Laboratorium en synchrotron X-straal microspectroscopie en beeldvorming op Daphnia magna

Laboratorium en synchrotron X-straal microspectroscopie en beeldvorming op Daphnia magna

Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door

Inge LINDEMANN

Academiejaar 2009-2010

Promotor: Prof. Dr. Laszlo Vincze Copromotor: Dr. Bjo¨rn De Samber

Voorwoord Hier komt het voorwoord

i

Inhoudsopgave Voorwoord

i

1 Inleiding en doelstelling

1

2 Laboratorium en synchrotron X-straal spectroscopie 2.1 Introductie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Eigenschappen van elektromagnetische straling . . . . . . 2.3 Het elektromagnetisch spectrum . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Röntgenstraling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1 Karakteristieken van X-stralen . . . . . . . . . . . 2.4.2 Bronnen van X-stralen . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3 Monochromatisatie van de X-straling . . . . . . . 2.4.4 Focussering van X-stralen . . . . . . . . . . . . . 2.4.5 Interactie van X-straling met het monster . . . . 2.4.6 Detectie van de X-stralen . . . . . . . . . . . . . 2.4.7 Algemene opbouw van een synchrotron beamline .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

3 Laboratorium micro-XRF 3.1 Introductie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Werkingsprincipe van EDAX Eagle-III . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Resolutie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Theorie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Verandering van de resolutie voor verschillende elementen . 3.3.3 Invloed van het voltageverschil van de X-straalbuis. . . . . 3.3.4 Gebruik van filters. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Detectielimiet en het verband met kwantitatieve analyse . . . . . 3.4.1 Theorie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Toepassing op SRM ‘bovine liver’. . . . . . . . . . . . . . . Homogeniteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aanwezigheid van nuggets achterhalen . . . . . . . . . . . Berekening Detectielimiet . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5 Daphnia magna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.1 Introductie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

3 3 3 4 5 5 5 15 16 20 24 26

. . . . . . . . . . . . . . .

29 29 29 30 30 31 32 33 37 37 38 40 46 53 58 58

Inhoudsopgave 3.5.2

3.5.3 3.5.4

iii Fluorescentie-intensiteitsmeting. De 2D-coupe. . . . . . . . . . . De volledige Daphnia magna. . Oppervlakteconcentratie . . . . Clusteranalyse . . . . . . . . . .

4 Synchrotron micro-XRF metingen 4.1 Introductie . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Beamline L te HASYLAB . . . . . . 4.3 Keuze en voorbereiding monsters . . 4.4 De proefopstelling . . . . . . . . . . . 4.4.1 Onderzoek naar de focussering 4.4.2 Resolutie van de CCD-camera 4.5 Resultaten . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1 NIST SRM 1577b . . . . . . . 4.5.2 Daphnia . . . . . . . . . . . . De Intensiteitsdistributie . . . De oppervlakteconcentraties . 4.6 Tomografie . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . van de . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . straling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . .

59 59 61 65 66

. . . . . . . . . . . .

71 71 71 72 73 74 76 79 79 81 81 85 86

Hoofdstuk 1 Inleiding en doelstelling Dit onderzoek tracht ecotoxicologische vragen te beantwoorden omtrent het opnemen van zware metalen door het modelorganisme Daphnia magna. De watervlo Daphnia magna wordt vaak gebruikt in onderzoek naar de kwaliteit van water. De bedoeling is biotic ligand models te ontwerpen die door onder andere de metaalconcentratie in rekening te brengen, de toxiciteit van het water voor de flora en fauna voorspellen. Met behulp van micro-XRF-spectroscopie kan de elementdistributie in de verschillende organen van Daphnia magna achterhaald worden. Zo kan bepaald worden in welke mate en via welke weg de metalen worden opgenomen. Dit bevordert het inschatten van het effect dat een bepaalde metaalconcentratie in het water zal hebben op organismen zoals de Daphnia magna. In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van XRF-metingen met de EDAX Eagle-III, een laboratoriumtoestel, en de synchrotron HASYLAB te Duitsland. Deze metingen werden uitgevoerd op Daphnia magna’s geleverd door de vakgroep ‘Toegepaste ecologie en milieubiologie’. Naast referentiestalen werden ook monsters blootgesteld aan verschillende metalen onderzocht. Er werd getracht de meettechniek op biologische monsters te optimaliseren op zowel het laboratoriumstoestel als de synchrotron. In het eerste deel van dit werk wordt een theoretische toelichting gegeven bij elektromagnetische straling en X-straling in het bijzonder. De gebruikte Röntgenstraalbronnen, de X-straalbuis en de synchrotron, worden in detail bekeken. Vervolgens worden de verschillende wijzen van monochromatisatie en focussering van de verkregen stralenbundel onderzocht en gekeken welke mogelijke interacties de straling met het monster kan hebben. Om dit deel te eindigen wordt een woordje uitleg gegeven bij de detectie van het verkregen signaal en een overzicht gegeven van een volledige beamline. Het tweede deel, genaamd ‘Laboratorium micro-XRF’ overloopt de resultaten verkregen met de EDAX Eagle-III. De instrumentele parameters werden in termen van de resolutie onderzocht met behulp van draadmetingen. Hiernaast werd ook de detectielimiet zo ver mogelijk geoptimaliseerd met behulp van metingen op het standaard-referentiemateriaal bovine liver SRM 1577c. Op hetzelfde monster werd een heterogeniteitsstudie uitgevoerd, zodat de voorgaande berekeningen naar waarde konden geschat worden. Vervolgens werd de opgedane kennis toegepast op twee verschillende Daphnia magna’s. 1

Hoofdstuk 1. Inleiding en doelstelling

2

Hierop werd naast kwantitatieve analyse van de elementdistributie, principale componenten clusteranalyse uitgevoerd. Zo werd de verdeling van de elementen over de verschillende organen onderzocht en werd getracht patronen te herkennen. In het derde onderdeel wordt dieper ingegaan op de metingen met de synchrotron. Met behulp van een CCD-camera werd de resolutie bepaald. Er werd ook uitvoerig onderzoek gedaan naar de combinatie van de twee verschillende detectors. Op de synchrotron werden vier verschillende Daphnia magna’s opgemeten: twee genotypes met elk een referentiestaal en een monster blootgesteld aan metalen. Er werden elementdistributies opgesteld en de oppervlakteconcentratie van Zn in deze vier monsters werd vergeleken. Hiernaast werd ook een 3-dimensionaal onderzoek naar de elementdistributies gedaan met behulp van tomografie. Het laatste hoofdstuk omvat een samenvatting en besluit van de verkregen resultaten.

Hoofdstuk 2 Laboratorium en synchrotron X-straal spectroscopie 2.1

Introductie

In dit hoofdstuk worden de eigenschappen van elektromagnetische straling en X-stralen in het bijzonder besproken. Het opwekken van X-stralen met behulp van een X-straalbuis en in een synchrotron wordt uitgelegd in deel 2.4.2. De gegenereerde X-straalbundel wordt gemonochromatiseerd en gefocust, zodat ze de gewenste eigenschappen heeft voor interactie met het monster. De belangrijkste vormen van interactie (Compton en Rayleigh verstrooiing en het foto-elektrisch effect) worden vervolgens uitgelegd. Door deze interacties zal het monster fluoresceren en deze straling kan gedetecteerd worden met behulp van onder andere solid state detectors, silicon drift detectors en charge coupled devices.

2.2

Eigenschappen van elektromagnetische straling

Elektromagnetische straling bestaat uit een voorplanting van elektrische en magnetische oscillaties die loodrecht ten opzichte van elkaar gepositioneerd zijn. Er is geen medium nodig voor deze voortplanting. Elektromagnetische straling in het vacuum heeft een snelheid gelijk aan de lichtsnelheid. Figuur 2.1 toont een schematische voorstelling van een elektromagnetische golf. Hierop ~ en de magnetische veldvector B ~ loodrecht is waar te nemen dat de elektrische veldvector E op elkaar staan en in fase zijn. Deze vectoren kunnen als volgt beschreven worden: ~ = E~0 sin(ωt - ~k~r) E ~ = B~0 sin(ωt - ~k~r ) B Waarbij ω de hoekfrequentie is, en afhankelijk van de frequentie f van de golf volgens: ω=2πf 3

Hoofdstuk 2. Laboratorium en synchrotron X-straal spectroscopie

4

Figuur 2.1: de elektromagnetische golf

Een elektromagnetische golf kan zich dus zonder verlies aan energie in het vacuum voortbewegen. Dit is een rechtstreeks gevolg van de 4 wetten van Maxwell: ∇·D=ρ

(2.1)

∇·B=0

(2.2)

∇×E+

∂B =0 ∂t

(2.3)

∂D =J (2.4) ∂t Hierin staat D voor de diëlektrische verplaatsing en H voor de magnetische veldsterkte. Het symbool ρ staat voor de elektrische ladingsdichtheid en J voor de elektrische stroomdichtheid. Vergelijking 2.1 beschrijft hoe een elektrisch veld opgewekt wordt door elektrische ladingen, dit is de wet van Gauss. Een dipool kan een magnetisch veld opwekkken volgens de magnetische wet van Gauss (Vergelijking 2.2. De wet van Faraday (Vergelijking 2.3) en de wet van Ampère (Vergelijking 2.4) geven respectievelijk weer hoe een veranderend magnetisch veld een elektrisch veld genereert en omgekeerd hoe een magnetisch veld wordt opgewekt door een veranderend eleketrisch veld. Als deze 4 wetten worden bekeken wordt het duidelijk dat een EM-golf zichzelf in stand houdt door een wisselwerking tussen de veranderende elektrische en magnetische velden. ∇×H−

2.3

Het elektromagnetisch spectrum

Om elektromagnetische straling te karakteriseren wordt gebruik gemaakt van de golflengte λ, de frequentie f of het golfgetal k. Deze eerste twee zijn met elkaar verbonden via de lichtsnelheid c, deze relatie wordt beschreven door de golfvergelijking: λ·f =c


5

Het golfgetal k kan berekend worden met behulp van de golflengte en geeft aan hoeveel golven (golflengtes) er per lengte-eenheid voorkomen. k=

2π λ

Het golfgetal is de grootte van ~k , een vector in de voortplantingsrichting van de golf ~ x B. ~ gegeven door de vector E Met behulp van deze 3 stralingswaarden kan er een onderscheid gemaakt worden tussen verschillende golven. Figuur 2.2 toont een overzicht van het elektromagnetisch spectrum.

Figuur 2.2: het elektromagnetisch spectrum

Spectroscopische analysemethoden omvatten het meten van de elektromagnetische straling die geabsorbeerd, verstrooid en geëmiteerd wordt door een monster.

2.4

R¨ ontgenstraling

2.4.1

Karakteristieken van X-stralen

In dit werk werd gebruik gemaakt van X-straling of Röntgenstraling om spectroscopische experimenten uit te voeren. Dit is straling in het energiebereik van 0,1 tot 100 keV, wat ◦ overeenkomt met een golflengte van 0,1 tot 100 A.

2.4.2

Bronnen van X-stralen

In dit onderzoek werden 2 bronnen van Röntgenstraling aangewend: 1. De X-straalbuis In de X-straalbuis of Röntgenbuis, schematisch weergegeven in Figuur 2.3, zijn er 2 belangrijke processen die zorgen voor de productie van X-straling:


6

• Remstraling of Bremsstrahlung. • Karakteristieke straling opgewekt door electron impact ionisatie, gevolgd door X-straal fluorescentie (XRF). Deze vinden tegelijkertijd plaats en geven aanleiding tot een X-straalbuis excitatiespectrum.

Figuur 2.3: de R¨ ontgenbuis

A. Remstraling Bremsstrahlung is straling opgewekt als een geladen deeltje een verandering in versnelling ondergaat. Dit kan een acceleratie of een deccelaratie zijn. In een Röntgenbuis wordt dit principe gebruikt voor het produceren van X-straling. Elektronen afkomstig van een filament worden sterk versneld door een elektrisch veld tussen de kathode en anode. Bij botsing met de anode verlaagt de snelheid van de elektronen sterk. De verloren kinetische energie wordt voor 99 % omgezet in warmte, slechts een kleine fractie wordt omgezet in Röntgenstraling. Om deze grote hoeveelheid aan warmte op te vangen en zo de levensduur van de X-straalbuis te garanderen, wordt de anode gekoeld (water- en/of luchtkoeling) en wordt de anode vervaardigd uit een metaal met een hoog smeltpunt, zoals W, Mo en Rh. De continue Bremmstrahlung component in het spectrum van een X-straalbuis kan waargenomen worden in Figuur 2.4. De maximale bereikte X-straalenergie hangt af van het voltage-verschil tussen anode en kathode in de X-straalbuis. In het geval van Figuur 2.4 is dit ongeveer 45 kV. B. Karakteristieke straling • Theorie Bij een botsing van een hoog energetisch vrij elektron met een atomair elektron uit de binnenste elektronschillen kan, indien de kinetische energie van het inkomende elektron hoger is dan de bindingsenergie van dat atomair


7

Figuur 2.4: Het spectrum van de remstraling gegenereed door een X-straalbuis

elektron, het atoom ge¨ıoniseerd worden door uitstoting van dit elektron. Dit wordt electron impact ionisatie genoemd. Er onstaat hierbij een ‘gat’ in de elektronenmantel. Deze onstabiele toestand zal zich snel herstellen door verval van een hoger gelegen elektron in de lager gelegen vrije positie via inner-shell elektrontransities. Hierbij zal de overtollige energie van het elektron omgezet worden in de vorm van X-straling, dit fenomeen wordt X-straalfluorescentie (XRF) genoemd. Deze overtollige energie kan echter ook overgedragen worden op een hoger gelegen elektron dat vervolgens het atoom verlaat als een Auger-elektron. Beide processen, X-straal fluorescentie en productie van Auger-elektronen, zijn terug te vinden in Figuur 2.5. De karakteristieke X-straling heeft een specifieke golflengte naargelang het energieverschil tussen de verschillende elektronenschillen. Dit is typerend voor elk element. De golflengte (of energie) van de uitgezonden straling hangt af van het energieverschil tussen de elektronschillen. Met name de schil met het elektrongat en de schil waar het elektron dat het lager gelegen elektron-gat opvult van afkomstig is. Het spectrum wordt dan ook terecht een lijnspectrum genoemd. Het volledige X-stralen spectrum van een X-straalbuis is dus combinatie van de remstraling en de karakteristieke straling. (Figuur 2.7) De karakteristieke lijnen zijn gesuperponeerd op een achtergrond van bremsstrahlung. • Wet van Moseley


8

Figuur 2.5: Model van de productie van karakteristieke X-straling en Auger elektronen via elektron impact ionisatie.

Moseley heeft aangetoond dat de karakteristieke straling van de verschillende elementen een specifiek √ patroon kent [1]. Als het atoomgetal Z wordt uitgezet ten opzichte van f requentie, dan volgen de karakteristieke stralingen van de verschillende elementen een rechte lijn zoals gevisualiseerd in Figuur 2.6. De wet van Moseley legt het verband tussen de energie van de geëmiteerde straling en het atoomgetal Z: E(keV ) = K(Z − 1)2 waarbij K een constante is die 1, 042 × 10−2 bedraagt voor de K-schillen, 1, 494 × 10−3 voor de L-schillen en 3, 446 × 10−4 voor een M-schil. • Selectieregels De overgang van elektronen van de ene op de andere schil die karakteristieke X-straling tot gevolgd heeft, is onderworpen aan selectieregels. Deze selectieregels bepalen welke elektrontransities mogelijk zijn om van een bepaalde toestand naar een andere te gaan. De meest intense lijnen volgen uit de elektrische dipool selectieregels, de magnetische dipool en de elektrische quadrupool selectieregels dragen bij aan zwakkere signalen in het spectrum. Lijnen die eigenlijk niet zouden mogen voorkomen volgens de elektrische dipool selectieregels worden soms ‘verboden lijnen’ genoemd [2]. • Notatie De meest gebruikte methode om de verschillende karakteristieke X-stralen van een element aan te duiden is de Siegbahn-notatie. Hierbij wordt het


9

Figuur 2.6: Het Moseley-plot voor karakteristieke X-straling

lager gelegen energieniveau waar de oorspronkelijke excitatie ontstaan was aangeduid met de letter overeenkomend met deze schil: K,L,M,... Dit wordt gevolgd door een Griekse letter die aanduidt vanuit welke schil de elektronentransitie is gebeurd. Deze techniek van naamgeving wordt echter verweten onvolledig en onsystematisch te zijn, en daardoor minder duidelijk. De officiële IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) methode is simpel en makkelijk toe te passen op alle mogelijke transities. Hier wordt de letter van de lager gelegen schil opgevolgd door de letter overeenkomend met het hoger energieniveau [3]. Een overzicht van de verschillende vormen om karakteristieke straling te benoemen kan gevonden worden in Tabel 2.1. Een voorbeeld van de mogelijke elektronentransities en hun benamingen kan gevonden worden in Figuur 2.8


10

Figuur 2.7: Het volledige spectrum van een Rh-X-straalbuis. Tabel 2.1: De Siegbahn notatie

Lager energieniveau Hoger energieniveau Siegbahn notatie K(1s) L3 (2p3/2 ) Kα1 K(1s) L2 (2p1/2 ) Kα2 K(1s) M3 (3p3/2 ) Kβ1 L3 (2p3/2 ) M5 (3d5/2 ) Lα1 L2 (2p1/2 ) M4 (3d3/2 ) Lβ1 M5 (3d5/2 ) N7 (5p3/2 ) M α1

IUPAC notatie K − L3 K − L2 K − M3 L3 − M5 L2 − M4 M5 − N7

2. Synchrotronstraling • Historische aspecten Een synchrotron is de meest intense bron van X-straling gemaakt door de mens. Figuur 2.9 geeft een plattegrond van een typische synchrotron. De eerste generatie synchrotrons waren niet bedoeld als bron van straling, maar werden gebruikt in het domein van de deeltjesfysica. De geproduceerde X-stralen werden als sterk nadelig ondervonden omdat hierdoor de energie van de versnelde deeltjes afnam. In de tweede generatie werd de geproduceerde straling niet meer als parasitair ondervonden, maar werd juist getracht de intensiteit ervan te verhogen. Zo onstond de derde generatie aan synchrotrons. Hierin worden X-stralen niet enkel door bending magnets opgewekt, maar ook door insertion devices. Waardoor de straling nog intenser is. • Algemene werking


11

Figuur 2.8: De elektron-energieniveaus van barium (Z=56).

Geladen deeltjes (bijvoorbeeld elektronen of protonen) worden lineair versneld met een linear accelerator (linac). Daarna worden ze verder versneld in een booster-synchrotron vooraleer ze ge¨ınjecteerd worden in de storage ring. De injectie gebeurt in pakketjes, waardoor de deeltjes zich door de synchrotron voortbewegen in groepjes of bunches. De storage ring is een vacu¨ um ring waarin de geladen deeltjes circuleren. Ze worden hierbij op regelmatige afstand gefocust door quadrupool magneten. De deeltjes worden op hun cirkelvormige baan gehouden door middel van een sterk magnetisch veld gegenereerd in buigmagneten of bending magnets. De energie die de geladen deeltjes verliezen bij elke richtingsverandering wordt terug aangeleverd door middel van radiofrequency cavities, waarvan een afbeelding en schema kunnen teruggevonden worden in Figuur 2.10. Deze geven de deeltjes een energiestoot hoger dan hun oorspronkelijke verlies, omdat ze door deze versnelling weer EM-straling zullen uitzenden. De radiofrequency cavities leveren een longitudinaal elektrisch veld met een frequentie tussen 100 kHz en 10-30 GHz. Als een deeltje met lading e door een caviteitsopening passeert, zal het een versnelling ∆E ondergaan: ∆E = e∆V met ∆V het voltageverschil over de caviteitsopening: ∆V = V0 sin(ωrf t + Φ) ωrf is de radiofrequency-frequentie, Φ de fasehoek en V0 het effectieve voltage. De caviteitsopeningen worden gesynchroniseerd door de frequentie af te stellen


12

Figuur 2.9: Schema van een synchrotron. Bron: http://www.aps.anl.gov/

op de snelheid van de deeltjes die erdoor passeren. Deeltjes die passeren zullen versneld worden door het elektrisch veld en vervolgens afgestoten door het magnetisch veld, dit zorgt voor een sterke versnelling [4]. Een synchrotron is echter geen perfect vacu¨ um, er zijn enkele positieve ionen in aanwezig. Dit zorgt ervoor dat elektronen verloren gaan en de intensiteit van de opgewekte straling daalt. Daarom wordt er regelmatig een injectie van nieuwe deeltjes uitgevoerd, zodat de intensiteit terug op zijn beginpunt komt. • Opwekken van X-straling Wanneer geladen deeltjes (zoals elektronen of protonen) een richtingverandering ondergaan, zenden ze straling uit. De maximale energie van deze straling hangt af van de snelheid van de deeltjes. In een synchrotron halen de deeltjes 99,99% van de lichtsnelheid, dit zorgt voor elektromagnetische straling tot ver in het X-straalgebied: synchrotronstraling. Een richtingsverandering van de geladen deeltjes wordt veroorzaakt door bending magnets en insertion devices, dit laatste kunnen undulators of wigglers zijn.


13

Figuur 2.10: Afbeelding en werkingsprincipe van een radiofrequency cavity.

A. Bending magnets Een bending magnet is een dipoolmagneet die een homogeen magnetisch veld opwekt. Geladen deeltjes die in dit veld terechtkomen zullen, onder invloed van de Lorenzkracht, een richtingsverandering ondergaan loodrecht op het magnetisch veld en collineair met de oorspronkelijke beweging van het deeltje. Een opeenvolging van bending magnets zorgt voor de circulaire beweging. B. Wiggler Een wiggler is een opeenvolging van dipoolmagneten, waarbij het magnetisch veld alterneert tussen de verschillende magneten. Elektronen die deze magnetische velden doorkruisen zullen oscilleren en bij elke richtingverandering straling uitzenden, zoals weergegeven in Figuur 2.11. Een belangrijke parameter bij insertion devices is K, deze karakteriseert de beweging van het deeltje: eBλu K = 2πm ec met e de lading van het deeltje, B het magnetisch veld, λu de golflengte van het magnetisch veld, me de rustmassa van het deeltje en c de snelheid van het licht. Als K1 zal het deeltje weinig oscilleren, de straling zal sterk


14

Figuur 2.11: Werkingsprincipe van de insertion devices

onderhevig zijn aan interferentie waardoor de energiebanden in het spectrum smal zijn. Bij wigglers is K1, de amplitude van de oscillatie is groot en de straling afkomstig van elke periode sommeert bij de rest. Dit geeft een breed energiespectrum, wat in deel 2 van Figuur 2.12 afgebeeld staat. De straling afkomstig van een wiggler is intenser dan een bending magnet. Bezit het x perioden, dan zal het 2 keer intenser zijn. C. Undulator Bij undulators is K≈1. De intensiteit afkomstig van een undulator is groter dan die van een bending magnet of wiggler. Als de undulator x perioden bezit, zal het x2 intenser zijn dan een bending magnet. Dit tengevolge van de constructieve interferentie van de verschillende perioden. • Eigenschappen van synchrotronstraling Synchrotronstraling heeft verschillende voordelen ten opzichte van X-stralen opgewekt door een X-straalbuis: – Een hele hoge intensiteit, vele grootte-ordes hoger gelegen dan de andere X-straalbronnen, 106 tot 107 keer hoger dan de X-straalbuis. – Mogelijkheid het spectrum van de synchrotron te monochromatiseren in een groot spectraal bereik van infrarood tot harde X-stralen. – Natuurlijke collimatie, waardoor een veel kleiner oppervlak wordt belicht.


15

Figuur 2.12: Schematische voorstelling van de ’opening angle’ van een bending magnet, wiggler en undulator en hun overeenkomstig spectrum.

– Hoge mate van polarisatie. – Hoge mate van coherentie in de straal. – De gepulseerde tijdstructuur. De nadelen: – Beschikbaarheid van een synchrotronfaciliteit. – Toegankelijkheid van een synchrotronfaciliteit. – Kosten van een meting.

2.4.3

Monochromatisatie van de X-straling

Een monochromator wordt gebruikt om een golflengte-gebied uit het spectrum van de inkomde straling te selecteren door middel van het principe van Bragg. Wanneer X-stralen invallen op een kristal, zal er bij een bepaalde hoek θ constructieve interferentie optreden van een bepaalde golflengte λ (voor n=1). De wet van Bragg toont aan onder welke omstandigheden de interferentie constructief is, dit principe wordt ge¨ıllustreerd in Figuur: 2.13. Indien het faseverschil een veelvoud is van 2dsinθ, dan treedt er constructieve interferentie op: nλ = 2dsinθ Waarbij λ de golflengte van de straling is, d is de roosterafstand en θ is de hoek tussen de inkomende straling en de vlakken van het kristalrooster. Men krijgt een set van harmonieken, verschillende golflengtes overeenkomend met de verschillende n-waarden. De


16

meest intense hiervan is degene waarbij n=1. Door de hoek θ te veranderen is het mogelijk om een andere set van harmonieken te verkrijgen.

Figuur 2.13: De wet van Bragg: constructieve interferentie op roostervlakken.

De twee meest gebruikte vormen van monochromators zijn de perfect crystals, en de multilayer monochromators. A. Perfect crystal monochromator Deze kristallen hebben een zeer goede energieresolutie (∆E/E ≈ 10−4 ), wat ze geschikt maakt voor experimenten waarbij een uitstekende energieresolutie vereist is zoals X-straal absorptie-spectroscopie (XAFS). Er zijn doorgaans 2 kristallen achter elkaar opgesteld. Door de hoek tussen beide goed te kiezen zal de uitgaande, gemonochromatiseerde bundel, parallel zijn aan de inkomende witte bundel, wat de opstelling vereenvoudigd, zoals ge¨ıllustreerd in Figuur: 2.14. Door de tweede spiegel wat uit fase te stellen, is het mogelijk om alleen de hoofdharmoniek te selecteren (n=1), wat wel met een licht verlies aan intensiteit gepaard gaat. Perfect crystal monochromators zijn meestal vervaardigd uit een perfect kristal van Si(1 1 1) of Si(3 1 1). B. Multilayer monochromator Deze vorm van monochromators voorzien een veel hogere flux dan perfect crystal monochromators, hoewel hun energieresolutie lager is. (∆E/E ≈ 1 − 2.10−2 ) Deze eigenschappen maken ze zeer geschikt voor XRF-spectroscopie. Ze bestaan uit dunne lagen van materialen met alternerende elektronendensiteit (Figuur 2.15).

2.4.4

Focussering van X-stralen

Vaak is het wenselijk om X-stralen te focussen door middel van geavanceerde optica. Deze kunnen bestaan uit 1 of meer spiegels die plat, half-gebogen of volledig gebogen zijn. Hiernaast worden ook polycapillaire optica, compound refractive lenses en Fresnel zone plates gebruikt.


17

Figuur 2.14: Perfect crystal monochromator

Figuur 2.15: De multilayer monochromator

A. Polycapillaire optica (PC)[5] [6] Polycapillaire optica bestaan uit duizenden glasvezels met elk een interne diameter van 3-10 µm. Door totale reflectie in de vezels wordt de straling gefocust in een focaal punt. Zolang de invalshoek kleiner is dan de kritische hoek zulllen de X-stralen zich verder voortbewegen door de vezel. Deze kritische hoek verkleint bij stijging van de energie van de invallende straling. Er zijn 2 veelgebruikte vormen van polycapillaire optica naargelang de toepassing: vollenzen en halflenzen. De vollenzen wordt gebruikt om de straling afkomstig van een X-straalbuis met puntbron te focussen tot een micropunt, dit wordt weergegeven in Figuur 2.16-a. De halflenzen worden gebruikt om een parallelle bundel afkomstig van een synchrotron te focussen tot een punt, wat afgebeeld staat in Figuur 2.16-b , of omgekeerd om een parallelle bundel vanuit een X-straalbuis te bekomen, zoals


18

in Figuur 2.16-c. Polycapillaire optica beschikken over een resolutie van 5 - 100 µm, met apertuur tot 1µm)[7].

Figuur 2.16: Schematische voorstelling van de 3 soorten polycapillaire optica.

B. Kirkpatrick-Baez Spiegel(KB) KB spiegels zijn eveneens gebaseerd op het principe van totale reflectie. Het zijn spiegels gemaakt van Si-kristallen die meestal gecoat worden met goud om ze voldoende reflecterend te maken. Om zo weinig mogelijk intensiteitsverlies te hebben van de straling moet de invalshoek van de straling kleiner zijn dan de kritische hoek. Dit heeft als gevolg dat de invalshoek vaak tot onder 0,5◦ moet zijn. Er zijn 2 veel voorkomende geometrieën voor een Kirkpatrick-Baez-systeem: Eén enkele spiegel kan in 2 richtingen gebogen zijn, in de lengte en in de breedte. Op Figuur 2.17 staan r en R voor de radii van de buigingshoeken, hierbij is r ± 10 cm is en R enkele kilometers .

Figuur 2.17: Kirkpatrick-Baez spiegel: dubbel gebogen


19

De focale afstand f moet gelijk zijn voor de lengte en de breedte. Dit heeft als gevolg dat de hoek α vastligt door de keuze van r en R: fbreedte =

r 2cosα

flengte =

Rcosα 2

cosα =

√

rR

Een nadeel van deze opstelling is dat het spiegeloppervlak perfect ellipsisch moet zijn om afwijkingen te vermijden, dit is moeilijk te maken daar de buiging in 2 richtingen is. Een makkelijkere opstelling zijn de twee halfgebogen spiegels, die elk de straal in een andere richting focust (Figuur 2.18).

Figuur 2.18: Kirkpatrick-Baez spiegel: enkel gebogen

De KBs hebben als voordeel dat ze voor een hoge resolutie (tot 50-100 nm), een hoge flux en mogelijk gelijktijdige monochromatisatie zorgen. Om naast de focussering tegelijk ook monochromatisatie te verkrijgen, wordt gebruik gemaakt van Kirkpatrick-Baez optica gemaakt van multilagen. Dit zijn afwisselende lagen van silicoon en wolfraam. Reflectie is hier een vorm van Bragg diffractie. Deze toepassing staat toe grotere hoeken te gebruiken dan bij gewone spiegels, tot wel 1◦ . C. Compound refractive lenses (CRL) [8] Naast spiegels kunnen ook lenzen gebruikt worden. Focusing gebeurt hierbij op basis van refractie. De focale afstand f van een lens wordt als volgt beschreven: f=

R 2n−1

In deze lenzenmakersformule staat n voor de brekingsindex van het materiaal waaruit de lens gemaakt is en R voor de straal van de buiging in de lens zoals afgebeeld in Figuur 2.19. Bij een synchrotronopstelling komt de straling uit het harde Röntgenstralen-gebied, voor deze soort straling ligt de brekingsindex dicht bij 1. Hierdoor is de refractie van één enkele lens te zwak. Daarom worden veel lenzen achtereen gezet, een opstelling die compound refractive lens wordt genoemd. Hierdoor is focussering door middel van refractie wel mogelijk en worden de brekingsindexen gecombineerd zodat de focale afstand verkleint van enkele meters tot een 10-tal centimeter.

Hoofdstuk 2. Laboratorium en synchrotron X-straal spectroscopie 1 f

=

1 f1

+

20

1 f2

Figuur 2.19: Werkingsprincipe compound refractive lens

Als materiaal wordt vaak gekozen voor beryllium of aluminium (lage Z-elementen) zodat absorptie minimaal is. R moet klein blijven (10-100 µm) om de lage refractie van de harde X-stralen te compenseren. Focussering door middel van CRLs heeft als voordeel een sub-µm resolutie te bereiken en minder onderhevig te zijn aan temperatuursschommelingen. D. Fresnel zone plates (FZP) [9] Fresnel zone plates maken gebruik van diffractie in plaats van refractie om X-stralen te focussen. Een schematische voorstelling en foto van de FZPs zijn weergegeven in Figuur: 2.20. De zone plates bestaan uit een set van radiaal symmetrische ringen die alternerend doorzichtig en ondoorzichtig zijn. De afstand tussen de ringen is zó dat het gediffracteerd licht constructief interfereert in het focaal punt. Om het werkingsprincipe hierachter te begrijpen moet teruggegaan worden naar het HuygensFresnel principe. Deze stelt dat elk punt in een voortbewegende golf als een nieuwe bron van golven kan optreden. Bij elke ring van de zone plates treedt dit effect op, al deze golven zullen interfereren en in het focaal punt zal constructieve interferentie optreden. Het voordeel van FZPs is dat een hoge resolutie van 50 nm kan bereikt worden, maar enkel in het zachte X-straalgebied (tot ± 10 keV).

2.4.5

Interactie van X-straling met het monster

X-stralen met energie 1-100 keV zullen vooral op 3 manieren met materie interageren: verstrooiing via Rayleigh of Compton en het foto-elektrisch effect. A. Rayleigh verstrooiing


21

Figuur 2.20: Fresnel zone plates

Rayleigh verstrooiing, een vorm van elastische verstrooiing, ontstaat doordat het invallend foton geen energie verliest bij de verstrooiing. Dit treedt vooral op bij Xstralen van lage energie en zwaardere atomen. De doorsnede σ, die de kans op de interactie weergeeft, toont dit aan: σ=

2π 5 d6 d 6 ( ) 3λ4 2

waarbij d de diameter van het atoom, n de refractieve index van het element en λ de golflengte van het invallend licht is. B. Compton verstrooiing Bij Compton of inelastische verstrooiing zal het foton een deel van zijn energie afgeven aan elektronen op de buitenste schillen (de valentie-elektronen). Het Compton foton zal dan verstrooid worden in een andere richting en met een lagere energie Ecompton zijn weg vervolgen: ECompton =

1+

E0 E0 (1−cosΘ) 2 me c

waarbij Θ de hoek is waaronder het foton wordt verstrooid, me de massa van het elektron, E0 de energie van het invallende foton en c de lichtsnelheid. Hoe hoger E0 , hoe hoger dus de kans dat het foton in een terugwaartse richting (Θ = 180◦ ) wordt verstrooid. Onder een hoek van 90◦ is Compton verstrooiing minimaal. Als Ecompton na de verstrooiing nog hoog genoeg is, kan het proces opnieuw plaatsvinden.


22

Compton verstrooiing treedt vooral op bij elementen met een lager atoomgetal. Bij deze botsing is er behoud van energie. De energie van het invallend foton E0 is gelijk aan de som van de energie van het uitgaande elektron Ee en het verstrooid foton ECompton . E0 = ECompton + Ee C. Het foto-elektrische effect Als het invallende foton al zijn energie afgeeft aan het elektron, zal dit fotoelektron het atoom verlaten met een kinetische energie Ef oto gelijk aan het verschil van de energie van het invallende foton hν en de bindingsenergie van het elektron Eb : Ef oto = hν − Eb Er onstaat dus een gat in de binnenste schillen van de elektronenmantel. Deze onstabiele toestand zal zich herstellen door een cascade van hoger gelegen elektronen. Hierbij onstaan er terug karakteristieke X-stralen of Augerelektronen. Het foto-elektrisch effect treedt op als de energie van het foton enkele eV tot KeV bedraagt. Een element met een hoger atoomgetal Z zal meer kans hebben op karakteristieke X-straling doordat de doorsnede stijgt: σ = constante

Zn E3

met n een getal tussen 4 en 5. E. Totaal van alle interacties Als een X-straal bundel met intensiteit I invalt op het monster zal het intensiteit verliezen door deze verschillende effecten. De totale verloren intensiteit dI kan berekend worden met behulp van de atomaire doorsnede σ [10]: dI = −Inσdx waarbij dx de afstand is die de straal in het monster heeft afgelegd, n het aantal atomen per volume-eenheid en σ de totale atomaire doorsnede (de kans dat een binnenkomend foton zal interageren). Door integratie kan de bovenstaande formule omgevormd worden zodat de overgebleven intensiteit doorheen een monster van dikte x verkregen kan worden: I(x) = I0 e−nσx


23

Daar σ afhankelijk is van de lineaire attenuatie coefficient µL volgens: σ=

µL n

kan ook afgeleid worden dat: I(x) = I0 e−µL x = I0 e−µρ ρx waarbij µρ de massa attenuatie coefficient is en ρ de dichtheid. Men kan de doorsneden van de individuele effecten optellen, hetzelfde geldt ook voor de attenuatie coefficienten. σtotaal = σf otoelektrisch + σRayleigh + σCompton µρ (E, Z) = τρ (E, Z) + σρ,R (E, Z) + σρ,C (E, Z) met τρ (E, Z) de fotoelektrische doorsnede, σρ,R (E, Z) de doorsnede van de Rayleigh verstrooiing en σρ,C (E, Z) de doorsnede van de Compton verstrooiing. Het is mogelijk om te bepalen welk effect in welke mate heeft bijgedragen aan het intensiteitsverlies via de doorsnede σ, door de verhouding van de individuele doorsnede of de totale attenuatie coefficient te bepalen. Het aandeel van Compton verstrooiing kan bvb. berekend worden als volgt: PCompton (E, Z) =

σC (E,Z) µ(E,Z)

De energie-afhankelijkheid van de individuele effecten kan teruggevonden worden in Figuur 2.21. Als men de verschillende attenuatiecoëfficiënten optelt, wordt er een tand-structuur bekomen, deze ‘absorption edges’ komen overeen met de bindinsenergieën van bepaalde elektronen. Voor een samengestelde stof zal de totale attenuatie coëfficiënt µρ afhangen van de fotonenergie E, het atoomgetal Z, en de gewichtsfracties wi : µρ,totaal (E, Z0 , ..., Zn ) =

Pn

i=1

wi µρ (E, Zi )


24

Figuur 2.21: De verschillende attenuatie coefficienten.

2.4.6

Detectie van de X-stralen

A. Ionisatiekamer Ionisatiekamers zijn kamers gevuld met gas dat onder invloed van ioniserende straling (zoals X-stralen) ionen zal vormen (Figuur 2.22). Deze ionen worden gecollecteerd door de elektroden aan weerszijden van de kamer die onder een hoog spanningsverschil staan. Met een voltagemeter kan de stroom, en dus de stralingsintensiteit, bepaald worden. Aan de hand van een ionisatiekamer is het mogelijk om te corrigeren voor de afnemende intensiteit van een synchrotronbundel of om X-straalabsorptie spectroscopie experimenten uit te voeren. B. Solid State Detector (SSD) Een SDD detector laat energie dispersieve detectie toe, wat inhoudt dat de fotonen gedetecteerd worden op basis van hun energie. X-straling valt in op een halfgeleiderkristal gemaakt van silicium of germanium. Via foto-elektrische absorptie, zullen


25

Figuur 2.22: De ionisatiekamer

elektron-gat-paren ontstaan. De energie van het invallende foton is proportioneel met het aantal elektron-gat-paren die er ontstaan. De elektronen en gaten zullen vervolgens naar de elektroden bewegen die aan weerszijden van het halfgeleider kristal zijn opgesteld, onder invloed van het elektrisch veld over de elektroden. Er wordt een voltage-puls gedetecteerd, die proportioneel is aan de fotonenenergie. Deze puls, die overeenkomt met een bepaalde energie, wordt vervolgens in een multi-channel analyzer gesorteerd. Dit principe is afgebeeld in Figuur 2.23. C. Silicon Drift Detector (SDD) [12] De silicon drift detectors zijn een vorm van SSD gemaakt van zeer zuiver silicium waarover een transversaal veld aangelegd is door een serie van ring-vormige elektroden. Deze elektroden kunnen teruggevonden worden aan 1 zijde van de detector (zie Figuur 2.24 ). De positieve bias van de elektroden verhoogt dichter naar de centrale, kleine verzamel-elektrode, de eind-anode. De potentiële energie voor de elektronen vervalt diagonaal van de achterkant van de detector naar de centrale verzamel-elektrode. Hierdoor zullen de elektronen ontstaan door de ionisaties veroorzaakt door de invallende fotonen, ‘driften’ naar de verzamel-elektrode. De opgemeten stroom in de verzamelelektrode wordt vervolgens omgezet in een voltage en versterkt door een field effect transistor (FET). Een SDD heeft een zeer goede energie resolutie en behoeft geen koeling met vloeibare stikstof. D. Charge coupled device (CCD) [13] Deze X-straalgevoelige camera zorgt voor omvorming van X-straling naar een afbeelding. Een schematische representatie van de werking van deze camera is afgebeeld in Figuur 2.25. Eerst worden de X-stralen opgevangen door een optisch transparant en luminescent scherm. Dit scherm bestaat uit een dunne film bestaande uit Y3 Al5 O12 (YAG) gedopeerd met Ce van ongeveer 20 µm dik op een zuiver YAG kristal met


26

Figuur 2.23: Principe van de solid state detector [11]

± 250 µm dikte. Ce-gedopeerd YAG is een scintillator die bij inval van X-stralen, zichtbaar-licht zal uitzenden via luminescentie. Een charge coupled device vormt het zichtbare-licht afbeelding om in een elektrische signaal. Dit elektrisch signaal wordt vervolgens in beeld omgezet zonder tijdsvertraging.

2.4.7

Algemene opbouw van een synchrotron beamline

X-straling afkomstig van een bending magnet of insertion device zal eerst gemonochromatiseerd en gefocust worden met een methode gekozen in functie van de gewenste parameters. Dit gedeelte van de opstelling kan in Figuur 2.26 als de optics cabin teruggevonden worden. De X-straalbundel passeert vervolgens een ionisatiekamer en valt vervolgens in op het monster. Dit monster staat gemonteerd op een beweeglijk onderstel dat beweging in de eerste 4 dimensies toestaat. Er zijn 1 of meerdere detectors die de reactie van het monster op de X-straling registreren. In het voorbeeld weergegeven in Figuur 2.27 zijn dit een XRF detector, een XRD-detector en een CCD camera. De feedback van deze detectors wordt doorgestuurd naar de control cabin.


Figuur 2.24: Schema van de silicon drift detector

Figuur 2.25: Principe van de Charge Coupled Device [14]

Figuur 2.26: Schema van een beamline.

27


28

Figuur 2.27: Schema van een synchrotronopstelling. Bron: cursus Advanced spectroscopic methods of analysis gedoceerd door professor Laszlo Vincze

Hoofdstuk 3 Laboratorium micro-XRF 3.1

Introductie

In dit hoofdstuk wordt de µ-XRF metingen van het modelorganisme Daphnia magna op het EDAX Eagle-III µ-XRF toestel besproken. Hiervoor werden eerst de instumentele parameters gekarakteriseerd. De parameters werden in termen van de resolutie beschreven en er werd getracht deze zo ver mogelijk te optimaliseren. Ook de variatie van de detectielimiet door verschillende factoren werd onderzocht. Er werd een heterogeniteitsstudie uitgevoerd op het standaard referentiemateriaal ‘bovine liver’ en de detectielimiet werden bepaald. Vervolgens werd de opgedane kennis toegepast op het modelorganisme Daphnia magna, waarvan 2 stalen zijn gebruikt: een controlestaal en een monster blootgesteld aan verschillende metalen. Naast bepaling van de oppervlakteconcentraties werd clusteranalyse uitgevoerd om de relatie tussen de verschillende organen en de elementdistributie duidelijk te maken.

3.2

Werkingsprincipe van EDAX Eagle-III

Het laboratoriumtoestel gebruikt voor XRF-analyse is de Eagle-III µProbe van EDAX. Deze X-straal microfluorescentie spectrometer staat afgebeeld in Figuur 3.1. De straling wordt hierin opgewekt met een 40 W X-straalbuis met een Rh-filament en gefocust met polycapillaire optica op een focaal punt enkele milimeters van het uiteinde van het capillair. Tussen de X-straalbuis en de polycapillaire optica kunnen verschillende filters en een beamstop gepositioneerd worden. Het monster wordt gevisualiseerd met 2 CCD camera’s, elk met een andere vergroting. De fluorescentie afkomstig van het monster wordt gedetecteerd met een Si(Li) detector, gekoeld met vloeibare stikstof. Deze detector is afgeschermd van de omgeving met een Be-raam en laat toe elementen van Na tot U tegelijkertijd te detecteren.

29

Hoofdstuk 3. Laboratorium micro-XRF

30

Figuur 3.1: Eagle III Probe

3.3 3.3.1

Resolutie Theorie

De spatiale resolutie, ook wel het scheidend vermogen genoemd, is best zo klein mogelijk. Om te bepalen hoeveel deze resolutie bedraagt wordt de diameter van de X-straalbundel afkomstig van de polycapillaire optica opgemeten met behulp van de thin wire scanning method. Hierbij wordt een dunne metaaldraad doorheen de straal bewogen in een richting loodrecht op de draad. De intensiteit van de fluorescentie wordt opgemeten in functie van de positie van de draad. Dit vormt een gaussiaanse piek. Door op halve hoogte van deze piek een horizontale lijn te trekken en de x-waarden van de snijpunten van deze lijn met de piek van elkaar af te trekken wordt de full width at half maximum (FWHM) bekomen. Om de grootte van het focaal punt f te berekenen, moet de berekende FWHM verbeterd worden voor de officiële dikte D van de draad via de formule: p f = F W HM 2 − D2 Deze focaal-punt breedte f is echter niet echt de diameter van de straal bij een bepaalde energie, maar de grootte van de straal bij een gemiddelde energie van alle X-stralen die het element waarop f bepaald is, kunnen exciteren. In dit werk werden hiervoor 4 verschillende draden gebruikt: • De ‘stainless steel’ draad (AISI 302). • Een 99,9 % zuivere Pd-draad van dikte 10 µm. • Een Mo-draad van 10 µm dikte. • Een Cu-draad van 99,99 % zuiverheid met dikte 10 µm.


3.3.2

31

Verandering van de resolutie voor verschillende elementen

De spatiale resolutie verschilt van element tot element. Om dit effect te bestuderen werden de straaldraad (voor de elementen Fe, Cr en Ni) en de paladiumdraad opgemeten met een X-straalbundel met diameter 25 µm en een 5 µm stapgrootte. De lifetime bedroeg 10 sec per punt voor de staaldraad, en 15 sec voor de Pd-draad. De metingen werden uitgevoerd bij een voltageverschil van 40 kV en 200 µA, zonder filter en in een normale atmosfeer. Beide draden zijn 10 µm dik. De resultaten van deze thin wire scan worden weergegeven in Figuur 3.2.

Figuur 3.2: Thin wire scan van verschillende elementen uit verschillende draden. Gemeten fluorescentie-intensiteit vs verplaatsing van de draad.

Uit deze Figuur kan opgemaakt worden dat elementen met een hoger atoomgetal een lagere FWHM hebben. Bij uitplotten van de gemeten FWHM in functie van de K-edge energy in Figuur 3.3, ziet men een duidelijk dalende trend. De K-edge energieën werden verkregen via XRayLib. Als men de absorptie van een element in functie van de energie van de inkomende straling uitzet, is de K-edge energy de sprong in deze trend die wordt veroorzaakt door de absorptie door de K-schil-elektronen.


32

Figuur 3.3: FWHM vs de energie van de K-edge voor de verschillende elementen.

De verandering van de resolutie voor verschillende elementen kan verklaard worden door de distributie van fotonen over de X-straalbundel. Hoe hoger de energie van het foton, hoe meer het zal gefocust worden door het capillair. De kritische hoek (zie vorig hoofdstuk bij ‘focussering van X-stralen’) waaronder de totale reflectie optreedt is namelijk energieafhankelijk [15]. Hoe hoger de invallende energie, hoe kleiner de kritische hoek. Dit zorgt voor een groter focaal punt voor fotonen met een lagere energie. Een element met een hogere atomair nummer heeft een hogere energie nodig voor excitatie, de K-edge energie. Hierdoor zal de resolutie verbeteren voor zwaardere elementen.

3.3.3

Invloed van het voltageverschil van de X-straalbuis.

Als het voltageverschil tussen kathode en anode in de X-straalbuis afneemt, zal de intensiteit van de opgewekte fluorescentie ook afnemen. Dit wordt aangetoond in Figuur 3.4 als de afname van de hoogte van de piek. Hiervoor werd de staaldraad met een 25 µm straaldiameter opgemeten zonder filter en in een luchtatmosfeer. De stapgrootte bedroeg steeds 5 µm en er werd 10 seconden lifetime per punt opgemeten. De stroomsterkte werd aangepast om een constante dode tijd te hebben voor de verschillende metingen. Uit de scans van deze draden kan opgemaakt worden dat een voltageverschil geen invloed heeft op de grootte van de X-straalbundel, een verwacht resultaat. Figuur 3.5 toont de somspectra van deze metingen . Een monster opgemeten bij een voltage-verschil van x kV zal een fluorescentie uitstralen met een maximum van x keV. Bij afname van de energie van de inkomende straling zullen minder elementen geëxciteerd kunnen worden. Elementen die wel nog voldoende energie ontvangen voor excitatie worden wel met ongeveer dezelfde efficiëntie geëxciteerd.


33

Figuur 3.4: Intensiteiten van de fluorescentie van Fe in functie van de verplaatsing van de draad, voor verschillende voltage-verschillen in de X-straalbuis.

3.3.4

Gebruik van filters.

Een goede keuze van filter geplaatst tussen de X-straalbuis en het polycapillair kan de resolutie sterk voordelig be¨ınvloeden [16]. Zoals al aangehaald bij het onderzoek naar de verandering van de resolutie voor de verschillende elementen, is de grootte van het focaal punt afhankelijk van de energie van de straling. Meer energetische straling zal sterker gefocust worden door het polycapillair. Om betere focussering te verkrijgen kunnen filters gebruikt worden, deze houden straling onder een bepaalde energie tegen. Om de invloed van het gebruik van filters op de grootte van het focaal punt en het verkregen fluorescentie-spectrum te bepalen werd in dit werk gebruik gemaakt van 4 verschillende filters: • Een aluminium filter van 25 µm dikte. • Een nikkel filter van 25 µm. • Een rhodium filter met een dikte van 50 µm. • En een aluminium filter, maar nu van 250 µm. De meting met deze verschillende filters werd toegepast op de koper en molybdenium draad. Er werd opgemeten met een beamsize van 25 µm, 40 kV voltageverschil in de Xstraalbuis, een stapgrootte van 5 µm en bij vacu¨ um. De lifetime per punt was telkens 10


34

Figuur 3.5: Somspectra van de Fe-draad bij verschillende voltage-verschillen in de X-straalbuis.

sec, buiten bij de Rh-filter en de Al-filter van 250 µm dikte, waar een lifetime van 20 sec nodig was. Dit komt omdat het gebruik van filters de intensiteit van de straling invallend op het monster sterk doet afnemen. In plaats van een hogere stroom te gebruiken, wat ervoor zorgt dat de X-straalbuis sneller verslijt, werd ervoor gekozen langer te meten bij gebruik van filters die de intensiteit significant doen afnemen. De resultaten voor de wire scan van de Cu-draad zijn in Figuur 3.6 weergegeven. Het verschil in FWHM tussen geen filter en de dunne Al-filter is minimaal. Een dikkere Alfilter verbetert de resolutie echter duidelijk. De Ni (Z=28) en Rh (Z=45) filter zorgen ervoor dat de energie nodig voor Cu-excitatie (Z=29) geblokkeerd wordt. Voor koper is de energie van de K-edge 8,97890 keV, voor nikkel 8,33280 keV. Zoals zichtbaar op Figuur 3.7 waar de massa attenuatie coefficienten van Ni en Cu overlapt zijn, zal de energie die koper nodig heeft voor excitatie al geabsorbeerd zijn door de nikkelfilter. Deze redenering geldt natuurlijk nog meer voor de Rh-filter.


35

Figuur 3.6: Draadscan van de koperdraad met verschillende filters. De intensiteit van de fluorescentie van koper uitgezet ten opzichte van de verplaatsing van de draad

Figuur 3.7: Massa attenuatie coefficient van de elementen Cu en Ni. Bron: NIST


36

De analyse van het element molybdenium (Z= 42) uit de Mo-draad met de verschillende filters leidt tot dezelfde conclusies. Figuur 3.8 geeft weer dat een Al-filter (Z=13) de resolutie slechts licht verbetert, dit effect stijgt echter met de dikte van de filter, nadeel is wel dat er langer moet gemeten worden. De Ni-filter (Z=28) geeft geen verbetering in resolutie. Dit komt omdat de L-edge van Mo op 2,8660 keV ligt, en de K-edge van Ni op 8,3330 keV. De Rh-filter (Z=45) verbetert de resolutie, deze zorgt voor een bijna monochromatisch spectrum (zie Figuur 3.9). Waarom? Ik verwacht een sterke verbetering in resolutie bij gebruik van de Ni-filter, en geen fluorescentie-signaal meer bij de Rh-filter.

Figuur 3.8: Fluorescentie van Mo uit de Mo-draad bij verschillende filters.

Een blik op de somspectra van de Mo-draad bekomen met de verschillende filters kan teruggevonden worden in Figuur 3.9.


37

Figuur 3.9: Somspectra van de Mo-draad bij gebruik van verschillende filters.

Bij gebruik van de Ni-filter kan een een duidelijke absorptie-rand waargenomen worden in het somspectrum. De Rh-filter zorgt voor een bijna monochromatisch excitatie van Mo-L.

3.4 3.4.1

Detectielimiet en het verband met kwantitatieve analyse Theorie

Er zijn 3 belangrijke kwantitatieve procedures die gebruikt kunnen worden om een analytisch signaal om te zetten in een concentratie of absolute massa [17]. Een kwantitatieve analysemethode heeft een accuraatheidsfout van onder 10%. A. De alpha-coëffficiënt methode vereist meerdere metingen op standaarden die qua samenstelling sterk moeten overeenkomen met het monster. Deze procedure kan niet gebruikt worden voor micro-XRF metingen omdat de samenstelling al verandert binnen een standaard zelf (zie verder). B. De tweede procedure wordt de fundamentele parameter methode genoemd (Mantler [18] en van Sprang [19]). Hierin wordt het theoretisch verband tussen gewichtsfracties en de fluorescentie-intensiteit gelegd via fundamentele parameters zoals absorptiecoeëfficient, fluorescentie-opbrengst, dichtheid van het monster en eigenschappen van het toestel.


38

C. Een derde manier om kwantitatieve analyse uit te voeren is via de Monte Carlo simulaties [20] [21]. De Monte Carlo methode werkt met de baan die de deeltjes afleggen en de density functions. Via het gebruik van random getallen wordt de kans op verschillende fysische processen achterhaald. In een iteratief proces wordt de gewichtsfractie benaderd, zo is na de k e stap: wik = wik−1

Ii,meas Ii,calc

Er wordt gestopt zodra: |wik − wik−1 | < ∆w In dit werk werd semikwantitatieve analyse uitgevoerd, dit omvat analytische technieken die 30-50% accuraat zijn. Hierbij werd eerst de elementaire yield uit een standaard bepaald. Hiervoor werden standaarden gekozen die qua samenstellling zoveel mogelijk gelijken op het te meten staal. Er werd gekozen voor de ‘bovine liver’ standaarden : NIST (National Institute for Standards and Technology) SRM (Standard Reference Materials) 1577. Om semikwantitatieve analyse uit te kunnen voeren moeten deze standaarden zo homogeen mogelijk zijn, zodat calibratie van het toestel mogelijk is en met de berekende yield kwantitieve informatie kan berekend worden uit de gemeten fluorescentie-intensiteiten van het staal.

3.4.2

Toepassing op SRM ‘bovine liver’.

Om de heterogeniteit en vervolgens de detectielimiet te bepalen werd gebruik gemaakt van het standaard referentiemateriaal ‘bovine liver’ (SRM 1577c). Dit werd tot ronde plaatjes geperst met een diameter van 13 mm, en een gewicht van 18,7 mg. De metingen werden uitgevoerd met een voltageverschil van 40 kV, bij gewone atmosfeer en zonder filter. Per punt werd er een lifetime van 10 sec lang gemeten en er werden 20 x 20 punten opgemeten. Er werd gekozen metingen uit te voeren van hetzelfde monster met 4 verschillende X-straalbundel-groottes: • straaldiameter 25 µm, stapgrootte: 20 µm • straaldiameter 105 µm, stapgrootte: 100 µm • straaldiameter 225 µm, stapgrootte: 200 µm • straaldiameter 315 µm, stapgrootte: 300 µm De diameter van de straal invallend op het monster kan veranderd worden door de afstand tussen het polycapillair en het monster te variëren. Een grotere afstand zal voor een bredere invallende X-straalbundel zorgen.


39

Figuur 3.10 en 3.11) zijn de somspectra van deze verschillende metingen. Het is duidelijk dat ze heel goed overeenkomen. Dit werd verwacht daar de meetvariabelen buiten de straal- en stapgrootte, niet verschilden. Er werd dus enkel meer of minder van het referentiemateriaal met X-stralen belicht.

Figuur 3.10: Somspectra van NIST SRM 1577c, meting met verschillende straalgroottes.

Figuur 3.11: Detail uit de somspectra van NIST SRM 1577c, meting met verschillende straalgroottes.


40

Homogeniteit Bij meting van de fluorescentie van een bepaald element, zal de fluorescentie-intensiteit variëren naargelang de positie in het staal en het tijdstip waarop gemeten werd. σtotaal is de totale variantie van de intensiteitsmeting. Het kwadraat ervan is de som van de kwadraten van de varianties tengevolge van het meetproces σmeting en de variantie veroorzaakt door heterogeniteit in het materiaal σheterogeniteit . σmeting bestaat uit de variantie door de natuurlijke Poisson-verdeling (σP oisson ) van de meting en de variantie tengevolge van de meetmethode zelf (σmethode ). [22] 2 2 2 + σmeting = σheterogeniteit σtotaal 2 2 σmeting = σmethode + σP2 oisson

Een materiaal is homogeen wanneer de totale variantie σtotaal niet significant groter is dan de variantie σmeting [23]. Dit geldt als alle variantie enkel afkomstig is van de meetmethode zelf of de natuurlijke Poisson-verdeling van de meting. Een homogeen staal kan dus herkend worden aan de lage σheterogeniteit . Bij de berekening van σheterogeniteit kan σmethode verwaarloosd worden, waardoor rekening houdend met bovenstaande formules enkel overschiet: 2 2 σtotaal = σheterogeniteit + σP2 oisson

σP2 oisson kan afgeleid worden uit de meting van het monster door een staafdiagram te maken van de distributie van de gemeten fluorescentie-intensiteiten. Als een Gauss-curve gefit wordt door dit staafdiagram zoals in Figuur 3.12 tot 3.15), dan komt σP2 oisson overeen met de intensiteit bij de piek van de Gauss-curve. 2 2 σtotaal = σheterogeniteit + Ipiek


41

Figuur 3.12: Histogramverdeling van de fluorescentie-intensiteiten gemeten met de X-straal met diameter 25 µm op NIST SRM 1577c. Door dit histogram is een Gauss-curve gefit. Naast beide wordt de elementdistributie van dezelfde meting weergegeven.


42



43

Figuur 3.14: Histogramverdeling van de fluorescentie-intensiteiten gemeten met X-de straal met diameter 225 µm op NIST SRM 1577c. Door dit histogram is een Gauss-curve gefit. Naast beide wordt de elementdistributie van dezelfde meting weergegeven.


44



45

Om de procentuele bijdrage van de heterogeniteit aan de totale variantie te bepalen wordt het volgende berekend: p 2 σheterogeniteit = σtotaal − Ipiek % van de variantie veroorzaakt door heterogeniteit=

σheterogeniteit Ipiek

· 100%

Dit geeft het resultaat in Tabel 3.1. Tabel 3.1: % van de variantie veroorzaakt door heterogeniteit.

25 µm P 4.5 S 4.0 Cl 3.9 K 3.8 Fe 13.2 Cu 31.3

105 µm 5.3 3.1 4.6 2.6 12.5 26.7

225 µm 3.7 3.0 4.5 3.0 13.3 29.4

315 µm 3.0 2.5 3.9 4.5 14.6 30.6

Uit de tabel kan opgemaakt worden dat de elementen met hoger atoomgetal minder homogeen verdeeld zijn. Hoe komt dit juist? Zoals hierboven uitgelegd is referentiemateriaal homogeen wanneer de totale variantie σtotaal niet significant groter is dan de variantie σmeting . In Figuur 3.16 staat de verdeling van de intensiteiten voor referentiematerialen afgebeeld in (a). Situatie (b) uit dezelfde Figuur komt voor als σtotaal wel significant groter is dan σmeting , dan is het element in het materiaal normaal en heterogeen verdeeld. Het materiaal kan echter ook heterogeen én niet-normaal verdeeld zijn. De verdeling van de intensiteiten voldoet in dit geval niet aan een Gaussiaanse distributie. Dit is onderdeel (c) van Figuur 3.16. Referentiematerialen die deze vorm van intensiteitsdistributie vertonen bezitten meestal nuggets, delen in het materiaal met een hogere of lagere concentratie van een bepaald element dan het gemiddelde van het volledige monster.

Figuur 3.16: 3 verschillende distributies van fluorescentie-intensiteit doorheen referentiematerialen. De stippellijn staat voor een Gaussische distributie met standaardafwijking smeting . [22]


46

Aanwezigheid van nuggets achterhalen Men kan de grootste van deze nuggets herkennen met het oog als de elementdistributies van de metingen worden bekeken. Figuur 3.17 zijn de elementdistributies verkregen uit de meting van SRM 1577c met de 4 verschillende X-straalbundel-diameters. Bevoorbeeld voor de straalgrootte 25µm , terug te vinden in Figuur 3.17 als (a), kan bovenaan in het midden een nugget met lagere concentratie aan P en K en verhoogde concentratie aan S en Cl teruggevonden worden.

Figuur 3.17: De elementdistributies van de verschillende elementen van de metingen met straaldiamter 25 µm, 105 µm, 225 µm en 315 µm van SRM1577c.

Deze visuele methode is echter heel subjectief en kan leiden tot foute conclusies over de heterogeniteit van het materiaal.


47

Het is mogelijk om enkele nuggets uit het histogram van de fluorescentie-intensiteiten te identificeren. Daar waar het histogram afwijkt van een normale distributie kan het bestaan van nuggets verondersteld worden. Een voorbeeld hiervan is het histogram van fosfor voor de straaldiamter 225 µm in Figuur 3.14. Kijkend naar het histogram, herkent men aan de lagere kant van het histogram pieken die niet in het Gauss-model passen en behoren tot een nugget met lagere P-concentratie. Dit resultaat kan vervolgens bevestigd worden door de elementdistributie van P, waar de nugget herkenbaar is. Deze tweede visuele methode is echter ook niet betrouwbaar en zeer voor interpretatie vatbaar. Het afwijken van de normaalverdeling kan beter getest worden via de D’Agostino-test [24]. Deze K 2 -test is gebaseerd op de kurtosis en symmetrie van de verdeling en geeft weer of een set van metingen normaal verdeeld is of niet. In Tabel 3.2 staan de resultaten van deze test voor de metingen van SRM 1577c met de verschillende X-straal-diameters. Tabel 3.2: Dagostino-test voor de normale verdeling van de intensiteiten voor verschillende elementen van SRM 1577c opgemeten bij verschillende straaldiameters. ‘Failed’ betekent dat de intensiteiten niet normaal verdeeld zijn, ‘passed’ betekent dat er een normaalverdeling is tussen de verschillende waarden.

Element 25 µm 105 µm P failed failed S failed failed Cl failed failed K failed failed Fe passed failed Cu passed passed

225 µm failed passed failed failed passed passed

315 µm failed failed failed failed passed passed

De Dagostino-test is heel streng. Wanneer er volgens de test een normaalverdeling is, klopt dit ook, er worden echter soms nugget-effecten toegewezen aan stalen die dit niet bezitten. Een voorbeeld hiervan zijn de intensiteiten van het element S bij de straaldiameter van 315 µm, deze zijn volgens de Dagostino-test niet normaal verdeeld, terwijl dit wel zo is. Principale component analyse (PCA) is een andere methode die gebruikt kan worden om dergelijke nuggets methodisch te identificeren [25] • Theorie PCA Principale component analyse is een wiskundige techniek waarbij een aantal gerelateerde variabelen worden herleid tot minder variabelen die niet meer van elkaar afhangen. De eerste principale component (PC) verklaart de grootste hoeveelheid van variatie in de meting, de tweede verklaart de grootste hoeveelheid van de overschietende variatie en zo verder. Deze techniek wordt vaak gebruikt om patronen in grote hoeveelheid data terug te vinden [26].


48

• Toepassing op SRM 1577c. De resultaten van de PCA op de eerdere meting van SRM 1577c kunnen teruggevonden worden in Figuur 3.18 tot 3.21. In de loading plots wordt er een grens vastgelegd waarbij de elementen die erbuiten liggen nugget-effecten ondervinden. Om deze grens precies te bepalen kan het betrouwbaarheidsinterval van de PCA-analyse gebruikt worden [25]. Als men dit bekijkt voor de beamsize 25 µm in Figuur 3.18, kan duidelijk de elementen P, S, Cl en K als elementen onderhevig aan nugget-effecten ge¨ındentificeerd worden.

Figuur 3.18: Principale component analyse van de meting op NIST SRM 1577c met straalgrootte 25 µm.



49



50


51


Een intensiteitsdistributie van deze Principale Componenten (PC) kunnen teruggevonden worden in Figuur 3.22.


Figuur 3.22: De intensiteitsdistributies van de berekende pricipale componenten van de metingen van SRM 1577c met straalgroottes 25 µm (a), 105 µm (b), 225 µm (c) en 315 µm (d).

52


53

Berekening Detectielimiet De minimale detectielimiet (MDL) komt overeen met de hoeveelheid materiaal dat een fluorescentie-intensiteit zal geven gelijk aan 3 keer de standaard deviatie van de achtergrondintensiteit. Het is een indicatie van de gevoeligheid van de gebruikte techniek, en geeft weer wat de minimum hoeveelheid is die kan gedetecteerd worden [27]. Omdat de fluorescentie-intensiteiten ongeveer normaal verdeeld zijn, komt de standaarddeviatie overeen met de vierkantswortel van het aantal tellen of de intensiteit [28]. Er zijn verschillende variaties op de minimale detectielimiet die berekend zijn geweest in dit werk: √ • MDL in oppervlaktieconcentraties(µg/cm2 ) = 3 · Copp · ( Iback /I · 106 ) √ • MDL in concentraties(ppm) = 3 · Ccert · ( Iback /I) √ • MDL in absolute bestraale gewichten(pg) = 3 · Copp · ( Iback /I))(S/108 ) I is de intensiteit gemeten voor een bepaald element, Iback is de achtergrondintensiteit voor dit element. Ccert is de gecertificeerde concentratie in µg/g gegeven door NIST [29]. Copp is de gecertificeerde oppervlakteconcentratie in pg/cm2 van het element, berekend rekening houdend met de oppervlaktedichtheid d: Copp = d · Ccert · 1000 Deze oppervlaktedichtheid d is voor SRM 1577c vastgelegd op 14,0885 mg/cm2 . De oppervlakte S (µm2 ) die bestraald wordt kan berekend worden met de diameter van de invallende straal D: √ S = 2 · π · ( D2 )2 zet ik hier een Figuur bij om de berekening van de bestraalde oppervlakte duidelijker te maken? De berekende detectielimieten staan afgebeeld in de Figuren 3.23 tot 3.25.


54

Figuur 3.23: Minimale detectielimiet in µg/cm2 van SRM 1577c bij verschillende straalgroottes.

Figuur 3.24:

Minimale detectielimiet in ppm van SRM 1577c bij verschillende straalgroottes.


55

Figuur 3.25: Minimale detectielimiet in pg van SRM 1577c bij verschillende straalgroottes. Voor elke straalgrootte werd een trendlijn doorheen de metingen getrokken.

Het is duidelijk dat gebruik van een kleinere straal een lagere detectielimiet geeft. Dit komt omdat bredere stralen meer Bremstrahlung geven waardoor de detectielimiet stijgt. In figuren 3.23 en 3.24 zijn er voor sommige elementen sterke variaties in MDL voor de verschillende straalgroottes. Een voorbeeld hiervan is Mn (Z=25). Voor Mn komt dit door statistics. De piek in het spectrum, afgebeeld in Figuur 3.10, is heel klein en verdwijnt bijna in de achtergrond. Dit geldt ook voor het element Zn (Z=30). Voor K en Ca, waar de detectielimiet ook wat afwijkt, zijn er verschillende redenen: het zijn trace elementen die maar in kleine concentraties aanwezig zijn en in het spectrum bezitten ze een hoge achtergrond. Hiernaast zal, zoals zichtbaar in Figuur 3.11, de Rh-L-energie (2,6960 keV) wel voldoende zijn om P-Kα (2,1490 keV) en S-Kα (2,4720) te exciteren, maar voldoet het niet voor K-Kα (3,6070 keV) en Ca-Kα (4,0380 keV). K en Ca worden geëxciteerd door Bremsstrahlung. De detectielimiet zal afnemen met langere meettijd. Dit wordt duidelijk gevisualiseerd in Figuur 3.26. Dit is een meting van SRM 1577c bij een voltageverschil van 40 kV, een straaldiameter van 25 µm, aan de luchtatmosfeer en zonder filter. Er werd op 1 enkel punt gemeten voor 3000 sec lang, waarbij 3000 spectra werden opgenomen (live time = 1 sec). Vervolgens werden voor n van 1 tot 3000 de eerste n spectra opgesommeerd. Hierop werd dan de minimale detectielimiet berekend. Deze zijn in de Figuur uitgezet als symbolen (kruis, ster, bol, driehoek, vierkant) om de 50 seconden.


56

Figuur 3.26: De minimale detectielimiet in ppm voor de verschillende elementen. De punten zijn de gemeten waarden na opeenvolgende tijdstippen. De rode lijn is berekend met behulp van de intensiteiten en achtergrondsignalen op tijdstip 3000

In wat volgt zullen de intensiteiten gemeten op het standaardmateriaal gebruikt worden om een oppervlakteconcentratie te bereken van het monster. Hiervoor is het belangrijk dat men metingen gemeten op het SRM kan extrapoleren naar andere meettijden. In Figuur 3.26 wordt het bewijs geleverd dat dit verantwoord is. Hiervoor werd de ppm-detectielimiet berekend op basis van een intensiteit en achtergrondintensiteit van de meting na 3000 sec, en herleid naar de meettijd i van het monster. Een voorbeeld voor de detectielimiet na i seconden: ∗i Ii = I3000 3000 I ∗i Ibackgr,i = backgr,3000 3000 √ Ibackgr,i M DLi (ppm) = 3 · Ccert · Ii

Het is duidelijk uit de grafiek dat deze berekende minimale detectielimiet perfect overlapt met de detectielimieten berekend op basis van de spectra na elk tijdstip afzonderlijk. Het is dus verantwoord om de oppervlakteconcentratie te berekenen met behulp van de yield die aangepast werd naar het goede tijdsbestek. Deze yield is het aantal tellen dat bekomen wordt in een bepaalde tijd en van een bepaalde hoeveelheid materiaal. Er werden 2 verschillende yields berekend: • counts/sec/(µg/cm2 ) = • counts/sec/pg =

I·108 t·Copp ·S

I·106 t·Copp


57

Met t de meettijd. De resultaten van deze berekeningen staan afgebeeld in Figuur 3.27 en 3.28.

Figuur 3.27: Yield in counts/sec/(µg/cm2 ) van de verschillende elementen bij verschillende straalgroottes.

Figuur 3.28: Yield in counts/sec/pg van de verschillende elementen bij verschillende straalgroottes.


58

Om de oppervlakteconcentratie te berekenen van een monster wordt eerst een referentiemateriaal met overeenkomende elementsamenstelling opgemeten. Op basis van deze meting wordt vervolgens de yield berekend. Deze yield wordt dan gebruikt om de gemeten intensiteiten van het monster om te zetten in oppervlakteconcentratie Copp . Copp =

I yield

Copp is een waarde in µg/cm2 en yield staat in counts/sec/(µg/cm2 ). Bij de berekening van deze yield wordt in plaats van de tijd gebruikt bij het meten van het SRM, de tijd genomen die gebruikt is om de intensiteiten van het sample op te meten.

3.5 3.5.1

Daphnia magna Introductie

In toxicologische studies wordt onderzoek gedaan naar de giftige effecten van natuurlijke of synthetische giften op de leden van het ecosysteem. Vooral transitiemetalen zoals Co, Cu, Ni en Zn zijn van groot belang in dit onderzoek. Om te voorspellen hoe de toxische effecten voor de organismen variëren met de physicochemishe eigenschappen van het water en de concentratie van deze metalen, worden biotic ligand models (BLMs) gebruikt. De BLM neemt omgevingskarakteristieken zoals temperatuur, pH en metaal-concentratie in rekening en geeft een maat voor de kwaliteit van het water voor het ecosysteem. Het is belangrijk dat deze BLMs betrouwbare en reproduceerbare resultaten geven. Om de modellen verder te verfijnen wordt in dit werk onderzoek gedaan naar de relatie tussen de metaal-concentratie in water en de distributie van het metaal over de verschillende organen van het organisme zelf. Dit was met vorige methoden niet mogelijk omdat het volledige monster nodig was (zoals voor ICP-MS), en er geen onderscheid kon gemaakt worden tussen de verschillende organen. Met µ-XRF-metingen kan dit nu echter wel. Door bevoorbeeld het verschil in concentratie van de metalen aanwezig in de kieuwen en darm te bekijken kan onderzocht worden via welke weg de metalen in het lichaam worden opgenomen [30]. Er werd gebruik gemaakt van de kleine kreeftachtige Daphnia magna (Figuur 3.29) uit de klasse van de Branchiopoda. Deze keuze werd gemaakt omdat ze maar een korte levenscyclus en een reproductiecyclus op basis van klonen hebben. Dit zorgt voor heel reproduceerbare resultaten voor de verschillende generaties. Ze komen wereldwijd voor in zoete waters en vormen een belangrijk onderdeel van veel natuurlijke cycli. Ze kunnen dus gebruikt worden voor het kwalificeren van vele verschillende waterbronnen [31]. Daphnia magna worden hiernaast al lang actief gebruikt als een indicatorsoort [32]. Bij aanwezigheid van blauwalgen in het water sterven ze, en bij de laag zuurstofgehalte in het water worden ze rood door de extra aanmaak van hemoglobine.


59

Figuur 3.29: Afbeelding van de Daphnia magna

3.5.2

Fluorescentie-intensiteitsmeting.

Alhoewel µ-XRF-metingen met behulp van synchrotronstraling een veel hogere gevoeligheid hebben, is deze bron van X-straling niet steeds beschikbaar. Hiernaast is het ook aangeraden vóór een meting op een synchrotron een preliminaire meting uit te voeren met een X-straalbron zoals de X-straalbuis. Zodat monstervoorbereidingsmethoden geoptimaliseerd en mogelijke problemen bij de meting op de synchrotron kunnen vermeden worden. In dit werk werden 2 verschillende Daphnia magna’s opgemeten met de Eagle-III. Een controlemonster en een Daphnia magna blootgesteld aan metalen. Van het controlemonster werd een dunne coupe opgemeten, van de blootgestelde Daphnia magna werd het volledige monster gemeten. De 2D-coupe. Eerst werd er een controle-daphnia opgemeten. Dit betekent dat er geen extra metalen aan het water of de voeding van de Daphnia magna zijn toegevoegd. Van dit monster werd een dunne coupe gebruikt. Hiervoor moest het eerst gedehydrateerd worden via een water/aceton reeks. Vervolgens werd het ingebed in parafilm en werden er dunne coupes van gemaakt met een microtoom [33]. Ik heb de voorbereidingen niet zelf gedaan, vermeld ik dat? De 2D-coupe van 10 µm dikte werd opgemeten in een scan van 76 op 114 pixels met telkens een stepsize van 25 µm en lifetime van 5 sec. De meting gebeurde bij 40 kV, 200 µA, 25 µm straalgrootte, zonder filter en aan de lucht blootgesteld. Figuur 3.30 toont de elementdistributies van deze meting voor de verschillende elementen. Er werd bij de zwaardere metalen (Ti, Mn, Cu, Zn, ...)enkel ruis opgemeten. Dit komt omdat er geen extra metalen waren toegevoegd bij dit controlemonster en de natuurlijke concentraties te laag zijn om met dit toestel waar te nemen.


60

Figuur 3.30: Distributie van de intensiteiten van de Daphnia magna-coupe.

Als men de mappings van de elementen Ca, Zn en Fe laat overlappen zoals in Figuur 3.31, kan duidelijk het uitwendige skelet bestaande uit Ca (in het rood) en de belangrijkste organen (groen en blauw) herkend worden.

Figuur 3.31: Distributie van de intensiteiten van Ca, Zn en Fe uit de Daphnia magna-coupe.

Het somspectrum van deze mapping wordt weergegeven in Figuur 3.32. De zwaardere metalen komen niet of amper boven de achtergrond uit. Enkel Fe, die in het bloed van de daphnia aanwezig is, is herkenbaar.


61

Figuur 3.32: Somspectrum van de Daphnia magna-coupe. (controle-monster)

De volledige Daphnia magna. Dit monster werd blootgesteld aan 2500 µg/l Zn, 2500 µg/l Ni en 30 µg/l Cd. Er werd chemische fixatie uitgevoerd. Dit werd gedaan door de daphnia magna eerst te dehydrateren met aceton-oplossingen van oplopende concentraties (70 %, 80%, 90 %, 2x98% en 2 x 100%) en onder te dompelen in 1-1,5 ml 1,1,1,3,3,3-hexamethydisilazane (HMDS) [33].


62

Hierna werd het opgemeten aan de lucht, zonder filter, met een voltageverschil van 40 kV en 200 µA. De straalgrootte was 25 µm. Er werden 94 op 123 punten opgemeten met een stepsize van 25 µm en een lifetime van 5 sec per punt. Deze voorbereiding en meting werd niet zelf uitgevoerd.

Figuur 3.33: Intensiteitsdistributies van de volledige Daphnia magna.

De intensiteitsdistributies in Figuur 3.33 van Zn en Ni tonen dat deze elementen vooral in de verteringsklier zijn opgenomen. Cd werd echter helemaal niet waargenomen bij deze XRF-meting. Laat men de elemente Ca, Fe en Zn overlappen (Figuur 3.34), dan kan duidelijk het externe skelet (rood) en het darmkanaal (blauw) herkend worden.


63

Figuur 3.34: Distributies van de intensiteiten van Ca, Zn en Fe uit de volledige Daphnia magna.


64

Figuur 3.35: Somspectrum van de volledige Daphnia magna die blootgesteld werd aan Zn, Ni en Cd.

Vergelijkt men het somspectrum van de volledige, blootgestelde Daphnia magna in Figuur 3.35 met het spectrum van de coupe van het referentie-monster in Figuur 3.32, dan is duidelijk dat in het eerste het Rh-L signaal verhoudingsgewijs met de signalen van de andere elementen veel lager ligt. Dit is logisch daar in de coupe veel minder Ca, P, S, Fe, ... zal aanwezig zijn dan in het volledige specimen. En het volledige monster werd ook blootgesteld aan metalen, waardoor de intensiteit van de metalen stijgt.


3.5.3

65

Oppervlakteconcentratie

Om de oppervlakteconcentratie van een bepaald element te bekomen werd een semikwantitative techniek gebruikt. Eerst werd de yield van het element berekend op basis van een meting met dezelfde variabelen op SRM 1577c (bovine liver). Deze yield staat in counts/sec/(µg/cm2 ), de bekomen oppervlakteconcentratie Copp heeft als eenheid µg/cm2 . Copp =

I yield

Met deze techniek werden de resultaten in Figuren 3.36 en 3.37 bekomen.

Figuur 3.36: Distributies van de oppervlakteconcentraties in µg/cm2 van de coupe.


66

Figuur 3.37: Distributies van de oppervlakteconcentratie µg/cm2 van de volledige daphnia magna.

3.5.4

Clusteranalyse

Er werd onderzocht of de verdeling van de elementen in de Daphnia magna een zekere trend kent. Dit werd gedaan door op basis van de elementen Ca, P en Fe k-means clustering uit te voeren. k-means clustering is een methode die verschillende elementen in k clusters zal onderverdelen op een manier zodat elk element bij de cluster behoort met het dichtsbijzijnde gemiddelde. Er werd voor Ca, P en Fe gekozen omdat deze ver van elkaar stonden in de loading plot bij de PCA. De bekomen clusters voor de controle-daphnia staan afgebeeld in Figuur 3.38. Cluster 1 is een verzameling van de punten die tot het achtergrondsignaal behoren. Dit geeft in het somspectrum een hoge piek voor Rh-L, maar voor de andere elementen een eerder lage intensiteit. Cluster 2, die een hoge concentratie aan de elementen P, S en K bezit, omvat de inwendige organen. Het uitwendig skelet wordt omvat door cluster 3, welke vooral een heel


67

hoog signaal geeft voor Ca. In de distributies van deze cluster kunnen al deze onderdelen van de Daphnia magna herkend worden.

Figuur 3.38: Somspectra en distributies van de clusters van de daphnia-coupe.

Om duidelijker de verwantschap van de verschillende elementen met de clusters weer te


68

geven werd principale componentanalyse uitgevoerd op de clusters. Figuur 3.39 toont de resultaten. Als de loading- en score-plot van PCA2 en PCA1 naast elkaar worden gelegd, kan men vaststellen dat de eerste cluster (de achtergrond) vooral bestaat uit Rh-signalen. Cluster2 (de zachteweefsels) heeft als hoofdelementen P, S, K, Fe, Ti, Cu en Zn. Mn, Cl en bovenal Ca behoren vooral tot de derde cluster (het skelet). Dit volgt de verwachting helemaal en was in zeker mate al op te maken uit de somspectra.


Figuur 3.39: Principale componentanalyse op de clusters van de daphnia-coupe.

69


70

De clusteranalyse van het blootgestelde Daphnia magna maakt een minder duidelijke onderverdeling (Figuren 3.40 en 3.41). Dit komt omdat bijna alle punten in het lichaampje P en Ca bezitten. Uit de distributies van de clusters kan wel opgemaakt worden dat cluster 1 met de achtergrond overeen komt.

Figuur 3.40: Distributies van de clusters van de volledige Daphnia magna.

Figuur 3.41: Somspectra van de clusters van de Daphnia magna.

Hoofdstuk 4 Synchrotron micro-XRF metingen 4.1

Introductie

4.2

Beamline L te HASYLAB

De synchrotron XRF-metingen werden uitgevoerd op de beamline L van de ‘Hamburger Synchrotronstrahlunglabor’ (HASYLAB) te Hamburg, Duitsland. Deze beamline is deel van de DORIS-III-ring, schematisch afgebeeld in Figuur 4.1. De positronen worden in 2 of 5 groepen in een baan van 289 meter lang versneld tot een energie van 4,45 GeV. Tussen deze positron-groepen zit 480 of 193 nsec respectievelijk. De initiële stroom is 140 mA. Beamline L heeft een bending magnet als X-straalbron. De straling werd in de gebruikte opstelling gemonochromatiseerd door een multilayer monochomator bestaande uit Ni en C, getuned door het Mostab-systeem. De geselecteerde energie bedroeg ongeveer 20 keV. Vóór de multilayer werd een Al-filter van 0,3 mm dikte geplaatst zodat de monochromator niet beschadigd werd door de hoog-energetische straling. Hierdoor verviel de intensiteit naar 90 % van zijn oorspronkelijke sterkte. Een ionisatiekamer met N2 registreerde de intensiteit van de straling vóo´r de focussering en na het monster. Het signaal van de ionisatiekamers werd versterkt met een Keithley versterker naar 1-10 V en dan door volt-to-frequence converters omgevormd en geanalyseerd door de counter. De straling werd gefocust door een single bounce capillary (SBC) [34] tot een focaal punt van ±10 µm diameter op een afstand van ± 5 cm. Deze keuze werd gemaakt omdat de SBC, in tegenstelling tot polycapillaire optica, een meer parallelle bundel heeft. Dit is beter om de Daphnia magna, tamelijk grote stalen, op te meten. Polycapillaire optica is beter voor dunnere stalen. De polycapillaire optica heeft echter een betere gain dan de SBC, namelijk 10 keer zo hoog als de gain van 300 van de SBC. De gain is de ratio van de intensiteit in het focaal punt met en zonder de optica. Dit nadeel werd aanvaard daar de afstand van de optica tot het focaal punt van de polycapillaire optica (± 5 mm) te klein is om een cryostream te gebruiken. Een cryostream of stroom van N2 werd op het monster gericht om de Daphnia magna 71

Hoofdstuk 4. Synchrotron micro-XRF metingen

72

Figuur 4.1: Schematische afbeelding van de Doris-III-ring.

bevroren te houden en zo min mogelijke vervormingen te hebben tijdens de meting. Er werden 3 verschillende detectors gebruikt: • SDD. Geproduceerd door SII en genaamd Vortex, het Si-kristal is 350 µm dik en heeft een oppervlakte van 50 mm2 . Het Be-raam is 25 µm dik. • Si(Li)-detector. Een detector genaamd Sirius 80, geproduceerd door Gresham. Het kristal bestaat uit Si gedopeerd met Li en heeft een oppervlakte van 80mm2 en een dikte van 4 mm. Een Be-raam van 12,5 µm dikte behoudt het vacu¨ um. • CCD. Genaamd PCO4000, bezit een hoge resolutie van 4008 x 2672 pixels van ± 9,9 µm grootte en wordt thermo-elektrisch gekoeld. Opnames gebeuren met een snelheid van 128 MB/sec.

4.3

Keuze en voorbereiding monsters

Als standaard referentiemateriaal werd gekozen voor NIST SRM 1577b, omdat het qua samenstelling goed overeenkomt met de Daphnia magna-stalen.


73

De Daphnia magna’s opgemeten aan de synchrotron HASYLAB kregen als voeding de algen Pseudokirchneriella subcapitata en Chlamydomonas reinhardtii in een 3:1 verhouding gebaseerd op het aantal cellen. De hoeveelheden waren 250 µg, 500 µg en 750 µg gedroogd gewicht per Daphnia in overeenkomstig de eerste, tweede en derde week van hun levenscyclus. Er werden 2 verschillende genotypes van de Daphnia magna opgemeten. Degene die na de preliminaire toxiciteitstest als de meest metaal-gevoelige (KNO17-53) en de meest tolerante (TER2-20) bleken te zijn. Beide zijn afkomstig uit een verschillend milieu. KNO17 is een vijver in de regio van Knokke, terwijl TER2 een vijver is in de buurt van Leuven (Neerijse). Van elk werd er een controle-monster en een monster blootgesteld aan Zn opgemeten. Het controle-medium werd ontdaan van alle Zn en Cu. In het blootgestelde medium werd Zn toegevoegd tot 250 µg/l. In totaal werden er van 4 verschillende Daphnia magna XRF metingen uitgevoerd. De Daphnia magna’s werden ter plaatste uit de cultuur gehaald en afgespoeld met gede¨ıoniseerd water. Ze werden vervolgens vastgelijmd op een polymeerbuisje en onmiddellijk ondergedompeld in vloeibare N2 . Dit zorgde voor een snelle en effectieve bevriezing zodat de natuurlijke distributie van de atomen zo min mogelijk veranderde. Hierna werd het monster in de cryostream geplaatst en kon de meting gestart worden.

4.4

De proefopstelling

Omdat de Daphnia manga’s tamelijk groot zijn (± 1 mm op 5mm) zal een enkele detector niet het volledige fluorescentie-signaal van de lichtere elementen kunnen waarnemen omwille van absorptie-effecten. Daarom werden 2 detectors gebruikt, elk aan weerszijden van het monster, loodrecht op de inkomende X-straalbundel om scattering-effecten minimaal op te vangen. Optimaal zouden er 2 gelijke detectors hiervoor gekozen worden, maar door defect werd een SDD-detector, die verder in dit werk ‘Vortex’ zal genoemd worden, en een Si(Li)-detector (waarnaar gerefereerd zal worden met ‘Sirius’) gebruikt.


74

Figuur 4.2: Foto van de opstelling gebruikt bij de beamline L te HASYLAB, Duitsland.

4.4.1

Onderzoek naar de focussering van de straling

Het gebruikte capillair is een SBC, hier wordt de X-straling met slechts 1 enkele reflectie op het binnenste oppervlak van het capillair gefocust.

Figuur 4.3: Schematische tekening van de Single Bounce Capillary. [35]

De straling die zich zonder reflectie doorheen het capillair zou voortbewegen, wordt tegengehouden met een micro-beamstop. Deze rechtstreekse straal zou anders veel ruis geven in het fluorescentiesignaal. De beamstops bestaan meestal uit hoge-Z-elementen zoals Pb, Pt en Ta. Ze moeten gealigneerd worden zodat ze perfect in het midden van


75

de SBC gesitueerd zijn. Allignatie van het SBC en de beamstop gebeurde met behulp van een CCD camera die de far-field images registreerde. Figuur 4.4 geeft deze far-field figuren weer. Deze afbeeldingen werden op geen enkele manier veranderd of gecorrigeerd. De afbeelding rechts is met beamstop opgenomen. Er kan opgemerkt worden dat de ringen niet perfect circulair zijn, dit komt door kleine onregelmatigheden in het capillair en de beamstop.

Figuur 4.4: Far-field afbeelding van organisch materiaal gemaakt met behulp van de CCD zonder(linkse figuur) en met (rechtse figuur) beamstop in de SBC. De verticale lijnen geven aan waar het lijnprofiel doorheen opgemeten werd.

Om het effect van de beamstop op de straling beter te kunnen onderzoeken werd een lijnprofiel van de far-field afbeeldingen gemaakt. Een lijnprofiel geeft de intensiteit van de pixels op een bepaalde lijn weer. De lijnen in Figuur 4.4 geven de positie weer waar dit lijnprofiel werd opgemeten. Het resultaat kan teruggevonden worden in Figuur 4.5.

Figuur 4.5: Vertikaal lijnprofiel doorheen de afbeelding van de SBC met (boven) en zonder (onder) beamstop.


76

De CCD-camera kan ook gebruikt worden om de positie van de X-straalbundel op het monster te verifiëren. Hiervoor wordt de SBC uit de X-straalbundel verwijderd en wordt met behulp van de CCD het radiografiebeeld bekeken. Bij een interessant deel van het monster wordt de SBC teruggeplaatst. Zo kan de positie van het monster in de straal geoptimaliseerd worden.

4.4.2

Resolutie van de CCD-camera

Met behulp van een teststructuur werd de resolutie van de CCD-camera bepaald. Hiervoor werd de teststructuur X500-200-30 geproduceerd door XRADIA gebruikt. Om een duidelijker beeld te verkrijgen van de teststructuur zodat een adequate bepaling van de resolutie kon uitgevoerd worden, moest het ruwe beeld eerst gecorrigeerd worden voor de achtergrond-belichting. Er zijn 3 vormen van beeldverbetering die kunnen uitgevoerd worden [36]: • Offset correction In Offset correction wordt een Dark Image of Offset Image afgetrokken van de ruwe afbeelding. De Dark Image is het beeld verkregen bij afwezigheid van X-straling. Deze correctie elimineert variaties ten gevolge van elektronische onregelmatigheden in de detector. • Gain correction Door de afbeelding te corrigeren met behulp van een Flat Field of Gain Image worden variaties ten gevolge van verschillende detector-respons en/of X-straal-intensiteit in iedere pixel weggewerkt. De Flat Field wordt opgenomen met een ongehinderde Xstraal. Dus zonder monster of teststructuur tussen de SBC en CCD-detector. Voor Gain correction kan worden uitgevoerd moet eerst Offset correction worden toegepast op de Flat Field en ruwe figuur. • Pixel correction In een laatste stap kunnen niet-werkende pixels weggewerkt worden. Dit wordt gedaan met behulp van een pixel map opgesteld door de frabikant van de detector. In dit werk was er geen toegang tot een pixel map, dus werd een combinatie van offset correction en gain correction gebruikt [37]: C=

I−D F −D

met C de gecorrigeerde figuur, I de ruwe figuur, D de Dark Image en F de Flat Field. Deze verschillende figuren staan afgebeeld in Figuur 4.6.


77

Figuur 4.6: Afbeeldingen gemaakt met behulp van de CCD-camera PCO4000 van de teststructuur x500-200-30. (a) is de Dark Image, (b) de Flat Field, (c) de ongecorrigeerde afbeelding en (d) de afbeelding gecorrigeerd via offset en gain correction.

Op de gecorrigeerde afbeelding werd de resolutie van de detector bepaald door een lijnprofiel doorheen de variable line spacing grating op te stellen. De variable line spacing grating kan in de tekstructuur op Figuur 4.7 teruggevonden worden als de balken boven en rechts van het rooster. Via het lijnprofiel in Figuur 4.8 werd bepaald vanaf welk punt er geen onderscheid meer kan gemaakt worden tussen de verschillende structuren. Om de keuze van dit punt duidelijker toe te lichten werd een detail rechts in Figuur 4.8 weergegeven. Als deze pixel dan aangeduid wordt op de figuur van de teststructuur, zoals gedaan geweest is in Figuur 4.7, kan de resolutie afgelezen worden. Volgens deze methode werd bepaald dat de horizontale resolutie rond 1,5 µm bedraagt en de verticale resolutie net boven 2 µm ligt.


78

Figuur 4.7: Gecorrigeerde far-field afbeelding van de teststructuur x500-200-30. De lijnen waardoorheen de lijnprofielen werden opgenomen staan weergegeven als ’profile 1’ en ’profile 2’. Hierop werd het begin en einde van de structuren herkenbaar in het lijnprofiel aangeduid.

Figuur 4.8: Links: lijnprofiel 1 (verticale) doorheen de variable line spacing grating van de teststructuur x500-200-30. Rechts: detail uit het lijnprofiel. De rode lijnen duiden aan vanaf waar geen onderscheid meer kan gemaakt worden tussen de structuren onderling.


4.5 4.5.1

79

Resultaten NIST SRM 1577b

Na elke Daphnia magna-meting werd een exemplaar van NIST SRM 1577b opgemeten. Hiervan werden 2 op 10 punten opgemeten met 15 sec lifetime per punt. Horizontaal werd een stapgrootte van 10 µm gebruikt, verticaal bedroeg de stapgrootte 20 µm. De yield werd berekend om oppervlakteconcentraties van de Daphnia magna te bepalen. In Figuur 4.9 staan de somspectra van de eerste meting op 1577b waargenomen door detectors Vortex en Sirius. De Vortex geeft een betere energie-resolutie dan de Sirius voor de lager gelegen energiën. Volgens de producenten heeft de Vortex een resolutie kleiner dan 136 eV bij Mn-Kα en de Sirius een resolutie van 148 eV voor dezelfde energie. De Sirius is gemaakt om hogere energieën, en dus zwaardere elementen, op te meten dan de Vortex.

Figuur 4.9: Somspectra van NIST SRM 1577b opgenomen door detector ‘Vortex’ en ‘Sirius’.

De verkregen detectielimieten en yields staan weergegeven in Figuur 4.10 en 4.11. Deze waarden zijn significant beter dan deze verkregen met de meting op het toestel Eagle-III.


80

Figuur 4.10: Bepaling van de minimale detectielimiet voor de verschillende elementen van SRM 1577b ‘bovine liver’ bij een meettijd van 330 sec.

Figuur 4.11: Bepaling van de yield voor de verschillende elementen van SRM 1577b ‘bovine liver’ bij een meettijd van 330 sec.


4.5.2

81

Daphnia

De Intensiteitsdistributie Er werden 4 verschillende Daphnia magna-monsters opgemeten. Bij elk van deze metingen werd een stapgrootte van 20 µm horizontaal en verticaal toegepast. Per punt werd 1 seconde lifetime gemeten. Afhankelijk van de grootte van de monsters werd een verschillend aantal stappen gebruikt. De somspectra van de metingen worden afgebeeld in Figuur 4.12 tot 4.15. Deze spectra zijn genormaliseerd naar de intensiteit van de Compton-straling om ze goed te kunnen vergelijken. De blootgestelde monsters hebben systematisch meer zink opgenomen dan de controlemonsters. Uit de detail-weergaven blijkt ook dat het monster TER2-20 meer zink heeft opgenomen dan KNO17-53.

Figuur 4.12: Somspectra bekomen met de detector ‘Vortex’.


Figuur 4.13: Detail uit de somspectra bekomen met de detector ‘Vortex’.

Figuur 4.14: Somspectra bekomen met de detector ‘Sirius’.

82


83

Figuur 4.15: Detail uit de somspectra bekomen met de detector ‘Sirius’.

Om de intensiteitsdistributie van een bepaald element te verkrijgen, werd het signaal van beide detectors gesommeerd. Hiervoor werden de verkregen intensiteiten eerst geschaald zodat de maximum-intensiteit in de distributie 1000 tellen bedroeg. Omdat er met twee verschillende detectors gewerkt werd, was het sommeren anders niet verantwoord. In Figuur 4.16 staan de geschaalde intensiteiten waargenomen door beide detectors afzonderlijk en hun sommaties voor het blootgestelde monster TER2-20.


84

Figuur 4.16: Optellen van de intensiteiten verkregen via de Vortex- en Sirius-detector voor een selectie van de elementen van de blootgestelde Daphnia magna TER2-20.

De verkregen resultaten staan voor het blootgestelde monster KNO17-53 in Figuur 4.17.

Figuur 4.17: Intensiteitmappings voor de verschillende elementen van de blootgestelde Daphnia magna KNO17-53.

In dit werk wordt vooral belang gesteld in de distributie van zink in de Daphnia magna’s. In Figuur 4.18 worden de intensiteitsdistributies voor Zn opgemeten door de verschillende detectoren (links en midden) en gesommeerd (rechts) vergeleken. Uit deze vergelijking blijkt dat KNO17-53 meer gelijkmatig het Zn opneemt in het darmkanaal, verteringsklier


85

en eieren dan de TER2-20. De verteringsklier en darmkanaal zijn onderdeel van het verteringssysteem van de Daphnia magna. TER2-20 vertoont vooral een hoge Zn-intensiteit in het kieuw-achtige osmoregulerend weefsel. Dit is een belangrijk onderdeel van de Daphnia magna voor opname en uitscheiding van ionen uit en naar de omgeving. Zo wordt via actief ionentransport de ionensamenstelling in het lichaam osmotisch gereguleerd [38].

Figuur 4.18: Vergelijking van de intensiteiten bekomen voor Zn. Links: intensiteiten bekomen met de Vortex. Midden: Sirius-meting. Rechts: som van beide. (a): controlemonster TER2-20 (b): blootgestelde TER2-20 (c): controle KNO17-53 (d): blootgestelde KNO17-53

De oppervlakteconcentraties Met behulp van de metingen uitgevoerd op de SRM 1577b werd een yield berekend voor elk element. Op gelijkaardige wijze als in vorig hoofdstuk kan met de yield de intensiteitsdistributies omgevormd worden in oppervlakteconcentratie-distributies. Omdat er gewerkt werd met twee verschillende detectors, wordt de yield berekend op de som van de intensiteiten waargenomen door de afzonderlijke detectors. Hiermee wordt dan de som van de intensiteiten van het monster omgevormd tot oppervlakteconcentraties. Bij deze berekening moet rekening gehouden worden dat de meetttijd zogezegd verdubbeld is, met elke detector afzonderlijk werd het SRM gedurende 330 sec opgemeten, beide samen hebben dus gedurende 660 sec opgemeten: yield =

I1 +I2 660·Copp ·106

waarbij I1 en I2 de intensiteiten waargenomen door respectievelijk de Vortex- en Siriusdetector zijn. Copp in pg/cm2 is de gecertificeerde oppervlakteconcentratie berekend met gegevens afkomstig van het certificaat van het referentiemateriaal. De oppervlakteconcentraties worden dan met behulp van deze yield uit de sommatie van de intensiteiten berekend:

Hoofdstuk 4. Synchrotron micro-XRF metingen concmonster =

86

I1,monster +I2,monster yield

Het resultaat verkregen voor het controlemonster van KNO17-53 staat in Figuur 4.19.

Figuur 4.19: Oppervlakteconcentratie-distributies berekend voor de meting van het controlemonster van KNO17-53, selectie van enkele elementen. De oppervlakteconcentratie staat in µg/cm2 .

Voor hogere-Z elementen zorgen deze vormen van quantificatie voor een grote overschatting van hun concentratie, omdat hun fluorescentie-signaal geen absorptie door het monster zelf ondervind en dus in gelijke mate de twee detectors bereikt. Voor de zwaarste elementen kan de zo berekende oppervlakteconcentratie tot dubbel van de echte waarde liggen. Bij lagere-Z elementen zal absorptie echter wel een grote rol spelen en zorgt de sommatie van de twee signalen dat hier rekening mee wordt gehouden. Het is echter wel een semi-kwantitatieve methode, de verkregen resultaten zijn niet de exacte oppervlakteconcentraties aanwezig in het staal. Het maakte het mogelijk om in dit werk een vergelijkend onderzoek te doen naar de distributie van Zn in de verschillende monsters. Om echte kwantitatieve informatie te verkrijgen zou absorptie-correctie moeten uitgevoerd worden.

4.6

Tomografie

Om meer informatie te verkrijgen over de exacte element-distributie kunnen drie-dimensionale tomografische technieken gebruikt worden. Dit kan belangrijke informatie geven over de


87

exacte positie van een bepaald element in een onderdeel van het monster. Er bestaan twee veelgebruikte 3D-methoden: confocale analyse en XRF computed microtomography (XRF CT). In de confocale techniek [39] wordt naast focussering van de inkomende straling, de fluorescentiestraling die het monster verlaat locaal gedetecteerd met behulp van een polycapillaire detector lens. Zo wordt straling uit een specifiek microvolume geanalyseerd, het volume waar het focaal punt van het inkomende-straling-monocapillair en het detectiepolycapillair overlappen [40] (Figuur 4.20).

Figuur 4.20: Geometrie van de confocale opstelling. De doorsnede tussen beide bepaalt het confocaal volume waaruit fluorescentie-straling wordt gedetecteerd [41].

De methode gebruikt in dit werk is XRF CT [42]. Hiermee kan een snede doorheen het volledige monster geanalyseerd worden. Om deze snede te verkrijgen wordt op een bepaalde hoogte een lijnscan opgemeten, hierna wordt het monster over een bepaald aantal graden gedraaid en wordt weer dezelfde lijnscan opgemeten. Dit wordt herhaald tot het monster een volledige 360 ◦ draai heeft ondergaan. Omdat er in dit werk met twee tegenover elkaar geplaatste detectors in plaats van met een enkele werd gewerkt, kan de meettijd gehalveerd worden door het monster maar over 180 ◦ te draaien. De verkregen lijnscans worden onder elkaar geplaatst om zo het sinogram te bekomen. In dit onderzoek werd van de blootgestelde Daphnia magna TER2-20 op twee verschillende hoogtes een dergelijk sinogram geconstrueerd. In Figuur 4.21 kan het sinogram opgemeten door de twee verschillende detectors en hun sommatie weergevonden worden. Voor deze metingen werd een 20 µm stapgrootte gebruikt en werd na elke lijnscan van 125 punten over 2 graden gedraaid, zodat in totaal 90 lijnscans werden opgemeten. Per punt werd een lifetime van 1 seconde gemeten. De twee hoogtes liggen op 200 µm van elkaar.


88

Figuur 4.21: Sinogram van een selectie van elementen uit het blootgestelde monster TER2-20. Beeld van de verschillende detectors en hun sommatie.

Vervolgens wordt via wiskundige methoden uit het sinogram een elementdistributie doorheen de snede opgemaakt, dit wordt ’reconstructie’ genoemd. In Figuur 4.22 en 4.23 kunnen deze gereconstrueerde beelden teruggevonden worden.

Figuur 4.22: Gereconstrueerde elementdistributies op basis van de sinogrammen bekomen van de blootgestelde Daphnia magna TER2-20. De laagste hoogte.


89

Figuur 4.23: Gereconstrueerde elementdistributies op basis van de sinogrammen bekomen van de blootgestelde Daphnia magna TER2-20. 200 µm hoger gelegen dan Figuur 4.22.

Bibliografie [1] H.G.J. Moseley. The high frequency spectra of the elements. Philosophical Magazine Series 6, 26:1024–1034, 1913. [2] B.K. Agarwal. X-ray spectroscopy, an introduction. second edition, 1979. [3] R. Jenkins, R. Manne, R. Robin, and C. Senemaud. Nomenclature, symbols, units and their usage in spectrochemical analysis - VIII. Nomenclature system for X-ray spectroscopy (Recommendations 1991). 1991. [4] S.Y. Lee. Accelerator physics. World scientific publishing Co. Pte. Ltd., second edition, 2004. [5] M. Leoni, U. Welzel, and P. Scardi. Polycapillary optics for materials science studies: Instrumental effects and their correction. J. Res. Natl. Inst. Stand. Technol., 109:27– 48, 2004. [6] K.Tsuji, J.Injuk, and R. Van Grieken. X-ray Spectrometry:recent technological advances, chapter Polycapillary X-ray optics. John Wiley & Sons, 2004. [7] Y. Yan and W.M. Gibson. Polycapillary optics and x-ray analytical techniques. ICDD:Advances in X-ray Analysis, 45:298–305, 2002. [8] A. Snigirev, V. Kohn, I. Snigireva, and B. Lengeler. A compound refractive lens for focusing high-energy x-rays. Nature, 384:49–51, 1996. [9] G. Schmahl and D. Rudolph. Zone plates for x-ray microscopy. X-Ray Microscopy, pages 63–74, 1984. [10] A. Brunetti, M. Sanchez del Rio, B. Golosio, A. Simionovici, and A. Somogyi. A library for xray-matter interaction cross sections for x-ray fluorescence applications. Spectrochimica Acta Part B, 59:1725–1731, 2004. [11] R. Grieken and A. Markowicz. Handbook of X-ray spectrometry. Marcel Dekker inc., 2 edition, 2002.

90

Bibliografie

91

[12] P. Lechner, S. Eckbauer, R. Hartmann, S. Krisch, D. Hauff, R. Richter, H. Soltau, L. Struder, C. Fiorini, E. Gatti, A. Longoni, and M. Sampietro. Silicon drift detectors for high resolution room temperature x-ray spectroscopy. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A, 377:346–351, 1996. [13] A. Koch, C. Raven, P. Spanne, and A. Snigirev. X-ray imaging with submicrometer resolution employing transparent luminescent screens. J. Opt. Soc. Am. A, 15:1940– 1951, 1998. [14] M.Stampanoni, G. Borchert, P. Wyss, R.Abela, B.Patterson, S.Hunt, D. Vermeulen, and P.Ruegsegger. High resolution x-ray detector for synchrotron-based microtomography. Nuclear instruments and method in physics research, 491:291–301, 2002. [15] A.Matsuda, Y.Nodera, K.Nakano, and K.Tsuji. X-ray energy dependence of the properties of the focused beams produced by polycapillary x-ray lens. Analytical sciences, 24:843–846, 2008. [16] K. Nakano, A. Matsuda, U. Nodera, and K. Tsuji. Improvement of spatial resolution of µ-xrf by using a thin metal filter. X-ray Spectrom., 37:642–645, 2008. [17] B. Kanngieber. Quantification procedures in micro x-ray flurescence analysis. Spectrochimica Acta Part B, 58:609–614, 2003. [18] B. Beckhoff, B. Kanngiefer, N. Langhoff, R. Wedell, and H. Wolff. Handbook of practical X-ray fluorescence analysis. Springer, 2006. [19] H.A. van Sprang. Fundamental parameter methods in xrf spectroscopy. Advances in X-ray analysis, 42:1–10, 2000. [20] R. Grieken. X-ray spectrometry: recent technological advances, chapter 6. Wiley, 2004. [21] K. Janssen L. Vincze and F. Adams. A general monte carlo simulation of energydispersive x-ray fluorescence spectrometers. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 48:553–573, 1993. [22] L. Kempenaers, K. Janssens, L.Vincze, B.Vekemans, A. Somogyi, M. Drakopoulos, A. simionovici, and F. Adams. A monte carlo model for studying the microhetergeneity of trace elements in reference materials by means of synchrotron micorscopic x-ray fluorescence. Anal.Chem., 74:5017–5026, 2002. [23] L. Kempenaers, L. Vincze, and K. Janssen. The use of synchrotron micro-xrf for characterization of the micro-heterogeneity of heavy metals in low-z reference materials. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 55:651–669, 2000. [24] R.B.D’Agostino, A. Belanger, and R.B.D’Agostino jr. A suggestion for using powerful and informative tests of normality. The American statistician, 44:316–321, 1990.

Bibliografie

92

[25] J.L. Molloy and J.R. Sieber. Classification of microheterogeneity in solid samples using µxrf. Anal Bioanal Chem, 392:995–1001, 2008. [26] I.T. Jolliffe. Principal Components Analysis. Springer, second edition, 2002. [27] A.Currie. Lower limit of detection: definition and elaboration of a proposed position for radiological effluent and environmental measurements. US Nuclear Regulatory Commission NUREG/CR-4007, pages 1–139, 1984. [28] M.K. Tiwari, A.K.Singh, and K.J.S. Sawhney. Sample perparation for evaluation of detection limits in x-ray fluorescence spectrometry. Analytical Sciences, 21:143–147, 2005. [29] National Institute of Standards and Technology. Certificate of analysis, standard reference material 1577c, bovine liver. [30] B. De Samber, R. Evens, K. De Schamphelaere, G.Silversmit, B.Masschaele, T.Schoonjans, B.Vekemans, C.R.Janssen, L.Van Hoorebeke, I.Szaloki, F.Vanhaecke, G.Falkenberg, and L. Vincze. A combionation of synchrotron and laboratory x-ray techniques for studying tissue-specific trace level metal distributions in daphnia magna. journal of analytical atomic spectromety, 23:829–839, 2008. [31] R. De Bernardi and R.H.Peters. Daphnia, chapter Why Daphnia? Consiglio nazionale delle ricerche, Istituto italiano di idrobiologia, 1987. [32] S.Fields and M. JOhnston. Whither model organisme research? Science, 307:1885– 1886, 2005. [33] B. De Samber. Spatially resolved X-ray micro/nano-spectroscopy and imaging on the model organism Daphnia magna using laboratory and synchrotron sources. PhD thesis, UGent, 2010. [34] S. W. Cornaby. The handbook of X-ray single-bounce monocapillary optics, including optical design and synchrotron applications. PhD thesis, Cornell University, 2008. [35] G. Falkenberg, K. Rickers, D.H. Bilderback, and R. Huang. A single-bounce capillary for focusing of hard x-rays. [36] Rad icon Imaging. http://www.rad-icon.com/support-faq.php. [37] A.L.C. Kwan and J.A. Seibert. An improved method for flat-field correction of flat panel x-ray detector. Med. Phys., 33:391–393, 2006. [38] S. Kikuchi. The fine structure of the gill epithelium of a fresh-water flea, daphnia magna (crustacea: Phyllopoda) and changes associated with acclimation to various salinities. Cell Tissue Research, 229:253–268, 1983.

Bibliografie

93

[39] L.Bincze, B. Vekemans, F.E.Brenker, G. Falkenberg, K. Rickers, A. Somogyi, M. Kersten, and F. Adams. Three-dimensional trace element analysis by confocal x-ray microfluorescence imaging. Anal. Chem., 76:6786–6791, 2004. [40] W.Malzer and B. Kanngiebber. A model for the confocal volume of 3d micro x-ray fluorescence spectrometer. Spectrochimica Acta Part B, 60:1334–1341, 2005. [41] A.R. Woll, D.H. Bilderback, S. Gruner, N. Gao, R. Huang, C. Bisulca, and J. Mass. Confocal x-ray fluorescence (xrf) microscopy: A new technique for the nondestructive compositional depth profiling of paintings. Mater. Res. Soc. Symp. Proc., 852:002.5.1– 002.5.10, 2005. [42] R.A. Ketcham and W.D. Carlson. Acquisition, optimization and interpretation of xray computed tomographic imagery: applications to the geosciences. Computers and Geosciences, 27:381–400, 2001.

Laboratorium en synchrotron X-straal microspectroscopie en beeldvorming op Daphnia magna

Recommend Documents