PBO-blad
SociaalEconomische Raad
Mededelingenblad en Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie
Inhoudsopgave jaargang 54 27 februari 2004 nummer 11
Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie BEDRIJFSLICHAMEN Productschap Pluimvee en Eieren (PPE 22) Productschap Vee en Vlees (PVV 16) Productschap Zuivel (PZ 4) Hoofdbedrijfschap voor de Detailhandel (HBD 1)
2 2 37 40 41
Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie BEDRLTFSLICHAMEN Productschap Pluimvee en Eieren PPE 22
Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 (2ûû4-11 Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 12 februari 2004 tot wijziging van het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1 999
Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op artikelen 3 en 8 van de Verordening hygiënevoorcchriften pluimveeverwerkende industrie 1999,
Besluit:
Artikel I Het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1 999 wordt gewijzigd als volgt: A
In artikel 2 wordt in de tweede volzin "Bijlage i" vervangen door: Bijlagen II, III, IV en V B 1.
Bijlage I vervalt;
2.
De bijlagen I, 11, 111, IV, V bij dit besluit worden ingevoegd.
Artikel I I Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin het wordt geplaatst.
Zoetermeer, 12 februari 2004
J.J. Ramekers voorzitter
S .B.M. Jongerius secretaris
2
TOELtCHTtNG BIJ HET BESLUIT TOT WIJZIGING VAN HET BESLUIT PROTOCOLLEN HYGIËNEVOORSCHRIFTEN PLUIMVEEVERWERKENDE INDUSTRIE 1 999 (2004-11
Het besluit voorziet in de wijziging van de voorwaarden voor erkenning van laboratoria zoals deze zijn opgenomen in Bijlage I. Met de wijziging worden regels opgenomen voor de laboratoria die met Salmonella besmette monsters verder serotyperen. Deze laboratoria dienen voor 1 januari 2005 voor deze verrichting een erkenning van de Raad voor Accreditatie t e hebben. Daarnaast dienen zij deet te nemen aan ringtesten e n duploonderzoeken waarbij de kwaliteit van dit type onderzoek wordt getest. Voorts is bepaald dat de laboratoria jaarlijks isolaten naar het RIVM moeten insturen ten behoeve van h e t faagtyperingsonderzoek. Tenslotte worden voorschriften gegeven omtrent het gebruik van de verschillende erkende analysemethoden, de zogenaamde branchemethoden. Er mogen niet meerdere branchemethoden naast elkaar gebruikt worden, zodat het laboratorium kan 'kiezen' uit de uitslagen. De beschreven wijzigingen zijn doorgevoerd onder herziening van de indeling en nadere uitsplitsing van de bijlagen, hetgeen heeft geleid tot de integrale vervanging van Bijlage I door de Bijlagen 1 t/m V bij dit besluit. Van de gelegenheid is gebruik gemaakt om in de tekst enkele redactionele wijzigingen aan te brengen.
Zoetermeer, 12 februari 2004
J.J. Ramekers voorzitter
S .B.M. Jongerius secretaris
Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimverwerkende industrie 'i999. bijlagen.
inhoudsopgave
Bijlage I
Bijlage I1 Bijlage III Bijlage IV Bijlage V
Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de analyses van Monsters op de aan- of afwezigheid van Salmonella enlof Campylobacter uitvoeren. Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campylobacter in pluimvee(v1ees) en eieren. Vermeldingcwijze van d e resultaten van Salmonella onderzoeken. Serologische bevestiging en serotypering. Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwij kende monsters, Acceptatiecriteria
3
Bijlage I: Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de analyses van monsters op de aan- of afwezigheid van Salmonella enlof Campylobacter uitvoeren. A.
Sinds 1 juli 2000 dienen de laboratoria de laboratoria geaccrediteerd te zijn voor de door de branche opgestelde analyse methode inzake de bepaling van Salmonella en per 1 januari 2 0 0 5 voor de bepaling van Campylobacter Dat wil zeggen dat het laboratorium m e t ingang van deze datum over een accreditatiecertificaat op basis van de norm ISOIIEC 17025-moet beschikken die door de Raad voor Accreditatie te Utrecht (hierna t e noemen RVA) wordt verleend. Hieronder dient tenminste de bepaling van Salmonella in de matrix mest volgens de door de branche opgestelde analyse methode te vallen.
B.
Voor laboratoria die in het buitenland zijn gevestigd zal geen Nederlandse accreditatie door de R V A vereist zijn maar een gelijkwaardige erkenning van het betreffende land.
C.
De laboratoria dienen voor de bepaling van Salmonella en Campylobacter gebruik te maken van door de branche opgestelde analyse methodes. De analyse methodes zijn bij dit besluit opgenomen. Aangezien de R V A votledig gevalideerde analysemethoden accrediteert, dienen de branche-methodes van een validatie rapport te worden voorzien. Het Productschap draagt zorg, op basis van het aangeleverde validatierapport, voor de beoordeling van de methode door de R V A inzake zijn geschiktheid voor accreditatie als branchemethode.
D.
Het laboratorium heeft de mogelijkheid t o t het gebruik van één van de toegelaten methoden. Er mogen, o m te bepalen of het monster al dan niet besmet is met Salmonella, niet meerdere testen naast elkaar toegepast worden. O m verder t e kunnen serotyperen dient echter bij toepassing van één van de snelle detectiemethoden een positief monster worden geïsoleerd middels de MSRVmethode.
E.
Indien het laboratorium bij toepassing van een snelle detectiemethode een positieve bepaling wordt gedaan en het monster ten behoeve van de serotypering niet verder ge'isoleerd kan worden, moet op het uitslagenformulier hiervan melding worden gema a kt.
F.
Alle laboratoria dienen mee te doen met Salmonella-ringonderzoek, t o t nu toe georganiseerd door het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne t e Bilthoven (hierna t e noemen RIVM). Zodra een ringonderzoek voor Campytobacter i s opgezet, dient een laboratorium ook a a n dit ringonderzoek mee te doen.
G.
Het laboratorium verstrekt het Productschap eik kwartaal een overzicht waarop is aangegeven hoeveel koppels of hoeveel analyses door het betreffende laboratorium zijn onderzocht respectievelijk zijn uitgevoerd. Tevens geeft het laboratorium aan hoeveel koppels of analyses hiervan positief waren. Voor zover afgesproken met de pluimveehouder/broederij of slachterij zendt het laboratorium op aanvraag de resultaten van analyses door a a n het Productschap (bijvoorbeeld Salmonelta paratyphi B var. Java)
4
H.
Jaarlijks moeten de laboratoria monsters Salmonella enteritidis (S.e.1 of Salmonella typhimurium (S.t.1 opsturen naar het RIVM. Dit t e n behoeve van het faagtyperingsonderzoek, dat het RIVM uitvoert in het kader van de EUZoönoserapportage.
I.
De serotypering van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium mag door ieder erkend laboratorium worden uitgevoerd. De serotypering van d e overige Salmonella serotypen mag uitsluitend uitgevoerd worden door de erkende laboratoria die voor deze verrichting uiterlijk op 1 januari 2005 een erkenning hebben bij de RvA. Het betreft serotypen die op een door het Productschap opgestelde lijst van veel vòòrkomende serotypen in pluimvee staan vermeld. De op deze lijst vermelde serotypen kunnen worden gewijzigd als de in pluimvee/pluimveeproducten vbbrkomende serotypen wijzigen.
J.
De laboratoria die de serotyperingen uitvoeren zijn verplicht: de serotyperingen uit te voeren conform het antigenen schema van Kaufmann White; jaarlijks maximaal 10 isolaten door t e sturen naar het RIVM ter cerotypering. Dit is een duplo onderzoek om de kwaliteit van het serotyperen t e toetsen; deel te nemen aan ringonderzoeken, die de kwaliteit van het serotyperen eveneens testen; isolaten, afkomstig van andere erkende laboratoria die geen serotypering van de typen met uitzondering van S.e. en S.t. kunnen uitvoeren, te analyseren. Hiervoor mogen geen afwijkende tarieven in rekening worden gebracht.
Bijlage II : Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campytobacter in pluimvee(vtees) en eieren Voor het aantonen van Salmonella en/of Campylobacter in pluimvee(v1ees) en eieren staat de pluimveesector een aantal analysemethoden ter beschikking, welke goedgekeurd zijn door de Raad voor Accreditatie. Het laboratorium kan deze analysemethoden toepassen voor de analyses in het kader van d e Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij 1 999 en de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1 999. Het laboratorium dient dan wel de betreff ende analysemethode onder haar accreditatie van de Raad voor Accreditatie (ISOAEC i70251 onder t e brengen. De analysemethoden zijn: I . PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 2. Alternatieve PVE Branchemethode ProbeliaTMPCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 3. Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons afkomstig van pluimvee. 4. PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van t he r mot o Ie r a nt e Campylobac ter s p p in mo nst e r s pIuim v ee, p Iu irnv ee p roduc t e n e n omgeving smonsters.
.
5
I
PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee
i.Onderwerp Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct.
2. Definities Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. Defectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
3.Principe Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmediurn, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium.
4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten v a n anaiysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water
BPw
bijlage 1 .1
Selectief ophopingsmedium rnodified semi-solid Rappaport- Vassiiiaáis medium
MSRV
bijlage 1.2
Selectieve agar brioant groen agar
BGA
bijlage 1 . 3
Bevestigingsmedia ureumag ar triple-sugar-ironagar lysine-decarbox ylase medium
UA TSI LDC
bijlage 1.4 bijlage 1 .5 bijlage 1 .6
Salrnonelta polyvalent aqglutinatie serum
De samenstelting en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 . Er m a g echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn.
6
I
5. Apparatuur en glaswerk Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor eenmalig gebruik mogen worden toegepast. Broedstoof voor het bebroeden bij 37°C -r 1"C Broedstoof voor het bebroeden bij 42°C I 0,5T Waterbad ingesteld op 47°C k 2°C Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm. Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0 , l ml en een meetvolume van 1 ml. Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. Cultuurbuizen van 17/18 x 1 5 0 mm en van 8 x 1 6 0 mm.
5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7.
6. Werk wijze De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet t e worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.
Voorbehandeling van bet monster Verdun het monster 1 :1O in BPw. In de volgende tabel' is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoevealheden en het volume 3Pw weergegeven: --^..
---....._..-._._I.I_^.
aantallen ... ...... .... .^ 2x25 swabs 3x20 swabs 2x 1 5 swabs 2 paar 6x 2 5 cwabs 2x 30 swabc 30 swabs 25 gram 25 gram 25 gram 40 stukjes~
___
. .. I
" . I
I
--I1-..l..____.._
(hoeveelheid (circa)) .,.. . .. . ......
.
"
12,5 10 7,5 10 12,5 15 15 25 (25 (25 (60
gram) gram) gram) gram) gram) gram) gram) gram) gram) gram) gram) -
- -
....
....._..^^.__.._-_.I_
BPw .....,. 112,5 ml 90 ml 67,5 ml 90 ml 112,5 ml 135 mi 135 ml 225 ml 225 ml 225 ml 540 ml "_
I
.,.,... .. .
.
.. . ..... ".
type monster . . ..,,..... . . . . swabs broederijen swabs stallen swabs overschoentjes swabs swabs blinde darrnrnest dons eindproduct vel van de borstkap --- inlegvellen . ~
Incubeer d e potten BPw 18 k 2 uur bij 37°C k 1°C. De potten mogen tussentijds gedurende 2 dagen in de koelkast bewaard worden, deze 'koudestap' is mogelijk.
Beënring en bebroeding Breng 0,l ml BPw-cultuur op een MSRV plaat (bij 9 cm platen 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,l rnl in een driehoek. Incubeer de platen 1 x 24 & 2 uur bij 42°C k 0,5"C. De platen moeten met het deksel van de petrischaal naar boven ge'incubeerd worden, aangezien h e t een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 1 x 24 k 2 uur bij 42°C t 0,5T bebroed t e worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een witlgrijze kleur. Verdachte platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een öse 1
Noot: standaard monsters in 225 ml BPw mag ook uitgevoerd worden. Het gaat er om d a t er minimaal een 1: 10 verdunning gemaakt worden. Een ruimere verdunning dan 1 : 10 is toegestaan, een kleinere verdunning dan 1: 10 is niet toegestaan.
7
materiaal uit de agar t e nemen en daarmee een gedroogde BGA plaat t e beënten. Incubeer deze platen gedurende 24 k 2 uur bij 37°C +. 1°C. Beoordeling Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging Voor de bevestiging uit met minimaal 1 t o t maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en t o t 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de BGA plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuingestolde oppervlak en een steekenting t o t op de bodem van d e buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistof oppervlak af te strijken. De buizen worden 24 k 2 uur bij 37°C t- 1°C g eincu be erd . Opmerking: Wanneer geen goed losliggende kolonies op de BGA plaat zijn verkregen of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende ctoorflora is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde BGA- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van d e Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan o m eerst de bevestigingstest met de TSI uit t e voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC. Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten:
f S l aoar onderin d e buis
- geel - zwart - bellenlscheuren
schuine gedeelte
- roodlonveranderd
-
glucose positief (100%) - vorming van H2S (97,6%1 - gasvorming van glucose (91,9%1
I - lactose en/of sucrose negatief (resp. 99,2% en 99,5%)
J
-
geen kleuromslag van het medium
- negatief 1100%1
LDC - paarse kleur en groei in medium
- positief
(94,6%I
Het gebruik van biochemische kits (zoals API, Cryctal) is ook toegestaan. Biochemisch verdachte kolonies dienen serologisch bevestigd te worden met een polyvalent serum. Dit werkvoorschrift is opgenomen in bijlage 3.1 .
8
De totale beoordeling van biochemische en serologische resultaten is als volgt:
Indien een stam alleen biochemisch verdacht is, wordt deze opgestuurd naar het RIVM. Een andere mogelijkheid is het inzetten van een zogenaamde 'lange bonte rij' of een biochemische kit. Op het resultaat i a n het RIVM hoeft niet gewacht t e worden, alvorens een uitslag wordt afgegeven. Voor de doncmoncters en faecesmonsters vindt cerotypering plaats v o o r de 4 hoofdgroepen van Salmonella (6, C, D en E) en indien van toepassing identificatie v a n Salmonella Enteritidis en Salmonella Typhimurium. (indien nog niet bij pluimveehouder het cerotype nog niet bekend is). In bijlage IV is het werkvoorschrift opgenomen.
7. Controle Voor de eerstelijnscontrole
van de methode dienen te worden meegenomen:
- Positieve controle - Negatieve controle
- Blanco controle De eerstelijnscontrotes met MSRV platen staan beschreven in bijlage 2. 8 . Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal' (zie bijlage lil) als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden om hoeveel gram het ongeveer gaat dat is onderzocht. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V ) . 9. Bronvermelding
- NEN-EN 1 2824 Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella ( I S 0 6579: 1993, gewijzigd).
H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: 189-19 9 . - Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faecec m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassitiadis (MSRV)-medium, september 1999
- Zee, van der
Indien een ingangscontrole wordt toegepast per batch, k a n de negatieve controle komen t e vervallen
9
Bijlage 1 : Samenstelling en bereiding van media en reagentia
1.1
Gebufferd pepton water (BPw)
samenstelling: pepton NaCI NazHP04.12HzO KHzP04 water
10,o g 5,O g 9,o 9 1,s g 1 0 0 0 ml
bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). - Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 i 0,2 bedraagt bij 25°C. - Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen. - Steriliseer in een autoclaaf ( 1 5 min. 121°C).
1-2
Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRVI3
oplossing A (basis): tryptose caseine hydrolysaat NaCI KHzPO4 MgCl2 malachietgroen oxalaat agar gedestilleerd water
4,59g 4,59 g 7,349 1,47 g 10,93 g 0,037 g 2,7 g 1000 ml
bereiding - Los de ingrediënten op in het water. - Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN). - Stel d e pH op 5,2 0,2. Koel het mengcel af tot 50°C. oplossing B (novobiocine): Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water. Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 pm). bereiding MSRV medium: - Voeg oplossing B toe aan 5 0 0 ml oplossing A. - Meng de oplossing. Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen. Even aan de lucht drogen om een n a t oppervlak t e voorkomen.
3
De MSRV-platen moeten volgens de voorschriften van de leverancier/fabrikant bewaard worden.
10
1.3
Briljant groen agar (BGAI
oplossing A (basis): vleesextract pepton gistextract
Na2HPû4 NaHzP04 agar water
'
=
5,O g 10,o 9 3,O g 1,o g 0,6 g 12 g t o t 1 8 g 900 ml
'
afhankelijk van de sterkte van de gel
bereiding: - Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting). - Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,O f 0,2 is. - Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 1 2 i"C). oplossing B (suiker/fenol rood oplossingl: lactose 10,o g sucrose 10,o 9 fenolrood OtO9 g water t o t een eindvolume van 100 ml bereiding: - Los de componenten op in +. 50 ml water. Vul m e t water aan t o t een eindvolume van 100 ml. Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70°C Koel af t o t 47°C i 1°C. Gebruik de oplossing direct. oplossing C IbriQant groen oplossing): briljant groen k 0,5 g water 100 ml bereiding: Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 rng/l) toe aan het water. Bewaar de oplossing tenminste 1 dag i n het donker zodat auto-sterilisatie optreedt. bereiding complete medium : oplossing A 900 rnl oplossing B 1 0 0 ml oplossing C 1 rnl bereiding: Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C t o e aan de ( t o t 47°C t l a C l afgekoelde oplossing B. Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium. bereiding van de agar platen: Giet h e t vers bereide mediurn in grote I ( 40 mi) of in kleine petrischalen { ? 1 5 mi). Laat de platen stollen. Droog de platen voor gebruik.
Ureumagar (UA)
1.4
oplossing A {basismedium): 1,o g pepton glucose 1,o g NaCI 5,O g KH2P04 2,o g fenolrood 12,0 mg agar 12,O tot 1 8 , O g 1000 ml gedestilleerd water
'
= afhankelijk van de sterkte van de gel
bereiding: - Los de ingrediënten op in het water. - Stel d e pH op 6,8 0,2 bij 25°C en filtreer de oplossing. - Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121"C in een autoclaaf - Laat de oplossing afkoelen t o t 47°C. oplossing B íureumoplossingl: ureum 400 g gedestilleerd water 1000 ml bereiding: Los de ureum op in het water Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit. bereiding complete medium: oplossing A oplossing B
950 ml 50 ml
bereiding: - Voeg oplossing B (ureurnoplossing) toe aan oplossing A (basismedium). - Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 1 O rnl medium. - Laat de buizen stollen zadat een schuin gedeelte ontstaat. Triple-sugar-ironagar (TSII
1.5
samenstelling: vleesextract 3,O g gistextract 3,O g pepton 20,o 9 NaCI 5,O g lactose 10,o 9 sucrose 10,o g glucose 1,o g ijzer (lil) citraat 0.3 g natriumthiosutfaat 0,3 g fenolrood 0,024 g agar 12,O tot 1 8 , O g gedestilleerd water 1000 ml
'
'
= afhankelijk van de sterkte van de gel
12
bereiding : Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). - Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 k 0,2 is. Verdeel het medium over buizen, per buis 10 mi medium. - steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 120°C in een autoclaaf. Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat.
1.6
Lysine-decarboxylase medium (LDC)
samenstelfing: 1-lysine rnonohydrocfiloride 5,O g 3,O g gistextract glucose 1,o g 0,015 g brornocresol purper water 1000 ml bereiding: Loc de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). - Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 f 0.2 is. Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 ml medium. Steriliseer in een autoclaaf (1O min. 121"C).
Bijlage
4: Eerstelijnscontrole met MSRV platen
Onderwerp Deze bijlage beschrijft een methode voor de eerstelijnscontrole op de analyse van Salmonella met MSRV. Werkwijze Om de kwaliteit van de geproduceerde media t e bewaken, dient iedere dag een controle volgens onderstaand schema t e worden uitgevoerd.
Positieve controle Inoculum:
Kolonie aanstippen met entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met gebufferd peptonwater (BPW). Ca. 24 f 2 uur bij 37°C incuberen in BPw ( 1 O*)en verdunnen tot 1O3 of commercieel verkrijgbaar bij de IGB Groningen.
Controlestam:
S . en feritidis
I
i 0 0 FtL op de plaat pipetteren I
incuberen i x ' 2 4 k 2 uur
42 zt 0,5"C
I
wit/grijze troebeling plaat
positief 13
Alternatieve PVE Branchemethode PROBELIATMPCR voor het aantonen van Sa/mone//a in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee Versie 14 november 2002
1. Onderwerp Dit protocol beschrijft een 2 4 - u u r s methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de PRûBELIATM test (Bio-Rad Laboratories) in dons, faeces ( m e s t ) , vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd t e n o p z i c h t e v a n de door de branche opgestelde en door de Raad v o o r Accreditatie goedgekeurde analyse methode
MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polyrnerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.
Detectie van Salmonella: bepalen van d e aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als h e t onderzoek w o r d t uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
3. Principe Uit e en voor ophopingcme d ium wordt , n a voor inc u bat ie, het DNA van Salmon ella geïsoleerd . Vervolgens vindt amplificatie plaats van een voor Salmonella specifieke en gepatenteerde DNAsequentie, het lagA gen, met behulp van de PCR. Het vermenigvuldigde DNA wordt na hybridisatie op een microtiterplaatstrip aangetoond middels een colorimetricche reactie. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.
4. Reagentia en andere materialen De PROBELIATb’Salmonella t e s t bestaat uit kant-en-klare reagentia, inclusief voorophopingmedium. Het t e gebruiken gedestilleerde water moet v a n anatysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water (BPw)
Bio-Rad code 356-4684 (500 gl [bijlage 1 . l I of Blo-Rad code 355-4 170 i225 mW
PRO BEL IA^^ Salmonella t e s t Bio-Rad code 357-8000 Bio-Rad code 35 7-800 1
Amplificatie kit Detectie k i t
De samenstelling en bereiding van media en kits is opgenomen in bijlage 1
14
Ibijlage 1.21 [bijlage 1 .21
5. Apparatuur en verbruikcmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium e n de voor de PR06ELIATMtest benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 5.1 5.2
5.3 5.4
5.5 5.6
5.7 5.8 5.9 5.1 O 5.1 1 5.1 2
Broedstoof voor h e t bebroeden bij 37 5 I OC Micropipetten (5-50 en 20-200 pl) Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max. 10,000-15.000 rpm) Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op 561 1 O C en 1 O 0 f 1 Bio-Rad iCycler thermocycler voor PCR Bio-Rad microtiterplaat sha kerhncubator Model Stat-Fax Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/41 Bio-Rad microtiterplat reader Model 5 5 0 met 4 5 0 nm en 620 nrn filters Stomacherzak met filter Steriele centrifuge buisjes 1,5 m l Steriele micropipetpunten met filter Steriele PCR-tubes 200 pui
6. Specifieke eisen betreffende de laboratorium ruimtes
PCR technologie is zeer gevoelig: amplificatie van een enkel molecuul genereert miljoenen identieke kopieën van de gewenste sequentie. Deze kopieën kunnen v i a aërosolen in de laboratorium ruimte circuleren. Om besmetting van nieuwe monsters met DNA sequenties vanuit amplificaties van voorgaande monsters t e voorkòmen, is het essentiëel om de ruimtes waar de monster behandeling en het mixen van de reagentia plaatsvindt (pre-PCR ruimte) te scheiden van de ruimte waar de amplicon analyse plaatsvindt en de centrifugebuisjes worden geopend (postPCR ruimte). Het gebruik van de PR06ELlATM PCR test vereist een minimum van 2 afgescheiden ruimtes. Elke ruimte is voorzien van eigen gebruiksmaterialen zoals pipetten, handschoenen, laboratorium jassen, etc., die niet mogen circuleren van de ene werkplek naar de andere. 7 . Werkwijze
Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. De monsters dienen binnen 4 u u r na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met h e t inzetten van de monsters totdat maximaal 4 8 uur + 4 uur na de datum van rnonstername i s verstreken. Voorbehandeling van het monster Verdun het monster 1 : I O in BPw in een stomacherzak met filter. Stomacher, en incubeer de BPw gedurende 1 8 1 2 uur bij 37'C k IOC. Bij verwerking van nekvel t e n behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden t e worden; een overmaat vet kan de isolatie van D N A bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling.
15
Amplificatie en detectie van DNA met PROBELIATMSalmonella Na voorophoping wordt de inhoud van de stomacherzak lichtjes gehomogeniseerd middels voorzichtig zwenken. Vervolgens wordt met een steriele pipet (bij voorkeur met filter) 1 m l homogenaat uit de stomacherzak gepipetteerd in een 1,5 ml centrifuge buisje. Hierbij moeten geen vet, donsresten of andere vaste substanties worden meegepipetteerd. Overige stappen worden uitgevoerd conform de gebruiksaanwijzing v a n de PROBELIATM Salmonella testkit (instructie van de fabrikant). Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIATM Salmofieila testkit (instructie van de fabrikant). Deze zijn gebaseerd op bepating van de optische densiteit (OD) verkregen op de Salmonella detectiestrip ( H l ), vergeleken met de OD van hetzelfde monster op de detectiestrip van de interne controle (HO). Zie ook onderstaande tabel:
1 2 3
Salmonellae ( H l )
Interne controle (HOI Resultaat
OD > 0.070
niet van belang OD > 0.070 OD c 0.070
OD < 0.070 OD < 0.070
positief negatief inhibitie
In het geval van inhibitie van de amplificatiereactie (de OD'c voor monster en corresponderende interne controle zijn lager dan de gestelde cut-off vaiue van 0.070)dient een nieuwe test t e worden uitgevoerd. Hiertoe wordt het supernatant van het betreffende monster, verkregen na isolatie van DNA, 1 : 1 O verdund met steriel w a t e r (instructie van de fabrikant). vervolgens wordt de PCR opnieuw ingezet. Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aanwezig. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella afwezig. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de PROBELIATMSalmonella is ter beoordeling van de gebruiker maar is n i e t vereist. Echter in die gevallen waarin volgens de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1 999 of de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1 999 nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelf d e BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden, zie hiervoor de PVE branchemethode MSRV. In bijlage IV is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen. 8 . Controle
De PROBELIATMSalmonella test kit bevat één positieve en twee negatieve controles. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie e n is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen. Validatie v a n de test: De OD van de beide negatieve controles dient kleiner te zijn dan 0.050; deze waarde bevindt zich meestal tussen de 0.020 en 0.030. De OD van d e positieve controle dient groter te zijn dan 2.000. De test is alleen geldig indien de optische densiteit van d e controles voldoet aan bovengenoemde condities. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen t e worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen t e vervallen) - Blanco controle
16
9. Opgave van het resultaat H e t resultaat wordt opgegeven ais 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaaf' als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol.
Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).
iO. Bronvermelding Fach P., Dilasser F., Grout J., and Tache J., Evaluation of a polymerase chain reactionbased test for detecting Salmonella spp. in food samples: PROBELIATM Salmonella spp. Journal of Food Protection, Vol. 62 (12):1387-13 9 3 ( 1 999). Hartman E.G. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr 401 91 9, september 1999. Miras I,, Hermant N., Arricau N., Popoff M . Y . Nucleotide sequence of lagA and lagB genes invoived in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 ( 1 1: 17-20 (1995). PROBELIATM Salmonella spp.: AFNOR cettification, attest SDP-07/2-06/96. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000'. Van der Zee, H., e t al. Vergelijking van de Salmonella bepaling met behulp van de conventionele branchemethode (MSRV) en een snelle alternatieve detectiemethode (PROBELIATMPCR) in de pluimveesector. PVE, september 2002,
17
11. Bijlagen Bijlage 1 : Samenstelling v a n voorophopingsrnedium en PROBELIATMtectkits
1. l
Voorophopingsmedium: Gebufferd peption water (BPw)
Samenstelling: Pepton 10,o g NaCI 5,o g NazHP04 385 g KHzP04 1,5 g Water 1000 ml
Bereiding: -
Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting) Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 i 0,2 bedraagt bij 25 OC Verdeel h e t medium over de daartoe geschikte flessen Steriliseer in een autoclaaf (15 min. , 121 O C )
-
-
1.2
PRO BEL IA^^ Salmonella test
Samenstelling arnplificatie kit Al Lysis reagens A2 Salmonella spp. amplificatie m i x A3 PCR Positieve controle A4 PCR Negatieve controle A5 Denaturatie reagens
1 fles 2 buizen 1 buis 1 buis 1 fles
Samenstelling detectie kit: 96 welk plaat ( 1 2x8) gecoat m e t een probe HO H1
HZ H3 H4 H5 H6 H7
22 ml 2 x 2,5 ml 0,25 mi 0,5 mi 6 ml
1 microtiterplaat specifiek voor de interne controle I microtiterplaat 96 w e l k plaat ( 1 2x8) gecoat m e t een probe Specifiek voor Salmonella spp. Hybridisatie buffer 1 fles 100 ml Peroxidase-gelabelde probes specifiek voor 1 buis 100 ml Salmonella spp. en de interne controle Was buffer ( 1Ox geconcentreerd) 1 fles 1 0 0 ml 1 fles 60 ml Substraat buffer Chromogeen: tetramethulbenzidine ITMB) 1 buis 1 ml Stop oplossing (1,5 N zwavelzuur] 1 fles 28 ml 20 stuks Afdekfolie voor de microtiterplaat
18
Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS S L M voor het aantonen van Salmonella in dons, afkomstig van pluimvee Versie 14 november 2002
1. Onderwerp Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor h e t aantonen van Sa/mone/la m e t behulp van de VIDAS SLM test (bioMérieux) in dons afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten optjchte van de door de branche opgestelde en door d e Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV.
2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.
Detectie van Salmonella: bepalen van d e aan- of afwezigheid van d e z e micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
3. Principe VIDAS SLM is een enzym immunoascay voor detectie van Salmonelía antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat. De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 1 8 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 1 8 uur in een 3" ophopingsmedium. Van dit l a a t s t e ophopingsmedium w o r d t een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar.
4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijvoorbeeld bioMérieux r e f . 42043 of Branchemethode MSRV [bijlage 11 Selectief op hopingsmedi um Rappaport- Vassiliadis bouillon seleniet e ysteine bouillon M bouillon
Mb
Selectieve agar briljant groen agar
BGA PVE Branchemethode M S R V
RV SC
bijvoorbeeld bioMérieux r e f . 4207 3 bijvoorbeeld bioMérieux r e f . 42052 bijvoorbeeld bioMériecix r e f . 42077
19
Bevestigingsmedia ureumagar triple-sugar-ironagar lysine-decarbox ylase medium
UA TSI
PVE Branchemethode MSRV PVE Branchemethode MSRV LDC PVE Branchemethode MSRV
Salmonella polyvalent agglutinatie serum
PVE Branchemethode M S R V
De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van d e PVE Branchemethode MSRV. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in d e gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant. 5. Apparatuur en verbruiksmaterialen
De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.
* * * * * * * * * * *
Broedstoof voor het bebroeden bij 37'C f 1 O C Broedstoof voor het bebroeden bij 42°C I 0,5OC Micropipet (500 PI) Steriele micropipetpunten Waterbad (100 OC) of equivalent Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm. Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,l ml en een meetvolume van 1 mt Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. Cultuurbuizen van 1 7 / 1 8 x 150 m m en van 8 x 160 mm. Stomacherzakken (met filter) VIDAS analyse apparaat
6. Werkwijze
Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijtage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden m e t het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorophoping Verdun het monster 1 : 1 O in BPw ( 2 5 gram dons in 2 2 5 ml BPw). Stomacher, e n incubeer de BPw 1 8 k 2 uur bij 37°C F 1°C.
Selectieve ophoping Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml SC bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37°C 1°C. Breng tegelijkertijd ook 0 , l ml van deze 8Pw suspentie over in 10 m l RV bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 42°C +r 0,5"C
*
Na-ophoping Breng na incubatie van de SC bouillon 1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RV bouillon 1 ml hiervan over in een ze buis met 1 0 ml M bouillon. Herincubeer de SC bouillon en de RV bouillon voor nog eens 1 8 uur, o m bevestiging achteraf mogelijk te maken.
20
Incubeer de M bouillon buizen gedurende 1 8 uur bij 42°C f 0,5"C. Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 1 5 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Bewaar de Overgebleven bouillons bij 2-8°C voor bevestiging. Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten m e t een test Value = O , 23 worden als Salmonellapositief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd m e t behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia . Bevestiging van posirieve resultaten Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (RV en SC) vanuit de broedstoven en vanuit de M bouillons vanuit de koeling af op gedroogde BGA platen. Incubeer deze platen gedurende 24 k 2 uur bij 37°C +. 1°C. Beoordeling 5GA platen Controleer de bebroede BGA-platen o p de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging van deze specifieke kolonies, zowel biochemisch ais serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in de PVE Branchemethode MSRV.
Voor doncrnonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (indien bij de pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is hiervoor het werkvoorschrift opgenomen. 7 . Controle De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CLM test, instructie van de fabrikant. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen t e worden meegenomen: Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen t e vervallen) - Blanco controle
-
8 . Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in dons', als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop d e monsters aangeleverd moeten worden, dan dient h e t laboratorium hierover schriftelijk een opmerking t e maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).
21
9. Bronvermelding Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces rn.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr. 401 91 9, september 1999.
I S 0 6579:l993(E). Microbiology. General guidance on methods for the detection of Salmonella. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campy/obacfer in de pluimveevleessector 2000+. Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van d e VIDAS SLM methode. PVE, september 2002.
22
PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, piuimveeproducten en omgevingsmonsters
1 Onderwerp en toepacsingsgebied Dit protoco t beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacrer spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in pluimvee, verse pluimveeproducten en omgevingsmonsters zoals mestmonsters en blindedarm mestmonsters.
2 Normatieve verwijzingen NEN-EN-1SO 6887-1 : 1 999, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1 : Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen. NEN-EN-IS0 6887-2: 2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten. NEN-IS0 7 2 1 8:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken. NVN-ENV-IS0 1 1 133-7:2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1 : Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium
3 Termen en definities Campylubacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.
4 Beginsel Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA). Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende I minuut gestomacherd met 1O 0 ml selectief ophopingsmedium (Prestoni. Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd e n alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 OC. Vervolgens wordt afgeknt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA). Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5"C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies. Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle wordt een deel van de isolaten biochemisch en/of serologisch bevestigd.
23
5 Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen 5.1 Algemeen
Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de pH een pH-meter; referentietemperatuur 2 5 O C . Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1 OC en 5 O C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmediurn niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.
5.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) 5.2.1 Preston basismedium 5.2.1.1 Samenstelling
Vleesextractpoede ra Peptona Natrium chloridea Natrium pyruvaatb Natrium metabisulfietb Ijzer (li) sulfaatb (FeS04.7HzO) Water
10,o 10,o 5,O 0,25 0,25 0,25 1 O00
g 9
9 g
9 g
mI
OPMERKING ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de n a a m Nutriënt Broth No.2 ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FEP supplement)
5.2.1.2 Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 k 0,2 bedraagt bij 25OC. Steriliseer gedurende 1 5 minuten bij ( 1 21 % 1 I O C .
24
5.2.2 Preston antibiotica oplossing 5.2.2.1 Samenstelling Polymyxine-B Rifampicine Trimethoprirn lactaat Amphotericine-B Water
5000 0,Ol 0,Ol 0,Ol 4
OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het "vroeger" gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.
5.2.2.2Bereiding Los de antibiotica op in h e t water en steriliseer door middel van filtratie (0,22pm filter)
5.2.3 Compleet Preston ophopingsmedium 5.2.3.1 samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium Antibiotica oplossing
1 O00 4
ml ml
5.2.3.2Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismediurn af tot onder de 45OC. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing to en meng z rgvuldig.
OPMERKING in de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium { e n in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk i s (Jacobs-Reitsrna et al., 2003). 5.3 Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cefoperazone Deox ychola te Agar
ImCCDAI
25
5.3.1 mCCDA Basismedium
5.3.1.I Samenstetling Vleesextract poedera Pepton” Natrium chloride a Bacteriologische charcoal Ca seïne hy droIy sa a t Natrium deoxycholaat Ijzer (li) sulfaat IFeS04.7HzO) Natriumpyruvaat Agar Water
10,o 10,o 5 ,O 4.0
3,O 1 ,o
0,25 0,25 12,o 1 O00
OPMERKING ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2.
a
5.3.1.2 Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,4 k 0,2bedraagt bij 2 5 T . Steriliseer gedurende 1 5 minuten bij ( 12 f 11°C.
*
5.3.2 mCCDA antibiotica supplement
5.3.2.1 Samenstelling Cefoperazone Amphotericine-B Water OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mCCDA supplement.
5.3.2.2 Bereiding Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 p m filter)
5.3.3 Complete mCCDA voedingsbodem 5.3.3.1Samenstelling Basismedium Antibiotica oplossing
1 O00 4
ml
ml
5.3.3.2 Bereiding
Koel het basismedium af tot ongeveer 45°C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing t o e en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en l a a t stollen.
26
5.4 Bevestigingsmedia 5.4.1 Oxidase reagens 5.4.1.1 Samenstelling
N,N,N‘, N’-tetramethyl-I ,4-fenyleendiarnmoniumdihlo~ide Water
0,l 10
gram ml
5.4.1.2 Bereiding -
Los het N,N,N’,N’-tetramethyI-1,4-fenyleendiamrnoniumdihloride op in h e t water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest. Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. 5.4.2 Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campyiobacrer
LIa tex aggIut inatietest en voor bevestiging va n t he rrnot o Ie rant e Campylob acter zij n commerciëel verkrijgbaar. Enkele leveranciers staan vermeld in Bijlage A.
5.4.3 Triple Sugarllron agar (TSI)
5.4.3.1Samenstellincr Vleesextract Gistextract Pepton Natriumchloride Lactose Sucrose Glucose IJzer (IIII citraat Natriumthiosuifaat Fenolrood Agar Water
3,O
g 9 g g g 9 9
3,o 20,o
5,O
10,o 10,o 1,o 0,3 9 0,3 9 0,024 g 12,o 9 1O00 mi
5.4.3.2 Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de p t l zo in dat deze na sterilisatie 7,4 k 0,2 is. Verdeel het medium over geschikte reageerbuizen, 1 O ml medium per buis. Steriliseer gedurende 1 5 minuten bij ( 1 21 ? 11°C. Laat de agar stollen, zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, nog een schuin gedeelte ontstaat.
27
6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NENI S 0 7 2 1 8 ) en in het bijzonder de onderstaande: Broedstoof voor het bebroeden bij (41,s & 1)'C. Suspendeertoestel, Stornacher Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van rnicroaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen {'gas-zakjes'). 6.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1OOOx.
6.1 6.2 6.3
OPMERKING Gesteriliseerde materialen voor éénmaiig gebruik mogen w o r d e n toegepast
7
Monstername
Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE ieeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd. Bederfelijke piuimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld ( 1- 4 O ) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever. Campylobacfer is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.
Monsters dienen binnen 48 uur na monstername t e worden ingezet.
8
Werkwijze
8.1 Algemeen
In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Carnpylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft.
8.2 Direct uitplaten 8.2.1 Monstervoorbehandeling Monsters waarin hoge aantallen Campylobacfer worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op h e t isolatiemedium afgestreken. Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open t e knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over t e brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele c w a b of entoog).
8.2.2 Isolatie
Beënt vanuit het mengmonster m e t behulp van de swab of entoog een halve mCCDA-plaat. Beënt de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp v a n e e n steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan. Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende 48 ( + 4) uur bij 41,5 ( k l ) D C . 28
8.3 Ophoping 8.3.1 Monstervoorbehandeling Breng 25 gram k 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk h u i d van d e borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Prestan bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).
8.3.2 Ophoping Incubeer de ophopingsbouillon (24 5 2) uur bij (41,5 f 1loc in micro-aëroob milieu. Indien ge'incubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cml, kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.
8.3.3Isolatie Ent met behulp van een entoog (10 pui) de Preston-cuttuur na incubatie uit op een mCCDAplaat. Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende (48 i 4) uur bij (41,5 f 11 O C .
8.4 Beoordeling kolonies op mCCûA Beoordeel bebroede mCCDA-platen op de aanwezigheid van kolonies m e t de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en d e neiging om met de entctreep mee te groeien. Deze kolonies worden als 'verdacht positief' aangemerkt.
9
Bevestiging
9.1 Algemeen Voor de bevestiging uit met minimaal 1 t o t maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van rnengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen. Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld. 9.2 Oxidase reactie
Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mCCDA plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 1O seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt. 9.3 Microscopie
Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een facecontrast of donkerveld microscoop (1OOx objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid v a n Campylobacter. Bij kleuring volgens Gram tonen Camp ylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram-negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed t e zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen ( > 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen.
29
9.4 Aanvullende bevestiging
Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest o f een TSI-buis, bijvoorbeetd m e t 1 op 50 bevestigde kolonies. Voer eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mCCDA-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement). 9.4.1 Latexagglutinatietest
Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma's commercieel verkrijgbaar (zie Bijlage A) en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van d e fabrikant worden ingezet en afgelezen. 9.4.2 TSI buis
Beënt een TSI buis middels ladderen van het schuin gestolde deel en middeis steek-enten in de agar. Incubeer deze buis (24 2) uur bij (41,5 f 1IOC in micro-aëroob milieu. Beoordeel de reacties als weergegeven in tabel 1 .
*
9.5 In terpretatie bevestigingsreacties Campyiobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1
Tabel 1- Karakteristieken van Campy/obacter Test
-Lactose
Karakteristieke kurketrekkervormige morfologie en grote beweeglijkheid Paarsvorming rood/o nveranderd geen ZwartkleuringNegatief: gehele buis rood Positief: voet geel, schuine deel rood; Neg. :geen bellenlscheuren Pos.: belletjes enlof scheuren in agar Positief: gehele buis geel
-Sucrose
Positief: gehele buis geel
-HzS-vorming
Positief: zwarte kleur in voet
Latexagglutinatie
Volgens voorschrift fabrikant
Microscopie
Oxidase TSI -Glucose (zuurvorming)
-Glucose Igasvorming)
Campyiubacter-spe cif i e k resultaat
Omschrijving
-t
+
1
-t
"Indien het een Campylobacter coli betreft kan de buis toch enige zwarting t e zien geven (dit species is namelijk beperkt in staat t o t HzS-vorming).
30
1 0 Opgave van h e t resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Campylobacter in h e t betreffende monstermateriaal' als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze).
1 1 Precisie Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden.
1 2 Verslag Vermeld in h e t verslag: de gevolgde methode; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevotgde methode van monsterneming, indien bekend; het resultaat volgens hoofdstuk 8 ; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beÏnvloed.
1 3 Bronvermelding
NEN-EN I S 0 10272.: 1995 M.icrobiology of food and animal feeding s t u f f s - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technicat corrigenda (IS010272: 1 995iCor. 1 : 1996(E) and I S 0 10272: 1 9 9 5 K o r : 1997(E). Jacobs-Reitsma, W. F. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural Univercity Wageningen, The Netherlands. Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies o n Campytobacter isolation rnethodc f r o m fresh poultry products. Posterpresentation at t h e 1 2th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organicms, september 2003, Aarhus, Denmark. PVE Branchemethode (MSRV) voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee (inclusief 5 bijlagen), d.d. 20-07-01 Vb. Bo. nr. 31.
31
Bijlage A
Beschikbare latex agglutinatie testen voor bevestiging van thermotolerante C a m p ylobacter zijn onder andere: Dryspot Campylobacter Test, Oxoid DR 7 50M
Oxoid Itd., Basingstoke Hampchire, England
In NL via :
Oxoid Pieter Goedkoopweg 38 Postbus 490, 2000 AL Haarlem Tel: 0 2 3 5 3 1 91 73 Fax: 0 2 3 5 3 1 0 5 4 3
-
INDX@ Campy (jci)” 50 test kit Catalog # 2200-01 -5 0 (voorheen Meritec”-Campy (jcl), #203050, Meridian Diagnostics) Integrated Diagnostics, Inc. Baltimore. MD 2 1 2 2 7 USA in NL via:
Siotrading Poctbus 254 3 6 4 0 AG Mijdrecht Tel: 0 2 9 7 286848 Fax: 0297 2 8 7 5 7 0
Microscreen Catnpylobacter, M46 Microgen Bioproducts Ltd. (voorheen Mercia Diagnostics) 1, Admiralty Way, Camberley, Surrey GU1 5 3DT, UK @
In NL via:
Lucron bioproducts BV. Postbus 5 7 6590 AB Gennep Tel: 0485 5 1 1675 Fax: 0 4 8 5 5 1 2 0 5 2
32
Bijlage
B
Voor de eerstelijnscontroie van de methode dienen t e worden meegenomen: Blanco controle Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle buis wordt afgeënt op een mCCDA-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op de mCCDA-plaat. Indien een hoeveelheid {btindedarm)mest direct met behulp van een swab wordt geënt op een mCCDA-plaat, dan wordt een onbeënte mCCDA-plaat gebruikt als blanco controle,. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op deze mCCDA-plaat. Positieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni. (bijvoorbeeld ATCC 29428). Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Prestonbuis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle buis wordt afgeënt op een mCCDA-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mCCDA-plaat groei te zien zijn m e t de typische morfologische kenmerken. Indien op het laboratorium monsters (b1indedarm)mest worden ingezet, dan wordt een mCCDA-plaat aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mCCDA-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken. Tevens kan deze referentiestam gebruikt worden als positieve controle bij de uitvoering van de oxidase test, de microscopie en eventueel de agglutinatie test en/of TSI-buis. Voor de ingangscontrole van een batch dienen t e worden meegenomen: Positieve controle zie boven Negatieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze controlestam mag op een mCCDA-plaat geen 'verdachte' kolonies te zien geven. Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden. Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden.
33
BIJLAGE 111: Vermeldingswijze van de resultaten van Salmonella onderzoeken Monsters die in de pluimveevlees- en eiersector worden genomen voor bacteriologisch onderzoek: A. inlegvellen (opfokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven en vleeskuikenbedrijven) : Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n w e l afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid v a n Salmonella in inlegvellen’.
B. mest {cloacaswabs) (opfokbedrijven, fokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven) Cloacaswabs 4 weken: Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- d a n w e i afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ’aanwezigheid v a n Salmonella in swabs‘. C. cloacaswabc vanaf 16 weken: Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n w e l afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs‘. C. dons (broederiien) Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n w e l afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ’aanwezigheid van Salmonella in dons‘.
D. mest (swabs of overschoentjes) (vleeskuikenbedrijven) Swabs: Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- d a n w e l afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’. Overschoentjes: Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ’aanwezigheid van Salmonella in overschoentjes’.
E. blindedarm {slachterijen) Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ’aanwezigheid van Salmonella in blindedarmmest’. F. vellen (slachterijen) Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n w e l afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in vellen’ G. eindproducten (slachterijenluitsnijderijen) H e t laboratorium bepaalt of Salmonella aan- d a n wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in eindproduct’.
H. swabs (broederijen/pluimveestallen) Het laboratorium bepaalt o f Salmonella aan- d a n w e l afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.
34
Bijlage IV: Serologische bevestiging en serotypering 3.1
Serologische bevestiging.
Onderzoek op auto-agglutinatie: Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing t0,85% NaCI). Breng met een steriele entnaald een beetje materiaal van de te onderzoeken kolonie in de druppel zodat een troebeling ontstaat. => Beweeg gedurende 30-60 seconden het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken) 3 Beoordeel het resultaat tegen een donkere achtergrond (met een vergrootglas). De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op auto-agglutinatie v a n de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen worden niet onderzocht met polyvalent 0serum.
3
=
I
Agglutinatie methode: Agglutineer van Salmonella-verdachte kolonies m e t polyvalent serum A t/m E of A t/m G; indien negatief vervolgen met polyvalent serum A t / m S. 3 Breng op een objectglas een druppel antiserum. 3 Breng met een steriele entnaald een beetje materiaal van de t e onderzoeken kolonie in de druppel zodat een lichte troebeling ontstaat. s Beweeg gedurende 30-60 seconden het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken). 3 Beoordeel het resultaat tegen een donkere achtergrond (met een vergrootglas). De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op een positieve reactie van de onderzochte stam.
3.2
Serotypering.
Agglutineer van Salrnonella-verdachte kolonies eerst met serum A t / m E of A tim G; indien negatief vervolgen met polyvalent serum A t / m S.
Bij een positieve agglutinatie met polyvalent A t / m G wordt geagglutineerd met de groepssera B, C (C1 en C2),D en E 11 t / m 5). Indien positief met B, dan wordt vervolgens geagglutineerd met flagellair antiserum H-i, Hiertoe wordt een schuine agar (bijvoorbeeld nutriëntenagar) beënr (middels ladderen) met de t e agglutineren Salmonella en wordt 1 druppel fysiologisch zout (0,85% NaCI) aan deze buis toegevoegd. Na 24 I 2 uur incuberen bij 37°C wordt cultuur van de vochtige schuine zijde genomen voor de agglutinatie met H-i serum. Indien H-i positief dan heeft men een Salmonella typhimurium. Indien H-i negatief dan is het een Salmonella B groep. Indien positief met D, dan wordt vervolgens geagglutineerd met flagellair antiserum H-m. Indien H-m positief dan heeft men een Salmonella enteritidis. Indien H-m negatief dan heeft men Salmonella D groep. Salmonella die alleen met polyvalent A t i m S agglutineren, kunnen, indien gewenst, voor typering opgestuurd worden naar het RIVM, t.a.v. Infectieziekten, Diagnostiek e n Screening laboratorium. Dit geldt tevens voor alle niet-serotypeerbare Salmonetla.
35
Bijlage V: Opmerkingen Opdrachtgever bij aanleveren afwijkende m onsters, a cce pt at ie criteria
Indien afwijkingen in de voorgeschreven kwaliteit en wijze van aanleveren van monsters zijn geconstateerd, moet in ieder geval bij de volgende punten richting de opdrachtgever een opmerking worden gemaakt, waaruit blijkt dat er in de procedure van monstername en inzenden een afwijking is geconstateerd en om welke afwijking het gaat. Ten algemene. Indien er tussen de datum van monstername e n de datum van ontvangst op het laboratorium meer dan 48 uur is verstreken. s Indien bij de inzending één van de volgende gegevens ontbreekt: monsterdatum, stalnummer en KIP-nummer. 3 Indien monsters zodanig zijn verpakt dat lekkage is opgetreden en zodanig zijn geadresseerd dat voor transporteur en laboratorium verwarring kan ontstaan. 3
Monsters. Inlegvellen (opfokbedrijven, opfokvermeerderincysbedrijven en vleeskuikenbedrijven: a) Indien onvoldoende inlegvellen worden aangeleverd. b) Indien de monsters inlegvellen onvoldoende groot zijn. c ) Indien de monsters inlegvellen niet duidelijk met mest zijn besmeurd. d) Indien de monsters inlegvellen niet worden aangeleverd in een plastic monsterpot of -zak. Dons (broederijen): a) Indien het monster niet minimaal 25 gram dons bevat. b) Indien het monster geen natte dons bevat. c ) Indien het monster niet in een monsterpot of -zak wordt aangeleverd. Mest (swabs of overschoentjes) (vleeskuikenbedrijven): Swabs: a) Indien onvoldoende swabs worden aangeleverd. b) Indien de swabs onvoldoende met mest zijn besmeurd. c) indien de swabs niet tot twee mengmonsters zijn gepoold (tenzij de swabs individueel zijn verpakt). d) Indien de swabs niet in monsterpotten worden aangeleverd. Overschoentjes: a) Indien onvoldoende paar overschoentjes zijn aangeleverd. b) Indien de overschoentjes niet duidelijk met mest zijn besmeurd. c ) Indien de overschoentjes niet in monsterzakken worden aangeleverd. d) Indien elk paar overschoentjes niet in een aparte monsterzak is verpakt. Blindedarmmest [slachterijen): a ) Indien onvoldoende blindedarm monsters zijn genomen. b) Indien de blindedarm monsters van onvoldoende formaat zijn. c) Indien de blindedarm monsters niet in kunststofbakjes zijn aangeleverd.
36
Veilen (slachterijen): a) Indien h e t monster vel van de borstkap niet minimaal 25 gram weegt. b) Indien het monster niet gekoeld ( O - 4 'C) getransporteerd en bewaard is. Eindproducten (slachterijen/uitsnijderijen): a) Indien het monster eindproduct niet minimaal 25 gram weegt. b). Indien het monster niet gekoeld ( O - 4 OC) getransporteerd en bewaard is.
Productschap Vee en Vlees
P W 16
Besluit verstrekking gegevens verhandeling ( P W )2004 Besluit van het bestuur van het Productschap Vee en Vlees van 11 februari 2004, houdende aanwijzing gegevens die door ondernemers dienen t e worden verstrekt ter zake van nationale en internationale verhandeling en vaststelling van een daartoe bestemd formulier (Besluit verstrekking gegevens verhandeting (PVV) 2004) Het bestuur van het Productschap Vee en Vlees; Gelet op artikel 7 van de Verordening registratie en verstrekking van gegevens (PVV) 2003; Besluit:
Artikel 1
1. De ingevolge artikel 6 van de Verordening registratie en verstrekking van gegevens (PVV) 2003 t e verstrekken gegevens hebben tevens betrekking op nationale en internationale verhandeling als bedoeld in artikel 7, eerste lid, sub g, van de Verordening registratie en verstrekking van gegevens (PVV) 2003.
2. De in het eerste lid bedoelde gegevens worden, op verzoek van de voorzitter van het productschap, door de ondernemer verstrekt door middel van het formulier volgens h e t in de bijlage opgenomen model.
Artikel 2
1. Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin het wordt geplaatst.
2. Dit besluit wordt aangehaald als: Besluit verstrekking gegevens verhandeling (PVV) 2004.
Zoetermeer, 11 februari 2004
J.J. Ramekers, voorzitter S .B.M. Jongerius secretaris
37
TOELICHTING BIJ HET BESLUIT VERSTREKKING GEGEVENS VERHANDELING (PVV) 2004 Ter vervulling van de taken van het productschap is de monitoring van de handelsactiviteiten in de sector noodzakelijk. Tot op heden zijn de ondernemers niet gehouden gegevens te verstrekken inzake de grensoverschrijdende handelsactiviteiten. In verband met de toenemende internationalisering van de handel is het in voorkomend geval gewenst dat zowel de gegevens inzake de nationale als de internationale verhandeling worden verstrekt. Grondslag van het besluit vormt artikel 7 van de Verordening registratie en verstrekking van gegevens (PVV) 2003. Met onderhavig besluit kan aan ondernemers uit hoofde van de genoemde verordening de verplichting worden opgelegd gegevens te verstrekken die tevens betrekking hebben op handelsactiviteiten. Ondernemers dienen de te verstrekken gegevens volledig en naar waarheid in t e vullen op het formulier zoals opgenomen in het model bij dit besluit. De indiening van het formulier aan het productschap geschiedt op een door het productschap te bepalen tijdstip.
Zoetermeer, 11 februari 2004 J.J. Ramekers, voorzitter
S.B.M. Jongerius secretaris
38
BIJLAGE BIJ HET BESLUIT VERSTREKKING GEGEVENS VERHANDELING (PVVI 2004 OVERZICHT ONTVANGEN DIEREN IN (kalenderjaar)
dieren:
Intvangen van: (naam en idres handelaar)
Aldus naar waarheid ingevuld d.d. (datum en naam):
39
Vijze van ntvangst: (levend f geslacht Intvangen)
idien ieslacht, in Iederland teslacht?
Productschap Zuivel PZ 4
Verordening tot wijziging (5)van de Zuivelverordening 1994, Uitvoering regeling superhefing Verordening van het Productschap Zui,vel van 18 juni 2003, tot wijziging (5) van de Zuivelverordening 1994, Uitvoering regeling superheffingHet bestuur van het Productschap Zuivel; Gelet op artikel 3 van de Verordening (EG) nr. 1392/2001 van de Commissie van 9 juli 2001 houdende vaststelling van de uitvoeringsbepalingenvan Verordening (EEG) nr. 3950192 van de Raad tot instelling van een extra heffing in de sector melk en zuivelproducten (PbEG L 187), de artikelen 9 en 34 van de Regeling superheffing 1993 en artikel 96 van de Wet op de bedrijfsorganisatie; Besluit: Artikel I
De Zuivelverordening 1994, Uitvoering regeling superheffing wordt als volgt gewijzigd: Artikel 14 vervalt. Artikel II
Deze verordening treedt in werking met ingang van de dag na publicatie in het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie en werkt terug tot en met 1 maart 2003. Zoetermeer, 18 juni 2003 G.A. Koopstra voorzitter F. Beekman secretaris
Goedgekeurd door de h.nister van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit bij "eschikking TRCJZ/2003/5734 d.d. 9 februari 2004. TOELICHTING
Verordening (EG) nr, 139212001 bevat onder meer een regeling over de bepaling van het representatieve vetgehalte in geval van aankoop van fabrieksquoturn. In dat geval wordt het representatieve vetgehalte van de verkrijger van het quotum gemiddeld met het representatieve vetgehalte van degene van wie het quotum is gekocht (gewogen gemiddelde). Het productschap is belast met de uitvoering van de regeling {artikel 9 van de Regeling superheffing 7993). In artikel 14 van de productschapsverordening staan nadere voorschriften over de wijze waarop het productschap het nieuwe representatieve vetgehalte van de verkrijger berekent in specifieke overdrachtsituaties. De voorschriften zijn bedoeld om tegen te gaan dat oneigenlijk voordeel wordt verkregen van het in ons land toegepaste systeem van afronding van het tweede cijfer achter de komma. Dit systeem wordt i
Vb. Bo 24 juni 1994, nr. 26; laatstelijk gewijzigd bij Verordening tot wijziging (4) van de Zuivelverordening 1994, Uitvoering regeling superheffing, Vb. Bo 31 mei 2002,nr. 32.
40
niet meer toegepast voor overdrachten die op of na 1 maart 2003 bij het productschap zijn aangemeld. Daarom komt de betrokken bepaling te vervallen. Zoetermeer, 18 juni 2003 G.A. Koopstra voorzitter
F. Beekman secretaris Hoofdbedrijfschap voor de Detailhandel HBD 1
Eerste wijzigingsverordening Verordening Arbeidsvoorwaarden Detailhandel 2003
Verordening van het Hoofdbedrijfschap Detailhandel van 28 januari 2004, houdende wijziging van de Verordening Arbeidsvoorwaarden Detailhandel 2003 werste wijzigingsverordeningVerordening Arbeidsvoorwaarden Detailhandel 2003) Het bestuur van het Hoofdbedrijfschap Detailhandel; Gelet op artikel 93, tweede lid van de Wet op de bedrijfsorganisatie; Besluit:
ARTIKEL I
in de Verordening arbeidsvoorwaarden detailhandel 2003 van 23 april 2003 (Verordeningenblad Bedrijfiorganisatie27 juni 2003, m. 41, €€l3D8) worden de navolgende wijzigingen aangebracht: A Aan artikel 5 , worden een vierde en vijfde lid toegevoegd, luidende: Het loon van de werknemer, dat hoger ligt dan het loon volgens de voor hem 4. geldende loonschaal, wordt met ingang van 1maart 2004 verhoogd met 2,5%. Deze verhoging geldt niet voor werknemers die zijn ingedeeld in functiegroep I en die recht hebben op het wettelijk minimum loon. 5.
Voor werknemers in een onderneming aan wie generiek in de periode 1 oktober 2002 tot en met 29 februari 2004 een loonsverhoging is toegekend, kan deze verhoging in mindering worden gebracht op de verhoging als bedoeld in het vierde lid. Indien die loonsverhoging in deze periode hoger was dan 2,S%, zal deze niet neerwaarts worden bijgesteld.
B De loonschalen opgenomen in de bijlage, genoemd in artikel 5 , lid 1, worden gewijzigd als volgt:
41
Bijlage 1 Loonschalen per 1 maart 2004 in euro's Loonschalen per week leeftijdl Groep Functiejaar I 15 87,55 16 100,70 17 115,30 18 132,RO 19 153,25 20 179,50 21 21I,60 22 248,lO 2WO 291,9û I1 12 13 14 Loonschalen per maand leeftijdl Groep Functiejaar I 15 379.45 16 436,35 17 499,60 18 575,50 19 664,OO 20 777,85 21 917,OO 22 . 1.075,lO 2310 1.264,80 I1 12 13 14 Loonschalen per 4 weken leeftijdl Groep I Functiejaar 15 350,20 16 402,80 17 461,20 18 531,ZO 19 6i3,W 20 718,OO 21 846,40 22 992,40 2310 1.167,60 11 12 13 14
Groep
I1 104,17 119,48 137,72 158,91 185,97 219,52 257,18
30230 307,19 313,34
Groep II 452,57 517,88 596,73 688,55
806,25 950,43 1.114,63 I.311,I9 1.331,20 I.357.82
Groep II 496,68 477,86 550,88 635,62 743,87 878,08 1.028,71 1.209,97 1.228,79 I.253,38
Groep 111
141,83 163,60 191,27 225,98 264,83 311,32 317,79 324,26 330,76
Groep 111
613,81 70835 829,79 978,lO 1.147,OO 1.34944 1.376,51 1.4O4,17 I.432,25
Groep 111
567,32 654,42 765,07 903,93 1.059,32 1.245,30 1.271,I5 1.297,04 1.323,04
Groep IV
Groep
197,15 231,88 271 ,a9 320,14 328,313 336,63 344,86 351,76
20421 239,45 279,55 327,Bl
v
336,05 344,28 353,lO 360,16
Groep IV
Groep V
853,33 1.005,78 1.I 79,37 1.387,70 1.422,41 1.457,72 1.494,21 1.524,09
i .038,13 I.21 I, i 4 1.419,46 I.454,78 1.491,27 I.528,35 1.558,91
8B5,11
Groep IV
Groep
788,60 92?,48 I.087,56 1.280,54 1.313,54 I.346,53 1.379,43 1.407,06
816.89 957,78 1.118,18 1: .31I,20 1.344,19 1.3773 1 I.412,42 1.440,67
v
N.B. 1. In de loonschalen gaat het om bruto lonen. 2. De lonen van groep 1zijn de geldende wettelijk minimumlonen. In de tabel zijn de wettelijke minimum lonen per Ijuli 2003 opgenomen.
42
ARTIKEL II 1.
De verordening kan worden aangehaald als Eerste wijzigingsverordening Verordening Arbeidsvoorwaarden Detailhandel 2003.
2.
Deze verordening treedt in werking met ingang van 1 maart 2004.
Den Haag, 28 januari 2004
A.F. Kolkman voorzitter E.E. van de Lustgraaf secretaris Goedgekeurd door de Bestuurskamer van de Sociaal-Economische Raad bij besluit van 23 februari 2004.
Toelichting De VAD is een restregeling voor die branches en ondernemingen waarvoor nog geen privaatrechtelijk tot stand gekomen CAO geldt. Het HBD heeft een aantal jaren geleden een werkgroep VAD ingesteld die tot taak heeft te stimuleren dat de branches en ondernemingen die thans nog onder de VAD vallen onder te brengen in CAO’s. Om branches en ondernemingen onder de werkingssfeer van een CAO te brengen moet of de werkingssfeer van de bestaande CAO’s worden uitgebreid, of moeten nieuwe CAO’s worden afgesloten. De VAD komt per 1juii 2004 te vervallen. Gestreefd werd vóór de hierboven genoemde datum van 1juli 2004 alle onder de VAD ValIende branches onder te brengen in CAO’s.Veel branches zijn in de loop van de tijd al onder de werkingssfeer van CAO’s gebracht. Het voorstel tot wijziging van de loonschalen van de Verordening Arbeidsvowwaarden Detailhandel 2003 per i maart 2004 is een bestuursbesluit. De lonen zijn smds 1 oktober 2002 niet verhoogd. De verhoging per 1 oktober 2002 was gebaseerd op de loonontwikkelingen2001. De verhoging per 1 maart 2004 betreft dan ook een inhaalslag conform de afspraak in de STAR (Stichting van de Arbeid) en betreft nog de aanpassing, gebaseerd op de loonontwikkelingen2002. Het is denkbaar dat sommige werkgevers niet op de onderhavige VAD-wijzigingen hebben gewacht en al eerder zijn overgegaan tot een algemene loonsverhoging VOM hun werknemers.Om te voorkomen dat daar bovemp per 1 maart 2004 nog een 2,5% loonsverhoging zou moeten worden toegepast, is in artikel 5, lid 5, bepaald dat de eerdere verhoging in mindering kan worden gebracht op de thans voorgeschreven loonsverhoging.Mocht over de toepassing van deze bepaling tussen een werkgever en een werbemer discussie ontstaan, dan kan ingevolge artikel 23, tweede lid, aan de Kleine Commissie VAD om uitleg worden gevraagd.
43
De wijziging van de VAD heeft op geen enkele wijze invloed op de privaatrechtelijke CAO-onderhandehgen. Het betreft immers een verlate aanpassing aan de loonstijgingen over 2002.Bovendien is het een besluit van het bestuur HBD en geen resuitaat van onderhandehgen van sociale parhers. Bestuurspartijen communiceren dit ook met hun achterbannen.
De VAD verdwijnt per 1juli 2004.De Werkgroep VAD za1 een uiterste inspanning plegen om vrijwel alle werknemers in de detailhandel onder een CAO te laten vallen. Er zal een communicatieplan worden ontwikkeld met betrekking tot het verdwijnen van de V A D op 30 juni 2004. De in Groep I opgenomen lonen zijn de lonen volgens het geldende wettelijk minimum loon op het moment van vaststelling van onderhavige verordening. Indien het wettelijk minimum loon nadien wordt gewijzigd, geldt uiteraard het gewijzigde wettelijk minimum loon. Den Haag, 28 januari 2 0 4 A.F. Kolkman voorzitter E.E. van de Lustgraaf secretaris
44
Wettelijk voorgeschreven uitgave van de SociaalEconomische Raad met mededelingen, verordeningen en besluiten van de publiekrechtelijke bedrijfsorganisatie (pbo). Verschijnt wekelijks. ISSN 0920-4865 SociaalEconomische Raad
Redactie: Bezuidenhoutseweg 60 Postbus 90405 2509 LK Den Haag Telefoon: 070 - 3 499 499 Telefax: 070 - 3 832 535 E-mail:
[email protected] De SER heeft een eigen website op het Internet. Deze is te vinden op www.ser.nl Opgave abonnementen, opzeggingen en adreswijzigingen uitsluitend schriftelijk bij de abonnementenadministratie van de SER. Abonnementsprijs 136,13 per jaar, losse nummers 3,40.
