSTUK 3: BLEPHAROPHIMOSIS-PTOSISEPICANTHUS INVERSUS SYNDROOM Fenotype Prevalentie Penetrantie Fenotypische expressie Overervingspatroon Verantwoordelijk(e) gen(en) Chromosomale locatie Opbouw gen Opbouw eiwit Type(s) niet-coderende variatie
Blepharophimosis, ptosis en epicanthus inversus syndroom (BPES; OMIM 110100) 1 : 50.000 100% voor ooglidfenotype Variabel voor ovarieel fenotype Autosomaal dominant forkhead box L2 (FOXL2) 3q23; 2,7 kb één exon forkhead domein (sterk geconserveerd) en polyalanine tract Cis-ruptie: translocatie en deletie enhancers
1. Het fenotype BPES Het blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndroom (BPES) is een zeldzame ontwikkelingsstoornis van de oogleden, al (type I) dan niet (type II) geassocieerd met prematuur ovarieel falen (POF). De vier belangrijkste kenmerken van BPES zijn (zie Figuur 8.) (52): 1. reductie van de horizontale dimensie van de palpebrale fissuur (blepharophimosis); 2. ptosis of afhangen van bovenste oogleden; 3. epicanthus inversus of sikkelvormige opwaartse huidplooi van de binnenkant van het onderste ooglid; 4. telecanthus of een laterale verschuiving van de canthi waarbij de interpupillaire afstand echter gelijk blijft.
Figuur 8. De faciale kenmerken van kinderen met BPES (52)
29
2. FOXL2 als enige gen verantwoordelijk voor BPES In 2001 werd forkhead box L2 (FOXL2) geïdentificeerd als oorzakelijk gen voor BPES en het blijft tot dusver het enige aangetoonde ziekte-gen. Het gen bestaat uit slechts één exon van 2,7 kb groot. Het eiwit beslaat 376 aminozuren en bevat een 110 aminozuren groot DNA-bindend forkhead domein en een polyalanine tract (polyAla). De functie van dit polyAla is onbekend (52)(53). FOXL2 is lid van de familie van de FOX-genen, een omvangrijke genfamilie die codeert voor forkhead transcriptiefactoren. Veel FOX-genen treden in eerste instantie op als regulatoren van de embryonale differentiatie, maar fungeren vervolgens in het volwassen organisme als onderhoudsgenen. Ook FOXL2 vervult een dubbele rol voor de ovaria: differentiatie tot ovaria en het in stand houden van de adulte granulosa cellen. Bovendien blijkt uit expressiestudies bij mens, muis en geit dat FOXL2 ook geëxpresseerd in de oogleden en de hypofyse. Voor genen met een dergelijke complexe spatio-temporele expressie zijn controle-elementen over lange afstand onmisbaar. Wanneer deze verstoord worden, spreken we van een cis-ruptie. Doorheen de jaren is er een groeiende evidentie ontstaan voor dergelijke mechanismen als oorzaak van BPES (54)(55).
3. Dierenmodellen met een BPES-analoog
Figuur 9. Schematische representatie van de PIS-locus bij de geit op chromosoom 1q43. De bewuste PIS-deletie is afgebeeld als een donkergrijze balk en bevat regulerende elementen voor drie genen: PISRT1, FOXL2 en PFOXic (voorgesteld als lichtgrijze pijlen). De zwarte lijnen stellen BACs voor (56).
Er bestaat een natuurlijk dierenmodel voor BPES: de Polled Intersex syndrome (PIS) geit. Een geit met dit syndroom heeft geen hoorns en lijdt aan een XX intersex fenotype. Een 12 kb grote deletie (280 kb stroomopwaarts van FOXL2) bleek verantwoordelijk voor dit fenotype. Het opmerkelijke is dat deze deletie geen coderende sequenties bevat, maar wel de transcriptie van op zijn minst drie genen verstoord: PISRT1, FOXL2 en promotor FOXL2 inverse complementary (PFOXic) (zie Figuur 9). Daarom werd aangenomen dat de PIS-locus
30
bestanddelen bevat die bijdragen aan de long-range cis-regulatie van verschillende genen (56). Recenter werd een nieuw FOXL2-allel gegenereerd in muizen: een piggyBac insertie 160 kb stroomopwaarts van de transcriptie-eenheid. Deze resulteert in een op BPES gelijkend fenotype (vrouwelijke subfertiliteit, ooglid- en andere craniale afwijkingen). Dankzij dit model werd een evolutionair bewaard element geïdentificeerd dat enhancer activiteit vertoont: ECF1. De humane ortholoog van dit element (hECF1) situeert zich 175 kb stroomopwaarts van FOXL2. Waarschijnlijk wordt deze vermoedelijke enhancer bij de mens verstoord door de gebalanceerde translocaties die in paragraaf 4.1 van dit hoofdstuk besproken worden (57).
4. Mutaties in FOXL2 Een reviewartikel uit 2009 ging de tot dan toe beschreven sequentievariaties na in BPESpatiënten. In 88% van de BPES-patiënten kan het onderliggend moleculair defect aangetoond worden. In 71% van de gevallen bleek het om intragenische mutaties te gaan, 12% waren deleties en in 5% werden veranderingen buiten de transcriptie-eenheid aangetroffen. Het is de 5% die buiten de transcriptie-eenheid gelegen zijn, die we hier verder zullen bespreken in chronologische volgorde (58). FOXL2-mutaties zijn loss-of-function mutaties die leiden tot haplo-insufficiëntie van FOXL2. Dit werd vermoed doordat FOXL2 deleties hetzelfde fenotype veroorzaken als intragenische mutaties (59). Ook het fenotype ten gevolge van defecten die buiten de transcriptie-eenheid gelegen zijn, is niet te onderscheiden van het fenotype ten gevolge van een intragenische mutatie of deletie van het gen (58).
4.1 Gebalanceerde translaties (1999) Drie gebalanceerde translocaties stroomopwaarts van FOXL2 – gedetecteerd nog voor de identificatie van FOXL2 mutaties als oorzaak van BPES – deden voor het eerst een position effect vermoeden. De translatiebreekpunten bevinden zich 130 kb, 160 kb en 171 kb stroomopwaarts van FOXL2, alle gelegen binnen intron 6 van het aanpalende MRPS22 gen (60). Door middel van mens-muis vergelijkende sequentie-analyse stelde men het bestaan van drie sterk geconserveerde sequenties vast in intron 6, 11 en 12 van MRPS22. Dit maakt hen kandidaat cis-elementen. Intron 11 bleek bovendien het humaan ortholoog van de PIS-locus te bevatten. Zoals eerder vermeld, wordt vermoed dat deze translocaties onder andere het hECF1 afscheiden (60)(61)(62)(63). 31
4.2 Vijf microdeleties (2005) De identificatie van vijf microdeleties bevestigde het vermoeden van cis-elementen. Eén deletie van ongeveer 188 kb bevindt zich stroomafwaarts ten opzichte van FOXL2. Stroomopwaarts bevinden zich vier overlappende deleties, variërend in lengte van 126 kb tot 1,9 Mb. Hun shortest regio of deletion overlap (SRO) is een zone met een omvang van 126 kb op 230 kb afstand van FOXL2, stroomopwaarts van de translocatiebreekpunten. Uit vergelijkende sequentie-analyse bleek dit gebied 25 conserved nongenic elements (CNEs) te bevatten, die op hun beurt een aantal transcriptiefactorbindingsplaatsen herbergen. Deze CNEs komen hierdoor eveneens in aanmerking als mogelijke long-range cis-regulatorische elementen. Bovendien bevat de SRO eveneens de PIS-locus (55).
4.3 Afbakening van SRO tot 7,4 kb (2009) De SRO die hierboven beschreven is, kon enkele jaren later nog verder afgebakend worden. Een veel kleinere deletie die volledig omvat zit in de oorspronkelijke SRO, bleek verantwoordelijk voor een typisch BPES fenotype. Met zijn 7,4 kb was deze deletie op dat moment (2009) de kleinste deletie van cis-regulerende elementen, verantwoordelijk voor een monogenische aandoening. Deze bleek acht CNEs (van de 25 CNEs uit de initiële SRO) en het polled intersex syndrome regulated transcript 1 (PISRT1) te verstoren. Het regulatorisch potentieel van de acht vernoemde CNEs werd getest door middel van in vitro luciferase assays en aangetoond voor drie van deze CNEs. Men neemt aan dat PISRT1 samen met FOXL2 tot expressie komt in granulosacellen en een weefselspecifieke regulerende rol speelt (64). Chromosome conformation capture (3C) liet toe een fysische interactie aan te tonen tussen de FOXL2 kernpromotor en drie stroomopwaartse CNEs, die bovendien ook onderling interageren. Deze drie worden beschouwd als distant enhancers. Eén van deze fragmenten bevat de 7,4 kb regio van de kleinste SRO (64).
32
5. Discussie FOXL2 kan net als PAX6 beschouwd worden als een paradigma hoe ontwikkelingsgenen gebruik maken van regulatorische elementen en de mogelijke verstoringen. De relatieve gelijkenis in fenotype, maar ook de identificatie van orthologe chromosomale regio’s en vergelijkbare genetische defecten die aan de basis liggen van BPES bij de mens, het polled intersex fenotype bij de geit en het piggyBac fenotype bij de muis, lijken de analogie te onderschrijven tussen deze aandoeningen. Dat zou betekenen dat de transcriptionele regulatie van FOXL2 geconserveerd is tussen mens, muis en geit, waardoor een gelijkaardige ziektebeelden optreden wanneer deze controle verstoord wordt (58)(64)(65).
33
HOOFDSTUK 4 : OUDERDOMSGEBONDEN MACULAIRE DEGENERATIE Fenotype Prevalentie Fenotypische expressie Soort aandoening Type(s) niet-coderende variatie
Age-related macular degeneration (AMD) [MIM 603075] Tot >25% in de bejaarde bevolking Natte, droge of gemengde AMD Multifactorieel Alu-RNA accumulatie
1. Het fenotype AMD Age-related macular degeneration (AMD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening van de macula die voornamelijk voorkomt in de oudere populatie (60+). Deze ziekte treft de retina in haar meest sensitieve gebied, namelijk de macula, en wordt gekenmerkt door het geleidelijk afnemen van de centrale gezichtsscherpte. Het wordt voor patiënten moeilijk tot onmogelijk om te lezen en gezichten te herkennen; het vermogen om kleuren en details te onderscheiden neemt af. Doordat het perifeer zicht grotendeels intact blijft, worden deze patiënten echter niet (volledig) blind (66)(67). Deze aandoening is de belangrijkste oorzaak van visusverlies bij 50-plussers in ontwikkelde landen. De prevalentie loopt op tot meer dan 25% bij mensen ouder dan 75 jaar. Wereldwijd lijden meer dan 30 miljoen mensen aan de gevolgen van deze ziekte en men verwacht dat het aantal zal verdubbelen in de komende 20 jaar (66)(68).
Figuur 10. Fundusbeelden in verschillende stadia van AMD (66) Funduscopieën genomen tijdens verschillende stadia van age-related macular degeneration (AMD). a) Drusen-afzettingen tijdens het begin tot intermediair stadium van AMD. b) Het rechteroog van een patiënt met neovasculaire AMD dat een subretinale vochtophoping, hemorrhagieën en exsudaten vertoont. c) Een fluoresceïne-angiografie van het linkeroog van dezelfde patiënt met natte AMD toont de hyperfluorescentie in het gebied met choroïdale neovascularisatie. d) Centrale geografische atrofie, gekenmerkt door een grote drusen-ophoping temporaal.
34
2. De pathogenese van AMD AMD is een multifactoriële aandoening. Allerlei factoren dragen bij tot de pathogenese, elkaar daarbij versterkend of tegenwerkend. Ook retrotransposons dragen bij tot de ontwikkeling van deze ziekte. Vooraleer naar de oorzakelijke factoren te kijken (zie punt 3), zal kort besproken worden welke veranderingen de retina ondergaat tijdens de ontwikkeling van AMD.
2.1 Het belang van het retinal pigmented epithelium Onder de fotoreceptorlaag bevindt zich één laag retinal pigmented epithelium (RPE) die ondersteunend werkt ten aanzien van de fotoreceptoren. Het RPE vervult een trofische rol, beschermt de integriteit door bij te dragen tot de bloed-retina-barrière en staat in voor fagocytose van verouderde of beschadigde cellen. Het RPE is van essentieel belang voor het in stand houden van de retina en staat centraal in de pathogenese van AMD. Het is de aftakeling van het RPE die secundair leidt tot fotoreceptordegeneratie (69)(70).
2.2 Drusenafzettingen als eerste teken van AMD Het eerste klinisch teken van AMD is de aanwezigheid van drusen tussen het RPE en de membraan van Bruch. Drusen zijn extracellulaire accumulaties van acellulair materiaal, zoals lipiden, proteïnen, complementfactoren, immunoglobulines, amyloid en dsRNA. Kleine geïsoleerde
eilandjes
van
drusen
kunnen
beschouwd
worden
als
een
normaal
ouderdomsverschijnsel, maar wanneer ze groter worden en samenvloeien vormen ze een voorbode voor AMD. Drusenafzetting is waarschijnlijk het gevolg van een falen van autofagie en lysosomale vertering van cellulaire componenten (70)(71).
2.3 Het verloop van AMD Het beginstadium van AMD kenmerkt zich door drusenafzetting, maar verloopt grotendeels asymptomatisch. Het vroeg stadium zal daardoor enkel door een fundoscopie-onderzoek opgemerkt worden (zie Figuur 10 en Bijlage 2.c). De pathologie kan in twee mogelijke richtingen verder evolueren: -
Geografische atrofie (GA) (de droge vorm) wordt gekenmerkt door zones van degenererend RPE en als gevolg daarvan een atrofie van de fotoreceptoren die erboven liggen (zie Bijlage 2.d). Deze vorm is het meest frequent (ongeveer 85% van de patiënten) en verloopt eerder langzaam. Voor deze vorm bestaat tot op heden geen therapie.
35
-
Exsudatief AMD (natte vorm) treft slechts 10-15% van de AMD-patiënten en kenmerkt zich door choroïdale neovascularisatie waarbij immature bloedvaten vanuit het choroïd naar de retina toe groeien. Dit gaat gepaard met het lekken van vloeistof in de retina (zie Bijlage 2.e). Hoewel dit de zeldzamere variant is, veroorzaakt natte AMD wel 90% van de blindheid ten gevolge van de aandoening. Voor deze variant is een behandeling mogelijk: intravitreale toediening van een angiogenese-remmer zorgt voor een stabilisatie van de situatie.
Beide eindstadia sluiten elkaar niet uit: in de periferie van geografische atrofie is vaak neovascularisatie aanwezig en de langdurige behandeling van natte AMD met anti-VEGF, kan leiden tot de ontwikkeling van GA, waarschijnlijk door atrofie van de choriocapillairen (70).
3. De multifactoriële etiologie omvat transposable elements AMD is een typisch voorbeeld van een complexe aandoening waarbij zowel genetische als omgevingsgebonden risicofactoren een rol spelen. De meest bepalende factor is het bereiken van een hoge leeftijd, maar er lijkt ook een associatie met roken, hypertensie, hyperlipidemie, hypermetropie en cataractchirurgie aanwezig te zijn (67). Genome wide association studies (GWAS) brachten nieuwe inzichten in de complexe genetische basis van de aandoening. Er werden reeds verschillende susceptibiliteits-loci geïdentificeerd, en door hun functie in overweging te nemen, winnen we inzichten in welke biologische paden geassocieerd zijn met de pathologie. Het sterkste verband kon aangetoond worden met de single nucleotide variatie (SNP) Tyr402His, een polymorfisme van complementfactor H, wijzend op het belang van het immuunsysteem binnen de etiopathogenese. Andere geassocieerde paden zijn het lipidenmetabolisme, de extracellulaire matrix, oxidatieve stress en angiogenese (66)(72).
3.1 Alu-retrotransposons Wat AMD interessant maakt in het licht van deze thesis, is de vaststelling dat er een toename is van Alu-RNA-transcripten in de ogen van patiënten met GA. Als het Alu-RNA effectief bijdraagt tot de etiopathogenese, is dit een eerste voorbeeld van hoe deze niet-coderende RNA-sequenties ziekte uitlokken in een multifactoriële aandoening (73). De ontdekking van de betrokkenheid van retrotransposons begon met de observatie dat in ogen met GA 65% minder Dicer aanwezig is ten opzichte van gezonde controlepersonen. 36
Dicer is een ribonuclease die instaat voor de maturatie van mircoRNA (zie hoofdstuk 1). De relevantie van deze daling werd aangetoond door Kaneko et al.. Muizen waarin Dicer werd uitgeschakeld, ontwikkelden RPE-degeneratie. Nochtans bleek het afsterven van cellen niet te wijten te zijn aan het microRNA-tekort (73). Een andere verklaring voor de cytotoxiteit ten gevolge van de Dicer-afname, presenteerde zich in de vorm van een gestegen gehalte aan Alu-RNA. Deze toename kan vastgesteld worden in de ogen van GA-patiënten, met name in hun RPE, maar ze kan ook uitgelokt worden door in muismodellen het Dicer-enzyme uit te schakelen. Het oplopen van het AluRNA, hetzij het door een Dicer-deficiëntie, hetzij door het rechtstreeks in te spuiten in de ogen van gezonde muizen, leidt tot een degeneratie van het RPE (74). Door samen met het Alu- RNA ook de Dicer-expressie op te drijven, wordt het toxisch effect geneutraliseerd. Waarschijnlijk verwerkt Dicer het Alu-RNA tot kortere, minder toxische sequenties en beschermt het op die manier tegen het accumuleren van toxische retrotransposon-elementen. Dit is geen onbelangrijke taak aangezien retrotransposons bijna de helft van ons genoom uitmaken (74)(75).
3.2 Oxidatieve stress De retina is een zeer zuurstofrijke omgeving. Relatief tot zijn gewicht verbruikt de retina meer zuurstof dan enig ander weefsel in ons lichaam. Dit toont aan waarom de fotoreceptorcellen onder zware oxidatieve stress staan. In verouderende structuren neemt het vermogen om met deze constante aanvoer van afvalproducten om te gaan af. Dit resulteert in toenemende mate in een ophoping van lipofuscine ter hoogte van lysosomen en extracellulaire drusenafzettingen. Aangezien oxidatieve stress ook de neerregulatie van Dicer induceert, moet de Alu-RNA ophoping, net als de drusen, waarschijnlijk gezien worden als het gevolg van de schade die door oxidatie wordt aangericht, eerder dan dat het verantwoordelijk is voor de initiële onset van de pathologie (68)(71).
3.3 Het immuunsysteem De cytotoxische werking van Alu-RNA verloopt waarschijnlijk via het aangeboren immuunsysteem. Hoewel een functionerend retinaal immuunsysteem noodzakelijk is voor het behouden van visuele homeostase, is overactivatie evenzeer schadelijk (70). Tarallo et al. waren de eersten om aan te tonen dat inflammasoom-activatie een primaire drijvende kracht is binnen de etiopathogenese van AMD. Een inflammasoom is een proteïnecomplex dat, als reactie op gevaarsignalen, zorgt voor de maturatie van de pro37
inflammatoire cytokines IL-1β en IL-18 met als uiteindelijk resultaat apoptose. Een inflammasoomcomplex is opgebouwd uit drie eiwitcomponenten: NLRP3 (NLR family, pyrin domain containing 3 [een onderdeel van de NOD-like receptor familie]), ASC (Apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD) en caspase1. De activerende stimuli kunnen zowel exogeen als endogeen zijn. Drusen en bepaalde complementfactoren vormen een dergelijke endogene stimulus, maar ook Alu-RNA-transcripten kunnen die rol vervullen (70)(76). Alu-RNA induceert onder meer mitochondraal reactive oxygen species (ROS). ROS primet de NLRP3-receptor waardoor die vervolgens door het Alu-RNA zelf geactiveerd kan worden. Het geactiveerd inflammasoom produceert IL-18, dat via myeloid differentiation factor 88 (MYD88) tot apoptose leidt (76). Niettegenstaande zijn potent cytotoxisch effect, werd in andere studies een positief effect opgetekend voor IL-18: de vrijstelling van het cytokine remt neovascularisatie en beschermt op die manier tegen het ontstaan van natte AMD. Enerzijds is IL-18 een beschermende factor tegen neo-angiogenese, anderzijds bevordert het de RPE-apoptose, kenmerkend voor GA. Dit voorbeeld geeft goed weer hoe kwetsbaar het evenwicht is, dat het immuunsysteem moet zien te bewaren (70).
4. Overzicht AMD pathogenese Alu-RNA is één speler binnen het brede spectrum aan pro-inflammatoire factoren, waar de verouderende retina voortdurend aan blootgesteld wordt. Deze tear and wear elementen vormen de drijvende kracht achter de pathogenese van AMD. Ze brengen het immuunsysteem op gang, dat echter niet in staat is de afvalstoffen efficiënt te klaren. Dit resulteert in een continue para-inflammatoire toestand die het RPE beschadigt, wat leidt tot verdere accumulatie van afvalstoffen. Een vicieuze cirkel is het gevolg (zie Figuur 11) (70). In de neovasculaire vorm leidt de teloorgang van de bloed-retina-barrière tot de aanvoer van immuuncellen in een omgeving die normaal sterk afgeschermd is. Pro-angiogenetische cytokines die door de macrofagen worden afgescheiden, zorgen voor een lekkend abnormaal vasculair netwerk. In het geval van GA leidt het falen van de herstelmechanismen tot degenererende gebieden van RPE-cellen en fotoreceptoren. Dit proces breidt zich uit doordat aangetaste RPE-cellen naburige cellen aantasten (70).
38
Het model dat door Kaneko et al. voorop gesteld wordt, is dat in het RPE continu Alu-RNA geproduceerd wordt. In gezonde individuen zorgt Dicer ervoor dat deze lange en schadelijke dubbelstrengige sequenties gereduceerd worden tot kortere onschadelijke versies. GApatiënten hebben echter te kampen met een sterk afgenomen Dicer -gehalte, waarschijnlijk ten gevolge van oxidatieve stress, wat toelaat dat het Alu-RNA accumuleert en uiteindelijk celdood veroorzaakt in het RPE (74)(75).
39
Figuur 11. Een geïntegreerd model voor AMD pathogenese (70) De factoren die bijdragen tot AMD zijn onderverdeeld in a) falen van het immuun-gemedieerd onderhoud van de retina b) immuun-gemedieerde retinale schade. Het samenspel van deze factoren leidt hetzij tot c) geografische atrofie, hetzij tot d) neovasculaire AMD. a) Een van de vroegste stappen in de pathogenese is het afnemen van de capaciteit om aan de metabole vereisten van de retina te voldoen. Genetische, metabole en omgevingsgebonden factoren leiden tot een accumulatie van schadelijke elementen: lipiden, lipofuscine, peroxidation by-products en Alu-RNA. Deze toxische afzettingen doen de balans uiteindelijk overslaan naar immuunactivatie. b) Eens de retina vol afvalmateriaal zit, begint een onaangepaste immuunreactie. De toxische elementen induceren verscheidene immuunpaden, zoals de klassieke pathway, de alternatieve complement pathway en de inflammasoom en Toll-like receptor pathway. Uiteindelijk leidt de aanhoudende activatie van deze pro-inflamatoire en beschadigende systemen tot gevorderde AMD. c) In het geval van geografische atrofie zien we een beschadiging van het RPE die tot RPE-degeneratie en vervolgens tot de aantasting van de choriocapillairen en de neurale retinacellen leidt. d) Bij neovasculaire AMD resulteert de teloorgang van de bloed-retina-barrière in een migratie van immuuncellen naar de retina. Hierbij komen vasculaire groeifactoren vrij die aanleiding geven tot neovascularisatie en uiteindelijk blindheid. Afkortingen figuur: 4-HNE, 4-hydroxynonenal; A2E, N-retinyl-N-retinylidene ethanolamine; C1q, complement component 1q; CEP, carboxyethylpyrrole; CX3CR1, CX3C-chemokine receptor 1; CXCL10, CXC-chemokine ligand 10; IL, interleukin; iNKT, invariant natural killer T; MDA, malondialdehyde; TNF, tumour necrosis factor
5. Discussie Uit dit hoofdstuk blijkt dat de transcriptie van retrotransposons actiever is dan verwacht. Ook dient opgemerkt te worden dat de betrokkenheid van Alu in AMD een eerste voorbeeld is van hoe deze sequentie kan bijdragen tot een multifactoriële aandoening. Ook het mechanisme waarop dit gebeurt, is vernieuwend en werpt een nieuw licht op de pathogene mogelijkheden van retrotransposons. Verder onderzoek is aangewezen en zou kunnen bijdragen tot het ontwikkelen van een therapie voor GA. Voor Dicer – gekend om zijn centrale rol in de maturatie van niet-coderend RNA – betekent dit een bijkomende functie die voorheen onbekend was. Hiermee dient rekening gehouden te worden wanneer in de toekomst systemen bestudeerd worden waarbij Dicer gedisreguleerd is. De regulatie en uiteenlopende functies van Dicer zouden verder uitgeklaard moeten worden om het potentieel van dit enzyme ten volle te kunnen inschatten.
40
HOOFDSTUK 5: LEBER CONGENITAL AMAUROSIS Fenotype Prevalentie Penetrantie Fenotypische expressie Overervingspatroon Verantwoordelijk(e) gen(en) Belangrijkste gen Chromosomale locatie CEP290 Opbouw CEP290 gen Opbouw CEP290 eiwit
Type(s) niet-coderende variatie
Leber congenital amaurosis [MIM 204000] 1/60.000 Volledig Variabel Meestal autosomaal recessief Genetisch heterogeen 18 genen Centrosomal protein 290kDa (CEP290) CEP290: 12q21.32 54 exonen, de coderende regio begint vanaf exon 2 Dertien coiled-coil (CC) domeinen, zes KID motieven, drie tropomyosin homology domains en een ATP/GTP binding site motif A. Intronische verandering: gewijzigde splicing
1. Het fenotype LCA Leber congenital amaurosis (LCA) is de vroegste en ernstigste retinale dystrofie. Retinale dystrofie veroorzaakt ongeneeslijke blindheid met een algemene prevalentie van 1/3000. LCA als deelverzameling is een stuk zeldzamer (1/60.000), maar relatief gezien toch van groot belang, aangezien geschat wordt dat het 10 tot 20% van de blindheid op kinderleeftijd veroorzaakt. Kenmerkend is de wijde genetische en fenotypische heterogeniteit (77). LCA veroorzaakt typisch een ernstige visuele beperking – gaande tot blindheid, nystagmus en afwezige pupilreflexen – doch de presentatie kan sterk variëren aangezien LCA door mutaties in veel verschillende genen veroorzaakt kan worden. Er kan een progressie vastgesteld worden tijdens het eerste levensjaar (77). In zeldzame gevallen worden een vertraagde ontwikkeling en mentale retardatie waargenomen in personen met LCA (78).
Het is één van de vormen van retinale dystrofie die het meest heterogeen is. Tot hiertoe zijn 18 ziektegenen geïdentificeerd, samen in staat om ongeveer 70% van de gevallen te verklaren (zie Figuur 12.) (79)(80)(81). Elk van deze genen draagt op zijn eigen manier bij tot de 41
ontwikkeling en het functioneren van de retina. In West-Europa liggen mutaties in het centrosomal protein 290 (CEP290) het vaakst aan de oorzaak van LCA (tot 20% van de gevallen) (82).
Figuur 12. De verantwoordelijke genen voor LCA. Slechts veertien van de achttien genen zijn afgebeeld. A) Prevalentie van de mutaties voor veertien oorzakelijke genen. CEP290 (15%), GUCY2D (12%) en CRB1 (10%) zijn de frequentste. Dertig percent van de LCA-gevallen kan niet verklaard worden door mutaties in gekende genen. B) De expressie van de LCA genen geordend volgens hun lokalisatie in de fotoreceptoren. De 14 genen zijn gegroepeerd in overeenkomst met de retinale functie die ze uitoefenen (80). Afkortingen figuur: BB, basal body; CC, connecting cilium; OLM, outer limiting membrane; OS, outer segments; PR, photoreceptor
2. CEP290 als belangrijkste gen 2.1 Functie Het CEP290-gen codeert voor een eiwit nodig in de ontwikkeling van centrosomen en cilia. Cilia zijn onder meer noodzakelijk voor de perceptie van sensorische input. Mutaties in CEP290 zijn verantwoordelijk voor 15 tot 22% van alle LCA-gevallen (83), maar ze worden bijna uitsluitend aangetroffen in patiënten met een Europese afstamming (84).
2.2 Fenotypes geassocieerd met CEP290-mutaties Anderzijds zijn er tientallen CEP290-mutaties geïdentificeerd in verscheidene ciliopathiëen. De frequentst getroffen organen zijn het centraal zenuwstelsel (Senior-Løken syndroom4), de retina (LCA) en de nieren (nefronoftisis) (zie Figuur 13). Het Joubert syndroom5, het BardetBiedl syndroom6 en het lethale Meckel-Gruber syndroom7 komen eveneens voor (82). Er 4
Het Senior-Løken syndroom([MIM] 266900) is een zeer zeldzame genetische aandoening bestaande uit de combinatie van LCA en een nieraandoening, nefronoftisis genaamd (118) . 5 Het Joubert syndroom is een zeldzame aandoening die zich zeer heterogeen presenteert. Het cerebellum is typisch aangedaan, maar patiënten vertonen ook vaak een ontwikkelingsstoornis en mentale retardatie (119). 6 Het Bardet-Biedl syndroom is een erfelijke aandoening waarbij kinderen een ontwikkelingsachterstand hebben in combinatie met problemen met het zicht, een typisch uiterlijk en overgewicht (120). 7 Het Meckel syndroom is een lethale ciliopathie die specifiek de nieren, het centrale zenuwstelsel en de lever aantast (121).
42
bestaat een gedeeltelijke overlap tussen deze aandoeningen. Het is onduidelijk hoe mutaties in één enkel gen tot zo’n pleiotropie kunnen leiden. Er wordt gespeculeerd dat andere genen (waarschijnlijk eveneens betrokken in de cilia) bijdragen (83).
Figuur 13. Pleiotropie van het CEP290-gen (85) De cirkels stellen de drie orgaansystemen voor die het vaakst getroffen worden wanneer er zich verstoringen voordoen van CEP290: het centraal zenuwstelsel, het oog en de nieren. Overlap tussen cirkels stellen multiorgaan fenotypes voor. Voor elke aandoening zijn de oorzakelijke genen weergegeven (het meest frequente gen is onderlijnd, zeldzamere genen staan tussen haakjes). Afkortingen die voorkomen in deze figuur: JS: Joubert syndroom; SLS: Senior-Løken syndroom; NPH: nefronoftisis; CORS: cerebello-oculo-renal syndrome
2.3 Frequentste mutatie is diep intronisch Maar liefst tien percent van alle LCA gevallen wordt veroorzaakt door één welbepaalde mutatie: c.2991+1655A>G. Deze is gelegen in intron 26 van CEP290 en werd voor het eerst aangetroffen in een Frans-Canadese, consanguine familie met LCA. De drie aangetaste broers en hun zus zijn allen zwaar visueel gehandicapt tot blind (zie Figuur 15.) (86). RT-PCR onthulde een aberrant splice-product bij de getroffen gezinsleden, dat teruggevoerd kon worden tot een cryptisch exon binnen intron 26. Dit exon (128 bp lang) introduceert een stopcodon tussen exonen 26 en 27 (zie Figuur 14.) (86).
43
Figuur 14. Het cryptisch exon bevindt zich 1,5 kb stroomafwaarts van exon 26. Sequenering van het omliggend DNA onthulde een transitie waardoor een splice-donor site ontstaat. Nucleotiden die deel uitmaken van het cryptisch exon zijn afgebeeld als hoofdletters, terwijl de intronenequentie in kleine letters weergegeven is (86).
In de wild type sequentie bevindt zich een sterke splice-acceptor site kortbij exon 26, maar aangezien er geen splice-donor site aanwezig is, blijft dit zonder gevolgen. De A>G transitie (c.2991+1655A>G) creëert echter een krachtige splice-donor site 1,5 kb stroomafwaarts van exon 26, met als resultaat een splicing van het cryptisch exon in het CEP290 mRNA. Door deze alternatieve splicing out of frame, volgt er een eiwittruncatie en wordt veel minder functioneel CEP290 geproduceerd (86). De vier getroffen gezinsleden van de Frans-Canadese familie bleken homozygoot voor de mutatie, waar hun gezonde tegenhangers heterozygoot waren of de mutatie niet droegen (86).
Figuur 15. Stamboom van de originele Frans-Canadese familie. Drie broers en één zus leiden aan LCA (zwarte symbolen). De haplotypes voor de regio die CEP290 bevat, staan afgebeeld (86).
44
Het is echter belangrijk op te merken dat er toch nog een kleine hoeveelheid wild-type product aangemaakt wordt. Er werd geopperd dat er sprake zou kunnen zijn van een dosis-afhankelijk mechanisme. Complete loss-of-function van beide allelen zou tot het Joubert syndroom leiden. Een residuele CEP290 activiteit zou een normale cerebellaire en renale ontwikkeling waarborgen, maar onvoldoende zijn om de retina te doen functioneren (86)(87). Nochtans werden sindsdien LCA-patiënten gevonden met twee nul-allelen. De dosisafhankelijke hypothese blijkt dus zeker niet allesverklarend te zijn (84)(87).
3. Therapeutische perspectieven Gezien de ruime klinische en genetische heterogeniteit die LCA vertoont, vormt deze aandoening een serieuze uitdaging met het oog op behandelingen: er zijn talrijke therapeutische windows mogelijk. Echter, aangezien de c.2991+1655A>G mutatie verantwoordelijk geacht wordt voor 10% van de LCA, is het onomstotelijk een interessant doelwit (82). Het splicen van pre-mRNA dient om niet-coderende intronen te verwijderen en laat ook toe om proteïnediversiteit te genereren door in- of exclusie van specifieke exonen. Mutaties die leiden tot missplicing liggen frequent aan de oorzaak van genetische aandoeningen. Daarom is er reeds ruim onderzoek gebeurd naar de modificatie van splice patterns (88). Eén van de meest haalbare opties is het gebruik van antisense oligonucleotides (AONs). Het doel van AONs is exon skipping mogelijk maken. Ze richten zich op specifieke exonen in het pre-mRNA en verbergen deze voor de splicing machinery zodat ze overgeslagen worden tijdens het splicing proces. Ze zijn voornamelijk onderzocht in het kader van de behandeling van acute aandoeningen zoals bijvoorbeeld acute retinitis ten gevolge van het cytomegalovirus, waarvoor Vitravene© ontwikkeld werd. Op het gebied van monogenische ziektebeelden is er vooral veel onderzoek naar een therapie voor de ziekte van Duchenne. De c.2991+1655A>G subset van LCA komt eveneens in aanmerking, aangezien het hier ook om een splicing fout gaat (88). Het oog is bovendien in het bijzonder een aantrekkelijk doelwit-orgaan om dergelijke nieuwe behandelmethodes in te testen. Het is klein, eenvoudig bereikbaar, begrensd en bezit een efficiënte bloed-retina-barrière (82). Gerard et al. gingen na of AONs toepasbaar zijn in de klinische praktijk als behandeling voor LCA (zie Figuur 16). AONs (zowel diegene die gericht zijn tegen de splice-donor als de – 45
acceptorsite) veroorzaken een zodanige toename van de concentratie aan wild-type (wt) mRNA, dat het de levels in wt-cellen evenaart. Dit herstel ziet men jammer genoeg onvoldoende weerspiegeld in het CEP290-eiwitpeil, dat slechts matig toeneemt. Dergelijke discrepanties werden reeds eerder gemeld in studies rond de behandeling van spierdystrofieën (82)(89).
Figuur 16.Een schematische representatie van het wild-type en het mutante CEP290 transcript en de sequenties van de AONs. Vijf AONs werden ontwikkeld (82).
4. Discussie LCA is een polygenetische aandoening, maar een niet verwaarloosbare fractie van de gevallen is een gevolg van onregelmatigheden in het niet-coderend DNA, in dit geval aberrante splicing. Deze vaststelling laat zien dat het belangrijk is rekening te houden met “junk DNA” tijdens genetische testing. De therapeutische perspectieven van AONs voor aberrante splicing zijn een interessant zijspoor van het onderzoek naar de invloed van niet-coderend DNA op LCA. Hoewel de eerste resultaten niet zo overtuigend zijn als men gehoopt had, zijn de resultaten van dit onderzoek toch interessant. Immers: ofschoon de proteïnetoename niet gelijkmatig oploopt met de stijging van het respliced mRNA, werd toch een significante verbetering van de ciliatie gemeld. Dit onderschrijft het therapeutisch potentieel van de strategie. Daarenboven is er de aanmoediging van het feit dat Vitravene© een efficiënte methode blijkt die bovendien geen zware bijwerkingen heeft. De ervaring die reeds voor handen is met AON’s op het gebied van de behandeling van acute ziektebeelden en monogenische aandoeningen, zal zeker bruikbaar zijn in de zoektocht naar levenslange behandelingen voor uiteenlopende genetische aandoeningen
(82).
46
HOOFDSTUK 6: KERATOCONUS Fenotype Prevalentie Fenotypische expressie Soort aandoening
Keratoconus 1/2000 Variabel Complex multifactorieel Meestal sporadisch MicroRNA: mutatie in de seed regio
Type(s) niet-coderende variatie
1. Het fenotype keratoconus Keratoconus is een bilaterale niet-inflammatoire verdunning van de cornea waardoor een kegelvormige protrusie ontstaat (zie Figuur 17). Het klinische spectrum is zeer breed: van de subklinische
forme
corneatransplantaties
fruste8 vereisen.
tot
ernstige
Hoewel
progressieve relatief
weinig
vormen bekend
die is
uiteindelijk over
het
ontstaansmechanisme van deze doorgaans complexe, multifactoriële aandoening, staat vast dat op zijn minst een aantal factoren genetisch zijn (90).
Figuur 17. Foto van oog met keratoconus (91)
Het is de frequentste corneale dystrofie met een incidentie van 1/2000. Deze aandoening kan geïsoleerd voorkomen, maar vaker presenteert ze zich in associatie met andere systeem- of oogaandoeningen9 (92).
2. Oorzakelijke factoren In de meeste gevallen is keratoconus een sporadische ziekte, doch in een minderheid zien we een positieve familiale anamnese. Er is een duidelijke erfelijke component in 6-19% van de 8
De term verwijst naar cornea’s met subtiele topografische kenmerken die echter nooit evolueren tot echte keratoconus. 9 Het syndroom van Down, Leber Congenitale Amaurosis, atopie en bindweefselziekten.
47
gevallen.
Fijnere
onderzoeksmethoden
wijzen
erop
dat
ongeveer
50%
van
de
eerstegraadsverwanten subtiele corneale abnormaliteiten vertonen. De genetische factoren blijken echter bijzonder heterogeen en oorzakelijke mutaties aanwijzen is tot dusver zeer omslachtig gebleken (90). De mogelijke associatie met het VSX1 gen is reeds uitvoerig onderzocht, maar nog steeds onderwerp van discussie en contribuerend tot slechts een klein percentage van de gevallen. Andere vermeende spelers zijn ZEB1, SOD1, TGFBI, COL4A3, COL4A4 en FLG. Naast de genetische component leveren omgevingsfactoren als traumata en eye rubbing eveneens hun bijdrage (92). In 2011 werd een nieuw mechanisme ontsluierd dat in bepaalde families bijdraagt tot de etiopathogenese van erfelijke keratoconus, namelijk disregulatie van microRNA (93).
2.1 MicroRNA Zoals reeds in de inleiding beschreven werd, zijn microRNA’s korte enkelstrengige RNAsequenties die via hun seed regio binden op hun doelwit-mRNA en zodoende de translatie verhinderen. 2.1.1 Ontdekking van de associatie
De eerste miRNA verandering betrokken bij een Mendeliaans overervende aandoening werd beschreven in 2009: mutaties in het miR-96 bleken verantwoordelijk voor erfelijke doofheid in twee Spaanse families (93). De associatie van keratoconus met miRNA kwam aan het licht toen Hughes et al. een Ierse familie bestudeerden die getroffen was door een autosomaal dominante keratoconus met anterieure polaire cataract die voorkwam in 18 van de 38 familieleden in drie generaties. De aandoening kon gekoppeld worden tot een regio op chromosoom 15 (15q22– q24) (94). Er werden echter geen mutaties aangetroffen in eiwitcoderende genen in deze regio. Bij verder onderzoek werd een mutatie in miR-184 weerhouden als meest waarschijnlijke oorzaak (93). 2.1.2 De werking van miR-184
Vooraleer op het effect van de mutaties in te gaan, zal eerst het normaal functioneren van miR-184 overlopen worden. MiR-184 is het meest abundante miRNA in de cornea en lens. Het belang van deze sequentie blijkt uit de mate van conservatie: de gensequentie is geconserveerd in alle 65 species waarvan geweten is dat ze een kopie dragen, waarbij de seed regio veruit het meest geconserveerd is. Onder de mogelijke doelwitten van miR-184 zitten prominente transcriptiefactoren en structuurelementen voor de lens. Dit zou kunnen verklaren waarom de Ierse familie, waarvan eerder sprake was in dit hoofdstuk, ook door cataract 48
getroffen werd (93). Recent werd ontdekt dat miR-184 de differentiatie van pluripotente stamcellen tot corneale epitheelcellen reguleert. Knockdown van miR-184 veroorzaakt een afname van PAX6 en keratin 3 (11). In het kader van deze masterproef gaat de interesse echter uit naar de interactie tussen miR-184 en miR-205. Door middel van computermodellen werd bepaald dat miR-184 en miR-205 twee gemeenschappelijke doelwit-genen hebben: inositol polyphosphate-5 phosphatase-like 1 (INPPL1) en integrin beta 4 (ITGB4). Hun onderlinge relatie is er één van competitieve inhibitie (95).
2.1.2.1 INPPL1
INPPL1 is het gen dat codeert voor het enzyme SH2-domain containing Phosphatidylinositol3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 2 (SHIP2). SHIP2 vervult meerdere rollen binnen het menselijk lichaam: de regulatie van insuline, epidermale groeifactor en actine remodellering (96). MiR-205 vervult de “klassieke” rol van miRNA: het onderdrukt de translatie van INPPL1. De rol die miR-184 speelt is echter uniek: het bindt de seed regio van INPPL1 maar heeft geen ander effect op de translatie dan dat het voorkomt dat miR-205 kan inwerken. Het neutraliseert dus de inhiberende activiteit van miR-205. Het corneaal epitheel is het enige dat beide miRNA’s tot uiting brengt en dus de enige situatie waarin ze hun interactie (competitieve inhibitie) kunnen uitoefenen. Dit is het eerste – en tot nog toe enige – voorbeeld van hoe een miRNA een ander miRNA negatief reguleert om de neerregulatie van een doelwit-gen te beperken (97). Enerzijds zijn voldoende hoge SHIP2 levels vereist om neovascularisatie te onderdrukken. De cornea hoort avasculair te zijn. Neovascularisatie zou immers de lichtdoorlaatbaarheid verstoren. Door Akt te inhiberen wordt VEGF laag gehouden en angiogenese onderdrukt. miR-205
INPPL
Akt-pathway
celoverleving
A) miR-184
miR-205
INPPL
Akt-pathway
celoverleving
B) Figuur 18. Competitieve inhibitie tussen miR-184 en miR-205. A) Schematische weergave van de invloed die miR-205 uitoefent op de Akt-pathway. B) Schematische weergave van de competitieve inhibitie die miR-184 uitoefent op miR-205.
Anderzijds is SHIP2 een tumorsupressor die wegens zijn negatieve controle over de Akt pathway de celoverleving stimuleert. Dat maakt van miR-205 een tumorpromotor met zijn 49
inhibitie van SHIP2. MiR-184 balanceert miR-205 uit om voldoende apoptose te verzekeren (zie Figuur 18. en Figuur 19.) (97). Wanneer de competitieve inhibitie van miR-184 op miR-205 afneemt, verlengt de celoverleving ter hoogte van de cornea. Hoe INPPL1 exact kadert in de pathogenese van keratoconus is nog niet duidelijk. Enerzijds kan overmatige celdood bijdragen tot keratoconus (zoals waarschijnlijk gebeurt bij eye rubbing); anderzijds is apoptosis een cruciale stap tijdens de genezing van corneale wondjes (zie Figuur 21.). Mogelijks is het via het falen van dit laatste mechanisme dat INPPL1 bijdraagt tot keratoconus (93)(98).
Figuur 19. Het model volgens Yu et al.: het regulerend effect van miR-205 en miR-184 op SHIP2 in verschillende epithelen (95). A) Epidermale keratinocyten: door antagomir-20510 toe te voegen, verlaagt het miR-205 gehalte en verhoogt het SHIP2 gehalte, waardoor er minder Akt signaling is en meer apoptose. B) Corneale keratinocyten: door antagomir-184 toe te voegen, verlaagt het miR-184 gehalte, wat miR-205 toelaat om SHIP2 te onderdrukken met toegenomen celoverleving en angiogenese als gevolg. C) Squamous cell carcinoma (SCC): toevoeging van miR-184 of een antagomir-205 zou mogelijks therapeutische kunnen zijn door de toename van SHIP2 – fungerend als tumorsupressor.
2.1.2.2 ITGB4
Integrin beta 4 (ITGB4) codeert voor het belangrijkste structureel eiwit van de hemidesmosomen die nodig zijn om corneale basale epitheelcellen aan de basale membraan te verankeren.
Wanneer
zich
een
corneale
beschadiging
voordoet,
degraderen
de
hemidesmosomen van de basale epitheellaag om celmigratie toe te laten, waarna ze zich herstellen. Sinds 2006 weten we dat de expressie van miR-184 stopt op de plaats van een corneale laesie en herneemt na genezing (99) (zie Figuur 20.). Hieruit leiden Hughes et al. de hypothese af dat ITGB4 eveneens bijdraagt tot de pathogenese van keratoconus (93).
10
Een antagomir voor miR-205. Antagomiren zijn synthetische single-stranded RNA molecules, complementair aan een specifiek miRNA. Door het miRNA te bezetten, verlagen ze de beschikbare concentratie en verhinderen aldus hun werking.
50
Figuur 20. Het effect van cornea-epitheel wondheling en miR-184 expressie (99) A) Centrale laesie ter hoogte van het cornea-epitheel, waarbij het omliggende epitheel intact is. B) Binnen de eerste 24 uur na de wonde begint reeds de re-epithelialisatie. C) Na 48 uur is de laesie volledig hersteld. D) Gedurende de eerste 24 uur kon geen miR-184 gedetecteerd worden in het zich herstellende epitheel, E) maar wel in het naburige intacte epitheel. Dit wijst erop dat de verwonding lokaal zorgt voor neerregulatie van miR-184. F) Na 48 uur is er opnieuw sterke miR-184 expressie in het herstelde epitheel, G) maar eveneens in het naburige epitheel.
Volgens bepaalde schattingen zouden tot 1000 genen gereguleerd kunnen zijn door miR-184, al dan niet in competitie met een ander miRNA. Het is mogelijk dat het schadelijk effect van miR-184 niet enkel via INPPL1 en ITGB4 verloopt (93). 2.1.3 Mutaties in miR-184 als oorzaak van keratoconus
De eerste mutatie die ontdekt werd, was een transitie (c.57C>T) in de seed regio (zie Figuur 21). Deze verandering heeft geen effect op de expressieniveaus van miR-184, maar doordat deze zich in de seed regio bevindt, hypothekeert ze de bindingscapaciteit van miR-184 op zijn doelwit-genen en zodoende ook het functioneren. MiR-184 met een mutatie in de seed regio is immers niet in staat om met miR-205 te wedijveren voor de gemeenschappelijke target sites in de 3’UTR van INPPL1 en ITGB4 (93).
51
Figuur 21. De conservatie van miR-184 varianten bij diverse diersoorten, de structuur van miR-184 en de interacties van miR-184 en miR-205 (93). A) Multiple alignment van de miR-184 sequenties van verschillende gewervelde diersoorten. Afwijkingen van de humane referentiesequentie zijn aangeduid in groen. De mature miRNA-sequentie is rood, waarbij de seed regio bovendien in vet weergegeven is. De positie van mutatie miR-184r.57c>u is aangeduid met een blauwe pijl. B) Secundaire structuur en vrije energie (kcal/mol) voor het wild-type en mutante miR-184 zoals ze voorspeld zijn door Mfold. De mutatie veroorzaakt geen destabilisatie van de secundaire structuur van het proteïne. C) Target site van miR-184 en miR-205 in de UTR’s van INPPL1 en ITGB4 zoals voorspeld door microCosm (uitgedrukt in vrije energie). Volgende afkortingen werden gebruikt: hsa, Homo sapiens; ptr, Pan troglodytes; ppy, Pongo pygmaeus; mne, Macaca nemestrina; mdo, Monodelphis domestica; gga, Gallus gallus; ssc, Sus scrofa; rno, Rattus norvegicus; mmu, Mus musculus; xtr, Xenopus tropicalis; dre, Danio rerio.
Lechner et al. stootten bij patiënten met keratoconus op twee nieuwe mutaties: miR-184 (+3A>G) en (+8C>A),. Om te achterhalen of deze mutaties ook effectief een pathogeen effect hebben, werden ze geanalyseerd met behulp van computermodellen. Uit deze onderzoeken blijkt dat beide mutaties aanleiding geven tot structurele wijzigingen in de stem-loop structuur van het pri-miRNA (zie Figuur 22.B). De structuur van de miRNA-precursoren is van cruciaal belang voor het verdere productieproces en dus ook voor de expressieniveaus (11).
52
Figuur 22. De (+3A>G) en (+8C>A) mutaties in miR-184 (11). A) Cytosine op positie 8 is bewaard bij alle species. Adenine op positie 3 van miR-184 is eveneens sterk bewaard, doch enkel onder zoogdieren. B) Van links naar rechts: miR-184 WT, 3A>G en 8C>A. De kleuren geven de positionele entropie weer, veroorzaakt door de stucturele wijzigingen in de precursoren. C) Transfectie met mutante transcripten geeft een significante afname van het relatieve expressielevel van miR-184 ten opzichte van een transfectie met wild type transcripten. Dit wijst op een wijziging in de miRNA processing.
De gewijzigde structuur van de precursoren verstoort de herkenning door Drosha en Dicer waardoor het maturatieproces minder efficiënt verloopt. De gedaalde miR-184 levels die hieruit volgen, kunnen onvoldoende blijken om hun regulerend functie naar behoren uit te oefenen (11). De (+8C>A) transitie, die door Lechner et al. ontdekt werd in een Britse familie, gaf aanleiding tot een extreme situatie: de mutageen vergrote interne lus maakte de vereiste inwerking van Drosha en Dicer onmogelijk, leidend tot afwezige miR-184 expressie en regulatie (11).
Voor de (+3A>G) mutatie, gevonden in een Australische familie, werd voorspeld dat ze de basepairing zou bemoeilijken in een regio vereist voor Drosha cleavage. Als gevolg bemerken we een gedaalde miR-184 expressie. De penetrantie van keratoconus is onvolledig in deze Australische familie (11). Opmerkelijk is dat de vader, die dezelfde mutatie draagt als zijn twee zonen met keratoconus, zelf het fenotype niet vertoont, ook geen fruste vorm. Daarentegen hebben beide ouders 53
enkele
subtiele
kenmerken
die
vaak
deel
uitmaken
van
een
algemene
keratoconusbeschrijving: dunne, wazige cornea’s en prominente corneale zenuwen (11). De hypothese die Lechner et al. hiertoe opperen is dat de moeder, hoewel ze geen miR-184 mutatie draagt, andere nog onbekende genetische risicofactoren bezit, die haar zonen hebben overgeërfd. Het samenspel van de miR-184 mutatie en andere genetische risicofactoren dat leidt tot keratoconus bij de broers (11).
De relatieve ernst van beide mutaties weerspiegelt zich ook in de evolutionaire conservatie van de gemuteerde nucleotiden: adenine op positie 3 is bewaard onder zoogdieren, maar cytosine op positie 8 heeft een homologie over alle diersoorten en de mutatie aldaar heeft dan ook zwaardere gevolgen (zoals een volledig afwezige expressie) (zie Figuur 22. A en C) (11).
3. Discussie MiR-184 is een waar paradigma voor de multifunctionaliteit van miRNA. Naast haar bijdrage in de etiopathogenese van keratoconus, bestaat een sterk vermoeden dat miR-184 een nog veel centralere rol vervult in de embryonale ontwikkeling van het oog (zoals in de vascularisatie) (100)(101). In paragraaf 2.1.2 werd beschreven dat miR-184 zich in de cornea als een tumorsupressor gedraagt. Het is dan ook opmerkelijk dat gemeld wordt dat miR-184 in squameuze carcinomen van de tong net als tumorpromotor fungeert. Experimenten waarbij dit miRNA onderdrukt werd door RNAi, toonden immers een reductie van de celproliferatie. Deze schijnbare tegenstrijdigheid toont aan hoe complex de werking van miR-184 is. Verder zou dit miRNA ook betrokken zijn in de ontwikkeling van het adaptief immuunsysteem. Tot slot wordt er een associatie gezien tussen miR-184* en de ziekte van Parkinson waarbij zelfs al in de richting van therapeutische perspectieven gedacht wordt (102).
Gezien dit breed spectrum aan functies in tal van weefsels, is miR-184 een bijzonder interessant element voor verder onderzoek. In feite is naar de miRNA’s in het algemeen verdere research nodig. Immers, van alle miRNA’s die reeds geïdentificeerd zijn in de mens, kon voor nog maar voor een zeer klein aandeel een functie aangewezen worden.
54
HOOFDSTUK 7: BLAUWE OGEN Fenotype Prevalentie Penetrantie Fenotypische expressie Overervingspatroon Verantwoordelijk(e) gen(en)
Belangrijkste gen Chromosomale locatie Opbouw gen Opbouw eiwit Type(s) niet-coderende variatie
Blauwe ogen Zeer sterk afhankelijk van de populatie Onvolledig Variabel Complex polygenetisch OCA2, TYR, TYRP1, DCT, SILV, OCA2, MATP, ASIP, MC1R, POMC, OA1, MITF, MYO5A, RAB27A, HPS1, HPS6 Oculocutaneous albinism II (OCA2) 15q12-q13; 345 kb 24 exonen 110 kD proteïne met twaalf transmembranair overspannende regio’s Cis-ruptie: mutatie in enhancer
Figuur 23. Spectrum aan meest voorkomende oogkleuren (103)
1. De oogkleur als fenotypisch kenmerk Oogkleur wordt soms gebruikt als tekstboek voorbeeld van monogenische Mendeliaanse overerving, doch de realiteit blijkt een stuk complexer. Momenteel wordt ervan uit gegaan dat een zestiental verschillende genen betrokken zijn bij het bepalen van de oogkleur (zie overzichtstabel), doch de belangrijkste spelers zouden zich bevinden op chromosoom 15 (104). De humane oogkleur kan variëren van bruintinten over hazelnoot, groen, blauw, grijs en in zeldzame gevallen rood en violet (die enkel voorkomen bij mensen met ernstig albinisme). Oogkleur is de resultante van variërende hoeveelheden melanine die geproduceerd en bewaard worden in de melanocyten van de irissen. Twee soorten melanine staan in voor de 55
pigmentatie van huid, haar en ogen: eumelanine en feomelanine Een derde vorm, neuromelanine, komt enkel voor in het centraal zenuwstelsel (103). De kleur van de iris wordt bepaald door de hoeveelheid en het type melanine in de melanocyten en de dichtheid van het stroma. Blauw of groen pigment komt niet voor in de ogen van mensen. Deze kleuren worden veroorzaakt door Rayleighverstrooiing 11 in het stroma. Het aantal melanocyten is gelijk tussen lichte en donkere ogen (103). Wanneer licht invalt op een oog dat een hoge dichtheid aan melanine bevat, wordt het zichtbare licht geabsorbeerd en het beetje dat gereflecteerd wordt, is bruin. Hoe minder melanine aanwezig is in de cellen, hoe lichter de oogkleur. Rode ogen zijn het gevolg van een afwezigheid van pigment waardoor de reflectie van de bloedvaten gezien wordt. Wanneer zeer weinig pigment aanwezig is, creëert dit een felle blauwe kleur die samen met de rode reflectie aanleiding geeft tot violet (104).
2. OCA2 als voornaamste gen voor de oogkleur OCA2 codeert voor het P proteïne dat de melanogenese en de zuurtegraad in melanosomen reguleert. Mutaties in dit gen veroorzaken oculocutaan albinisme type 2, wat meteen ook de naamgeving verklaart. Volgens bepaalde schattingen zou 74% van de variatie in oogkleur bij Caucasiërs verklaard worden door een interval op chromosoom 15 dat ondermeer het OCA2gen bevat (105). Waarschijnlijk beïnvloedt OCA2 de pigmentatie via tyrosinase, het snelheidsbepalende enzyme van de melanogenese. Inderdaad bleek een sterke associatie te bestaan tussen OCA2-transcriptieniveaus en de intensiteit van de pigmentatie zoals blijkt uit de CNVs van het gen, die enerzijds hyperpigmentatie en anderzijds hypopigmentatie veroorzaken. Nochtans bleek dat slechts een klein gedeelte van de oogkleurvariatie in een Caucasische populatie verklaard kon worden door coderende allelen van OCA2 (106).
2.1 Mutaties binnen intronen van OCA2 In 2007 bleek het eerste intron van OCA2 drie single nucleotide variaties (SNPs) te bevatten die een sterke associatie vertoonden met het al dan niet hebben van blauwe ogen. Dit was de eerste aanwijzing dat verschillen in een 5’ proximale controleregio van het OCA2-gen de mRNA-transcriptieniveaus wijzigen en via deze weg belangrijk zijn in het bepalen van het uiteindelijke fenotype (107).
11
Rayleighverstrooiing is de verstrooiing van licht door deeltjes die kleiner zijn dan de golflengte van het licht.
56
2.2 Mutaties binnen het naburige gen HERC2 Sinds 2008 is door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen aangetoond dat een SNP in het naburige HERC2-gen sterker gecorreleerd is met een blauwe/bruine oogkleur dan SNPs in OCA2 of elders in het genoom (108)(109)(110). Het gaat over rs12913832, een nietcoderende SNP die zich 21,5 kb stroomopwaarts van OCA2 bevindt en zich situeert in intron 86 van HERC2. Voor zover bekend heeft HERC2 geen enkele betrokkenheid in pigmentatie. Door sequentie-alignering werd duidelijk dat deze SNP zich bevindt in een korte doch zeer sterk geconserveerde sequentie, waarvan vooropgesteld wordt dat dit een enhancer is (108). Bovendien bleek rs12913832 sterk gerelateerd met het expressieniveau van OCA2 (111).
Visser et al. (2012) gebruikten humane epidermale melanocyten van neonatale oorsprong (HEMn) om te bewijzen dat rs12913832 fungeert als een allelspecifieke enhancer. Donker gepigmenteerde melanocyten (HEMn-DP cellen) bleken homozygoot voor het T allel terwijl de licht gepimenteerden (HEMn-LP cellen) twee C-allelen bevatten. Door middel van formaldehyde-assisted
identification
of
regulatory
(FAIRE)
en
chromatin
immunoprecipitation (ChIP) werd inzicht verkregen in de chromatinestatus van de regio, die alle kenmerken van een regulerende controleregio bleek te bezitten (een open chromatinestructuur, rekrutering van RNAPII en specifieke epigenetische eigenschappen). Opnieuw kwam de allel-specificiteit naar voor: er werd een meer uitgesproken rekrutering van RNAP II naar de OCA2 promotor vastgesteld in HEMn-DP cellen ten opzichte van HEMn-LP cellen. Ook in luciferase reporter assays gedraagt rs12913832 zich als een melanocyt-specifieke enhancer en is de respons vijfmaal hoger in T-allelen. 2.2.1 Mechanisme achter allel-specifieke enhancer
Distale enhancers communiceren met
de
promotor
van hun doelwit-genen via
chromatinelussen. Door middel van chromosome conformation capture (3C) technologie was het mogelijk om allel-dependente chromatine loops te detecteren voor rs12913832. De lusvorming komt tot stand door de binding van de transcriptiefactoren HLTF, LEF1 en MITF op rs12913832. Voor het T-allel gebeurt de rekrutering van transcriptiefactoren in sterkere mate dan voor het C-allel met als gevolg een toegenomen looping naar de OCA2-promotor toe (zie Figuur 24). Daardoor neemt de OCA2-expressie toe, wordt meer melanine geproduceerd en zien we uiteindelijk een donkerdere pigmentatie. Al deze stappen gebeuren in mindere mate bij een homozygoot C-allel (110). Een mogelijke verklaring is een wijziging in de HLTF-bindingsplaats bij het C-allel, waardoor de rekrutering van HLTF minder vlot verloopt, wat de uiteindelijke lusvorming belemmert (106). De conclusie is dat HERC2 rs12913832 de 57
belangrijkste predictor is voor oogkleur in Europeanen. Daarenboven is ook huid- en haarkleur in sterke mate afhankelijk van deze SNP (112).
Figuur 24. Schematische weergave van hoe een SNP in een distaal enhancer element de OCA2-expressie beïnvloedt. SNP rs12913832 bevindt zich in het 86ste intron van HERC2 en heeft twee allelen. Het T-allel van rs12913832 bindt met HLTF (grijze vijfhoek) wat de rekrutering van MITF1 (roze ovaal) en LEF1 (blauw ovaal) en de chromatine loop formation initieert. Op deze manier worden enhancer en promotor samengebracht, ontstaat een sterke OCA2-activatie en een donkere pigmentatie. Het C-allel kan HLTF niet binden wat tot een minder sterke activatie van alle hoger vernoemde processen leidt, resulterend in een lichtere kleur. De gele ovaal staat voor het transcriptiecomplex en de zwarte pijl correleert met de mate van transcriptie (106).
3. Een praktische toepassing Wat de ontdekking van deze enhancers extra belangwekkend maakt, is het feit dat ze een zeer concrete toepassing gevonden hebben binnen het veld van de forensische geneeskunde. In een studie waar meer dan 6000 Nederlanders aan deelnamen, bleek het mogelijk om op basis van slechts 6 SNP’s het hebben van blauwe of bruine ogen te voorspellen met een accuraatheid van 90% (113). De mogelijkheid tot het voorspellen van uiterlijk zichtbare kenmerken louter op basis van een DNA-staal, wordt Forensic DNA Phenotyping genoemd en zal toelaten dat politieonderzoek in de toekomst meer gericht kan gebeuren (114). Recent werden 24 predictieve DNA-variaties gekoppeld in het HIrisPlex-systeem dat toelaat om simultaan haaren oogkleur te voorspellen (115). Naarmate meer bekend wordt over de genetische bepaling van uiterlijk zichtbare kenmerken, zal de voorspellende waarde van dergelijke programma’s toenemen.
58
4. Discussie De vaststelling dat rs12913832 – een niet-coderend SNP – zich gedraagt als een allelspecifieke enhancer voor het OCA2 gen in melanocyten is interessant omwille van een aantal redenen. Eerst en vooral is het één van de weinige voorbeelden waarbij cis-ruptie een fenotypisch kenmerk teweeg brengt. Bovendien is het feit dat deze onderzoektak meteen al toelaat geïmplementeerd te worden in praktische toepassingen een sterk signaal dat het onderzoek naar “junk DNA” niet enkel leerzaam is, maar ook toepasbaar in de realiteit op korte termijn.
Suzuki et al. stelden vast dat de OCA2-expressie toeneemt wanneer de epidermis blootgesteld wordt aan UVB-straling (116). Het is momenteel niet duidelijk of de rs12913832 enhancer hier een actieve rol in speelt. De melanogenese staat immers ook onder de controle van epigenetische factoren zoals hormonen en tal van omgevingsfactoren (117). Hoe al deze signalisatiepaden integreren in de rs12913832 enhancer en het regulatorisch netwerk van OCA2, dient nog verder onderzocht te worden. Verscheidene GWASs naar humane pigmentatie en melanomen identificeerden nieuwe susceptibiliteits-loci waarvan een aanzienlijk deel gelegen is in niet-coderende regio’s. Dit doet alvast vermoeden dat melanocyt-specifieke enhancers niet enkel relevant zijn voor melanogenese, maar ook voor carcinogenese en het bruinen van de huid onder invloed van UV-straling (106).
59
CONCLUSIE Elementen uit het niet-coderend deel van het genoom dragen in belangrijke mate bij tot genregulatie. Zij kunnen bijdragen tot normale kenmerken, en tot het ontstaan van ziekte zeldzame monogenische, frequente multifactoriële en verworven aandoeningen - wanneer zij foutief gereguleerd zijn. Een toenemend aantal genetische defecten in deze elementen wordt gerapporteerd,
ondermeer door de beschikbaarheid van performante genoomwijde
technieken. Een groter inzicht in deze genetische defecten heeft impact de diagnostiek van de aandoeningen waarin zij een rol spelen, en biedt ook therapeutische perspectieven, zoals het gebruik van antisense oligonucleotiden (AON) voor het uitschakelen van diep intronische mutaties. Het inventariseren van de functionele elementen in het humaan genoom is essentieel. De verschillende fasen van het ENCODE project speelden hierin een cruciale rol. In deze masterproef werd veel aandacht besteed aan cis-regulatorische elementen die een rol spelen in het oog. Meer specifiek hebben een aantal genoomwijde methodes een belangrijke rol gespeeld in de identificatie van cis-regulatorische elementen in het genoom (5): 1. Aangezien een percentage functionele elementen evolutionair geconserveerd is, werd vergelijkende sequentie-analyse van genomen gebruikt voor succesvolle identificatie van regulatorische elementen. Het ENCODE project leerde ons echter dat het verband tussen conservatie en functionaliteit niet steeds absoluut is . 2. Een
andere
methode
die
met
succes
gebruikt
werd,
is
de
DNase
I
hypersensitiviteitsbepaling.
De validatie van cis-regulatorische elementen kan onder meer gebeuren in vivo door transgene rapporteerstudies in de muis of zebravis. Een moeilijkheid is dat negatieve resultaten niet volstaan om te besluiten dat een sequentie niet functioneel is. Cis-elementen kunnen immers bijzonder specifiek zijn. Een element dat tijdens rapporteerstudies ogenschijnlijk silent blijft, zou in een ander weefsel of celtype of op een ander tijdstip misschien wel actief kunnen zijn. De dynamiek en complexiteit van regulatorische elementen is wat hen in staat stelt tot zeer fijne regulatienuances, maar maakt tegelijk hun identificatie en validatie moeilijk (16).
Naast het ENCODE project droegen locusspecifieke genetische studies van aandoeningen die veroorzaakt worden door niet-coderende defecten, zoals cis-rupties, in belangrijke mate bij tot 60
onze kennis over het regulatorisch landschap. Wat opvallend is bij deze studies, is dat er nauwelijks voorbeelden gekend zijn van cis-ruptie van insulators of silencers. Deze observatie doet leemtes vermoeden in ons begrip van deze elementen, wat perspectieven biedt voor toekomstig onderzoek (14). Een andere opvallende observatie die reeds in de inleiding aan bod kwam, is het feit dat er relatief weinig voorbeelden gekend zijn van puntmutaties in een cis-element die oorzaak zijn van een fenotype bij de mens. Dit doet vermoeden dat cis-elementen een zekere robuustheid bezitten, mogelijks gedeeltelijk te verklaren door de functionele overlap tussen cis-elementen en het feit dat ze vaak verschillende bindingsplaatsen bevatten voor een specifieke TF. Anderzijds zouden (punt)mutaties in cis-elementen ook bijzonder subtiele fenotypes kunnen uitlokken, die tot nog toe onopgemerkt gebleven zijn (18). Naast de cis-regulatorische elementen werden ook voorbeelden gegeven van onderzoek over niet-coderend RNA. Studies van elementen zoals retrotransposons zorgden voor verrassende inzichten zoals de actieve transcriptie van Alu die bijdraagt tot het ontstaan van AMD.
Tot slot kunnen we aannemen dat de 'dark side of the genome' nog tal van ongekende functionele elementen bevat. We verwachten dat verder onderzoek hierover zal bijdragen tot een groter begrip van fysiologische ontwikkelingsprocessen bij de mens, en van het ontstaan van monogenische, multifactoriele en verworven ziekten.
61
BIBLIOGRAFIE 1.
NICHOLAS WADE. From One Genome, Many Types of Cells. But How? New York Times [Internet]. New York; 2009;D4. Available from: http://www.nytimes.com/2009/02/24/science/24chromatin.html?pagewanted=all&_r=0
2.
Pennisi E. Shining a light on the genome’s “dark matter”. Science [Internet]. 2010 Dec 17 [cited 2012 Nov 12];330(6011):1614. Available from: http://www.sciencemag.org/content/330/6011/1614.short
3.
Alexander RP, Fang G, Rozowsky J, Snyder M, Gerstein MB. Annotating non-coding regions of the genome. Nat. Rev. Genet. [Internet]. Nature Publishing Group; 2010 Aug [cited 2012 Oct 30];11(8):559–71. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20628352
4.
Niu D-K, Jiang L. Can ENCODE tell us how much junk DNA we carry in our genome? Biochem. Biophys. Res. Commun. [Internet]. 2013 Jan 25 [cited 2014 Mar 22];430(4):1340–3. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X12024229
5.
Birney E, Stamatoyannopoulos J a, Dutta A, Guigó R, Gingeras TR, Margulies EH, et al. Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature [Internet]. 2007 Jun 14 [cited 2013 May 21];447(7146):799–816. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2212820&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
6.
Elgar G, Vavouri T. Tuning in to the signals: noncoding sequence conservation in vertebrate genomes. Trends Genet. [Internet]. 2008 Jul [cited 2012 Oct 30];24(7):344–52. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.tig.2008.04.005
7.
Barrett LW, Fletcher S, Wilton SD. Regulation of eukaryotic gene expression by the untranslated gene regions and other non-coding elements. Cell. Mol. Life Sci. [Internet]. 2012 Dec [cited 2014 Mar 31];69(21):3613–34. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3474909&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
8.
Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet. [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2010 Sep [cited 2013 Nov 7];11(9):597–610. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrg2843
9.
Huntzinger E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2011 Feb [cited 2013 Nov 7];12(2):99–110. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrg2936
10.
Pyle AM, Gurtan AM, Sharp PA. The Role of miRNAs in Regulating Gene Expression Networks. J. Mol. Biol. [Internet]. 2013 [cited 2013 Dec 6];425(19):3582–600. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361300154X
11.
Lechner J, Bae HA, Guduric-Fuchs J, Rice A, Govindarajan G, Siddiqui S, et al. Mutational analysis of MIR184 in sporadic keratoconus and myopia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. [Internet]. 2013 Aug 5 [cited 2013 Nov 25];54(8):5266–72. Available from: http://www.iovs.org/content/54/8/5266.long
12.
Zhang C. MicroRNomics: a newly emerging approach for disease biology. Physiol. Genomics [Internet]. 2008 Apr 22 [cited 2014 Apr 7];33(2):139–47. Available from: http://physiolgenomics.physiology.org/content/33/2/139.full
62
13.
Dhir A, Buratti E. Alternative splicing: role of pseudoexons in human disease and potential therapeutic strategies. FEBS J. [Internet]. 2010 Feb [cited 2014 Mar 8];277(4):841–55. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20082636
14.
Bhatia S, Kleinjan DA. Disruption of long-range gene regulation in human genetic disease: a kaleidoscope of general principles, diverse mechanisms and unique phenotypic consequences. Hum. Genet. [Internet]. 2014 Feb 5 [cited 2014 Mar 20]; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24496500
15.
Visel A, Rubin EM, Pennacchio LA. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature [Internet]. Nature Publishing Group; 2009 Sep 10 [cited 2012 Nov 6];461(7261):199–205. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nature08451
16.
Pennacchio LA, Bickmore W, Dean A, Nobrega MA, Bejerano G. Enhancers: five essential questions. Nat. Rev. Genet. [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2013 Apr [cited 2014 Mar 24];14(4):288–95. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrg3458
17.
Dixon JR, Selvaraj S, Yue F, Kim A, Li Y, Shen Y, et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2012 May 17 [cited 2014 Mar 19];485(7398):376– 80. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nature11082
18.
Kleinjan D-J, Coutinho P. Cis-ruption mechanisms: disruption of cis-regulatory control as a cause of human genetic disease. Briefings Funct. genomics proteomics [Internet]. Oxford University Press; 2009;8(4):317–32. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19596743
19.
Chatterjee S, Pal JK. Role of 5’- and 3'-untranslated regions of mRNAs in human diseases. Biol. Cell [Internet]. 2009 May [cited 2014 Mar 19];101(5):251–62. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19275763
20.
Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature [Internet]. 2001 Feb 15;409(6822):860–921. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11237011
21.
Kumar CS, Qureshi SF, Ali A, Satyanarayana ML, Rangaraju A, Venkateshwari A, et al. Hidden magicians of genome evolution. Indian J. Med. Res. [Internet]. 2013 Jun [cited 2014 Apr 12];137(6):1052–60. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3734710&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
22.
Belancio VP, Roy-Engel AM, Deininger PL. All y’all need to know 'bout retroelements in cancer. Semin. Cancer Biol. [Internet]. Elsevier Ltd; 2010 Aug [cited 2013 Aug 28];20(4):200–10. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2943028&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
23.
Kreahling J, Graveley BR. The origins and implications of Aluternative splicing. Trends Genet. [Internet]. 2004 Jan;20(1):1–4. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14698612
24.
Shaw MW, Falls HF, Neel J V. Congenital Aniridia. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 1960 Dec [cited 2013 Jul 9];12(4 Pt 1):389–415. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1932171&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
25.
Hingorani M, Hanson I, van Heyningen V. Aniridia. Eur. J. Hum. Genet. [Internet]. 2012 Oct [cited 2013 Jun 24];20(10):1011–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22692063
63
26.
Lee H, Khan R, O’Keefe M. Aniridia: current pathology and management. Acta Ophthalmol. [Internet]. 2008 Nov [cited 2013 May 24];86(7):708–15. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18937825
27.
Kokotas H, Petersen MB. Clinical and molecular aspects of aniridia. Clin. Genet. [Internet]. 2010 May [cited 2013 Jun 23];77(5):409–20. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20132240
28.
Martha A, Ferrell RE, Mintz-Hittner H, Lyons LA, Saunders GF. Paired box mutations in familial and sporadic aniridia predicts truncated aniridia proteins. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 1994 May [cited 2013 Jul 10];54(5):801–11. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1918271&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
29.
Kang Y, Lin Y, Li X, Wu Q, Huang L, Li Q, et al. Mutation analysis of PAX6 in inherited and sporadic aniridia from northeastern China. Mol. Vis. [Internet]. 2012 Jan [cited 2013 Jul 8];18:1750–4. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3398500&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
30.
Gregory-Evans CY, Wallace VA, Gregory-Evans K. Gene networks: dissecting pathways in retinal development and disease. Prog. Retin. Eye Res. [Internet]. 2013 Mar [cited 2014 Mar 21];33:40–66. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1350946212000730
31.
Van Heyningen V, Williamson K a. PAX6 in sensory development. Hum. Mol. Genet. [Internet]. 2002 May 15;11(10):1161–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12015275
32.
Prosser J, van Heyningen V. PAX6 mutations reviewed. Hum. Mutat. [Internet]. 1998 Jan;11(2):93–108. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9482572
33.
Brown a, McKie M, van Heyningen V, Prosser J. The Human PAX6 Mutation Database. Nucleic Acids Res. [Internet]. 1998 Jan 1;26(1):259–64. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=147180&tool=pmcentrez&rendertype=abstra ct
34.
Lim HT, Seo E-J, Kim G-H, Ahn H, Lee H, Shin KH, et al. Comparison between aniridia with and without PAX6 mutations: clinical and molecular analysis in 14 Korean patients with aniridia. Ophthalmology [Internet]. Elsevier Inc.; 2012 Jun [cited 2013 Jul 8];119(6):1258–64. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22361317
35.
Shaham O, Menuchin Y, Farhy C, Ashery-Padan R. Pax6: a multi-level regulator of ocular development. Prog. Retin. Eye Res. [Internet]. Elsevier Ltd; 2012 Sep [cited 2013 Sep 18];31(5):351–76. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22561546
36.
National Center for Biotechnology Information. Pax6 paired box 6 [ Mus musculus (house mouse) ] [Internet]. 2014 [cited 2014 Mar 31]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18508
37.
Ton CC, Hirvonen H, Miwa H, Weil MM, Monaghan P, Jordan T, et al. Positional cloning and characterization of a paired box- and homeobox-containing gene from the aniridia region. Cell [Internet]. 1991 Dec 20 [cited 2013 Jul 11];67(6):1059–74. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1684738
38.
Kim J, Lauderdale JD. Analysis of Pax6 expression using a BAC transgene reveals the presence of a paired-less isoform of Pax6 in the eye and olfactory bulb. Dev. Biol. [Internet]. 2006 [cited 2013 Sep 23];292(2):486–505. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160605009577
64
39.
Kleinjan DA, Seawright A, Mella S, Carr CB, Tyas DA, Simpson TI, et al. Long-range downstream enhancers are essential for Pax6 expression. Dev. Biol. [Internet]. Elsevier; 2006;299(2-5):563–81. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17014839
40.
Elso C, Lu X, Weisner P, Thompson H. A reciprocal translocation dissects roles of Pax6 alternative promoters and upstream regulatory elements in the development of pancreas, brain, and eye. genesis [Internet]. 2013 [cited 2014 Mar 29];17(9):1–17. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dvg.22409/full
41.
LOVD development T. LOVD Gene homepage [Internet]. 2014 [cited 2013 Jul 16]. Available from: http://lsdb.hgu.mrc.ac.uk/home.php?select_db=PAX6
42.
Kleinjan D, Heyningen V Van. Position effect in human genetic disease. Hum. Mol. Genet. 1998;7(10):1611–8.
43.
Lauderdale JD, Wilensky JS, Oliver ER, Walton DS, Glaser T. 3’ deletions cause aniridia by preventing PAX6 gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. [Internet]. 2000 Dec 5 [cited 2013 Jul 9];97(25):13755–9. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=17648&tool=pmcentrez&rendertype=abstrac t
44.
Fantes J, Redeker B, Breen M, Boyle S, Brown J, Fletcher J, et al. Aniridia-associated cytogenetic rearrangements suggest that a position effect may cause the mutant phenotype. Hum. Mol. Genet. [Internet]. 1995 Mar [cited 2013 Jul 9];4(3):415–22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7795596
45.
Kleinjan DA, Seawright A, Schedl A, Quinlan RA, Danes S, Heyningen V Van. Aniridia-associated translocations, DNase hypersensitivity, sequence comparison and transgenic analysis redefine the functional domain of PAX6. 2001;10(19):2049–60.
46.
Lauderdale JD, Wilensky JS, Oliver ER, Walton DS, Glaser T. 3’ deletions cause aniridia by preventing PAX6 gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. [Internet]. 2000 Dec 5 [cited 2014 Mar 29];97(25):13755–9. Available from: http://www.pnas.org/content/97/25/13755.full
47.
Kleinjan D a, Seawright A, Elgar G, van Heyningen V. Characterization of a novel gene adjacent to PAX6, revealing synteny conservation with functional significance. Mamm. Genome [Internet]. 2002 Feb [cited 2013 Aug 14];13(2):102–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11889558
48.
Wawrocka A, Budny B, Debicki S, Jamsheer A, Sowinska A, Krawczynski MR. PAX6 3’ deletion in a family with aniridia. Ophthalmic Genet. [Internet]. 2012 Mar [cited 2013 Jul 8];33(1):44–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21985185
49.
Bhatia S, Bengani H, Fish M, Brown A, Divizia MT, de Marco R, et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 2013 Dec 5 [cited 2014 Mar 28];93(6):1126–34. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002929713005156
50.
Hingorani M, Williamson K a, Moore AT, van Heyningen V. Detailed ophthalmologic evaluation of 43 individuals with PAX6 mutations. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. [Internet]. 2009 Jun [cited 2013 Jul 9];50(6):2581–90. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218613
51.
Li Y, Li Y, Liu Y, Xie P, Li F, Li G. PAX6, a Novel Target of microRNA-7, Promotes Cellular Proliferation and Invasion in Human Colorectal Cancer Cells. Dig. Dis. Sci. [Internet]. 2014 Mar [cited 2014 Mar 29];59(3):598–606. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24185687
52.
Verdin H, De Baere E. FOXL2 impairment in human disease. Horm. Res. pædiatrics [Internet]. Karger Publishers; 2012 Jan 12 [cited 2013 Jul 2];77(1):2–11. Available from: http://www.karger.com/Article/FullText/335236
65
53.
US National Library of Medicine. FOXL2 - forkhead box L2 [Internet]. 2014 [cited 2014 Apr 3]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/FOXL2
54.
Cocquet J, De Baere E, Gareil M, Pannetier M, Xia X, Fellous M, et al. Structure, evolution and expression of the FOXL2 transcription unit. Cytogenet. Genome Res. [Internet]. Karger Publishers; 2003 Jan 17 [cited 2014 Mar 6];101(3-4):206–11. Available from: http://www.karger.com/Article/FullText/74338
55.
Beysen D, Raes J, Leroy BP, Lucassen A, Yates JRW, Clayton-Smith J, et al. Deletions involving longrange conserved nongenic sequences upstream and downstream of FOXL2 as a novel disease-causing mechanism in blepharophimosis syndrome. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 2005 Aug [cited 2013 Jul 8];77(2):205–18. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1224524&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
56.
Baron D, Batista F, Chaffaux S, Cocquet J, Cotinot C, Cribiu E, et al. Foxl2 gene and the development of the ovary: a story about goat, mouse, fish and woman. Reprod. Nutr. Dev. [Internet]. EDP Sciences; 2005 Jan 1 [cited 2014 Mar 15];45(3):377–82. Available from: http://dx.doi.org/10.1051/rnd:2005028
57.
Shi F, Ding S, Zhao S, Han M, Zhuang Y, Xu T, et al. A piggyBac insertion disrupts Foxl2 expression that mimics BPES syndrome in mice. Hum. Mol. Genet. [Internet]. 2014 Mar 5 [cited 2014 Apr 12];ddu092–. Available from: http://hmg.oxfordjournals.org/content/early/2014/03/05/hmg.ddu092.long
58.
Beysen D, De Paepe A, De Baere E. FOXL2 mutations and genomic rearrangements in BPES. Hum. Mutat. [Internet]. 2009 Feb [cited 2013 Jul 2];30(2):158–69. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18726931
59.
De Baere E, Beysen D, Oley C, Lorenz B, Cocquet J, De Sutter P, et al. FOXL2 and BPES: mutational hotspots, phenotypic variability, and revision of the genotype-phenotype correlation. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 2003 Feb [cited 2014 Feb 22];72(2):478–87. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=379240&tool=pmcentrez&rendertype=abstra ct
60.
Crisponi L, Uda M, Deiana M, Loi A, Nagaraja R, Chiappe F, et al. FOXL2 inactivation by a translocation 171 kb away: analysis of 500 kb of chromosome 3 for candidate long-range regulatory sequences. Genomics [Internet]. 2004 May [cited 2014 Feb 4];83(5):757–64. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15081106
61.
De Baere E, Van Roy N, Speleman F, Fukushima Y, De Paepe A, Messiaen L. Closing in on the BPES gene on 3q23: mapping of a de Novo reciprocal translocation t(3;4)(q23;p15.2) breakpoint within a 45kb cosmid and mapping of three candidate genes, RBP1, RBP2, and beta’-COP, distal to the breakpoint. Genomics [Internet]. 1999 Apr 1 [cited 2014 Mar 15];57(1):70–8. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0888754399957476
62.
Praphanphoj V, Goodman BK, Thomas GH, Niel KM, Toomes C, Dixon MJ, et al. Molecular cytogenetic evaluation in a patient with a translocation (3;21) associated with blepharophimosis, ptosis, epicanthus inversus syndrome (BPES). Genomics [Internet]. 2000 Apr 1 [cited 2014 Mar 15];65(1):67– 9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10777667
63.
Crisponi L, Deiana M, Loi A, Chiappe F, Uda M, Amati P, et al. The putative forkhead transcription factor FOXL2 is mutated in blepharophimosis/ptosis/epicanthus inversus syndrome. Nat. Genet. [Internet]. 2001 Feb [cited 2014 Feb 22];27(2):159–66. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11175783
64.
D’haene B, Attanasio C, Beysen D, Dostie J, Lemire E, Bouchard P, et al. Disease-causing 7.4 kb cisregulatory deletion disrupting conserved non-coding sequences and their interaction with the FOXL2 promotor: implications for mutation screening. Horwitz MS, editor. PLoS Genet. [Internet]. Public Library of Science; 2009 Jun [cited 2014 Feb 22];5(6):e1000522. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pgen.1000522
66
65.
Loffler KA, Combes AN, Wilhelm D, Beverdam A, Bowles J, Koopman P. Pisrt1, a gene implicated in XX sex reversal, is expressed in gonads of both sexes during mouse development. Mol. Genet. Metab. [Internet]. 2005 Jan [cited 2014 Mar 6];86(1-2):286–92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096719205002131
66.
Ratnapriya R, Chew EY. Age-related macular degeneration-clinical review and genetics update. Clin. Genet. [Internet]. 2013 Aug [cited 2013 Nov 11];84(2):160–6. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3732788&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
67.
Khaw P, Shah P, Elkington A. ABC of Eyes. 4th editio. London: BMJ books; 2004. p. 93.
68.
Klettner A, Kauppinen A, Blasiak J, Roider J, Salminen A, Kaarniranta K. Cellular and molecular mechanisms of age-related macular degeneration: From impaired autophagy to neovascularization. Int. J. Biochem. Cell Biol. [Internet]. 2013 [cited 2013 Nov 6];45(7):1457–67. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1357272513001180
69.
Ambati J, Fowler BJ. Mechanisms of Age-Related Macular Degeneration. Neuron [Internet]. 2012 [cited 2013 Nov 6];75(1):26–39. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627312005806
70.
Ambati J, Atkinson JP, Gelfand BD. Immunology of age-related macular degeneration. Nat. Rev. Immunol. [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2013 Jun [cited 2013 Nov 6];13(6):438–51. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nri3459
71.
Campbell M, Doyle SL. An eye on the future of inflammasomes and drug development in AMD. J. Mol. Med. (Berl). [Internet]. 2013 Sep [cited 2013 Nov 6];91(9):1059–70. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23661041
72.
Cooke Bailey JN, Sobrin L, Pericak-Vance M a, Haines JL, Hammond CJ, Wiggs JL. Advances in the genomics of common eye diseases. Hum. Mol. Genet. [Internet]. 2013 Aug 23 [cited 2013 Aug 28];1–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23962718
73.
Kaneko H, Dridi S, Tarallo V, Gelfand BD, Fowler BJ, Karikó K, et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. 2011;471(7338):325–30.
74.
Kaneko H, Dridi S, Tarallo V, Gelfand BD, Fowler BJ, Cho WG, et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2011 Mar 17 [cited 2013 Nov 14];471(7338):325–30. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nature09830
75.
Meister G. Vision: Dicer leaps into view. Nature [Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.; 2011 Mar 17 [cited 2014 Mar 4];471(7338):308–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/471308a
76.
Tarallo V, Hirano Y, Gelfand BD, Dridi S, Kerur N, Kim Y, et al. DICER1 loss and Alu RNA induce age-related macular degeneration via the NLRP3 inflammasome and MyD88. Cell [Internet]. 2012 May 11 [cited 2013 Aug 23];149(4):847–59. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3351582&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
77.
Kaplan J. Leber congenital amaurosis: from darkness to spotlight. Ophthalmic Genet. [Internet]. Informa UK Ltd UK; 2008 Sep 8 [cited 2014 Mar 8];29(3):92–8. Available from: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1080/13816810802232768
78.
US National Library of Medicine. Leber congenital amaurosis [Internet]. 2014 [cited 2013 Apr 13]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/leber-congenital-amaurosis
67
79.
Stephen P. Daiger. Retnet: retinal information network [Internet]. 2014 [cited 2014 Apr 10]. Available from: https://sph.uth.edu/retnet/sum-dis.htm#B-diseases
80.
Den Hollander AI, Roepman R, Koenekoop RK, Cremers FPM. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Prog. Retin. Eye Res. [Internet]. 2008 Jul [cited 2014 Feb 11];27(4):391–419. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1350946208000360
81.
Garanto A, van Beersum SEC, Peters TA, Roepman R, Cremers FPM, Collin RWJ. Unexpected CEP290 mRNA splicing in a humanized knock-in mouse model for Leber congenital amaurosis. PLoS One [Internet]. 2013 Jan [cited 2014 Mar 8];8(11):e79369. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3819269&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
82.
Gerard X, Perrault I, Hanein S, Silva E, Bigot K, Defoort-Delhemmes S, et al. AON-mediated Exon Skipping Restores Ciliation in Fibroblasts Harboring the Common Leber Congenital Amaurosis CEP290 Mutation. Mol. Ther. Nucleic Acids [Internet]. 2012 Jan [cited 2014 Mar 8];1:e29. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3390222&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
83.
US National Library of Medicine. CEP290 [Internet]. 2014 [cited 2013 Apr 13]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/CEP290
84.
Perrault I, Delphin N, Hanein S, Gerber S, Dufier J-L, Roche O, et al. Spectrum of NPHP6/CEP290 mutations in Leber congenital amaurosis and delineation of the associated phenotype. Hum. Mutat. [Internet]. 2007 Apr [cited 2014 Mar 13];28(4):416. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17345604
85.
Valente EM, Brancati F, Dallapiccola B. Genotypes and phenotypes of Joubert syndrome and related disorders. Eur. J. Med. Genet. [Internet]. 2008 Jan [cited 2014 Mar 31];51(1):1–23. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S176972120700119X
86.
Den Hollander AI, Koenekoop RK, Yzer S, Lopez I, Arends ML, Voesenek KEJ, et al. Mutations in the CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 2006 Sep [cited 2014 Mar 8];79(3):556–61. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002929707627554
87.
Coppieters F, Lefever S, Leroy BP, De Baere E. CEP290, a gene with many faces: mutation overview and presentation of CEP290base. Hum. Mutat. [Internet]. 2010 Oct [cited 2013 Jun 21];31(10):1097– 108. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20690115
88.
Spitali P, Aartsma-Rus A. Splice modulating therapies for human disease. Cell [Internet]. 2012 Mar 16 [cited 2014 Feb 3];148(6):1085–8. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867412002140
89.
Collin RW, den Hollander AI, van der Velde-Visser SD, Bennicelli J, Bennett J, Cremers FP. Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Mol. Ther. Nucleic Acids [Internet]. American Society of Gene & Cell Therapy; 2012 Jan 27 [cited 2014 Apr 1];1:e14. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/mtna.2012.3
90.
Edwards M, McGhee CN, Dean S. The genetics of keratoconus. Clin. Exp. Ophthalmol. [Internet]. 2001 Dec [cited 2013 Dec 12];29(6):345–51. Available from: http://doi.wiley.com/10.1046/j.14429071.2001.d01-16.x
91.
Global Keratoconus Foundation. Keratoconus [Internet]. 2014 [cited 2013 Dec 11]. Available from: http://kcglobal.org/content/view/14/26/
68
92.
Burdon KP, Vincent AL. Insights into keratoconus from a genetic perspective. Clin. Exp. Optom. [Internet]. 2013 Mar [cited 2013 Nov 25];96(2):146–54. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23387289
93.
Hughes AE, Bradley DT, Campbell M, Lechner J, Dash DP, Simpson DA, et al. Mutation Altering the miR-184 Seed Region Causes Familial Keratoconus with Cataract [Internet]. Am. J. Hum. Genet. 2011 [cited 2013 Nov 25]. p. 628–33. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002929711004046
94.
Hughes AE. Familial Keratoconus with Cataract: Linkage to the Long Arm of Chromosome 15 and Exclusion of Candidate Genes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. [Internet]. 2003 Dec 1 [cited 2014 Mar 2];44(12):5063–6. Available from: http://www.iovs.org/content/44/12/5063.long
95.
Yu J, Ryan DG, Getsios S, Oliveira-Fernandes M, Fatima A, Lavker RM. MicroRNA-184 antagonizes microRNA-205 to maintain SHIP2 levels in epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. [Internet]. 2008 Dec 9 [cited 2014 Mar 2];105(49):19300–5. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2587229&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act
96.
US National Library of Medicine. INPPL1 [Internet]. 2014 [cited 2014 Apr 4]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/INPPL1
97.
Yu J, Ryan DG, Getsios S, Oliveira-Fernandes M, Fatima A, Lavker RM. MicroRNA-184 antagonizes microRNA-205 to maintain SHIP2 levels in epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. [Internet]. 2008 Dec 9 [cited 2013 Dec 11];105(49):19300–5. Available from: http://www.pnas.org/content/105/49/19300
98.
Wilson SE, Chaurasia SS, Medeiros FW. Apoptosis in the initiation, modulation and termination of the corneal wound healing response. Exp. Eye Res. [Internet]. 2007 [cited 2013 Dec 20];85(3):305–11. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014483507001662
99.
Ryan DG, Oliveira-Fernandes M, Lavker RM. MicroRNAs of the mammalian eye display distinct and overlapping tissue specificity. Mol. Vis. [Internet]. 2006 Jan [cited 2014 Mar 1];12:1175–84. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17102797
100.
Metlapally R, Gonzalez P, Hawthorne FA, Tran-Viet K-N, Wildsoet CF, Young TL. Scleral Micro-RNA Signatures in Adult and Fetal Eyes. Lewin A, editor. PLoS One [Internet]. Public Library of Science; 2013 Jan [cited 2013 Dec 1];8(10):e78984. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0078984
101.
Conte I, Banfi S, Bovolenta P. Non-coding RNAs in the development of sensory organs and related diseases. Cell. Mol. Life Sci. [Internet]. 2013 Nov [cited 2013 Nov 17];70(21):4141–55. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23588489
102.
O’Neill M. OMIM MIR184 [Internet]. OMIM. 2012 [cited 2014 Apr 10]. Available from: http://omim.org/entry/613146
103.
Sturm RA, Frudakis TN. Eye colour: portals into pigmentation genes and ancestry. Trends Genet. [Internet]. 2004 Aug [cited 2014 Feb 3];20(8):327–32. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168952504001593
104.
White D, Rabago-Smith M. Genotype-phenotype associations and human eye color. J. Hum. Genet. [Internet]. 2011 Jan [cited 2014 Jan 22];56(1):5–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20944644
105.
Zhu G, Evans DM, Duffy DL, Montgomery GW, Medland SE, Gillespie NA, et al. A Genome Scan for Eye Color in 502 Twin Families: Most Variation is due to a QTL on Chromosome 15q. Twin Res.
69
[Internet]. Cambridge University Press; 2004 Feb 21 [cited 2014 Feb 14];7(02):197–210. Available from: http://journals.cambridge.org/abstract_S1369052300004475 106.
Visser M, Kayser M, Grosveld F, Palstra R-J. Genetic variation in regulatory DNA elements: The case of OCA2 transcriptional regulation. Pigment Cell Melanoma Res. [Internet]. 2014 Jan 4 [cited 2014 Feb 11]; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24387780
107.
Duffy DL, Montgomery GW, Chen W, Zhao ZZ, Le L, James MR, et al. A three-single-nucleotide polymorphism haplotype in intron 1 of OCA2 explains most human eye-color variation. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 2007 Feb [cited 2014 Feb 12];80(2):241–52. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002929707626822
108.
Sturm RA, Duffy DL, Zhao ZZ, Leite FPN, Stark MS, Hayward NK, et al. A single SNP in an evolutionary conserved region within intron 86 of the HERC2 gene determines human blue-brown eye color. Am. J. Hum. Genet. [Internet]. 2008 Feb [cited 2014 Feb 11];82(2):424–31. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002929707000407
109.
Eiberg H, Troelsen J, Nielsen M, Mikkelsen A, Mengel-From J, Kjaer KW, et al. Blue eye color in humans may be caused by a perfectly associated founder mutation in a regulatory element located within the HERC2 gene inhibiting OCA2 expression. Hum. Genet. [Internet]. 2008 Mar [cited 2014 Jan 22];123(2):177–87. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18172690
110.
Visser M, Kayser M, Palstra R-J. HERC2 rs12913832 modulates human pigmentation by attenuating chromatin-loop formation between a long-range enhancer and the OCA2 promoter. Genome Res. [Internet]. 2012 Mar 1 [cited 2014 Feb 11];22(3):446–55. Available from: http://genome.cshlp.org/content/22/3/446
111.
Cook AL, Chen W, Thurber AE, Smit DJ, Smith AG, Bladen TG, et al. Analysis of cultured human melanocytes based on polymorphisms within the SLC45A2/MATP, SLC24A5/NCKX5, and OCA2/P loci. J. Invest. Dermatol. [Internet]. The Society for Investigative Dermatology, Inc; 2009 Feb 24 [cited 2014 Feb 13];129(2):392–405. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/jid.2008.211
112.
Liu F, Wen B, Kayser M. Colorful DNA polymorphisms in humans. Semin. Cell Dev. Biol. [Internet]. Elsevier Ltd; 2013 [cited 2014 Feb 16];24(6-7):562–75. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23587773
113.
Liu F, van Duijn K, Vingerling JR, Hofman A, Uitterlinden AG, Janssens ACJW, et al. Eye color and the prediction of complex phenotypes from genotypes. Curr. Biol. [Internet]. 2009 Mar 10 [cited 2014 Feb 13];19(5):R192–3. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982209005971
114.
Walsh S, Liu F, Ballantyne KN, van Oven M, Lao O, Kayser M. IrisPlex: a sensitive DNA tool for accurate prediction of blue and brown eye colour in the absence of ancestry information. Forensic Sci. Int. Genet. [Internet]. 2011 Jun [cited 2014 Feb 11];5(3):170–80. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1872497310000323
115.
Walsh S, Liu F, Wollstein A, Kovatsi L, Ralf A, Kosiniak-Kamysz A, et al. The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA. Forensic Sci. Int. Genet. [Internet]. 2013 Jan [cited 2014 Jan 23];7(1):98–115. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1872497312001810
116.
Suzuki I, Kato T, Motokawa T, Tomita Y, Nakamura E, Katagiri T. Increase of pro-opiomelanocortin mRNA prior to tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, dopachrome tautomerase, Pmel-17/gp100, and Pprotein mRNA in human skin after ultraviolet B irradiation. J. Invest. Dermatol. [Internet]. 2002 Jan [cited 2014 Apr 13];118(1):73–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1046/j.1523-1747.2002.01647.x
117.
Hirobe T. How are proliferation and differentiation of melanocytes regulated? Pigment Cell Melanoma Res. [Internet]. 2011 Jun [cited 2014 Apr 1];24(3):462–78. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21375698
70
118.
US National Library of Medicine. Senior-Løken syndrome [Internet]. 2014 [cited 2014 Mar 31]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/senior-loken-syndrome
119.
US National Library of Medicine. Joubert syndrome [Internet]. 2014 [cited 2014 Mar 31]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/joubert-syndrome
120.
Vermeer AMC, Brouns-van Engelen M. Bardet-Biedl syndroom [Internet]. 2014 [cited 2014 Mar 31]. Available from: http://www.erfelijkheid.nl/content/bardet-biedl-syndroom
121.
US National Library of Medicine. Meckel syndrome [Internet]. 2014 [cited 2014 Mar 31]. Available from: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/meckel-syndrome
71
72
BIJLAGEN Bijlage 1. Tabel met de omschrijving van diep intronische mutaties van het PAX6 gen door Hingorani et al (50).
Bijlage 2. De retinale opbouw: de gezonde toestand vergeleken met de staat bij AMD (70)
De retinale opbouw: de gezonde toestand vergeleken met de staat bij AMD (70) a) De retina is opgebouwd uit verschillende lagen. Van anterieur naar posterieur zien we de ganglioncellaag, de retinale microglia, de bipolaire cellaag, de horizontale cellaag, de fotoreceptoren, het retinal pigmented epithelium, de membraan van Bruch en het choroidaal vasculair netwerk. De macula is een dense verzameling van fotoreceptoren op de retina en is verantwoordelijk voor ons scherp zicht. b) Deze doorsnede van het humane oog toont het focusseren van licht op de macula. c) Vroege AMD is geassocieerd met een accumulatie van drusen en microglia, choroidale macrofagen en een verdikte membraan van Bruch. d) Geografische atrofie wordt gekenmerkt door samenvloeiende regio’s van fotoreceptordegeneratie en constrictie van choroidale bloedvaten. e) Neovasculaire AMD gaat gepaard met de invasie van de retina door abnormale, lekkende choroidale bloedvaten en macrofagen die doorheen de membraan van Bruch breken. Dit leidt tot fotoreceptordegeneratie.
