Ověření tvorby biogenních aminů mikroflórou trávicího traktu člověka Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Ověření tvorby biogenních aminů mikroflórou trávicího traktu člověka Diplomová práce

Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc.

Brno 2012

Vypracoval: Bc. Petra Svobodníková

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Ověření tvorby biogenních aminů mikroflórou trávicího traktu člověka vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne………………………………………. podpis diplomanta ………………………

Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala prof. MVDr. Ing. T. Komprdovi, CSc. za poskytnutí odborného vedení a cenných rad při zpracování diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. P. Sládkové, PhD., za pomoc při práci v laboratoři. Ing. M. Kolářové za poskytnutí dílčích výsledků k její disertační práci. Firmě Hollandia a.s. za poskytnutí vzorků jogurtů a v neposlední řadě bych ráda poděkovala za finanční podporu IGA MENDELU IP 19/2011.

ASTRAKT Praktická část diplomové práce se zabývá schopností tvorby dekarboxylázové aktivity u mikroorganismů získaných ze vzorků stolice probandů. Došlo k rozdělení do 3 skupin (kontrolní, probiotické, synbiotické), každá skupina obsahovala 22 probandů ve věku 22±3 roky. Dekarboxylázová aktivita se stanovovala 0. 21. a 28. den pomocí metody HPLC. Rod Enterococcus a BMK byly ve všech vzorcích stanoveny jako tyrosindekarboxyláza pozitivní. U rodu Bacteroides a BIFI nebyla dekarboxylázová aktivita naměřena ani v jednom ze vzorků. U rodu Clostidium, Eubacterium a druhu E. coli měla dekarboxylázová aktivita tendenci se snižovat u skupiny probiotické a synbiotické, ale vliv skupin nebyl statisticky průkazný (p ˃ 0,05). Klíčová slova: probiotika, prebiotika, mikroorganismy, dekarboxylační aktivita, metoda HPLC.

ABSTRACT The practical part deals with the ability of microorganisms amino acid decarboxylase activity in stool samples obtained from probands. Was divided into 3 groups (control, probiotic, synbiotic), each group contained 22 probands aged 22 ± 3 years. Amino acid decarboxylase activity was determined by 0th, 21st and 28st day using the HPLC method. The genus Enterococcus and LAB were determined in all samples as a tyrDC positive. The genus Bacteroides and Bifi dekarboxylase activity was measured in either of the samples. In the genus Clostidium, Eubacterium and species E. coli had amino acid decarboxylse activity tends to reduce the probiotic group and synbiotic, but the influence of groups was not statistically significant (p ˃ 0.05). Keywords: probiotics, prebiotics, micro-organisms, decarboxylation activity, HPLC method.

Obsah 1

ÚVOD ..................................................................................................... 9

2

LITERÁRNÍ PŘEHLED ................................................................... 10 2.1

Trávicí trakt člověka ....................................................................................... 10

2.2

Kolonizace střeva .............................................................................................. 10 Mikroorganismy osídlující trávicí trakt člověka .................................... 11

2.2.1 2.2.1.1

Rod Streptococcus ....................................................................................... 12

2.2.1.2

Rod Clostridium ........................................................................................... 12

2.2.1.3

Escherichia coli .............................................................................................. 13

2.2.1.4

Rod Bacterioides............................................................................................. 14

2.2.1.5

Rod Bifidobacterium ...................................................................................... 14

2.2.1.6

Rod Lactobacillus ........................................................................................... 15

Probiotika ............................................................................................................. 15

2.3 2.3.1

Mechanismus působení ................................................................................. 16

2.3.2

Zdravotní účinky ............................................................................................ 16

Prebiotika .............................................................................................................. 19

2.4 2.4.1

Druhy prebiotik .............................................................................................. 20

2.4.2

Pozitivní účinek prebiotik............................................................................. 21

2.5

Synbiotika ............................................................................................................. 22

2.6

Charakteristika biogenních aminů .......................................................... 22

2.6.1

Chemická struktura a dělení ....................................................................... 22

2.6.2

Vznik biogenních aminů ............................................................................... 24

2.6.2.1

Podmínky vzniku ........................................................................................ 25 Fyziologický účinek, toxicita, toxický účinek ........................................... 26

2.6.3 2.6.3.1

Fyziologický účinek ..................................................................................... 26

2.6.3.2 Toxicita ................................................................................................. 27 2.6.3.3 Toxický účinek...................................................................................... 27 2.6.4

Hygienický význam biogenních aminů v potravinách ........................... 28

2.6.5

Výskyt BA a polyaminů v potravinách ..................................................... 29

2.6.5.1 V mase a masných výrobcích ............................................................... 29 2.6.5.2 V rybách a rybích produktech .............................................................. 30 2.6.5.3 V sýrech a mléčných výrobcích ............................................................ 30 2.6.5.4 V pivu a vínu ......................................................................................... 31 2.6.6

Mikroorganismy produkující biogenní aminy ..................................... 31

2.6.7

Charakteristika významných MO produkujících biogenní aminy .... 31

2.6.7.1 Bakterie mléčného kvašení .................................................................. 31 2.6.7.2 Rod Enterococcus ................................................................................. 32 2.6.8

Stanovení biogenních aminů .................................................................. 35

2.6.8.1 Chromatografie obecně ........................................................................ 36 2.6.8.2 HPLC (vysoce účinná kapalinová chromatografie) ......................... 37 2.6.8.3 Využití HPLC pro stanovení BA .......................................................... 40

3

CÍL........................................................................................................ 42

4

MATERIÁL A METODY.................................................................. 43 4.1

Materiál .................................................................................................................. 43

Jogurty .............................................................................................................. 43

4.1.1

Metody .................................................................................................................... 43

4.2

4.2.1

Stanovení bakterií rodu Enterococcus .................................................. 44

4.2.2

Stanovení bakterií rodu E. coli .............................................................. 45

4.2.3

Stanovení bakterií rodu Lactobacillus acidophilus a BMK ................ 46

4.2.4

Stanovení bakterií rodu Eubacterium .................................................. 47

4.2.5

Stanovení bakterií rodu Bacteroides ..................................................... 48

4.2.6

Stanovení bakterií rodu Clostridium .................................................... 49

4.2.7

Stanovení bakterií rodu Bifidobacterium ............................................. 50

4.2.8

Testování tyrosindekarboxylázové a histidindekarboxylázové aktivity

izolovaných MO z trávicího traktu v dekaroxylačním mediu (DCM) ............... 51 Stanovení biogenních aminů pomocí HPLC ................................................... 53

4.2.9 4.3

5

Statistické vyhodnocení ............................................................................................ 54

VÝSLEDKY A DISKUZE ................................................................. 55 5.1

Stanovení dekarboxylázové aktivity u rodu Enterococcus, BMK (resp.

Lactobacillus acidophilus) ......................................................................................... 55 5.2

Stanovení dekarboxylázové aktivity druhu E. coli ..................................... 57

5.3

Stanovení dekarboxylázové aktivity rodu Clostridium ............................... 61

5.4

Stanovení dekarboxylační aktivity rodu Eubacterium................................ 65

5.5

Vliv délky konzumace jogurtů na tvorbu tyrosindekarboxylázy .............. 69

6

ZÁVĚR................................................................................................. 72

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY............................................... 74

8

SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ................................................ 84

9

8.1

Seznam obrázků ............................................................................................. 84

8.2

Seznam tabulek............................................................................................... 85

SEZNAM ZKRATEK ........................................................................ 87

1

ÚVOD Probiotika a prebiotika mají pozitivní vliv na modulaci střevní mikroflóry a tím

schopnost ovlivnit zdraví hostitele. Zkoumány jsou i nejvhodnější kombinace probiotických a prebiotických druhů se schopností potlačit druhy patogenní. Není známo mnoho experimentů zaměřených na identifikaci dekarboxyláza - pozitivních bakterií trávicího traktu s následnou tvorbou BA. Schopnost tvořit BA byla popsána u některých mikroorganismů zejména čeledi Enterobacteriaceae, Pseudomonas ssp., a u bakterií mléčného kvašení. Biogenní aminy jsou přírodní antinutriční faktory a jsou důležité z hygienického hlediska, neboť byly zahrnuty jako původci otrav z jídla. Histamin, putrescin, kadaverin, tyramin, tryptamina, β-fenyletylamin, spermin a spermidin jsou považovány za nejvýznamnější biogenní aminy se vyskytující v potravinách. Hlavním zdrojem jsou ryby, sýry, pivo a víno. Sýry představují ideální prostředí pro tvorbu BA, které vznikají především dekarboxylací volných aminokyselin za působení bakteriálních dekarboxyláz. Analýza je velmi důležitá, protože BA mohou být využity jako ukazatele stupně čerstvosti a kazivosti potravin. Některé metody byly vyvinuty pro stanovení biogenních aminů v potravinách. Analytické metody používané pro kvantifikaci BA jsou založeny především na chromatografických metodách: chromatografie na tenké vrstvě (TLC), plynová chromatografie (GC), kapilární elektroforéza (CE) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). HPLC se nejčastěji používá pro analýzu BA.

9

2

LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1 Trávicí trakt člověka Gastrointestinální trakt člověka se skládá z úst, dutiny ústní, jícnu, žaludku, tenkého a tlustého střeva. Tlusté střevo se dělí na několik částí, a to na slepé střevo, vzestupný, příčný a sestupný tračník, esovitou kličku, poslední částí je konečník (Macfarline a Cummings, 1991). Ústa skrývají komplexní mikroflóru sestávající z fakultativních a přísně anaerobních MO včetně streptokoků, Bacteroides, laktobacilů a kvasinek, tato mikroflóra je silně ovlivněna faktory životního prostředí a výživovými faktory. V žaludku a dvanáctníku jsou zastoupeny nejvíce laktobacily, streptokoky a kvasinky. V tenkém střevě převládají laktobacily, koliformní bakterie, streptokoky, bifidobakterie a fusobakterie a to v koncentraci 104 KTJ/g (Švestka, 2008). Kolonizace horního střeva koliformními organismy je příznačná pro některé infekční patogeny, jako je Vibrio cholera a enterotoxigenní Escherichia coli. Tlusté střevo obvykle obsahuje bujnou mikroflóru s celkovou koncentrací 1011 bakterií / g stolice. Anaeroby, jako jsou Bacteroides, anaerobní streptokoky, a klostridií převyšují fakultativní anaeroby, jako je E. coli (Gorbach, 1993).

2.2 Kolonizace střeva Na kolonizaci střeva se podílí několik faktorů Porod Plod v děloze je sterilní. Rozvoj střevní mikroflóra je zahájena v průběhu porodu. Prvními obyvateli dětského střeva jsou bakterie pocházející od matky. U vaginálního porodu k tomu přispívá vaginální flóra matky. Zatímco u císařského řezu je klíčové nemocniční prostředí. U těchto dětí dochází ke kolonizaci opožděně. Pro děti narozené císařským řezem je charakteristický nižší výskyt laktobacilů a bifidobakterií. Prvními

10

mikroorganismy osídlujícími trávicí trakt jsou enterobakterie (E. coli) a enterokoky, ty jsou dominantní první týdny života. Následují bifibakterie, Clostridium a Bacterioides. Výživa Dalším faktorem ovlivňujícím osídlení trávicího traktu novorozence je kromě způsobu porodu také výživa. U kojených dětí jsou dominantní z 90% bifidobakterie a laktobacily. Převaha bifidobakterií je způsobena látkami, které jsou obsaženy v mateřském mléce a selektivně příznivě působí právě na růst bifidobakterií a laktobacilů (bifidogenní faktor). Tento bifidogenní faktor je v mateřském mléce tvořen převážně oligosacharidy odvozenými od laktózy a glykoproteinů. Dospělého typu střevní mikroflóry je dosaženo ve věku 1 až 2 let. Od 2 let se mikroflóra stává stabilnější a v dospělosti zůstává konstantní. Věk Mikroflóra dospělého jedince zahrnuje nepředstavitelné množství mikroorganismů (1014, váha více než 1kg), převyšující počet buněk lidského organismu o jeden desítkový řád. Mikrobiální systém zahrnuje více než 500 druhů. Mezi nimi převažují rody Bacteroides a Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus a Escherichia. Ve střevní mikroflóře seniorů bylo zjištěno snížení počtu bifidobakterií a naopak

zvýšení

klostridií,

laktobacilů,

streptokoků

a

Enterobacteriaceae

(Saunier, Dore, 2002). Léky, antibiotika Požití antibiotik způsobuje poškození mikroflóry (Bourlioux a kol., 2003). 2.2.1

Mikroorganismy osídlující trávicí trakt člověka Lidská střevní mikroflóry představuje komplexní ekosystém, který je dnes uzná-

ván pro svůj vliv na lidské zdraví a pohodu. Přispívá k dozrávání imunitního systému a poskytuje přímou bariéru proti kolonizaci patogeny způsobujícími alergie, zánětlivá onemocnění

střev

a

případně

i

metabolické

a

degenerativní

onemocnění

(Salminen a kol., 1998). Jedná se o soubor mikroorganizmů, které jsou přítomny v trá-

11

vicím traktu zdravého člověka a jsou v určité kvantitativní a kvalitativní rovnováze, což je jedna ze základních schopností tohoto systému (Švestka, 2008).

2.2.1.1 Rod Streptococcus Steptococcus jsou gram – pozitivní, kulovité bakterie mléčného kvašení. Buněčné dělení probíhá kolem osy a tím je lze pozorovat v párech nebo řetězcích. Některé druhy streptokoků jsou zodpovědné za nemoci u lidí a zvířat. Mezi tyto nemoci patří bolesti v krku, zápal plic, meningitida, endokarditida a bachorová acidóza u zvířat. Nicméně, mnoho kmenů je nepatogenních a vyskytují se jako přirození komenzálové flóry na kůži, v dutině ústní a nosohltanu, horních cest dýchacích, trávicího ústrojí a urogenitálního traktu člověka i zvířat. Druhy žijící v gastrointestinálním traktu člověka jsou fakultativně anaerobní (Juneja, Sofos, 2010). 2.2.1.2 Rod Clostridium Klostridie jsou různorodá skupina bakterií, které mají bohatou historii v lékařství a průmyslové mikrobiologii. Rod Clostridium jsou přísně anaerobní sporotvorné tyčinky, které rostou v nepřítomnosti kyslíku. Způsobují různá onemocnění zvířat a lidí. Toxiny a enzymy jsou hlavními faktory virulence, které přispívají nemocem, mezi něž patří botulismus, tetanus, sněť a rané záněty. Hrají důležitou roli v kvasných procesech pro výrobu rozpouštědel a organických kyselin (Johnoson, 2009). Do rodu Clostridium patří několik lékařsky významných druhů: Clostridium botulinum způsobuje botulismus. Projeví se za 6 – 72 hod. po požití kontaminované potraviny. Dostaví se bolest hlavy, nevolnost, zvracení, sucho v ústech, dvojité vidění, ochrnutí dýchacího svalstva. Léčebně se podává antibotulinové sérum. Při dostatečném ohřevu potravin se toxin zničí. Clostridium tetani způsobuje tetanus. Jeho toxin ovlivňuje nervový systém a způsobuje charakteristické křeče. V ČR se povinně očkuje.

12

Clostridium difficile je součástí střevní flóry u lidí. Nebezpečí spočívá v jeho pomnožení ve střevě lidí při léčbě určitými druhy antibiotik. Tvoří toxiny, které poškozují výstelku střeva. Objevují se bolesti břicha a vodnaté průjmy (Votava a kol., 2003).

2.2.1.3 Escherichia coli Escherichia coli je běžný komenzál tlustého střeva. Fekálním znečištěním se dostává do vody, kde může přežít řadu týdnů. Slouží jako nejběžnější indikátor fekální kontaminace pitné vody. Jde o gram - negativní tyčinky se zaoblenými konci, 2-3 µm dlouhé a 0,6 µm široké, někdy mohou být krátké - kokobacilární, barví se homogenně. Na povrchu mají různé typy fimbrií, z nichž jedny jsou zastoupeny ve velkém počtu na povrchu bakteriální buňky a umožňují adhezi na hostitelskou buňku. Některé typy E. coli tvoří pouzdra a jejich kolonie mají hlenovitý charakter. Podle antigenní struktury se dělí na sérotypy. Somatických (O) antigenů je 167, k nim se váží K a H antigeny, takže jejich kombinací vzniká 240 sérotypů. Kapsulární antigeny se dělí podle chemického složení na ty, které jsou tvořeny kyselými nebo neutrálními polysacharidy, a na ty, které se skládají z bílkovin a tvoří struktury podobné fimbriím. Patogenní Escherichia coli vyvolává 2 typy onemocnění: -

extraintestinální (zejména močových cest, septická onemocnění, infekce ran,

hnisavé procesy) -

v intestinálním traktu infekce provázené průjmy (určité kmeny)

Extraintestinální formy jsou vyvolány převážně komenzálními sérotypy a infekce je často endogenní. Mohou se uplatnit ty kmeny, které vzdorují baktericidii séra a fagocytóze, tj. mají polysacharidový kapsulární antigen; v močovém traktu ty, které mají tzv. P fimbrie, jimiž adherují na sliznici močových cest (uropatogenní E. coli). E. coli je pyogenní bakterie. V zažívacím traktu se určité kmeny E. coli uplatňují jako patogeny různými mechanismy, podle kterých se skupiny těchto tzv. enteropatogenních kmenů E. coli označují jako:

13

-

enteropatogenní (EPEC)

-

enterotoxigenní (ETEC)

-

enteroinvazivní (EIEC)

-

enterohemoragické (EHEC) (Bednář, 1996).

2.2.1.4 Rod Bacterioides Bacteroides fragilis je gram-negativní obligátní anaerobní tyčinka, která tvoří velkou složku 1% až 2% z normální střevní bakteriální mikroflóry v tlustém střevě člověka a zvířat. B. fragilis je často spojován s extraintestinální infekcí, jako jsou abscesy měkkých tkání, stejně jako s průjmovým onemocněním u zvířat i lidí. Enterotoxigenní B. fragilis (ETBF) je rozvíjející se střevní patogen spojovaný s průjmovým onemocněním u dětí, dospělých a zvířat. Druhy Bacteroides nejsou sporotvorné, ale produkují velkou kapsli. Jejich patogenita je omezená, protože nemají žádný endotoxin v buněčné membráně. Bacteroides fragilis je primárně spojován s infekcí břišní dutiny. Není vyloženě invazivní, ale je schopen účastnit se nitrobřišních infekcí v případě, že je slizniční stěna střeva narušena. B. fragilis je nejčastější anaerobní organismy izolované z klinických infekcí až 81%, při neléčení infekce je úmrtnost 60%. Je vzácně příčinou septické artritidy (Prindiville a kol., 2000). 2.2.1.5

Rod Bifidobacterium

Bifidobakterie jsou gram – pozitivní, nesporogenní, nepohyblivé anaerobní tyčinky, které patří do skupiny Actinobacteria. Většina bifidobakterií je izolovaných z dutiny ústní, střeva nebo pochvy člověka, ale také z kysaného mléka a odpadních vod. Dominují v mikroflóře dětí. Kmeny Bifidobactrium se používají jako živé kultury pro mléčné výrobky, farmaceutické preparáty a krmiva zvířat. V současné době je známo více než 30 druhů (Masco a kol., 2003). Hrají důležitou roli ve střevě, protože přispívají k regulaci pH pomocí mléčné a octové kyseliny, které zabraňují růstu a množení mnoha patogenů

a

hnilobných

bakterií.

Používají

(Zavaglia a kol., 1999).

14

se

jako

probiotické

přípravky

Rod Lactobacillus

2.2.1.6

Rod Lactobacillus je heterogenní skupina bakterií mléčného kvašení (LAB), která má významný dopad na kvašení potravin. V důsledku toho se laktobacily používají již několik desetiletí v konzervaci potravin, jako spouštěče pro fermentaci mléčných výrobků, zeleniny, ryb a klobás. Laktobacily se také používají jako probiotika a na výrobu nutriceutik. Skupina L. acidophilus obsahuje téměř výlučně obligátně homofermentativní laktobacily. Kromě L. acidophilus se mnoho dalších druhů používá v průmyslu jako je například Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus crispatus, L. delbrueckii poddruh delbrueckii, lactis, bulgaricus, a indicus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus a Lactobacillus gasseri. L. helveticus a L. delbrueckii hrají roli jako startovací kultury v mlékárně a rostlinné fermentaci. Některé kmeny druhu L. acidophilus již dlouho mají klíčovou roli na lidské zdraví a pozitivní vliv na střevní mikroflóru

(Pot, 2008). Skupina L. casei obsahuje nejvíce známé druhy Lactobacillus

rhamnosus, Lactobacillus paracasei, L. casei a Lactobacillus zeae ty se také nachází v siláži, ve zvířecím a lidském gastrointestinálním traktu (Pot a Tsakalidou, 2009). L. salivarius je homofermentativní Lactobacillus izolovaný z ústní dutiny člověka (Giraffa, 2010).

2.3 Probiotika Probiotika jsou živé mikrobiální doplňky stravy, které mění buď složení, nebo metabolickou aktivitu střevní mikroflóry, dále modulují imunitní systém tak aby příznivě ovlivňoval zdraví konzumenta (Madden, 2005). Nejznámější MO používaná jako probiotika jsou Lactobacillus, Bifidobacterium a Streptococcus spp., které izolujeme z lidského trávicího traktu. Účinnost a zdravotní nezávadnost musí být vědecky prokázána. Kritéria vhodných bakteriálních kmenů pro výrobu probiotik: -

Prvním krokem při výběru probiotik je stanovení jejich taxonomického zařazení (Morelli, 2007)

-

Odolnost vůči žaludečním kyselinám a žluči

-

Schopnost kolonizovat lidské střevo 15

-

Produkovat antimikrobiální látky

-

Dobré růstové vlastnosti (musí přerůst klostridie)

-

Přínos pro zdraví konzumenta (Gorbach, 2002)

2.3.1 Mechanismus působení Probiotické bakterie mají četné a různorodé vlivy na hostitele. Různé organismy mohou ovlivňovat prostředí střevního lumenu, funkci epitelu sliznice, funkci slizniční bariéry a slizniční imunitní systém. Tab 1. Mechanismus působení probiotik (Ng, 2009) Mezi hlavní mechanismy probiotik patří Antimikrobiální aktivita

Snížení pH lumenu Vylučují antimikrobiální peptidy Inhibice bakteriální invazi Blokace bakteriální adhezi k epiteliálním buňkám Zvýšení funkce bariéry Zvýšení produkce hlenu Zvýšení nepropustnosti bariéry Imunomodulace Účinky na epiteliální buňky Účinky na dendritické buňky Účinky na monocyty / makrofágy Vliv na lymfocyty - B-lymfocyty - NK buňky - T-buňky

2.3.2 Zdravotní účinky Zdravotní účinky probiotik se dělí na vědecky prokázané a potenciální, ty se musí dále vědecky prokázat. 16

Zmírnění laktózové intolerance Poruchami trávení laktózy ve světě trpí asi 2/3 populace. Nejvíce v Africe a Asii, v Evropě jsou to asi 2%. Symptomy zahrnují řídkou stolici, nadýmání, bolesti břicha a pocit na zvracení (Tuohy a kol., 2003). Probiotika zmírňují laktózovou intoleranci dodáním β-galaktosidázy do trávicího traktu člověka (Vasiljevic, 2008). Zmírnění a prevence průjmů Řada probiotických kmenů se využívá pro svou protiprůjmovou schopnost, s různým stupněm úspěšnosti. Při akutním průjmu, často výsledkem rotavirové infekce, bylo prokázáno podáním Lactobacillus rhamnosus GG snížení doby trvání průjmu přibližně o 50%. Mechanismy působení nebyly zcela objasněny, ale může zahrnovat opevnění slizniční integrity a / nebo stimulaci imunitní odpovědi, například prostřednictvím zvýšení imunoglobulinu (Ig) A. Bifidobacterium bifidum ve spojení s Streptococcus thermophilus ve standardním mléce prokazuje také snížení výskytu rotavirového průjmu. Průjem se vyskytuje asi u 20ti% pacientů, kteří dostávají antibiotika. Antibiotika by mohly přímo ovlivnit střevní mikroflóry, tím že podněcují růst patogenních mikroorganismů například Clostridium difficile a Klebsiella oxytoca (Tuohy a kol., 2003). Zmírnění symptomů alergie a atopického ekzému u dětí Atopický ekzém je často prvním příznakem alergie a je spojen s jídlem ve vysokém procentu případů. Epidemiologické údaje naznačují, že změny střevní mikroflóry mohou mít vliv na vznik alergických onemocnění. Nepřímý důkaz pro toto zjištění je, že atopické děti mají více koliformních bakterií a klostridií a méně bifidobakterií a laktobacilů ve střevě, než děti neatopické. Probiotické bakterie, pozitivně ovlivňují hostitele zlepšením jeho mikrobiální rovnováhy, mohou zprostředkovat antialergické účinky tím, že stimuluje produkci protizánětlivých cytokinů až 1037, transformující růstový faktor - β a tvorbu IgA ve střevě (Vijanen, Kujtunen, Haahtale a kol., 2005). Léčba zánětů střeva U ulcerózní kolitidy (UC) je zánětlivá odpověď omezena na sliznici a submukózu tlustého střeva. U Crohnovy choroby (CD), se může celý zánět rozšířit přes střevní stěnu do celého trávicího traktu. U CD jsou hlavními příznaky průjem, bolesti břicha a 17

úbytek hmotnosti díky četným průjmům. U UC jsou hlavním příznakem stejné jako u Crohnovy choroby, často však ještě doprovázeny krvácením z konečníku. Obě choroby jsou běžné ve vyspělém světě. CD ukazuje vyšší výskyt u žen než u mužů. UC se zdá být rovnoměrně rozdělena mezi muži a ženami (Jonkers, Stockbrüger, 2007). Požití probiotických bakterií má potenciál ke stabilizaci imunologické bariéry ve střevní sliznici tím, že sníží tvorbu místních prozánětlivých cytokinů (Murali a kol., 2010). Eradikace H. pylori Helicobacter pylori je velmi rozšířeným patogenem, je hlavní příčinou chronické gastritidy, peptických vředů a rizikovým faktorem pro vznik žaludečních malignit. Léčba antibiotiky má 90% účinnost. Nicméně jsou drahá, způsobují vedlejší účinky a snižují odolnost vůči antibiotikům. Probiotika by mohla představovat levné alternativní řešení pro snížení kolonizace H. pylori (Martínek, Špičák, Pantofličková, 2005). Probiotické organismy produkují antimikrobiálních látek, které prokazují inhibiční aktivitu vůči tomuto patogenu (Tong, Ran, Shen a kol., 2007). Snížení hladiny plazmatického cholesterolu Mírné snížení cholesterolu bylo prokázáno po podání fermentovaných mléčných výrobků s vhodným kmenem bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií. Probiotické bakterie fermentují nestravitelné sacharidy pocházející z potravy, dochází k produkci mastných kyselin s krátkým řetězcem ve střevě, které pak mohou způsobit pokles hladiny krevních lipidů tím, že inhibují syntézu cholesterolu v játrech. Kromě toho mohou některé bakterie narušovat vstřebávání cholesterolu ze střeva do solí žlučových kyselin a tím ovlivňuje metabolismus cholesterolu (Roberfroid, 2002). Prevence rakoviny Kolorektální karcinom (CRC) je třetí nejčastější forma rakoviny. Současná léčba včetně chemoterapie, radioterapie a chirurgie je spojena s vysokým rizikem komplikací a ne vždy úspěšná, zdůrazňuje potřebu rozvíjet nové léčebné strategie. Použití prebiotik, probiotik nebo kombinací obou (synbiotik) představuje novou možnost léčby. Probiotika mění střevní mikroflóru zvýšením koncentrace bakterií, jako jsou Lactobacillus a bifidobakterie a snížení úrovně patogenních mikroorganismů. Tato strategie má poten18

ciál k potlačení růstu a progrese nádorového onemocnění. Zvýšením imunitní funkce a protinádorové činnosti, vazba na potenciální karcinogeny potravin včetně toxinů nalezených v masných výrobcích, snížení bakteriálních enzymů, které hydrolyzují prekarcinogenní sloučeniny jako jsou β-glukuronidázy. Probiotika mají potenciál ovlivnit významně vývoj a léčbu rakoviny tlustého střeva a může mít významnou roli v prevenci rakoviny (Silva, Sivieri, Rossi, 2009).

Další zdravotní přínosy probiotik: -

Zvýšené vstřebávání vápníku

-

Syntéza některých vitamínů (K, B)

-

Ustavení nebo obnovení zdravé střevní mikroflóry, která mohla být narušena užíváním antibiotik, hormonů či nevhodnou kyselinotvornou stravou s převahou jednoduchých cukrů a chemických látek

Probiotika čelí problému, jak přežít průchod žaludkem a tenkým střevem a dlouhodobě se usídlit v tlustém střevu. Konzumace proto musí být pravidelná, dlouhodobá a v dostatečných dávkách (Kaláč, 2003).

2.4 Prebiotika Prebiotika jsou definována jako nestravitelné složky potravy, které ovlivňují příznivě růst a / nebo aktivitu jedné nebo omezeného počtu bakterií tlustého střeva, a tím zlepšují zdraví hostitele. Stimulující bakterie by měly být prospěšné povahy, a to bifidobakterie nebo laktobacily (Gibson, 2006). Aby mohly být složky potravy klasifikované jako prebiotika musí: - Odolávat žaludečním kyselinám, hydrolýze enzymy a gastrointestinální absorpci než se dostanou do tlustého střeva - Být fermentovány střevní mikroflórou - Prospívat lidskému zdraví - Selektivně stimulovat probiotika 19

- Být stabilní při procesu zpracování potravin 2.4.1 Druhy prebiotik Jako prebiotika se nejvíce využívají oligosacharidy: -

Frukto-oligosacharidy (FOS)

-

Inulin

-

Galakto-oligosacharidů (GOS)

-

Laktulóza

-

Laktocukróza

-

Isomalto-oligosacharidy

-

Sójové oligosacharidy

-

Xylo-oligosacharidy (XOS)

-

Gentio-oligosacharidy

Frukto-oligosacharidy FOS jsou polymery (polymerizační stupeň 2.30) D-fruktosy spojené β (2→1) vazbami zakončené molekulou sacharózy, jsou rostlinného původu (čekanka, cibule, artyčoky, rajčata, česnek, banán) a jejich průměrný obsah v čerstvém ovoci či zelenině je 6 %. Průmyslově se vyrábí buď hydrolýzou inulinu nebo ze sacharózy červené řepy účinkem fruktosylfuranosidázy z Aspergillus niger (transfruktosylace). Nejsou využívány patogenními mikroorganismy tlustého střeva (Escherichia coli, Clostridium perfringens) ani Streptococcus mutans v ústech (nepřispívají k tvorbě zubního kazu). Při dávkování 3,6 g FOS denně se snižuje produkce toxických složek a nežádoucích enzymů ve střevech o 0,45 %. Pozitivní efekt pro dospělého jedince má dávka 2,10 g/den, průměrná spotřeba je však pouze 0,8 g/den. Galakto-oligosacharidy GOS jsou živočišného původu (kravské mléko) a průmyslově se vyrábějí z laktózy transgalaktosylací účinkem β-galaktosidáz. Podobně jako FOS působí jako rozpustná vláknina. GOS mají kromě fyziologických účinků také významné fyzikálně chemické vlastnosti. Ve srovnání s monosacharidy mají vyšší molekulovou hmotnost, a 20

tím zvyšují viskozitu výrobků. U mražených produktů ovlivňují bod tuhnutí, u tepelně zpracovávaných potravin omezují hnědnutí v důsledku Maillardových reakcí. Způsobují zadržování vlhkosti, vazbou vody snižují její aktivitu, a tím významně omezují projevy mikrobiální kontaminace výrobků. Mohou být využívány jako inhibitory retrogradace škrobu. Laktulóza Laktulóza (4-O-β-D-galaktopyranosyl-D-fruktosa) vzniká izomerací glukosylu v laktóze působením záhřevu na mléko a je v malém množství přirozenou složkou tepelně ošetřeného mléka a mléčných výrobků. Vliv na střevní mikroflóru má až ve větších koncentracích, je proto komerčně produkována zahříváním laktózy za katalýzy např. hydroxidem sodným. Laktulóza je podávána pacientům s jaterní encefalopatií (intoxikací mozku močovinou v důsledku nefunkčnosti jater) a s chronickou zácpou. Jsou zkvašovány v tlustém střevě intestinální mikroflórou a redukují tvorbu amoniaku (Rudolfová, Čurda, 2005). Xylo - oligosacharidy XOS jsou cukry tvořené jednotkami xylózy přirozeně se vyskytující v ovoci, zelenině, mléce a medu. Jeho průmyslová výroba se provádí pomocí lignocelulózových materiálů. XOS lze použít pro různé účely, mezi něž patří aplikace v potravinách a farmaceutickém průmyslu. Jeho požití podporuje selektivní růst Bifidobacterium spp., který reguluje střevní funkce (Gullón a kol., 2009). 2.4.2 Pozitivní účinek prebiotik - příznivý vliv na mikroflóru tlustého střeva - snížení energetického příjmu z potraviny - zvětšení objemu stolice a potlačení zácpy Spekuluje se i o dalších pozitivních účincích: - prevence a zeslabení střevních infekcí a průjmů - posílení imunity 21

- prevence rakoviny tlustého střeva a konečníku - snížení hladiny cholesterolu v krvi - prevence osteoporózy Doporučovaný denní příjem prebiotik je 0,3 g/kg hmotnosti u mužů a 0,4 g/kg u žen (Kaláč, 2003).

2.5 Synbiotika Jsou definována jako živé mikrobiální doplňky (probiotika) v kombinaci s prebiotiky, které jsou pro ně specifické (Nevoral, 2005). Jako synbiotika se mohou používat fruktooligosacharidy v kombinaci s rodem Bifidobacterium nebo laktitol ve spojení s laktobacily. Zlepšují přežití a usídlení probiotických mikroorganismů ve střevě a tedy nastolení rovnováhy střevní mikroflóry, a tím se potlačuje množení a aktivita škodlivých

bakterií.

Jde

tedy

o

synergický

účinek,

proto

pojem

synbiotika

(Collins, Gibson, 1999).

2.6 Charakteristika biogenních aminů Biogenní aminy jsou důležité dusíkaté sloučeniny biologického významu v rostlinných, mikrobiálních a živočišných buňkách. V potravinářské mikrobiologii, jsou někdy spojené s kazivostí a kvasnými procesy. Některé toxikologické vlastnosti a otravy spojené s jídlem vyvolává hlavně histamin a tyramin. Sekundární aminy mohou podstoupit nitrozaci a tvořit nitrosaminy. Lepší znalost faktorů ovlivňujících jejich vznik je nezbytné pro zlepšení kvality a bezpečnosti potravin (Silla-Santos, 1996). BA jsou nízko molekulární sloučeniny syntetizované enzymatickými dekarboxylačními aminokyselinami (Ladero a kol., 2009). 2.6.1 Chemická struktura a dělení Histamin, putrescine, kadaverin, tyramin, tryptamina, β-fenyletylamin, spermin a spermidin jsou považovány za nejvýznamnější biogenní aminy a vyskytují se v potravinách. Tyto aminy jsou označovány jako biogenní, protože jsou tvořeny působením ži-

22

vých organismů (Shalaby, 1999). Biogenní aminy jsou nízkomolekulární sloučeniny odvozené od aminokyselin. Mají jeden nebo více kladných nábojů a hydrofobní kostru. Podle chemické struktury se dělí: Alifatické (putrescin, kadaverin, spermin, spermidin) Aromatické (tyramin, fenyletylamin) Heterocyklické (histamin, serotonin) (Morreno-Arribas, 2009) Obr. 1 Chemická struktura některých biogenních aminů (Önal, 2007)

Histamin

Tryptamin

Tyramin

2- fenylethylamin

Putrescin

Kadaverin

Agmatin

Spermidin

23

Spermin

2.6.2 Vznik biogenních aminů Dekarboxylace aminokyselin probíhá odstraněním karbonylové skupiny a tak vzniká příslušný amin (Shalaby, 1996).

Obr. 2 Schéma vzniku biogenních aminů z aminokyselin (Kaláč, Křížek, 2002) Hlavní prekurzory biogenních aminů jsou: Histidin → Histamin Tyrosin → Tyramin Hydroxytryptofan → Serotonin Tryptofan → Tryptamin Lysin → Kadaverin Ornithin → Putrescin Arginin → Spermin Arginin → Spermidin (Silla-Santos, 1998) 24

2.6.2.1 Podmínky vzniku Tři základní podmínky vzniku biogenních aminů v potravinách působením mikroorganismů jsou: -

V substrátu musí být přítomny volné aminokyseliny

-

Musí být přítomny organismy s dekarboxylázovou aktivitou

-

Musí být navozené takové podmínky, které umožní růst bakterií, syntézu dekarboxyláz a jejich aktivitu (Silla Santos, 1996).

Vzhledem k různorodosti druhů a kmenů jsou různé i optimální podmínky pro tvorbu BA jako je teplota, pH, přístup kyslíku nebo obsah soli (Komprda, 2005). Teplota má značný vliv na tvorbu BA hlavně u sýrů a ryb. Obsah aminů se zvyšuje s rostoucí teplotou skladování. Přesto může mít vztah mezi teplotou a aktivitou mikroorganismů, které jsou přítomny ve fermentovaných masných výrobcích, na tvorbu BA opačný účinek. Tuto variabilitu ovlivňuje mnoho jevů, jako jsou například kinetika růstu, počet buněk a aktivita enzymů. Tento účinek na aktivitu proteolytických a dekarboxylačních enzymů má rostoucí vliv na konečné množství biogenních aminů. S rostoucí teplotou se zvyšuje proteolytická i dekarboxylační činnost mikroorganismů a tím i množství biogenních aminů (Suzzi, Gardini, 2003). Při 15°C zůstává mikrobiální činnost enzymů aktivní, i když v průběhu skladování, většina mikrobiální populace dosáhne fáze stacionárního růstu nebo smrti (Bover-Cid a kol., 2000). Naproti tomu při nízkých teplotách, jako při dlouhodobé skladování masa při 4°C vzniká putrescin v důsledku působení psychrotrofních pseudomonád (Bover-Cid a kol., 1999). Teploty mezi 20°C – 37°C jsou ideální pro růst většiny bakterií, které mají dekarboxylační činnost. Snížením těchto teplot dochází k inhibici jejich růstu. Přítomnost zkvasitelných cukrů jako je D – glukóza, zvyšuje množství aminokyselin i dekarboxylační činnost mikroorganismů. Jako optimální množství D – glukózy bylo zjištěno 0,5 - 2%, zatímco množství vyšší než 3 % způsobuje inhibici enzymatické činnosti (Karovičová, Kohajdová, 2005).

25

Dalším důležitým faktorem pro tvorbu biogenních aminů je pH. Hodnota pH ovlivňuje dekarboxylázovou činnost a nízké pH cca 3,0 - 6,0 je optimální pro bakterie, které vykazují dekarboxylázovou aktivitu. Navíc v kyselém prostředí bakterie více vytvářejí dekarboxylační enzymy, jako součást svého obranného mechanismu proti kyselosti (Silla Santos, 1996). Při vyšším koncentraci NaCl se zvyšuje dekarboxylační činnost mikroorganismů a tím i tvorba biogenních aminů. Bylo prokázáno, že koncentrace NaCl v rozmezí od 3,5% do 5,5% může inhibovat produkci histaminu (Gardini a kol., 2001). 2.6.3 Fyziologický účinek, toxicita, toxický účinek 2.6.3.1 Fyziologický účinek BA hrají několik klíčových rolí ve fyziologii a vývoji eukaryotických buněk. Nejvíce aktivními BA jsou histamin a tyramin. Polyaminy, jako putrescin, spermin a spermidin hrají zásadní roli v růstu a diferenciaci buněk prostřednictvím regulace genů, v projevu a modulaci signálních drah. Histamin se vyskytuje v mnoha živých tkáních jako normální složka těla. U lidí se nachází v různých koncentracích v mozku, plicích, žaludku, tenkém a tlustém střevě, děloze a močovodech. Vyrábí se a je uložen převážně v žírných buňkách, cirkulujících bazofylech a neuronech. Jde o neurotransmiter, místní hormon, podílí se na sekreci žaludeční kyseliny, růstu a diferenciaci buněk, regulaci cirkadiánního rytmu těla, příjmu potravy, má vliv na učení a paměť, imunitní odpověď a alergické reakce. Tyramin a β-fenylethylamin jsou zahrnuty do skupiny stopových aminů, endogenní látky se silnou strukturální podobnosti s klasickými inhibitory neurotransmiterů, ačkoli endogenní hladiny těchto látek jsou nejméně o dva řády nižší, než jsou hladiny těchto neurotransmiterů. Tyramin se podílí na ovlivňování krevního tlaku, na periferní vazokonstrikci, zvyšuje srdeční výdej, zvyšuje dýchání, zvyšuje krevní cukr, způsobuje uvolňování noradrenalinu. Putrescin reguluje expresi genů a ovlivňuje růst a diferenciaci buněk (Ladero, 2009).

26

2.6.3.2 Toxicita Normální příjem BA je metabolizován ve střevním traktu velmi výkonným detoxifikačním systémem založeným na aktivitě enzymů monoaminooxidáz (MAO), diaminoooxidáz (DAO) a histidinmethyltransferázy (HMT). Při nadměrném příjmu BA potravou však detoxifikační kapacita tohoto systému nemusí stačit. Toxicita histaminu a tyraminu je zvyšována současnou konzumací alkoholu a potravin obsahujících jiné BA, zejména diaminy a polyaminy. Jejich negativní účinek spočívá v odčerpání detoxifikačních enzymů MAO, DAO a HMT a v následném zesílení účinku toxičtějších BA (Komprda, 2005). Za normálních okolností je histamin, který se dostane do střeva člověka, inaktivován a nevznikají žádné klinické příznaky onemocnění. Při příjmu velkého množství histaminu jsou inaktivační mechanismy prolomeny a histamin se dostává mimo střevo. Jsou známy dva hlavní enzymy, které metabolizují histamin. Je to jednak histamináza a histamin-N-metyltransferáza. Přítomnost dalších biogenních aminů nebo užívání některých léků může inhibovat účinek těchto enzymů a potencovat účinek biogenních aminů (Steinhauserová, 2004). Závažnost klinických příznaků způsobených BA závisí na množství a druhu, individuální citlivosti a schopnosti detoxikace ve střevě. Tato činnost může být ovlivněna geneticky nebo různými inhibitory. Některá antidepresiva a isoflavony (a jejich metabolity) byly popsány jako inhibitory MAO. Kouření je další rizikový, který zvyšuje pravděpodobně toxický účinek biogenních aminů a snižuje činnost MAO a DAO až o 30%. Alkohol a acetaldehyd mají také schopnost zvýšit toxický účinek BA a to tak, že zvyšují propustnost těchto sloučenin střevní stěnou (Ladero 2010). Toxikologická úroveň závisí na individuálních vlastnostech a přítomnosti jiných aminů. Právní horní limit je u histaminu 100 mg na kg potraviny, u tyraminu 100 – 800 mg/ kg a pro fenylethylamin je hodnota 30 mg/kg (Gardini, 2001). 2.6.3.3 Toxický účinek

Příjem potravin s vysokou koncentrací BA může způsobovat migrény, bolesti hlavy, žaludeční a střevní potíže (Ruiz-Capillas, Jiménez-Colmenero, 2004). Histamin a tyramin jsou nejvíce studované BA kvůli jejich toxikologickým účinkům. Většina intoxikací produkované BA se vztahují k histaminu, protože může vést k rozšiřování cév a kapilár, což způsobuje bolesti hlavy, hypotenzi, poruchy zažívacího traktu a otoky. Ty27

ramin způsobuje zvýšení koncentrace noradrenalinu v krvi jako nepřímý dopad, chová se vazokonstrikčně, vyvolává bolesti hlavy, vysoký krevní tlak a migrény. Kromě toho, putrescin a kadaverin jsou potenciální prekurzory karcinogenních nitrosaminů. Z tohoto důvodu je velmi důležité, aby se zabránilo hromadění těchto aminů v potravinářských výrobcích (Munoz, 2008). Polyaminy a jejich enzymy jsou pevně spojeny se šířením nádorů v GIT, a existuje stále více důkazů, že putrescinu a spermidin mají roli při prosazování maligní transformace buněk. Zvýšené koncentrace putrescinu byly zjištěny rovněž při karcinomech žaludku způsobených H. pylori (Ladero, 2010). 2.6.4 Hygienický význam biogenních aminů v potravinách Z pohledu hygieny slouží biogenní aminy jako indikátor stupně kažení potravin (Bover - Cid, 2000). U nefermentovaných potravin jsou BA především indikátorem nežádoucí mikrobiální činnosti. Stanovení BA může být využito k posouzení míry rozkladu sledovaného materiálu. V případě skladování potravin může být obsah biogenních aminů ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). Index biogenních aminů (BAI) udává, že obsah histanimu, putrescinu a kadaverinu se při skladování zvyšuje, kdežto obsah sperminu a spermidinu se nemění nebo se snižuje. SPD a SPM nevznikají primárně dekarboxylací MO, ale vstupují z použité suroviny. Čím je podíl BA vyšší tím je horší kvalita a senzorické vlastnosti potravin.

[

]

(Komprda, 2004). S tím souvisí i legislativní omezení nejvyšší přípustné dávky. Legislativa ČR do roku 2004 obsahovala legislativní limity pro vybrané BA v rybách, sýrech, pivu a vínu, ale dnes je v ČR platný jen hygienický limit pro histamin v rybách a výrobcích z ryb uváděný v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 ve výši 100. Tento limit může být ve dvou vzorcích z devíti z jedné šarže překročen až do hodnoty 200 mg/kg. Legislativa

28

neurčuje

výrobcům

deklarovat

obsah

biogenních

aminů

na

obale

(Standardová, Borkovcová, Vorlová, 2008). 2.6.5 Výskyt BA a polyaminů v potravinách BA jsou obsaženy hlavně v sýrech, rybách, masných výrobcích, vejcích a houbách. Na jejich přítomnost se sledují hlavně potraviny, které prošli kvasným procesem nebo byly vystaveny mikrobiální kontaminaci během zrání a skladování. Alkoholické nápoje jako je pivo mohou obsahovat biogenní aminy stejně tak jako některé jiné fermentované potraviny. Aminy jsou také považovány jako endogenní rostlinné látky, proto může být jejich koncentrace v některé zelenině a ovoci zvýšená (Shalaby, 1999). Potraviny kvašené bakteriemi mléčného kvašení (LAB) jsou obecně považovány za netoxické a nepatogenní. Histamin se vyskytuje v mnoha různých potravinách. Při vysokých koncentracích, které jsou rizikové faktory pro intoxikaci potravin, zatímco střední hodnoty mohou vést k potravní intoleranci. Zkažené potraviny, zejména u fermentovaných výrobků, vykazují vyšší hladinu biogenních aminů (Bodmer, 1999). 2.6.5.1 V mase a masných výrobcích V masných výrobcích lze nalézt biogenní aminy v důsledku použití nekvalitních surovin, znečištění a nevhodných podmínek při zpracování a skladování. Kromě toho se mohou BA v masných výrobcích hromadit díky mikroorganismům zodpovědných za fermentaci (Latorre-Moratalla, Bover-Cid a kol., 2010). Nižší obsah BA je zjiště při správném výrobním procesu pro tvorbu masných výrobků, s použitím startovacích kultur, které nemají dekarboxylázovou aktivitu. Nevařená a zrající masa vykazují vyšší množství histamin a tyramin, než vařené masné výrobky. Na tvorbu biogenních aminů v mletém mase mají velký vliv dekarboxylační mikroorganismy, které se nacházejí v počáteční surovině. Suché salámy bez startovacích MO mají variabilní koncentraci BA. Polyaminy, putrescin, kadaverin, histamin, tyramin a 2-fenylethylamin se také vyskytují ve fermentovaných salámech. Uzené maso a produkty jako jsou klobásy, mohou způsobovat otravy spojené s histaminem a tyraminem (Adams, 2000).

29

2.6.5.2 V rybách a rybích produktech Úroveň aminů je v rybích produktech velmi značná. Ve fermentovaných rybách se nachází stopové množství putrescinu a tyraminu. Arginin je obsažen v rybí omáčce. V ančovičkách je vysoká úroveň BA kvůli dlouhému procesu zpracování, což podporuje růst bakterií. Nejvyšší riziko tvorby nadměrného množství histaminu je u tzv. scombroidních ryb, mezi které patří například makrely, tuňáci, sledě nebo sardele. Je to proto, že tyto ryby mají přirozeně vyšší obsah aminokyseliny histidinu, ze kterého histamin vzniká při vysoké mikrobiální kontaminaci ryb a při nedodržení chladírenského procesu, a to zvláště v teplém ročním období. Nejčastěji se histamin tvoří ihned po vylovení ryb, které nejsou patřičně zchlazeny na teplotu kolem +1 °C. Další rizikovou operací je tepelné opracování, především uzení ryb, například makrel. Při nesprávném skladování a zároveň vysoké mikrobiální kontaminaci (znečištění ryb) se může vytvořit toxické množství dříve, než se ryba projeví senzoricky jako závadná. 2.6.5.3 V sýrech a mléčných výrobcích Tvorba biogenních aminů (BA) závisí na obsahu aminokyselin a peptidů v mléce, na přítomnosti bakterií schopných dekarboxylace, na pH, koncentraci soli (např. nad 3,5 %), aktivitě vody, technologii (např. zařazení pasterace), době zrání a skladování a přítomnosti kofaktorů jako pyridoxalfosfát. Enzymy způsobující proteolýzu mléčných bílkovin pocházejí z mléka, ze syřidel, ze zákysových a startovacích kultur a z kontaminující mikroflóry. Koncentrace BA v čerstvém mléce je neparná (méně než 1 mg/kg). Jedná se o propylamin, hexylamin, alifatické di- a polyaminy, histamin a tyramin. Obsah histaminu v mléce je 0,5 až 0,8 mg/kg, v sušeném mléce je obsah histaminu 131 mg/kg, obsah tyraminu 42 mg/kg. Obsah BA v sýrech může být i více než 1 g/kg. Množství tyraminu může dosáhnout až 500 mg/kg (v případě přítomnosti proteolytických enzymů a určitého kmene Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens). Nejnižší koncentrace BA byla zjištěna v eidamských sýrech (58 mg/kg), střední v sýru Romadúr (937 mg/kg), nejvyšší ve vyzrálých sýrech ementálského typu (1820 mg/kg). Obsah BA v tvrdých sýrech je všeobecně nižší než v tavených sýrech. Během skladování obsah BA stoupá, až nakonec (např. u ovčího sýra po 220 dnech) klesá, příp. vymizí. Skladováním při zvýšené teplotě obsah BA roste. Proti vzniku BA působí nisin resp. 30

entarocin 4, pokud je některými bakteriemi produkován (Lactococcus lactis a Enterococcin EFS 2. resp. Enterococcus faecalis) (Suková, 2006). 2.6.5.4 V pivu a vínu Kadaverin, histamin, putrescin a tyramin jsou vyráběny ve velkém množství při alkoholové fermentaci. Mnoho druhů BA bylo zjištěno jak v bílém tak v červeném víně a to hlavně tyramin, histamin, tryptamin, 2-fenylethylamin, putrescin a kadaverin. Putrescin, histamin a tyramin vznikají také při jablečno - mléčném kvašení a při procesu zrání vína. V pivu byla pozorována přítomnost tyraminu a histaminu. Biogenní aminy jsou tvořeny z enzymů ječmene při sladování a to i za sterilních podmínek. Kontaminace zrna mikroflórou a kvasinkami je zodpovědná za tvorbu histaminu v pivu. Slad a chmel mohou přispět k obsahu aminů v sladině a pivu. Hladina sperminu a spermidinu se prudce snížila v průběhu rmutování, zatímco hladina ostatních aminů se zvýšila, s výjimkou putrescinu (Adams, 2000). 2.6.6 Mikroorganismy produkující biogenní aminy Bakteriální enzymy, dekarboxylázy, hrají klíčovou roli při tvorbě biogenních aminů, a proto mikroorganismy, které je vyrábějí, jsou velmi důležitým elementem. Dekarboxylázy jsou skupina enzymů katalyzujících dekarboxylaci, tj. odnětí CO2. Patří mezi lyázy, jejich koenzymem může být pyridoxalfosfát. Dekarboxylační aktivitu vykazují rody Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Shigella, Photo-Escherichia, bakterie mléčného kvašení, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus a Enterococcus. Tyto rody mají schopnost dekarboxylace jedné nebo více aminokyselin (Karovičová, 2003). 2.6.7 Charakteristika významných MO produkujících biogenní aminy 2.6.7.1 Bakterie mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení jsou významná skupina MO, jsou definovány jako gram-pozitivní, nesporogenní, mikroaerofilní bakterie. Morfologicky se BMK řadí jak mezi koky, tak mezi tyčinky a obecně neprodukují katalázu. Název této skupiny bakterií 31

je odvozen od jejich schopnosti fermentovat sacharidy na kyselinu mléčnou (homofermentace) jako hlavní produkt (Štegnerová, 2007). Mezofilní bakterie mléčného kvašení jsou bakterie, které za podmínek specifikovaných normou vytvářejí kolonie na tuhé selektivní půdě (MRS o pH = 5,7) po inkubaci při 30°C za dobu 72 hodin (ČNS ISO 15214). Taxonomie BMK je provázena velkými změnami. Jedná se o velmi heterogenní skupinu, do které patří rody Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Sporolactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. Rody Lactobacillus, Enterococcus a Bifidobacterium jsou užívány rovněž jako probiotika s cílem kompenzovat účinky škodlivých faktorů, působících na lidský organismus.Mléčné bakterie jsou v přírodě ubikvitárně rozšířené, zejména v místech s vysokou koncentrací sacharidů, aminokyselin, vitamínů a vyšší tenzí CO2. Tvoří součást bakteriálního osídlení respiračního systému a dominantní část mikroflóry trávícího a urogenitálního traktu člověka i zvířat a jsou nalézány v klinickém materiálu humánního a animálního původu (Štegnerová, 2007). Některé druhy mají schopnost syntetizovat biogenní aminy, které mohou být škodlivé pro lidské zdraví (Bernardeau, 2008). Bakterie mléčného kvašení jsou častými producenty biogenních aminů. Schopnost dekarboxylace tyrozinu byla pozorována u mnoha zástupců rodů Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus,, Enterococcus, Oenococcus, dekarboxylace tryptofanu u rodu Lactococcus, Leuconostoc a Lactobacillus. Produkce putrescinu byla zjištěna u rodu Lactobacillus (Bover-Cid a kol., 2008) a produkce histaminu u Lactobacillus, Oenococcus a Pediococcus (Landete a kol., 2007). Produkce biogenních aminů je vlastnost specifická spíše pro určité kmeny bakterií než vlastnost typická pro daný druh, takže různé kmeny téhož druhu se mohou lišit v produkci biogenních aminů (Arena, Manca de Nadra, 2001). 2.6.7.2 Rod Enterococcus Rod Enterococcus patří mezi bakterie mléčného kvašení, jedná se o různorodou gram-pozitivní skupinu bakterií, hrají důležitou roli v potravinářském průmyslu (Ladero, 2010). Termínem enterokoky jsou označovány streptokoky, kteří jsou schopni růst při teplotách 10-45°C, koncentraci NaCl 6,5% a pH 9,6 a mohou přežít teplotu 60°C po dobu 30 minut (Robinson, 2010). Zástupci bakteriálního rodu Enterococcus se vyskytují jako saprofyté a komenzálové trávicího ústrojí. Jejich výskyt v potravinách 32

nelze dávat do souvislostí s přímou kontaminací fekáliemi, protože enterokoky se nezávisle na fekálním znečištění nacházejí i v životním prostředí (Burdychová a kol, 2007). Jako probiotické přísady do potravin i krmiv se používají E. faecium a E. faecalis, tyto MO jsou schopny tvořit tyramin.

33

Tab. 2 Mikroorganismy nalezené v potravinách produkující BA (Ladero, 2010) Jídlo

Biogenní aminy

Mikroorganismy

Ryby

Histamin

Morganella morganii, Klebsiella pneumonia , Hafnia alvei, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Citobacter freundii, Clostridium sp, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Aeromonas spp., Pleisomonas shigelloides, Photobacterium spp

Sýr

Histamin

Lactobacillus buchneri

Tyramin

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans,Entererocccus hirae, Lactobacillus brevis, Lactobacillus curvatus

Putrescin

Enterobacteriaceae (Enterobacter, Serratia, Escherichia, Salmonella, Hafnia, Citrobacter, Klebsiella) Lactobacillus brevis

Kadaverin

Enterobacteriaceae

Histamin

Oenococcus oeni, Lactobacillus hilgardii, Pediococcus parvulus

Tyramin

Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium

Putrescin

Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, O. Oeni, Lb. buchneri, Lactobacillus zeae

Histamin

Enterobacteriaceae, Stphylococcus capitis

Tyramin

Staphylococccus carnosus, Staphylococccus xylosus, Staphylococccus epidermidis, Staphylococccus saprophyticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus bavaricus,Carnobacteriumdivergens, Carnobacterium pistola

Putrescin

Enterobacteriaceae, M. morganii, S. liquefaciens, Pseudomonas, Lb. curvatus, Enterococcus

Kadaverin

Enterobacteriaceae

Víno

Maso

34

2.6.8 Stanovení biogenních aminů Stanovení biogenních aminů je rozhodující pro posuzování možných zdravotních rizik před spotřebou (Eerola, 1993). Obecné schéma stanovení BA a PA je následující: extrakce aminů (CCl3COOH, HClO4, HCl) → derivatizace (dansyl chlorid, o-fthaldialdehyd) → oddělení (chromatograficky, elektroforeticky) → detekce (UV, MS) (Komprda, Dohnal, 2010). Nejběžnějšími problémy při analýze biogenních aminů v potravinách je složitá matrice vzorku, přítomnost potenciálních rušivých sloučenin a výskyt několika biogenních aminů současně ve stejném alikvotním podílu. Pro extrakci biogenních aminů se jako rozpouštědla používají 0,6 M kyselina chloristá, 5 – 10 % kyselina trichloroctová a 0,1 M HCl. U mléčných výrobků je vhodné na extrakci BA použít methanol při zvýšené teplotě (60°C). Některé parametry významně ovlivňují výtěžnost a využití BA (např. pH a stupeň nasycení extrakčního roztoku). Relativní extrakční účinnost těchto rozpouštědel závisí na typu a povaze BA a potraviny, ze které jsou extrahovány. Extrakce na pevné fázi (SPE) je efektivnější než klasická extrakce kapalina-kapalina. Extrakce kapalina – kapalina je méně vhodná, protože je nepřesná a velmi náročná na čas (Karovičová, Kohajdová, 2005). Pro stanovení biogenních aminů bylo vyvinuto několik analytických technik zahrnujících tenkovrstvou chromatografii (TLC), plynovou chromatografii (GC), kapilární elektroforézu (CE) a kapalinovou chromatografii (HPLC). TLC metoda se stále používá kvůli své jednoduchosti, rychlosti a možnosti prověření několika vzorků najednou, a to je hlavně účinné v potravinářském průmyslu. Používá se široké spektrum organických rozpouštědel,

moderní

metody

používají

hlavně

ty

netoxické

(Lapa - Guimaraes a Pickova, 2004). Iontová chromatografie je vhodná zejména pro stanovení složitých matric. Extrakty kyseliny chloristé jsou injekčně podány bez jakéhokoliv dalšího zpracování na sloupec

katexu

a

vymývány

roztokem

kyseliny

methansulfonové

(Favaro, Pastore, Saccani a Cavalli, 2007). Plynová chromatografie se tak často pro stanovení biogenních aminů nepoužívá, kvůli problémům spojených s odkalením. 35

Aromatické a heterocyklické BA lze snadno určit pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE) bez derivatizace kvůli své přirozené absorpci UV světla. Jejich analýza je rychlá (migrační časy v rozmezí 4-9 min) (Dadáková, 2001). 2.6.8.1 Chromatografie obecně Fyzikálně - chemická separační technika. Jejíž podstatou jsou rozdíly v afinitě separovaných složek (kapalných, plynných) ke dvěma nemísitelným fázím, z nichž jedna je mobilní (pohyblivá) a druhá stacionární (nepohyblivá). Podle povahy mobilní fáze se rozlišuje chromatogafie: kapalinová (LP) a plynnová (GC). Podle mechanismu separace: - Adsorpční - Rozdělovací - Iontoměničová - Afinitní - Gelová - Plynová - Vysoce účinná kapalinová (HPLC – sorbenty s menšími částicemi a vyšší mechanickou odolností, zvýšený tlak) Podle způsobu vymývání složek: - Eluční - Frontální - Vytěsňovací Podle geometrického uspořádání aparatury: - Kolonová - Plošná (Rovenský, 2006).

36

2.6.8.2 HPLC (vysoce účinná kapalinová chromatografie) Mezi metodami kapalinové chromatografie zaujímá významné místo technika HPLC. Mobilní fází je v tomto případě kapalina. Stacionární fází je film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče nebo pevný adsorbent. Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy se nazývá kapalinový chromatograf. Separace probíhá v separační koloně, která obsahuje stacionární (nepohyblivou) fázi = sorbent a mobilní (pohyblivou) fázi = eluent. Rozdílné analyty (dělené látky) mají rozdílnou afinitu ke stacionární fázi. Různé analyty podléhají různé distribuci (rozdělování) mezi mobilní a stacionární fázi. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány) (Skoog, West, Holler, 2004).

Obr. 4 Schéma kapalinové chromatografie (Anonym 1, 2010) dostupné na

37

Obr.

5

Schéma

kapalinového

chromatografu

(Anonym

2)

dostupné

na

< http://users.prf.jcu.cz/sima/analyticka_chemie/separa_soubory/image004.jpg> Zásobník mobilní fáze Mobilní fáze (zpravidla směsi organických rozpouštědel nebo vodné roztoky pufrů) se před použitím filtrují (odstranění nečistot) a odplyňují (např. s použitím ultrazvukové lázně). Do systému HPLC jsou čerpány nejčastěji ze skleněných lahví. Do láhve zasahuje čerpací hadička opatřená často skleněnou fritou. Zároveň mobilní fází z důvodu dokonalého a soustavného odplyňování trvale probublává hélium (jinou alternativou odplyňování je použití membránového degasseru) (Skoog, West, Holler, 2004). Čerpadla Tok mobilní fáze je zajištován vysokotlakým čerpadlem. V HPLC jsou používány dva základní typy čerpadel. Tzv. lineární čerpadlo se skládá z pístu, který se pohybuje v pracovním válci o objemu až několika set ml. Mobilní fáze je před analýzou naplněna do válce a posuvem pístu následně vytlačována do dávkovacího ventilu a separační kolony. Rovnoměrného pohybu pístu ve válci je dosaženo otáčením závitového posuvu s pomocí krokového motorku. Výhodou tohoto čerpadla je bezpulsní provoz, principiálním nedostatkem je nemožnost změny složení mobilní fáze během analýzy. Zmíněný nedostatek eliminuje v současnosti nejčastěji používané reciproční uspořádání čerpadla, kde píst ve válci o objemu desítek až stovek μl periodicky nasává a vytlačuje mobilní fázi. Definovaný směr toku mobilní fáze ze zásobníku do dávkovacího ventilu a na ko38

lonu zajišťuje dvojice kuličkových ventilů. Funkce tohoto typu čerpadla není bezpulsní, eliminace tlakových pulsů je možno dosáhnout zařazením druhého pracovního válce s pístem pracujícím v opačné periodě. U recipročního typu čerpadla je možno měnit složení mobilní fáze před jejím vstupem do pracovního válce (Opekar a kol., 2002) Dávkovací zařízení Přímý nástřik vzorku injekční stříkačkou přes septum nebo při zastavení toku mobilní fáze (stop-flow) přímo na vrstvu sorbentu v koloně je metodou se špatnou reprodukovatelností, tedy nevhodnou pro kvantitativní analýzu. Nástřiková zařízení se musí vyrovnat s vysokými tlaky na koloně, používají se především dávkovací vysokotlaké ventily se smyčkou. Dobře vybavená chromatografická zařízení mají k dispozici autosamplery se zásobníkem vzorků (nejlépe s temperací) a s programovatelnou derivatizací vzorku před analýzou (Gratzfeld, Schuster, 2001). Kolona Separační kolony používané v HPLC musí odolat vysokému tlaku mobilní fáze. Jsou většinou vyrobeny z ocelové nebo tlustostěnné skleněné trubice o vnitřním průměru 2 – 5 mm a délce 30 – 300 mm. Kolony jsou naplněny vhodnou stacionární fází. Tou bývá obvykle oxid křemičitý vhodné zrnitosti, nejčastěji chemicky modifikovaný navázáním vhodných funkčních skupin. Typ funkční skupiny navázaný na povrch oxidu křemičitého určuje výslednou polaritu stacionární fáze. V HPLC jsou běžně používány hydrofobní stacionární fáze s navázanými uhlovodíkovými funkčními skupinami, stacionární fáze je pojmenována podle délky uhlovodíkových řetězců (např. C8 – oktyl, C18 – oktadecyl atd.). Jako stacionární fáze může být použit i granulovaný iontoměnič, tvořený nejčastěji síťovaným polystyrenem s navázanými kationogenními nebo anionogenními funkčními skupinami (Opekar, 2002). Detektory Spektrofotometrický (fotometrický) detektor Je v kolonové chromatografii nejvíce rozšířen. Eluent vytéká z kolony do měrné cely. Přístroj je vybaven deuteriovou výbojkou a mřížkovým monochromátorem. Může pracovat při vlnové délce v rozsahu 220 až 600 nm. Hlavní nevýhodou těchto detektorů 39

je neschopnost zaznamenávat složky, které neabsorbují UV záření. Vhodné i pro gradientovou eluci. Tento detektor pracuje na bázi spektrometru. Fluorimetrický detektor Podobný fotometrickému. Polychromatické záření prochází monochromátorem a dopadá na celu, kterou protéká eluent z kolony a část záření je absorbována. Emitované fluorescenční záření vstupuje do emisního monochromátoru. Záření pak dopadá na fotoelektrický násobič, kde se přemění na elektrický signál. Jednoznačnou předností tohoto detektoru je jeho vysoká citlivost. Je schopen detegovat eluovanou látku v koncentraci 10 až 1000x menší než fotometrický detektor. Další výhodou je značná selektivita. Voltametrický detektor Dovoluje zaznamenat velmi malé koncentrace organických látek, které jsou elektrochemicky redukovatelné nebo oxidovatelné. Detektor měří proud mezi pracovní (polarizovatelnou) a pomocnou elektrodou v závislosti na vloženém potenciálu. Lze tak stanovit fenoly, trioly, peroxidy, aromatické aminy, ketony, aldehydy, nitrolátky, konjugované estery (Kříženecka, 2007). Refraktometrický detektor Měří rozdíly mezi indexem lomu mobilní fáze a fluátu. Tento detektor není příliš citlivý (detekční limit 107 g/ml), ale je velmi univerzální. Při použití se musí přísně dodržovat konstantní teplota (Klouda, 2003). 2.6.8.3 Využití HPLC pro stanovení BA Ke stanovení biogenních aminů se obvykle jako nejvhodnější analytická metoda jeví RP-HPLC. Pro přesnější detekci jsou požadovány kroky předčištění a izolaci stanovených složek (Proestos a kol., 2008). Jen některé z nich absorbují UV spektrum ve viditelné oblasti, jako další krok se provádí derivatizace a to pre- nebo post-kolonová. Tento krok je důležitý k zajištění dostatečné citlivosti před aplikací injekce. Jako derivatizační činidla se používají nejčastěji dansylchlorid, o–ftalaldehyd, benzoylchlorid aj. (Gosetti a kol., 2007). Derivatizace 40

s dansylchloridem (DCL) má tu výhodu, že umožňuje detekci UV záření (254 nm) a rychlý eluční čas. O-ftaldialdehyd (OPA) derivatizace představuje dobrou volbu, pokud současně stanovujeme volný amin a aminokyselinu, ale vyžaduje spektrofluorometrickou detekci a delší eluční čas (Innocente, 2005). Separace se provádí pomocí kapalinového chromatografu. Po ukončení separace následuje identifikace s následným kvantitativní vyhodnocení analyzovaného vzorku. K identifikaci separovaných látek ve vzorcích se používá porovnání retenčních časů standardů a přítomných látek ve vzorku. U derivátů OPA se navíc používá srovnání absorpčních spekter eluovaných látek a standardů (Smělá, 2004).

41

3

CÍL Izolace bakterií mléčného kvašení z jogurtu a ze stolice 3 pokusných skupin osob

a následné stanovení dekarboxylační aktivity. 1. Izolace bifidobakterií a bakterií Lactobacillus acidophilus z jogurtu 2. Izolace vybraných bakterií zastoupených v tlustém střevě člověka 3. Stanovení dekarboxylační aktivity těchto izolátů

42

4

MATERIÁL A METODY

4.1 Materiál 4.1.1 Jogurty Jako materiál byly použity bílé selské jogurty (Hollandia, Karlovy Vary). Jogurty jsou složeny z mléka, mléčné bílkoviny, živé jogurtové kultury a kultury probiotické a to nejméně 100 milionů živých mikroorganismů v 1g. Jogurtové složka neobsahuje stabilizátory. A obsah tuku je nejméně 3,5%. Skladování při teplotě 4 – 8°C. Průměrná výživová hodnota ve 100 g výrobku Energie:

262 kJ, 63 kcal

Bílkoviny:

3,4 g

Sacharidy:

3,5 g

Tuky:

3,9 g

Vápník:

125 mg - tj. 15,5% DDD

4.2 Metody Byly sestaveny 3 skupiny osob pro sledování vlivu konzumace probiotik resp. synbiotik na mikroflóru travícího traktu. Skupina kontrolní (K) bez konzumace fermentovaných mléčných výrobků, probiotická (P) tato skupina konzumovala bílé selské jogurty s kulturou BIFI a Lactobacillus acidophilus o hmotnosti 200 g/ den (Hollandia, Karlovy Vary) a skupinu synbiotickou (S), která konzumonavala bílé selské jogurty s kulturou BIFI a Lactobacillus acidophilus s přídavkem inulinu o hmotnosti 200 g / den (Hollandia, Karlovy Vary). V každé skupině bylo 22 probandů. Celý pokus byl zahájen desetidenní adaptační fáze, na tuto fázi navazovala třítýdenní konzumace jogurtů a vše bylo zakončeno týdenní fází doznívání. V průběhu pokusu provedla každá

43

skupina 6x odběr vzorku stolice. Odběr se prováděl sterilními odběrovými tampóny s aktivním uhlím (Vitrium, Česká republika).

Tab 4. Popis odběru vzorku Číslo odběru

Den odběru

1

0. (konec adaptační fáze)

2

7.

3

14.

4

21. (konec konzumace jogurtů)

5

26.

6

28.(fáze doznívání) Měření pH jogurtů bylo provedeno ihned po přivezení od výrobce do laboratoře.

Bylo měřeno pomocí elektrody. Dále bylo pH měřeno na WTW microprocesor pH metru pH 95 (Německo) v intervalech 7., 14. a 21. den. Jogurty byly neustále skladovány při teplotě 4°C. Každá analytická metoda (mikrobiologická, fyzikální i chemická) byla prováděna ve dvou opakováních. 4.2.1 Stanovení bakterií rodu Enterococcus Stanovení bylo provedeno na mediu Bile esculin azide agar (HiMedia, Indonesie). Složení živné půdy Bille Esculin Azide Agar Kasein, enzymatický hydrolyzát

17,0 g/l

Oxgall

10,0 g/l

Hovězí extrakt

5,0 g/l

Proteózo - pepton

3,0 g/l

Chlorid sodný

5,0 g/l 44

Azid sodný

0,15 g/l

Citrát železito - amonný

0,5 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách (220A, Schoeller, Praha, ČR) 56,65 g živné půdy, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále by odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (Bile esculin azide agar, HiMedia, Indonesie) zchlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 48 hod. aerobně. 4.2.2 Stanovení bakterií rodu E. coli Stanovení bylo provedeno na ENDO agaru (Merck, Nizozemí). Složení živné půdy ENDO Masový pepton

10,0 g/l

Laktóza

10,0 g/l

Hydrogenfosforečnan amonný

3,5 g/l

Siřičitan sodný

2,5 g/l

Fuchsin

0,5 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l 45

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách (220A, Schoeller, Praha, ČR) 41,5 g živné půdy, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min. (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále by odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (ENDO, Merck, Nizozemí) zchlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 48 hod. anaerobně. 4.2.3 Stanovení bakterií rodu Lactobacillus acidophilus a BMK Stanovení bylo provedeno na mediu MRS (Biokar Diagnostic, Francie). Složení živné půdy MRS Pepton

10,0 g/l

Kvasniční extrakt

5,0 g/l

Masový extrakt

10,0 g/l

Glukóza

20,0 g/l

Tween 80

1,08 g/l

Difosfát sodný

2,0 g/l

Octan sodný

5,0 g/l

Citrát sodný

2,0 g/l

Sulfid hořčíku

0,2 g/l

46

Sulfid manganu

0,05 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách (220A, Schoeller, Praha, ČR) 70,3 g živné půdy, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále by odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (MRS, Biokar Diagnostic, Francie) u rodu Lactobacillus acidophilus byl použit supplement Clindamycin hydrochloric (Sigma – Aldrich, USA). Živná půda byla zchlazena na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 48 hod. aerobně. 4.2.4 Stanovení bakterií rodu Eubacterium Stanovení bylo provedeno na médiu Wilkins – Chalgren (Oxoid, VB). Složení živné půdy Wilkins - Chalgren Trypton

10,0 g/l

Pepton

10,0 g/l

Kvasnicový extrakt

5,0 g/l

Glukóza

1,0 g/l

Chlorid sodný

5,0 g/l

L - arginin

1,0 g/l

47

Pyruvát sodný

1,0 g/l

Hemin Menadion

0,005 g/l 0,0005 g/l

Bakteriologický agar

10,0 g/l

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách (220A, Schoeller, Praha, ČR) 43 g živné půdy, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále byl odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (Wilkins – Chalgren, Oxoid, VB), zchlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 72 hod. 4.2.5 Stanovení bakterií rodu Bacteroides Stanovení bylo provedeno na mediu Bacteroides (HiMedia, Indonesie) Složení živné půdy Bacterioides Kasein, enzymatický hydrolyzát

15,0 g/l

Sojový pepton

5,0 g/l

Chlorid sodný

5,0 g/l

Oxgall

20,0 g/l

Hemin (0,1% roztok)

0,01 g/l

Eskulin

1,0 g/l 48

Citrát železito - amonný

0,5 g/l

Vitamín K1

0,1 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách (220A, Schoeller, Praha, ČR) 61,51 g živné půdy, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále by odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (Bacterioides, HiMedia, Indonesie) a byl použit supplement Bacterioides. Živná půda byla zchlazena na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 48 hod anaerobně. 4.2.6 Stanovení bakterií rodu Clostridium Stanovení bylo provedeno na médiu Bouillon RCM dle Hirsche (Biokar Diagnostic, Francie). Složení živné půdy Bouillon RCM dle Hirsche Pepton

10,0 g/l

Kvasniční extrakt

3,0 g/l

Glukóza

5,0 g/l

Chlorid sodný

5,0 g/l

Rozpustný škrob

1,0 g/l

49

Octan sodný

3,0 g/l

Cystein hydrochlorid

0,5 g/l

Agar

0,5 g/l Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách

(220A, Schoeller, Praha, ČR) 43 g živné půdy s přídavkem Bacteriologického agaru typu E, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále by odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (Bouillon RCM dle Hirsche, Biokar Diagnostic, Francie), zchlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 48 hod anaerobně. 4.2.7 Stanovení bakterií rodu Bifidobacterium Stanovení bylo provedeno na mediu BSM se suplementem BSE, složení půdy nebylo výrobcem specifikováno. Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo na laboratorních vahách (220A, Schoeller, Praha, ČR) 55,5 g živné půdy, ta byla zalita jedním litrem destilované vody a ponechána nabobtnat. Následně byla provedena sterilace při teplotě 121°C/20 min (autokláv Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller, Praha, ČR). Po ukončení sterilace byla láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Scholler, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C.

50

Kultivace U vzorku po homogenizaci (homogenizátor Bagmixer 400, Fabrilabo, Francie) bylo provedeno ředění 9 ml fyziologického roztoku a 1 ml vzorku. Dále by odebrán 1 ml zředěného vzorku a odpipetován na Petriho misky, které byly zality živnou půdou (BSM) zchlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány v termostatu (Sanyo, Scholler, Praha, ČR) při teplotě 37°C po dobu 48 hod anaerobně.

4.2.8 Testování tyrosindekarboxylázové a histidindekarboxylázové aktivity izolovaných MO z trávicího traktu v dekaroxylačním mediu (DCM) Pro testování byl náhodně vybrán počet kolonií roven

. Kolonie byly 3x přečiš-

těny. Následně proběhla inokulace do dekarboxylačního média (DCM, podle autorů Bover – Cid a Holzpfel, 1999 citace dle Sládková, 2010, viz. tabulka 3), dekarboxylační médium obsahovalo 1% disodné soli tyrosinu a volnou bázi histidinu. Všechny izoláty byly inokulovány po dobu 4 dní a teplotě 37 °C s a bez (negativní kontrola) přidání tyrosinu a histidinu. Izoláty byly pozitivní po změně barvy ze žluté na fialovou.

51

Tab. 3 Dekarboxylační médium Trypton

5,0 g/l

Kvasnicový extrakt

5,0 g/l

Masový extrakt

5,0 g/l

NaCl

2,5 g/l

Glukóza

2,0 g/l

Tween 80

1,0 g/l

MgSO4

0,2 g/l

MnSO4

0,05 g/l

FeSO4

0,04 g/l

Citrát amonný

2,0 g/l

Thiamin

0,01 g/l

K2PO4

2,0 g/l

CaCO3

0,10 g/l

Pyridoxal-5-fosfát

0,05 g/l

Bromkresol pyrol

0,06 g/l

Agar

20,0 g/l

Použité AK L-tyrosin 1% disodné soli (SIGMA - Francie)

10,0 g/l

Volné báze histaminu (Cabbiochem - Kanada)

10,0 g/l

Do reagenční láhve bylo připraveno dekarboxylační medium (ze všech komponentů Tab 3., mimo AK). Směs byla zalita jedním litrem vody, následně byla vložena do autoklávu (Sanyo MLS – 3750/3780, Schoeller instruments, Praha, ČR) na 121°C/20 min. Po vyjmutí z autoklávu byla reagenční láhev s dekarboxylačním médiem vložena do vodní lázně (Julabo TW 20, Schoeller instruments, Praha, ČR), která byla vytemperována na 45°C. PH směsi bylo upraveno na 7,4 pomocí sterilních roztoků 0,1M HCl a 0,1 M NaOH. AK byly rozpuštěny v 0,1 M HCl a přefiltrovány přes filtr (Filter FFPT

52

2502-100-25 mm) a přidány do směsi, kde bylo pH opět upraveno na 7,4 pomocí sterilních roztoků 0,1M NaOH a 0,1M HCl. 4.2.9 Stanovení biogenních aminů pomocí HPLC Do 85 ml zkumavek bylo naváženo 10 g vzorku (± 1 mg) a přidáno 0,5 ml vnitřního standardu (1,7- diaminoheptan, koncentrace 1 mg/ml) a vzorky byly extrahovány 2 minuty s 15 ml 5 % kyseliny trichloroctové (TCA) za použití homogenizátoru Heidolph Diax 900 (Německo). Suspenze byla centrifugována po dobu 10 minut při 4 °C pomocí centrifugy Hettich Universal 32R (Hettich, Německo). Supernatant byl filtrován přes papírový filtr a pevný podíl byl opět extrahován. Spojené supernatanty byly doplněny na 50 ml deionizovanou vodou a zfiltrován přes jednorázový nylonový membránový filtr (13 mm, 0,45 μl, Chromatography Research Supplies, Addison, USA). Extrakt byl derivatizován dansylchloridem (5-dimethylaminonaphtalen-1-sulfonylchlorid, DCl). 1 ml extraktu byl napipetován do vialky 8 ml a k němu bylo přidáno 0,5 ml nasyceného Na2CO3 (pH upraveno na 11,2) a 1 ml derivatizačního činidla následně byla směs promíchána 1 minutu pomocí míchadla (MS2 Minishaker IKA, IKA Werke GmbH, Staufen, Německo). Derivatizace probíhala 1 hodinu ve tmě při 40 °C, a deriváty aminů byly extrahovány třikrát 1 ml diethyletheru. Organická fáze byla odpařena do sucha dusíkem a odparek byl rozpuštěn v 0,5 ml acetonitrilu (ACN). Roztok byl zfiltrován přes nylonový membránový filtr 0,45 μm a nastříknut na chromatografickou kolonu. Separace biogenních aminů byla provedena pomocí kapalinové chromatografie HP 1100 (Agilent Technologies, Wilmington, USA) složeného z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového degazeru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCl byla provedena pomocí gradientové eluce s H2O/ACN (čas 0 – 23 minut: H2O 0 - 35 %, ACN 65 – 100 %) na koloně Zorbax Elipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) s předkolonou Meta Gard ODS-2 (30 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) při průtoku 0,8 ml min -1 s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 254 nm.

53

4.3 Statistické vyhodnocení Program Statistica 10 (Stat Soft Inc., Tusla, OK, USA) byl použit pro výpočet průměru, směrodatné chyby od průměru, jednofaktorové analýzy rozptylu s následnou Post Hoc analýzou (Duncanův test) a regresí analýzy. Průměr Je statistická veličina, která v jistém smyslu vyjadřuje typickou hodnotu popisující soubor mnoha hodnot. Definice aritmetického průměru je, tzn. součet všech hodnot vydělený jejich počtem. Směrodatná chyba od průměru Může být použita jako míra přesnosti, s jakou výběrový aritmetický průměr x odhaduje skutečnou střední hodnotu µ. Prakticky se používá pro výpočet intervalů spolehlivosti aritmetického průměru u výběrových souborů (Stávková, Dufek, 2005). Jednoduchá analýza rozptylu Byla použita na zjištění rozdílů mezi jednotlivými skupinami, s následným použitím Duncanova testu. Rozdíly mezi skupinami byly stanoveny jako průkazné (p ˂ 0,05) nebo neprůkazné (p ˃ 0,05). Regresní analýza Vystihuje průběh závislosti prostřednictvím odpovídající matematické funkce. Byla použita na zjištění závisloti mezi procentuálním bakterií se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu na délce konzumace preparátů. Výsledky byly vyhodnoceny jako průkazné (p ˂ 0,05), neprůkazné (p ˃ 0,05), vysoce průkazné (p ˃ 0,01) a velmi vysoce průkazné (p ˃ 0,001).

54

5

VÝSLEDKY A DISKUZE V diplomové práci byl zjišťován vliv konzumace probiotik resp. synbiotik na

dekarboxylázovou aktivitu střevní mikroflóry. Pro dosažení požadovaného terapeutického účinku, by měla být minimální koncentrace probiotických výrobků > 1 x 106 CFU / ml nebo g. Denní konzumace by se měla pohybovat v rozmezí mezi 108 - 109 probiotických mikroorganismů (Kailasapathy, Chin, 2000). Každý rod nebo kmen byl testován na tyrDC (tyrosindekarboxylázu) a hDC (histidindekarboxylázu), a to ve dnech 0. (adaptační fáze), 21. (po třítýdenní konzumaci jogurtů) a 28. (fáze doznívání, bez konzumace). V experimentu bylo zjištěno, že dekarboxylázovou aktivitu vykazovaly téměř všechny sledované izoláty s výjimkou bifidobaktérií a rodu Bacteroides. V tyto dny byly pomocí metody HPLC testovány i jogurty u nichž nebyla prokázána tvorba BA a neprokázala se ani dekarboxylázová aktivita. V analyzovaných vzorcích byl zjištěn pouze výskyt tyrDC, hDC nebyla detekována v žádném ze vzorků stolice. To potvrdili i Bover – Cid a kol. (1999), kteří stanovovali obsah biogenních aminů ze vzorků klobás. Ačkoliv některé kmeny LAB jsou hlášeny jako intenzivní producenti histidindekarboxylázy, ani v jejich studii nebyla tato skutečnost prokázána. Ke stejným výsledkům ve své práci došli i Rejchrtová a kol. (2011), ti v izolovaných vzorcích sýrů zrajících pod mazem u rodu BMK a enterokoků, také prokázali pomocí metody HPLC pouze přítomnost tyraminu, histamin nebyl detekován ani v jednom ze vzorků.

5.1 Stanovení dekarboxylázové aktivity u rodu Enterococcus, BMK (resp. Lactobacillus acidophilus) V našem pokusu jsme rod Enterococcus, i přesto že patří mezi BMK stanovovali samostatně, protože je považován za významného producenta BA a to hlavně tyraminu.

55

Tuto skutečnost jsme prokázali již pomocí dekarboxylačního media, kdy byly všechny izoláty stanoveny jako pozitivní, což se následně prokázalo i metodou HPLC. Connil a kol. (2002) ve své studii zjistili, že většina bakterií rodu Enterococcus schopných produkovat tyramin pochází z potravin s výjimkou klinicky izolovaného E. faecalis. Dle Ladero a kol. (2012) je rod Enterococcus považován za významného producenta BA hlavně ve fermentovaných mléčných výrobcích. Výroba tyraminu v mléčných výrobcích je mnohostranný proces, ve kterém je hlavní požadavek kladen na přítomnost minimálního počtu mikroorganismů produkujících tyramin. Akumulace tyraminu je pak ovlivněna v různých ekologických a technologických procesech. Burdychová a kol. (2007) uvádí, že řada kmenů rodu Enterococcus tvoří takové koncentrace tyraminu, které již překračují hladinu toxicity (100 mg.l-1). Proto přítomnost kmenů produkujících tyramin v GIT může mít negativní důsledky na zdraví hostitele, tyto důsledky mohou být o to závažnější u vnímavých jedinců (Ladero, 2008). V předkládané diplomové práci byl pomocí dekarboxylačního média stanovován také rod BMK (resp. Lactobacillus acidophilus), jako dekarboxyláza-pozitivní bylo stanoveno 50% vzorků, zbytek byl označen jako negativní. Metodou HPLC bylo však u rodu BMK stanoveno 100% vzorků jako dekarboxyláza-pozitivní. V práci Komprda a kol., publikované v roce 2008 byly všechny izoláty rodu LAB získané z holandského polotvrdého sýra hlášeny jako dekarboxyláza pozitivní. Na nespolehlivost dekarboxylačního média poukazuje i studie Rejchrtové a kol. (2011), která se zabývala stanovením dekarboxylázové aktivity ve vzorcích sýrů zrajících pod mazem. Kdy u výsledků zjištěných pomocí HPLC u BMK bylo procento pozitivních vzorků (detekce histamin/tyramin) výrazně vyšší, než u výsledků získaných dekarboxylačním médiem.

56

5.2 Stanovení dekarboxylázové aktivity druhu E. coli Na obr. 5 - 7 je posuzován vliv faktoru skupin na tvorbu tyrosindekarboxylázy u bakterií druhu E. coli. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC v časovém intervalu (0., 21. a 28. den). V tab. 5 je zaznamenán průměrný obsah bakterií druhu E. coli se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u kontrolní, probiotické a synbiotické skupiny v 0. den odběru. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 probandů. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií druhu E. coli.

Tab. 5 Průměrné zastoupení bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 0. den Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

18,2

± 8,4

22

P

9,1

± 6,3

22

S

22,7

± 9,1

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

Na obr. 5 je patrné, že mezi množstvím bakterií druhu E. coli se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu a skupinami (K, P, S) v adaptační fázi nebyl rozdíl statisticky průkazný (p > 0,05).

57

% pozitivních izolátů bakterií druhu E.coli

35

A

30

A

25 20

A

15 10 5 0 K

P

S

skupiny

Obr. 5 Grafické znázornění průměrného zastoupení izolátů bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (0. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší (p ˃ 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova test

V tab. 6 je zobrazen průměrný obsah bakterií druhu E. coli se schopností tvořit tyrDC u skupiny kontrolní, probiotické a synbiotické v 21. den odběru. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 probandů. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií druhu E. coli Tab. 6 Průměrné zastoupení bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 21. den

Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

13,6

± 7,5

22

P

4,5

± 4,5

22

S

0

±0

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

58

Po ukončení konzumace jogurtů (obr. 6), nebyl mezi množstvím bakterií druhu E. coli se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu a skupinami (K, P, S) zjištěn statisticky rozdíl (p > 0,05), přesto byl u skupiny konzumující probiotika naměřen mírný pokles dekarboxylázové aktivity bakterií tohoto druhu, u synbiotické skupiny nebyla metodou HPLC prokázána žádná tyrosindekarboxyláza. Stejné hodnoty jako 21. den byly naměřeny i po 7denní adaptační fázi (obr. 7). Výsledky pokusu naznačují možný pozitivní vliv probiotických a synbiotických kultur na snižování schopnosti tvorby biogenních aminů (tyraminu) u bakterií druhu E. coli. Mezi významné producenty biogenních aminů patří dle Valero a kol. (2005) i bak-

% pozitivních izolátů bakterií druhu E. coli

terie z čeledi Enterobacteriaceae.

25

A

20 15 A 10 5

A 0 K

P

S

skupiny

Obr. 6 Grafické znázornění průměrného zastoupení izolátů bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po konzumaci jogurtů (21. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina A – průměry se průkazně neliší (p > 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

V tab. 7 je uveden obsah bakterií druhu E. coli se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u skupiny K, P, S v 28. den odběru. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 pro-

59

bandů. Stanovení tyrosindekarboxylázy bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií druhu E. coli. Tab. 7 Průměrné zastoupení bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 28. den

Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

13,6

± 7,5

22

P

4,5

± 4,5

22

S

0

±0

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření

% pozitivních izolátů bakterií druhu E. coli

K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

25

A

20 15 A

10 5 A

0 K

P

S

skupiny

Obr. 7 Grafické znázornění průměrného zastoupení izolátů bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin ve fázi doznívání (28. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Průměry označené písmeny A se průkazně neliší (p > 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

60

Stanovení dekarboxylázové aktivity rodu Clostridium

5.3

Na obr. 8, 9 a 10 je posuzován pouze vliv skupin jako jediného faktoru na schopnost tvořit tyrosindekarboxylázu u bakterií rodu Clostridium. Stanovení bylo prováděno na kapalinovém chromatografu v časovém intervalu (0., 21. a 28. den). V tab. 8 je zaznamenán obsah bakterií rodu Clostridium se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u skupiny kontrolní, probiotické a synbiotické v 0. den odběru. Stanovení tyrDC bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií rodu Clostridium. Každá skupina obsahovala 22 probandů. Tab. 8 Průměrné zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 0. den

Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

22,7

± 9,1

22

P

13,6

± 7,4

22

S

13,6

± 7,4

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

Na obr. 8 je patrný neprokazatelný statistický rozdíl (p > 0,05) zjištěný Duncanovým testem mezi procentuálním zastoupením izolátů bakterií rodu Clostridium s tyrosindekarboxylázovou aktivitou v adaptační fázi a sledovanými skupinami.

61

% pozitivních izolátů bakterií rodu Clostridium

35

A

30 25

A

A

P

S

20 15 10 5 0 K

skupiny

Obr 8. Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) seschopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (0. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší (p ˃ 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

V tab. 9 je zobrazen obsah bakterií rodu Clostridium se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u skupiny K, P, S. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií rodu Clostridium do každé skupiny bylo zařazeno 22 probandů.

Tab. 9 Průměrné zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 21. den skupiny

průměr

s.ch.

n

K

13,6

± 7,5

22

P

4,5

± 4,5

22

S

9,1

± 6,3

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

62

Neprokazatelný statistický rozdíl (p > 0,05) byl zjištěn pomocí Duncanova testu mezi bakteriemi se schopností tvořit tyrDC a skupinami (kontrolní, probiotickou a synbiotickou) po třítýdenní konzumaci jogurtů. Přesto došlo k mírnému snížení tyrosindekarboxylázové aktivity u skupiny probiotické a synbiotické. U probiotické skupiny

% pozitivních izolátů bakterií rodu Clostridium

bylo snížení patrnější a to o víc než 4% oproti snížení u skupiny synbiotické (obr. 9).

25

A

20 A 15 A 10 5 0 K

P

S

skupiny

Obr. 9 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po konzumaci jogutů (21. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší (p ˃ 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

V tab. 10 je zaznamenán průměrný obsah bakterií rodu Clostridium se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u skupiny K, P, S v 28. den odběru. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 probandů. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií rodu Clostridium.

63

Tab. 10 Průměrné zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 28. den Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

13,6

± 7,7

22

P

0

±0

22

S

4,5

± 4,5

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

U bakterií rodu Clostridium schopných tvořit tyrDC nebyl vliv sledovaných skupin statisticky průkazný (p > 0,05) ani po 7denní adaptační fázi (obr. 10). Tyrosindekarboxyláza byla naměřena pouze u kontrolní a synbiotické skupiny, což poukazuje na

% pozitivních izolátů bakterií rodu Clostridium

možný pozitivní vliv probiotik na snížení tvorby tohoto enzymu u rodu Clostridium. 25 A 20 15 A

10 5 A 0 K

P

S

skupiny

Obr. 10 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu po fázi doznívání (28. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší (p ˃ 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

64

Stanovení dekarboxylační aktivity rodu Eubacterium

5.4

Obr. 11 – 13 poukazuje na ovlivnění tvorby tyrosindekarboxylázy pomocí probiotických resp. synbiotických jogurtů u rodu Eubacterium. Schopnost tvořit tyrosindekarboxylázu byla testována 0., 21. a 28. den pomocí kapalinového chromatografu. V tab. 11 je uveden průměrný obsah bakterií rodu Eubacterium se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u K, P a S skupiny v 0. den odběru. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 probandů. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií rodu Eubacterium.

Tab. 11 Průměrné zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 0. den Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

100

±0

22

P

91

± 8,4

22

S

100

±0

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

Obr. 11 mapuje vliv skupin na průměrný obsah dekarboxyláza-pozitivních izolátů bakterií rodu Eubacterium v 0. den. Vliv faktoru skupin nebyl statisticky průkazný (p > 0,05).

65

% pozitivních izolátů bakterií rodu Eubacterium

120 A

A

A

K

P

S

100 80 60 40

20 0

skupiny

Obr. 11 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (0. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší (p ˃ 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

V tab. 12 je zaznamenán průměrný obsah bakterií rodu Eubacterium se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u skupiny K, P a S v 0. den odběru. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií rodu Eubacterium, každá skupina obsahovala 22 probandů. Tab. 12 Průměrné zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 21. den Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

100

±0

22

P

82

± 8,4

22

S

82

± 8,4

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

66

Na obr. 12 je neprokazatelný statistický rozdíl (p > 0,05) mezi % bakterií schopných tvořit tyrDC a sledovanými skupinami. Stanovení bylo prováděno 21. den (na konci konzumace jogurtů). U skupiny P a S byla dekarboxylázová aktivita snížena na

% pozitivních izolátů bakterií druhu Eubacterium

82 %.

120 A 100

A

A

P

S

80 60 40 20 0 K

skupiny

Obr. 12 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po konzumaci jogurtů (21. den) K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší při p ˃ 0,05; na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu.

V tab. 13 je zaznamenán průměrný obsah bakterií rodu Eubacterium se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u kontrolní, probiotické a synbiotické skupiny v 28. den odběru. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 probandů. Stanovení bylo prováděno metodou HPLC z 66 izolátů bakterií rodu Eubacterium.

67

Tab. 13 Průměrné zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 28. den Skupiny

průměr

s.ch.

n

K

100

±0

22

P

86

± 7,5

22

S

82

± 8,4

22

s.ch. - směrodatná chyba od průměru, n – počet měření K – kontrolní skupina; P – probiotická skupina; S – synbiotická skupina

Při vyhodnocení výsledků pomocí Duncanova nebyl po fázi doznívání (obr. 13) mezi tyrozindekarboxylázovou aktivitu rodu Eubacterium a sledovaných skupin prokazatelný statistický rozdíl (p > 0,05). U skupiny probiotické však narostla dekarboxylázová aktivita o 4 % oproti hodnotám naměřeným 21. den, u skupiny S tato hodnota zůstala stejná tedy na 82%. Tyto výsledky mohou poukazovat na možný příznivý vliv

% pozitivních izolátů bakterií rodu Eubacterium

synbiotik na snižování dekarboxylázové aktivity. 120 A 100

A A

80 60 40 20 0 K

P

S

skupiny

Obr. 13

Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po fázi doznívání (28. den)

K (kontrolní), P (probiotická) a S (synbiotická) skupina Stejně označené průměry (A) se neliší (p ˃ 0,05); na statistické zpracování dat byla použita jednofaktorová analýza rozptylu, s následným použitím Duncanova testu

68

5.5

Vliv délky konzumace jogurtů na tvorbu tyrosindekarboxylázy Na obrázku (14 - 16) jsou zobrazeny závislosti tvorby tyrosindekarboxylázy u

bakterií rodu Clostridium, Eubacterium a druhu E. coli na délce konzumace (kontrolních, probiotických a synbiotických) preparátů. Dekarboxylázová aktivita byla stanovována 0., 21. a 28. den a to pomocí metody HPLC. V každém grafu je zohledněn faktor skupin (K, P a S), výjimkou byla jen kontrolní skupina u rodu Eubacterium kdy všechny vzorky byly stanoveny kapalinovým chromatografem jako pozitivní. Vyhodnocení

% pozitivních izolátů bakterií druhu E. coli

výsledků bylo provedeno lineární regresí.

SYNBIOTICKÁ SK. y = 22,23 - 1,0489x R² = 0,9423; p ˂ 0,001

25 20

KONTROLNÍ SK. y = 18,01-0,175x R² = 0,9423; p ˂ 0,05

15

PROBIOTICKÁ SK. y = 8,916 - 0,175x R² = 0,9423; p ˃ 0,05

10 5 0

0

5

10

15

20

25

30

délka konzumace kontolních /probiotických /synbiotických preparátů (dny)

Obr. 14 Pozorování závislostí bakterií druhu E.coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu na délce trvání konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny) u probandů Na obr. 14 můžeme pozorovat snižující se obsah dekarboxyláza pozitivních bakterií druhu E. coli a to u skupiny kontrolní (p < 0,05) podle funkce y = 18,01 - 0,175x, konzumující probiotika (p > 0,05) y = 90,192 - 0,23x a u skupiny synbiotické (p < 0,001) podle funkce y = 99,308 – 0,6923x.

69

% pozotivních izolátů bakterií rodu Clostridium

25 20

KONTROLNÍ SK. y = 22,38-0,35 x R² = 0,9423; p ˂0,01

SYNBIOTICKÁ SK. y = 13,958 -0,2995 x R² = 0,9197; p ˂ 0,05

15 10

PROBIOTICKÁ SK. y =13,769 - 0,4736x R² = 0,9423; p ˃ 0,05

5 0 0

5 10 15 20 25 délka konzumace kontolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny)

30

Obr. 15 Pozorování závislostí bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu na délce trvání konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny) u probandů Na obr. 16 můžeme pozorovat snižující se obsah dekarboxyláza pozitivních bakterií rodu Clostridium podle funkce y = 22,38-0,35x (kontrolní skupina) funkce je statisticky vysoce průkazná (p < 0,01), u skupiny probiotické se dekarboxylázová aktivita snižuje podle funkce y = 13,769 - 0,4736x (p > 0,05) a u synbiotické (p < 0,05) y = 13,958 – 0,2995x.

70

% pozitivních izolátů bakterií rodu Eubacterium

105 100 95 90 85 80 75 70 65 60

PROBIOTICKÁ SK. y = 90,192 - 0,2363 x R² = 0,5829, p ˂ 0,001

SYNBIOTICKÁ SK. y = 99,308 -0,692 x R² = 0,9423; p ˂ 0,001

0

5

10

15

20

25

30

délka konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny)

Obr. 16 Pozorování závislostí bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu na délce trvání konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny) u probandů Na obr. 16 můžeme pozorovat snižující se obsah dekarboxyláza pozitivních bakterií rodu Eubacterium (p < 0,001) u skupiny konzumující probiotika podle funkce (y = 90,192 - 0,23x) a u skupiny synbiotické podle funkce (y = 99,308 – 0,6923x).

71

6

ZÁVĚR V rámci pokusu bylo zkoumáno, zda má vliv konzumace probiotik resp. prebiotik

na tvorbu biogenních aminů v trávicím traktu člověka. Jako materiál byly použity jogurty bílé, značky Hollandia Karlovy Vary, a.s. Sledování biogenních aminů je důležité z hlediska toxicity na lidské zdraví, jejich množství také ovlivňuje kvalitu potravin. Pro stanovení se používá řada metod, v našem případě byla dekarboxylázová aktivita stanovena dekarboxylačním mediem s následným prověřením metodou HPLC. Před analýzou dochází k přeočkování mikroorganismů na živnou půdu. U stanovení dekarboxylačním mediem může docházet k barevným reakcím bez tvorby biogenních aminů, takto stanovené výsledky nemůžeme brát jako zcela prokazatelné, dochází k tvorbě falešně pozitivních reakcí, kvůli tvorbě jiných alkalických sloučenin. Proto se musí používat ještě kontrolní měření pomoci kapalinové chromatografie (HPLC). Vzorky byly metodou HPLC stanovovány různém časovém období (0., 21., 28. den) a sledoval se vliv skupin na tvorbu tyrosindekarboxylázy mikroorganismů získaných ze vzorku stolice probandů. V experimentu bylo zjištěno, že dekarboxylázovou aktivitu vykazovaly téměř všechny sledované izoláty s výjimkou bifidobaktérií a rodu Bacteroides. V našem pokusu jsme prokázali, že rod Enterococcus vykazuje ve všech izolovaných vzorcích dekarboxylázovou aktivitu a to jak při stanovení dekarboxylačním mediem, tak i kapalinovou chromatografií. U bakterií mléčného kvašení jsme dekarboxylačním mediem stanovili jako dekarboxyláza – pozitivní 50% vzorků. Následným prověřením těchto vzorků metodou HPLC jsme jako pozitivní stanovili všech 100%, toto poukazuje na nespolehlivost dekarboxylačního media. U všech izolátů byla zjištěna pouze tyrDC, hDC jsme neprokázali. Na pravděpodobný pozitivní vliv probiotik a synbiotik poukazuje mírné snížení dekarboxylázové aktivity u rodu Eubacterium, clostridií a druhu E. coli. U bakterií druhu E. coli nebyla po konzumaci jogurtů ani v následném měření ve fázi doznívání

72

naměřena u synbiotické skupiny žádná tyrosindekarboxylázová aktivita. I u probiotické skupiny došlo ke snížení. Vliv skupin však nebyl statisticky průkazný (p ˃ 0,05). U rodu Clostridium došlo ke snížení u skupiny konzumující probiotika v 21. den byla hodnota tyrDC 4,5 % v následném měření už nebyla naměřena žádná tyrosindekarboxyláza. U synbiotické skupiny také došlo k mírnému snížení dekarboxylázové aktivity (p ˃ 0,05). U rodu Eubacterium je patrné snížení dekarboxyláza-pozitivních bakterií u obou skupin (probiotické a synbiotické) na 82% po třítýdenní konzumaci jogurtů. Ve fázi doznívání byla naměřena u synbiotické skupiny opět 82%, ale u skupiny probiotická došlo k nárůstu na 86%. Geny pro tvorbu tyraminu se následně prověřili PCR.

73

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

ADAMS M. R., MOSS M. O.: Food microbiology, Royal society of chemistry, 2000, s. 479. ARENA M. E., MANCA DE NADRA M. C., 2001. Biogenic amine production by Lactobacillus, In Journal of Applied Microbiology, roč. 90, 2001, s. 158-162. ANONYM

1

2010:

dostupné

na



[cit. 2012-02-02] ANONYM 2: dostuné na [cit. 2012-04-02] BEDNÁŘ M., a kol.: Lékařská mikrobiologie: bakteriologie, virologie, parazitologie. Praha: Triton, 1996str. 560. BERNARDEAU M., VERNOUX J. P., HENRI-DUBERNET S., GUÉGUEN M.: Safety assessment of dairy microorganisms: the Lactobacillus genus, Int J Food Microbiol., 2008, s. 278-85. BODMER S., IMARK C., KNEUBUHL M.: Biogenic amines in foods: histamine and food processing. Inflammation Research, 1999, 48 (6), str. 296–300, ISSN 1023–3830. BOVER-CID S., SCHOPPEN S., IZQUIERDO-PULIDO M., VIDAL-CAROU M.C.: Relationship between biogenic amine contents and the size of dry fermented sausages, Meat science, Vol.51, 1999, s. 305-311. BOVER-CID S., IZQUIERDO-PULIDO M., VIDAL-CAROU M.C.: Influence of hygienic quality of raw materials on biogenic amine production during ripening and storage of dry fermented sausages, Journal of Food Protection, Vol. 63, No. 11, 2000, s. 1544-1550.

74

BOVER-CID S., MIGUÉLEZ-ARRIZADO M. J., BECKER B., HOLZAPFEL W. H.,VIDAL-CAROU M. C.: Amino acid decarboxylation by Lactobacillus curvatus CTC273 affected by the pH and glucose availability, In Food Microbiology, roč. 25, 2008, s. 269-277. BOURLIOUX P., KOLETZKO, B.; GUARNER F., BRAESCO V.: The intestine and its microflora are partners for the protection of the host: report on the Danone Symposium "The Intelligent Intestine," held in Paris, American Journal of Clinical Nutrition, 2003, roč. 78. č. 4, s. 675-683. ISS 0002-9165. BURDYCHOVÁ R., SLÁDKOVÁ P.: Mikrobiologická analýza potravin. Brno: Ediční středisko MZLU v Brně, 2007, s. 218. COLLINS M. D., GIBSON G. R.: Probiotics, prebiotics and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut. Am. J. Clin. Nutr. 69: 1999, s.1052-1057. CONNIL N. a kol..: Identification of the Enterococcus faecalis tyrosine Decarboxylase Operon Involved in tyramine Production, Applied and enviromental microbiology, 2002. ČSN ISO 15214:1998: Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C, Český normalizační institut, Praha 2000, 12s. DADÁKOVÁ E., PROCHÁZKOVÁ E., KŘÍŢEK M.: Application of micellar electrokinetic capillary chromatography for quantitative analysis of quercetin in plant material, Electrophoresis, 2001, 22, s. 1573-1578. DAPKEVICIUS M. L., a kol..: Biogenicamine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms, International Journal of Food Microbiology 57, 2000, s. 107–114 EEROLA S., HINKKANEN R., LINDFORS E., HIRVI T.: Liquid chromatographic determination of biogenic amines in dry sausages, J. AOAC Int., 1993, 575–577. FAVARO G., PASTORE P., SACCANI G., CAVALLI S.: Food Chemistry Determination of biogenic amines in fresh and processed meat by ion chromatography and integra75

ted pulsed amperometric detection on Au electrode, Food Chemistry, Volume: 105, 2007, s. 1652-1658. GARDINI F., a kol: Effect of pH, temperatur, and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic aktivity and biogenic amine production of Enterococcus feacalis. International journal of food mikrobiology, vol. 64, 2001, s. 105-117. GIRAFFA G., CHANISHVILL N., WIDYASTUTI Y.: Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology, Research in Microbiology, 2010, s. 480-487. GORBACH S. L., KNOX T. A. a ROUBENOFF R.: Interactions between nutrition and infection with human immunodeficiency virus, Nutrition Reviews, 1993, 51:226-234. GORBACH S. L.: Probiotics in the Third Millennium: Digestieve Liver Dissease, 2002, 34 (Suppl.2), s. 52-57 GOSETTI F., MAZZUCCO E., GIANOTTI V., POLATI S., GENNARO M. C.: High performance liquid chromatography / tandem mass spectrometry determination of biogenic amines in typical Piedmont cheeses, Journal of Chromatography A, 2007, Volume: 1149, Issue: 2, s. 151-15. GIBSON G., ROBERFROID M. B.: Dietary modulation of the colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics, J Nutr , 1995, 125: 1401–1412. GIBSON G. R.: Prebiotics development and application, Hoboken, USA, 2006, s. 266, ISBN 0-470-02313-9. GRATZFELD-HUSGEN A., SCHUSTER R.: HPLC for Food Analysis, A primer, Agilent Technologies Company, Germany, 2001. GULLÓN M., a kol.: Manufacture of prebiotics from biomass sources. Prebiotics and probiotics science and technology, 2009, s. 335-385. INNOCENTE N., a kol.: Determination of biogenic amines in cheese using HPLC technique and direct derivatization of acid extract, Food Chem. 101, 1285, 2007. JOHNSON S.: Recurren Clostridium difficile infection: a of risk factors, treatments, and cutcomes, Journal of infection vol. 58, 2009, 403 – 410. 76

JONKERS D., STOCKBRUNGER R.: Review article: probiotics in gastrointestinal and liver diseases. Aliment Pharmacol Ther, 26 (Suppl. 2), 2007, s. 133–148. JUNEJA I. K., SOFOS J.,K.: Patogens and toxins in food, ASM Press, 2010, s. 512. KAILASAPHATHY K., CHIN J.: Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunology and Cell Biology. 78, 2000, p. 80-88. KALÁČ P., KŘÍŽEK M.: Biogenní aminy a polyamidy v potravinách, Výživa a potraviny 12 -13, 2002, s. 53-56 KALAČ P.: Funkční potraviny, České Budějovice: Nakladatelství Dona, 2003, str. 3441, ISBN 80-7322-029-6. KAROVIČOVA J.; KOHAJDOVA Z. Biogenic amines in food, Chem.listy, 1 (59), 2003, s. 70–79. KAROVIČOVÁ J., KOHAJDOVÁ Z.: Biogenic amines in foods, Chem. Listy 59, 2005, s. 70-79. KLOUDA P.: Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 2003, 132 s., ISBN 80-86369-07-2 KOMPRDA T., SMĚLÁ D., PECHOVÁ P., KALHOTKA L., ŠTENCL J., KLEIDUS B.: Effect of starter culture, spice mix and storage time and temperature on biogenic amine content of dry fermented sausages, Meat Science 67, 2004, p. 607-616. KOMPRDA T.: Biogenní aminy a polyaminy ve fermentovaných potravinách živočišného původu, Veterinářství, sv. 55, č. 10, 2005, s. 646-650. ISSN 0506-823.1 KOMRDA T.: Obecná hygiena potravin 1. vydání, MZLU Brno, 2004, s. 146 KOMPRDA T., BURDYCHOVÁ R., DOHNAL V., CWIKOVÁ O., SLÁDKOVÁ P. KOVÁ

a

DVOŘÁČ-

H.: Tyramine production in Dutch-type semi-hard cheese from two different pro-

ducers. Food Microbiol. 25, 2008, s. 219-227.

77

KOMPRDA T.; DOHNAL V.: Amines. In: Leo M.L. Nollet, Fidel Toldrá (Edited): Handbook of Dairy Foods Analysis, Analysis, 2009032734. Boca Raton, FL, USA: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2010, s. 861-878, ISBN 978-1-4200-4631-1. KŘÍŽEK M., KALÁČ P.: Biogenic amines in foods and their roles in human nutrition, Czech Journal of Food Science 16, 1998, str. 151–159. KŘÍŽENECKÁ S.: Základy analytické chemie, Univerzita Jana Engliše, 2007, s. 110 LATORRE-MORATALLA M. L., BOVER-CID S., a kol:. Strategies to reduce biogenic amine accumulation in traditional sausage manufacturing. LWT – Food Sci Technol, 43(1), 2010, 20–5. LADERO V., FERNÁNDEZ M., ALVAREZ M.A.: Isolation and identification of tyramine-producing enterococci from human fecal samples, Can. J. Microbiol. 55, 2009, s. 215-218. LADERO V., MARTÍNEZ N., MARTÍN M.C. a kol: qPCR for quantitative detection of tyramine-producing bacteria in dairy products, Food Research International, Volume 43, Issue 1, January 2010, Pages 289-295. LADERO V., FERNÁNDEZ M., CALLES-ENRÍQUEZ M. a kol: Is the production of the biogenic amines tyramine and putrescine a species-level trait in enterococci?, Food Microbiology, Volume 30, Issue 1, 2012, s. 132-138. LANDETE J. M., DE LAS RIVAS B., MARCOBAL A., MUÑOZ R.: Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on foods, In International Journal of Food Microbiology, roč.117, 2007, s. 258-269. LAPA-GUIMARAES J., PICKOVA J.: New solvent system for thinlayer chromatographicdetermination of nine biogenic amines in fish and squid, Journal of Chromatography A, 1045, 2004, s. 223-232 . MACFARLANE G. T. a CUMMING J. H.: The colonie flora, fermentation and large bowel digestive function. In: The Large Intestine: Physiology, Pathophysiology and Disease, Raven Press, New York, NY, 1991, 51-92.

78

MADDEN J. A., a kol.: Effect of probiotics on preventing disruption of the intestinal microflora following antibiotic therapy: a double-blind, placebo-controlled pilot study, Int Immunopharmacol, 5, 2005, s.1091–1097. MARTÍNEK J., ŠPIČÁK J., PANTOFLÍČKOVÁ D.: Helicobacter pylori a peptický vřed: co nového? Čes. a slov. Gastroenterol., 2000; 54:24-34. MASCO L., HUYS G., GEVERS D., VERBRUGGHEN L., SWINGS J.: Identification of Bifidobacterium species using rep-PCR fingerprinting, Syst. Appl. Microbiol., 26(4),2003, s. 557-63. MORELLI L.: In vitro assessment of probiotic bacteria from survival to funcionality, Int. diary J. 17, 2007, s. 1278-1281. MORENO-ARRIBAS V. a kol.: Wine chemistry and biochemistry. Springer, 2009, s. 735 MORET S. a CONTE L. S.: High-performance liquid chromatographic evaluation of biogenic amines in foods. An analysis of different methods of sample preparation in relation to food characteristics, J. Chromatography A 729, 1996, s. 363. MUNOZ R.: Bakteriální biogenních aminů produkce, SciTopics , 2008, [cit:12-02-01], MURALI E., a kol.:Probiotics as Potential Therapies in Human Gastrointestinal Health, International Journal of Advances in Pharmaceutical Sciences, 2010, s. 96-110. NEVORAL J.: Prebiotika, probiotika, synbiotika, Pediatr. Pax, 2005, s. 34-35. NG S. C. A KOL., Mechanisms of action of probiotics: Recent advances, Inflamm bowel dis. vol. 15, 2009, s. 300-310. OPEKAR F.: Základní analytická chemie, Karolium 2010, ISBN 9788024617756. ÖNAL A.: A review: Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods, Food Chem. 103, 2007, s. 1475. POT B.: The taxonomy of lactic acid bacteria, In. Bactéries lactiques, de la génétique aux ferments. G. Corrieu, F.M. Luquet, eds. Lavoisier, 2008, s. 1-152. 79

POT B, TSAKALIDOU E.: Taxonomy and metabolism of Lactobacillus. Chapter 2 In: Lactobacillus Molecular Biology. Edited by: Ljungh and Wadstrom, Caister Academic press, 2009, str. 3- 58. PRINDIVILLE T.P., A KOL: Bacterioides fragilis Enterotoxin gene sequens in patients with inflamatory bowel discase, Emerging Infectious diseases vol 6, No. 2, 2006. PROESTOS CH., KAPSOKEFALOU M., KOMAITIS M.: Analysis of naturally occuring phenolic compounds in aromatic plants by RP-HPLC and GC-MS after sylvation, Journal of Food Quality, Volume 31, Issue 3, June 2008, s. 402–414. REJCHRTOVÁ E., a kol.: Determination of dakarboxylase aktivity the selected bacteria hazarrdous, Mendelnet 2011. ROBINSON A.D., A KOL.: Popula genetics Enterococcus, Bacterial Population Genetics in Infectious Disease, 2010, s. 426. ROBERFROID M. B.: Functional foods: concepts and application to inulin and oligofructose, Br J Nutr 87, Suppl. 2, 2002, s. 139–143. ROIG-SAGUÉS,A. X., HERNÀNDEZ-HERRERO M. M., LÓPEZ-SABATER E. I., RODRÍGUEZ-JEREZ J. J., MORA-VENTURA M. T.:Evaluation of three decarboxylating agar media to detect histamine and tyramine-producing bacteria in ripened sausages, In Letters in Applied Microbiology, roč. 25, 1997, s. 309-312. ROVENSKÝ J., A KOL.: Revmatologický výkladový slovník, 2006, s. 208, 80-2471614-3 RUDOLFOVÁ J., ČURDA L.: Prebiotický účinek galaktooligosacharidů a využití laktosy pro jejich produkci, Chem. Listy 99, 2005, s. 168 - 174. RUIZ-CAPILLAS C., JIMÉNEZ-COLMENERO F.: Biogenic amines in meat and meat products, Critical Reviews in Food Science and Nutrition 44, 2004, p. 489-499. SALMINEN S. A KOL.: Demonstration of safety of probiotics — a review, International Journal of Food Microbiology, Volume 44, Issues 1–2, 20 October 1998, s. 93-106.

80

SAUNIER K., DORE, J.: Gastrointestinal tract and the elderly: functional foods, gut microflora and healthy ageing, Digestive and Liver Disease 34, 2002, s. 19-24. SHALABY A. R.: Significance of biogenic amines to food safety and human health, Food Research International, Volume 29, Issue 7, October 1996, s. 675-690. SHALABY A.R.: Simple, rapid and valid thin layer chromatographic metod for determining biogenic amines in food, Food chemistry 65, 1999, s. 117-121. SILLA SANTOS M. H.: Biogenic amines: their importance in foods, International Journal of Food Microbiology, Volume 29, Issues 2–3, April 1996, s. 213-231. SILLA SANTOS M. H.: Amino acid decarboxylase capability of microorganisms isolated in Spanish fermented meat products, International Journal of Food Microbiology, Volume 39, Issue 3, 17 February 1998, s. 227-230. SILVA F, M., SIVIERI K., ROSSI A. E.: Effects of a probiotic soy product and physical exercise on formation of pre-neoplastic lesions in rat colons in a short-term model of carcinogenic, Journal of the International Society of Sports Nutrition , 2009. SKOOG D. A; WEST D. M.; HOLLER J. F.; CROUCH S. R.: Fundamentals of Analytical Chemistry (8th ed.). Thomson Brooks/Cole, 2004, ISBN 0-03-035523-0. Section 30E SMĚLÁ D., PECHOVÁ P., KOMPRDA T., KLEIDUS B., KUBÁŇ V.: Chromatografické stanovení biogenních aminů v trvanlivých salámech během fermentace a skladování, Chem. Listy 98, 2004, s. 432-437. SLÁDKOVÁ P.: Molekulární a mikrobiologické aspekty tvorby biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích, Dizertační práce, 20010 Mendlova univerzita v Brně STANDAROVÁ E., BORKOVCOVÁ I., VORLOVÁ L. (2008): Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě, Veterinářství 58 (11), s. 735-738. ISBN 05068231.

81

SUKOVÁ I., Biogenní aminy v mléčných výrobcích, ÚZEI, 2006, [cit:09-06-25], dostupné na SUZZI G., GARDINI F.: Biogenic amines in dry fermented sausages: a review, Int. J. of Food Microbiology 88, Issue 1, 2003,p. 41-54. STEINHAUSEROVÁ I.: Otravy biotoxiny ryb a mořských živočichů, Veterinářství 2004, s. 176-179. ŠTEGNEROVÁ H. A KOL.: Identifikace bakterií mléčného kvašení v mase baleném v podmínkách ochranné atmosféry, Veterinářství 57, 2007, s. 39-42. ŠVESTKA T.: Mikroflóra trávicího traktu a probiotika, Pediatr. Pax, 2008, s. 34-35. TONG J. L., RAN Z. H., SHEN J., A KOL.: Meta-analysis: the eff ect of supplementation with probiotics on eradication rates and adverse events during Helicobacter pylori eradication therapy, Aliment Pharmacol Ther 25, 2007, s. 155-168. TUOHY K., A KOL.: Using probiotics and prebiotics to improve gut health, Drug Discovery Today, 2003, s. 692-700. VALERO B. V., BAUER F., SMULDERS F. J.M., ARIÑO A., HAGEN U., PAULSEN P.: Biogenic Amines and Polyamines and Total Aerobic Count During Storage of VacuumPackaged Porcine Kidney, Liver and Spleen. Food Sci. Tech. Int. 11(5), 2005, s. 337 – 344 ISSN 1082-0132 VASILJEVIC T., SHAH N. P.: Probiotics-From Metchnikoff to bioactives, International Dairy Journal, vol. 18, 2008, s. 714–728. VOLTAVA M, A KOL.: Lékařská mikrobiologie speciální, 1. vyd. Brno : Neptun, 2003, s. 495, ISBN-10: 80-902896-6-5. VILJANEN M., KUITUNEN M., HAAHTALE T., A KOL.: Probiotic effects on faecal inflammatory markers and on faecal IgA in food allergic atopic eczema/dermatitis syndrome infants, Pediatr Allergy Immunol. 16, 2005, s. 65–71.

82

ZAVAGLIA A. G. A KOL.: Characterization of Bifidobacterium strains using BOX primers, Anae. 6, 1999, s. 169-177.

83

8

SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ

8.1 Seznam obrázků Obr. 1 Chemická struktura některých aminů Obr. 2 Schéma vzniku biogenních aminů z aminokyselin Obr. 3 Schéma kapalinové chromatografie Obr. 4 Schéma kapalinového chromatografu Obr. 5 Grafické znázornění průměrného zastoupení izolátů bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (0. den) Obr. 6 Grafické znázornění průměrného zastoupení izolátů bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po konzumaci jogurtů (21. den) Obr. 7 Grafické znázornění průměrného zastoupení izolátů bakterií kmene E. coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin ve fázi doznívání (28. den) Obr. 8 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) seschopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (0. den) Obr. 9 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po konzumaci jogutů (21. den) Obr. 10 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázuu sledovaných skupin po fázi doznívání (28. den) Obr. 11 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (0. den) Obr. 12 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin po konzumaci jogurtů (21. den) 84

Obr. 13 Grafické znázornění průměrného zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu u sledovaných skupin v adaptační fázi (28. den) Obr.14 Pozorování závislostí bakterií druhu E.coli (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu na délce trvání konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny) u probandů schopností tvořit tyrosindekarboxylázu po fázi doznívání (28. den) Obr. 15 Pozorování závislostí bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvořit tyrosindekarboxylázu na délce trvání konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny) u probandů Obr. 16

Pozorování závislostí bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvořit

tyrosindekarboxylázu na délce trvání konzumace kontrolních / probiotických / synbiotických preparátů (dny) u probandů

8.2 Seznam tabulek Tab. 1 Mechanismus působení probiotik Tab. 2 Mikroorganismy produkující biogenní aminy nalezené v potravinách Tab. 3 Dekarboxylační medium Tab. 4 Popis odběru vzorku Tab. 5 Průměrné zastoupení bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 0. den Tab. 6 Průměrné zastoupení bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 21. den Tab. 7 Průměrné zastoupení bakterií druhu E. coli (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 28. den Tab. 8 Průměrné zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvorby tyr sindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 0. den

85

Tab. 9 Průměrné zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 21. den Tab. 10 Průměrné zastoupení bakterií rodu Clostridium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 28. den Tab. 11 Průměrné zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 0. den Tab. 12 Průměrné zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 21. den Tab. 13 Průměrné zastoupení bakterií rodu Eubacterium (%) se schopností tvorby tyrosindekaroboxylázy u sledovaných skupin při odběru vzorku 28. den

86

9

SEZNAM ZKRATEK

ACN - Acetonitril AK - Aminokyseliny BA – Biogenní aminy Bact. - Bacteroides BAI – Index biogenních aminů BIFI – Bifidobacterium BMK – Bakterie mléčného kvašené CAD - Kadaverin CE – Kapalinová elektroforéza CD – Crohnova choroba Clost. - Clostridium DAO - Diaminooxidáza DCM – Dekarboxylační medium DCL – Dansylchlorid EHEC – Enterohemoragická E. coli EIEC – Enteroinvazivní E. coli Entero. – Enterobacteriaceae EPEC – Enteropatogenní E. coli ETBF – Enterotoxigenní B. fragilis ETEC – Enterotoxigenní E. coli Eubac. – Eubacterium

87

FOS – Fruktooligosacharid GC – Plynová chromatografie GOS – Gluko - oligosacharidy GIT – Gastrointestinální trakt HCl – Kyselina chlorovodíková HIS – Histamin HMT - Histaminethyltransferáza HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Ig A – Imunoglobulin A K – Kontrolní skupina LA – Lactobacillus acidophylus LAB – Laktobakterie MAO - Monoaminooxidáza MO – Mikroorganismus NaOH – Hydroxid sodný OPA – O - ftaldialdehyd P- Probiotická skupina PUT – Putrescin S –Synbiotická skupina SPD – Spermidin SPM - Spermin TLC – Chromatografie na tenké vrstvě

88

UC – Ulcerózní kolitida XOS – Xylo - oligosacharid

89