4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Optická (světelná) Mikroskopie pro TM I
[email protected] Ústav skla a keramiky VŠCHT Praha
+42- 0- 22044- 4151
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Osnova přednášky Typy klasických biologických a polarizačních mikroskopů Přehled součástí polarizačního mikroskopu Osvětlení, filtry
Clony, kondenzor Objektivy, okuláry Kompenzátory
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy
polarizační mikroskop
stereomikroskop
/Nikon/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - polarizační mikroskopy na ÚSK
NIKON Eclipse E400POL
Jenapol
- další mikroskopy: Meopta 565, aj.
Amplival
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu - stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okulár
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu - stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okuláry
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení Dolní osvětlení - (diaskopické) - procházející světlo - průhledné preparáty, výbrusy
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení Horní osvětlení - (episkopické) - odražené světlo - neprůhledné preparáty, nábrusy, reliéf
- polopropustné zrcadlo - objektiv je zároveň kondenzorem
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení Boční osvětlení - episkopické - odražené světlo - zvýraznění morfologie povrchu
- lampa - (pro stereomikroskopy) - vláknová optika - přenos světla svazkem vláken ale i kapalinou flexibilní osvětlení, vysoká intenzita
- LED kroužky na objektivy pokrytí 360° /Olympus/
/Edmund Optics/
/Olympus/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - zdroje světla Žárovky - s wolframovým vláknem - halogenové - přibližuje se bodovému zdroji světla
- nízké stejnosměrné napětí (~ 20 V), velký proud, výkon kolem 100 W -
jednoduchá regulace intenzity potenciometrem spojité barevné spektrum barva světla se mění s teplotou vlákna limitovaná životnost vlákna (1000 h)
/microscopy primer/
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - zdroje světla LED diody - bodový zdroj intenzivního bílého světla
- nízké stejnosměrné napětí
/Edmund Optics/
- zanedbatelné teplo - regulace intenzity - vysoká životnost (10000 h) - sestavení plošných zdrojů - více principů vzniku 1) RGB míchání 2) fosforescence →
/wiki/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - zdroje světla Výbojky - rtuťová, xenonová - pro luminiscenční mikroskopy
- UV oblast, ale i blízké IČ - monochromatické světlo (s filtry) - nízká životnost (200 h)
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení Kolektorová čočka - spojka, z bodového zdroje vytváří rovnoběžné paprsky světla
Polní (světelná) clona - zužuje svazek světla, eliminace odlesků - neslouží k regulaci intenzity světla - obraz se ostře promítá do roviny předmětu - okraj clony by se měl krýt s okrajem zorného pole Filtry - matový filtr - rozptyluje světlo - lepší homogenita - neutrální filtr - snižuje intenzitu světla, spektrum nemění - absorpční filtry - korekce barevného spektra např. modrý filtr pro žluté světlo žárovky → bílé světlo
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení - interferenční filtry - tenká vrstva, propustí úzký interval spektra Polarizátor - polarizační filtr
- extrémně pleochroické látky, orientované polymerní molekuly - poměrně nízká propustnost, cca 38% - výklopný, otočný - většinou předozadní rovina kmitu Aperturní clona - reguluje vstupní průměr kondenzoru (vrcholový úhel kužele paprsků vystupujících z kondenzoru)
- otevřená - vysoká rozlišovací schopnost, malý kontrast, malá hloubka o. - zavřená - ohybové jevy na rozhraních, vysoký kontrast - neslouží k regulaci osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení Kondenzor - soustřeďuje světelné paprsky do preparátu
- numerická apertura (NA = 𝑛 sin 𝜃 ) větší či stejná jako u objektivu - vlákno osvětlení se má ostře zobrazovat v rovině aperturní clony
- kondenzory pro fázový kontrast a temné pole
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - osvětlení Köhlerův princip osvětlení - nejčastější způsob osvětlení
- roviny, kde dochází k ostrému zobrazení předmětu a vlákna - roviny zobrazení vlákna lze pozorovat po vyjmutí okuláru nebo zasunutím Bertrandovy čočky
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - stolek, stativ Otočný stolek - dělení na 360°, nonium 0,1°,
- aretace šroubem, někdy centrovatelný - křížový vodič se stupnicí - přítlačné pružiny - motorizovaný z-posuv, automatické ostření Zaostřování - šroub na hrubé a jemné ostření, mikrometrická stupnice - zaostřuje se zásadně zdola - tubus se postupně zvedá Držák objektivů - sáňkový, revolverový - 5 objektivů - centrovatelný, centrace se provádí iterativně
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - stolek, stativ Zaostřování - test zručnosti - měření tloušťky vzorku, indexu lomu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - objektivy Objektivy - nejdůležitější součást mikroskopu - určuje kvalitu obrazu - rozdělení suché × imerzní (I) - konstrukce → charakteristiky: - výrobce - Nikon, Olympus, aj. - korekce objektivu - Plan, Apo, aj. - zvětšení 𝑍0 (4x – 100x) tj. ohnisk. vzdálenost (1,5 – > 20 mm) - numerická apertura - NA = 𝑛 ⋅ sin 𝛼, 𝛼 je polovina /microscopy primer/ vstupního úhlu - délka tubusu v mm, ∝ pro nekonečnou optiku - tloušťka krycího skla, 0 pro preparáty bez skla - polarizační objektiv - (Pol, P) - menší počet čoček, nesmí být napětí ovlivňuje dvojlom
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - objektivy - rozlišení objektivu: 𝑑 =
𝜆 , NA
𝜆 je vlnová délka světla
Korigované optické vady: - Aplanát – korigovaná sférická vada a koma - Anastigmát – korigován astigmatismus - Ortoskopický objektiv – korigováno zkreslení
- Achromát – sférická vada a longitudinální chromatická vada pro 2λ (žlutá a zelená oblast) - Planachromát – navíc zklenutí zorného pole (vhodný pro mikrofotografii) - Apochromát – longitudinální chromatická vada pro 3λ - Planapochromát – má navíc odstraněno zklenutí
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - objektivy Imerzní objektivy: - zvýšení numerické apertury (>1)
- eliminace totálního odrazu, vyšší rozlišení - více detailů - imerze - vysoký index lomu - bromnaftalen (1,658), methylenjodid (1,740)
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - okulár Okulár - zvětšuje obraz vytvořený objektivem včetně vad
- zvětšení 10x - 20x - nejčastěji Huygensův okulár (dvě spojky, obr. rovina mezi) - kompenzační okuláry - vyrovnávají vady objektivů - nitkový kříž, příp. stupnice - kamerový adaptér C-mount
/microscopy primer/
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Technické vybavení - kompenzátory - slídová destička - původně planparalelní lupínek muskovitu, kolmý k ostré středné, nyní křemen, fázové zpoždění je 1/4𝜆 (~150 nm) - sádrovcová destička - nyní křemen, fázové zpoždění je 1𝜆, červenofialová barva I. řádu (~560 nm) - křemenný klín - klín vybroušený z křišťálu rovnoběžně s optickou osou plynulá změna fázového zpoždění, I. - III. řád - Berekův kompenzátor - destička kalcitu, řez kolmo k ose c, nulový dvojlom, otáčením dojde ke změně fázového zpoždění, 4 řády - Sénarmontův kompenzátor - polarizátor s 1/4𝜆 destičkou otočenou o 45° - Bertrandova čočka - spojná čočka - umožňuje pozorování: konoskopické obrázky, vlákno osvětlení, zadní ohnisková rovina objektivu, aperturní clona - Analyzátor - otočný polarizátor se stupnicí
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Údržba mikroskopu Prevence - chránit před kontaminací prachem, otisky prstů, zbytky vzorků
- chránit před mechanickým (hrubé zacházení), chemickým (leptání) a tepelným poškozením (degradace filtrů) Údržba - servis, mazání a čištění mechanických dílů - čištění optických dílů
Literatura: M. Zölffel, The clean microscope, Zeiss.
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Údržba mikroskopu čistý mikroskop (vlevo), špína v místě polní clony (vpravo nahoře), prach na čipu kamery (vpravo dole)
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Údržba mikroskopu 1. roztok detergentu, 2. líh, ether, n-hexan, aj. (pozor na leptání tmelů!) 2. špejle 3. balónek 4. vata, mikrovlákna
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Údržba mikroskopu příprava vatových tamponů
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Údržba mikroskopu správné čištění čoček
