PROTEINY ( = BÍLKOVINY) DNA RNA protein modifikovaný protein

PROTEINY ( = BÍLKOVINY)

DNA → RNA → protein → modifikovaný protein

- více než 50 % buněčné sušiny organismů

-chemicky se jedná o biopolymery složené z jednoho nebo více lineárních polypeptidových řetězců, obsahujících obvykle 100 až 2 000 aminokyselinových zbytků (kódovaných AK)

-

není obecná klasifikace; lze je rozdělovat např. podle: -specifické funkce -chemického složení -tvaru a rozpustnosti molekul -lokalizace v organismu

Funkce (rozmanité)

-strukturní -obranná (protilátky)

-transportní -zásobní

-katalytickou -regulační

-pohybová (myosin a aktin ve svalových vláknech)

Chemické složení • Jednoduché • Složené - polypeptidová + neproteinová část

Složené: • metaloproteiny • fosfoproteiny • glykoproteiny • lipoproteiny • nukleoproteiny

DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY -globulární - albuminy (rozp. ve vodě) - globuliny (rozp. v roztocích solí) -fibrilární -membránové

DĚLENÍ PODLE LOKLAIZACE V ORGANISMU -intracelulární (vnitrobuněčné) a extracelulární (mimobuněčné) -bílkoviny krevní plasmy (též plasmové, plasmatické nebo sérové proteiny)

Vznik peptidové vazby Zjednodušené schema – níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč?

+

H3N

CH R1

COO-

+

+

H3N

CH R2

COO-

+

H3N

CH C R1

NH CH COO-

O

R2

Polypeptidový řetězec (peptidy, proteiny) DNA → RNA → protein → modifikovaný protein Syntéza proteinů animace: http://www.youtube.com/watch?v=PEDQoQuIhkg

Úrovně struktur -primární struktura - pořadí zbytků aminokyselinových zbytků v lineárním polypeptidovém řetězci -sekundární struktura popisuje prostorové vztahy sousedních nebo blízkých aminokyselinových zbytků -terciární struktura - prostorové vztahy vzdálených částí řetězce a tím i celkový tvar molekuly -kvarterní struktura popisuje vzájemné uspořádání více polypeptidových řetězců; řada bílkovin není tvořena jediným řetězcem, složeným do definované terciární struktury; často jde o oligomery tvořené jedním nebo několika typy tzv. podjednotek

Struktury bílkovin

Primární struktura bílkovin ( + kovalentní) pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci (kódováno v DNA)

Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) 1 - 3: jednoduché bílkoviny 4 - 8: složené bílkoviny

Lze pohlížet jako na text

>gi|307229470|ref|ZP_07515881.1| putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTP NIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKDVALGRNELT IANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDN AKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVA FTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTGEYYANISYL DAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDN LWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPVYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESL VPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKT DRFETINQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG

URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ

AK1-AK2-AK3 ....AKn  kyselá nebo bazická hydrolysa  AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn

(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny chromatografické dělení)

Určení N-koncové a C-koncové aminokyseliny N-koncové: – Sangerova metoda; reakce s DNF (viz reakce AK)

C-koncové: -specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy) -redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu

Určování sekvence – Edmanovo odbourávání

- zbylý polypeptidový řetězec zůstane neporušen (rozdíl proti využití totální hydrolýzy při Sangerově metodě – jen N-koncová AK); lze tedy opakovat a přímo „číst“ pořadí AK; princip automatických sekvenátorů – až několik desítek AK

Určování primární struktury • Určení počtu polypeptidových řetězců v proteinu;

• Rozštěpení disulfidových vazeb mezi řetězci a uvnitř polypeptidových řetězců; • Izolace jednotlivých řetězců;

• Vícenásobné specifické štěpení polypeptidových řetězců na kratší fragmenty; • Určení pořadí aminokyselin v těchto fragmentech; • Sestavení primární struktury polypeptidů; • Určení původního propojení polypeptidových řetězců.

Pozn. Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie

Určování primární stuktury

Prostorové uspořádání biopolymerů (obecné znaky) 1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. 2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

Stabilizace struktury bílkovin – nekovalentní interakce *Vazebná

Příklad

Typ interakce

energie

(kJ/mol)

vodíkové vazby: voda (led)

-O-H...O=

17

„peptidové vazby“ (můstky H…O)

=N-H...O=C

15

neutrální a nabitá skupina

-COO-...HO-CH2-

15

elektrostatické interakce ion-ion

-COO-...+H3N-

permanentní dipól - permanentní dipól

Londonovy dispersní interakce patrové interakce

hydrofobní interakce

| | d+ dC =O ...Cd+=Od| |

20-30

2

mezi dvěma alifatickými atomy C mezi dvěma aromatickými kruhy Phe

0,11

mezi dvěma methylovými skupinami

1,2

mezi dvěma postranními

6

6

Hydrofobní interakce

Sekundární struktura - popisuje prostorové uspořádání sousedních nebo blízkých částí polypeptidového řetězce

•

konformace polypeptidového řetězce je definována torzními úhly vazby Cα-N (φ) a vazby Cα- C (ψ) - hodnota těchto úhlů je definována jako 180° v případě, že je řetězec v rovinné, plně rozvinuté konformaci a klesá až k hodnotě –180° (přetočení „na druhou stranu“). Volná rotace je omezena sterickými zábranami mezi atomy vlastní kostry polypeptidového řetězce a sterickou náročností postranních řetězců aminokyselin; rotační úhly mohou tedy nabývat jen určitých hodnot

stereotypní opakování struktury –NH-CHR-CO=> tendence k tvorbě periodických prostorových struktur Základní typy: α-šroubovice β-struktury α-šroubovice charakterizovány parametry: výškou závitu, směrem otáčení (levotočivé a pravotočivé) a počtem aminokyselinových zbytků nebo počtem atomů na jednu otáčku šroubovice.

Sekundární struktury bílkovin

V proteinech časo - pravotočivá šroubovice označovaná jako αhelix, která je charakterizována výškou závitu 0,54 nm a 3,6 aminokyselinového zbytku (resp. 11 atomy) na jeden závit - stabilizován vnitrořetězcovými vodíkovými můstky, které se vytvářejí podél osy šroubovice mezi nad sebou ležícími CO a NH skupinami.

β-struktura - další časté periodické uspořádání polypeptidového řetězce -bývá stabilizována propojením s antiparalelně (častěji) či paralelně probíhajícím polypeptidovým řetězcem stejné konformace, s nímž je spojen maximálním možným počtem meziřetězcových vodíkových můstků. Tak vznikají struktury zvané β-skládaný list (angl. β-pleated sheet). Jejich plocha bývá různým způsobem zakřivena (tzv. twisted sheet) nebo může tvořit válec (tzv. β-barrel)

Antiparalelní β-struktura polypeptidového řetězce

Periodické sekundární struktury – zastoupeny v proteinech různou měrou, od několika procent až po desítky procent z celkové struktury. Mezi těmito útvary se řetězec otáčí zpět, někdy až o 180º. Tyto ostré změny směru, umožněné určitými sekvencemi aminokyselin, bývají označovány jako β-ohyby, (angl. β-bend nebo β-turn), protože často propojují β-struktury. Jsou tvořeny čtyřmi aminokyselinovými zbytky, často se v nich vyskytuje prolin a glycin. Jsou charakteristické pro globulární bílkoviny, zajišťují jejich sférický tvar.

Supersekundární struktury např.: Zn-prst, Leu Zip

Alfa helixy v hemoglobinu

Terciární struktura proteinů -popisuje uspořádání celého polypeptidového řetězce a tedy i celkový tvar molekuly.

Terciární struktura myoglobinu

Kvarterní struktura

Příklady bílkovin s kvarterní strukturou Bílkovina

Rel.mol.hm. oligomeru

Počet podjednotek Charakter, funkce

hemoglobin (lidský)

64 500

4

2 + 2 podjednotky dvou typů (a2b2 tetramer), přenos kyslíku

α-amylasa (lidská)

97 600

2

identické podjednotky, enzym (hydrolytické štěpení škrobu)

alkoholdehydrogenasa (kvasinky)

150 000

4

identické podj., enzym (katalysuje redukci acetaldehydu na ethanol)

ferritin (lidský)

480 000

20

skladování železitých iontů (až 4300 Fe3+)

glutaminsynthetasa (E.coli)

592 000

12

enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité identické podj. tvoří 2 šestiúhelníky umístěné nad sebou

pyruvátdekarboxylasa (E.coli)

4 400 000

72

enzymový komplex, podjednotky 3 typů, každá katalysuje jednu dílčí reakci (odd. 9.2)

hemocyanin (plži)

8 000 000

160

metalloprotein obsahující Cu2+; přenos O2; dutý válec 40x40 nm

virus tabákové mozaiky

39 300 000

2130

helikálně uspořádané identické podj. (Mr 17 500) tvořící komplex s RNA

Svinování proteinů (folding) - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně - při skládání některých proteinů, zejména bílkovin s kvarterní strukturou, asistují v buňkách bílkoviny označované jako chaperony

a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů

Vlastnosti proteinů

• Nábojové vlastnosti

• Rozpustnost - v závislosti na pH, iontové síle • Denaturace - ztráta nativní konformace

• Kooperativita (denaturační přechod) •Optické

Rozpustnost proteinů - v závislosti iontové síle

Kooperativita -důsledky pro vlastnosti biopolymerů Molekula reaguje na podněty z vnějšího prostředí jako celek; to znamená, že konformační impuls, vyvolaný v jedné části molekuly, může vyvolat celý řetězec následků, jež končí konformační změnou v jiné, prostorově vzdálené části molekuly

Sigmoidní charakter - náhlý přechod mezi nativním a denaturovaným stavem je důsledkem kooperativity nativní struktury -př. fosforylace enzymů

OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: -peptidová vazba (200 – 220 nm) -aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm ( pro srov. DNA cca 260 nm)

Abs. spektra lidského sérového albuminu (1), lidského imunoglobulinu G (2) a DNA (3) v ultrafialové oblasti. Koncentrace obou bílkovin je 1 mg/ml, koncentrace DNA 0,1 mg/ml

Vztah struktury a funkce vybraných proteinů Keratiny (ř. keras roh) - významná skupina fibrilárních bílkovin; podílejí se na výstavbě intermediárních filament cytoskeletu vlasů, chlupů, nehtů, rohů a peří; nerozpustné ve vodě a odolné vůči fyzikálním i chemickým vlivům. Hlavní skupina - α-keratiny - struktura je tvořena α -helixem; dvě tyto šroubovice se pak stáčejí do levotočivého „kabelu“ (tzv. coiled-coil), jejichž dvojice vytváří protofilamentum a osmice intermediární filamentum cytoskeletu

Imunoglobuliny (Ig) - globulární glykoproteiny krevního séra. Molekula připomíná tvarem písmeno Y; na jeho horních ramenech jsou lokalizovány oblasti, které nekovalentně váží antigeny; pro svojí velkou strukturní různorodost se označují jako variabilní.

Svalové kontrakce - aktin, myosin a tropomyosin

Membránové proteiny

Hemoglobin

Kovalentní modifikace proteinů

aneb translací to nekončí

translací to nekončí

DNA → RNA → protein → modifikovaný protein

Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů?  Ano. Nejedná se jen o „kosmetické“ změny  Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)

Čím jsou determinovány možné kovalentní modifikace?

 typem, pořadím a prostorovou lokalizací aminokyselinových zbytků  aparátem enzymů realizujících modifikace

KOVALENTNÍ MODIFIKACE (enzymové i neenzymové)

IN VITRO

IN VIVO

VRATNÉ

NEVRATNÉ

PŘIROZENÉ

UMĚLÉ

1. Posttranslační modifikace  role v řadě různých buněčných procesů  svinování proteinů

 stabilizace prostorové struktury proteinů  lokalizace proteinů v buňce  přenos signálu  exprese genů  regulace aktivity enzymů  mezibuněčné interakce

Příklady posttranslačních modifikací Fosforylace  vratná modifikace (kinasy / fosfatasy)  obvykle na –OH skupinách zbytků serinu, threoninu, tyrosinu

 významný regulační prvek:  aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována fosforylací na zbytku serinu v pozici 14

 regulace transkripce  role při přenosu signálu

Regulace transkripce fosforylací  CREB (cAMP - responsive element binding protein) – transkripční faktor  fosforylace na serin 133 → asociace s CBP; (CREB binding protein) → CREB –CBP komplex aktivuje CREB dependentní transkripci mj. i remodelací chromatinu acetylací histonů

Glykosylace  připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny  role glykosylace:  často nutná pro správné svinutí proteinu  stabilizace proteinu  regulace

 rozpoznávání  molekulové  mezibuněčné

 obrovská variabilita – řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby

Místa připojení sacharidů na protein  (N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů  (O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny  (C) (přes tryptofan)  (P) (fosfothreonin, fosfoserin)

Mechanismus glykosylace na asparagin

dolichol

Regulace transkripce glykosylací  glykosylace CREBu „brzda“ transkripce - působí opačně než fosforylace  modifikován serin a threonin N- acetylglukosaminem

Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné interakce proteinů

 Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů

 Acylace – připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu

farnesylace

Modifikace proteinu jiným proteinem - proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům lysinu jiného proteinu  Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein)

 SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem, regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď na stres

Acetylace - obvyklá na N – koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován

Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou

acetylace

Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K)

Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mono- nebo dimethylován

methylace

Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII  schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku

Sulfatace – různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein – protein interakce) Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin

Vytvoření disulfidových vazeb

- typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po svinutí proteinu do (téměř) finální podoby

Aktivace zymogenů - odštěpením sekvence, která kryje jejich aktivní centrum - proteasy (chymotrypsin, trypsin, trombin)

2. Enzymová modifikace (in vitro) Defosforylace kaseinů ve zrajících sýrech (fosfatasa)  vliv na štěpení a následně chuťové vlastnosti sýrů; vstřebávání vápníku

 možnost ovlivnění procesu (přídavek fosfatasy)

3. Neenzymové modifikace (in vivo i in vitro) Oxidativní poškození  působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species) vodíku (H2O2), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O2−. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO3− ; vznik: H2O2 + NO2− → ONOO− + H2O),

 oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze oxidovaných zbytků zpět na methionin oxidace methioninu

 chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku

Glykace  navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo)  na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově

 Příklady:  in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách) obsahujících jak proteiny, tak sacharidy  in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace

4. Umělé modifikace proteinů Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek  ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys  iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification)

Kovalentní imobilizace enzymů  možnost opakovaného použití  stabilizace enzymu  vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho autokatalytickými

produkty (proteasy)

Eupergit C  kopolymer vážící proteiny přes oxiranové skupiny reakcí s -NH2 s volnými skupinami zbytků lysinu  více bodové kovalentní připojení → stabilizace

 vysoká stabilita při pH 1 až 12  penicilin amidasa na Eupergitu C - 60% původní aktivity po 800 cyklech

Význam kovalentních modifikací proteinů  pro funkci živých organismů (setkání s medvědem)  v potravinářství (výroba sýrů)

 biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů)  diagnostické metody v medicíně (glykace)  proteomika (kvantifikace proteinů)