Ontwikkeling van een neutraal rood retentie test en de cometassay in Daphnia magna: biomarkers van fysieke conditie en genetische schade T X

Ontwikkeling van een neutraal rood retentie test en de cometassay in Daphnia magna: biomarkers van fysieke conditie en genetische schade

T

X Auteur: Kees Tuk Werkdocument nr: 99 . 165 X Datum: juli 1999

Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling

Ontwikkeling van een neutraal rood retentie test en de cometassay in Daphnia magna: biomarkers van fysieke conditie en genetische schade

Auteur: Kees Tuk Werkdocument nr: 99 . 165 X Datum: juli 1999

Samenvatting Biomarkers zijn biologische parameters die informatie verschaffen over de blootstelling van organismen en/of over de mate van verandering van levensfuncties van deze organismen. Biomarkers zijn vaak moleculair of cellulair van aard cn effecten op dit niveau treden vaak op voordat organismen zichtbaar minder functioneren. Biomarkcrbcpalingen zijn dan ook meestal gevoeliger dan bijvoorbeeld sterfte. Daarnaast zijn ze over het algemeen goedkoper en sncller dan dc traditionele bioassays. Het toenemend gebruik van biomarkers in ecotoxicologische risicobeoordeling geeft aan dat er een extra waarde kan worden toegekend aan deze markers. Aangezien er nog erg weinig gebruik is gemaakt van biomarkers in zoetwater invcrtebralcn werd besloten om een tweetal biomaikcrtcstcn te ontwikkelen voor gebruik in Daphnia magna, de Neutraal Rood Retentie test (NRR test) waarmee de lysosomale membraanstabilitcit kan worden bepaald als maat voor de fysieke conditie van het dier en de cometassay als bepaling van de genetische schade in de vorm van DNA strengbrcuken. Nadat de twee bepalingen zijn ontwikkeld voor gebruik in Daphnia's werden experimenten uitgevoerd waarbij Daphnia's 48 uur werden blootgesteld aan een aantal stoffen (cadmiumchloride, kaliumdichromaat, lindaan cn pcntachloorfenol) waarna de NRR-test werd uitgevoerd. Dit leverde voor de twee metaalzouten een significante verlaging van de neutraalrood retentie op bij een concentratie die ± 3 x lager ligt als de LC-50 voor deze stoffen. Dc andere stoffen geven effect op of rond de LC-50 waarde. De cometassay, uitgevoerd op cellen uit de Daphnia die in vitro zijn blootgesteld aan waterstofperoxide en Ethyl methaan sulfonaat (EMS) leverde een LOEC^.j op van 340 ug/l voor H 2 0 2 en van 5.7 mg/l voor EMS. Bij de cometassay, uitgevoerd op cellen van de Daphnia, blootgesteld in vivo aan waterstofperoxide, EMS, 4-nitro-quinoline-l-oxide (4-NQO), en lindaan werden LOEC^^ waarden gevonden van respectievelijk 5.6 mg/l, 56 mg/l, 100 pg/l en >1.8 mg/l. Bij experimenten om het verband tussen de twee testen en effecten op populaticnivcau aan te geven waarbij Daphnia's chronisch werden blootgesteld aan kaliumdichromaat, lindaan en 4-NQO werd gevonden dat de LOBC,^ van de cometassay, uitgevoerd op jongen van deze dieren rond de LOEC voor de intrinsieke populatiegroei ( L O E C R J ligt. 4-NQO, als modelstof voor genotoxiciteit blijkt bij acute blootstelling (48 uur) significant effect te geven bij een concentratie die bij chronische blootstelling significant effect geeft op de voortplanting. De twee genotoxische stoffen in het onderzoek: EMS en 4-NQO geven bij acute blootstelling significant effect in de cometassay bij concentraties waarbij nog geen zichtbare toxische effecten te zien zijn (sterfte, bcweeglijkheid). Mogelijk zou een acute Daphniatest, gevolgd door een cometassay voorspellcnd kunnen zijn voor effecten op de populatiegroei door genotoxiciteit. De cometassay is ook gebruikt bij de beoordeling van genotoxiciteit van concentraten van oppcrvlaktewaters van verschillende locaties langs Rijn, Maas en in Rijnland (bij Noordwijkeihout). Uit de resultaten bleek dat de concentraten van Rijn en Maaswater genotoxische stoffen bevattcn die al bij vrij lage concentratiefactoren (7.8 x geconcentreerd) kunnen worden aangetoond, terwijl acute toxiciteit met deze concentraten optrad bij ± 36 x geconcentreerd (LC-50). Het concentraat uit het Rijnland was wel toxisch (LC-50 = 44 x geconcentreerd) maar bevatte geen aantoonbare genotoxiciteit. Samenv attend kan worden gezegd, dat de twee opgezette biomarkcr testen bruikbarc informatie kunnen geven over de toxicologische processen van stoffen in Daphnia magna, en dat met name de cometassay een goed bruikbare, snelle test is voor de bepaling van genotoxiciteit in een zoetwater organisme als Daphnia magna, en daardoor informatie kan geven over genotoxische effecten op invertebraten in het aquatisch milieu. Dit in tegenstelling tot veelgebruikte testen als de Ames-test en dc Umu-C test, die mutageniteit in micro-organismen aantonen.

Opbouw van het rapport Dit rapport behandelt de ontwikkeling en de toepassing van een tweetal biomarkcrbepalingen in Daphnia magna, de ncutraalrood retentietest, een methode om de stabiliteit van lysosomcn te bepalen en hiermee de algemene conditie van het dier te schatten, en de cometassay, een test die de aanwezigheid van DNA streng breuken aantoont. In de inleiding in hoofdstuk 1 wordt de ratio van de keuze voor deze twee biomarkers uitgelegd. In hoofdstuk 2 worden de principes waarop de twee testen berusten beschreven. Hoofdstuk 3 beschrijft de methodiek van de testen en de methoden van calibratie en vergelijking van deze bepalingen met ccn bekende biologische parameter als populatiegroei. In hoofdstuk 4 worden de resultaten besproken van de toepassing op enkele referentiestoffen en oppervlaktewaterconcentraten. Ook worden de resultaten van de ecologische calibratie hier beschreven. Hoofdstuk 5 bespreekt verder de uitkomsten van de testen en gaat in op de bruikbaarheid van de testen het hier gekozen testorganisme. Daphnia magna cn op de bruikbaarheid bij ecotoxicologische risicoschatting. In hoofdstuk 6 worden naast de conclusies naar aanleiding van de resultaten nog wat aanbevelingen voor toekomstig onderzoek gedaan. Hoofdstuk 7 bevat de literatuurverwijzingen en hoofdstuk 8 de bijlagen.

Inhoud 1

Inleiding

6

2

Principes van de testen 2.1 Neutraal rood retentietcst (NRR test) 2.2 Cometassay

8 8 9

3

Materiaal en methoden 3.1 Cultuur van Daphnia magna 3.2 Teststoffcn en oplossingen 3.3 Neutraal rood retcntietest 3.4 Cometassay 3.4.1 Blootstelling 3.4.1.a Blootstelling in vivo 3.4. l b Blootstelling in vitro 3.4.1c Langdurige blootstelling in vivo 3.4.2 Isolatie van cellen uit Daphnia's 3.3.2 Uitvoering van de cometassay 3.4 Vergelijking van de biomarkers met effecten op de populatiegroei tijdens chronische blootstelling; een poging tot ecologische calibratie 3.5 Gebruik van de cometassay met oppervlaktewaterconcentraten

11 11 11 12 13 13 13 13 13 13 14

Resultaten 4.1 Neutraal rood retentietest 4.2 Cometassay 4.2.1 Acute in vitro blootstelling 4.2.2 Acute in vivo blootstelling 4.3 Vergelijking van de NRR test en cometassay met effecten op de populatiegroei tijdens chronische blootstelling 4.4 Gebruik van de cometassay bij de beoordeling van oppervlaktewaterconcentraten

16 16 17 17 21 24 27

5

Discussie

29

6

Conclusies en aanbevelingen

34

7

Literatuur

35

8

Bijlagen 8.1 Samenstelling van Daphniabuffer met BSA (DBSA) 8.2Samenstelling van de lysisbuffer voor de cometassay 8.3Samenstelling van de electroforescbuffer voer de cometassay 8.4 Lotka's formule voor de berekening van de intrinsieke populatiegroei

37 37

4

14 15

38 39 40

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna

1

Inleiding

Biomarkers kunnen worden gedefinieerd als (veelal moleculaire) indicatoren voor veranderingen in biologische processen of systemen in organismen die worden veroorzaakt door blootstelling aan chemische, biologische of fysische agent ia. Ze kunnen betrekking hebben op effecten die worden veroorzaakt, ze kunnen een indicator zijn voor de mate van blootstelling of voor de gevoeligheid van een soort of individu voor de agentia waaraan het is blootgesteld. Een goede biomarker verschaft oorzakelijk inzicht en signaleert een effect dat specifiek is voor een bepaald agens of toont waarom de ene soort wel kwetsbaar is voor een stof en de andere niet. De groeiende behoefte aan inzicht in stof-respons relaties heeft een toenemend gebruik van biomarkers in ecotoxicologisch onderzoek tot gevolg gehad. Biomarkcrbepalingen zijn over het algemeen gevoeliger en sneller dan bioassays, en dientcngevolgc ook goedkoper. Echter, doordat de biomarkerbepalingen vaak op cellulair of moleculair biologisch vlak zitten, is de correlatie tussen effecten, waargenomen in de bepalingen en voorspellingen over effecten op populatieniveau moeilijker te leggen. Veel biomarkers kunnen in verschillende soorten organismen worden bepaald. Verschillen in gevoeligheid tussen soorten kan informatie verschaffen over de mate van aantasting van een ecosysteem. Als de biomarker alleen in gevoelige soorten kan worden aangetoond zal het ecosysteem minder onder druk staan dan wanneer ook ongevoelige soorten reageren. Van veel biomarkers is de gevoeligheid in diverse soorten echter nog onbekend. Vooral in evcrtebraten is nog niet veel kennis op dit gebied. In oppervlaktewater kunnen we met de huidige acute bioassays (bacterien, algen, Crustacea, vis) pas toxische effecten meten in geconccntreerde monsters. Dit is aan de ene kant prcttig. Toxiciteit in oppervlaktewateren is de laatste tijd tot onder een acuut niveau teruggedrongen. Maar om met kortdurende experimenten onderzoek te doen naar de nog aanwezige toxiciteit moeten we dus extractcn maken van het oppervlaktewater om effecten te zien. Deze effecten willen we graag vertalen naar chronische effecten in onverdund water. Het gebruik van biomarkers kan deze vertaling, mede door de vaak grotere gevoeligheid van de bepalingen helpen onderbouwen. Criteria die op de afdeling WSCE van belang worden geacht voor een bruikbare biomarker bepaling als uitbreiding van het pakket toxiciteitstoetsen zoals deze nu worden uitgevoerd: - De biomarker moet te implementeren zijn in een bioassay, bij voorkeur een reeds op ecotoxicologie lopende assay. De biomarker is dan bijvoorbeeld een eindpunt van een bioassay, waarbij een organisme wordt blootgesteld aan een milieumonster. Indien mogelijk moet de biomarkerbepaling ook kunnen worden uitgevoerd in organismen die in het veld worden verzameld. Tevens is, door de gelijktijdig meelopende bioassay een goed beeld te verkrijgen van de gevoeligheid van de biomarkerbepaling. - De biomarker moet bruikbaar zijn in evertebraten. De wet en regelgeving op het gebied van het gebruik van gewervelde dieren voor toxicologische testen wordt steeds stronger. Dit zal het gebruik van deze dieren in testen die ongerief veroorzaken steeds moeilijker maken - We willen onderzoek doen naar dc relatie tussen de respons op (sub)-cellulair niveau en de 'fitness' van het dier. Vooral met betrekking tot voortplanting en populatiegroei parameters. Het moet dus mogelijk zijn om de uitkomsten van biomarker bepalingen in individuen te relateren aan bijvoorbeeld voortplantingssucces in een chronische test. Het combineren van deze criteria heeft tot gevolg gehad dat er gekozen is voor het opzetten van biomarkerbepalingen in Daphnia magna die dc fysieke conditie van het dier op cellulair niveau aangeven cn een genetische schade test die in hetzelfde organisme toepasbaar is. Het is bekend dat pathologische effecten die het gevolg zijn van toxische stoffen een aantal processen op intracellulair niveau tot gevolg hebben. Een van deze effecten is het gedeeltelijke verlies van de

6

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test cn de cometassay in Daphnia magna membraanstabiliteit. Wat er precies gebeurt is niet helemaal bekend. Of er nu echt gaten en onderbrekingen in de membranen komen of dat er een aantal pompen slechtergaan werken of iets anders: het effect is duidelijk aantoonbaar. De membranen van de cel (interne en externe membranen) worden meer permeabcl. Voor het aantonen van de verhoogde instabiliteit van een van de membranen in de cel is een test beschikbaar die gebruik maakt van de kleurbaarheid van de lysosomen door een kleurstof: neutraal rood. Het principe van deze test wordt in het hoofdstuk: Principes van de testen nader uitgelegd. Aangezien eerdere publicaties over lysosomale stabiliteit in cellen van mariene invertebraten (Lowe 1994, 1995, Moore 1997) aangaven dat een dergelijke assay voor invertebraten mogelijk was werd gekozen voor het opzetten van een neutraalrood retentietest in Daphnia's. Voor het aantonen van genetische schade zijn een aantal testen ontwikkeld. Vooral op het gebied van mutageniteit is een hele batterij voorhanden (bijvoorbeeld de Ames-test met al zijn variaties en de mutachromoplate test). Echter, deze testen tonen slechts een deel van de mogelijk optredende genetische schade aan: het optreden van mutaties. Andere testen maken gebruik van de optredende reparaticmechanismen in de cel bij genetische schade (voorbeelden: mutatox. Umu-c test). Verder bestaan er testen die het optreden van chromosoomafwijkingen aantonen (micronucleus, sister chromatid exchange test). Een test die in Daphnia's uitvoerbaar is en die een mate van totale DNA-schade aangeeft is wenselijk. Aangezien uit verschillende publicaties bekend is dat de meeste optredende DNA-schade gevallen, waaronder mutaties en adductvoiming weer worden gerepareerd (Eastman 1992, Fairbairn 1995), maar dat bij die reparaties regelmatig DNA-strengbreuken optreden en dat DNA-strengbreuken ook direct kunnen optreden bij radicaalvorming, werd besloten een test op te zetten die DNAstrengbreuken aantoont. De meest gebruikte assays hiervoor zijn de z.g.n. alkaline unwinding assay (Shugart 1996) en assays die gebruik maken van de verhoogde electroforetische mobiliteit van DNA fragmenten, op cellulair en 'macro'niveau (Theodorakisl994, De Coen 1999). Aangezien uit Daphnia's slechts weinig cellen kunnen worden gehaald werd gekozen voor de cellulaire variant van deze test, de 'cometassay' of single cell gel electroforese test (SCGE test). Ook deze test wordt beschreven in het hoofdstuk Principes van de testen.


2

Principes van de testen

2.1 Neutraalrood retentietest (NRR test) Iedere eukariotische cel (zie figuur 1) bevat een aantal blaasjessystemen. Deze systemen zorgen voor het transport van bijvoorbeeld in het ruw endoplasmatisch reticulum geproduceerde ciwitten naar het celmembraan. Een ander blaasjessysteem zorgt voorde 'routing' van opgenomen deeltjes en stoffen (gefagocyteerd en geendocyteerd) naar de organellen die de spijsvertering van dc cel verzorgen: de lysosomen. Hier versmelten de zgn. fagosomcn met de lysosomen tot ccn fagolysosoom. De lysosomen zijn toegcrust met een aantal eiwit-, vet-, en koolhydraatsplitsende cnzymen om de opgenomen deeltjes te kunnen verteren. In de lysosomen heerst een vrij lage pH: ± 5. Dit is het pH optimum van de spijsverteringsenzymen. In het cytosol van de cel heerst een pH van ongeveer 7. Dit betekent dat de concentratie H* ionen in de lysosomen 100 x zo hoog is als in het cytosol. Deze concentratie wordt op peil gehouden door zgn. protonenpompen, die constant H+ ionen door het membraan van het lysosoom pompen. Figuur 1. Schematische overzichtstekening van de cel

Milochondrie Peroxysoom Golgi-apparaat Kern Nucleolus Cytoskelel Ruw endoplasmatuch reticulum

Secreiie-granula

Glad endoplasmaluch reticulum

Ribosomcn

Golgi-apparaai

Neutraal rood is een zwakke base en neutraal geladen en vertoont een verschijnsel dat lysosomotropic wordt genoemd. De stof kan in opgeloste vorm vrij diffunderen in ccn cel en zijn organellen. Echter, in het zure milieu van een lysosoom aangekomen, zal neutraal rood een proton opnemen. Hierdoor wordt de stof positief geladen en kan nog maar langzaam het membraan passeren met als gevolg dat dc stof accumuleert in de lysosomen. De lager wordende concentratie H" ionen in de lysosomen wordt weer aangevuld door de protonenpompen (figuur 2). De constante instroom van neutraal rood kan echter niet eeuwig blijven doorgaan. Op een gegeven moment wordt de concentratie van de stof in de lysosomen zo hoog dat deze toxische effecten

8

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en dc cometassay in Daphnia magna veroorzaakt. Het milieu in de organellen kan niet meer worden gehandhaafd en de membranen van dc lysosomen raken lek. Het neutraalrood zal dan versneld uit de lysosomen lekken en het cytosol rood kleuren. In een gezondc cel met goed gesloten membranen cn goed wcrkende protonenpompen zal het vrij lang duren voordat er lek van neutraal rood uit de lysosomen optreedt. Een eel die in ccn slechtere conditie is door vergiftiging met een stof bijvoorbeeld of doordat de homeostase van het organisme waar de cel in leeft al een tijd onder druk staat door een toxisch effect zal een kortere retentie van neutraal rood vertonen. Het neutraal rood zal hier dus sneller uit dc lysosomen lekken. Pcrmeatie van de membranen van de cel (niet alleen van het celmembraan) en remming van de protonenpompen zijn voorbeelden van toxische effecten die een verlaagde rctentietijd van neutraal rood tot gevolg hebben. Iedere eukariotische cel beschikt over lysosomen. Dus ook iedere cel van de Daphnia. Echter als we alle cellen van de Daphnia kleuren met neutraal rood blijkt dat er maar een paar ecltypen redelijk tot goed gekleurd worden door neutraal rood: het darmepitheel en wat cellen die zich los in de lichaamsholten van het dier bevinden (waarschijnlijk een soort hemolymfe cellen). De losmazige cellen zijn vrij moeilijk in voldoende mate uit Daphnia's te isoleren. Aangezien de darm vrij makkelijk uit Daphnia's is te prepareren en het darmepitheel erg veel goed aankleurbare lysosomen bevat, wordt de NRR test uitgevoerd op preparaten van de darmen. Figuur 2. Lysosomotropic van een zwakke base als neutraal rood, hier aangegeven als 11:

H,0

Lysosomotropie van zwakke basen door middel van een protonenval De mei-geprotoneerde. normaal tot permealie in slaal zi|nde vorm B wordt in het lysosoom gevangen als BH *. de geprotoneerde vorm die nie! kan permeeren Door osmose wordt waler aangetrokken. De voor dil proces benodigde energie wordl geleverd door een door ATP aangedreven protonenpomp die de protonen naar binnen stuwt.

2.2 Cometassay Het DNA van organismen staat constant bloot aan invloeden die de intcgriteit van het molecuul kunnen beschadigen. Deze invloeden zijn, naast intracellulair (aflees cn replicatiefoutjes) ook van buitenaf afkomstig. Ioniserende strafing en stoffen die interactie vertonen met het DNA molecuul kunnen een, al dan niet blijvende, verandering teweegbrengen. De stoffen die interactie met DNA vertonen hebben hier onze grootste interesse. Schade aan het DNA molecuul kan door een aantal toxicologische processen worden veroorzaakt: - Metabolieten van PAK's (bijvoorbeeld benzo|a|pyreen die door het MFO systeem (Mixed Function Oxidase enzymen) worden gegenereerd kunnen zich direct aan het DNA binden (adductvorming). Dit kan mutageen of carcinogeen werken. - Sommige zware metalen (bijv. Cr6*) kunnen zich direct aan het DNA binden. Ook dit kan tot mutaties leiden. - Verschillende organische stoffen (PAK's. PCB's, bipyridylen. aromatische hydroxylamines, nitroaromatische stoffen, aromatische di-olenen en quinones) veroorzaken bij hun mctabolisering

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna zuurstofradicalen. Tijdens hun verwerking in de cel door NADPH afhankelijke reductases worden superoxide anionen gevormd (0 : .) die waterstofperoxide (H : 0 2 ) doen ontstaan. Watersofperoxide op zijn beurt kan weer aanleiding geven tot het ontstaan van hydroxylradicalen (OH«). AI deze zuurstofradicalen hebben de neiging om te reageren met eiwitten, lipiden en DNA in de cel. Dit verschijnsel wordt oxidatieve stress genoemd. In het DNA molecule zijn vooral de suikers en de basen het doelwit van de radicalen: Er kan crosslinking ontstaan door reactie van een radicaal met suikers en OH» kan worden geaddeerd aan de basen. De cel beschikt over een uitgebreid systeem van reparaticmechanismen waarmee optredende schades weer worden venvijderd. Tijdens het 'wegknippen' van schade uit het DNA-molecule ontstaat er tijdelijk een breuk. Deze brcuk wordt gedicht door DNA-Iigase. Echter, dit enzym is niet perfect. Regelmatig levert een reparatie in het DNA-molecule dan ook een breuk van de streng op. Deze breuken zijn wel weer te repareren door andere reparatiesystemen in de cel. Maar: hoe meer breuken er gelijktijdig optreden hoe groter de kans dat het DNA molecuul echt breekt, een dubbelstrengsbreuk dus. Dubbelstrcngsbreuken zijn vrijwel niet meer te repareren en zijn vaak aanleiding tot verminderd functioneren van de cel of celdood. Het meten van de hoeveelheid DNA-strengbreuken is dus een maat voor de hoeveelheid DNA-schade die er op dat moment optreedt. Er zijn een aantal testen ontwikkeld die de hoeveelheid DNA-streng breuken meten. Er bestaat een zgn. DNA unwinding assay (Shugart 1996), die erop gebaseerd is dat DNA dat op enkele plaatsten een breuk vertoont zich sneller 'ontwikkelt' in basisch milieu dan intact DNA. Het DNA heeft meer startpunten om los te wikkelen en zal dan ook na een bepaalde incubatietijd bij hoge pH voor een groter deel uit enkelstrengs DNA bestaan. Het nog overgebleven dubbelstrengs DNA wordt dan gekleurd met een fluorcscerende stof en gekwantificeerd. Een andere veel gebruikte test maakt berust op de eigenschap dat DNA-fragmenten in een clektrisch veld zich sneller bewegen in de richting van de anode dan het complete DNA. Het grote DNA molecuul wordt, zeker als het in een agaroscgel wordt gebracht geremd in zijn beweging. Er bestaan twee testen die gebruik maken van dit principe: Bij een test (Theodorakis 1994) wordt het DNA uit een blootgesteld organisme ge'isoleerd en vervolgens bij hoge pH geelectroforeerd in een agarosegel die is ondergedompeld in een buffer (submarine DNA electroforese). Na de electroforese wordt het DNA in de gel gekleurd cn gefotografecrd. Aan dc hand van het migratiepatroon van het DNA kan dan iets gezegd worden over de hoeveelheid strengbreuken. Bij de andere test worden de cellen van het blootgesteldc organisme in dc agarosegel gebracht, waarna de cellen gelyseerd worden en het DNA, na ontwikkeling in enkelstrengs DNA door incubatie bij hoge pH wordt geelectroforeerd in een submarine electroforese. Hierna wordt het DNA in de agarose gekleurd met een fluorescerende stof en het migratiepatroon wordt bekeken met een fluorescentiemicroscoop. DNA fragmenten zullen, afhankelijk van hun grootte, een bepaalde afstand uit de celkemen zijn gemigreerd en de preparaten van deze komen zien er dan uit als een soort kometen. De test is hier ook naar vemoemd: de cometassay. Het grote voordeel van deze assay is dat hij met kleine hoeveelheden cellen kan worden uitgevoerd. Dat is met name bij onderzoek naar DNA schade in Daphnia erg nuttig. Daarnaast is de test erg gevoelig. De hoeveelheid DNA-strengbreuken kan worden aangegeven op een kwalitatieve wijze (wel/geen staart, lang kort) of een kwantitatieve wijze (staartlengtc in um, percentage gemigreerd DNA, tail moment).

10

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test cn dc cometassay in Daphnia magna

3

Materiaal en methoden

3.1 Cultuur van Daphnia magna. De hier beschreven experimenten werden uitgevoerd met Daphnia's uit een cultuur op de afdeling WSCE. In deze cultuur worden 50 Daphnia's per aquarium gehouden in aquaria van 2.5 liter in Elendt M4 medium, dat constant wordt belucht. De temperatuur is 20°C en er wordt een dag/nacht ritme aangehouden van 11 uur/13 uur. De dieren krijgen dagelijks een suspensie van Chlorella pyrenoidosa: ongeveer 2.5* 10 per dier. Drie maal per week worden de dieren overgezet naar schone aquaria. De jongen worden verwijderd en kunnen dan gebruikt worden voor experimenten. Een maal per week wordt vanuit een cultuur met 3 weken oude dieren een cohort jongen afgesplitst voor een nieuwe cultuur. 4 weken oude cultures worden verwijderd. 3.2 Teststoffen en oplossingen Voor de blootstellingen tijdens de experimenten werden de volgende stoffen gebruikt: - Cadmium standaard oplossing van 1.000 gram Cd per liter water als CdCl2. Leverancier Merck. Art nr. 9960. - Kaliumdichromaat. De doseringen van deze stof werden gemaakt vanuit een stockoplossing van 1 g/ml. Levcrancier: Baker. Art. nr. 216. - Lindaan (y-hexachloor cyclohexaan) van Riedel-de-Haen. Art. nr. 45548. De doseringen van deze stof werden gemaakt vanuit een stockoplossing van 1 mg/ml in DMSO (Merck 2931). - Pentachloorfenol van Fluka. Art. nr. 76470. De doseringen van deze stof werden gemaakt vanuit een stockoplossing van 1 mg/ml in DMSO. - Waterstofperoxide (H202), 30%ige oplossing van Baker. Art nr. 7047. De doseringen van deze stof werden gemaakt vanuit deze 30% oplossing, meestal met een aantal tussenverdunningen in het medium waarin ook werd blootgesteld. - Ethylmethaansulfonaat (EMS) van Sigma. Art. nr. M-0880. Dit is een vloeistof met een soortelijk gewicht van 1.14 g/ml. Voor het maken van dc doseringen werd de vloeistof direct in de juiste hoeveelheid in het medium verdund. - 4-Nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) van Sigma. Art nr. N-8141 De doseringen van deze stof werden gemaakt vanuit een stockoplossing van 1 mg/ml in DMSO. Voor de testen van de oppervlaktewaterconcentraten werd gebruikt gemaakt van concentraten van twee verschillende bronnen. De eerste groep oppervlaktewaterconcentraten zijn waterige concentraten, vervaardigd door J. Struijs van het RIVM. Deze concentraten zijn verkregen door acetonelutie van aan XAD geadsorbeerde organische fractie van een hoeveelheid oppervlaktewater van een aantal locaties. Deze cluaten werden op 2 manieren behandeld: door een Kudema Danish destillatie en door Supercritical Fluid extraction met C0 2 werden waterige concentraten verkregen. De andere oppervlaktewaterconcentraten zijn afkomstig van een onderzoek van de RTWA naarde bruikbaarheid van toxkits en mutageniteitstesten bij de beoordeling van oppervlaktewaterconcentraten en zijn vervaardigd van watermonsters van Eijsden en Lobith volgens de 'KIWA'methodc. Met deze methode worden per watermonster twee ethanoleluaten van de aan XAD geadsorbeerde organische fractie verkregen: een pH 2 en een pH 7 fractie. Er werd bij een experiment gebruik gemaakt van monsters, verkregen tijdens een TIE-experiment van S. Rotteveel. Hierbij werd poriewater van sediment van de Pctroleumhaven over een C-l 8 kolom geleid. De aan het kolom materiaal gebonden fractie werd geelueerd met methanol. De kolomdoorloop, het eluaat en het oorspronkelijke poriewater werden getest met de cometassay.

11

Ontwikkeling van dc neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna

3.3 Neutraal rood retentie test (NRR test) Voor de acute blootstelling aan de teststoffen werden dieren gebruikt die minimaal een week oud zijn. De darmen van jonge dieren zijn moeilijk te beoordelen. De epitheelcellen van Daphnia's zijn holocrien, d.w.z. dat ze de producten die ze uitscheiden (spijsverteringsenzymen) niet exocyteren maar dat het celmembraan aan de darmholte zijde openbreekt waarna de celinhoud met de producten vrijkomt (Schultz 1976). Dit schijnt bij jonge dieren zo vaak te gebeuren dat de hele darm microscopisch er rommelig uitzict en moeilijk is te beoordelen of de lysosomen in de cellen aangekleurd zijn of ook het cytoplasma. Nadat de dieren de eerste keer jongen hebben gehad is de opbouw van het epitheel regelmatiger cn beter te beoordelen. Bij de acute blootstelling werden de dieren 48 uur blootgesteld aan dc teststoffen in Elendt M4. Tijdens deze blootstelling werden dc dieren niet gevoerd. Bij de lange termijn blootstelling (tijdens de chronische testen) werden de dieren vanaf de start van de test blootgesteld totdat de NRR test werd uitgevoerd, na 13-16 dagen. De laatste 2 dagen werden de dieren dan niet gevoerd. Nadc blootstelling werden de overlevende dieren gespoeld in DBSA (voor recept: zie bijlage 1) en overgebracht naar een objectglaasje. Vervolgens werden de dieren onder een prepareermicroscoop gedood door decapitatie waarna de darmen werden uitgeprepareerd. De darmen werden overgebracht naar objectglaasjes met 30 p.1 DBSA, een darm per glaasjc.Vervolgens werden ze voorzichtig met twee prepareernaalden uit elkaar getrokken in 5 - 8 stukken. Hierna werd 30 ul van een oplossing met 200 ug/ml neutraal rood (Sigma N-6634) en 0.5 mg/ml trypsin inhibitor (Sigma T-6522) in DBSA per glaasje toegevoegd en gemengd. Het moment van toevoegen van de neutraal rood oplossing werd geregistreerd en aangehouden als T0. De glaasjcs werden afgedekt met 21x26 mm dekglaasjes en in een incubaticbak in een vochtige atmosfeer bij kamertemperatuur gehouden. Iedere 15 minuten werden de darmfragmenten bekeken. Op het moment dat in meer dan 80% van de cellen neutraal rood uit de lysosomen in het cytosol lekte (duidelijk zichtbaar doordat het cytoplasma van de cellen dan paarsrood aankleurt) werd de tijd geregistreerd. De tijd tussen T0 en dit moment wordt de retentietijd genoemd. Per preparaat werden 3 darmfragmenten bekeken. De gemiddelde retentietijden per preparaat en per concentratie werden vergeleken en op significante verschillen getoetst met de William's test. (Williams 1971).

12

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en dc cometassay in Daphnia magna

3.4

Cometassay

3.4.1 Blootstelling: 3.4.1 .a Acute blootstelling in vivo: Hiervoor werden dieren gebruikt, jonger dan 24 uur. Van het monster (bijvoorbeeld oppervlaktewater concentraat, of een oplossing van een stof) werd een concentratiereeks gemaakt in Elendt M4. Per concentratie werd. in triplo. 10 ml in buizen gepipetteerd. Aan de buizen werden per buis 6 jonge Daphnia's toegevoegd in een zo klein mogelijk volume. Duur van de blootstelling: 48 uur in Elendt M4. De dieren werden tijdens de blootstelling niet gevoerd. 3.4.1 .b Acute blootstelling in vitro: Voor de cellen die werden blootgesteld werden dieren gebruikt van 10-20 dagen oud. Dc dieren werden de laatste 48 uur niet gevoerd. Na de isolatie van de cellen en het inbedden in agarose (zie hieronder: uitvoering van de cometassay) werden de glaasjes in een incubatiebak gelegd en de agarose werd bedekt met 200 p.1 oplossing van de teststof in de gewenste concentratie. De cellen werden gedurende 2 uur bij 4°C in het donker blootgesteld. 3.4.1 .c Langdurige blootstelling (in vivo): Tijdens de uitvoering van een chronische test (zie hieronder: chronische toxiciteitstest) werden de dieren vanaf het begin van dc test blootgesteld aan de teststoffen in verschillende concentraties in Elendt M4. De jongen, waarmee de cometassay werd uitgevoerd, van de lc, 2°, 3C of 4' worp werden na de geboorte apart gezet in glazen potten van 250 ml (20 stuks, willekeurig genomen uit de geboren jongen van de blootgestelde ouderdieren) met 200 ml oplossing van de teststof in de gewenste concentratie. De jongen werden nog 2 dagen blootgesteld en gedurende deze tijd niet gevoerd.

3.4.2 Isolatie van cellen uit Daphnia's: Aangezien voor de cometassay een celsuspensie noodzakelijk is werden uit volwassen Daphnia's voor in vitro blootstellingen en uit jonge Daphnia's bij in vivo blootstellingen op de volgende wijze cellen gehaald: De dieren werden gedurende twee dagen niet gevoerd. Ze werden gespoeld in DBSA en verzameld op een polyamide gaasje met een maaswijdte van 150 um. Met een plastic 'stampertje' werden de dieren op ijs door het gaasje gewreven en het filtraat met cellen en debris werd onder het gaasje opgevangen in een Eppendorf reactievaatje. Het gaasje werd nog een maal doorgespoeld met koude DBSA. Hierna werd de suspensie gecentrifugeerd (5 min 150*g), het supernatant verwijderd en de pellet werd geresuspendcerd in een juiste hoeveelheid koude DBSA. De concentratie cellen werd bepaald met ccn telkamer en vervolgens werd de concentratie aangepast naar 2* lOVml. Op deze wijze werd uit een volwassen Daphnia ± 2.5*IO4 cellen gehaald en uitjuvenielen ± 1* IO3 cellen. Bij de meeste cometassays na in vivo testen werden dc cellen die uit de jongen werden verkregen niet geteld maar werden de cellen die uit ± 18 dieren opgenomen in 40 ul DBSA.

13

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en dc cometassay in Daphnia magna 3.4.3 Uitvoering van de cometassay: Het gebruikte protocol is een aangepaste versie van die van Devaux et al (1997). Er werden objectglaasjes met matranden gebruikt. Op de matrand van de glaasjes werd 45 ul warme 0.8% agarose (Sigma A-0169) in DB (DBSA zonder BSA) gepipetteerd. De oplossing werd bedekt met 15x15 mm dekglaasjes die licht zijn ingevet met vaseline. De glaasjes werden ongeveer 1 '/2 uur weggezet bij kamertemperatuur. Gedurende die tijd werden de eelsuspensies gemaakt. De dekglaasjes werden verwijderd en op de agarose werd een 40 uI 1:1 mengsel van een Daphnia celsuspensie (wel of niet blootgesteld) en 1% low gelling point agarose (Sigma A-4018) gepipetteerd. De low gelling point agarose werd in een 37°C waterbad op temperatuur gehouden. Hierna werd weer afgedekt met een ingevet dekglaasjc cn de glaasjes werden 10 minuten bij 4°C gezet om de agarose te laten stollen. Dc dekglaasjes werden weer verwijderd en er werd op de agarose 28 IJ.1 0.5% low gelling point agarose gepipetteerd. Er werd weer afgedekt en de glaasjes werden weer 10 minuten bij 4°C weggezet. Hiema werden de dekglaasjes verwijderd. De cellen van nog niet blootgestclde Daphnia's werden vanaf dit punt blootgesteld aan de testoplossingen (zie 3.4. l.b). De objectglaasjes werden gedurende 1 uur bij 4°C in het donker in een vers gemaakte lysisbuffer (zie bijlage 2) geincubeerd. De glaasjes werden voorzichtig 1 x gespoeld met demiwater en overgebracht naar een horizontale electroforesebak (Hoeffer supersub). Hierin werd koude electroforesebuffer (zie bijlage 3) gegoten totdat de glaasjes ongeveer 2 mm ondergedompeld waren. In het donker werd er nog 30 minuten geincubeerd om het DNA in de celkemen te laten ontwikkelen. Hiema werd er gedurende 24 minuten bij 20V en ongeveer 300 mA geelectroforeerd. Tijdens de electroforese werd er niet gekoeld. Na de electroforese werden de glaasjes overgebracht naar een kleurbak waar ze werden bedekt met neutralisatiebuffcr (0.4 M Tris/HCl pH 7.5) gedurende 10 minuten. Vervolgens werden ze 1 x gespoeld in demiwater en weer teruggelegd in de kleurbak, waar er 200 ul ethidiumbromide oplossing (Sigma E-1385 20 ug/ml) per glaasje werd opgebracht. Na 10 minuten kleuren en 5 minuten spoelen in demiwater werden de glaasjes afgedekt en bekeken met een Olympus BH-2 microscoop met epi-illuminatie van een HBO-100 kwiklamp met een excitatiefilter van 515-560 nm en een sperfilter van 590 nm. Van 50 willekeurig gekozen cellen in ieder preparaat werd de lengte van de staart gemeten met een objectief micrometer. De gemiddelde staartlengtes werden met elkaar vergeleken met de KruskallWallis test voor non-parametrische populaties.

3.5 Vergelijking van de biomarkers met effecten op de populatiegroei tijdens chronische blootstelling; een poging tot ecolonische calibratie Teneinde een indruk te krijgen van de gevoeligheid van dc NRR test en de cometassay en hun relatie met een klassieke parameter als intrinsieke populatiegroei (Rm) werden er, tijdens een aantal chronische toxiciteitstesten, uitgevoerd volgens de OECD richtlijn 202, deel II, NRR testen en cometassays uitgevoerd met dieren die met de test 'meeliepen' of uit de test voortkwamen. De uitvoering van de test is als volgt: Per testconcentratie worden 12 jonge Daphnia's van < 24 uur ingezet in potjes met een testvolume van 100 ml, 1 dier per potje. Het medium waar de dieren in worden gehouden is Elendt M4. De potjes worden tijdens de test niet belucht, Dagelijks krijgen de dieren Chlorellapyrenoidosa gevoerd, 5* 107 per potje. De dieren worden dagelijks gecontroleerd op sterfte en geboorte van jongen. Dit wordt nauwkeurig bijgehouden. Hieruit wordt na het afsluiten van de test de intrinsieke populatiegroei, Rm bepaald (Lotka 1913). Drie maal per week worden de dieren overgezet naar potjes met verse verdunningen van de teststof. De eventueel geboren jongen worden geteld en eventueel gebruikt voor de cometassay. Tevens is van een aantal teststoffen per concentratie een steekproef van 10 willekeurig opgepikte jongen van de eerste worp van de testdieren apart gezet in potten van 500 ml met de teststof en dezelfde hoeveelheid voeding per dag om het effect van de stoffen op de 2' generatie te bekijken.

14

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna Na de afsluiting van de test werd per concentratie, uit de sterfte en het aantal geboren jongen per dag. met behulp van Lotka's formule voor de intrinsieke populatiegroei (zie bijlage 4) Rm bepaald. De 10 dieren die ingezet werden aan het begin van de test (12 dieren werden ingezet maar per concentratie werden 2 dieren gebruikt voor de NRR-test) werden voor de berekening in 3 groepen verdeeld zodat per concentratie 3 schattingen van Rm werden verkregen. De gevonden waarden werden met de William's test met elkaar vergeleken zodat de Lowest Observed Effect Concentration (LOEC„J voor deze test kon worden vastgesteld. Tijdens deze testen werden per concentratie 2 dieren die chronisch waren blootgesteld aan de stoffen getest in de NRR-test. De leeftijd van de dieren op het moment van de NRR-test varieerde per experiment, maar was gemiddeld 14 dagen. Er werden ook jongen van de dieren uit de toets getest in de cometassay. Uiteindelijk kan op deze wijze een vergelijking worden gemaakt tussen de gevonden LOEC's van de NRR-test, de cometassay cn dc gevonden LOEC^'s in een en dezelfde uitgevoerde chronische blootstellingstest.

3.6 Gebruik van de cometassay met oppervlaktewater concentraten In een project, genaamd: Extractie, identificatie en karakterisering van onbekende stoffen, waarbij een aantal instituten concentraten van oppervlaktewater van een aantal locaties in bioassays heeft getest en de stoffen in de concentraten werden geanalyseerd (voor zover mogelijk) is door WSC ecotoxicologie geparticipeerd met de uitvoering van toxkits, een Daphniatest en de cometassay. Zie voor een volledige beschrijving van het project: Werkplan, Maas en Hendriks 1998. De bruikbaarheid van de cometassay bij de beoordeling van watermonsters kon op deze manier uitgetest worden. De concentraten werden bereid van oppervlaktewatermonsters van Eijsden, Lobith, Noorwijkerhout (Rijnland), Schaar van Ouden Doel en Maasluis door J. Struijs op het RIVM. Er werden per locatie op twee verschillende wijzen extracten bereid: De aan XAD geadsorbeerde organische fractie werd op 2 manieren geelueerd: met aceton gevolgd door een Kudema Danish destillatie en m.b.v. een supercritical fluid extraction met C02 volgens Struijs et al (1998). Tevens werden. in het kader van een onderzoek van de RTWA naar de bruikbaarheid van toxkits en mutageniteitstesten bij de beoordeling van oppervlaktewaterconcentraten, een aantal concentraten van Rijnwater bij Lobith en Maaswater bij Eijsden getest. (RTWA 1998). De concentraten werden eveneens met XAD vervaardigd uit oppervlaktewater volgens de 'KIWA methode' Hiermee worden per watermonster twee extracten verkregen: een pH2 en een pH7 monster. Het uittesten van de concentraten ging als volgt: - De concentratiefactor (CF) van de concentraten van het onbekende stoffen project was lOOOx in Dutch Standard Water (DSW). De KIWA monsters hebben een concentratiefactor van 25.000x in ethanol - Van de extracten werd een tweevoudige verdunningsrecks gemaakt in Elendt M4. te beginnen bij 250xCF en eindigend bij 7.8xCF, 30 ml per concentratie. De verdunningsreeks van de KIWA extracten begon bij 62.5x. - Met deze verdunningen werden reageerbuizen gevuld met 10 ml, 3 buizen per concentratie. Tevens werden 3 buizen gevuld met 10 ml Elendt M4 (bianco). De bianco bij de testen van de KIWA extracten bevatte nog 25 ^1 ethanol per 10 ml Elendt M4. - In de buizen werden 24 uur oude Daphnia's overgebracht, 6 Daphnia's per buis in een zo klein mogelijk volume. - Na 24 en 48 uur blootstelling werd de sterfte van de Daphnia's geregistreerd. Hieruit werd de LC50 berekend. - De overlevende Daphnia's werden getest in de cometassay, zoals boven is beschreven na acute blootstelling in vivo.

15

Ontwikkeling van dc neutraalrood retentie test cn de cometassay in Daphnia magna

Resultaten 4.1 Neutraal rood retentie test (NRR test) Er werden een aantal stoffen getest op hun effect in de retentietijd van neutraal rood in darmepitheel cellen van D. magna. Kaliumdichromaat, Cd als CdCl2, Lindaan en pentachloorfenol. De gebruikte concentraties staan in tabel 1, alsmede de gevonden retentietijden en de LC-50 waarden. De LC-50 waarden zijn verkregen uit testen die op dit lab werden uitgevoerd met Daphnia's, jonger dan 24 uur, na 48 uur blootstelling. Gebruikt medium was, evenals tijdens deze blootstellingen, Elendt M4. Tabel I. Gebruikte concentraties. LC-50 waarden en retentietijden van de teststoffen voor de NRR test: Stof

Cd

——^_^_^^^^^^^—^^^^^^^—

Kaliumdichromaat

Lindaan

Pentachloorfenol

LC-50 (mg/l) 0.6

0.57

1.7

0.27

concentraties (mg/l)

0 0.1 0.18 0.32 0.56 (i

0.1 0.18 0.32 0.56 0 1 1.8 3.2 5.6 10 0 0.17 0.3 0.54

retentietijd 78 ± 18 117±20 85+9 82 ± 13 62 + 18 245 ±17 250 ±17 185 ± 9 155 ±23 145 ±17 113 ± 12 100 ±10 90 ±14 113 ±25 80 ± 17 73 ± 15 130 ±26 129 ±14 97 ±25 135 ±39

(minuten) ± SD

(*) (*) (*)

* * *

* *

*

De sterretjes achter de retentietijden geven aan dat de gevonden tijd in de Williams test significant (p<0.05) vcrschilt van de controle. Dc tussen haakjes geplaatste sterretjes geven aan dat de retentietijd verschilt van dc laagste concentratie (0.1 mg/l). Uit de tabel valt onder andere het volgende op: 1. De retentietijd van de bianco tijdens de testen onderling vertoont grote variatie: Van 78 tot 245 minuten. 2. De twee metalen, cadmium en chroom in dichromaat geven een duidelijke daling in de retentietijd te zien, bij een concentratie die lager is als de LC-50: cadmium bij 0.18 mg/l terwijl de LC-50 0.6 mg/l is en dichromaat bij 0.18 mg/l terwijl de LC-50 0.57 mg/l is. 3. Lindaan geeft bij de hoogste geteste concentraties een duidelijk effect in de retentietijd. Deze concentraties liggen echter hoger als de LC-50 waarde voor jonge Daphnia's. 4. Pentachloorfenol geeft, ook in de hoogste geteste concentratie geen duidelijk significante daling van de retentietijd te zien.

16


4.2

Cometassay

4.2.1 Acute blootstelling in vitro: Nadat er een methode was ontwikkeld voor het verkrijgen van een celsuspensie uit Daphnia's konden deze cellen worden blootgesteld aan een tweetal bekende genotoxische stoffen: waterstofperoxide (HjOj) en ethyl-methaansulfonaat (EMS), een alkylerende stof. De resultaten van een aantal van deze testen zijn weergegeven in de figuren 3 t/m 5. De sterretjes bij de balken in de figuren geven aan dat de gevonden waarden significant verschillen van de bianco waarde (p<0.05 Kruskal Wallis). In figuur 3 zijn de resultaten te zien van een experiment met een concentratiereeks van H 2 0 2 . Een duidelijk effect is zichtbaar vanaf een concentratie van 340 u.g/1 (19 \iM). In figuur 4 zijn de resultaten van een vergelijkbare test te zien. Door problemen met de bianco is deze verloren gegaan. Het aangegeven significante verschil vanaf 340 u.g/1 is dan ook t.o.v. de laagste concentratie H ; 0 ; . In figuur 5 zijn de resultaten van een test met een tweetal concentraties EMS cn H202 als positieve controle te zien. EMS geeft hier een duidelijk en significant effect. Het effect lijkt iets minder als van waterstofperoxide. Van een echte dosis - respons relatie lijkt geen sprake te zijn. Ook in figuur 6 staan de resultaten van een test met H 2 0 2 en EMS . Hoewel de testomstandigheden hier hetzelfde waren als bij het experiment waar figuur 5 uit voortkwam, werden hier geen significante verschillen gevonden. De vrij hoge 'spontane' DNA-schade in de bianco en de grote spreiding in de monsters zijn hier de oorzaak van.

Figuur 3: In vitro blootstelling aan waterstofperoxide:

,

,

68

,

340 1700 concentratie (ug/l)

17

_

8500


Figuur 4: In vitro blootstelling aan waterstofperoxide:

8070 E

r

+

r*

6 0

f« | cu

40

I 3° 1 20 10 n \j 68

340

3400

concentratie (ug/l)

Figuur 5: in vitro blootstelling aan waterstofperoxide en EMS

80

*

70 _ 60 E =. 50

r *

1r*

• f> 40 JH

I 3° a to 20 10 0

1

controle

1.7 mg/l H202

5.7 mg/l EMS

18

57 mg/l EMS

Ontwikkeling van de neuUaalrood retentie test cn de cometassay in Daphnia magna

Figuur 6: blootstelling in vitro aan waterstofperoxide en EMS 80 70 60

[so 01

B 40 cu

1 30 10 0.

__i

controle

.

- — 1.

_

1.7 mg/\ H202

^

50 mg/\ EMS

VJ

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna Tijdens een TIE experiment (Rotteveel, 1999 rapport nog niet verschenen) met poriewater van sediment uit de Petroleumhaven te Amsterdam, werd een scheiding met een C18 kolom uitgevoerd. De doorloop werd opgevangen. De aan de kolom bindende fractie werd geelueerd met methanol. Voor details over deze behandeling: zie het bovenstaande rapport. Tijdens een eerder experiment was gebleken dat het poriewater genotoxiciteit vertoonde. Nu werd het poriewater voor en na C18 behandeling in vitro in de cometassay getest. Zie voor het resultaat figuur 7.

Figuur 7: in vitro blootstelling aan poriewater voor en na behandeling met een C-l8 kolom.

IOJ -

100 r

•g

80

3 CW

I

60

« r1 •

40

*

20

0

i —

_

—i

i

P172 P172doorloop onbehandeld C18

P172eluaat C18

DSWcontrole

1.36 mg/l H202

De sterren geven aan: een significant verschil t.o.v. de DSW controle. Uit dit experiment bleek dat, naast de positieve controle alleen het onbehandelde monster een duidelijk effect gaf in de cometassay. Dc doorloop van de kolom, alsmede het eluaat gaven wel een verhoging van dc gemiddelde staartlengte te zien t.o.v. de DSW controle, maar deze is niet significant. Deze resultaten konden echter niet worden gereproduceerd in een tweede experiment, door te hoge variatie in de metingen.

Onder ander door deze resultaten en de bcvindingcn tijdens eerdere experimenten dat het gebruik van uit volwassen Daphnia's geisoleerde cellen voor in vitro blootstelling voorafgaande aan een cometassay moeilijk te beoordelen preparaten gaf, werd besloten om een assay te ontwikkelen waarbij jonge Daphnia's in vivo worden blootgesteld aan monsters gedurende een tijd van bijvoorbeeld twee dagen waama uit de overlevende dieren cellen worden ge'isoleerd die direct in de conmetassay worden getest. Dit levert in ieder geval een blootstelling op die meer de werkelijke situatie nabootst. Daarnaast kunnen de blootstellingen worden uitgevoerd conform de S.O.P.'s die al bestaan voor acute Daphnia testen. Dc gevolgdc werkwijze staat beschreven in het materiaal & methoden hoofdstuk. Nadat deze methode in een aantal testen van concentraten van oppervlaktewatermonsters met goede resultaten werd toegepast, zijn een aantal stoffen getest in concentratierecksen tot aan de LC-50 waarde. De resultaten staan weergegeven in figuur 8 t.m. 11:

20

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna 4.2.2 Acute in vivo blootstelling: In figuur 8 is te zien dat de LOEC van H : 0 : bij in vivo blootstelling 5.6 mg/I is. Deze concentratie ligt vlakbij de LC50 48h (5.7 mg/l). Dit in tegenstelling tot dc in vitro blootstelling, waarbij H 2 0 2 al effect geeft bij een concentratie van 340 ng/l, een factor 16 lager. De LOEC van EMS bij in vivo blootstelling is 56 mg/l (figuur 9). Hoewel de in vitro blootstelling wisselende resultaten te zien gaf werd met die blootstelling een effect gezien bij 5.7 mg/l, een factor 10 lager dus. De LC50 van deze stof voor D. magna is ongeveer 310 mg/l. De LC-50 en de LOEC in de cometassay liggen hier dus wel wat uit elkaar. In figuur 10 zijn de resultaten van een in vivo experiment met lindaan te zien. Lindaan geeft hier geen significant genotoxisch effect. De hoogste concentratie waaraan de dieren zijn blootgesteld is vergelijkbaar met de LC-50: 1.7 mg/l. Figuur 11 geeft de resultaten van een in vivo experiment met 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) weer. Een significant effect werd hier gezien bij 300 ng/l. Helaas is het meetpunt bij 30 u.g/1 (dat wel was ingezet) weggevallen. Bij andere experimenten echter, waarbij deze stof als positieve controle werd meegenomen, (o.a. bij in vivo blootstellingen van oppervlaktewaterconcentraten) in een concentratie van 100 p.g/1, werd wel een significant effect gezien. Ook de experimenten met chronische blootstelling van deze stof wijzen erop dat de LOEC van deze stof bij in vivo blootstelling ligt op ongeveer 100 ug/l. De LC-50 van deze stof voor D. magna is 350 ng/l.

Figuur 8. Cometassay na in vivo blootstelling aan waterstofperoxide, 48 uur.

60

•—-

" — — - — - — • - — • - » • — — • - — •-—••—

— — * —

..-. — . —

—..,—- —

— -

50 4 •g 40 3

|

30

ra

5 20 10

0.56

1

1.8

3.2

concentratie (mg/l)

21

5.6


Figuur 9. Cometassay na in vivo blootstelling aan EMS. 48 uur.

Figuur 10. Cometassay na in vivo blootstelling aan lindaan. 48 uur:

22


Figuur 11. Cometassay na blootstelling aan 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO). 48 uur: 60

*

50f

40

& 30

«

1 2° 10 n. 0

3

300

concentratie (ug/l)

23


4.3 Vergelijking van de NRR test en cometassay met effecten op de populatiegroei tiidens chronische blootstelling. Tijdens de uitvoering van chronische testen van een viertal stoffen (Cd in CdCl2, K2Cr207, lindaan en 4-NQO) zijn er na 14 dagen blootstelling NRR testen uitgevoerd en bij jongen van verschillende worpen werd, na nog 48 uur blootstelling een cometassay uitgevoerd. Met de overgebleven ouderdieren (10 per testconcentratie) werd dc chronische test afgemaakt waarna uit de sterfte en geboortecijfers de intrinsieke populatiegroeisnelheid (Rm) kon worden bepaald. Na toetsing van de verschillende Rm waarden in een Williams test werd per stof een LOEC^ verkregen. Uit de NRR testen en de cometassays werden respectievelijk LOEC^^R en LOECc^a verkregen. De resultaten van deze testen staan in tabel 2. Tabel 2. Vergelijking van de respons van NRR test en cometassay met effecten op reproductie tijdens chronische blootstelling:

stof

Cd in CdCL K2Cr,07 lindaan 4-NQO

Effectparameters (concentraties in ug/D LOEC^ 2 1 dagen > 100 320 100 56

LOEC,™ 14 dagen > 100 1000 180

LOEC_ T worp

LOEC™.. 2° worp

320

560

32

100

LOEC^ 3e worp 100

LOEC^ 4e worp > 100

>180

> 180

De gevonden waarden, of eigenlijk het gebrek hieraan. bij de blootstelling aan cadmium zijn vooral het gevolg van het feit dat de gekozen concentratiereeks (10, 18, 32, 56 en 100 iJ.g/1) te laag bleek te zijn om effecten op de voortplanting te zien. Aangezien cr ook vrijwel geen effecten op de overige parameters werden geconstateerd (afgezien van een effect in de cometassay op de jongen van de 3* worp bij 100 p.g/1), zal dit experiment moeten worden herhaald met hogere concentraties. Het gevonden effect in de NRR test bij langdurige blootstelling aan dichromaat was geen verminderde retentietijd maar een duidelijk verhoogde. Tevens waren er duidelijke morfologische veranderingen te zien aan de lysosomen in de darmepitheelcellen van de dieren. De lysosomen waren geclusterd tot een groot lysosoom per cel. Het neutraalrood bleef in deze reuzelysosomen tot de bceindiging van het experiment na 3 Vi uur. De retentietijd van de kleurstof in de bianco was in dit experiment 2 uur en 20 minuten. In de jongen van de dieren die zijn blootgesteld aan dichromaat werd wel genotoxiciteit gevonden. Bij concentraties van resp. 320 u.g/1 en 560 ug/l was een duidelijk verhoogde migratie van het DNA van dc jongen waar te nemen. Hoewel lindaan vanaf een concentratie van 100 tJ.g/1 een verlaagde populatiegroeisnelheid bewerkstelligt is er geen DNA-schade te zien bij deze en hogere concentraties. Er is wel een effect te zien in de NRR test. In de hoogst geteste concentratie was de retentietijd significant verlaagd. Van 4-NQO is geen NRR test uitgevoerd. Bij de nakomelingen van de blootgestelde dieren was duidelijk DNA-schade te constateren. De populatiegroeisnelheid was duidelijk verlaagd vanaf een concentratie van 56 ug/l. Deze verlaagde groeisnelheid was het gevolg van een duidelijke verlaging van het aantal geboren jongen. Bij deze concentratie, cn bij de hogere geteste concentraties trad geen verhoogde sterfte op. Dit in tegenstelling tot de andere geteste stoffen waar, naast een verlaging van het aantal jongen per ouderdier, ook sterfte optrad onder de blootgestelde dieren. De life history parameters van de chronische testen staan bij elkaar in tabel 3.

24

Ontwikkeling van dc neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia

magna

Tabel 3 life history parameters van de chronische testen bij de vergelijking met de NRR test en de cometassay: Tussen haakjes zijn de standaardafwijkingen gegeven. Sterretjes geven een significant verschil aan t.o.v. de bianco (Williamstest. p<0.05). Stof

• concentratie jug/1 i •

Cd in CdCl2

> •

•

:0

:20 i 10 • 20 :20 iO :20 iO i 30 :60 •90 ;90 ; 100 • 20 :30

**:i"0" i 18 ""•32 •56 : 100 K2Cr207

lindaan

4-NQO

• sterfte • % na 21 dagen ••

io •180 :320 i 560 • 1000 : 1800 iO : 18 '"•32 156 : 100 i 180 iO :10 :18 :32 •56 ! loo

":T6"' i 10 :0 •40 i io :0 i 10 :30 :10 iO

gemiddeld aantal jongen

gemiddeld aantal jongen

(totaal)

(per overlevende nudei i

39.7(11.9) 43.7(15.0) 40.5(11.0) 43.2(8.3) 49.5 (10.2) 45.8 (7.0) 58.6 (8.6) 53.6(14.4) 23.9(16.4)* 17.3(6.6)'* 1.4(2.5)* 0* 44.0(10.7) 39.6(15.3) '44.6 (9.5) 46.5 (13.6) 48.3(10.1) 30.0(14.5)* 72.1(6.8) 71.9(7.2) 73.1(5.5) 58.2(8.1)* 29.3 (13.8)* 14.2(7.5)*

44.4 (4.6) 48.3 (3.7) 45.1 (5.0) 46.8 (2.5) 49.5 (10.2) 47.3 (4.7) 58.6 (8.6) 57.7 (4.0) 34.3(11.1)* r 2"6.6(i.4)* 2.0(1.4)* 0* 48.4 (2.6) 44.7 (6.7) [47.3 (4.2) 49.8 (9.3) 48.3(10.1) 40.5 (6.7)* 72.8 (6.8) 71.9(7.2) 74.0 (5.0) 57.7 (6.5)* 32.6 (9.7)* 14 2(7 5)*

:Rm

: 0.351 (0.008) i "6.356" "(0.620) i 0.367 (0.006) |^0.363 (0.014) i 0.372 (0.013) : 0.361 (0.012) i 0.385 (0.005) i 0.350 (0.007) ; 0.265(0.635ij* j •0.258 "(0.017"j* i0.034 (0059)"* ;0* ! 0.382 (0.015) 10.352(0.017) : 0.366 ("6.619) • 0.377 (0.006) ; 0.356 (0.025)* i 6.317 ("6.614 j * • 0.387(0.011) : 0.363 (0.024) i 0.367 (0.024) i 0.346 (0.021) : 0.284 (0.077*)* i 0.222 (0.023)*

Uit de weergegeven waarden is te zien dat bij een stof als lindaan een significant effect optreedt bij 100 ixg/1 (Rm), nog voordat er een duidelijk significant effect is te zien in het aantal geboren jongen. De verlaging van Rm is hier het gevolg van een combinatie van effecten op voortplanting en overleving. Bij 4-NQO treedt er al bij 32 ug/l een significant effect op in het aantal jongen, terwijl een significant effect op Rm pas vanaf 56 p.g/1 is te zien. Hier is de life history parameter voortplanting dus iets gevoeligcr als de combinatieparamcter populatiegroeisnelheid. Bij kaliumdichromaat, waar bij de concentratie van significant effect op de voortplanting ook al een duidelijk effect op de overleving is te zien (320 p.g/1) is ook de verlaging van de Rm direct significant.

25

Ontwikkeling van dc neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna Tijdens de uitvoering van de chronische blootstellingen van Daphnia's aan kaliumdichromaat en 4NQO zijn uit de jongen van de eerste worp per concentratie 10 jongen w illekeurig gekozen cn overgebracht naar potten met de overeenkomstige concentraties teststof. Deze dieren werden dagelijks gevoerd en drie keer per week werd de oplossing waarin ze werden blootgesteld ververst. De dieren werden nog 12 dagen blootgesteld. De uit deze dieren geboren jongen werden geteld. Dit om een idee te krijgen van het eventuele effect van blootstelling op de 2' generatie De resultaten van deze tellingen zijn weergegeven in tabel 4 en 5.

Tabel 4 . Overleving en aantal geboren jongen van 10 1* generatie jongen uit de chronische test met K^C^O,:

concentratie

3 dagen

5dagen

7 dagen

overleving (%)

overleving (%)

overleving (%)

overie ving (%)

aantal jongen

overleving (%)

aantal jongen

OM

100

100

100

100

97

100

80

177

17.7

180 ng/l

100

100

100

100

44

100

39

83

8.3

320 ng/l

100

100

100

100

15

90

92

107

11.9

40

0

30

5

5

1.7

0

—

0

—

—

560 ng/l

70

60

60

looo ng/i

0

0

0

10 dagen

12 i agen totaal aantal jongen

aantal jongen per overlevend dier

~

Hoewel dit niet statistisch kan worden getoetst lijkt er al vanaf 180 ng/l een verlaagde reproductie op te treden in de tweede generatie.

Tabel 5. Overleving en aantal geboren jongen van 10 1* generatie jongen uit de chronische test met 4-NQO:

concentratie

3 dagen

5dagen

7dagen

10 dagen

12 dagen

overleving (%)

overleving (%)

overleving (%)

overleving (%)

aantal jongen

overleving (%)

aantal jongen

0ng/l

100

1(H)

too

90

57

90

76

133

14.8

10 ng/i

100

100

100

100

53

100

44

97

9.7 7.4

totaal aantal jongen

aantal jongen per overlevend dier

18 ng/i

60

50

50

50

25

50

12

37

32 ng/l

60

60

60

60

0

60

57

57

9.5

56 ng/l

70

60

50

40

0

40

0

(i

0

ioo ng/i

80

50

40

30

0

30

0

0

0

Vanaf een concentratie van 10 jj.g/1 4-NQO lijkt er een verminderde reproductie op te treden. Vanaf 56 ug/l is dc reproductie zo vertraagd dat er na 12 dagen nog geen jongen zijn geboren.

26


4.4 Gebruik van de Cometassay bij de beoordeling van oppervlaktewater concentraten De resultaten van de testen die zijn uitgevoerd met de concentraten van het onbekende stoffen project staan in tabel 6. Uit de uitslagen van de toxiciteitstesten blijkt dat de verkregen SFE concentraten vrijwel niet toxisch zijn. Er werd slechts in een paar gevallen wat sterfte gevonden in de hoogste concentratie. Met de KD concentraten werd wel sterfte geconstateerd. De concentraten van de verschillende locaties ontlopen elkaar niet veel. Lobith lijkt iets minder toxisch te zijn evenals Rijnland t.o.v. de andere loacties. Maar de verschillen zijn klein en de verkregen LC-50 waarden liggen alien binnen elkaars 95% waarschijnlijkheidsinterval. In het controlemonster (een concentraat van Spa water) werd ook enige sterfte geconstateerd in de hoogste geteste concentratie: 39%. Ook met de cometassay was duidelijk dat de monsters die met de SFE methode zijn opgewerkt veel minder effect geven als de KD monsters. Echter, er zijn een paar uitzonderingen: Het SFE concentraat van Maasluis lijkt zelfs bij een lagere concentratie effect te geven als het KD concentraat. Ook met het SFE concentraat van Schaar van Ouden Doel werd significant effect gevonden in de laagste concentratie. Hier moet bij vermeld worden dat dit SFE monster een duidelijke piek te zien gaf: een concentratiefactor van 15.6 (CF=15.6) gaf een maximaal effect. Daarna werd het effect minder en vanaf CF=62.5 was ergecn significant effect meer te zien. Als we de resultaten van de KD concentraten naast elkaar leggen valt op dat de gevonden LOEC's van de locaties ongeveer gelijk zijn en een factor 2 tot 6 lager liggen als de LC-50 waarden van de monsters. Op een na: Het concentraat van Rijnland (Lisse) geeft geen zichtbare DNA-schade, terwijl het wel toxisch was met een LC-50 van CF=44. In tabel 7 staan de resultaten van dc testen met dc KIWA concentraten van monsters van Lobith en Eijsden van een aantal data in 1998. De monsters van Eijsden van 8-9-98 zijn in andere concentraties getest als de overige monsters aangezien achteraf bleek dat dc concentratiefactor niet 25000x was maar 21259. Met deze concentratiefactor is rekening gehouden bij de berekeningen. De cometassays geven over het algemeen een LOEC te zien die in de dezelfde orde grootte ligt als de LC-50 48h, op een tweetal monsters na. De pH2 monsters van Eijsden van 14-7-98 en 8-9-98 zijn allebei niet toxisch (LC-50 >CF=62.5, de hoogst geteste concentratie) maar geven al bij een lage concentratie een duidelijk effect in de cometassay: 14-7-98 bij CF=7.8 en 8-9-98 bij CF=13.3. Hier moet bij vermeld worden dat het monster van 14-7-09 geen duidelijke dosis effect relatie te zien gaf: CF=7.8 was direct significant hoger als de bianco, CF=15.6en CF=31.2 zaten net iets onder de p<0.05 grens en CF=62.5 was weer significant. In mindere mate geldt dit ook voor het pH2 monster van Eijsden van 11-11-99. Hoewel dit monster iets toxischer was (LC-50: CF= 57.1) is er al genotoxiciteit aantoonbaar bij een 4x zo lage concentratie, CF=I5.6.

27

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en dc cometassay in Daphnia

magna

Tabel 6. Resultaten van de toxiciteits testen met Daphnia en de cometassays van een aantal oppervlaktewaterconcentraten: Tussen haakjes staan de 95% betrouwbaarheidsintervallen gegeven bij de LC-50 waarden.

1

Monster

extractie

Controle Controle Lobith Lobith Eijsden Eijsden Maassluis Maasluis Schaar v. Oudcn Doel Schaar v. Oudcn Doel Rijnland Rijnland

KD extract SFE extract KD extract SFE extract KD extract SFE extract KD extract SFE extract KD extract SFE extract KD extract SFE extract

:

Toxiciteitstest 48h. LC-50 >CF= 250 >CF= 250 CF=39(15- 107) >CF= 250 CF=36(14-95) >CF= 250 CF=34(14-81) >CF= 250 CF=34 (30 - 40) >CF= 250 CF=44 >CF= 250

i

il

Cometassay LOEC (p<0.05% Kruskal-Wallis) CF=250 >CF= 250 CF-5.7 >CF= 250 CF=7.8 >CF= 250 CF=15.6 CF=7.8 CF=7.8 CF=7.8 >CF= 62.5 > CF=250

-J

Tabel 7.Resultaten van toxiciteitstesten met Daphnia en cometassays van oppevlaktewaterconcentratcn van lx>bith en Eijsden. vervaardigd volgens de KTWA methode, van ccn aantal monsterdata. Tussen haakjes zijn de 95 % betrouwbaarheids intervallen gegeven bij de LC-50 waarden.

Monster Eijsden 14-7-'98 8-9-98 11-11-98 Lobith 14-7-98 9-9-98 11-11-98

Toxiciteitstest 48h. LC-50

Cometassay LOEC (p<0.05 Kruskal-Wallis)

pH2 pH7 pH2 pH7 pH2 pH7

> CF=62.5 CF=31.2(29-33) > CF=62.5 CF=47.2 (34 - 66) CF=57.1(27- 119) CF=42.8 (34 - 53)

CF=7.8 CF=31.2 CF=13.3 CF=26.5 CF=15.6 CF=31.2

pH2 pH7 pH2 pH7 pH2 pH7

CF=23.9(19-29) CF=8.2(6-10) > CF=62.5 CF=65.4(15-212) CF=20.4(16-26) CF -12.6(10- 15)

CF=31.2 CF=7.8 CF=62.5 CF=31.2 CF=15.6 CF=I5.6

28


Discussie Zoals al in de inleiding is gezegd kunnen voor biomarkers een aantal criteria worden genoemd die het belang van deze bepalingen voor ecotoxicologisch onderzoek aangeven. Dc twee in dit onderzoek bekeken biomarkers, die allebei niet specifieke biomarkers van de conditie van een organisme kunnen worden genoemd voldoen aan een aantal van deze criteria. Daarnaast zijn er bij de keuze voor deze twee biomarkers een aantal punten aangegeven die voor ons van belang worden geacht voor een bruikbare biomarkerbepaling naast de bepalingen die op de afdeling ecotoxicologie worden uitgevoerd. De biomarkertest moet implementeerbaar zijn in een bestaande bioassay, tocpasbaar zijn in invertebraten en aantoonbare relaties hebben met populatiegroei parameters. De mogelijkheden tot implementatie van de twee biomarkertesten in een bestaande bioassay zijn divers. Iedere blootstelling aan stoffen of monsters t.b.v. de cometassay werd uitgevoerd op dezelfde wijze als de acute of de chronische daphniatest wordt uitgevoerd. Bij de chronische blootstelling werden de testen uitgevoerd op jongen die werden geboren uit de dieren in de chronische test. DcNRR test Bij de NRR test na acute blootstelling lag dit iets anders. Aangezien het darmepitheel van jonge Daphnia's erg moeilijk te beoordelen bleek, is vrij snel tijdens het ontwikkelen van de test overgegaan op uitvoer van de test bij dieren die minstens 1 keer hebben gejongd. De darmen zien er dan veel nistiger uit en er is goed onderscheid te maken tussen cellen met gekleurde lysosomen cn cellen waarbij het cytoplasma ook is aangekleurd. Daarom worden voor deze test dieren gebruikt die minstens 8 dagen oud zijn. Het verschil in gevoeligheid tussen jonge Daphnia's en oudere dieren kan aanzienlijk zijn. Dit is in dit onderzoek goed te zien bij lindaan. De testdieren werden hier blootgesteld aan concentraties lindaan (1.8 - 10 mg/l) die voor jonge dieren al dodelijk zou zijn (LC50 48h = 1.7 mg/l). Afgezien hiervan kan ook de NRR test in Daphnia's worden gebruikt als eindpuntsmeting van de algemene conditie van de dieren in een bioassay. Bij de testen met chronische blootstelling werden de NRR testen uitgevoerd op dieren die exact hetzelfde behandeld werden als in de parallel lopende chronische bioassay. Resultaten, voortkomende uit deze testen zijn dus wel te cxtrapolcrcn naar effecten in dc chronische testen. Dan blijkt dat dc lysosomalc stabiliteit bij chronische blootstelling, bij de stoffen die tot nu toe zijn getest duidelijk reageert op langdurige blootstelling. Bij blootstelling aan lindaan wend een verminderdc stabiliteit gevonden bij 180 ug/l. Bij kaliumdichromaat werd juist ccn verhoogde stabiliteit gevonden bij 1 mg/l. De morfologie van de lysosomen was duidelijk veranderd. Iedere cel leek een groot lysosoom te bevatten die in de NRR test geen tekenen van teruglekken van de kleurstof naar het cytoplasma gaf te zien. Het fenomeen van lysosomale veranderingen na blootstelling aan toxicanten is door andere onderzoekers al vaker beschreven. Lowe (1994) en Giamberini (1997) melddcn het fenomeen. Giamberini nocmt het een niet specifieke stress biomarker en gaat er vanuit dat de grote lysosomen ontstaan door fusie van kleine secundaire lysosomen tot grote autolysosomen. Over eventuele negatieve gevolgen van de lysosomale fusie wordt weinig gezegd. Maar aangezien de fusie waarschijnlijk het gevolg is van instabiliteit van de membranen van de lysosomen mag verwacht worden dat de functie van de lysosomen achteruit zal gaan. Onder andere door het binnendringen van water in de organellen zal de pH in de lysosomen niet optimaal meer zijn voor een aantal enzymen. Dit kan zelfs inactivatie van enzymen tot gevolg hebben. Variabiliteit in de NRR test Het is duidelijk dat beide biomarkers bruikbaar zijn in Daphnia magna. De NRR test is echter tot nu toe slechts met een beperkte celpopulatie te gebruiken. Alleen de darmpjes van de dieren laten zich makkelijk uitpreparercn en kleuren met neutraal rood. Waarschijnlijk zijn dit ook de cellen in Daphnia die het eerst met een in het water opgeloste, of aan voedseldeeltjes hechtende toxicant in aanraking komen. De retentietest op stukjes darm van de dieren vertoont een vrij grote variatie. Met andere woorden: tussen stukjes darm van hetzelfde dier bestaat er een aanzienlijk verschil in

29

Ontwikkeling van de neutraalrood retenUe test cn dc cometassay in Daphnia magna retentietijd van de kleurstof. Voor een deel is deze variabiliteit mogelijk toe te schrijven aan de isolaticmethode. Door het mechanisch in stukjes delen van de darm kunnen cellen in de darm beschadigd raken. Deze veronderstelling wordt gesteund door de observatie dat op de "scheurranden" van de stukjes het teruglekken van neutraalrood in het cytoplasma van de cellen vaak het eerst begint. Het zou dus wenselijk zijn om een methode te ontwikkelen waarbij de cellen van de darm in suspensie kunnen worden getest. Dit komt ook de objectiviteit van de test ten goede. Nu wordt geschat wanneer 80% van de cellen in een weefselstukje cytoplasmakleuring vertoont. Een ander deel van de variabiliteit lijkt in de test zelf besloten te liggen. Ook andere gebruikers van de test vermelden grote variatie (Scott-Fordsmand 1998, Weeks 1996, Lowe 1994). Uit de resultaten van de testen met de verschillende stoffen kan worden opgemaakt dat er een grote variatie bestaat in de testen onderling: de bianco retentietijd varieert tussen de 78 en 245 minuten. Een verklaring, anders dan de hierboven vermelde oorzaken kan eigenlijk niet gegeven worden. Het maakt eventuele standaardisatie van de test wel moeilijk. De test is ook vrij arbeidsintensief. Aangezien de darmpreparaten gedurende de hele retentietijd moeten worden gecontroleerd op het teruglekken van de kleurstof in het cytoplasma kunnen er maar een beperkt aantal preparaten tegelijk worden gemaakt. 8 is wel het maximum. Gevoeligheid van de NRR test Ondanks dc variatie in de test kan worden gesteld dat bij toepassing van de test op darmpreparaten van blootgestelde Daphnia's cr effecten kunnen worden gevonden. Met name metalen (cadmium en chroom) geven effect bij concentraties, 3 - 4 x lager dan de LC-50 waarden. De andere geteste stoffen lijken nauwelijks effect te geven, of pas bij concentraties rond of boven de LC-50 waarde. Het is mogelijk geen toe val dat juist de twee metalen van de teststoffen effect geven. Van Daphnia is bekend dat het dier extra gevoelig is voor metalen, vergeleken met andere invertebraten. Een andere mogelijke verklaring voor het verschil tussen de effecten met de metalen en de overige stoffen is, dat de testen zijn uitgevoerd in Elendt M4 medium. Dit medium bevat een hoeveelheid EDTA. De binding van deze metalen aan EDTA kan dc beschikbaarheid van de metalen verlagen. Als de F.DTAmetaal complexen echter het zure milieu van lysosomen kunnen bereiken zullen veel metalen losrakcn van de chelator en alsnog hun toxiciteit bewerkstelligen. Voorwaarde hiervoor is wel dat het EDTAmctaalcomplex opgenomen wordt in de lysosomen. De NRR test zal als biomarker van conditie van een organisme goed bruikbaar kunnen zijn bij waarnemingen van veld materiaal. Daphnia's, uitgezet gedurende enige tijd in het veld, of verzameld uit de veldpopulatie kunnen heel goed met de NRR-test worden beoordeeld op hun conditie. Daarbij kan de test ook worden toegepast op andere organismen zodat met een biomarkertest de mate van aantasting van een ecosysteem kan worden geschat. Het is dan wel van belang de verschillende gevoeligheden van de soorten met deze biomarkertest te weten. De cometassay De cometassay als test voor genotoxiciteit in een invertebraat als Daphnia magna lijkt zeer goed bruikbaar. Er zijn meer onderzoeken gedaan naar de bruikbaarheid van genotoxiciteitstesten op invertebraten (Garman 1997, Mitchelmore 1996, Nacci 1996, Wilson 1998), maar dit betrof het gebruik van zoutwater organismen. In Duitsland is een groep bezig met onderzoek naar de effecten van genotoxische stoffen op eencellige algen en dieren (Erbes 1997, Wessler 1998). Pas recentelijk is het gebruik van een DNA-schade test in Daphnia beschreven (De Coen 1999). Het gebruik van uit Daphnia's gcisoleerde cellen voor in vitro blootstelling heeft voor en nadelen. Een groot voordeel van in vitro blootstelling is de grotere gevoeligheid. Uit de testen die met waterstofperoxide en EMS in vitro en in vivo zijn uitgevoerd blijkt dat er grote verschillen zijn in LOECrffc,,. Bij EMS is de LOEC in vitro: 5.7 mg/l en in vivo: 56 mg/l. Waterstofperoxide heeft een LOEC in vitro van 0.34 mg/l, en in vivo 5.6 mg/l. De verklaring hiervoor heeft zeer waarschijnlijk te maken met de opnamekinetiek van de stoffen in het organisme en de verdeling over de verschillende compartimenten. De grote variatie in de cometassays met in vitro blootstelling maakt deze test echter moeilijk te gebruiken. Waarschijnlijk door de methode die gevolgd wordt bij het isoleren van de cellen is de gevoeligheid van de cellen variabel. Bij het gebruik van deze test is dan ook het altijd meenemen van positieve en negatieve controles zeer aan te radon. De validiteit van de uitslag van de

30

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test cn de cometassay in Daphnia magna test moet dan afhangen van de uitkomst van deze controles. De gevoeligheid van dc cellen van Daphnia magna bij in vivo blootstelling lijkt veel minder variabel. Deze methode heeft dan ook de voorkeur bij het testen van stoffen en milieumonsters op aanwezigheid van genotoxiciteit. Deze conclusie is een beetje is strijd met wat bijvoorbeeld Wilson (1998) vond bij dc vergelijking van in vitro met in vivo blootstelling in Mytilus edulis. Hier werd ook een grotere gevoeligheid gevonden bij in vitro blootstelling maar juist een grotere variabiliteit in de in vivo methode. De in vitro methode werd dan ook aangeraden bij genotoxische risicobeoordeling voor mariene organismen. Mogelijk dat de onelegante manier waarop Daphniacellen worden ge'isoleerd ons hier patten speelt. De cellen worden op dezelfde manier geisoleerd in beide methodes maar bij de in vivo blootstelling heeft de blootstelling dan al plaatsgevonden en de ontstanc variabiliteit ten gevolge van de isolatie heeft dan geen invloed meer op de uitslag van de test. Gebruik van celliinen Het is echter maar de vraag of voor het uittesten van in vitro genotoxiciteit cellen van Daphnia nodig zijn. Mogelijk geven gekweekte cellen van bijvoorbeeld een vis cellijn of idealiter een Daphnia cellijn dezelfde of soortgclijke resultaten. De variabiliteit van testen met dit materiaal zal veel kleiner zijn doordat voor het verkrijgen van celsuspensies voor dc testen minder ingrijpende en celbeschadigende handelingen nodig zijn. Ook zullen er in de preparaten geen storende carapaxfragmenten cn weefseldcbris aanwezig zijn. De bruikbaarheid van cellijnen voor het testen van genotoxiciteit zal in de nabije toekomst worden uitgetest. Ook het nabootsen in vitro van metabolise ring van stoffen met behulp van bijv. S9 mix zal dan worden uitgeprobeerd. Deze nabootsing is vooral van belang bij de schatting van de genotoxiciteit van bijvoorbeeld PAK mengsels en met PAK's verontreinigde monsters, waarvan een deel pas genotoxisch wordt na omzetting door het MFO-systeem of soortgelijke enzymsystemen. Staartlengtemeting vs. 'tailmoment' In dit onderzoek is de aanwezigheid van genotoxiciteit nog bepaald door het toetsen van de verschillen tussen de staartlengtes van de ontstane kometen. Dit is een eenvoudige cn doeltreffende methode waarvoor niets meer nodig is dan een fluorescentiemicroscoop met de juiste filters en een oculairmicrometer. Uit een aantal publicaties blijkt dat het bepalen van het zogenaamde 'tailmoment" of de bepaling van het percentage DNA in de staart een gevoeliger methode is die lagere LOECs oplevert bij stofstudies (Faibairn 1995, Mitchelmore 1998, Erbes 1997). Hoewel dit verschil in gevoeligheid bij andere studies niet blijkt (Belpaeme 1996, Koppen 1996) wordt toch vaak de voorkeur gegeven aan het bepalen van significante DNA schade met behulp van dc bepaling van het tailmoment of het percentage DNA in de staart. Deze beide methoden maken gebruik van beeldanalysetechnieken waarbij van 50 - 100 gedigitaliseerde beelden van comets het percentage DNA van de kern dat in de staart terecht is gekomen wordt berekend en eventueel wordt vermenigvuldigd met de staart lengte om het tailmoment te verkrijgen. Deze methoden vereisen natuurlijk wel een extra investering: Naast een fluorescentiemicroscoop is een digitale camera met de mogelijkheid om beelden te integreren en software nodig om de verkregen beelden te analyseren. Voordeel van deze methode is echter wel de al besproken hogere gevoeligheid maar ook wordt cr objectiever gemeten dan wanneer van 50 willekeurig gekozen cellen de staartlcngte wordt gemeten. Het 'kiezen' van willekeurige cellen blijft echter een factor die subjectiviteit kan introduceren, of er nu een tailmoment wordt bepaald of alleen maar de staartlcngte. Effecten van genotoxische stoffen in dc cometassav Als we de resultaten van de LOEC.ff.a in de cometassay met verschillende stoffen en de LC-50 waarden voor deze stoffen naast elkaar leggen dan valt op dat vrijwel alle stoffen wel bij een bepaalde concentratie DNA-schade veroorzaken. Ook stoffen die waarschijnlijk niet genotoxisch zijn. Mogelijk is deze gevonden schade (die meestal optreedt bij concentraties, op of rond de LC-50) het gevolg van apoptose van de cellen in het organisme of door vcrminderde reparatie van spontane DNA-schade door de verlaagde fitness van het dier. Mede daarom kan de cometassay ook worden gezien als een niet specifieke biomarker voor algemene fitness van een organisme. Apoptose, ook wel

31

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna geprogrammeerde celdood genoemd, is het gestuurde sterven van cellen in gercguleerde afstervingsprocessen van weefsels. Bij apoptose is het hele proces van celdood 'voorgeprogrammeerd' en verloopt volgens een vaststaand schema. Dit in tegenstelling tot necrose, waarbij cellen en wcefsel op een vrij chaotische manier afstervcn. Een van de kenmerken van apoptose is het afbrekcn van het DNA in stukken van een bepaalde lengte die, door hun lagere molecuulgewicht, in de cometassay een hogere mobiliteit zullen hebben. Het grote verschil tussen genotoxische en niet genotoxische stoffen in de cometassay is echter de concentratie t.o.v. de LC-50 waarbij significant effect kan worden aangetoond in de assay. Als de LOECrffca van een stof veel lager ligt dan op grond van de LC-50 van de stof verwacht mag worden. dus als er al significante effecten in de cometassay te zien zijn voordat er toxische effecten in de acute bioassay optreden hebben we met een genotoxische stof te maken. Voorbeelden hiervan zijn: 4-NQO ( L O E C ^ i 50 pg/l, LC-50 - 350 pg/l) en EMS (LOEC,^ 56 mg/l, LC-50 = 310 mg/l). Stoffen als Lindaan (LOEC,^ > 1.8 mg/l, LC-50 = 1.7 mg/l) en kaliumdichromaat (LOEC,,*, 0.56 mg/l, LC-50 = 0.57 mg/l) zijn duidelijk niet genotoxisch volgens deze denkwijze. Waterstofperoxide blijkt bij in vivo blootstelling ook niet genotoxisch te zijn (LOEC^h,, 5.6 mg/l, LC-50 = 5.7 mg/l). Waterstofperoxide is ccn stof die bij veel in vitro experimenten duidelijke genotoxiciteit vertoond door het induceren van oxidatieve stress door zuurstofradicalen. Waarschijnlijk komt deze stof echter niet in contact met de cellen die gebruikt worden voor de cometassay. Door de isolafiemethode komen vooral cellen in de suspensie die in een vrij los weefselverband zitten of zelfs zonder weefselverband in het organisme aanwezig zijn (zoals hemolymfecellen). Mogelijk vertoont waterstofperoxide door zijn hoge reactiviteit zijn toxische effecten in eerste instantie vooral in cellen die in direct contact met het water staan (darmepitheel, filterapparaat). Vergelijking van de LOEC in dc cometassay met populatie effecten Uit de resultaten van de cometassay tijdens chronische blootstellingen die zijn uitgevoerd met een paar stoffen komt naar voren dat de LCEC,^ concentraties die gevonden worden vergelijkbaar zijn met de gevonden LOECR,, concentraties in dezelfde experimenten, De experimenten met cadmium moeten nog worden herhaald aangezien de gekozen concentraties te laag waren om effecten op dc voortplanting te zien. In de jongen van de dieren die langdurig aan kaliumdichromaat hadden blootgcstaan was de cometassay significant positief vanaf 320 pg/I en 560 pg/l voor de 1" en 2° worp respectievelijk. Deze concentraties liggen gelijk met de LOEC,,,, (320 pg/l). Lindaan geeft in de geteste concentraties geen effect in dc cometassay. LOEQ,, in dit experiment is 100 pg/l. 4-NQO beschadigde het DNA van de jongen van langdurig blootgestelde dieren significant vanaf 32 pg/l bij de F worp en vanaf 100 pg/l bij dc 2' worp. LOEC^ was in dit experiment 56 pg/l. De gevonden significante effecteoncentraties van deze stof bij acute blootstelling (48 uur) geven aan dat deze gevonden concentraties voorspellend kunnen zijn voor effecten op de voortplanting. Anders gezegd zou genotoxiciteit van deze stof, gevonden na 48 uur blootstelling, voorspellen dat de stof bij deze concentratie ook effecten heeft op de voortplanting bij langduriger blootstelling. Natuurlijk zijn er eerst meerdere experimenten nodig met genotoxische en niet genotoxische stoffen om dit vermoeden te versterken en te bevestigen. Effecten op meerdere generaties De jongen van de dieren die langdurig hebben blootgcstaan aan de onderzochte stoffen lijken nog meer last te hebben dan de ouderdieren. De experimenten met de jongen van de eerste worpen uit de testen met kaliumdichromaat cn 4-NQO lijken hierop te wijzen. Al kan er geen statistische toets op worden uitgevoerd: het lijkt erop dat het aantal jongen in de 2e generatie bij kaliumdichromaat vanaf 180 pg/l verlaagd is (t.o.v. 320 pg/l in de F generatie) en bij 4-NQO vanaf 10 pg/l (t.o.v. 32 pg/l in de F generatie). De vcrvolgexperimenten zullen dan ook zo worden uitgevoerd dat de voortplanting in deze F generatie wordt gevolgd in een proefopzet, vergelijkbaar met de standaard chronische test zodat er een significante effectconcentratic kan worden vastgesteld. In dezelfde experimenten zullen cometassays worden uitgevoerd met jongen van de F en de 2° generatie met en zonder blootstelling aan de stof na de geboorte van de dieren. Op deze wijze kan er mogelijk iets gezegd worden over de effecten van genotoxische stoffen op verdere generaties na blootstelling.

32

Ontwikkeling van de neutraalrood retentie test cn dc cometassay in Daphnia magna

Oppervlaktewaterconcentraten Het gebruik van de cometassay bij de beoordeling van oppervlaktewater concentraten lijkt wel wat extra informatie op te leveren. Uit de vergelijking tussen de LC-50 concentraties en de LOEC,^ kunnen we zien dat de monsters van Lobith, Eijsden, Maassluis en Schaar van Ouden Doel genotoxische stoffen bevatten, en het monster uit Rijnland niet. Het project Extractie, identificatie en karakterisering van onbekende stoffen is nog niet afgerond, en van de analyse van de stoffen in dc concentraten is nog niet veel bekend, maar de gegevens van de cometassay kunnen, samen met de analyses extra informatie geven over de identiteit van de genotoxische stoffen in oppervlaktewatermonsters. Bij een aantal cometassays van verdunningsreeksen van stoffen en mengsels trad een zogenaamd 'piekeffect' op: na duidelijk significante effecten trad bij blootstelling aan hogere concentraties van het mengsel minder effect op en verdween zelfs in een paar gevallen. Mogelijk worden hier de DNAreparatiemechanismen door het optreden van de schade opgereguleerd wat juist na 2 dagen blootstelling een lagere DNA-schade oplcvert (Devaux 1997, De Coen 1999).

33


6

Conclusies en aanbevelingen

Dc NRR test is als biomarker van algemene conditie in Daphnia magna bruikbaar als eindpuntsbcpaling na een bioassay, maar is dan niet gcvoeliger dan de parameter sterfte. Om de test minder variabel te krijgen in dit organisme is het aan te radon om een methode te vinden om een celsuspensie te verkrijgen van het darmepitheel. Dc bepaling kan goed dienst doen als biomarker van algemene conditie bij veldonderzoek. Juist door zijn toepasbaarheid in verschillende organismen is deze biomarker heel bruikbaar om de mate van toxische stress aan te geven in verschillende lagen van een ecosysteem. Het is dan nog wel noodzakelijk om dc gevoeligheid van meerdere soorten met de NRR test te bepalen. De cometassay is, als biomarker van genetische schade een gevoelige test en goed bruikbaar in Daphnia magna. Met name toegepast na in vivo blootstelling geeft de test reproduceerbare resultaten die ecologisch relevant lijken te zijn. Mede door zijn relatief eenvoudige uitvoerbaarheid, de mogelijkheid om dc test uit te voeren direct na een acute blootstelling en zijn snelle resultaten kan de test gebruikt worden om, naast acute toxiciteit ook genotoxiciteit te bepalen. Het uitvoeren van een test kost, inclusief verwerking van de resultaten, ongeveer 11 uur, verspreid over 4 dagen. In deze tijd kunnen maximaal 21 preparaten worden verwerkt. Dus bijvoorbeeld 9 monsters in duplo met 3 controlcpreparaten, of twee verdunningsreeksen van ccn monster met controlepreparaten. De test is ook heel goed bruikbaar om DNA-schade aan te tonen na in vitro blootstelling, niet zozeer in Daphnia maar wel in cellijnen. Hier is extra onderzoek zeker nog nodig. Vooral op het gebied van blootstellingsduur, temperatuur, omstandigheden en het gebruik van S9. Het voordeel van het gebruik van een cellijn is ook dat er meer gemanipuleerd kan worden met deze blootstellingsomstandigheden. Er kan, door het toevoegen van specifieke remmers van cellulaire processen, meer inzicht verkregen worden in de processen die DNA strengbreuken tot gevolg hebben bij blootstelling aan bepaalde stoffen. Daarnaast verdient het aanbeveling om het verband tussen de biomarkers en effecten op de populatiegroei bij Daphnia magna nog wat vender uit te zoeken. Experimenten, waarbij ook de jongen van de dieren worden gevolgd in het voortbrengen van nakomelingen en het optreden van DNAschade zullen meer inzicht geven in de correlatie tussen DNA-schade en populatiegroei. Vooral voor genotoxische stoffen kunnen experimenten, waarbij de voortgebrachte jongen gevolgd worden met en zonder voortgezette blootstelling, aangeven of de onderzochte stoffen schade toebrengen aan generaties nadat de blootstelling al verdwenen is. Voor de analyse van de verkregen preparaten in de cometassay zijn tegenwoordig kant en klare softwarepakkctten verkrijgbaar. Deze vergemakkelijken de analyse niet direct, maar maken de bepaling waarschijnlijk wel minder gevoelig voor 'operatorafhankelijke' variaties.

34


7

Literatuur

Belpaeme K., Delbeke K.. Zhu Land Kirsch-Volders M.(1996) Cytogenetic studies of PCB77 on brown trout (Salmo trutta fario) using the micronucleus test and the alkaline comet assay. Mutagenesis 11, 485-492. De Coen W.M.I. (1999) Energy metabolism. DNA damage and population dynamics of the waterflea Daphnia magna Straus under toxic stress. Proefschrift Universiteit Gent. De Coen W. and Janssen CR. (1999) Toxicant-induced DNA damage and oxidative stress in Daphnia magna. Submitted to Environmental Toxicology and Chemistry. Devaux A.. Pesonen M.; Monod G. (1997) Alkaline Cometassay in Rainbow trout hepatocytes. Toxicology in vitro 11,71-79. Eastman A. and Barry M.A.(1992) The origin of DNA Breaks: a consequence of DNA damage. DNA repair, or apoptosis? Cancer Investigation 10, 229-240. Erbes M., Wessler A.. Obst U and Wild A. (1997) Detection of primary DNA damage in Chlamidomonas reinhardtii by means of modified microgel electrophoresis. Environmental and molecular mutagenesis 30, 448-458. Fairbahn D.W., Olive P.L. and O'Neill K.L.(1995) The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research 339, 37-59. Giamberini Land Pihan JC. (1997) Lysosomal changes in the hemocytes of the freshwater mussel Dreissena polymorpha experimentally exposed to lead and zinc. Diseases of aquatic organisms 28. 221-227. Garman G.D., Anderson S.L.and Cherr G.N.(1997) Developmental abnormalities and DNA-protein crosslinks in sea urchin embryos exposed to three metals. Aquatic Toxicology 39, 247-265. Kooiman S.A.L.M. (1993) Dynamic energy budgets in biological systems. Cambridge University Press. 350 pp. Lotka A. (1913) A natural population norm. J. Wash. Acad. Sei. 3. 241-248. Koppen G. and Verschaeve L.(1996) The alkaline comet test on plants cells: A new genotoxicity test for DNA strand breaks in Viciafaba root cells. Mutation Research 360, 193-200. Lotka A.J. (1913) A natural population norm. Journal of the Washington Academy of Sciences 3, 241-248 and 289-293. Lowe D.M. and Pipe R.K.(1994) Contaminant induced lysosomal membrane damage in marine mussel digestive cells: an in vitro study. Aquatic Toxicology 30, 357-365. Lowe D.M.. Soverchia C.and Moore M.N.(1995) Lysosomal membrane responses in the blood and digestive cells of mussels experimentally exposed to fluoranthrene. Aquatic Toxicology 33. 105-112. Maas H, en Hendriks J. Werkplan voor het project Extractie. identificatie cn karakterisering van onbekende stoffen'. Projectnummer6100 1 431 11. Augustus 1998. Mitchelmore C.L.. Birmclin C . Livingstone D.R. and Chipman J.K. (1996) The detection of DNA strand breaks in isolated mussel (jVfytilus edulis L.) digestive gland cells using the 'comet' assay. In Press. Mitchelmore CL. and Chipman J.K.(1998) Detection of DNA strand breaks in brown trout (Salmo trutta) hepatocytes and blood cells using the single cell gel electrophoresis (comet) assay. Aquatic Toxicology 41, 161-182.

35

Ontw ikkeling van dc ncuUaalrood retentie test en de cometassay in Daphnia magna

Moore M.N.. Lowe DM.. Soverchis C . Haigh S.D.and Hales S.G.(1997) Uptake of a non-caloric, edible sucrose polyester oil and olive oil by marine mussels and their influence on uptake and effects of anthracene. Aquatic Toxicology 39, 307-320. Nacci D.E.. Cayula S. and Jackim E. (1996) Detection of DNA damage in individual cells of marine organisms using the single cell gel assay. Aquatic Toxicology 35. 197-210. RTWA (1998) Effectgerichte monitoring van de Rijn en de Maas. Projectgroep bio tests. Scott-Fordsmand J. J., Weeks J.M. and Hopkin S.P. (1998) Toxicity of nickel to the earthworm and the applicability of the neutral red retention assay. Ecotoxicology 7, 291-295. Shugart L.R. (1996) Application of the alkaline unwinding assay to detect DNA strand breaks in aquatic species. Techniques in Aquatic Toxicology 205-218. Struijs J., van der Kamp R. and Hogendoom E.A. (1998) Isolating organic micropollutants from water samples by means of XAD resins and supercritical fluid extraction. RIVM report 607602 001 Bilthoven. Theodorakis CW. D'Surney S. and Shugart L.R. (1994) Detection of genotoxic insult as DNA strand breaks in fish blood cells by agarose gel electrophoresis. Environmental toxicology and Chemistry 13. 1023-1031. Weeks J.M. and Svendsen C(1996) Neutral red retention by lysosomes from earthworm (Lumbricicus rubellus) coelomocytes: a simple biomarker of exposure to soil copper. Environmental Toxicology and Chemistry 15. 1808-1805. Wessler A. Erbes M. Krolla-Sidenstein P. and Obst U. (1998) Detection of DNA-damages in aquatic protozoa and algae by means of microgel electrophoresis (comet assay) for genotoxicological quality mapping of surface water. Acta Hydrochim. Hydrobiol. 26. 82-89. Williams D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. Wilson J.T,, Pascoe PL.. Parry J.M. and Dixon D.R. (1998) Evaluation of the comet assay as a method for the detection of DNA damage in the cells of a marine invertebrate, Mytilus edulis L. (Mollusca: Pelecypoda). Mutation Research 399, 87-95.

36


8

Bijlagen

8.1 Samenstelling van Daphniabuffer met BSA (DBSA) De buffer bevat per liter NaCl KCI CaCU MgS04.7H:0

2.7353 gram 0.0615 gram 0.6959 gram 0.2237 gram

(46.75 mM) (0.825 mM) (6.27 mM) (1.1 mM)

Deze oplossing kan lang bij kamertemperatuur bewaard worden. Voor gebruik wordt aan 100 ml buffer 0.5 ml 1M HEPES pH 7.4 en 100 mg Bovine Serum Albumine (BSA) toegevoegd. De buffer heeft een concentratie van 60 mM en een osmolaliteit van 132 mOsm/kg.

37


8.2 Samenstelling van de lvsisbuffer voor de cometassay Deze buffer wordt's ochtends voor de test gemaakt en koel weggezet. 100 ml buffer bevat: l%N-Lauroylsarcosine 2.5 M NaCl' 0.1 MEDTA 0.2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethaan

(= 1 gram) (= 14.63 gram) (=3.72 gram) (=0.121 gram)

De pH wordt gesteld op 10 met natronloog (25% en 5%). Hiema wordt dc buffer bij 4°C weggezet. Vlak voor gebruik wordt toegevoegd: 1.11 ml Triton-X-lOOen 11.1 ml DMSO.

38


8.3 Samenstelling van de electroforesebuffer voer de cometassay 1.5 liter buffer bevat: 18 gram NaOH 5.58 EDTA (natriumzout)

(= 0.3 M) (= 1 mM)

Deze buffer is lang houdbaar, wordt bij 4°C weggezet en pas vlak voor gebruik in de clectroforesebak gegoten.

39


8.4

Lotka's formule voor de berekening van de intrinsieke populatiegroei

Volgens Lotka (1913) kan de intrinsieke groei van een populatie op tijdstip x worden berekend volgens onderstaande formule:

oo

lx*mx*e

rm x -r*x

=1

x=0

waann: lx = het gedeelte overlevende dieren op tijdstip x van een originele cohort, allcmaal geboren op tijdstip 0. Mx = het gemiddelde aantal nakomelingen, voortgekomen uit een dier met de leeftijd in de range (x x+1). Bij de schatting van de intrinsieke populatiegroei in een chronische toxiciteitstest met 10 Daphnia's per concentratie van een stof wordt als volgt te werk gegaan: - De 10 dieren worden in 3 groepen verdeeld: 2 groepen van 3 en een groep van 4 dieren. - Na afloop van de blootstelling als overleving en reproduktie per dier zijn bepaald wordt per groep een intrinsieke populatiegroei bepaald. Hieruit volgen voor een concentratie van een stof drie schattingen van rm. - Uit deze drie schattingen kan een gemiddelde worden berekend en de schattingen kunnen worden gebruikt in Williams test om eventuele significante verschillen tussen de gevonden rm waarden aan te tonen.

40

Groot, Astrid de Van: Groot, Astrid de Verzonden: maandag 20 december 1999 11:06 Aan: Westphal, Roland CC: BIBLIOTHEEK RIZA Onderwerp: bekkenwin digitaal Beste Roland, Hebjij het werkdocument 99.161X op diskette. Zoja, wil je deze diskette dan voorzien van werkdocumentnr. 99.161X en naar de bieb sturen. Met vriendelijke groet, Astrid de Groot

Ontwikkeling van een neutraal rood retentie test en de cometassay in Daphnia magna: biomarkers van fysieke conditie en genetische schade T X

Recommend Documents