Bílkoviny (=proteiny) (vztah struktury a funkce) DNA RNA protein modifikovaný protein

Bílkoviny (=proteiny) (vztah struktury a funkce) DNA → RNA → protein → modifikovaný protein

Chemické složení • Jednoduché • Složené - polypeptidová + neproteinová část Složené: • metaloproteiny • fosfoproteiny • glykoproteiny • lipoproteiny

• nukleoproteiny

BÍLKOVINY = PROTEINY , ·

Kde je hranice mezi bílkovinami a (poly)peptidy?

DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY globulární - albuminy (rozp. ve vodě) - globuliny (rozp. v roztocích solí) fibrilární membránové

Vznik peptidové vazby Zjednodušené schema – níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč?

+

H3N

CH R1

COO-

+

+

H3N

CH

COO-

R2

+

H3N

CH C R1

Peptidy 2 – několik desítek AK

O

NH CH COOR2

Úrovně struktur

Struktury bílkovin

Struktury bílkovin

Primární struktura bílkovin ( + kovalentní) pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci (kódováno v DNA)

Lze pohlížet jako na text >gi|307229470|ref|ZP_07515881.1| putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQI VKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKD VALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLV NTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVV NWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYG DWADKPWRGTGEYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVT REARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPV YGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQ DDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETINQIGKNPDIEKQMY GKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG

Určování primární struktury (aminokyselinové složení) 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. Dvě nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců 8. Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie

Určení N-koncové aminokyseliny

Určení C-koncové aminokyseliny

• Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy)

• Redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu

Princip petidového mapování

Určování primární stuktury

I. Štěpení proteinu(ů)

(malá variabilita; volba enzymu, reakčních podmínek)

II. Analýza vzniklých peptidových fragmentů

1. Chromatografické a elektroforetické metody

2. Hmotnostní spektrometrie na principu MALDI-TOF

(značná variabilita) 3. Hmotnostní spektrometrie na principu LC-MS/MS

Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) 1 - 3: jednoduché bílkoviny 4 - 8: složené bílkoviny

Konformace peptidového řetězce

Typy nekovalentních interakcí uplatňujících se v živých systémech

Střední hodnota energie vazby C - H v molekule methanu je 416 kJ.mol-1. ** Pro prostředí s hodnotou relativní permitivity 4, přibližně odpovídající nepolárnímu prostředí uvnitř bílkovinné globule. *

Hydrofobní interakce

Sekundární struktury bílkovin

Sekundární struktury bílkovin

Sekundární struktury bílkovin

Sekundární struktury bílkovin

Sekundární struktury bílkovin

Sekundární struktury bílkovin

Sekundární struktury bílkovin

Alfa helixy v hemoglobinu

Terciární struktura

Terciární struktura

Obecné znaky prostorového uspořádání ”organisovaných" biopolymerů 1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. 2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

Vlastnosti proteinů

• Nábojové vlastnosti • Rozpustnost - v závislosti na pH • Denaturace - ztráta nativní konformace • Kooperativita (denaturační přechod) •Optické

Kvarterní struktura

Příklady bílkovin s kvarterní strukturou

Struktury bílkovin

Svinování (folding) - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů (peptidylprolin-cis-trans-isomerasa, proteindisulfid-isomerasa) - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?

Svinování (folding)

Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné

transportní a skladovací

pohyb ochranné a obranné regulační

katalytická

kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) hemoglobin a myoglobin (O2) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport aktin a myosin (+další) imunoglobuliny fibrinogen hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy enzymy

Kovalentní modifikace proteinů aneb translací to nekončí

translací to nekončí

DNA → RNA → protein → modifikovaný protein Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů? 



Ano. Nejedná se jen o „kosmetické“ změny Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)

Čím jsou determinovány možné kovalentní modifikace?



typem, pořadím a prostorovou lokalizací aminokyselinových zbytků

 aparátem enzymů realizujících modifikace

KOVALENTNÍ MODIFIKACE (enzymové i neenzymové)

IN VITRO

IN VIVO

VRATNÉ

NEVRATNÉ

PŘIROZENÉ

UMĚLÉ

1. Posttranslační modifikace 

role v řadě různých buněčných procesů  svinování proteinů  stabilizace prostorové struktury proteinů  lokalizace proteinů v buňce  přenos signálu  exprese genů  regulace aktivity enzymů

 mezibuněčné interakce

Příklady posttranslačních modifikací Fosforylace  vratná modifikace (kinasy / fosfatasy)

 obvykle na –OH skupinách zbytků serinu, threoninu, tyrosinu  významný regulační prvek:  aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována fosforylací na zbytku serinu v pozici 14

 regulace transkripce

 role při přenosu signálu

Regulace transkripce fosforylací 

CREB (cAMP - responsive element binding protein) – transkripční faktor  fosforylace na serin 133 → asociace s CBP; (CREB binding protein) → CREB –CBP komplex aktivuje CREB dependentní transkripci mj. i remodelací chromatinu acetylací histonů

Glykosylace 



připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny role glykosylace:  často nutná pro správné svinutí proteinu  stabilizace proteinu  regulace  rozpoznávání 

molekulové



mezibuněčné

 obrovská variabilita – řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby

Místa připojení sacharidů na protein  (N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů  (O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny  (C) (přes tryptofan)  (P) (fosfothreonin, fosfoserin)

Mechanismus glykosylace na asparagin

dolichol

Regulace transkripce glykosylací  glykosylace CREBu „brzda“ transkripce - působí opačně než fosforylace  modifikován serin a threonin N- acetylglukosaminem

Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné interakce proteinů

 Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů

 Acylace – připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu

farnesylace

Modifikace proteinu jiným proteinem - proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům lysinu jiného proteinu  Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein)

 SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem, regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď na stres

Acetylace -

obvyklá na N – koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován

Hydroxylace -

konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou

Jodace -

thyroxinu

acetylace

thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze

Karboxylace -

karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K)

Methylace -

methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mononebo di- methylován methylace

Nukleotidylace

- připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII  schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku

Sulfatace – interakce)

různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein – protein

Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin

Vytvoření disulfidových vazeb

- typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po svinutí proteinu do (téměř) finální podoby

Aktivace zymogenů

2. Enzymová modifikace (in vitro) Defosforylace kaseinů ve zrajících sýrech (fosfatasa)  vliv na štěpení a následně chuťové vlastnosti sýrů; vstřebávání vápníku  možnost ovlivnění procesu (přídavek fosfatasy)

3. Neenzymové modifikace (in vivo i in vitro) Oxidativní poškození  působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species)

vodíku (H2O2), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O2−. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO3− ; vznik: H2O2 + NO2− → ONOO− + H2O),

 oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze oxidovaných zbytků zpět na methionin

 chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku

oxidace methioninu

Glykace  navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo) 

na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově

 Příklady: 



in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách) obsahujících jak proteiny, tak sacharidy in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace

4. Umělé modifikace proteinů Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek  ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys  iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification)

Kovalentní imobilizace enzymů  možnost opakovaného použití  stabilizace enzymu  vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho autokatalytickými

produkty (proteasy)

Eupergit C









kopolymer vážící proteiny přes oxiranové skupiny reakcí s -NH2 s volnými skupinami zbytků lysinu více bodové kovalentní připojení → stabilizace vysoká stabilita při pH 1 až 12

penicilin amidasa na Eupergitu C - 60% původní aktivity po 800 cyklech

Význam kovalentních modifikací proteinů  pro funkci živých organismů (setkání s medvědem)

 v potravinářství (výroba sýrů)  biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů)

 diagnostické metody v medicíně (glykace)  proteomika (kvantifikace proteinů)

Chromatografické metody pro separaci proteinů



Gelová chromatografie



Ionexová chromatografie



Chromatografie s hydrofóbní interakcí



Afinitní chromatografie

Gelová chromatografie 

       

Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později Isokratická eluce Objem vzorku < 2 % objemu kolony Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid Možnost stanovení molekulových hmotností Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

Gelová permeační chromatografie

Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

Gelová permeační chromatografie

Gelová chromatografie

Gelová chromatografie

Gelová chromatografie

Gelová chromatografie

Gelová chromatografie

Příklad Pokuste se vysvětlit pořadí, ve kterém se budou vymývat z kolony Sephadexu G-200 následující bílkoviny: cytochrom c (RMH = 96 000), ATPsulfurylasa (RMH = 154 000) a xantinoxidasa (RMH = 300 000).