UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Voeding, Genetica en Ethologie Laboratorium voor gentherapie Academiejaar 2011-2012
ONTWIKKELING EN IN VIVO EVALUATIE VAN GENETISCHE VACCINS TEGEN WEST NILE VIRUS Stefanie LAST Eerste master in de farmaceutische zorg
Promotor Prof. Dr. N. Sanders
Commissarissen Dr. K. Raemdonck Dr. S. Soenen
Experimenteel begeleidster dr. Marina De Filette
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
SAMENVATTING Het West Nile virus (WNV) is een RNA (+) virus, behorende tot het genus van de flavivirussen. Het is een zeer wijd verspreid virus dat een grote waaier aan species kan infecteren. Het wordt door muggen overgedragen en de infectie verloopt vaak asymptomatisch. Bij minder dan 1% van de geïnfecteerden kunnen er zich echter levensbedreigende complicaties voordoen. Ook zorgt het voor heel wat problemen bij de paarden. Hierdoor is het wenselijk om een vaccin te ontwikkelen tegen dit virus.
In het eerste onderdeel van deze thesis wordt er geprobeerd om een stabiel plasmide te modelleren, waaruit vervolgens een mRNA-vaccin kan gevormd worden. In de pT7Tsvectorplasmide wordt een nieuw 3’UTR, met een stabiliserend UTR van het humaan globine en een lange poly-A staart geligeerd. Uit de literatuur is namelijk gebleken dat deze onderdelen de stabiliteit van mRNA verhogen. Het ligeren van het genfragment voor deze stabiliserende sequenties in pT7Ts is echter nog niet gelukt. Verder onderzoek zal hiervoor dus nodig zijn. De mogelijks belangrijkste verbetering die in de toekomst kan gemaakt worden, is het gebruik van een andere bacteriestam voor de transformatie. In de literatuur werd gevonden dat de XL-1blue bacterie de beste resultaten geeft bij transformatie van een plasmide met een lange poly-A staart. In de pT7Ts-vector, zonder de lange poly-A staart, wordt ook het gen van respectievelijk het E-proteïne (van WNV) en van het luciferasegen geligeerd. Na het sequeneren van de plasmiden kan besloten worden dat de genen effectief in de plasmiden gekloneerd zijn. Deze zullen in de toekomst verder gemodificeerd worden om stabieler mRNA te produceren. In het tweede onderdeel van deze masterproef wordt onderzocht welk epitoop van het E-proteïne kan gebruikt worden als stimulus voor de cytokineproductie in de ELISPOT-assay. De testen worden uitgevoerd zowel voor BALB/c als NMRI muizen, aangezien verschillende muisstammen verschillende MHC-moleculen bezitten. Hierdoor is het optimale epitoop voor stimulatie mogelijks niet hetzelfde voor deze twee muizenstammen. Zowel de stimulatie van de IL-4, IL-6 als IFN-ɣ productie wordt getest. Uit de resultaten kan afgeleidt worden dat, zowel
voor
BALB/c
als
voor
NMRI
muizen,
het
peptide
IC32
(GTDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNP) de beste stimulatie geeft. Het DNA-vaccin, waarvan gebruik gemaakt wordt om de muizen te infecteren, geeft echter geen IL-4 productie, waardoor dit in verdere testen kan weggelaten worden.
DANKWOORD
Dit dankwoord is voor iedereen die mij geholpen heeft gedurende het schrijven van mijn masterproef. In het bijzonder wil ik hierbij mijn promotor Prof. Dr. Sanders bedanken voor de begeleiding bij het schrijven van mijn thesis. Ook wil ik hem bedanken om mij de mogelijkheid te geven het onderzoek voor mijn masterproef in zijn vakgroep uit te voeren. Mijn begeleidster Marina De Filette wil ik nadrukkelijk bedanken voor de vele tijd die ze vrijmaakte om mij te begeleiden gedurende deze volledige periode en voor de vele zaken die ze mij bijgeleerd heeft. Zowel voor de theoretische als voor de praktische informatie die ik heb meegekregen. Verder wil ik ook graag Ruben bedanken voor het steeds oplossen van de technische problemen, Mario voor de extra hulp in het labo, Sofie, Wenwen, Steven, Dominique, Linda, Alice, Karen, Jozefien, Caro, Tiphanie voor de uitleg die ik kreeg. Ook wil ik hen, samen met Cindy en Shana, bedanken voor de aangename werksfeer. Als laatste wil ik ook mijn ouders bedanken om mij de mogelijkheid te geven om deze studies aan te vangen en voor hun aanhoudende steun.
INHOUDSOPGAVE 1
INLEIDING ........................................................................................................... 1 1.1 HET IMMUUNSYSTEEM ............................................................................................ 1 1.1.1
Onderdelen van het immuunsysteem ........................................................ 1
1.1.2
Cellulaire en humorale immuunrespons .................................................... 2
1.2 VACCINS ................................................................................................................... 4 1.2.1
Levend-verzwakte vaccins ......................................................................... 4
1.2.2
Afgedode vaccins ...................................................................................... 5
1.2.3
Subunit vaccins ......................................................................................... 5
1.2.4
Genetische vaccins .................................................................................... 6
1.2.4.1 DNA vaccins................................................................................................... 6 1.2.4.2 mRNA vaccins ................................................................................................ 7 1.2.4.3 Verschil tussen DNA en mRNA vaccins op de immuunrespons .................... 8 1.3 MESSENGER RNA VACCINATIE ................................................................................. 9 1.3.1
De aanmaak .............................................................................................. 9
1.3.2
De werking ............................................................................................... 9
1.3.3
De stabiliteit ........................................................................................... 10
1.4 HET WEST NILE VIRUS ............................................................................................ 12 1.4.1
De behandeling ....................................................................................... 13
1.4.2
Vaccins tegen WNV ................................................................................. 14
2
OBJECTIEVEN .................................................................................................... 15
3
MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................... 17 3.1 Veel gebruikte materialen ..................................................................................... 17 3.2 PLASMIDEN ............................................................................................................ 17 3.3 PLASMIDEN OPGROEIEN ........................................................................................ 18 3.3.1
Protocol .................................................................................................. 18
3.3.2
Samenstelling van de gebruikte oplossingen ........................................... 18
3.4 PLASMIDEN OPZUIVEREN ...................................................................................... 18 3.4.1
Protocol Qiagen methode (MINI/MIDI prep) ........................................... 18
3.4.2
Protocol birnboim methode .................................................................... 19
3.5 KLONEREN VAN PLASMIDEN.................................................................................. 20 3.5.1
Principe .................................................................................................. 20
3.5.2
Gelelektroforese ..................................................................................... 22
3.5.2.1 Principe ....................................................................................................... 22
3.5.2.2 Protocol gelelektroforese ........................................................................... 23 3.5.2.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 23 3.5.3
Elueren van DNA uit agarosegel .............................................................. 24
3.5.3.1 Principe ....................................................................................................... 24 3.5.3.2 Protocol elueren van DNA uit agarosegel ................................................... 24 3.5.4
Nanodrop ............................................................................................... 25
3.5.4.1 Principe ....................................................................................................... 25 3.5.4.2 Protocol nanodrop ...................................................................................... 25 3.5.5
Protocol defosforyleren van plasmiden ................................................... 25
3.5.6
Protocol ligatie van vector pT7Ts met pIDTsmart-fragment ...................... 26
3.5.7
Transformeren van plasmiden ................................................................. 26
3.5.7.1 Principe ....................................................................................................... 26 3.5.7.2 Protocol transformatie van het chimeer plasmide in E.coli ....................... 26 3.5.7.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 27 3.5.8
Uitplaten van getransformeerde cellen ................................................... 27
3.5.8.1 Protocol ....................................................................................................... 27 3.5.8.2 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 27 3.5.9
Polymerase chain reaction (PCR) ............................................................. 28
3.5.9.1 Principe ....................................................................................................... 28 3.5.9.2 Protocol vermenigvuldigen van het luciferasegen en het gen van het Eproteïne….. .................................................................................................................... 28 3.5.9.3 Protocol voor het testen op de aanwezigheid van het geligeerde gen ...... 28 3.5.10 Sequenering............................................................................................ 29 3.6 PEPTIDENSTAMMEN .............................................................................................. 29 3.6.1
Protocol opgroeien en induceren van de bacteriën .................................. 30
3.6.1.1 Principe ....................................................................................................... 30 3.6.1.2 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 30 3.6.2
Affiniteitschromatografie ........................................................................ 31
3.6.2.1 Principe ....................................................................................................... 31 3.6.2.2 Protocol zuivering van GST-tagged proteïnen ............................................ 31 3.6.2.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 32 3.6.3
Proteïnen scheiden met acrylamide gelelektroforese .............................. 32
3.6.3.1 Protocol ....................................................................................................... 32 3.6.3.2 Samenstellingen buffers ............................................................................. 33 3.6.4
Muisexperiment ..................................................................................... 34
3.6.4.1 Injecteren van de muis ................................................................................ 34
3.6.4.2 Opzuiveren van de cellen van de milt ......................................................... 34 3.6.4.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 35 3.6.5
Flow cytometer ....................................................................................... 35
3.6.6
ELISPOT .................................................................................................. 35
3.6.6.1 Principe ....................................................................................................... 35 3.6.6.2 Protocol ....................................................................................................... 35 3.6.6.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen.............................................. 37 4
RESULTATEN ..................................................................................................... 38 4.1 ONTWIKKELING VAN EEN MESSENGER RNA VACCIN ............................................ 38 4.1.1
Vorming van het stabiele plasmide.......................................................... 38
4.1.2
Ligatie van het luciferasegen en van het gen van het E-proteïne .............. 40
4.1.2.1 Voorbereiding van de vector ...................................................................... 40 4.1.2.2 Voorbereiding van het luciferasegen en het E-proteïne gen ..................... 40 4.1.2.3 Ligatie van het luciferasegen en van het E-proteïne gen ........................... 41 4.1.2.4 Testen van de ligatie ................................................................................... 42 4.1.2.5 Opgroeien van de klonen ............................................................................ 42 4.1.2.6 Sequeneren van de plasmiden.................................................................... 43 4.2 TESTEN VAN DE PEPTIDESTAMMEN ...................................................................... 43
5
4.2.1
Opgroeien en induceren van de peptidestammen ................................... 43
4.2.2
ELISPOT .................................................................................................. 44
DISCUSSIE ......................................................................................................... 46 5.1 ONTWIKKELING VAN EEN STABIEL MRNA VACCIN. ............................................... 46
5.2 LIGATIE VAN HET E-PROTEÏNE GEN EN VAN HET LUCIFERASEGEN IN HET PLASMIDE. ............................................................................................................................ 48 5.3 DE STIMULATIE VAN SPLENOCYTEN M.B.V. PEPTIDEN NA DNA VACCINATIE ....... 48 6
CONCLUSIE ........................................................................................................ 50
7
LITERATUURLIJST .............................................................................................. 51
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN APC
antigen presenterende cellen
APS
ammoniumpersulfaat
ARCA
anti-reverse Cap
BSA
bovine serum albumine
CIAP
calf intestinal alkaline phosphatase
CTL-respons
killer-T-cel respons
DNA
desoxyribonucleic acid
ELISA
enzyme-linked Immuno sorbent assay
ELISPOT
enzyme-Linked Immunospot
E-glycoproteïne
envelop glycoproteïne
GABA
gamma-labeled anti-biotine
GM-CSF
granulocyte-macrophage colony-stimulating Factor
GST
glutathione S-transferase
IFN-ɣ
interferon-ɣ
IL
interleukine
IPTG
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside
MHC (I of II)
major histocompatibility complex (I of II)
mRNA
messenger ribonucleic acid
PBS
phosphate buffered saline
prM/M
premembraan/membraan glycoproteïne
Rpm
rotations per minute
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
SDS
sodium dodecyl sulphate
TEMED
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
Th-1 of Th-2 cellen
T-helpercellen van het type 1 of 2
TLR
Toll-like receptoren
TNF-α
tumor necrosis factor α
TNGT
Tris/NaCl/Glutathion/Triton x-100
tRNA
transfer ribonucleic acid
UTR
untranslated region
UV
ultraviolet
WNV
West Nile Virus
1 1.1
INLEIDING HET IMMUUNSYSTEEM
1.1.1 Onderdelen van het immuunsysteem Het immuunsysteem staat in voor de bescherming van het lichaam tegen lichaamsvreemde organismen en bestaat uit 3 grote delen: de externe barrières, de aangeboren en de adaptieve tak van het immuunsysteem (1, 2). (zie figuur 1.1)
Figuur 1.1 De verschillende onderdelen van het aangeboren en het adaptieve immuunsysteem. (Bron: http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n1/fig_tab/nrc1252_F1.html (06/04/2012))
Onder de externe barrières worden zowel de fysieke (zoals de huid en de muceuze membranen) als de chemische barrières (zoals enzymen) gerekend. Wanneer deze tekort schieten, moeten het aangeboren en het verworven immuunsysteem in werking treden (3). Het aangeboren immuunsysteem is aanwezig van bij de geboorte en is niet specifiek, het wordt daarom ook wel het niet-specifieke immuunsysteem genoemd. Het treedt onmiddellijk in werking wanneer er een vreemd partikel in het lichaam komt en staat in voor de eerstelijnsverdediging. Het zal geen geheugen opbouwen waardoor het slechts weinig kan beïnvloed worden. De monocyten, macrofagen, granulocyten en natural killer (NK)cellen behoren tot dit niet-specifieke immuunsysteem. Hun hoofddoel is het fagocyteren van binnengedrongen pathogenen (3). Een onderdeel van enorm belang, zijn de dendritische cellen. Deze vormen de link tussen het aangeboren en het adaptieve immuunsysteem en zijn van cruciaal belang bij de activatie van een efficiënte immuunreactie (1-4). Een tweede zeer belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem, zijn de Toll-like receptoren (TLR). Door deze transmembranaire eiwitten heeft het immuunsysteem de mogelijkheid tot de herkenning van vele organismen. TLR’s kunnen opgedeeld worden in verschillende groepen.
1
De TLR’s 3, 7, 8 en 9 zijn intracellulaire receptoren en zijn belangrijk voor de herkenning van nucleïnezuren (DNA en RNA) (1, 3, 5, 6). Het verworven of adaptief immuunsysteem is veel specifieker en heeft de mogelijkheid om ongeveer ieder pathogeen te herkennen en te vernietigen. Bij de geboorte is deze tak van het immuunsysteem nog niet ontwikkeld, waardoor de bescherming gedurende de levensloop moet opgebouwd worden. Bij een eerste contact met een pathogeen zal er een lag-fase zijn vooraleer de maximale respons wordt bereikt. Wanneer het echter om een zeer virulent organisme gaat, bestaat de kans dat het immuunsysteem te laat zijn optimale sterkte bereikt. Bij een tweede contact met hetzelfde pathogeen, zal het immuunsysteem veel sneller en effectiever kunnen reageren, waardoor het pathogeen zal afgedood worden vooraleer men ziek wordt. De reden voor deze snellere en sterkere respons is dat er bij een eerste contact geheugen wordt opgebouwd. Van deze mogelijkheid tot de vorming van geheugen wordt gebruik gemaakt bij vaccinatie. Er zal daarbij gezorgd worden dat het eerste contact niet met het schadelijke pathogeen is, maar met het onschadelijke vaccin.
1.1.2 Cellulaire en humorale immuunrespons Een extra opdeling die gemaakt wordt in het immuunsysteem, is het onderscheid tussen de cellulaire en de humorale immuunrespons (zie figuur 1.2) (3). De humorale immuniteit speelt een belangrijke rol in de herkenning van vreemde moleculen die zich extracellulair bevinden. Van zodra een pathogeen zich echter in de cellen bevindt, zal de cellulaire immuniteit cruciaal worden (3).
De humorale immuunrespons wordt gekenmerkt door antilichamen. Deze antilichamen worden gevormd door de B-cellen. Wanneer B-cellen geactiveerd worden, zullen ze prolifereren en differentiëren tot geheugencellen en plasmacellen. De plasmacellen zullen zorgen voor de aanmaak van een grote hoeveelheid specifieke antilichamen tegen het pathogeen of tegen het vreemde partikel waardoor de B-cel geactiveerd werd (3).
De cellulaire immuunrespons wordt gekenmerkt door de T-cellen. Deze T-lymfocyten bezitten een T-celreceptor waarmee ze de antigenen herkennen. Om antigenen te
2
herkennen, mogen ze echter niet in hun vrije vorm voorkomen, maar moeten ze gepresenteerd worden door een major histocompatibility complex (MHC) molecule (3). T-cellen kunnen verder opgedeeld worden in cytotoxische T-cellen (CD8+) en Helper Tcellen (CD4+). De cytotoxische T-cellen staan in voor het doden van o.a. viraal geïnfecteerde cellen en tumorcellen. Ze worden geactiveerd door de herkenning van peptiden, gepresenteerd door MHC I. Deze MHC I zal enkel de door de cel aangemaakte peptiden presenteren. T-helpercellen daarentegen worden geactiveerd door de herkenning van peptiden, gepresenteerd door MHC II. Deze peptiden zijn afkomstig van proteïnen die via fagocytose zijn opgenomen door een antigen presenterende cel (APC). Voor de activatie van een naïeve T-cel zal niet alleen de herkenning van een peptide gepresenteerd door MHC nodig zijn, er is ook steeds een co-stimulatoir signaal nodig dat afkomstig is van dezelfde cel (4). Dit signaal wordt geleverd door de interactie van CD28 van de T-cel met CD80 van de APC.
Figuur 1.2 Het onderscheid tussen de humorale en de cellulaire immuniteit van de specifieke immuniteit. De humorale immuniteit wordt gekenmerkt door de B-lymfocyten, die via antilichaamproductie zorgen voor de inactivatie van extracellulaire pathogenen. De cellulaire immuniteit bestaat uit cytotoxische T-cellen (Tc), die zorgen voor het doden van pathogenen, en uit T-helpercellen (Th), die macrofagen en B-cellen helpen door middel van cytokineproductie.
T-helpercellen kunnen verder opgedeeld worden in Th-1 en Th-2 cellen. De Th-1-cellen zijn zeer belangrijk voor de activatie van macrofagen. Macrofagen zijn fagocyterende cellen die de na fagocytose opgenomen pathogenen zullen vernietigen. Sommige pathogenen kunnen zich echter vermenigvuldigen in de vesikels van een macrofaag. Door de activatie van die macrofagen door een Th1-cel, zullen deze pathogenen toch vernietigd worden. Th1-
3
cellen zijn ook belangrijk in het ondersteunen van de cellulaire immuunrespons. Dit komt in belangrijke mate door hun productie van IL-2 en IFN-ɣ (3). Th2-cellen dragen bij tot de activatie van B-cellen. Er kan dus besloten worden dat het immuunsysteem een complex systeem is van goed samenwerkende onderdelen die zeer sterk met elkaar in verband staan. Belangrijk in de communicatie tussen de verschillende onderdelen zijn de cytokines. Deze zullen een regulerend effect hebben en kunnen dus de immuunrespons in een bepaalde richting sturen (1, 3, 4). Typische cytokines die betrokken zijn bij de Th-1 respons zijn IL-2, IFN-ɣ en TNF-α . De cytokines IL-4, 5, en 13 zijn typische cytokines voor de Th2-respons (3).
1.2
VACCINS Vaccinaties worden aangezien als het optimale middel voor de bescherming tegen
bepaalde infecties en dus om hun morbiditeit en mortaliteit te verminderen (2, 7). Het principe ervan berust op het opbouwen van geheugen na een eerste contact, waarna de immuunrespons bij het 2e contact veel sneller en sterker zal zijn (1, 2). Bij de ontwikkeling van een vaccin wordt als doel gesteld om immuniteit te induceren tegen een bepaalde ziekte. Dit door een immuunrespons op te wekken die zo dicht mogelijk aanleunt tegen de natuurlijke immuunrespons, normaal door deze ziekte veroorzaakt, zonder de ontwikkeling van de ziekte. Ook zal er geprobeerd worden om de mogelijke nevenwerkingen door de inflammatoire reactie zo laag mogelijk te houden (2). Om deze eigenschappen mogelijk te maken is een goede kennis van de werking van de infectieziekte noodzakelijk. Er bestaan verschillende types van vaccins. En voor vele ziektes zijn reeds effectieve vaccins gemaakt met behulp van levend-verzwakte of geïnactiveerde pathogenen, of doormiddel van zogenaamde subunit vaccins. Toch hebben deze vaccins vele beperkingen en zijn er verschillende ziektes waarvoor deze types vaccins niet geschikt zijn.
1.2.1 Levend-verzwakte vaccins Levend verzwakte vaccins worden o.a. ontwikkeld door het wild type pathogeen te laten groeien in een medium dat mutantvorming stimuleert (bijvoorbeeld door het pathogeen te laten groeien in niet-humane cellijnen) (2). 4
Levend verzwakte vaccins hebben het voordeel dat ze zowel een killer T-cel (CTL) respons als een helper T-cel respons kunnen mediëren. Ook zorgen ze voor de vorming van antilichamen (2). Ze zullen het immuunsysteem dus op dezelfde manier stimuleren als zou de infectie zelf doorgemaakt worden. De persoon zal er echter niet -of slechts zeer licht- ziek door worden. Een heel belangrijk nadeel waarmee zeker rekening moet gehouden worden, is dat het verzwakte virus ontstaan is door spontane mutaties en dat deze dus spontaan kunnen terugmuteren naar de virulente vorm. De patiënt zal de infectie dan in zijn volledige sterkte doormaken. Een ander nadeel is dat levend verzwakte vaccins toch een sterke infectie kunnen veroorzaken bij mensen met een verminderd immuunsysteem (2).
1.2.2 Afgedode vaccins Bij de ontwikkeling van afgedode vaccins, zal het wild type pathogeen gedood worden met o.a. UV-straling, hitte, formol,… (2) Deze afgedode pathogenen zullen als vaccin toegediend worden. Afgedode vaccins hebben niet het nadeel dat ze kunnen terugmuteren naar de virulente vorm, maar de kans bestaat wel dat niet alle aanwezige viruspartikels adequaat gedood zijn. De, mogelijks aanwezige, nog steeds levende partikels zullen de patiënt ernstig kunnen infecteren. Afgedode vaccins hebben een zeer sterke beperking doordat ze geen CTL-respons mediëren. Dit komt doordat de proteïnen niet in de cel zelf worden aangemaakt, maar slechts gefagocyteerd worden door antigen presenterende cellen (APC). Na fagocytose worden ze door middel van MHC II moleculen gepresenteerd en niet door MHC I(8). Door deze beperking zijn afgedode vaccins niet bruikbaar voor bepaalde pathogenen waarbij de immuniteit zeer sterk afhankelijk is van de CTL-respons. Afgedode vaccins zullen zo bijvoorbeeld minder efficiënt zijn ter preventie van virale infecties.
1.2.3 Subunit vaccins Subunit vaccins bevatten een of meerdere fragmenten (vb. viraal proteïne, peptide, polysaccharide,…) van het pathogeen waarvan gekend is dat het zeer immunogeen is. Het risico, op het krijgen van de infectie, dat aanwezig was bij de vorige 2 types vaccins is met dit type vaccin omzeild. De beperking, met betrekking tot de CTL-respons, is echter ook
5
aanwezig bij dit soort vaccins. Subunit vaccins zullen hier bovenop vaak nog een lage immunogeniciteit bezitten (2). Om deze reden zullen er vaak multiple dosissen moeten toegediend worden. Ook wordt er daarom nog steeds veel onderzoek gedaan naar het gebruik van verschillende adjuvantia voor het verbeteren van de immuunrespons na vaccinatie met subunit vaccins.
1.2.4 Genetische vaccins 1.2.4.1 DNA vaccins Een vrij nieuwe methode, die vele problemen van de eerder besproken vaccins omzeilt, is het gebruik van DNA vaccins. DNA moleculen, die coderen voor één of meerdere antigenen van het virus, worden hierbij toegediend. Het DNA wordt vervolgens opgenomen in de nucleus
van
de
cellen,
waar
de
transcriptie en translatie van het antigen plaatsvindt. De virale proteïnen worden dus aangemaakt door de cellen zelf. Toch blijven deze proteïnen lichaamsvreemd en zullen ze, na gepresenteerd te worden via een MHC-molecule (zowel MHC I als MHC II), het immuunsysteem activeren. Er zal hierdoor zowel een humorale als cellulaire immuunrespons opgewekt worden (2, 4, 8).
Figuur 1.3 De methode voor de aanmaak van een DNA vaccin tegen het West Nile virus.
De aanmaak van DNA vaccins is gemakkelijk en niet duur, vergeleken met de aanmaak van de eerder vermelde vaccins. Het plasmide met de gewenste genetische informatie wordt geconstrueerd, waarna het wordt getransformeerd in bacteriën. Door de aanwezigheid van 6
een antibioticum resistentiegen in het pDNA kunnen de getransformeerde bacteriën selectief opgekweekt worden in een medium met dit antibioticum. Vervolgens worden de bacteriën
gelyseerd
en
worden
de
plasmiden
opgezuiverd
(zie
figuur
1.3)
(http://www.niaid.nih.gov/topics/westnile/research/pages/wnvgraphic.aspx (29/02/2012)). Naast de eenvoudige aanmaak, leveren DNA vaccins nog andere voordelen (8). Ze zijn (temperatuur)stabieler dan levende vaccins en zijn gemakkelijk te bewaren in gelyofyliseerde vorm. Ook biedt deze methode de mogelijkheid tot het vormen van een vector met de genetische informatie voor verschillende antigenen. Op deze manier kan 1 vaccin ontwikkeld worden dat immuniteit geeft tegen verschillende antigenen. DNA vaccins hebben echter ook nadelen (6). Als eerste nadeel wordt vermeld dat ze vaak een lage efficiëntie hebben. Hoogstwaarschijnlijk is een van de belangrijkste oorzaken hiervan het feit dat het DNA de nucleus moet bereiken vooraleer het kan getranscripteerd en getranslateerd worden. Deze penetratie is vaak problematisch laag, zeker voor cellen die traag of helemaal niet delen (8). Een tweede probleem is dat er een risico is op incorporatie in het genoom van de gastcel. De kans dat dit voorkomt is echter klein, maar wanneer het gebeurt, ontstaat de mogelijkheid tot het activeren van een oncogen of het inactiveren van een tumor suppressorgen, met de kans op de ontwikkeling van kanker. Bij specifiek onderzoek naar de kans op het ontwikkelen van maligniteiten door DNA vaccins, blijkt deze kans echter zeer laag (minder dan 1 op 106 gevaccineerden)(9). Ook kunnen DNA vaccins autoreactiviteit induceren, of ontwikkeling geven van tolerantie aangezien het DNA voor lange tijd aanwezig kan zijn in de cel en zo continue productie van het proteïne kan veroorzaken. Als laatste opmerking wordt het belang van de aanwezigheid van een goede promotor, voor de transcriptie naar mRNA, benadrukt.
1.2.4.2 mRNA vaccins Messenger RNA is onstabieler dan DNA, waardoor er lange tijd de overtuiging was dat het gebruik van mRNA voor vaccinatie niet effectief zou zijn. De laatste tijd is echter gebleken dat mRNA het cytosol toch bereikt en dit voordat het afgebroken wordt door de aanwezige RNasen (10). Pascolo et al. stelt dat een mogelijke verklaring hiervoor te vinden is in de veronderstelling dat sommige cellen een receptor tot expressie brengen die zorgt voor
7
de cellulaire opname van exogeen mRNA. Deze receptor zou een communicatiemiddel zijn tussen de cellen (11). Messenger RNA vaccins bezitten, net zoals DNA vaccins, de voordelen van een genetisch vaccin. Het vaccin kan aangepast worden aan vele ziektes, de productie van het vaccin is vrij gemakkelijk en de bewaring is goedkoop. Bovenop deze voordelen, worden ook nog een aantal problemen, die aanwezig waren bij DNA vaccins, omzeilt (5, 6, 10). Messenger RNA kan rechtstreeks getranslateerd worden in het cytosol van de cel, zonder eerst naar de nucleus van de cel te moeten. Hierdoor wordt deze limiterende stap omzeild. Hoogstwaarschijnlijk is dit de reden waarom mRNA vaccins meer proteïneproductie geven in niet delende cellen dan DNA vaccins en waarom ze bruikbaar zijn in een bredere waaier van cellen. Een tweede voordeel is dat er bij het gebruik van mRNA geen nood is aan de aanwezigheid van een efficiënte promotor. Ook zal er geen risico op incorporatie in het DNA van de gastcel zijn, dus geen risico op de ontwikkeling van kanker (11). Een vierde extra voordeel is dat er met mRNA minder kans is op de ontwikkeling van tolerantie, aangezien er minder kans is dat het mRNA voor lange tijd in de cel aanwezig blijft en dus continue productie van het proteïne geeft. Daarnaast zijn er ook geen genen aanwezig die coderen voor antibioticaresistentie .
1.2.4.3 Verschil tussen DNA en mRNA vaccins op de immuunrespons Een opmerkelijk verschil dat ontdekt werd tussen DNA en mRNA vaccins, was dat de immuunrespons verschillend is. Bij DNA vaccinatie wordt een Th1-respons bekomen (cellulaire immuniteit) en bij toedienen van een mRNA vaccin wordt er een Th2-respons (humorale immuniteit) verkregen (6). Aangezien er voor de ontwikkeling van antivirale vaccins ook een Th1-respons gewenst is, was onderzoek nodig om deze Th2-respons van het mRNA vaccin te manipuleren in de richting van een Th1-respons. Goede resultaten werden bekomen door toediening van granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). GM-CSF, dat reeds als adjuvans bij DNA vaccinatie wordt gebruikt, stimuleert de aanmaak van witte bloedcellen en maakt bijgevolg het vaccin potenter (4, 12). Bij toediening 24u na het mRNA vaccin zal het de Th2-respons switchen naar een Th1-respons (6, 10, 11).
8
1.3
MESSENGER RNA VACCINATIE
1.3.1 De aanmaak De aanmaak van mRNA start steeds vertrekkende van plasmide DNA. Dit geproduceerde plasmide wordt gelineariseerd met behulp van een restrictie-enzym, dat knipt in een unieke restrictiesite downstream van de poly-A staart. Het gelineariseerde plasmide doet vervolgens dienst als template voor de mRNA productie. Met behulp van een RNA polymerase, dat een promotor herkent die zich voor het te transcripteren gen bevindt, wordt het mRNA gevormd. Belangrijk is dat de 4 nucleotiden (ATP, UTP, GTP en CTP) in het reactiemidden aanwezig zijn, evenals een voldoende hoeveelheid Capanaloog. Na de transcriptie wordt DNase toegevoegd om het DNA te vernietigen. Vervolgens kan het mRNA via verschillende methoden opgezuiverd worden. Een van de beste methoden om het mRNA te zuiveren is het gebruik van chromatografische technieken. Hierbij zal niet alleen het mRNA uit het mengsel gehaald worden, maar kan ook mRNA van verschillende lengtes gescheiden worden. Langere of kortere mRNA-strengen die mogelijks gevormd worden in de reactie, worden op deze manier verwijderd (10, 11). De efficiëntie van dit proces is zeer hoog. Vb. uit 1 µg DNA kan een productie van ongeveer 30µg mRNA bekomen worden (11). Het mRNA kan voor lange tijd bewaard worden bij -20 of -80°C . Bij 4°C kan het slechts enkele dagen bewaard worden (10).
1.3.2 De werking Na toediening en opname van het mRNA in de cel wordt het, in het cytosol, getranslateerd tot proteïnen. In het cytosol zijn ook steeds proteasen aanwezig die verantwoordelijk zijn voor de gelimiteerde proteolyse van proteïnen tot peptiden (1). Deze in de cel ontstane peptiden worden vervolgens in het endoplasmatisch reticulum geladen op MHC klasse I moleculen (8). Wanneer de getransfecteerde cellen APC’s zijn (en dus het costimulatoir signaal kunnen geven, nodig voor de activatie van naïve T-cellen), kunnen ze CD8+ cytotoxische T-cellen activeren. Peptiden in APC kunnen ook binden aan MHC klasse II moleculen, waardoor ze CD4+ T-helpercellen kunnen activeren. Naast de cellulaire tak, kan ook de humorale tak geactiveerd worden door mRNA vaccins. Dit gebeurt door proteïnen die in de extracellulaire matrix terechtkomen en de B-cellen stimuleren (11).
9
1.3.3 De stabiliteit Messenger RNA bestaat uit 5 delen (zie figuur 1.4). Het begint met een 5’ capstructuur. Vervolgens bevindt zich de 5’ UTR (5’ untranslated region), waarna de sequentie volgt die codeert voor een bepaald proteïne. Deze sequentie moet meestal starten met een ATG codon in Kozakomgeving en zal eindigen met een stopcodon. Na het stopcodon zit een 3’ UTR en uiteindelijk eindigt het mRNA met een poly-A staart (5, 10).
Figuur 1.4 De structuur van een mature mRNA-molecule met zijn 5 verschillende onderdelen; de 5’ Capstructuur, het 5’UTR, de coderende regio, het 3’UTR en de poly-A-staart.
De efficiëntie van een vaccin hangt af van de duur en de mate van de expressie van het gevormde proteïne. Er worden dus veel inspanningen geleverd om de transcriptie van mRNA te verbeteren en om mRNA te stabiliseren, waardoor er respectievelijk een sterkere en langere expressie bekomen wordt (10).
De 5’ Cap is een guanine nucleotide, essentieel voor de translatie (13) (zie figuur 1.5) (http://www.invitrogen.com (05/03/2012)). De 5’ Cap is via een 5’5’trifosfaatbinding verbonden met het 5’ einde van de RNA streng. Door deze binding lijkt dit uiteinde op het 3’ einde van het mRNA, waardoor het resistent wordt
aan
de
afbraak
door
5’
exonucleasen. Een probleem dat zich
Figuur 1.5 De chemische structuur van de 5’ Cap. (C1: de normaal gebruikte Cap; C3: de gemodificeerde ARCA)
voordoet bij mRNA vorming, is dat het Cap-dinucleotide, dat meestal gebruikt wordt, twee OH-functies (op de 3’C-atomen) bezit die aan de binding kunnen deelnemen. De molecule kan dus in 2 richtingen geïncorporeerd worden.
10
Bij de aanmaak van synthetisch mRNA zal 80% van het mRNA gecapt worden, maar slechts de helft van het gevormde mRNA zal dus functioneel zijn. Een mogelijkheid om dit te omzeilen is het gebruik van een Cap-molecule gemodificeerd aan de OH-functie die de vorming van het niet-functionele mRNA bewerkstelligt. Door deze modificatie kunnen enkel de juist gecapte mRNA-molecules gevormd worden. Anti-reverse Cap (ARCA) is zo een gemodificeerde Cap die vaak wordt gebruikt. Modificatie van de Cap-molecule zal mogelijks nog extra verbeteringen geven in de translatie-efficiëntie door momenteel nog onbekende redenen (10).
Een andere aanpassing, voor het verbeteren van de translatie-efficiëntie, is codon optimalisatie. Bepaalde codons hebben een tRNA, rijker aanwezig in het organisme dan andere. Deze codons zullen dus sneller getranslateerd worden dan de codons die een zeldzamer tRNA bezitten. Door het aanpassen van de mRNA structuur naar gunstige codons (waarvoor veel tRNA’s aanwezig zijn), zal het mRNA sneller getranslateerd worden en zullen er dus meer proteïnen gesynthetiseerd worden (12). Deze optimalisatie van het mRNA wordt door verschillende bedrijven aangeboden (10).
Na het stopcodon, maar voor de poly-A staart, bevindt zich nog een belangrijke regio, het untranslated 3’ einde (3’ UTR). Deze regio wordt niet overgeschreven, maar speelt (samen met de poly-A staart) een belangrijke rol in de stabiliteit van het mRNA (12). Wanneer de 3’UTR rijk is aan pyrimidinesequenties, zal deze stabiliserende eigenschappen krijgen. AUrijke sequenties daarentegen worden het best verwijderd, aangezien deze destabiliserende eigenschappen geven aan het mRNA. Messenger RNA dat wordt gebruikt voor vaccins, zal meestal een globine stabiliserende UTR bevatten, rijk aan pyrimidines (10).
Een laatste belangrijke aanpassing heeft betrekking tot de poly-A staart. De poly-A staart speelt een zeer belangrijke rol, zowel in het remmen van de degradatie en de decapping, als in het verbeteren van de translatie (13). Er wordt aangenomen dat het verlengen van de poly-A staart tot 120 adenosineresiduen een positief effect heeft op de mRNA stabiliteit en op de translatie-efficiëntie. De optimale lengte zou echter afhankelijk zijn van celtype tot celtype (5).
11
1.4
HET WEST NILE VIRUS Het West Nile Virus behoort tot het genus van de flavivirussen. Het is een RNA (+) virus
dat de genen bevat voor 10 virale proteïnen. Belangrijke genen voor de immuniteit (en vaccinontwikkeling), zijn
de
genen
van
de
2
oppervlakte
glycoproteïnen; het
premembraan/membraan glycoproteïne (prM/M) en het envelop glycoproteïne (E) (14, 15). Het West Nile virus is een virus dat wordt overgedragen door muggen. Geïnfecteerde muggen bezitten viruspartikels in hun speekselklieren en bij het zuigen van bloed bij mens of dier, zullen deze worden doorgegeven. Het virus kan infectie veroorzaken in een grote waaier aan species gaande van mensen tot paarden, vogels, honden, katten,… De vogels zijn het reservoir van het virus. Ze worden ook wel de versterkende gastheer genoemd, aangezien het virus zich in hen kan vermenigvuldigen en ze hierdoor nieuwe muggen kunnen besmetten (15). Mensen, paarden en andere dieren worden aangezien als doodlopende gastheren daar zij slechts een korte periode van viremie doormaken. Hierdoor zullen zij meestal geen nieuwe muggen besmetten
(14)
(zie
figuur
1.6)
(http://www.metrovancouver.org/services/wnv/Pages/AboutTheVirus.aspx (05/03/2012)). Het virus is niet overdraagbaar van mens op mens, maar er zijn wel gevallen gerapporteerd van overdracht via bloedtransfusie, orgaantransplantatie of van overdracht van moeder op kind via de placenta of via borstvoeding (14).
Figuur 1.6 De levenscyclus van het West Nile virus. De vogels zijn de versterkende gastheren en zullen nieuwe muggen besmetten. De mens, paarden,… zijn doodlopende gastheren door hun korte periode van viremie.
Het West Nile virus is een zeer wijd verspreid virus. Op vele plaatsen komt het slechts sporadisch voor, maar er waren reeds meldingen van epidemieën in Afrika, Australië, het Midden
Oosten,
Europa,
Azië
en
de
12
USA
(14,
15).
(zie
figuur
1.7)
(http://health.howstuffworks.com/diseases-conditions/infectious/west-nile-virus5.htm (30/03/2012))
Figuur 1.7 De verspreiding van het West Nile virus wereldwijd.
Bij het overgrote deel van de geïnfecteerden (90%) verloopt de infectie zonder symptomen of heeft men slechts last van lichte koorts. Wanneer er zich echter symptomen voordoen, zijn deze vaak aspecifiek. Zo kan er naast de lichte koorts ook vermoeidheid, hoofdpijn, gewrichtspijnen, rillingen, lymfadenopathie,… voorkomen. Bij minder dan 1% van de besmettingen treden er ernstige symptomen op met betrekking tot het centraal zenuwstelsel (meningitis, encephalitis), deze kunnen tot een dodelijke afloop leiden. Oudere personen of personen met een verminderde immuniteit, lopen een hoger risico op het krijgen van deze levensbedreigende complicaties (14, 15).
1.4.1 De behandeling Een afdoende behandeling (antivirale middelen) tegen het West Nile virus is (nog) niet ter beschikking (7, 14). De patiënten zullen eerder symptomatisch en ondersteunend moeten behandeld worden (15). Er gaan echter steeds meer stemmen op om meer inspanningen te doen om de infectie zoveel mogelijk te proberen voorkomen. Voorkomen van de infectie kan worden bereikt door het vermijden van muggenbeten. Volledig voorkomen van muggenbeten is echter zeer moeilijk en het gebruik van veel insecticiden brengt potentiële toxiciteit met zich mee (7). Een tweede mogelijkheid voor het voorkomen van de infectie, is vaccinatie. Aangezien het West Nile virus een geschiedenis heeft met het optreden van epidemieën en door het voorkomen van levensbedreigende complicaties, lijkt de ontwikkeling van een vaccin voor de
13
mens tegen het West Nile virus verantwoord. Toch blijft de vraag of het op grote schaal toedienen van het vaccin een voldoende groot rendement zal geven, uitgaande van het feit dat het voornamelijk om een sporadisch voorkomende infectieziekte gaat. Een optimaal vaccin voor deze situatie zou een vaccin zijn, dat enkele dagen na toediening reeds bescherming geeft en dus kan toegediend worden wanneer er een epidemische dreiging ontstaat (7). Belangrijke kandidaten voor vaccinatie zijn personen met hoge besmettingskans of mensen met een hoge kans op het krijgen van ernstige complicaties.
1.4.2 Vaccins tegen WNV Momenteel is er nog geen vaccin op de markt dat goedgekeurd is voor de immunisatie van mensen. Wel zijn er verschillende vaccins in ontwikkeling (14, 15). Er zijn wel verschillende vaccins op de markt voor paarden. Nochtans is er een bijkomende voorwaarde voor het op de markt mogen brengen van een vaccin voor dieren. Deze voorwaarde is dat het veilig moet zijn voor de mens wanneer het dier eventueel zou geconsumeerd worden (7). De reden voor het op de markt zijn van een vaccin voor paarden is dat het West Nile virus belangrijke negatieve gevolgen heeft op de paardenhandel De oorzaak daarvan is niet alleen te zoeken bij de sterfte of ziekte van de dieren, maar ook door problemen die het veroorzaakt met betrekking tot de handel of door afgelasten van paardenevenementen.
14
2
OBJECTIEVEN Het West Nile virus is een wijd verspreid virus dat reeds verscheidene epidemieën
veroorzaakte over een groot deel van de wereld. Door de levensbedreigende complicaties bij de mens en door het verlies van veel geld in de paardenindustrie, is er een grote belangstelling voor de ontwikkeling van een vaccin tegen het West Nile virus. De industrie is op zoek naar een vaccin dat direct na toediening reeds bescherming geeft, zodat het kan toegediend worden wanneer er een epidemische dreiging ontstaat. Een mogelijk kandidaatvaccin, is een genetisch vaccin. Hierbij bestaan 2 varianten; een DNA- of een RNAvaccin. Bij een genetisch vaccin zullen de genen van de virale antigenen worden toegediend, waarna de proteïnen door de gastheer worden aangemaakt. Hierdoor zal zowel een T-cel(CTL en T-helper respons) als een antilichaamrespons tot stand komen. Extra voordelen ten opzichte van andere vaccins, zijn de eenvoudige en goedkope aanmaak, de eenvoudige bewaring in de gelyofyliseerde vorm en de mogelijkheid tot de vorming van één vaccin tegen verscheidene antigenen. RNA-vaccins hebben hier bovenop nog de voordelen dat ze de nucleus niet moeten bereiken waardoor ze de belangrijkste oorzaak van de lage immunogeniciteit van de DNA-vaccins mogelijks omzeilen, ze hebben geen nood aan een efficiënte promotor, ze kunnen niet incorporeren in het DNA van de gastheer en ze zullen geen tolerantie geven.
In deze thesis wordt onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van een mRNA-vaccin tegen het West Nile virus. Hierbij zal er een plasmide gevormd worden waarin het gen coderend voor het E-proteïne is geligeerd. Ook het luciferasegen wordt in de pT7Ts-vector geligeerd. Eens dit plasmide gevormd is, wordt het gelineariseerd en vervolgens gebruikt voor de productie van mRNA. Bij gebruik van de pT7Ts-vectorplasmide, wordt er echter een mRNA bekomen met een lage stabiliteit. Om deze reden wordt er een fragment in het plasmide geligeerd dat de stabiliserende UTR bevat en een langere poly-A staart. Deze zijn bevorderlijk voor de stabiliteit van het mRNA.
Een tweede onderdeel van de thesis is het onderzoek naar het stimulerende epitoop van het E-proteïne voor het DNA-vaccin. Dit peptide wordt gebruikt om de cellen van de milt te
15
stimuleren tot cytokineproductie, waarna dit kan gecontroleerd worden via ELISPOT. Het gebruik van een peptide, in de plaats van het volledige proteïne, voor de stimulatie heeft een belangrijk aantal voordelen. Zo is de aanmaak van een peptide eenvoudiger en goedkoper dan de aanmaak van een proteïne.
16
3 3.1
3.2
MATERIAAL EN METHODEN VEEL GEBRUIKTE MATERIALEN
Autoclaaf: systec VB-55, Wettenberg, Duitsland
Centrifuge: Sorvall RC-5B, Thermo Scientific, Wilmington, USA
Eppendorf centrifuge: Eppendorf 5415D, Hamburg, Duitsland
Vortex: MS1 Minishaker IKA, Staufen, Duitsland
Isopropanol: VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk
Ethanol 70%: VWR international, Leuven, België
PLASMIDEN Tijdens het onderzoek wordt gebruik gemaakt van 2 plasmiden. (zie figuur 3.1)
(http://www.idtdna.com en http://www.xenbase.org (09/03/2012)) Plasmide pT7Ts is gebaseerd op de vector pGEM4Z en wordt als kloneringsvector gebruikt. Het pIDTsmart plasmide bevat het 3’UTR en de A149 poly-A staart die in pT7Ts gekloneerd worden om het later te produceren mRNA extra stabiliteit te geven. Op beide plasmiden is het gen voor ampicillineresistentie aanwezig, zodat ze selectief kunnen opgegroeid worden. Vervolgens zal het luciferasegen of het gen coderend voor het E-proteïne in het plasmide met de stabiliserende sequenties gekloneerd worden.
Figuur 3.1 Links: pIDTsmart plasmide. Rechts: deel van de sequentie van pT7Ts.
17
3.3
PLASMIDEN OPGROEIEN
3.3.1 Protocol In een 50ml tube wordt 6ml LB-medium gebracht. Hierbij wordt 6µl ampicilline (finale concentratie 100µg/ml) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) gevoegd en 60µl bacteriën, die de plasmiden bevatten (pT7Ts of pIDTsmart). Deze procedure wordt uitgevoerd in een LAFkast.
3.3.2 Samenstelling van de gebruikte oplossingen LB-medium Voor de aanmaak van 1L LB-medium worden 10g trypton (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), 5g gistextract (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 10g NaCl (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) opgelost in gedestilleerd water. Na de aanmaak wordt het LBmedium geautoclaveerd.
3.4
PLASMIDEN OPZUIVEREN In deze thesis worden 2 methoden gebruikt om plasmiden op te zuiveren uit de
bacteriën; de Qiagen methode en de Birnboim methode.
3.4.1 Protocol Qiagen methode (MINI/MIDI prep) Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een kit van de firma Qiagen (Hilden, Duitsland). Na een nacht groei bij 37°C, worden de kiemen afgecentrifugeerd. Het volume in de 50ml tubes wordt hiervoor verdeeld over verschillende 2ml eppendorfjes. Deze worden 5 minuten bij 14000rpm gecentrifugeerd. Het supernatans wordt verwijderd en aan de pellet wordt 300µl P1 buffer (resuspensiebuffer) toegevoegd. De epjes worden gevortexed om de cellen terug in suspensie te brengen. 300µl P2 buffer (lysebuffer) wordt toegevoegd waarna voorzichtig wordt geschud en de epjes 5 minuten geïncubeerd worden bij kamertemperatuur. De suspensie zal blauw kleuren bij deze stap, omwille van de aanwezigheid van de kleurindicator
LyseBlue.
Vervolgens
wordt
er
aan
elk
epje
300µl
P3
buffer
(neutralisatiebuffer) toegevoegd. Er wordt weer voorzichtig geschud en het epje wordt 10 18
minuten geïncubeerd op ijs. Bij deze stap zal de vloeistof terug wit kleuren en er zal segregatie optreden. Gedurende de 10 minuten dat de epjes op ijs gehouden worden, kan de qiagen-100 kolom geëquilibreerd worden. Dit gebeurt door 4ml QBT buffer (equilibratiebuffer) op de kolom te brengen. De vloeistof die door de kolom loopt wordt opgevangen in een tube. Na de 10 minuten incubatie op ijs, worden de eppendorfs 15 minuten gecentrifugeerd (14000rpm) waarna het supernatans, waarin het DNA zich bevindt, op de geëquilibreerde kolom wordt gebracht. Het pDNA zal vastgehouden worden op de kolom. Vervolgens wordt de kolom 2 maal gewassen met 10ml QC buffer (wasbuffer). Na deze stappen wordt de kolom op een nieuwe tube gebracht, waarna het DNA ervan wordt geëlueerd met behulp van 5ml buffer QN (elutiebuffer). Bij deze 5ml eluens wordt 3.5ml isopropanol gevoegd (0.7x het volume van het eluens). Het bekomen volume wordt verdeeld over 4 epjes van 2ml waarna ze 30 minuten gecentrifugeerd worden. Het neergeslagen DNA wordt gewassen met 1ml koude 70% ethanol. Weer wordt er 5 minuten gecentrifugeerd en wordt het supernatans verwijderd. Het DNA-pelletje wordt gedroogd aan de lucht tot alle ethanol verdampt is. Tenslotte wordt bij elk epje 30µl water gevoegd om het DNA op te lossen.
3.4.2 Protocol birnboim methode De buffers die gebruikt worden, zijn bekomen via de firma Qiagen (Hilden, Duitsland). Na 12 uur groeien, zullen de E.coli bacteriën geoogst worden; de helft van het medium wordt verdeeld over eppendorfs. Hiervan wordt 1.5ml gepippeteerd per epje. Vervolgens worden de epjes gecentrifugeerd (5min aan 12000rpm). Het supernatans wordt verwijderd en van de overige hoeveelheid cultuur wordt bij elk epje 1.5ml gevoegd. Opnieuw wordt er 5 minuten aan 12000rpm gecentrifugeerd en wordt het supernatans verwijderd. De bekomen pellets worden gehersuspendeerd in 200μl TE-buffer, door op en neer pipetteren. Vervolgens wordt er 400μl P2-buffer (lysebuffer) bij elk epje gevoegd. Dit wordt gemengd en 3 minuten geïncubeerd. Vervolgens wordt 300μl P3-buffer (neutralisatiebuffer) toegevoegd. Het geheel wordt 5 minuten gecentrifugeerd (12000rpm) waarna het supernatans wordt overgebracht in nieuwe epjes. 500μl fenol (Vel n.v., Leuven, België) /chloroform (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) (1:1) wordt toegevoegd waarna grondig gevortexed wordt om de 2 fasen de kans te geven goed met elkaar in contact te komen. 19
Vervolgens wordt er 5 minuten gecentrifugeerd (12000rpm) om de fasen terug te scheiden. Na centrifugatie wordt de bovenste fase afgenomen en in nieuwe epjes gebracht. Hieraan wordt 500μl chloroform (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) /isoamylalcohol (UCB, Leuven, België) (24:1) toegevoegd. Er wordt gevortexed en opnieuw 5 minuten gecentrifugeerd (12000rpm). Weer wordt de bovenste fase overgebracht in nieuwe eppendorfs. Dit maal wordt 750μl isopropanol toegevoegd, waarna er grondig gemengd wordt. De epjes worden 5 minuten bij 4°C geplaatst, waarna ze 5 minuten gecentrifugeerd worden (12000rpm). Het supernatans wordt verwijderd en er wordt 500μl 70% ethanol toegevoegd aan de pellets. Na centrifugatie (5min aan 12000rpm) wordt alle ethanol verwijderd. De pellets worden gedroogd aan de lucht en opgelost in 30μl water.
3.5
KLONEREN VAN PLASMIDEN
3.5.1 Principe Voor het kloneren van een insert in een vectorplasmide worden zowel het insert als de vector geknipt met restrictie-enzymen. Deze
enzymen
(ook
endonucleasen
genoemd) herkennen en knippen een specifieke sequentie in het DNA. Voor het knippen van een plasmide, is naast
het
restrictie-enzym
ook
de
aanwezigheid van bovine serum albumine Figuur 3.2 Het vormen van sticky ends en blunt ends (BSA) (0.01µl/µl) en van de optimale door restrictie-enzymen. buffer (0.1µl/µl) in het medium noodzakelijk. Er wordt steeds geknipt met minimum 1 unit enzym per microgram plasmide DNA.
De knip van restrictie-enzymen kan recht (ontstaan van “blunt” uiteinden) of scheef zijn (ontstaan
van
“sticky”
uiteinden).
(zie
figuur
3.2)
(http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/Lecture2.html(09/03/20 12)). De ligatie van DNA-fragmenten met sticky uiteinden zal een betere opbrengst geven dan ligatie van blunt ended DNA.
20
Voor het knippen van zowel de vector (pT7Ts) als de insert (pIDTsmart) worden 2 verschillende restrictie-enzymen gebruikt. Beide enzymen herkennen een andere sequentie, waar ze na het knippen andere sticky uiteinden vormen. Aangezien zowel de vector als de insert met dezelfde enzymen worden geknipt, zullen ze compatibele sticky uiteinden bezitten. Doordat sticky uiteinden enkel kunnen ligeren wanneer de uiteinden compatibel zijn, kan het insert slechts in 1 richting in de vector geligeerd worden. Deze methode van kloneren wordt directioneel klonen genoemd. Het is belangrijk om restrictie-enzymen te gebruiken die slechts eenmaal knippen in het plasmide. Er wordt daarom in ons geval gekozen voor de enzymen SpeI en PstI voor het invoegen van het stabiliserende fragment en voor SpeI en BglII voor het invoegen van het luciferasegen of het gen coderend voor het E-proteïne. Bij het knippen met de restrictie-enzymen wordt er vaak geen 100% rendement verkregen. Om deze reden wordt er na het knippen met een restrictie-enzym gecontroleerd met agarose gelelektroforese of het enzym effectief geknipt heeft. Enkel het geknipte plasmide wordt opgezuiverd uit de gel en daarmee wordt verder gewerkt. Wanneer het mengsel echter direct zou gebruikt worden, zonder opzuivering van het gewenste fragment, kunnen er nog plasmiden aanwezig zijn die slechts met 1 restrictieenzym geknipt zijn. Bij deze plasmiden zal er zelf-ligatie optreden aangezien terug sluiten, zonder insert, efficiënter gebeurt dan het ligeren van een insert in een vector. Om dit te voorkomen kan 1 van de 2 DNA-fragmenten (de geknipte vector, of het insert) behandeld worden met fosfatase (CIAP=calf intestinal alkaline phosphatase) vooraleer de vector en insert te ligeren. Vervolgens wordt een mengsel van vector en insert geïncubeerd met T4 DNA ligase in aanwezigheid van de ligatiebuffer. T4 DNA ligase zorgt voor de vorming van een fosfordiesterbinding tussen het 5’ fosfaateinde en het 3’ OH-einde van de DNA strengen. De optimale temperatuur voor ligatie ligt tussen de 4 en 37°C.
Figuur 3.3 De formule voor de bepaling van de benodigde volumes voor het bekomen van een optimale ligatiereactie. Il insert lengte, Vl vector lengte, Ic insert concentratie, Vc vector concentratie, Ir insert-totvector ratio (insert/vector), T totaal volume van de DNA oplossing, Vv vector volume, Iv insert volume.
21
Voor het verkrijgen van de ligatie van 1 insert in 1 vector is het belangrijk dat de verhouding van de concentraties van vector en insert optimaal is. Een eenvoudige en snel te gebruiken formule voor het berekenen van de optimale hoeveelheden die samengevoegd moeten worden is de formule weergegeven in figuur 3.3. (16).
3.5.2 Gelelektroforese 3.5.2.1 Principe Gelelektroforese kan gebruikt worden om DNA-fragmenten te scheiden en om te controleren of restrictie-enzymen effectief geknipt hebben. Dit doordat de snelheid van migratie van DNA-moleculen door de agarosegel afhankelijk is van hun grootte en van hun conformatie.
Figuur 3.4 Links: De 1kb ladder. Rechts: De hyperladder IV.
De grootte van de DNA fragmenten, alsook hun concentratie kan bepaald worden aan de hand van een DNA-ladder. Deze bevat verschillende fragmenten van gekende lengtes. De ladders die hier gebruikt worden, zijn de 1kb ladder of de hyperladder IV (zie figuur 3.4). De concentratie agarose die gebruikt wordt om de gel te gieten is afhankelijk van de grootte van de te scheiden DNAfragmenten. Hoe kleiner de fragmenten, hoe groter het percentage aan agarose dat zal gekozen worden. Meestal wordt er in deze thesis gekozen voor een 0.8% gel. Voor fragmenten kleiner dan 500bp wordt er wel best gekozen voor een gel met Figuur
3.5 Chemische structuur ethidiumbromide.
een hogere concentratie.
22
Het visualiseren van de gescheiden DNA fragmenten gebeurt d.m.v. ethidiumbromide (zie Figuur 3.5), welke aan de agarosegel wordt toegevoegd. Ethidiumbromide is een planaire molecule die bindt aan het DNA door te intercaleren tussen de basenparen. Wanneer de gel belicht wordt met ultraviolet (UV) licht, zullen de gebieden van de gel die het DNA bevatten fluoresceren.
3.5.2.2 Protocol gelelektroforese Een bepaalde hoeveelheid agarose (3.2g voor een 0.8% gel) (MDBio,Inc, Piscataway, USA) wordt afgewogen, in een glazen fles gebracht en aangelengd tot 400ml met TBE-(1x)buffer. Aangezien agarose slecht oplosbaar is, wordt het geheel opgewarmd in een microgolfoven tot alles is opgelost. De oplossing wordt vervolgens gekoeld tot 55°C in een warmwaterbad. Eens afgekoeld wordt ethidiumbromide (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) toegevoegd (0.1ml/L). Een gelbakje wordt afgeplakt met tape, een kammetje wordt geplaatst en de gel wordt gegoten. Na de stolling worden het kammetje en de tape verwijderd, waarna het gelbakje in het elektroforesetoestel wordt geplaatst. Hierbij is het belangrijk dat de gel volledig ondergedompeld is in TBE-oplossing vooraleer de stalen worden geladen. Ladingsbuffer wordt toegevoegd aan de stalen (0.2µl/µl) waarna de stalen in de laantjes worden geladen. Ook wordt er een laantje geladen met 10µl van een bepaalde DNA-ladder. De stroombron wordt aangesloten en de DNA-moleculen krijgen de tijd om door de gel te migreren. Vervolgens wordt de gel uit het elektroforesetoestel gehaald en bekeken onder UV-licht.
3.5.2.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen TBE-buffer (10x) 109.03g Tris (Gentaur, Kampenhout, België) wordt samengevoegd met 55.66g Boorzuur (VWR international, Leuven, België) en 40ml 0.5M EDTA (VWR international, Leuven, België) waarna aangelengd wordt tot 2L met gedestilleerd water. Vervolgens wordt de oplossing geautoclaveerd. Voor een 1x oplossing wordt nog 1 op 10 verdund met gedestilleerd water. 23
Ladingsbuffer Er wordt een oplossing gemaakt die 30% (v/v) glycerol (UCB, Leuven, België), 0.25% xyleencyanol-FF (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) en 0.25% broomfenolblauw (UCB, Leuven, België) bevat.
3.5.3 Elueren van DNA uit agarosegel 3.5.3.1 Principe Om verder te werken met de stalen die m.b.v. gelelektroforese gescheiden zijn, wordt het DNA opgezuiverd uit de gel. Hiervoor gebruiken we de geneclean kit van MPBio (Illkirch, Frankrijk).
3.5.3.2 Protocol elueren van DNA uit agarosegel Nadat de gewenste band uit de gel gesneden werd, werd zijn gewicht bepaald. Afhankelijk van het gewicht van de uitgesneden gel wordt er een bepaalde hoeveelheid TBE modifier en NaI toegevoegd (0.5x TBE en 4.5x NaI). Vervolgens wordt het epje in een warmwaterbad van 45-55°C gebracht tot de gel volledig opgelost is. Een bepaalde hoeveelheid Glassmilk, afhankelijk van het volume reeds aanwezig in het epje, wordt toegevoegd. De oplossing wordt gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd terwijl er gemengd wordt, zodat de partikels niet sedimenteren. Nadien wordt er gecentrifugeerd (5 sec bij 14000rpm) om het DNA, gebonden aan de glassmilkpartikels, te pelleteren. Het supernatans wordt verwijderd en 500µl New Wash wordt toegevoegd. Het pellet wordt terug in suspensie gebracht door verschillende malen op en neer te pipetteren. Na centrifugatie (5sec bij 14000rpm) wordt de wasoplossing verwijderd. De wasstap wordt herhaald waarna het pellet gedroogd wordt aan de lucht. Het is hierbij belangrijk dat alle ethanol verdampt is. Nadien wordt het pellet terug opgelost in een bepaalde hoeveelheid water. Na 30 seconden centrifugeren wordt het supernatans overgebracht naar een nieuw epje. Het DNA is aanwezig in dit supernatans.
24
3.5.4 Nanodrop 3.5.4.1 Principe De nanodrop is een spectrofotometer waarmee kleine volumes kunnen geanalyseerd worden. De vloeistof met de te meten moleculen wordt op zijn plaats gehouden d.m.v. de oppervlaktespanning, waardoor het gebruik van cuvetten omzeild wordt. (zie figuur 3.6) De nanodrop wordt gebruikt om de concentratie van Figuur 3.6 Illustratie nanodrop. DNA of RNA en van proteïnen te bepalen. Deze bepaling gebeurt door analyse van de absorbantie van de uitgezonden lichtstraal bij een golflengte van 260nm (nucleïnezuren) en 280nm (proteïnen). Hoe hoger de concentratie, hoe meer absorptie wordt gemeten. De waarde zal steeds gecorrigeerd worden ten opzicht van een blancometing. De nanodrop kan ook gebruikt worden om de zuiverheid van DNA- of RNA-stalen te bepalen. Dit zal gebeuren aan de hand van 2 belangrijke ratio’s; de 260/280-ratio en de 260/230-ratio.
3.5.4.2 Protocol nanodrop De nanodrop ND-100 spectrofotometer (Thermo scientific, Wilmington, USA) wordt gebruikt. Vooraleer er kan begonnen worden met de metingen, moet het meetoppervlak van het toestel 2x gespoeld worden met gedestilleerd water. Vervolgens wordt 2µl blanco oplossing aangebracht en wordt een blancometing uitgevoerd. De effectieve metingen worden gedaan door telkens 1µl van het staal op het meetoppervlak te brengen en op “measure” te klikken. De concentratie alsook de 260/280 en 260/230 ratio’s worden weergegeven. Tussen elke meting wordt het staal afgeveegd met een tissue.
3.5.5 Protocol defosforyleren van plasmiden De reactie wordt uitgevoerd in een eppendorf in een volume van 10µl. Een bepaalde hoeveelheid (vb. 8.5µl) plasmide oplossing wordt samengebracht met 1µl van de fosfatase buffer (10x) (Fermentas, Leon-Rot, Duitsland). Als laatste wordt 0.5µl fosfatase (Fermentas,
25
Leon-Rot, Duitsland) toegevoegd. Dit mengsel wordt 30 minuten geïncubeerd in een warmwaterbad van 37°C. Nadien wordt het enzym geïnactiveerd door het epje gedurende 10 minuten in een warmwaterbad van 75°C te plaatsen.
3.5.6 Protocol ligatie van vector pT7Ts met pIDTsmart-fragment Ligeren gebeurt in een eppendorfje, in een volume van 10µl. Een bepaalde hoeveelheid (vb. 3µl) van de vector wordt samengevoegd met een bepaald volume (vb. 4µl) van het fragment, afhankelijk van de concentraties van de oplossingen. Daarbij wordt 2µl van de 5x DNA Ligase reaction buffer gevoegd en tenslotte 1µl T4 DNA Ligase (beide van Invitrogen, Carlsbad, USA). Dit mengsel wordt gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geplaatst.
3.5.7 Transformeren van plasmiden 3.5.7.1 Principe Bij transformatie zal er vreemd DNA in de bacteriële cel worden gebracht. Het hydrofiele DNA zal echter niet zomaar door het celmembraan van de bacteriën penetreren. Om deze reden moeten de cellen eerst competent gemaakt worden. Het mechanisme waarmee het DNA vervolgens de cel penetreert, is nog niet voor 100% opgeklaard. Toch is er met zekerheid geweten dat de aanwezigheid van divalente kationen in het medium cruciaal is. De verklaring daarvoor zou kunnen gevonden worden in het feit dat er afstoting ontstaat doordat zowel de fosfolipiden, waaruit het celmembraan is opgebouwd, als de DNAmoleculen negatief geladen zijn. Wanneer er echter Ca2+ aanwezig is, zal dit de negatieve ladingen in de poriën kunnen neutraliseren waardoor het DNA wel zal binnendringen (17).
3.5.7.2 Protocol transformatie van het chimeer plasmide in E.coli Er wordt gebruik gemaakt van 2 verschillende competent gemaakte E.coli stammen (De MC1061 stam en de DH5α stam) (Invitrogen, Carlsbad, USA). Deze cellen worden ontdooid op ijs (0°C). In een eppendorfje wordt 50µl van de competente E.coli cellen samengevoegd met 2.5µl van het ligatieproduct. De epjes worden 30min geïncubeerd op ijs. Nadien wordt het epje 45sec bij 42°C gebracht, waarna het 2 minuten op ijs wordt geplaatst. Na de 26
hitteshock wordt er 500µl van een 50/50-mengsel van LB en SOB medium toegevoegd. Dit wordt 1 uur geïncubeerd in een schudder bij 37°C. Hierna kan er uitgeplaat worden.
3.5.7.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen LB-medium Zie 3.3.2 SOB-medium Voor de aanmaak van 1L SOB-medium worden 20g trypton (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), 5g gistextract (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 0.5g NaCl (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) opgelost in gedestilleerd water. Deze oplossing wordt geautoclaveerd waarna er 10ml van een 1M MgCL2-oplossing (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) en 10ml van een 1M MgSO4-oplossing (Merck, Leuven, België) wordt toegevoegd. Tenslotte wordt deze oplossing gesteriliseerd m.b.v. een filter.
3.5.8 Uitplaten van getransformeerde cellen 3.5.8.1 Protocol De getransformeerde E.coli cellen worden uitgeplaat op ampicilline bevattende LBgroeibodems. Een bepaalde hoeveelheid getransformeerde cellen (vb. 300µl medium) wordt op de bodems gepipetteerd en met behulp van glasparels homogeen uitgespreid. De platen worden overnacht geïncubeerd bij 37°C.
3.5.8.2 Samenstelling van de gebruikte oplossingen LB-medium voor de groeibodems Aan 200ml LB-medium (zie 3.3.2 ) wordt 4g agar (Invitrogen, Carlsbad, USA) toegevoegd. Vervolgens wordt het mengsel geautoclaveerd. Na autoclaveren, vlak voor het gieten van de platen, zal er ampicilline (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) (100µg/ml) toegevoegd worden. De bodems worden in petrischalen gegoten onder een laminaire flow waarna ze de tijd krijgen om te stollen.
27
3.5.9 Polymerase chain reaction (PCR) 3.5.9.1 Principe PCR wordt gebruikt voor het vermenigvuldigen van een bepaalde regio van het genetisch materiaal. De PCR reactie omvat een aantal cycli waarbij meestal drie temperaturen worden doorlopen. Eén cyclus bestaat uit de volgende stappen: denaturatie, primerannealing en extentie. In eerste instantie wordt het mengsel bij 94°C geplaatst, wat zal leiden tot de denaturatie van het dubbelstrengig template. Vervolgens wordt de temperatuur snel verlaagd tot 50°-60°C, wat specifieke hybridisatie toelaat van het enkelstrengig DNA met de primers, die perfect complementair zijn met de sequentie van het template. Hierna wordt de temperatuur verhoogd tot 72°C, zodat het Taq DNA polymerase nucleotiden kan inbouwen aan de primers. Een goede werking van het polymerase vergt een juiste zoutconcentratie. De concentratie van MgCl2 wordt empirisch bepaald, daar ze afhankelijk is van de gebruikte primers. Naast de zoutconcentratie kan ook de annealingstemperatuur geoptimaliseerd worden.
3.5.9.2 Protocol vermenigvuldigen van het luciferasegen en het gen van het E-proteïne Een eerste PCR-test die uitgevoerd wordt, is voor het bepalen van de optimale MgCl 2concentratie. Er zal hierbij gewerkt worden in een reactievolume van 25µl, bij een annealingtemperatuur van 52°C. Er wordt ook steeds een staal meegenomen zonder DNA voor de controle op eventueel aanwezige contaminatie (negatieve controle: L5 en W5). De samenstelling van de PCR-mix wordt weergegeven in bijlage 1. De T3 Thermocycler van Biometra (Goettingen, Duitsland) wordt gebruikt met het programma eveneens weergegeven in bijlage 1.
3.5.9.3 Protocol voor het testen op de aanwezigheid van het geligeerde gen Ook bij deze reacties wordt er gewerkt in een reactievolume van 25µl en zal hetzelfde toestel met hetzelfde programma worden gebruikt. De samenstelling van de PCR-mix wordt weergegeven in bijlage 2.
28
3.5.10 Sequenering De effectieve sequenering van de plasmiden gebeurt volgens het principe van de methode van Sanger en wordt uitgevoerd in het UZ Gent. De sequentiereactie wordt door ons uitgevoerd en de stalen worden in het UZ Gent in het toestel geladen. Hiervoor zal er een
sequentiemix
gemaakt
worden,
weergegeven
in
bijlage
3,
en
zal
het
sequentieprogramma, eveneens in bijlage 3, doorlopen worden m.b.v. de T3 thermocycler van Biometra (Goettingen, Duitsland).
3.6
PEPTIDENSTAMMEN De BL21 E. coli stammen die de plasmiden bevatten, coderend voor verschillende
peptiden van het domein III van het WNV-E eiwit gefusioneerd met GST (zie tabel 3.1) werden bekomen via Prof. S. Ulbert van het IZI Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (Leipzig, Duitsland). Alle pDNA’s die coderen voor een peptide bevatten ook een kanamycine resistentiegen, terwijl het controle pDNA, dat enkel voor GST codeert, een ampicilline resistentiegen bevat. Tabel 3.1 Sequenties van de geteste peptiden.
De peptidenstammen worden selectief opgegroeid, door de aanwezigheid van het antibioticum, tot de exponentiële groeifase. Op dat moment voegen we IPTG toe aan het groeimedium. De plasmiden bevatten het gen dat codeert voor een autoregulatorische repressor die invloed uitoefent op de pL promotor, gelegen voor het gen van interesse. Door toevoegen van IPTG, dat een synthetisch lactoseanaloog is, kan geen repressie meer optreden en heeft expressie van het gewenste gen plaats. Na
lyse
van
de
cellen,
worden
de
fusieproteïnen
opgezuiverd
m.b.v.
affiniteitschromatografie waarna ze kunnen gebruikt worden voor de stimulatie van de cytokineproductie door de miltcellen in de Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT). 29
3.6.1 Protocol opgroeien en induceren van de bacteriën De gebruikte producten voor dit experiment zijn aangekocht bij Sigma-Aldrich (Steinheim, Duitsland), tenzij anders weergegeven.
3.6.1.1 Principe 50µl van elke verkregen peptidestam wordt samengevoegd met 5ml LB-medium, aangerijkt met het antibioticum waartegen ze resistent zijn. Dit mengsel wordt al schuddend overnacht gegroeid bij 37°C. 500µl van deze cultuur wordt gemengd met 500µl glycerol (UCB, Leuven, België). Dit wordt ingevroren bij -80°C voor eventueel later gebruik. De overnacht gegroeide culturen worden 1/40 verdund met LB-medium. Hiervoor wordt 3.75ml cultuur in 150ml LB gebracht. Ook bij dit mengsel wordt, voor het bekomen van selectieve groei, (150µl) Kanamycine toegevoegd voor de peptidestammen en ampicilline voor de controle. Van deze beginoplossing wordt een staal genomen (50µl) waarvan de OD600 bepaald wordt m.b.v. de nanodrop. Vervolgens worden de oplossingen in de schudder geplaatst bij 37°C om te groeien. Om het uur wordt opnieuw een staal genomen, waarvan de OD600 bepaald wordt. Wanneer de OD600 een waarde tussen 0.6 en 0.8 bereikt, worden de bacteriën geïnduceerd met IPTG (1mM) (Fermentas, Leon-Rot, Duitsland). Na inductie worden de culturen terug in de schudder geplaatst bij 37°C en worden ze ±4 uur gegroeid. Na die periode worden de culturen afgecentrifugeerd en het supernatans wordt verwijderd. Het pellet wordt opgelost in 7.5ml lysebuffer. Dit wordt een half uur geschud bij kamertemperatuur, waarna de tubes worden afgecentrifugeerd (30min aan 15000rpm bij 4°C). Het supernatans wordt overgebracht in een nieuwe tube en dit lysaat zal gezuiverd worden.
3.6.1.2 Samenstelling van de gebruikte oplossingen Lysebuffer De lysebuffer bevat DTT in een concentratie van 1mM, EDTA (VWR international, Leuven, België) in een concentratie van 1mM, 1% (v/v) Triton X-100 en 1mg/ml lysozyme. Deze
30
oplossing wordt gemaakt in een 1x PBS oplossing. Vlak voor gebruik wordt 1 tablet proteaseinhibitor (Roche, Mannheim, Duitsland) toegevoegd per 10ml buffer. PBS PBS is een oplossing (met pH 7.2) van 50mM NaH2PO4 (Vel n.v., Leuven, België) en 150mM NaCl (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk).
3.6.2 Affiniteitschromatografie 3.6.2.1 Principe Door middel van affiniteitschromatografie kan een bepaalde
molecule,
zoals
hier
het
gewenste
fusieproteïne, op een eenvoudige manier en met hoge selectiviteit opgezuiverd worden. Door middel van de glutathione S-transferase (GST) tag kunnen ze selectief vastgehouden worden op een Glutathione HiCap Matrix, terwijl de overige proteïnen en contaminanten worden weggewassen. Na deze stappen kan het GST-tagged proteïne geëlueerd worden door toevoeging van een buffer die gereduceerd GST bevat. (zie figuur 3.7)
3.6.2.2 Protocol zuivering van GST-tagged proteïnen
Figuur 3.7 Het principe van de opzuivering van de GST-tagged proteïnen door middel van een Glutathione HiCap matrix.
Voor de zuivering wordt gebruik gemaakt van materiaal aangekocht bij de firma Qiagen (Hilden, Duitsland). Het protocol uit het Glutathione Affinity Handbook wordt gevolgd. Een lege kolom wordt opgehangen en er wordt 1ml 50% Glutathione HiCap Matrix slurry in gepipetteerd. De bewaringsvloeistof wordt door de kolom gelopen, waarna hij geëquilibreerd wordt m.b.v. 10ml PBS-EW buffer. Ondertussen wordt er een staal van 100µl genomen van het lysaat. Het overige lysaat wordt volledig op de kolom gebracht en de flow through wordt opgevangen in 15ml tubes. Hiervan wordt ook een staal van 100µl genomen. Vervolgens wordt de kolom 2x gewassen met 2.5ml PBS-EW. De doorgelopen vloeistof wordt
31
steeds opgevangen in epjes. Hierna wordt 500µl TNGT (elutiebuffer) op de kolom gebracht om het proteïne van de kolom te elueren. Deze elutiestap wordt 6x uitgevoerd en het eluaat wordt steeds in nieuwe epjes opgevangen. Na de 6e elutie wordt opnieuw 2.5ml PBS-EW buffer op de kolom gebracht. Deze vloeistof wordt opgevangen in een afvalvat. Hierna kan de kolom bewaard worden bij 4°C, waarna hij later opnieuw kan gebruikt worden. De epjes, met de verschillende stappen van de zuivering, worden bij -20°C bewaard.
3.6.2.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen PBS-EW (equilibratie- en wasbuffer) Een oplossing van 1mM DTT en 1mM EDTA (VWR international, Leuven, België) wordt gemaakt in de 1x PBS (samenstelling zie 3.6.1.2) TNGT (elutiebuffer) Er wordt een oplossing gemaakt die 50mM Tris (Gentaur, Kampenhout, België) pH 8.0, 0.4M NaCl (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk), 50mM gereduceerd LGlutathion, 0.1% Triton-x-100 en 1mM DTT bevat.
3.6.3 Proteïnen scheiden met acrylamide gelelektroforese 3.6.3.1 Protocol De gelcassette, waarin de gel wordt gegoten, wordt opgebouwd. Vervolgens wordt de running gel aangemaakt en wordt deze direct tussen de platen gepipetteerd. De ruimte wordt niet volledig gevuld om nog plaats te laten voor de, later aan te brengen, stacking gel. Deze ruimte wordt echter tijdens het stollen van de running gel opgevuld met isopropanol om uitdroging van de gel te vermijden. Na een half uur wordt de isopropanol verwijderd, waarna de stacking gel wordt aangemaakt en gepipetteerd in de vrije ruimte. Het kammetje wordt aangebracht en er wordt opnieuw een half uur gewacht. Wanneer de gel volledig gestold is, wordt het kammetje verwijderd, de gel in het elektroforesetoestel geplaatst en ondergedompeld in running buffer. De stalen worden verzwaard met ladingsbuffer (0.2µl/µl) waarna ze 5 minuten opgekookt worden in een warmwaterbad bij 100°C. Vervolgens worden ze in de laantjes geladen. De spanning wordt aangelegd en de gel wordt gelopen.
32
Eens deze stappen vervolledigd zijn, wordt de gel uit het toestel gehaald en wordt de stacking gel verwijderd. De running gel wordt in coomassiekleuring gebracht en een half uur op de schudder geplaatst. Nadien wordt de kleurvloeistof verwijderd en wordt destaining oplossing toegevoegd. Weer wordt het op de schudder geplaatst, waarna de destaining oplossing na een uur ververst wordt. De gel wordt overnacht in deze oplossing geplaatst om een goede ontkleuring te bekomen.
3.6.3.2 Samenstellingen buffers R/T buffer Voor de aanmaak van 1L buffer, worden 30.3g Tris (Gentaur, Kampenhout, België) en 144g glycine (Bio-rad, Nazareth Eke, België) opgelost in water. Running buffer 10ml 10% SDS (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) wordt samengevoegd met 100ml R/T buffer waarna aangelengd wordt met gedestilleerd water tot een volume van 1L. Running gel (15%) Voor 30ml van een 15% running gel, wordt 6.9ml gedestilleerd water samengevoegd met 15ml acrylamide-oplossing 30% (Bio-rad, Nazareth Eke, België), 7.5ml Tris 1.5M (Gentaur, Kampenhout, België) (pH8.8) en 0.3ml SDS 10% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland). Vlak voor het gieten van de gel worden 0.3ml APS 10% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) en 0.012ml TEMED (Fluka Chemie, Buchs, Zwitserland) toegevoegd. Deze laatste twee componenten zorgen voor de snellere stolling. Stacking gel Voor de aanmaak van 10ml stacking gel, wordt 6.8ml gedestilleerd water samengevoegd met 1.7ml acrylamide-oplossing 30% (Bio-rad, Nazareth Eke, België), 1.25ml Tris (Gentaur, Kampenhout, België) 1.0M (pH6.8), 0.1ml SDS 10% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), 0.1ml APS 10% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) en 0.01ml TEMED (Fluka Chemie, Buchs, Zwitserland). 6x Laemli buffer De ladingsbuffer bevat 125 mM Tris (Gentaur, Kampenhout, België), 10% glycerol, 2.3% SDS (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), 5% -mercaptoethanol (Gentaur, Kampenhout, België), 0.05% bromofenolblauw (UCB, Leuven, België) opgelost in gedestilleerd water. 33
Staining solution Een mengsel van 450ml methanol (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 100ml ijsazijn (Fiers, Kuurne, België) wordt aangelengd tot 1L. Hierin wordt 2.5g Coomassie bleu (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) opgelost. Destaining oplossing Er wordt een mengsel gemaakt van 450ml methanol (Merck, Darmstadt, Duitsland), 100ml ijsazijn (Fiers, Kuurne, België) en 400ml water. Dit wordt verder aangelengd tot een volume van 1L.
3.6.4 Muisexperiment 3.6.4.1 Injecteren van de muis De muizen worden in de dij intramusculair geïnjecteerd met het plasmide gecomplexeerd met DOTAP/DOPE. Vervolgens worden ze na 2 weken gedood om de cellulaire immuunrespons na te gaan m.b.v. ELISPOT.
3.6.4.2 Opzuiveren van de cellen van de milt De milt wordt aseptisch verwijderd en in een petrischaal gelegd met 20mL RPMI 1640 medium (life Technologies, Grand Island, USA).Hierna worden met behulp van een naald en een spuit de cellen uit de milt geflushed. De suspensie wordt gecentrifugeerd (5min aan 400xg) waarna het supernatans wordt verwijderd. Het pellet wordt gehersuspendeerd in 5ml rode bloedcellen lysebuffer en er wordt opnieuw gecentrifugeerd (5min aan 400xg), waarna het supernatans verwijderd wordt. Vervolgens worden de cellen gehersuspendeerd in 15ml PBS (life Technologies, Grand Island, USA), wordt er gecentrifugeerd en wordt het supernatans verwijderd. Het pellet wordt gehersuspendeerd in 2ml RPMI 1640 medium aangerijkt met 10% foetaal kalfserum (Invitrogen, Carlsbad, USA), L-glutamine (2mM) (Invitrogen, Carlsbad, USA), Penicilline (100U/ml) (Invitrogen, Carlsbad, USA) en Streptomycine (100µg/ml) (Invitrogen, Carlsbad, USA). 25µl van deze suspensie wordt overgebracht in 975µl PBS, waarna de splenocyten geteld worden met de flow cytometer en verdund worden zodat een concentratie bereikt wordt van 10 6 cellen per ml.
34
3.6.4.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen Lysebuffer voor rode bloedcellen Voor het bereiden van 1L lysebuffer worden 8.26g ammoniumchloride (Merck, Darmstadt, Duitsland), 1g Kaliumbicarbonaat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) en 0.037g EDTA (VWR international, Leuven, België) opgelost in gedestilleerd water. Vervolgens wordt de oplossing geautoclaveerd.
3.6.5 Flow cytometer De flow cytometer BD accuri C6 van de firma BD Biosciences (Erembodegem, België) wordt gebruikt voor het tellen van de miltcellen.
3.6.6 ELISPOT De producten gebruikt voor de ELISPOT zijn aangekocht bij U-CyTech biosciences (Utrecht, Nederland)
3.6.6.1 Principe Het principe van de enzym linked immunospot (ELISPOT) is afgeleidt van het principe van de ELISA. De secretie van cytokines of andere mediatoren, afkomstig van individuele cellen, zal gevisualiseerd worden. Dit gebeurt d.m.v. hun binding aan een antilichaam, gebonden op de bodem van de 96-well plaat. Vervolgens zal de detectie gebeuren door de binding van een tweede antilichaam, waaraan een enzym gekoppeld zit. Het zal dit enzym zijn dat voor de kleuringsreactie zorgt (18-20). (zie figuur 3.8)
3.6.6.2 Protocol 100µl coating antilichaam wordt in elk welletje van een 96-wellplaat gebracht. De plaat wordt afgedekt en overnacht geïncubeerd bij 4°C. De volgende dag wordt de vloeistof uit de platen verwijderd door stevig uitschudden. Er wordt 3x gewassen met 200µl PBS per well. Na deze wasstap wordt 200µl blocking buffer (1x) in iedere well gebracht. Hierna wordt de plaat afgedekt en 1 uur bij 37°C geplaatst. Vervolgens wordt de vloeistof verwijderd uit de 35
welletjes en worden de cellen toegevoegd. De cellen zullen echter eerst verdund worden tot een concentratie van 3x106 cellen/ml in een cultuurmedium waarin de juiste stimulus aanwezig is. Van deze verdunning wordt 100µl aangebracht per well. Om de reproduceerbaarheid na te gaan wordt er per celstaal in drievoud gewerkt. De plaat wordt afgedekt en wordt tussen de 12 en 24 uur bij 37°C geïncubeerd. Het is belangrijk dat alle voorafgaande stappen worden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. De hierop
Figuur 3.8 Het principe van de ELISPOT
volgende stappen mogen echter gebeuren buiten de laminaire flow. Na incubatie wordt de overmaat aan cellen verwijderd door te plaat stevig uit te schudden. De plaat wordt 2x gewassen met 200µl PBS per well. Vervolgens wordt ze 6x gewassen met telkens 250µl wasbuffer per well. Hierna wordt aan elke well 100µl verdund gebiotinyleerd detectie-antilichaam toegevoegd. De plaat wordt met plastiekfolie afgeplakt om uitdroging te voorkomen en 1 uur bij 37°C geïncubeerd. Weer wordt de vloeistof uit de wells verwijderd en worden ze 6x gewassen met telkens 250µl wasbuffer per well. 50µl GABA- (ɸ -gelabeled anti-biotine) antilichamen oplossing wordt in elke well gepipetteerd. De plaat wordt met dezelfde folie afgeplakt en 1 uur bij 37°C geïncubeerd. Na het verwijderen van de vloeistof wordt 6x gewassen met 250µl wasbuffer per well en wordt de plaat zeer goed uitgeschud en gedroogd. Vervolgens wordt 35µl activator I/II oplossing aangebracht per well. De plaat wordt afgedekt en een half uur bij kamertemperatuur, in een donkere omgeving, geplaatst. Nadien wordt de vloeistof verwijderd en eenmalig gewassen met water om de kleurreactie te stoppen. De plaat wordt weer gedroogd en de spots die gevormd zijn, worden bekeken onder de microscoop, of geteld m.b.v. de ELISPOT reader, ImmunoSpot® S6 Macro Analyzer van de firma CTL (Bonn, Duitsland).
36
3.6.6.3 Samenstelling van de gebruikte oplossingen Coating antilichamen 100µl van het bijgeleverde coating antilichaam wordt verdund met 10ml PBS-I. Blocking buffer (1x) 2ml blockingbuffer wordt verdund met 18ml PBS-I. Dilution buffer (1x) 1.5ml dilutiebuffer wordt verdund met 13.5ml PBS-I. Gebiotinyleerde detectie antilichamen 100µl gebiotinyleerde detectie antilichamen worden verdund met 10ml dilutiebuffer(1x). GABA (ɸ-gelabeld anti-biotine antilichamen) 100µl van de GABA-antilichamen wordt verdund met 5ml dilutiebuffer(1x). Activatoren 1.8ml van activator I wordt gemengd met 1.8ml van activator II vlak voor het gebruik ervan.
37
4 4.1
RESULTATEN ONTWIKKELING VAN EEN MESSENGER RNA VACCIN
4.1.1 Vorming van het stabiele plasmide Het plasmide dat gebruikt wordt voor de aanmaak van het mRNA is pT7Ts. Het mRNA afgeleid van dit plasmide bevat echter een 3‘ UTR gen van Xenopus dat we wensen te vervangen door het 3’ onvertaald gebied van -globine van de mens, waarvan beschreven is dat het zeer stabiel is. Dit fragment bevindt zich op het pIDTsmart plasmide, samen met een poly-A staart van 150 A’s in tegenstelling tot de kortere (A30) poly-A staart aanwezig op het pT7Ts plasmide.
Zowel pT7Ts als pIDTsmart worden eerst geknipt met het restrictie-enzym SpeI. Na zuivering uit de agarosegel wordt het gezuiverde fragment geknipt met het restrictie-enzym PstI. Een deel van beide fragmenten wordt geen 2e maal op gel geplaatst, maar wordt gedefosforyleerd om zelfligatie te voorkomen. De rest wordt een 2 e maal op gel geplaatst, om het juiste fragment op te zuiveren. Vervolgens wordt geligeerd. (zie tabel 4.1) Tabel 4.1 Samenstelling van de ligatiereacties.
Na deze ligatie wordt het plasmide getransformeerd in competent gemaakte cellen (zowel in MC1061 als in DH5α), waarna deze selectief gegroeid worden. De meeste groei wordt gezien bij ligatie 1. Dit kan mogelijks verklaard worden door zelf-ligatie van het pT7Tsfragment, aangezien het scheiden van het met PstI-geknipte en niet-geknipte pT7Ts met agarose gelelektroforese niet 100% mogelijk is.
Van elke plaat worden 20 kolonies gekozen waarvan een reincultuur wordt gemaakt op een nieuwe groeibodem. Na deze overnacht te groeien, worden van elk 4 kolonies opgegroeid in met ampicilline aangerijkt LB-medium. Na opzuivering met de birnboimmethode worden de plasmiden gecontroleerd op de effectieve opname van het gensegment. Dit gebeurt door middel van het XhoI restrictie-enzym. 38
Het plasmide pT7Ts bevat de knipplaats voor dit enzym niet, maar het 3’UTR-gen dat wordt ingebouwd bevat deze knipplaats. Zowel de verschillende klonen als pT7Ts (negatieve controle) en pIDTsmart (positieve controle) worden geknipt met XhoI. Uit de foto na de gelelektroforese (zie figuur 4.1) blijkt dat de geligeerde plasmiden geknipt waren, maar het fragment was niet van de verwachte grootte. Voor de controles was er ook een probleem. Het pT7Ts was, zoals verwacht, niet geknipt. pIDTsmart bleek echter, tegen de verwachting in, ook niet geknipt.
Figuur 4.1 Foto van de gel na het lopen van de geligeerde plasmiden, pIDT smart en pT7Ts na incubatie met XhoI. De geligeerde plasmiden blijken allemaal geknipt. pIDT smart en pT7Ts blijken niet geknipt.
Door deze tegensprekende resultaten wordt er een gelijkaardige controledigest uitgevoerd. Hierbij zal er naast de pT7Ts- en de pIDTsmart-controle slechts 1 kloon geknipt worden. De plasmiden worden bij deze test ook met SpeI geknipt. Op de foto van de gel (zie figuur 4.2) kan gezien worden dat SpeI de 3 plasmiden geknipt heeft. Bij de kloon verwachten we een band van 3200bp maar we detecteerden 2 banden van respectievelijk 2000bp en 400bp. Bij pIDTsmart en pT7Ts namen we de juiste band waar. De afbraak met het XhoI restrictie-enzym was ook niet correct. Ook hier namen we bij de kloon 2 banden waar, terwijl we er maar 1 zouden mogen detecteren. Bij pIDT smart, wat normaal moet geknipt worden, worden ook nog niet-geknipte plasmiden gezien. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het enzym een te korte tijd geïncubeerd was vooraleer het digest op gel werd geladen. Door deze zeer onverwachte resultaten kan er niet echt een besluit getrokken worden of het plasmide het 3’UTR opgenomen heeft. Er wordt beslist om eerst het luciferasegen en het
39
gen voor het E-proteïne van het West Nile virus te kloneren en daarna de klonering van het pIDTsmart-fragment ter herhalen.
Figuur 4.2. Foto van de gel na het lopen van pT7Ts, pIDTsmart en 1 kloon, eenmaal na incubatie met XhoI en eenmaal na incubatie met SpeI. SpeI knipt alle 3 de plasmiden.
4.1.2 Ligatie van het luciferasegen en van het gen van het E-proteïne 4.1.2.1 Voorbereiding van de vector We knipten 1µg van pT7Ts met SpeI, waarna het juiste fragment uit gel opgezuiverd werd. Dit fragment werd vervolgens geknipt met BglII. Opnieuw werd het juiste fragment opgezuiverd uit gel.
4.1.2.2 Voorbereiding van het luciferasegen en het E-proteïne gen Het in te voegen luciferasegen en het gen coderend voor het E-proteïne worden eerst m.b.v. PCR vermenigvuldigd. De optimale condities voor deze PCR-reactie worden op punt gesteld, waarbij verschillende magnesiumconcentraties worden getest. Na het doorlopen van deze PCR-cycli, worden de stalen op een 0.8% agarosegel gelopen (zie figuur 4.3). De banden die verwacht worden, zijn banden van 1300bp en 1700bp, respectievelijk overeenstemmend met het gen coderend voor het E-proteïne en voor het luciferasegen.
40
Figuur 4.3 Foto van de gel na het lopen van de PCR-producten van het luciferasegen en van het gen van het E-proteïne. De verwachte fragmenten van 1700bp (van het luciferasegen) en van 1300bp (van het gen van het E-proteïne) worden duidelijk gezien.
Na het lopen van de gel wordt vastgesteld dat er bij alle MgCl2-concentraties een goede concentratie aan DNA verkregen wordt. Ook worden geen banden waargenomen in de nabije omgeving van de gewenste banden. Aan de hand van de negatieve controle, waarop geen banden worden vastgesteld, kan ook besloten worden dat er geen contaminatie aanwezig is. Hierdoor wordt er besloten om niet verder te optimaliseren, maar om de banden onmiddellijk op te zuiveren uit de gel m.b.v. de geneclean kit.
Het opgezuiverde DNA wordt overnacht geknipt met SpeI, waarna het uit oplossing wordt gezuiverd met de geneclean kit. Vervolgens wordt het geknipt met BglII, waarna het op dezelfde manier uit de oplossing gezuiverd wordt. De bekomen fragmenten kunnen geligeerd worden in het plasmide.
4.1.2.3 Ligatie van het luciferasegen en van het E-proteïne gen Tabel 4.2 De samenstelling van de ligatiereacties voor de ligatie van het luciferasegen en van het E-proteïne gen in de vectorplasmiden.
Het luciferasegen en het gen coderend voor het E-proteïne van het West Nile virus worden in de pT7Ts-vector geligeerd (zie tabel 4.2). Na de ligatie worden de plasmiden
41
getransformeerd in competente bacteriën (MC1061) waarna ze opgegroeid worden. Op de agarbodems worden veel kolonies waargenomen.
4.1.2.4 Testen van de ligatie Een aantal kolonies worden overgeënt op een nieuwe agarbodem en tegelijkertijd getest op de aanwezigheid van de genen, coderend voor luciferase of WNV-E, in de plasmiden van de gegroeide bacteriën. Dit gebeurt door middel van koloniePCR (7 kolonies van ligatie 1 en 13 kolonies van ligatie 2 worden getest). Na het doorlopen van de cycli zal het reactiemengsel op een 0.8% agarosegel geladen worden. Op de foto van de gel (zie figuur 4.4) kan gezien worden dat in de meeste kolonies het luciferasegen (1700bp) of het gen voor het E-proteïne (1300bp) aanwezig is.
Figuur 4.4. Foto van de gel na het lopen van de PCR-producten voor het testen op de aanwezigheid van de geligeerde genen (Luc en WNV).
4.1.2.5 Opgroeien van de klonen Van de geteste klonen worden er een aantal gekozen om te sequeneren. Hiervoor worden de klonen eerst opgegroeid in 30ml LB, aangerijkt met ampicilline, waarna ze opgezuiverd worden via de Qiagen opzuivering (MIDI-prep). Zowel van ligatie 1 (pT7Ts + WNV) als ligatie 2 (pT7Ts + Luc) worden 3 klonen opgegroeid en opgezuiverd.
42
4.1.2.6 Sequeneren van de plasmiden Aangezien de sequentie van pT7Ts niet wordt vrijgegeven door de firma, werd er besloten om deze zelf te sequeneren. Dit met behulp van primers gebaseerd op het pGEM4Z plasmide, waarvan het plasmide pT7Ts afgeleid is. Ook de upstream en downstream gebieden, die de UTR en de poly-A staart van pIDTsmart flankeren, worden gesequeneerd omdat we ook van dit plasmide geen sequentiegegevens hebben. De gebruikte primers worden weergegeven in tabel 4.3. De sequenties van het luciferase gen en van het gen coderend voor het E-proteïne worden weergegeven in bijlage 4. De sequentiereacties op de WNV-E en Luc kloons tonen aan dat deze genen effectief gekloneerd zijn in pT 7Ts. De gesequeneerde sequenties van pT7Ts komen inderdaad overeen met deze van pGEM4Z met dit verschil dat de insert erin zit. Tabel 4.3 De gebruikte primers voor de sequenering van de verschillende plasmiden. (het minteken staat voor reverse primer, het plusteken verwijst naar een forward primer)
4.2
TESTEN VAN DE PEPTIDESTAMMEN
4.2.1 Opgroeien en induceren van de peptidestammen De culturen worden overnacht gegroeid waarna ze 1/40 verdund worden. Vervolgens worden ze opnieuw gegroeid tot de OD600 zich tussen de 0.6 en 0.8 bevindt. Op dat ogenblik worden de culturen geïnduceerd door toevoeging van IPTG (1mM). Na vervolgens 4 uur te groeien, worden de culturen afgecentrifugeerd en gelyseerd. Het lysaat wordt gezuiverd 43
door middel van de glutathion affiniteitschromatografie van Qiagen, waarna de bekomen stalen op een acrylamidegel geladen worden. Na het lopen wordt de gel gekleurd om de fusieproteïnen zichtbaar te maken (zie figuur 4.5).
Figuur 4.5 Acrylamidegels van de zuivering van IC32 (laan 1: de standaard, laan 2: lysaat, laan 3: flow through, laan 4: wasstap, lanen 5-10: de 6 elutiestappen), GST en IC33 (beide: laan 1: lysaat, laan 2: de standaard, laan 3: de flow through, laan 4: wasstap, lanen 5-10: elutiestappen).
Na de analyse van de gels, kon besloten worden dat de gewenste fusieproteïnen effectief tot expressie gebracht worden en na zuivering via affiniteistchromatografie minstens voor 90% zuiver zijn (lanen 5-10). De peptiden IC33 en IC34 gaven echter problemen. Deze fusieproteïnen konden slechts zeer zwak tot expressie gebracht worden. Verschillende aanpassingen van het protocol werden uitgetest, zoals groei en inductie bij 28°C i.p.v. 37°C of overnacht inductie bij 37°C. Geen van beide resulteerde echter in een hogere eiwitproductie.
4.2.2 ELISPOT
Figuur 4.6 ELISPOT plaat van de BALB/c IL-6 test geanalyseerd met de ELISPOT-reader.
44
De bekomen fusieproteïnen worden gebruikt in de ELISPOT als stimulus voor de cytokineproductie. Zowel voor BALB/c als voor NMRI muizen wordt er getest welk fusieproteïne de beste stimulatie geeft. Per muisstam werden voorafgaand 4 muizen geïnjecteerd met een pDNA vaccin gericht tegen WNV-E. Zowel de IL-6, IL-4 als de IFN-γ productie, door miltcellen geïsoleerd uit de muizen, worden onderzocht. De ELISPOT-platen worden geteld m.b.v. de ELISPOT reader (zie figuur 4.6) De bekomen resultaten worden weergegeven in tabel 4.4. Tabel 4.4 De gemiddelden van het aantal spots per well van de ELISPOT.
Uit deze resultaten kan besloten worden dat fusieproteïne IC32 de meeste stimulatie geeft. Dit zowel voor IL-6 als voor IFN-γ. De IL-4 stimulatie is voor dit DNA-vaccin echter onvoldoende, waardoor er hiervoor geen besluiten kunnen getrokken worden. Ook kan er besloten worden dat de stimulatie bij de beide muizenstammen toch door hetzelfde fusieproteïne gebeurt.
45
5
DISCUSSIE Het onderzoek naar de ontwikkeling van vaccins is zeer belangrijk, aangezien er nog
steeds heel wat ernstige ziekten zijn waarvoor geen efficiënt vaccin beschikbaar is. Voor West Nile virus zijn er reeds een aantal vaccins beschikbaar voor dieren, maar momenteel is er nog geen vaccin op de markt voor humaan gebruik.
Deze thesis kadert in het onderzoek naar genetische vaccins tegen het West Nile virus. Genetische vaccins krijgen steeds meer aandacht aangezien ze belangrijke voordelen bezitten ten opzichte van de andere vaccins, zoals het opwekken van een sterkere cellulaire immuniteit.
5.1
ONTWIKKELING VAN EEN STABIEL MRNA VACCIN. Uit de literatuur werd geleerd dat een lange poly-A staart stabiliteit geeft aan het mRNA
(5). Ook zal een 3’UTR met een hoge frequentie aan pyrimidines (vb. 3’UTR van globine) stabiliserende eigenschappen geven (10, 12). Aangezien de efficiëntie van een vaccin afhankelijk is van de sterkte en de duur van de expressie van het proteïne, wensen we een gestabiliseerd mRNA te produceren dat langer tot expressie blijft dan deze waarover de onderzoeksgroep momenteel beschikt. Hiervoor zal het 3’UTR en een A 30-staart van het pT7Ts verwijderd worden en vervangen worden door een 3’UTR-fragment dat het gen van het humaan α-globine bezit en een langere A149-staart. Dit fragment bevindt zich op het pIDTsmart plasmide.
De klonering van het fragment in de pT7Ts-vector bleek echter niet eenvoudig. Er wordt slechts zeer weinig groei verkregen na de transformatie van het plasmide in MC1061 en DH5α. Na het testen van de gegroeide klonen, worden ook geen resultaten verkregen waaruit sluitende conclusies kunnen getrokken worden. Andere kloneringsstrategiën zullen uitgetest moeten worden om alsnog de 3’UTR van het humaan α-globine en de A149-staart in de vector te kloneren.
46
Een mogelijke verklaring voor het bekomen van slechts een klein aantal transformanten is de niet optimale insert/vector ratio voor de ligatie. Dit is te wijten aan de moeilijkheid om een hoge concentratie te verkrijgen van het kleine pIDTsmart-fragment. Na het knippen van het plasmide met een restrictie-enzym, worden de verschillende fragmenten in het reactiemengsel steeds gescheiden door middel van agarose gelelektroforese. Hierna moet het gewenste fragment terug uit de gel gezuiverd worden. Deze zuivering wordt steeds uitgevoerd met de geneclean kit. Deze kit werd echter ontworpen voor de opzuivering van DNA-fragmenten groter dan 200bp, wat net op de rand ligt voor het door ons op te zuiveren fragment. Om een betere binding te krijgen voor deze kleine fragmenten, kan de temperatuur gedurende de bindingsstap opgedreven worden tot 55°C. Ook moet er steeds op gelet worden dat de pH van het NaI niet stijgt boven 7.5, aangezien de binding van het DNA dan sterk vermindert.
Wanneer deze kleine aanpassingen nog steeds niet voor een voldoende hoge concentratie aan insert zorgen, zou PCR een mogelijk alternatief zijn. Hierbij moet de sequentie van het pIDTsmart plasmide gekend zijn, waarna er 2 primers gekozen worden die elk aan 1 zijde een eindje buiten het fragment annaelen. Hierna zal het gewenste DNA fragment via PCR vermenigvuldigd kunnen worden en vervolgens geknipt kunnen worden met de 2 enzymen, om het nadien te kloneren in de pT7Ts-vector. In de literatuur wordt echter ook beschreven dat de lange poly-A staart de mogelijke boosdoener is. Bij onderzoek naar de transformatie van plasmiden met lange poly-A staart, wordt er slechts een zeer laag aantal transformanten bekomen. Ook wordt er gezien dat de bekomen transformanten vaak een poly-A-staart van kortere lengte zullen bevatten en dat de poly-A-staart dus onstabiel is in de bacteriën. De bacteriestam die de beste resultaten geeft, is XL-1blue (13). Bij verder onderzoek naar het vormen van een gestabiliseerd plasmide, is het dus aan te raden om de plasmiden te transformeren in competent gemaakte XL-1blue bacteriën i.p.v. in de MC1061 of DH5α.
47
5.2
LIGATIE VAN HET E-PROTEÏNE GEN EN VAN HET LUCIFERASEGEN IN HET PLASMIDE. De genen coderend voor het E-proteïne van het West Nile virus en voor het luciferasegen
zijn succesvol geligeerd in de pT7Ts-vector. Door gebruik te maken van het luciferase reporter gen, zal later de in vivo expressie van het luciferase mRNA in functie van de tijd kunnen gevolgd worden in de muizen m.b.v. het in vivo imaging system. Deze plasmiden zullen momenteel eventueel gebruikt kunnen worden voor de productie van mRNA voor vaccinatie, vermits de momenteel beschikbare pDNA’s voor in vitro transcriptie geen stabiliserende UTR, maar wel een korte poly-A staart (A30 of A50) hebben. Niettemin zal er met deze plasmiden verder gewerkt worden om het fragment met de 3’UTR van het humaan -globine en de lange poly-A staart alsnog in dit plasmide te kloneren.
Door invoeging van het luciferasegen in de plasmide zal het mogelijk worden om bij later uit te voeren in vivo testen, te visualiseren waar, wanneer en hoe lang het mRNA met de stabiliserende UTR in de muizen wordt getranslateerd. Deze data kunnen dan vergeleken worden met vroegere data bekomen met het mRNA zonder stabiliserende UTR. Een langere poly-A staart kan de stabiliteit van het mRNA verder verhogen. Er zal dus met deze plasmiden moeten verder gewerkt worden om de genen van het 3’UTR en de lange poly-A-staart nog in dit plasmide te ligeren.
5.3
DE STIMULATIE VAN SPLENOCYTEN M.B.V. PEPTIDEN NA DNA VACCINATIE De testen naar de stimulatie van de cytokineproductie door splenocyten d.m.v. ELISPOT
worden uitgevoerd voor 2 verschillende muizenstammen (de BALB/c muizen en de NMRI muizen) aangezien peptidestimulatie verschillend kan zijn naargelang de aanwezige MHCmoleculen. De BALB/c muisstam is een inbred stam, waarvan het MHC goed gekarakteriseerd is namelijk H2Kd, H2Dd, TIac. De NMRI muisstam is een outbred stam, waarvan het MHC type niet gekarakteriseerd is. Het is voor het onderzoek belangrijk dat het DNA vaccin werkzaam is bij muizen en later bij mensen met een verschillend MHC systeem. Uit de literatuur is reeds bekend dat peptidesequentie VNPFVSVATANAKVL splenocyten kan stimuleren afkomstig van C57Bl6-muizen die gevaccineerd waren met een WNV vaccin (21). 48
Bij de door ons geteste stammen wordt echter gezien dat fusieproteïne IC32 de beste stimulatie geeft (zowel voor IL-6 als voor IFN-ɣ). IC33 geeft ook een zwakke stimulatie, maar deze was waarschijnlijk aspecifiek aangezien het fusieproteïne amper tot expressie kwam. Ook het IC34-fusieproteïne was zeer moeilijk tot expressie te brengen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het peptide veel hydrofobe aminozuren bevat, waardoor het moeilijker tot expressie wordt gebracht. Ook de slechte wateroplosbaarheid van dergelijke peptiden maakt het moeilijker om deze te isoleren. Recombinante eiwitten die in bacteriën sterk tot expressie gebracht worden vormen ook vaak “inclusion bodies”. Deze wateronoplosbare aggregaten, van verkeerd opgevouwen eiwitten, kunnen eventueel terug wateroplosbaar worden door ze eerst te denatureren met guanidine of ureum. Na wegdialyseren van het denaturerend agens, zullen de eiwitten eventueel terug hun juiste driedimensionele structuur aannemen.
Wanneer de stimulatie van het IC32-fusieproteïne vergeleken wordt met de stimulatie door het volledige domein III van het E-proteïne, gekoppeld aan het Maltose Binding Protein (MBP), wordt waargenomen dat het IC32 betere stimulatie geeft. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat we in beide gevallen 10 µg van het recombinant eiwit gegeven hebben, maar dat de molariteit van het peptide verschillend is aangezien het MBP een moleculair gewicht heeft van ca. 43 kDa en GST slechts een moleculair gewicht van ca 26 kDa.
De bedoeling is om nu het peptide synthetisch te laten aanmaken bij een gespecialiseerde firma. Dit is veel sneller, efficiënter en goedkoper dan het produceren van voldoende hoeveelheden van het fusieproteïne.
Voor de testen naar de IL-4 productie, worden geen goede resultaten bekomen. Dit zowel voor de verschillende fusieproteïnen als voor het volledige proteïne. Hierdoor kan besloten worden dat het vaccin de IL-4 productie niet op gang brengt. Het testen van de IL-4 m.b.v. ELISPOT zal dus bij verder onderzoek weggelaten worden.
49
6
CONCLUSIE De constructie van het stabiele plasmide, door ligatie van het 3’UTR en de lange poly-A
staart, blijkt heel wat problemen met zich mee te brengen. Mogelijks worden deze veroorzaakt door de aanwezigheid van de lange poly-A-staart, waardoor de ligatie en transformatie moeilijk doorgaan. Ook is de stabiliteit van de poly-A-staart in de bacteriën zeer laag.
De ligatie van het luciferasegen, voor de in vivo imaging van mRNA expressie, en van het gen coderend voor het E-proteïne, waartegen de immuniteit zal opgebouwd worden, brachten geen problemen met zich mee. Deze genen zijn zonder moeilijkheden in de pT 7Tsvector geligeerd. Via PCR en door sequentieanalyse kon er ook bevestigd worden dat de genen effectief aanwezig zijn in het plasmide. In de toekomst zal er met deze plasmiden verder gewerkt worden om er het stabiliserende 3’UTR gen en de poly-A-staart in te ligeren. Dit plasmide kan vervolgens gebruikt worden voor mRNA-productie.
Als tweede onderdeel van deze thesis, worden verschillende fusieproteïnen getest voor de stimulatie van cytokineproductie in vitro door miltcellen afkomstig van muizen gevaccineerd met een DNA-vaccin tegen het West Nile virus d.m.v. ELISPOT. Hierbij wordt er geconcludeerd dat het fusieproteïne IC32 de beste stimulatie geeft. Dit zowel voor het in vitro testen van IL-6 als IFN-ɣ en zowel bij de BALB/c als de NMRI-muizen. De testen op IL4 geven geen goede resultaten doordat het DNA-vaccin de IL-4 productie niet stimuleert. Bij verder gebruik van de ELISPOT zal in de toekomst het peptide IC32 gebruikt worden als stimulus aangezien de stimulatie sterker is en de aanmaak gemakkelijker. De IL-4 test zal in verdere testen weggelaten worden.
50
7
LITERATUURLIJST
1. Moser M, Leo O. Key concepts in immunology. Vaccine. 2010;28 Suppl 3:C2-13. Epub 2010/08/18. 2. Zepp F. Principles of vaccine design-Lessons from nature. Vaccine. 2010;28 Suppl 3:C14-24. Epub 2010/08/18. 3.
Derksen RKK. Immunologie 2009.
4. Wolfgang W. Leitner HY, and Nicholas P. Restifo. DNA and RNA-based vaccines principles progress and prospects. Vaccine. 1999;18(9-10):765-77. 5. Yamamoto A, Kormann M, Rosenecker J, Rudolph C. Current prospects for mRNA gene delivery. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 2009;71(3):484-9. Epub 2008/10/25. 6. Carralot JP, Probst J, Hoerr I, Scheel B, Teufel R, Jung G, et al. Polarization of immunity induced by direct injection of naked sequence-stabilized mRNA vaccines. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2004;61(18):2418-24. Epub 2004/09/21. 7.
Monath TP. prospects for development of a vaccine against the West Nile Virus.
8. Indresh K. Srivastava P, and Margaret A. Liu, MD. gene vaccines. Annals of Internal Medicine. 2003;138:550-60. 9. Gregoriadis G. genetic vaccines strategies for optimization. Pharmaceutical Research. 1998;15:661-70. 10. Pascolo S. Vaccination with messenger RNA (mRNA). Handbook of Experimental Pharmacology. 2008;183:221-35. 11.
Pascolo S. messenger RNA-based vaccines. Expert Opin Biol Ther. 2004;4(8):1285-94.
12. Laddy DJ, Weiner DB. From plasmids to protection: a review of DNA vaccines against infectious diseases. International reviews of immunology. 2006;25(3-4):99-123. Epub 2006/07/05. 13. Elango N, Elango S, Shivshankar P, Katz MS. Optimized transfection of mRNA transcribed from a d(A/T)100 tail-containing vector. Biochemical and biophysical research communications. 2005;330(3):958-66. Epub 2005/04/06. 14. Dauphin G, Zientara S. West Nile virus: recent trends in diagnosis and vaccine development. Vaccine. 2007;25(30):5563-76. Epub 2007/02/13.
51
15. Campbell G, Marfin A, Lanciotti R, Gubler D. West Nile virus. The Lancet Infectious Diseases. 2002;2(9):519-29. 16. Cranenburgh RM. An equation for calculating the volumetric ratios required in a ligation reaction. Applied microbiology and biotechnology. 2004;65(2):200-2. Epub 2004/02/06. 17. Hanahan D. <studies on transformation of E Coli with plasmids.pdf>. J Mol Biol 1983;166:557-80. 18. Josephine H. Cox GF, Sylvia Janetzki. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 2006;38:274-82. 19. Scheibenbogen ALaC. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 2003;31:143-9. 20. Cecil C. Czerkinsky L-A, Hakan Nygren, Orjan Ouchterlony, Andrej Tarkowski. A solidPhase Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay for Enumeration of Specific AntibodySecreting Cells. Journal of Immunological Methods. 1983;65:109-21. 21. M. E. Osterhaus; Guus F. Rimmelzwaan. A recombinant Influenza A Virus Expressing Domain III of West Nile Virus Induces Protective Immuno Responses against Influenza and West Nile Virus. PLoS ONE. 2011;6(4):1-8.
52
BIJLAGE 1 (p 28) 3.5.10.2 Protocol vermenigvuldigen van het luciferasegen en het gen van het E-proteïne
Tabel 1 De instellingen voor het PCR-programma.
Tabel 2 De PCR-samenstelling voor de vermenigvuldiging van het luciferasegen.
Tabel 3 De PCR-samenstelling voor de vermenigvuldiging van het gen van het E-proteïne.
BIJLAGE 2 (p 29) 3.5.10.3 Protocol voor het testen op de aanwezigheid van het geligeerde gen
Tabel 1 De samenstelling van de PCR-mix voor het testen op de aanwezigheid van de geligeerde genen in de verschillende kolonies.
BIJLAGE 3 (p 29) 3.5.11 Sequenering
Tabel 1 De samenstelling van de sequentiemix voor de sequentiereactie en het toegepaste programma voor het uitvoeren van de reactie.
BIJLAGE 4 (p 43)
Sequentie van het luciferasegen atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcata aggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatactt cgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctct tcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaa cagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaata atccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccgg ttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacc taagggtgtggcccttccgcatagaactgcctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggata ctgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatg tatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttc gccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcgggg aagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccg agggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgg gcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttga ttgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtcttt aattaaatacaaaggatatcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggc aggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgt ggattacgtggccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccg gaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtccaaattg taa
Sequentie van domein III van het E-proteïne van het West Nile virus atgaagagagagctgctgtgtgtactgctgctttgtggactggctttcccattgcctgaccagggaatacatgggaggttcgcat tcaactgccttggaatgagcaacagagacttcttggaaggagtgtctggagcaacatgggtggatttggttctcgaaggcgacagct gcgtgactatcatgtctaaggacaagcctaccatcgatgtgaagatgatgaatatggaggcggccaacctggcagaggtccgcagtt attgctatttggctaccgtcagcgatctctccaccaaagctgcgtgcccgaccatgggagaagctcacaatgacaaacgtgctgacc cagcttttgtgtgcagacaaggagtggtggacaggggctggggcaacggctgcggattatttggcaaaggaagcattgacacatgc gccaaatttgcctgctctaccaaggcaataggaagaaccatcttgaaagagaatatcaagtacgaagtggccatttttgtccatgga ccaactactgtggagtcgcacggaaactactccacacaggttggagccactcaggcagggagattcagcatcactcctgcggcgcct tcatacacactaaagcttggagaatatggagaggtgacagtggactgtgaaccacggtcagggattgacaccaatgcatactacgt gatgactgttggaacaaagacgttcttggtccatcgtgagtggttcatggacctcaacctcccttggagcagtgctggaagtactgtgt ggaggaacagagagacgttaatggagtttgaggaaccacacgccacgaagcagtctgtgatagcattgggctcacaagagggagc tctgcatcaagctttggctggagccattcctgtggaattttcaagcaacactgtcaagttgacgtcgggtcatttgaagtgtagagtga agatggaaaaattgcagttgaagggaacaacctatggcgtctgttcaaaggctttcaagtttcttgggactcccgcagacacaggtc acggcactgtggtgttggaattgcagtacactggcacggatggaccttgtaaagttcctatctcgtcagtggcttcattgaacgaccta acgccagtgggcagattggtcactgtcaacccttttgtttcagtggccacggccaacgctaaggtcctgattgaattggaaccaccctt tggagactcatacatagtggtgggcagaggagaacaacagatcaatcaccattggcacaagtcttag
BIJLAGE 5: Evening lectures
Improving adherence: from research to policy to practice. Therapietrouw is zeer belangrijk bij geneesmiddelgebruik. Schade door geneesmiddelen kan komen door het geneesmiddel zelf, maar kan evengoed door het fout innemen van het geneesmiddel. Onder therapieontrouw, wordt zowel het niet innemen van het geneesmiddel gerekend alsook het op een foute manier innemen. 50% van die fouten komen door het onvrijwillig niet innemen van het geneesmiddel. Oorzaken hiervan zijn o.a. het vergeten innemen, het niet samengaan van het geneesmiddelgebruik met de levensstijl van de patiënt, de onmogelijkheid van het goed innemen door een fout in de formulatie,... De andere helft is opzettelijk, door het niet verstaan van het nut van de inname, door schrik voor de nevenwerkingen,… Voor het verbeteren van de therapietrouw is het belangrijk de oorzaak te vinden waarom er een fout optreedt. Aan de hand van deze oorzaak, zal er vervolgens een passende oplossing kunnen aangeboden worden. Belangrijk hierbij is dat de dokter en apotheker de patiënt zien als een persoon en niet als een nummer. Wanneer de patiënt voelt dat hij niet bekritiseerd wordt, maar dat er naar hem geluisterd wordt en dat er interesse is voor hem persoonlijk, zal hij zich beter voelen en sneller geneigd zijn om problemen met geneesmiddelgebruik ter sprake te brengen. Dit zal leiden tot een snellere vaststelling van het probleem, wat belangrijk is, aangezien het dan gemakkelijker is om het gedrag aan te passen.
Access to quality medicines in resources limited setting. De essentiële geneesmiddelenlijst is een lijst waarop de geneesmiddelen staan die op elk tijdstip in het land aanwezig moeten zijn. Deze geneesmiddelen moeten daarenboven beschikbaar en betaalbaar zijn voor elk individu en voor de gemeenschap en moeten gegarandeerd van goede kwaliteit zijn. In praktijk wordt er echter gezien dat er veel autoriteiten zijn, vooral deze van ontwikkelingslanden, die niet al deze zaken kunnen garanderen. Vaak is er een tekort aan opslagruimten, zijn de bestaande opslagruimten te klein en is er een slecht wegennet.
Hierdoor is het heel moeilijk om de toch beschikbare geneesmiddelen tot bij de patiënten te krijgen. Tot op de dag van vandaag zijn er dus nog steeds grote inspanningen nodig. Apothekers kunnen daarin een belangrijke rol spelen door o.a. hulp in de kwaliteitscontrole, hulp bij rationeel geneesmiddelengebruik, bij de verdeling en aankoop van geneesmiddelen met de beschikbare middelen,…
Counterfeit medicines: Pfizer's forensic Laboratories Namaakgeneesmiddelen zijn producten die gemaakt worden, zeer gelijkend op de gewone geneesmiddelen. Ze worden echter aangemaakt in onhygiënische omstandigheden, waardoor ze onzuiverheden kunnen bevatten. Ook bevatten ze vaak geen of een zeer lage concentratie van het actief bestanddeel. Zowel het geneesmiddel zelf als de volledige verpakking zal zodanig nagemaakt worden dat het vaak moeilijk wordt om een onderscheid te maken tussen het originele en het namaakgeneesmiddel. Door de farmaceutische bedrijven wordt er echter veel onderzoek gedaan naar het ontdekken en van de markt halen van deze producten. De reden waarom namaakgeneesmiddelen zo een wijd verspreid probleem zijn, is de hoge winst die ermee gemaakt wordt; ze zijn gemakkelijk aan te maken en door de opkomst van het internet is de verdeling een stuk gemakkelijker geworden. Ook is het besef over het hoge gezondheidsrisico, horend bij deze namaakgeneesmiddelen, beperkt. Uit deze lezing kan dus zeer duidelijk besloten worden dat namaakgeneesmiddelen een groot gezondheidsprobleem vormen en dat er grote inspanningen nodig zijn voor het opsporen ervan. Ook zijn er inspanningen nodig om de mensen bewust te maken van de risico’s verbonden aan het innemen van deze producten.
Applications of antibodies in the analysis of drugs, disease markers, bacteria and toxins Antilichamen zijn symmetrisch opgebouwde molecule bestaande uit zowel een variabel als een constant deel. Ze staan in voor vele verschillende reacties. Er bestaan polyclonale, monoclonale en recombinante antilichamen. Vooral de laatste groep is interessant doordat ze bovenop de gemakkelijke aanmaak en de lage kost ook de voordelen hebben dat ze zeer gevoelig zijn, op specifieke plaatsen kunnen gebracht worden en dat ze kunnen aangepast worden naargelang de wens. Zo kunnen bv. muisantilichamen gehumaniseerd worden, zodat
de immuunreactie erop zal verminderen, ook kunnen bepaalde aminozuren vervangen worden waardoor de eigenschappen van de molecule veranderen (vb de sensitiviteit). Door deze goede eigenschappen en door het ontstaan van machines, waarmee automatisch en met enorme snelheid een groot aantal verschillende klonen kan getest worden, zit het gebruik en onderzoek naar antilichamen momenteel enorm in de lift. Ook worden antilichamen steeds vaker aangewend voor het snelle onderzoek naar merkers van een bepaalde ziekte (vb. voor cardiovasculaire aandoeningen) of in de opsporing van ziektekiemen of drugs.
