WEST NILE VIRUS VACCINATIE PROJECT T

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Voeding, Genetica en Ethologie Laboratorium voor gentherapie Academiejaar 2012-‐2013

WEST NILE VIRUS VACCINATIE PROJECT T Kim CANNIE Eerste master in de farmaceutische zorg Promotor Prof. Dr. N. Sanders Commissarissen Dr. K. Raemdonck Dr. F. Van Nieuwerburgh Experimenteel begeleidster Dr. Marina De Filette

AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef”

Auteur

Prof. Dr. N. Sanders

Kim Cannie

Promotor

21 mei 2013

SAMENVATTING Het West Nile virus wordt verspreid via muggen, waarbij de geïnfecteerde mug de gastheer zal infecteren bij het zuigen van bloed. Vogels zijn het belangrijkste reservoir maar ook paarden en mensen kunnen besmet worden. Mensen zullen het virus niet terug overbrengen naar een bloedzuigende mug en worden hierdoor ‘dead’-‐end gastheren genoemd. Ongeveer 80 % van de infecties verloopt asymptomatisch, maar in 1% van de gevallen is deze levensbedreigend. Voornamelijk oudere mensen en mensen met een verminderde immuniteit lopen een verhoogd risico. Momenteel kan men zich enkel beschermen tegen het virus door het vermijden van muggenbeten. Het is dus wenselijk een vaccin te ontwikkelen tegen dit virus waarbij vooral de risicogroep gevaccineerd zal worden. Een DNA vaccin gericht tegen het West-‐Nile virus werd ontwikkeld en wordt momenteel onderzocht. Het vaccin bevat een plasmide met daarop de genen die coderen voor het E-‐ proteïne van het West nile virus. DNA vaccinatie resulteert in een humorale en een sterke cellulaire immuunrespons. Dit laatsgenoemde is een voordeel van DNA vaccins ten op zichte van de niet-‐levende conventionele vaccins. De effectiviteit van het vaccin wordt getest aan de hand van een ELISPOT assay en een ELISA. 26 fusieproteïnen, die samen het volledige E-‐ proteïne vormen, worden gebruikt als stimulantia in deze assays. De miltcellen van gevaccineerde muizen worden onderzocht op de aanwezigheid van antilichamen (ELISA) en cytokines (ELISPOT), die door geactiveerde T-‐cellen worden gesecreteerd. De ELISA resultaten zijn positief en er wordt een vaccin-‐geinduceerde humorale immuunrespons gedetecteerd. Peptiden 30-‐37 lokken hierbij de grootste respons uit. Uit de resultaten van de ELISPOT kon worden besloten dat het DNA vaccin niet leidde tot een sterke cellulaire immuunrespons, wat initieel wel verwacht werd.

DANKWOORD Graag wil ik een dankwoord richten aan de mensen die hebben bijgedragen aan de realisatie van deze masterproef. Eerst en vooral wil ik mijn promotor Prof. Dr. Niek Sanders bedanken omdat ik het onderzoek heb mogen uitvoeren in zijn vakgroep. In het bijzonder wil ik mijn begeleidster, Marina De Filette, bedanken voor de theoretische en praktische inzichten die ze me heeft bijbracht en voor het nalezen van mijn thesis. Verder wil ik ook graag Mario bedanken voor de extra hulp, Ruben, die voor me klaar stond als ‘Word’ weer eens tilt sloeg. En Iedereen aanwezig in het labo voor hun steun, zeer op prijs stellende afleiding, de nodige ontspanning en plezier. Ook nog een extra woordje van dank aan mijn ouders die me de mogelijkheid gaven om deze studie aan te vatten en altijd voor me klaar stonden met goede raad.

INHOUDSGAVE 1 INLEIDING .................................................................................................................... 1 1.1 IMMUUNSYSTEEM ....................................................................................................... 1 1.1.1 Algemeen........................................................................................................ 1 1.1.2 Het aangeboren immuunsysteem ................................................................... 1 1.1.3 Het verworven immuunsysteem ..................................................................... 3 1.1.3.1 Humorale immuniteit ...................................................................................... 4 1.1.3.2 Cellulaire immuniteit ....................................................................................... 4 1.2 DNA PLASMIDE VACCIN................................................................................................ 6 1.2.1 Algemeen........................................................................................................ 6 1.2.2 Werking .......................................................................................................... 7 1.2.3 Voordelen ....................................................................................................... 8 1.2.4 Veiligheid........................................................................................................ 8 1.2.5 Efficiëntie........................................................................................................ 9 1.3 HET WEST NILE VIRUS ................................................................................................ 10 1.3.1 Algemeen...................................................................................................... 10 1.3.2 Epidemiologie ............................................................................................... 11 1.3.3 Symptomen .................................................................................................. 12 1.3.4 Behandeling .................................................................................................. 12 1.3.5 Vaccin ........................................................................................................... 13 2 OBJECTIEVEN.............................................................................................................. 14 3 MATERIAAL EN METHODEN ....................................................................................... 16 3.1 VEEL GEBRUIKTE MATERIALEN................................................................................... 16 3.2 BACTERIËN OPGROEIEN ............................................................................................. 16 3.2.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 16 3.2.2 Principe......................................................................................................... 16 3.2.3 Protocol ........................................................................................................ 17 3.3 AFFINITEITSCHROMATOGRAFIE ................................................................................. 18 3.3.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 18 3.3.2 Principe......................................................................................................... 18 3.3.3 Protocol ........................................................................................................ 19

3.4 POLYACRYLAMIDE GELELEKTROFORESE .................................................................... 20 3.4.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 20 3.4.2 Princinpe....................................................................................................... 21 3.4.3 Protocol ........................................................................................................ 21 3.5 DIALYSE ...................................................................................................................... 22 3.5.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 22 3.5.2 Principe / protocol ........................................................................................ 22 3.6 NANODROP ................................................................................................................ 23 3.6.1 Materialen .................................................................................................... 23 3.6.2 Principe / Protocol ........................................................................................ 23 3.7 MUISEXPERIMENT...................................................................................................... 24 3.7.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 24 3.7.2 Protocol ........................................................................................................ 24 3.8 OPZUIVEREN VAN DE MILTCELLEN............................................................................. 24 3.8.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 24 3.8.2 Protocol ........................................................................................................ 25 3.9 OPZUIVEREN CD8 -‐ EN CD4 CELLEN ........................................................................... 25 3.9.1 Materialen en gebruikte oplossingen ............................................................ 25 3.9.2 Principe / Protocol ........................................................................................ 26 3.10 FLOW CYTOMETER ..................................................................................................... 26 3.10.1 Materialen en gebruikte oplossingen........................................................... 26 3.10.2 Principe / Protocol....................................................................................... 27 3.11 ELISPOT....................................................................................................................... 28 3.11.1 Materialen en gebruikte oplossingen........................................................... 28 3.11.2 Principe ....................................................................................................... 28 3.11.3 Protocol....................................................................................................... 29 3.12 ELISA........................................................................................................................... 30 3.12.1 Materialen en gebruikte oplossingen........................................................... 30 3.12.2 Principe ....................................................................................................... 31 3.12.3 Protocol....................................................................................................... 31 3.13 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ....................................................................... 33 3.13.1 Materialen en gebruikte oplossingen........................................................... 33

3.13.2 Principe / Protocol....................................................................................... 33 3.14 GELELEKTROFORESE ................................................................................................... 34 3.14.1 Materialen en gebruikte oplossingen........................................................... 34 3.14.2 Principe / Protocol....................................................................................... 34 4 RESULTATEN .............................................................................................................. 35 4.1 EXPRESSIE FUSIEPROTEÏNEN ...................................................................................... 35 4.2 BEPALING CONCENTRATIE FUSIEPROTEINEN............................................................. 36 4.3 CONTROLE ZUIVERING CD8/CD4 T-‐CELLEN................................................................ 37 4.4 ELISPOT....................................................................................................................... 39 4.5 ELISA........................................................................................................................... 41 4.5.1 ELISA E-‐proteïne............................................................................................ 41 4.5.2 ELISA fusieproteïnen ..................................................................................... 42 4.6 DNA VACCIN ............................................................................................................... 43 5 DISCUSSIE .................................................................................................................. 45 5.1 CELLULAIRE IMMUUNRESPONS ................................................................................. 45 5.2 HUMORALE IMMUUNRESPONS ................................................................................. 46 6 CONCLUSIE................................................................................................................. 47 7 LITERATUURLIJST ....................................................................................................... 48

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN APC

Antigenpresenteerde cellen

APS

Ammonium persulfaat

CD

Cluster of differentiation

dH2O

Gedestilleerd water

DNA

Deoxyribonucleid acid

E-‐proteïne

Envelop proteïne

ELISA

Enzyme-‐linked immunosorbent assay

ELISPOT

Enzyme-‐linked ImmunoSpot

FT

Flow-‐through

GM-‐CSF

Granulocyte-‐macrophage colony-‐stimulating factor

GST

Gluthation S-‐transferase

HRP

Horse raddish peroxidase

IL

Interleukine

IPTG

Isopropyl β-‐D-‐1-‐thiogalactopyranoside

MHC

Major histocompatibility complex

mRNA

Messenger ribonucleic acid

NK cellen

Natural killer cellen

PAMP

Pathogen-‐associated molecular pattern

PBS

Phosphate buffered saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PerCP

Peridinin-‐chlorophyll-‐protein complex

PRR

Pattern-‐recognition receptor

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TBE

Tris/Boraat/EDTA

TEMED

Tetramethylethyleendiamide

TLR

Toll-‐like receptor

TMB

Tetramethylbenzidine

TNF

Tumornecrosefactor

Tc-‐cel

Cytotoxische T-‐cel

Th-‐cel

T-‐helpercel

WVN

West Nile virus

1 1.1

INLEIDING IMMUUNSYSTEEM

1.1.1 Algemeen

Het immuunsysteem staat in voor de verdediging van het lichaam tegen vreemde

organismen, zoals bacteriën, virussen, schimmels en parasieten. Ontspoorde lichaamscellen of tumoren, die eveneens een risico vormen voor het lichaam, kunnen door het immuunsysteem worden herkend en opgeruimd. Ten slotte heeft het immuunsysteem de taak om oude en versleten cellen op te ruimen (Rijkers, G.T., 2009). De effecten van het afweersysteem zijn gunstig maar kunnen ook schade berokkenen aan het organisme en leiden tot een gevoel van onbehagen (Zepp, 2010). Wanneer de externe barrières van het lichaam beschadigd zijn en geen weerstand meer bieden tegen indringers, treedt het immuunsysteem in werking. Ons afweersysteem kan worden onderverdeeld in twee functioneel verschillende delen: het aangeboren immuunsysteem of niet-‐specifieke immuniteit en het adaptief immuunsysteem of specifieke immuniteit. Hoewel het doel van beide systemen identiek is, namelijk het bestrijden van infecties, verschilt hun aanpak sterk van elkaar (Mayer, 2013). 1.1.2 Het aangeboren immuunsysteem

Deze arm van het immuunsysteem vormt de eerstelijnsverdediging tegen potentiële

indringers (Moser & Oberdan, 2010) en is reeds aanwezig van bij de geboorte. De immuunrespons is snel, vrijwel onmiddellijk maximaal en is niet-‐antigen specifiek. Een nadeel van het aangeboren immuunsysteem is dat blootstelling aan een antigen niet resulteert in de opbouw van immunologisch geheugen (Zepp, 2010). De anatomische (zoals de huid en slijmvliezen) en chemische barrières (zoals destructieve enzymen, zure pH van de maag) van het lichaam verhinderen dat micro-‐organismen het lichaam binnendringen. Ook de bacteriële flora, die verspreid zit over gans het lichaam, speelt een rol bij de afweer (Rijkers et al., 2009). Wanneer deze barrières te kort schieten, komt als eerste het aangeboren immuunsysteem in actie. Macrofagen, dendritische cellen en de mobiele neutrofielen, eosinofielen, monocyten en natural killer cellen (NK-‐cellen) behoren tot dit aangeboren immuunsysteem (Zepp, 2010). 1

Deze cellen herkennen bepaalde geconserveerde structuren van micro-‐organismen, de zogenaamde pathogen-‐associated molecular patterns (PAMPs), die niet voorkomen op humane lichaamscellen. PAMP’s worden herkend door de receptoren van het niet-‐specifieke immuunsysteem en worden aangeduid als pattern-‐recognition receptors (PRR’s). Cruciaal voor het waarschuwen van het immuunsysteem bij infectie, zijn de Toll-‐like receptoren (TLR). Deze vormen een subgroep van de PRR’s en kunnen worden onderverdeeld in 10 verschillende groepen afhankelijk van hun lokalisatie en welk type PAMP ze herkennen. TLR’s 1,2,4 en 5 komen voor op het celoppervlak en herkennen voornamelijk bacteriële producten terwijl TLR’s 3,7,8 en 9 zich intracellulair bevinden en belangrijk zijn voor de herkenning van virale producten en nucleïnezuren. TLR’s komen tot expressie op een groot aantal cellen zoals op fagocyten, dendritische cellen, lymfocyten, epitheelcellen enzovoort. Het belangrijkste effectormechanisme van het aangeboren immuunsysteem, is fagocytose (Moser & Oberdan, 2010). Dit proces volgt na de herkenning van het micro-‐ organisme, waarna het via endocytose wordt opgenomen en gedood. De cellen van het aangeboren immuunsysteem, die door middel van fagocytose micro-‐organismen kunnen opnemen, zijn monocyten (voorlopers van macrofagen), macrofagen, neutrofielen en eosinofielen (Rijkers et al., 2009). Fagocyteren is niet de enige taak van deze cellen maar ook het uitscheiden van signaalmoleculen; chemokinen en cytokinen. Chemokinen zorgen ervoor dat fagocyten uit de bloedcirculatie worden aangetrokken naar de plaats van infectie. Cytokinen, zoals interleukines (IL) en tumornecrosefactor (TNF), hebben tal van effecten op het immuunsysteem, welke resulteren in een ontstekingsreactie. Deze reactie leidt tot het onschadelijk maken van het micro-‐organisme maar brengt ook ongemakken met zich mee (roodheid, pijn, zwelling) (Moser & Oberdan, 2010). Naast de fagocyten, vormen de NK-‐ cellen een tweede belangrijke groep effectorcellen. NK-‐cellen staan in voor het afdoden van onder andere viraal geïnfecteerde cellen en tumorcellen. Ze herkennen verstoringen van de MHC-‐expressie op het celoppervlak en scheiden, als gevolg hiervan, perforine en granzyme uit die de aangetaste cellen dan afdoden. Verder zijn er nog tal van eiwitten die een rol spelen bij de afweer, waaronder het complement systeem. Dit systeem bestaat uit een 30 tal eiwitten, heeft tal van functies en vormt een brug tussen het aangeboren en het verworven immuunsysteem. De dendritische cellen, eveneens een belangrijke groep effectorcellen, hebben als functie het presenteren van antigenen aan het verworven immuunsysteem. Deze antigenpresenterende cellen (APC) hebben hierdoor een schakelfunctie tussen de twee immuunsystemen. Zij gaan alsook de micro-‐organismen fagocyteren maar niet met het doel 2

ze te vernietigen maar wel de antigenen te presenteren waardoor de specifieke immuniteit wordt geactiveerd. Naast dendritische cellen, kunnen ook macrofagen en B-‐lymfocyten antigenen presenteren. Het aangeboren immuunsysteem zal er niet in slagen de infectie volledig te verwijderen maar houdt ze wel tegen. Het verworven immuunsysteem zal de micro-‐organismen vervolgens volledig elimineren (Rijkers et al., 2009). 1.1.3 Het verworven immuunsysteem

Het verworven of adaptief immuunsysteem is nog niet aanwezig bij de geboorte en

vormt de tweedelijnsverdediging (Zepp, 2010). De immuunrespons komt relatief traag op gang door de aanwezigheid van een lag-‐fase tussen de blootstelling aan het antigen en de maximale respons. De cellen van het adaptief immuunsysteem, B-‐ en T-‐lymfocyten, hebben de eigenschap om micro-‐organismen uiterst specifiek te gaan herkennen, waarna deze worden vernietigd. Bij een tweede contact met hetzelfde antigen, zal de respons veel sneller en efficiënter optreden waardoor er minder risico is op re-‐infectie. Deze snellere respons is mogelijk aangezien er bij een eerste contact geheugen wordt opgebouwd. Dit kenmerk is een essentieel verschil met het aangeboren immuunsysteem, waarbij de blootstelling aan het antigen niet resulteert in de opbouw van immunologisch geheugen (Moser & Oberdan, 2010). Recent heeft men ontdekt dat NK-‐cellen ook een geheugen kunnen opbouwen (Min-‐ Oo et al., 2013). Het adaptief immuunsysteem kan worden onderverdeeld in cellulaire en humorale immuniteit (zie figuur 1.1).

Figuur 1.1: Het adaptief immuunsysteem: cellulaire en humoral immuniteit. 3

1.1.3.1 Humorale immuniteit

De humorale immuniteit wordt gemedieerd door B-‐cellen en door B-‐cel geproduceerde

antilichamen. Extracellulaire micro-‐organismen, zoals bacteriën, sommige virussen en parasieten, worden voornamelijk uitgeschakeld door het humorale immuunsysteem (Rijkers, et al., 2009). B-‐cellen, ook wel B-‐lymfocyten genoemd, herkennen antigenen in solubele vorm door middel van hun B-‐celreceptor. De receptor wordt gevormd door een membraangebonden antilichaam met unieke specificiteit waardoor iedere B-‐cel slechts reageert met 1 specifiek antigen. Interactie tussen het lichaamsvreemde antigen en de receptor leidt tot activatie van de lymfocyten, waarna deze gaan prolifereren en differentiëren tot plasmacellen en geheugencellen (Moser & Oberdan, 2010). De volledige activatie van naïeve B-‐lymfocyten vereist echter 2 signalen. De binding van een antigen aan de B-‐celreceptor vormt het eerste signaal waarna interactie met Th2-‐cellen zorgt voor het tweede signaal. Naast deze interactie, produceren de Th2-‐cellen eveneens cytokinen (IL-‐4,IL-‐ 5 en IL-‐13), die bijdragen aan de B-‐cel activatie (zie figuur 1.1) (Rijkers et al., 2009). De plasmacellen zullen grote hoeveelheden antilichamen produceren die worden vrijgesteld in het bloed en in andere lichaamsvloeistoffen waar ze hun functies uitvoeren. Geheugencellen zorgen ervoor dat bij een tweede contact met het antigen, de immuunrespons sneller op gang komt. De belangrijkste effectorfuncties van antilichamen tijdens de humorale immuunrespons zijn: neutralisatie van o.a. bacteriële toxines, activatie van het complementsysteem en opsonisatie. Antilichamen zijn echter niet in staat de plasmamembraan te passeren waardoor intracellulaire pathogenen ontsnappen aan de humorale immuniteit (Moser & Oberdan, 2010). 1.1.3.2 Cellulaire immuniteit

T-‐lymfocyten, de cellen van het cellulaire immuunsysteem, zijn in staat om intracellulaire

micro-‐organismen te vernietigen en dekken op die manier de tekortkomingen van het humorale immuunsysteem. De T-‐celreceptor op het oppervlak van de T-‐lymfocyt is niet in staat om een antigen onmiddelljk te herkennen in tegenstelling tot de B-‐celreceptor. De antigenen worden slechts herkend als ze worden gepresenteerd door een groep van gespecialiseerde eiwitten: Major histocompatibility complex-‐moleculen (MHC-‐moleculen). Er zijn 2 klasses van MHC-‐moleculen, MHC-‐I en MHC-‐II, die verschillen in structuur en in hun distributie op de lichaamscellen (Moser & Oberdan, 2010). 4

De T-‐lymfocyten kunnen worden onderverdeeld in T-‐helpercellen (Th-‐cellen) en cytotoxische T-‐cellen (Tc-‐cellen). Het is mogelijk een onderscheid te maken tussen de twee T-‐cel populaties aan de hand van cel oppervlakte merkers: cluster of differentiation molecules (CD). Het CD8 eiwit komt voor op cytotoxische T-‐cellen en het CD4 eiwit bevindt zich op het oppervlak van T-‐helpercellen. Activatie van naïeve T-‐cellen vereist 2 signalen. Een eerste specifiek signaal wordt geleverd door de binding van de T-‐celreceptor aan het MCH/antigen complex, samen met de CD4 of CD8 co-‐receptor. Het tweede, costimulatoir signaal is niet specifiek en wordt geleverd door de interactie van het eiwit CD28 aanwezig op de T-‐cel met CD80/CD86 van de APC. Voor effector T-‐cellen is het tweede co-‐stimulatoir signaal overbodig (Rijkers et al., 2010). Cytotoxische T-‐cellen herkennen enkel peptiden in associatie met MHC-‐I moleculen, die voorkomen op alle lichaamscellen met een kern. De peptiden zijn afkomstig van virale glycoproteïnen of andere vreemde peptiden en worden intracellulair gegenereerd. Cytotoxische T-‐cellen zullen de viraal geïnfecteerde cel of tumorcel herkennen en uiteindelijk elimineren door middel van perforines en granzymes. Naast de cytotoxische effectormoleculen; perforine en granzyme, produceren deze T-‐cellen eveneens cytokines: IFN-‐γ en TNF (Moser & Oberdan, 2010). Analoog aan de Tc-‐cellen, herkennen de Th-‐cellen enkel peptiden in associatie met MHC-‐ II. Extracellulaire pathogenen worden via endocytose opgenomen door een APC en nadien gepresenteerd door MHC-‐II. Th-‐cellen kunnen worden onderverdeeld in Th1, Th2, Th17, Th9 en Th22 cellen. Het onderscheid wordt gemaakt aan de hand van de cytokines die ze produceren en hun functie. Th1 cellen produceren voornamelijk IFN-‐γ en IL-‐2 en zetten macrofagen aan om het micro-‐organismen intracellulair te vernietigen. Th2 cellen bieden hulp aan B-‐cellen voor de aanmaak van neutraliserende antilichamen en produceren onder andere IL-‐4, IL-‐5 en IL-‐13. Daarnaast verlenen Th17 cellen bescherming tegen extracellulaire bacteriën en schimmels, voornamelijk ter hoogte van mucosale oppervlakken. Th9 cellen zijn betrokken in de bescherming tegen extracellulaire parasieten, voornamelijk nematoden. Th22 cellen werden ontdekt bij inflammatoire huidziekten maar hun functie is nog niet gekend. Tenslotte zijn TFH cellen betrokken bij het stimuleren van germinale center responsen en bieden ze eveneens hulp bij de B-‐cel klasse switch (Dong & Martinez, 2010). De organen van het immuunsysteem, de lymfoïde organen, bevinden zich over gans het lichaam en kunnen worden onderverdeeld in de primaire en de secundaire lymfoïde organen. Zowel de B-‐cellen als de T-‐cellen onstaan in het beenmerg. De maturatie van de B-‐ 5

cellen vindt eveneens plaats in het beenmerg terwijl de T-‐cellen migreren naar de thymus en daar verder matureren. Het beenmerg en de tymus vormen de primaire lymfoide organen. Na de maturatie treden de lymfocyten in de bloedcirculatie, van waaruit ze verder migreren naar de secundaire lymfoïde organen. Deze zijn de milt, lymfeknopen en lymfoïde weefsels, waar de adaptieve immuunrespons wordt geïniteerd (Rijkers et al., 2009). 1.2

DNA PLASMIDE VACCIN

1.2.1 Algemeen

Een immunisatietechniek die sinds begin jaren 90 in opmars is, is DNA vaccinatie. Een

DNA vaccin is een niet-‐levend, stabiel vaccin en heeft een brede waaier aan toepassingen (Zhang et al., 2003). Aangezien het vaccin antigen wordt gepresenteerd aan het immuunsysteem op een manier gelijkaardig aan de natuurlijke blootstelling, zal er zowel een humorale als een cellulaire immuunrespons worden opgewekt (Cevayir et al., 2011). Dit laatste biedt een enorm voordeel tegenover de conventionele niet-‐levende vaccins, aangezien deze enkel een humorale respons induceren (Kutzler & Weiner, 2008). Deze methode is nog volop in ontwikkeling en heeft momenteel slechts toepassing in de veterinaire geneeskunde met als voorbeeld het ‘West Nile-‐Innovator® DNA’, een vaccin tegen het West nile virus (De Filette et al., 2012).

Figuur 1.2: Het design van een DNA vaccin. Een DNA vaccin bestaat uit een plasmide met daarop verschillende genen die samen zorgen voor het uitlokken van een immuunrespons zoals geïllustreerd in figuur 1.2. Het belangrijkste onderdeel van deze plasmide is de gen sequentie, die codeert voor het vaccin antigen. Deze sequentie wordt gekloneerd in een bacteriëel plasmide en wordt vooraf gegaan door een eukaryote promotor, wat noodzakelijk is voor de expressie van het gen in zoogdiercellen (Dunham, 2002). Promotors kunnen de expressie van eiwitten reguleren in 6

alle weefsels of weefsel-‐specifiek de eiwitexpressie reguleren (Kutzler & Weiner, 2008). Verder kunnen nog enhancer elementen toegevoegd worden die de beschikbare mRNA niveau’s verder kunnen verhogen, wat een significante impact heeft op de expressieniveaus van het eiwit (Griffiths et al., 2000). Een origin of replication maakt de groei van het plasmide mogelijk in bacteriecellen. De selectie van de getransformeerde bacteriën, dit zijn diegene die het plasmide daadwerkelijk hebben opgenomen, gebeurt met behulp van een antibioticaresistentiegen. Meestal wordt gebruik gemaakt van ampicilline of kanamycine resistentiegenen. Het DNA zal door de cellen worden opgenomen, waarna de transcriptie plaatsvindt naar het mRNA. Voor de stabilisatie van het mRNA wordt een polyadenylatie signaal opgenomen in het plasmide. Het plasmide bevat naast de basisgenen ook immunostimulatoire sequenties. Deze bestaan uit ongemethyleerde cytosine-‐fosfaat-‐ guanosine dinucleotiden en fungeren als endogene adjuvantia. In zoogdier DNA komen deze sequenties veel minder voor, waardoor deze herkend worden door het immuunsysteem. De herkenning van deze sequenties door Toll-‐like receptor 9 (TLR-‐9) leidt tot activatie van de B-‐ cellen, wat zorgt voor de secretie van antilichamen en verbetert de antigenpresentatie via activatie van macrofagen en dendritische cellen. Als laatste veroorzaken deze dinucleotiden een up-‐reguatie van NK-‐cellen (Dunham, 2002). 1.2.2 Werking

Figuur 1.3: Het opwekken van een immuunrespons na pDNA vaccinatie. 7

Antigenpresenterende cellen (APC), voornamelijk dendritische cellen, spelen de hoofdrol in het opwekken van een immuunrespons (Dunham, 2002). De gezuiverde plasmide wordt intradermaal, subcutaan of intramusculair geïnjecteerd en wordt opgenomen door keratinocyten, myocyten of APC. De plasmide zal de celkern binnendringen, waarna de transcriptie start. Na de transcriptie volgt de translatie van het mRNA in het cytoplasma met vorming van de vreemde antigenen (Kutzler & Weiner, 2008). De APC kan direct (zie route 3 op figuur 1.3) of indirect geactiveerd worden. De somatische cellen gaan de intracellulair gegenereerde proteïnen uitscheiden (route 1) of vrijstellen na celdood (route 2), wat leidt tot indirecte activatie van de APC (Dunham, 2002). Als gevolg van dit mechanisme, zullen de antigenen zowel gepresenteerd worden op MHC-‐I als op MHC-‐II moleculen. Enkel proteïnen die intracellulair worden gegenereerd, worden gepresenteerd op MHC-‐I. Dit zorgt voor het uitlokken van een cellulaire immuunrespons via de stimulatie van cytotoxische T-‐cellen. In tegenstelling tot de conventionele vaccins, waar de antigenen worden gepresenteerd op MHC-‐II en dus slechts leiden tot antilichaam productie (Gil, 1998). 1.2.3 Voordelen

Aangezien DNA vaccins niet-‐levend en niet-‐repliceerbaar zijn, is er weinig risico dat het

vaccin ziekte zal veroorzaken, in tegenstelling tot levend verzwakte en afgedode vaccins. Bovendien zijn DNA vaccins zeer flexibel aangezien verschillende genen gecodeerd kunnen worden op het plasmide. De DNA vaccins zijn (temperatuur)stabieler dan de conventionele vaccins en zijn gemakkelijk te bewaren en te transporteren aangezien ze geen koeling vereisen. De productie van DNA vaccins is eenvoudig en niet duur en kan op grote schaal gebeuren. Een ander voordeel van dit vaccin is dat zowel een humorale als een cellulaire immuunrespons wordt opgewekt. Zo biedt een DNA vaccin de voordelen van een levend verzwakt vaccin maar niet de nadelen (Kutzler & Weiner, 2008). 1.2.4 Veiligheid

Naast de vele voordelen zijn er ook enkele bedenkingen omtrent de veiligheid van het

vaccin. Ten eerste bestaat het risico dat het vaccin zal incorporeren in het cellulair DNA van de gastheer. Wanneer dit het geval is, kan dit leiden tot het activeren van een oncogen of het inactiveren van een tumor suppressor gen. De DNA vaccins die momenteel worden getest, vertonen echter geen relevante levels van integratie in het cellulair DNA. Indien het 8

fenomeen zich toch voordoet, is de snelheid van integratie veel lager dan de spontane mutatiefrequentie. Een tweede risico verbonden aan DNA vaccinatie, is het ontstaan van auto-‐immuniteit. Preklinische studies tonen echter geen stijging van anti-‐DNA antilichamen en er is nog geen overtuigend bewijs gevonden voor de ontwikkeling van auto-‐immuniteit ten gevolge van DNA vaccinatie. Een laatste punt betreft de ontwikkeling van antibioticaresistentie. De productie op grote schaal vereist het selectief opkweken van bacteriecellen die de plasmide hebben opgenomen. De getransformeerde bacteriecellen zullen resistent zijn aan het antibiotica als gevolg van de antibioticaresistentiemerker op het plasmide. Een tegenargument is dat de gebruikte resistentiegenen beperkt worden tot antibiotica die niet vaak worden gebruikt bij het behandelen van infecties zoals kanamycine (Kutzler & Weiner, 2008). 1.2.5 Efficiëntie

Het belangrijkste probleem van de DNA-‐vaccins betreft hun lage immunogeniciteit

(Cevayir et al., 2011). De immuunrespons is zwakker bij hogere primaten en mensen in vergelijking met de respons bij muizen. Tot op heden wordt er onderzoek gedaan naar methoden die de immunogeniciteit van het vaccin kunnen verbeteren. Een eerste methode die wordt onderzocht, is de optimalisatie van de transcriptionele elementen ter verbetering van de gentranscriptie en -‐expressie. Een belangrijke factor hierbij is de promotor, aanwezig op het plasmide. Een tweede belangrijk punt is de translatie van het gen. Optimalisatie van deze stap leidt tot een verhoogde proteïneproductie en dus een grotere immuunrespons. Ook codonoptimalisatie kan de expressie van proteïnen verhogen. Toevoegen van adjuvantia (vb. GM-‐CSF) aan de formulatie, kan eveneens een oplossing bieden (Kutzler & Weiner, 2008). Daarnaast worden er ook verschillende kationische carriers zoals liposomen (vb. DOTAP) en polymeren (vb. lineair polyethyleenimine) uitgetest omdat deze enerzijds het DNA beschermen tegen DNasen alsook de transfectie van de cellen kan verhogen (Goyal et al., 2012; Karmali & Chaudhuri, 2007). Als laatste tracht men de afgifte van het vaccin te optimaliseren. Eén van de technieken die momenteel wordt toegepast in klinische studies, is elektroporatie. Deze methode bestaat uit het toedienen van korte elektrische pulsen nadat het vaccin werd geïnjecteerd (Zhang et al., 2003). Dit zorgt ervoor dat er tijdelijke poriën worden gevormd in het celmembraan waardoor de plasmide de cel gemakkelijker kan binnendringen (Kutzler & Weiner, 2008). 9

1.3

HET WEST NILE VIRUS

1.3.1 Algemeen

Het West Nile virus is een arbovirus, wat betekent dat het via geleedpotigen wordt

overgedragen. Hoofdzakelijk verloopt de transmissie via muggen maar andere geleedpotigen kunnen ook een kleine rol spelen in het overbrengen van het pathogeen. Het virus behoort tot het geslacht van de Flavivirussen binnenin de familie van de Flaviviridae (CFSPH, 2009). In 1937 werd het WNV voor het eerst geïsoleerd in de West Nile provincie in Uganda en later werd het virus herkend als het meest wijdverspreide van de Flavivirussen (Hubálek & Halouzka, 1999). Het genoom van het virus bestaat uit een enkelstrengig, positief RNA molecule, telt ongeveer 11000 nucleotiden en wordt vertaald in een polypeptide. Dit polypeptide wordt post-‐translationeel verwerkt tot 10 proteïnen waarvan 3 structurele, vereist voor de vorming van het virus en 7 niet-‐structurele (zie figuur 1.4) (Welte et al., 2011). De structurele proteïnen zijn het capside, pre-‐membraan en envelop (E) proteïne. Het E-‐proteïne is noodzakelijk voor de receptorbinding, membraanfusie en assemblage van het virus en bestaat uit 3 afzonderlijke domeinen: domein I, II en III. Domein III is mogelijks de receptorbindingsplaats waartegen neutraliserende antilichamen worden gevormd in vivo. Het pre-‐membraan proteïne zal het E-‐proteïne assisteren bij de juiste opvouwing van het virus (Chávez et al., 2013). De niet-‐structurele proteïnen zijn nodig voor de replicatie van het genoom. De levenscyclus van het virus kan in 4 stadia worden onderverdeeld: aanhechting/binnendringen in de cel, translatie, replicatie en assemblage/verlaten van de cel. Het binnendringen van de cel gebeurt door middel van receptorgemedieerde endocytose, waarvan de specifieke receptor onbekend is. Via endocytose zal het virus de cel terug verlaten (Rossi et al.,2010).

Figuur 1.4: Het WVN genoom bevat 3 structurele proteïnen (rood) en 7 niet-‐structurele proteïnen (groen). 10

1.3.2 Epidemiologie

Het WVN bevindt zich in een cyclus tussen vogels en muggen, zoals geïllustreerd in figuur

1.5. De geïnfecteerde muggen zullen bij het zuigen van bloed, de gastheer infecteren met het virus. Vogels zijn het belangrijkste gewervelde reservoir maar ook andere zoogdieren, zoals paarden en mensen, kunnen geïnfecteerd worden. Mensen (en ook paarden) worden in deze cyclus accidentele of ‘dead-‐end’ gastheren genoemd omdat zij het virus niet terug overbrengen naar een bloedzuigende, niet-‐geïnfecteerde mug. Daarvoor is de concentratie van het virus in het bloed onvoldoende. Het virus wordt niet overgedragen van mens op mens maar er is wel transmissie mogelijk bij bloedtransfusie of orgaandonatie wanneer de donoren geïnfecteerd zijn. Er zijn eveneens gevallen gerapporteerd van overdracht tussen moeder en kind via de placenta of borstvoeding (Rossi et al.,2010). Sinds het virus voor het eerst werd geïsoleerd in Uganda, heeft het zich verspreid over een groot deel van de wereld. Het WNV heeft reeds epidemieën veroorzaakt in Afrika, Azië, het Midden-‐Oosten, Europa, Australië en in de USA, waar het in 1999 in New York voor het eerst werd gedetecteerd (Campbell et al., 2002).

Figuur 1.5: De levenscyclus van het West Nile virus (Shannan et al,2010) 11

1.3.3 Symptomen

Ongeveer 80 % van de infecties verlopen asymptomatisch. De ziekte kan zich uiten op 2

manieren; West Nile Koorts en West Nile Neuro-‐invasieve ziekte, waarbij de eerstgenoemde vorm het meeste voorkomt. De patiënten met West Nile koorts vertonen griepachtige symptomen, die meestal 2 tot 6 dagen aanhouden. Koorts, algemene malaise, zwakheid, hoofdpijn en pijn ter hoogte van de huid behoren tot de symptomen. Andere symptomen zoals diarree, misselijkheid, braken en conjunctivitis kunnen ook voorkomen. De incubatieperiode, dit is de tijd tussen de muggenbeet en de presentatie van de symptomen, bedraagt 2 tot 14 dagen. West Nile neuro-‐invasieve ziekte komt slechts voor in 1% van de gevallen en kan levensbedreigend zijn. Deze vorm treedt voornamelijk op bij oudere mensen en mensen met een verminderde immuniteit. Drie ziektebeelden zijn mogelijk: encefalitis, meningitis en slappe verlamming (CFSPH, 2009). De klachten gepaard gaande met encefalitis of meningitis, betreffen snel opkomende hoofdpijn, rugpijn, verwardheid, fotofobie en continue koorts (Rossi et al., 2010). Encefalitis kan ook nog gepaard gaan met desoriëntatie, tremors en wijzigingen in het bewustzijn. Verlamming komt voor bij sommige patiënten, is zeer acuut en typisch asymmetrisch. Het kan 1 of meerdere ledematen treffen en de zwakke ledematen worden donkerder dan normaal. De verlamming kan verdwijnen binnen enkele weken maar sommige patiënten blijven verlamd. Fatale afloop komt voor bij ongeveer 10 % van de patiëntien met West Nile neuro-‐invasieve ziekte, in het bijzonder bij mensen ouder dan 70 jaar. De prognose bij patiënten met encefalitis is vaak slechter dan bij patiënten met meningitis (CFSPH, 2009). Langetermijncomplicaties zijn ook niet ongewoon (Rossi et al., 2010). 1.3.4 Behandeling

De behandelingsmogelijkheden zijn gelimiteerd en beperken zich tot een

symptomatische behandeling. Momenteel is er nog geen specifiek antiviraal middel beschikbaar. Sommige klassieke antivirale middelen zijn veelbelovend in vitro maar het resultaat in vivo is nog onduidelijk. Een tweede behandelingsmethode die momenteel getest wordt, is het passief toedienen van anti-‐WVN antilichamen. Deze methode blijkt effectief te zijn in proefdier modellen. Verder onderzoek is nog noodzakelijk (Rossi et al., 2010).

12

1.3.5 Vaccin

Tot op heden is er nog geen vaccin voor humaan gebruik op de markt. Oudere en

immuungecompromitteerde mensen worden het meest getroffen door het WNV. Het gebruik van levende vaccins zijn hierbij dus niet aan te raden omwille van het mogelijke risico op infectie. Momenteel wordt onderzoek gedaan naar inactieve subunit vaccins zoals recombinante proteïne vaccins of DNA vaccins (Schneeweiss et al., 2011). Er zijn wel reeds verschillende vaccins beschikbaar voor paarden. De interesse naar een vaccin voor paarden is groot, omwille van de negatieve impact van het WNV op de paardenhandel (Dauphin & Zientara, 2007). Het eerste vaccin voor paarden is op de markt in de USA sinds 2001 en kreeg de naam West Nile-‐Innovator. Het vaccin bevat het volledige virus geïnactiveerd door formaldeyhde. Een ander afgedood virus vaccin is het Het Vetera WVN vaccin. Een derde vaccin voor paarden is het RecombitekEquine West Nile Virus vaccin en werd gecommercialiseed in 2004 in de USA. Dit vector vaccin zal de prM en E genen tot expressie brengen, wat een cytotoxische T-‐cel respons zal induceren. Het vaccin is veilig en jaarlijkse hervaccinatie is vereist (De Filette et al., 2012). Een DNA vaccin is reeds op de markt sinds augustus 2005 onder de naam West Nile-‐Innovator DNA. Het vaccin bevat een plasmide dat codeert voor het prM-‐ en E-‐proteïne van het West Nile virus en is het tweede DNA vaccin ooit gelicentieerd (Dauphin & Zientara, 2007; De Fillette et al., 2012).

13

2

OBJECTIEVEN Het West Nile Virus werd voor het eerst geïsoleerd in 1937 in de West Nile provincie in

Oeganda. Tot de jaren ’90 vormde het virus geen groot risico voor de volksgezondheid en kwam het slechts sporadisch voor. Sindsdien is het virus zich beginnen verspreiden over een groot deel van de wereld en is het WNV endemisch in Afrika, Azië, Australië, het Midden-‐ Oosten, Europa en in de Verenigde Staten van Amerika. In sommige gevallen is het WNV geassocieerd met ernstige neurologische symptomen. De behandelingsmogelijkheden zijn echter gelimiteerd en beperken zich tot een symptomatische behandeling. Momenteel zijn er enkel vaccins beschikbaar in de veterinaire sector. Omwille van deze problematiek, is er belangstelling voor de ontwikkeling van een humaan vaccin tegen het West Nile Virus. In deze thesis wordt onderzoek gedaan naar een DNA vaccin, bestaande uit een plasmide welke het E-‐proteïne tot expressie zal brengen. DNA vaccinatie heeft vele voordelen (zie 1.2.3) waaronder het opwekken van zowel een humorale als een cellulaire immuunrespons. Het vaccin wordt intramusculair toegediend bij BALBc muizen en de injecties worden onmiddellijk gevolgd door elelektroporatie waardoor het plasmide de cel gemakkelijker kan binnendringen. Drie weken later krijgen de muizen een tweede boost met het DNA vaccin. Na 2 weken heeft de immuunrespons zijn maximum bereikt en worden de muizen gedood. De miltcellen van de muizen worden opgezuiverd waarna deze worden gebruikt voor het testen van de cellulaire en de humorale immuunrespons, opgewekt door het vaccin. Of het vaccin wel degelijk een cellulaire immuunrespons opwekt, wordt onderzocht aan de hand van een Enzyme-‐linked ImmunoSPOT assay (ELISPOT) (zie 3.11). Deze techniek detecteert cytokines die worden geproduceerd door geactiveerde T-‐cellen. Het resultaat is de aanwezigheid van zwarte spots op de 96-‐well plaat, waarbij elke spot een cytokine-‐ secreterende cel voorstelt. De spots zullen worden geteld met de ELISPOT reader. Er wordt specifiek onderzocht welk epitoop van het E-‐proteïne de meeste stimulatie uitlokt. Daarvoor wordt gestart met de opzuivering van 26 peptiden gefusioneerd met GST, die samen het volledige E-‐proteïne vormen. De fusieproteïnen worden eerst tot expressie gebracht in een E-‐coli stam via inductie met IPTG. Na opzuivering van de fusieproteïnen door middel van gluthation affiniteitschromatografie (zie 3.3), worden ze elk afzonderlijk getest in de ELISPOT assay. Het vaccin wordt eveneens getest op het uitlokken van een humorale immuunrespons. Het serum van de gevaccineerde muizen wordt geanalyseerd in een enzyme-‐linked immunosorbent assay (ELISA) (zie 3.12). Analoog als bij de ELISPOT, wordt bij 14

de ELISA specifiek getest welk fusieproteïne aanleiding geeft tot de sterkste stimulatie. Bij ELISA is het secundaire antilichaam, dat het primaire antilichaam zal binden, geconjugeerd met een enzym. Dit enzym zorgt voor een kleurreactie wanneer het in contact komt met zijn substraat. Enkel op de plaatsen waar een antilichaam aanwezig is, zal een kleurverandering optreden. Deze 2 technieken, ELISPOT en ELISA, moeten de effectiviteit van het DNA vaccin in kaart brengen. 15

3

MATERIAAL EN METHODEN

3.1

VEEL GEBRUIKTE MATERIALEN -‐

Autoclaaf : Systec VB-‐55 (Systec-‐lab, Wettenberg, Duitsland)

-‐

Vortex : MS1 minishaker (IKA, Staufen, Duitsland)

-‐

Centrifuge : Sorvall RC-‐5B (Thermo Scientific, Waltham, USA)

-‐

Warmwaterbad : Buchi heating bath B-‐491 (Buchi, Flawil, Zwitserland)

-‐

Ethanol 70 % (VWR international, Radnor, USA)

3.2

BACTERIËN OPGROEIEN

3.2.1 Materialen en gebruikte oplossingen

-‐

Schudincubator : General purpose incubator (Shel Lab, Cornelius, USA)

-‐

LB agar (per liter) : 10 g NaCl (VWR international, Radnor, USA), 10 g trypton (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA) , 5 g yeast extract (Merck, Darmstadt, Duitsland) aanlengen met dH2O tot een volume van 1 l

-‐

Kanamycine (Merck, Darmstadt, Duitsland)

-‐

IPTG (Thermo Scientific, Waltham, USA)

-‐

Glycerol (UCB, Brussel, België)

-‐

26 BL21 E.Coli stammen (IZI Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Leipzig, Duitsland)

3.2.2 Principe Het experiment start met het opkweken van 26 bacteriestammen. Elke bacteriestam bevat een plasmide met daarop de genen die coderen voor een welbepaald peptide van het WNV-‐ E proteïne gefusioneerd met gluthation S-‐transferase (GST). De peptiden, bestaande uit ongeveer 30 aminozuren, vormen samen het volledige envelop proteïne van het West Nile virus. Een overzicht van de aminozuursequenties is weergegeven in tabel 3.1. Er is eveneens een kanamycine resistentiegen aanwezig op het plasmide, waardoor selectieve groei mogelijk wordt. De bacteriën worden opgekweekt in LB-‐medium tot de exponentiële groeifase, waarna isopropyl β-‐D-‐1-‐thiogalactopyranoside (IPTG) wordt toegevoegd. Het plasmide beschikt over het lac operon gelegen voor het gen van interesse. IPTG is een 16

synthetisch lactose analoog en zal de lac repressor inactiveren, wat leidt tot inductie van de peptidesynthese. In een volgende stap worden de bacteriecellen gelyseerd door het toevoegen van lyse buffer. In het medium bevinden zich dan de fusieproteïnen die vervolgens worden gezuiverd met behulp van affiniteitschromatografie. Tabel 3.1 Aminozuursequenties Bacteriestam

Aminozuursequentie

positie

GST-‐IC15 GST-‐IC16 GST-‐IC17 GST-‐IC18 GST-‐IC19 GST-‐IC20 GST-‐IC21 GST-‐IC22 GST-‐IC23 GST-‐IC24 GST-‐IC25 GST-‐IC26 GST-‐IC27 GST-‐IC28 GST-‐IC29 GST-‐IC30 GST-‐IC31 GST-‐IC32 GST-‐IC33 GST-‐IC34 GST-‐IC35 GST-‐IC36 GST-‐IC37 GST-‐IC38 GST-‐IC39 GST-‐IC40

LLLLVAPAYSFNCLGMSNRDFLEGVSGATW FLEGVSGATWVDLVLEGDSCVTIMSKDKPT VTIMSKDKPTIDVKMMNMEAANLAEVRSYC ANLAEVRSYCYLATVSDLSTKAACPTMGEA KAACPTMGEAHNDKRADPAFVCRQGVVDRG VCRQGVVDRGWGNGCGLFGKGSIDTCAKFA GSIDTCAKFACSTKATGRTILKENIKYEVA LKENIKYEVAIFVHGPTTVESHGNYSTQIG SHGNYSTQIGATQAGRFSITPAAPSYTLKL PAAPSYTLKLGEYGEVTVDCEPRSGIDTNA EPRSGIDTNAYYVMTVGTKTFLVHREWFMD FLVHREWFMDLNLPWSSAGSTVWRNRETLM TVWRNRETLMEFEEPHATKQSVIALGSQEG SVIALGSQEGALHQALAGAIPVEFSSNTVK PVEFSSNTVKLTSGHLKCRVKMEKLQLKGT KMEKLQLKGTTYGVCSKAFKFLGTPADTGH FLGTPADTGHGTVVLELQYTGTDGPCKVPI GTDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNP PVGRLVTVNPFVSVATANAKVLIELEPPFG VLIELEPPFGDSYIVVGRGEQQINHHWHKS QQINHHWHKSGSSIGKAFTTTLKGAQRLAA TLKGAQRLAALGDTAWDFGSVGGVFTSVGK VGGVFTSVGKAVHQVFGGAFRSLFGGMSWI RSLFGGMSWITQGLLGALLLWMGINARDRS WMGINARDRSIALTFLAVGGVLLFLSVNVH VLLFLSVNVHADTGCAIDISRQELRCGSGV

M66-‐75/E1-‐20 E11-‐40 E31-‐60 E51-‐80 E71-‐100 E91-‐120 E111-‐140 E131-‐160 E151-‐180 E171-‐200 E191-‐220 E211-‐240 E231-‐260 E251-‐280 E271-‐300 E291-‐320 E311-‐340 E331-‐360 E351-‐380 E371-‐400 E391-‐420 E411-‐440 E431-‐460 E451-‐480 E471-‐500 E491-‐501/NS1-‐18

3.2.3 Protocol

De bacteriestammen worden bewaard bij -‐80°C en ontdooid voor gebruik. 50 µl van elke

stam wordt opgekweekt in 5 ml LB-‐medium waaraan 5 µl kanamycine is toegevoegd. Dit mengsel wordt in een schudincubator geplaatst en overnacht gegroeid bij 37°C. Voor eventueel later gebruikt wordt 500 µl van de overnacht gegroeide cultuur vermengd met 500 µl glycerol en ingevroren bij -‐80°C. Vervolgens wordt 2 ml cultuur verdund in 100 ml LB-‐ 17

medium. Opnieuw wordt kanamycine toegevoegd en wordt het mengsel al schuddend gegroeid bij 37°C. Na 4u wordt 0,5 ml IPTG toegevoegd, waarna de cultuur terug overnacht in de schudincubator wordt geplaatst. De volgende dag wordt 33 ml cultuur afgecentrifugeerd gedurende 10 min bij 10000 rpm en wordt het supernatans verwijderd. Dit proces wordt 3 keer herhaald waarna het bacteriepellet wordt bewaard bij -‐20° voor verder gebruik. 3.3

AFFINITEITSCHROMATOGRAFIE


-‐

Polypropyleen kolom (Qiagen, Hilden, Duitsland)

-‐

Bransonic ultrasonic cleaner (Sigma-‐aldrich, St.Louis, USA)

-‐

PBS (met pH 7,2) : 50 mM NaH2PO4 , 150 mM NaCl

-‐

PBS-‐based lysis buffer (PBS-‐L) : 1 x PBS, protease inhibitor (Roche, Bazel, Zwitserland), 1mM DTT (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA), 1mM EDTA (VWR international, Radnor, USA), 1% (v/v) Triton X-‐100 (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA), 1 mg/ml Lysozyme (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA)

-‐

PBS-‐based equilibration and wash buffer (PBS-‐EW) : 1 x PBS, 1mM DTT, 1mM EDTA

-‐

Elution buffer (TNTG) : 50 mM Tris pH 8,0 (Bio-‐rad, Hercules, USA), 0,4 M NaCl (VWR international, Radnor, USA) , 50 mM L-‐Gluthatione reduced (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA), 0,1 % Triton-‐X-‐ 100, 1 mM DTT

-‐

50% Glutathione HiCap Matrix slurry (Qiagen, Hilden, Duitsland)

3.3.2 Principe

Voor de opzuivering van de gluthation S-‐transferase-‐gemerkte proteïnen, aanwezig in

het bacteriepellet, maken we gebruik van gluthation affiniteitschromatografie. Het tripeptide gluthation is geïmmobiliseerd op de Glutathione HiCap matrix en zal de GST-‐tag selectief binden. De overige proteïnen worden in een volgende stap weggewassen waarna de fusieproteïnen worden geëlueerd door toevoeging van TNTG. Deze elutiebuffer bevat gereduceerd glutathion, dat zal binden op de GST-‐tag waarna het gewenste fusieproteïne de kolom verlaat. (zie figuur 3.1) 18

Figuur 3.1: Het principe van gluthation affiniteitschromatografie 3.3.3 Protocol

De eerste stap van de opzuivering bestaat uit het vrijmaken van de proteïnen uit de cel.

Het bacteriepellet wordt opgelost in 7,5 ml lysebuffer en nadien hevig gevortexd. Vervolgens wordt de tube in de ‘Branson 2510’ geplaatst, dit gedurende 10 min. Dit sonificatietoestel stuurt ultrasone trillingen in de oplossing, die ervoor zorgen dat de bacteriecel uiteenvalt. De lysosymen aanwezig in de lysebuffer en de ultrasone trillingen zorgen er samen voor dat de proteïnen vrijkomen in het medium. Na de sonificatie wordt de oplossing afgecentrigufeerd (30 min bij 15000 rpm) en wordt het supernatans overgebracht in een nieuwe tube. Eén ml van de 50 % Glutathione HiCap matrix slurry wordt in een lege kolom gepipetteerd waarna deze wordt geëquilibreerd met behulp van 5 ml PBS-‐EW buffer. Het lysaat wordt volledig over de kolom gebracht en de flow-‐through (FT) wordt opgevangen in een 15 ml tube. In een volgende stap wordt de kolom gewassen door het toevoegen van 5 ml PBS-‐EW buffer. Ook de wash wordt opgevangen in een 15 ml tube. 500µl elutiebuffer wordt vervolgens toegevoegd en het eluaat, dat het GST-‐gemerkte proteïne bevat, wordt gecollecteerd in een eppendorfje. Deze laatste stap wordt 6 maal herhaald tot het proteïne volledig uit de kolom is geëlueerd. Van elke zuiveringsstap (lysaat, FT, wash) wordt een staal van 100 µl genomen. Op de kolom wordt 1 ml PBS-‐EW gebracht en deze wordt dan bewaard bij 4°C tot verder gebruik. De eppendorfjes met de zuiveringsfracties worden bewaard bij -‐20°C.

19

3.4

POLYACRYLAMIDE GELELEKTROFORESE


-‐

Mini-‐PROTEAN Tetra Cell (Bio-‐Rad, Hercules, USA)

-‐

Heater block QBD4 (Grant, ambridge, Engeland)

-‐

Running gel (12%) :

9,9 ml dH2O, 12 ml 30% acrylamide oplossing (Bio-‐rad, Hercules, USA), 7,5 ml Tris 1,5M (pH 8,8) (Bio-‐rad, Hercules, USA), 0,3 ml 10% SDS (Merck, Darmstadt, Duitsland), 0,3 10% APS (Biorad, Hercules, USA), 0,012 ml TEMED (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA) -‐

Stacking gel : 5,5 ml dH20, 1,3 ml 30% acrylamide oplossing, 1,0 ml Tris 1,5M (pH 6,8), 0,08 ml 10% SDS, 0,08 ml 10% APS, 0,08 ml TEMED

-‐

Sample buffer : 4 ml dH2O, 1 ml Tris-‐HCl 0,5 M (pH 6,8), 0,8 ml Glycerol, 1,6 ml 10% SDS, 0,4 ml 2-‐β-‐ mercaptoethanol (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA), 0,2 ml 0,05% Bromophenol blauw (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA)

-‐

Running/tranfer buffer (R/T buffer) : 30,3 g Tris, 144 g Glycine (Bio-‐rad, Hercules, USA)

-‐

Running buffer : 10 ml 10% SDS, 100 ml R/T buffer  aanlengen met dH2O tot een volume van 1 l

-‐

Prestained protein ladder (Thermo Scientific, Waltham, USA)

-‐

PageBlueTM Protein Staining Solution (Thermo Scientific, Waltham, USA)

-‐

Isopropanol (VWR international, Radnor, USA)

Figuur 3.2: Mini-‐PROTEAN Tetra Cell 20

3.4.2 Princinpe

Polyacrylamide gelelektroforese is een techniek die

gebruikt wordt voor het scheiden van proteïnen (5-‐250 kD). De proteïnen worden gescheiden op basis van grootte en bewegen doorheen de gel als respons op een elektrisch veld. Kleine proteïnen gaan sneller en verder migreren dan grote proteïnen als gevolg van de poriënstructuur van de gel. De gel bestaat uit twee delen; onderaan de running gel met daarboven een smalle strook met stacking gel. De running gel kan bestaan uit 6%, 8%, 10%, 12% en 15% acrylamide. Figuur 3.3: Proteïneladder Het gekozen percentage hangt af van de grootte van de proteïnen die men wenst te scheiden; hoe kleiner de proteïnen, hoe groter het percentage acrylamide dat gebruikt zal worden. Een polymerisatiereactie tussen acrylamide en bis-‐acrylamide vormt de basis van de gel. De reactie wordt geïnitieerd door ammonium persulfaat (APS) en tetramethylethyleendiamide (TEMED) treedt op als katalysator. De grootte van de proteïnen wordt geschat aan de hand van een proteïneladder (zie figuur 3.3). Deze bestaat uit gekleurde standaard proteïnen en wordt naast de stalen op de gel geladen. Voor de visualisatie van de proteïnen op de gel, wordt gebruik gemaakt van een proteïne staining solution. 3.4.3 Protocol

De frame wordt gemonteerd waartussen de gel zal worden aangebracht. De glasplaatjes

worden eerst gevuld met water ter controle van lekken waarna de running gel wordt aangemaakt. Deze wordt voorzichtig tussen de twee glasplaten gepipetteerd maar er wordt nog ruimte overgelaten voor de stacking gel. Tijdens het stollen van de running gel wordt de overgebleven ruimte opgevuld met isopropanol om uitdroging van de gel te voorkomen. Als de running gel volledig gestold is, kan gestart worden met de bereiding van de stacking gel. Het laagje isopropanol wordt nadien verwijderd en vervangen door de stacking gel, waarin een kammetje wordt geplaatst. Tijdens het stollen van de stacking gel, worden de stalen voorbereid. 50 µl staal wordt vermengd met 10 µl sample buffer, waarna de eppendorfjes 21

gedurende 5 minuten in de heating block (95°C) worden geplaatst. Wanneer ook de stacking gel volledig gestold is, wordt het kammetje verwijderd en wordt de gel in het elektroforese toestel geplaatst. Deze wordt opgevuld met running buffer waarna ieder laantje wordt gevuld met 30 µl staal en 1 laantje met 10 µl ladder. De mini-‐PROTEAN tetra cell wordt aangesloten aan een stroombron en de gel begint te lopen. Na 1 uur wordt de gel verwijderd uit het toestel en meerdere malen gewassen zodat sodium dodecyl sulfate (SDS) wordt verwijderd van de gel. Deze stof zou immers interfereren met de staining solution. Na de wasstap wordt de staining solution aangebracht over de gel en gedurende 1 uur op de schudder geplaatst (zie figuur 3.4). Wanneer de kleuring is voltooid, wordt de staining solution verwijderd en weggewassen. Als gevolg van de kleuring, zijn de proteïnen zichtbaar als smalle lijntjes op de gel.

Figuur 3.4: Procedure van proteÏne kleuring 3.5

DIALYSE


-‐

Membraan dialyse systeem (Float-‐A-‐Lyzer G2, Spectrumlabs, Breda, Nederland)

-‐

Phosphate buffered saline (PBS) : 137 mM NaCl (VWR international, Radnor, USA), 2,7 mM KCl (Noury-‐Baker N.V., Deventer, Nederland), 10 mM Na2HPO4 (Sigma-‐ Aldrich, St. Louis, USA), 2 mM KH2HPO4 (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)

3.5.2 Principe / protocol

Dialyse is een simpel proces waarbij kleine moleculen diffunderen van een hoge

concentratie naar een lage concentratie doorheen een semi-‐permeabel membraan tot een evenwicht bereikt wordt. Kleine moleculen worden op deze manier verwijderd terwijl grotere worden weerhouden. Voor het verwijderen van de elutiebuffer uit de proteïne stalen, gebruikt men deze scheidingstechniek. De buffer moleculen zijn veel kleiner dan de proteïnen en zullen doorheen het semi-‐permeabel membraan diffunderen. Eén ml staal 22

wordt in het dialyse systeem gepipetteerd waarna dit in een roterend vat met PBS wordt geplaatst. Na 12 u is een evenwicht bereikt en kan men het staal voorzichtig opzuigen met een pipet, waarna deze worden bewaard bij -‐20°C. 3.6

NANODROP

3.6.1 Materialen

-‐

NanoDrop ND-‐1000 (Themo Scientific, Waltham, USA)

-‐

Water, Mol Bio grade, Dnase-‐, Rnase -‐ en Proteasevrij (5 Prime, Hamburg, Duitsland)

3.6.2 Principe / Protocol

De nanodrop ND-‐1000 is een spectrofotometer die het mogelijk maakt kleine volumes te

analyseren. Dit meetinstrument wordt zowel gebruikt voor de kwantificatie als voor de evaluatie van de zuiverheid van nucleïnezuren en proteïnen. Traditionele cuvetten zijn overbodig aangezien de vloeistof op zijn plaats wordt gehouden door de oppervlaktespanning die heerst in de vloeistof. Er wordt steeds gestart met een blancometing waarbij 1 µl Dnase-‐, Rnase -‐ en Proteasevrij water wordt geanalyseerd. Na deze meting, maar ook na alle andere metingen, wordt het meetoppervlak gereinigd met een tissue. 1 µl staal wordt nadien aangebracht op het meetoppervlak (zie linkse figuur 3.5). Bij het sluiten van de arm wordt een kolom gevormd door de vloeistof (zie rechtse figuur 3.5) en tijdens de meting selecteert de nanodrop automatisch de optimale weglengte (0,5 mm – 1 mm). De meting duurt ± 10 seconden waarna de gemeten absorbantie meteen wordt omgezet naar de concentratie van het staal. De absorbantie wordt gemeten bij 260 nm (nucleïne zuren) en bij 280 nm (proteïnen). De 260/280 en de 260/230 ratio wordt eveneens weergegeven en geven een indicatie over de zuiverheid van DNA-‐ of RNA stalen.

Figuur 3.5: Illustratie nanodrop

23

3.7

MUISEXPERIMENT


-‐

ECM 830 (BTX Harvard apparatus, Holliston, USA)

-‐

7 BALB/c muizen (Janvier, Le Genest Saint Isle, Frankrijk)

-‐

Plasmide : pT-‐WNV-‐E (IZI Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Leipzig, Duitsland)

-‐

Isofuraangas : Isoflo (Abbott, Waver, België)

3.7.2 Protocol

De muizen worden verdoofd met isofluraangas en nadien geschoren op het dijbeen.

Vervolgens wordt 50 µl plasmide intramusculair geïnjecteerd. Naakt DNA injecteren is zeer inefficiënt omwille van de minimale opname door de cel. Een oplossing voor dit probleem, is het toedienen van korte elektrische pulsen. Deze techniek, bekend als elektroporatie, zorgt voor het vormen van reversibele hydrofiele poriën in de celmembraan, wat het DNA de kans biedt om de cel binnen te dringen. Vooraf wordt carbomeergel aangebracht op de huid van de muis, wat de geleiding doorheen de huid verbetert. Vier pulsen (100 volt) worden toegediend met een pauze van 100 ms tussen iedere puls. Hierna worden de polen verwisseld en worden er opnieuw 4 pulsen toegediend. Na 3 weken wordt deze procedure herhaald. Opnieuw 2 weken later worden de muizen gedood en wordt de milt verwijderd waarna de cellulaire immuunrespons wordt getest met behulp van ELISPOT. Een bloedstaal van elke muis wordt eveneens geanalyseerd ter controle van de humorale immuunrespons. Hiervoor wordt een ELISA assay gebruikt. 3.8

OPZUIVEREN VAN DE MILTCELLEN


-‐

Nylonfilter : Cell Strainer 70 µm (BD Falcon, Franklin Lakes, USA)

-‐

Rode bloedcellen lysebuffer : 8,26 g ammonium chloride (Merck, Darmstadt, Duitsland), 1 g kaliumcarbonaat (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA), 0,037 g EDTA (VWR interantional, Leuven, België)  oplossen in 1 l dH2O en autoclaveren.

-‐

RPMI 1640 medium (Life Technologies, Grand Island, USA)

24

-‐

Steriele PBS (Life Technologies, Grand Island, USA)

-‐

RPMI 1640 medium aangerijkt met 10 % foetaal kalfserum (Invitrogen, Carlsbad, USA), L-‐glutamine (2mM) (Invitrogen, Carlsbad, USA), penicilline (100U/ml) (Invitrogen, Carlsbad, USA), streptomycine (100 µl/ml) (Invitrogen, Carlsbad, USA) = compleet medium

-‐

Tryptaanblauw (Invitrogen, Carlsbad, USA)

3.8.2 Protocol De milt wordt aseptisch verwijderd en gewassen in een petrischaal gevuld met 20 ml RMPI 1640 medium. Vervolgens wordt de milt in een tweede petrischaal gelegd en worden de cellen uit de milt geflushed met behulp van een naald en spuit. Het medium, aangerijkt met de miltcellen, wordt over een nylonfilter gebracht en gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 5 min. Het supernatans wordt verwijderd en het pellet gehersuspendeerd in 5 ml rode bloedcellen lysebuffer. Opnieuw wordt de suspensie in de centrifuge geplaatst en afgedraaid bij 300 xg gedurende 5 min. Na het verwijderen van het supernatans, wordt het pellet gehersuspendeerd in 15 ml PBS. Er volgt opnieuw een centrifugestap, waarna het supernatans wordt verwijderd. Het pellet wordt nadien gehersuspendeerd in 2 ml compleet medium. De miltcellen worden 1 op 10 verdund en 100 µl van de verdunning wordt vermengd met 100 µl tryptaan blauw en 800 µl compleet medium. Hierna worden de cellen geteld met behulp van een Bürker telraam en microscoop. Afhankelijk van het aantal cellen wordt een verdunning gemaakt met als eindconcentratie 3x106 cellen per ml. 3.9

OPZUIVEREN CD8 -‐ EN CD4 CELLEN


-‐

Magneet : DynaMag™-‐15 Magnet (Invitrogen, Carlsbad, USA)

-‐

Dynabeads® FlowComp™ Mouse CD4 kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)

-‐

Dynabeads® FlowComp™ Mouse CD8 kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)

-‐

Isolatiebuffer : PBS MET 0,1 % BSA (Sigma, St; Louis, USA) en 2 mM EDTA (VWR interantional, Leuven, België)

25


De Dynabeads® FlowComp™ Mouse CD4/CD8 kit wordt gebruikt voor de positieve

magnetische isolatie van CD4+/ CD8+ T-‐cellen uit lymfoïde organen. Ongeveer 30-‐35 % van de miltcellen bij de muis zijn T-‐cellen, waarvan 70 % het CD4 antigen tot expressie brengen. De overige 30 % zijn CD8 positieve T-‐cellen. Dynabeads hebben een magnetische kern en bestaan uit polystyreen, gecoat met gemodifieerd streptavidine. Een celsuspensie van 5x107 cellen is vereist voor het protocol. Eerst wordt het DBS-‐X gebiotinyleerd FlowComp CD4 of CD8 antilichaam toegevoegd aan de celsupensie, dat zal binden aan de targetcellen. (Zie figuur 3.6, Stap 1). Na de incubatiestap worden de niet-‐gebonden antilichamen weggewassen en worden vervolgens de Dynabeads toegevoegd. Met behulp van een magneet worden de bead-‐gebonden targetcellen gescheiden van de andere cellen, waarna het supernatans verwijderd wordt (supernatans wordt bewaard voor verder gebruik) (stap 2). In de derde en laatste stap, worden de cellen losgekoppeld van de dynabeads met behulp van releasebuffer (stap 3). Deze buffer zal de biotine-‐streptavidine associatie tussen het antilichaam en de dynabeads verbreken. Het resultaat is een geïsoleerde bead-‐vrije celsuspensie met een zuiverheidsgraad van ± 85%. Stap 1

Stap 2

Stap 3



Resultaat

Figuur 3.6: Positieve magnetische isolatie van CD4+/CD8+ T-‐cellen. 3.10 FLOW CYTOMETER 3.10.1 Materialen en gebruikte oplossingen

-‐

Mouse BD Fc BlockTM (BD biosciences, San Jose, USA)

-‐

PerCP anti-‐mouse CD8a -‐ CD4 -‐ F4/80 (BioLegend, San Diego, USA)

-‐

Cell Staining buffer (BioLegend, San Diego, USA)

26

3.10.2 Principe / Protocol De zuivering uitgevoerd in 3.9.2 wordt gecontroleerd met behulp van flow cytometrie. De gebruikte antilichamen zijn geconjugeerd met een fluorescente probe: Peridinin-‐ chlorophyll-‐protein complex (PerCP). Acht eppendorfjes worden gevuld met 106 cellen (zoals geïllustreerd in tabel 3.2, kolom 1) en afgecentrifugeerd (5 min bij 350 xg), waarna het supernatans wordt verwijderd. Vervolgens worden de pellets gehersuspendeerd in 100 µl staining buffer. De Fc-‐receptoren worden geblokkeerd met behulp van mouse BD Fc BlockTM. Fc-‐receptoren komen voor op het oppervlak van B-‐lymfocyten, NK-‐cellen, macrofagen, neutrofielen en mastcellen. Deze receptoren kunnen de antilichamen aspecifiek gaan binden. Na een incubatiestap (5 min bij 4°C) wordt in elk eppendorfje 5 µl antilichaam toegevoegd zoals geïllustreerd in tabel 3.2. Na 20 min incuberen in het donker, worden de niet-‐gebonden antilichamen weggewassen door het toevoegen van 2 ml staining buffer en wordt de oplossing afgecentrifugeerd (5 min bij 350 xg). De wasstap wordt nog een tweede keer herhaald, waarna het pellet wordt gehersuspendeerd in 500 µl staining buffer. De flow cytometer wordt eerst voorgespoeld met gedestilleerd en gefilterd water, waarna de celsuspensie wordt geïnjecteerd. De flow cytometer wordt zo ingesteld dat de meting stopt na de analyse van 100.000 cellen. Tabel 3.2: Eppendorfjes gevuld met cellen en antilichaam.

Celtype

antilichaam

1.

Niet-‐gemerkte cellen

/

2.

Negatieve controle

PerCP F4/80

3.

Cellen voor de zuivering

PerCP CD4

4.

Cellen voor de zuivering

PerCP CD8a

5.

CD4 cellen

PerCP CD4

6.

CD4 cellen

PerCP CD8a

7.

CD8 cellen

PerCP CD8a

8.

CD8 cellen

PerCP CD4

27

3.11 ELISPOT 3.11.1 Materialen en gebruikte oplossingen

-‐

ELISPOT reader : Bioreader 5000 (BIO-‐SYS GmbH, Karben, Duitsland)

-‐

Blockingbuffer : 0,4 g BSA (Sigma, St. Louis, USA) oplossen in 40 ml steriele PBS

-‐

Coating antilichamen : LEAFTM Purified anti-‐mouse X (BioLegend, San Diego, USA)  X = IL-‐2 of IL-‐4 of IL-‐5 of IFN γ

-‐

Gebiotinyleerde detectie antilichamen : Biotin anti-‐mouse X (BioLegend, San Diego, USA)

-‐

GABA-‐gelabeld anti-‐biotine antilichamen (U-‐CyTech, Utrecht, Nederland)

-‐

Activatoren (U-‐CyTech, Utrecht, Nederland)

-‐

Concanavalin A Bioreagent (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)

-‐

PBS met 0,1 % TWEEN 20 (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)

3.11.2 Principe

De ELISPOT (Enzyme-‐linked ImmunoSPOT) assay wordt gebruikt voor de detectie van cytokines, geproduceerd door geactiveerde T-‐cellen. Deze assay is gebaseerd op het principe van ELISA (Enzyme-‐linked immunosorbent assay). De ELISPOT assay meet de cytokine vrijstelling van individuele cellen terwijl bij ELISA de totale hoeveelheid wordt gemeten, vrijgesteld door alle cellen in de well. De CD4+ of CD8+ T-‐cellen worden samen met de geschikte antigenen geïncubeerd. Als gevolg van de stimulus, worden de cytokinen vrijgesteld. De 96-‐well plaat wordt vooraf gecoat met een monoclonaal antlichaam dat het cytokine van interesse zal binden. Vervolgens worden de cellen weggewassen (Letsch & Scheibenbogen, 2003). Gebieden waar de cytokines gebonden zijn op het antilichaam, worden gevisualiseerd met behulp van een gebiotinyleerd anti-‐cytokine antilichaam in combinatie met een GABA-‐gelabeld anti-‐biotine antilichaam.

Figuur 3.7 : Principe van de ELISPOT met Silver staining procedure. 28

Als laatste wordt een reagens toegevoegd dat zorgt voor een zilverkleurige neerslag op de GABA moleculen, zodat de cytokine secretie zichtbaar wordt (Instruction Manual ELISPOT kit, U-‐CyTech biosciences). Het eindresultaat zijn zwarte spots, waarbij elke spot een cytokine-‐secreterende cel voorstelt. Het aantal spots geeft een schatting van het aantal antigen-‐specifieke T-‐cellen (Cox et al., 2006). 3.11.3 Protocol

64 wells worden gevuld met 100 µl coating antilichaam. Deze plaat wordt overnacht

geïncubeerd bij 4°C. De volgende dag wordt de vloeistof verwijderd door stevig uitschudden. Vervolgens wordt de plaat 3x gewassen met 200 µl steriele PBS per well. Om niet-‐specifieke binding op de bodem van de plaat te reduceren, wordt 200 µl blocking buffer in iedere well gepipetteerd. De plaat wordt gedurende 1 uur bij 37°C geplaatst. Tijdens dit uur, kan gestart worden met de voorbereiding van de cellen. In totaal zijn er 6 platen: 4 platen worden gevuld met CD4+ T-‐cellen en 2 met CD8+ T-‐cellen. Telkens wordt de secretie van een ander cytokine getest. De cellen worden eerst verdund met medium tot een concentratie van 3x106 cellen per ml. De stimulantia, die aan de cellen worden toegevoegd, zijn de gezuiverde proteïnen bekomen na dialyse. Aan iedere well wordt een verschillend proteïne toegevoegd zoals geïllustreerd in figuur 3.8. De GST-‐tag wordt eveneens getest, net zoals het volledige E-‐ proteïne, een positieve en een negatieve controle. K19 en K27 bestaan uit dezelfde aminozuursequenties als GST-‐IC19 en GST-‐IC27 maar zijn extra gezuiverd via gelfiltratie en worden alsook getest. 31 tubes worden gevuld met 1 ml cellen en de gezuiverde proteïnen. Afhankelijk van de gemeten concentratie, wordt berekend hoeveel µl proteïne noodzakelijk is om de cellen te stimuleren. De tubes worden daarna goed gevortexd en van elke tube wordt 100 µl aangebracht per well. Iedere proteïne wordt in tweevoud getest om de reproduceerbaarheid na te gaan. De plaat wordt afgedekt en overnacht geïncubeerd bij 37°C. De voorafgaande stappen worden uitgevoerd in de laminaire flow. Bij de volgende stappen, is dit geen vereiste meer. De volgende dag worden de cellen verwijderd door stevig schudden. De plaat wordt vervolgens 2 keer gewassen met niet-‐steriele PBS (200 µl per well) en 4 keer ondergedompeld in een bad met PBS/TWEEN. TWEEN zorgt ervoor dat de cellen stuk gaan. Na de wasstap wordt aan elke well 100 µl verdund gebiotinyleerd detectie antilichaam toegevoegd. De plaat wordt nadien gedurende 1 uur bij 37°C geplaatst en afgedekt met 29

plastiekfolie om uitdroging te voorkomen. Terug wordt de vloeistof verwijderd door stevig uitschudden en 4 maal wordt de plaat gewassen met PBS/TWEEN. Voor de detectie van het secundaire antilichaam, wordt 50 µl GABA gelabeld anti-‐biotine antilichaam toegevoegd per well. De plaat moet terug 1 uur incuberen bij 37°C en wordt afgedekt met plastiekfolie. Na 1 uur wordt de overmaat aan vloeistof verwijderd en wordt de plaat 4 keer gewassen met PBS/TWEEN. Vervolgens wordt de activator-‐oplossing bereid (50% activator I, 50% activator II) en hiervan wordt 35 µl gepipetteerd in iedere well. Dit moet een halfuur incuberen in het donker. De reactie zal nadien worden stopgezet door de plaat onder te dompelen in een bad met gedemineraliseerd water. De plaat wordt gedroogd en indien er spots gevormd zijn, kunnen deze worden bekeken onder de microscoop of geteld met behulp van de ELISPOT reader.

Figuur 3.8: De ELISPOT plaat. 3.12 ELISA 3.12.1 Materialen en gebruikte oplossingen

-‐

ELISA schudder : Schüttler MTS 2 (IKA, Staufen, Duitsland)

-‐

Buffer : 1,6 ml Na2CO3 + 3,4 ml NaHCO3 + 5 ml dH2O

-‐

Blocking buffer : 1,5 g melkpoeder (Regilait, St. Martin Belle Roche, Frankrijk) wordt opgelost in 50 ml PBS

30

-‐

PBS/TWEEN 20 (0,1%) (Sigma-‐Aldrich, St.Louis, USA)

-‐

Goat Anti-‐Mouse IgG1, Human ads-‐HRP (SouthernBiotech, Birmingham, USA)

-‐

Goat Anti-‐Mouse IgG2a, Human ads-‐HRP (SouthernBiotech, Birmingham, USA)

-‐

TMB Substrate Reagent Set (BD Biosciences)

3.12.2 Principe

Elisa detecteert de aanwezigheid van antilichamen in het serum van de gevaccineerde

muizen. Het antigen waarnaar men test, wordt geïmmobiliseerd op de bodem van de ELISA plaat, waarna het primaire antilichaam wordt toegevoegd. Het secundaire antilichaam is geconjugeerd met een enzyme (enzym-‐linked) en wordt eveneens toegevoegd. Dit enzyme zorgt voor een kleurreactie wanneer het in contact komt met zijn substraat. Enkel op plaatsen waar het antilichaam bindt op het antigen, zal een kleurverandering optreden. 3.12.3 Protocol

Tien ml buffer wordt aangemaakt en vermengd met 25 µl E-‐proteïne (antigen). In iedere

well wordt 100 µl gepipetteerd en vervolgens wordt de plaat overnacht geïncubeerd. De volgende dag wordt de vloeistof verwijderd door stevig uitschudden en wordt de plaat 3 x ondergedompeld in een bad gevuld met PBS/TWEEN. 200 µl blocking buffer wordt nadien toegevoegd in iedere well waarna de plaat 1 uur op een schudtoestel wordt geplaatst. Aan de blocking buffer wordt 0,1 % TWEEN toegevoegd en hiervan wordt 330 µl in de eerste rij van een tweede plaat gepipetteerd. De bloedstalen van de 4 gevaccineerde muizen werden vooraf 2 maal gecentrifugeerd gedurende 5 minuten aan 13000 tpm en vervolgens werd het serum ingevroren bij -‐20°C. Na het ontdooien,

wordt

het

serum

stevig

gevortexd. In de eerste rij wordt 3,3 µl per well gepipetteerd, dus het serum wordt 1/100 verdund. Om na te gaan of de ELISA correct is uitgevoerd, wordt er ook een positieve

en

een

negatieve

controle

toegevoegd. De positieve controle wordt 1/300 verdund. In de overige 7 rijen wordt 210 µl blockingbuffer/TWEEN toegevoegd. Figuur 3.9: De enzym-‐substraat reactie 31

Daarna wordt de verdunningsreeks aangemaakt. Er wordt 105 µl van rij 1 toegevoegd aan rij 2 dus we verdunnen telkens 1/3 (zie figuur 3.7). Na 1 uur wordt de blocking buffer verwijderd van plaat 1 en wordt 100 µl uit iedere well van plaat 2 toegevoegd aan plaat 1. Deze plaat wordt 1,5 uur geschud bij kamertemperatuur. Na de incubatiestap wordt de overmaat aan vloeistof opnieuw verwijderd en wordt de plaat gewassen met PBS/TWEEN. Vervolgens worden de secundaire antilichamen verdund in blockingbuffer met 0,1% TWEEN. Goat Anti-‐Mouse IgG1 wordt 1/6000 verdund en hiervan wordt 100 µl gepipetteerd in de linkse helft van de plaat. Goat Anti-‐Mouse IgG2a wordt eveneens verdund maar nu 1/7000 en 100 µl antilichaam wordt gepipetteerd in de rechtse helft van de plaat (zie figuur 3.10). Na 1,5 uur wordt het substraat toegevoegd. Het substraat reagens bestaat uit 2 oplossingen. Substraat reagens A bevat H202 en het reagens B bevat tetramethylbenzidine (TMB). TMB wordt geoxideerd door het Horse raddish peroxidase (HRP) in aanwezigheid van H2O2. Deze oxidatiereactie resulteert in een blauwe kleur. De reactie wordt na 10 min stopgezet door het toevoegen van H3PO4, wat zorgt voor een kleurverandering van blauw naar geel. De analyse van de plaat gebeurt met een ELISA reader door middel van een spectrofotometrische bepaling. De OD waardes van iedere well worden weergegeven. Verdunnings-‐ reeks: Rij B :1/300 Rij C :1/900 Rij D:1/2700 Rij E :1/8100 Rij F :1/24300 Rij G :1/72900 Rij H :1/218700 Figuur 3.10: De ELISA plaat: Goat Anti-‐Mouse IgG1/ Goat Anti-‐Mouse IgG2a 32

3.13 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 3.13.1 Materialen en gebruikte oplossingen

-‐

PCR toestel : T3 thermocycler (Biometra, Goettingen, Duitsland)

-‐

5 µl buffer (10x) (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)

-‐

1 µl dNTP  ATP, GTP, CTP, TTP (5 Prime, Hamburg, Duitsland)

-‐

1 µl E-‐DIIIF (forward primer) (Integraded DNA technologies, Coralville, USA)

-‐

1 µl E-‐DIIIR (reverse primer) (Integraded DNA technologies, Coralville, USA)

-‐

1 µl E-‐proteïne plasmide (2 verschillende bereidingen)

-‐

40 µl Water, Mol Bio grade, Dnase-‐, Rnase -‐ en Proteasevrij (5 Prime, Hamburg, Duitsland)

-‐

1 µl JumpStart Taq DNA polymerase (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)


PCR is een techniek die gebruikt wordt voor het vermenigvuldigen van DNA sequenties.

De methode omvat 20-‐40 thermische cycli, waarbij iedere cyclus bestaat uit 3 temperatuursveranderingen. De samenstelling van de PCR mix wordt weergegeven in bijlage 2. Tijdens de initiatiestap wordt de temperatuur opgedreven tot 95°C gedurende enkele minuten. Deze stap is nodig voor de activatie van het DNA polymerase. Daarna start de effectieve cyclus met de denaturatie van de DNA template, eveneens bij 95°C. De temperatuur wordt vervolgens verlaagd tot 50 à 60 °C gedurende 30 seconden. Dit is de annealing stap, die de hybridisatie toelaat van de primers met het enkelstrengig DNA. Bij de derde stap van de cylcus, wordt de temperatuur terug opgedreven tot 72°C, waarbij het Taq polymerase zijn optimale activiteit bereikt. Tijdens deze elongatiestap zal het DNA polymerase een nieuwe streng synthetiseren complementair aan de DNA template, te beginnen vanaf de primers. Na de laatste cyclus, blijft de temperatuur van 72°C nog 5 min behouden zodat zeker al het overgebleven enkelstrengig DNA, dubbelstrengig wordt.

33

3.14 GELELEKTROFORESE 3.14.1 Materialen en gebruikte oplossingen

-‐

0,8 % agarose gel : 3,2 g agarose (MdBio, Rockville, USA) in 400 ml TBE buffer

-‐

TBE buffer : 0.045M Tris-‐Boraat (TRIS (Gentaur, Kampenhout, België) + Boorzuur (VWR, Radnor, USA)) + 0.001M EDTA (VWR, Radnor, USA)

-‐

Ethidiumbromide : 0,1ml/l agarose gel (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)

-‐

Ladingsbuffer : 0,25% bromofenol blauw, 30% glycerol in water

-‐

1 Kb DNA plus ladder (Invitrogen, Carlsbad, USA)

-‐

PCR product (zie 3.13)


Aangezien agarose slecht oplosbaar is in TBE-‐buffer, wordt de gel eerst opgewarmd in de

microgolfoven tot alles is opgelost. Ondertussen wordt het gelbakje met een kammetje erin, afgeplakt met tape waarna de agarose gel in het bakje wordt gegoten. Na 30 min is de gel gestold en wordt het kammetje verwijderd. Het gelbakje wordt in het elektroforesetoestel geplaatst en volledig ondergedompeld in TBE-‐buffer. Eerst wordt 10 µl Kb-‐Plus ladder in het eerste laantje gepipetteerd. Aan het PCR-‐product met het DNA van het plasmide, wordt 5 µl ladingsbuffer toegevoegd. Hiervan wordt 10 µl geladen op de gel. Zodra alle stalen geladen zijn, wordt de stroombron aangeschakeld gedurende 40 min bij 120 mV. Door de negatieve lading van de fosfaatgroepen migreert het DNA naar de kathode. Ethidiumbromide wordt toegevoegd aan de gel voor de visualisatie van de DNA fragmenten. De vlakke structuur (zie figuur 3.11) van ethidiumbromide schuift tussen de basenparen en absorbeert UV-‐licht. Wanneer de gel onder een UV-‐lamp wordt geplaatst, zijn de nucleïnezuren duidelijk zichtbaar. Figuur 3.11: Structuur Ethidiumbromide. 34

4 4.1

RESULTATEN EXPRESSIE FUSIEPROTEÏNEN Bij de analyse van de polyacrylamidegels, werd nagegaan of de 26 bacteriestammen de

fusieproteïnen wel degelijk tot expressie brengen. De fusieproteïnen hebben een grootte van ± 25 kD en moeten tot expressie komen ter hoogte van de zevende band van de merker. Op figuur 4.1 is duidelijk te zien dat het fusieproteïne van bacteriestam 21 tot expressie is gekomen. Alle bacteriestammen hebben hun fusieproteïne tot expressie gebracht maar sommige zwakker dan andere stammen. Ter illustratie kwam het fusieproteïne van bacteriestam 17 zwak tot expressie (zie figuur 4.2), alsook de fusieproteïnen 15, 22, 25, 33, 34, 39 en 40.

Figuur 4.1: polyacrylamidegel van GST-‐IC21: laan 1 = Lysaat, laan 2 = Flow Through, Laan 3 = merker (cirkel duidt plaats aan waar fusieproteïnen tot expressie komen), Laan 4 = Wash, laan 5-‐10: Elutiefracties 1-‐6.

Figuur 4.2: Polyacrylamidegel van GST-‐IC17: laan 1 = Lysaat, laan 2 = merker, laan 3 = Flow Through, Laan 4 = Wash, Laan 5 = E1, Laan 6 = E2, Elutiefracties 3-‐6 zijn onduidelijk  zwakke expressie . 35

4.2

BEPALING CONCENTRATIE FUSIEPROTEINEN Zes elutiefracties (6 x 500 µl) werden gecollecteerd na de opzuivering van de gluthation

S-‐transferase gemerkte proteïnen. De elutiefractie met de hoogste opbrengst aan recombinant eiwit van elke opzuivering werd geselecteerd, waarna deze gedialyseerd werden. Na dialyse werd de concentratie bepaald met behulp van de nanodrop. Slecht 1 µl van iedere elutiefractie was nodig voor de analyse. De fusieproteïnen werden gebruikt in de ELISPOT als stimulus voor de cytokineproductie. Twee µg stimulus per well was nodig voor de stimulatie van de T-‐cellen. Met deze gegevens kon berekend worden hoeveel µl nodig was. Hoe kleiner de concentratie, hoe groter het volume nodig voor de stimulatie. Het berekende volume werd vervolgens toegevoegd aan de geïsoleerde CD4+ of CD8+ T-‐cellen, waarna het mengsel op de ELISPOT plaat werd gebracht. Tabel 4.1: Bepaling volume nodig voor ELISPOT. Nummer staal Elutiefractie Concentratie (mg/ml) 15 2 0,07 16 2 1,03 17 2 0,2 18 3 0,05 19 3 0,25 20 2 0,84 21 2 0,56 22 2 0,11 23 2 0,09 24 2 0,89 25 3 0,03 26 2 0,07 27 2 3,45 28 2 0,2 29 2 0,14 30 2 0,34 31 1 0,45 32 2 0,37 33 1 0,03 34 3 0,11 35 2 0,15 36 2 0,37 37 1 0,24 38 2 0,33 39 2 0,08 40 2 0,1

36

μl 28,57 1,94 10,00 40,00 8,00 2,38 3,57 18,18 22,22 2,25 66,67 28,57 0,58 10,00 14,29 5,88 4,44 5,41 66,67 18,18 13,33 5,41 8,33 6,06 25,00 20,00

4.3

CONTROLE ZUIVERING CD8/CD4 T-‐CELLEN Voor de magnetische isolatie van CD4+/CD8+ T-‐cellen uit miltcellen werd de Dynabeads

FlowComp CD4/CD8 kit gebruikt. Deze opzuivering werd gecontroleerd met behulp van de flow cytometer. Als eerste werd een staal met niet-‐gezuiverde en niet-‐gemerkte cellen geanalyseerd. Hierdoor kunnen we enerzijds de leefbaarheid van de cellen controleren alsook de autofluorescentie van de miltcellen analyseren. In ons staal waren geen autofluorescerende cellen aanwezig aangezien er maar 1 piek werd waargenomen (zie figuur 4.3). Aan een tweede staal niet-‐gezuiverde cellen werd PerCP anti-‐mouse F4/80 toegevoegd. F4/80 is een glycoproteïne en komt tot expressie op de meerderheid van de weefsel macrofagen maar niet op de macrofagen afkomstig uit de milt. Dit staal werd gebruikt als negatieve controle. De Fc-‐receptoren werden geblokkeerd om aspecifieke binding te verhinderen. Aangezien er geen F4/80 glycoproteïnen aanwezig waren in het staal en de Fc-‐ receptoren geblokkeerd waren, kon het toegevoegde antilichaam strikt gezien niet binden. Er werd effectief maar 1 piek gezien, die perfect overlapte met de piek van de niet-‐gemerkte cellen (zie figuur 4.3), dus er was geen aspecifieke binding aan de cellen.

Figuur 4.3: Overlap negatieve controle met niet-‐gemerkte cellen Ter controle van de opzuivering van de CD4+ T-‐cellen werden 3 stalen geanalyseerd. Eerst werden de niet-‐gezuiverde cellen geïncubeerd met PerCP anti-‐mouse CD4 waarna de gezuiverde CD4+ cellen eveneens werden geïncubeerd met datzelfde antilichaam. De eerste piek bevat de cellen die het CD4 antigen niet tot expressie brengen; B-‐cellen, macrofagen, CD8+ cellen enzovoort. De tweede piek bevat de CD4+ T-‐cellen, die het antilichaam zullen binden. Bij de overlap van de 2 curves (zie figuur 4.4 links) is duidelijk te zien dat de CD4+ T-‐ cellen zijn aangerijkt tijdens de opzuivering. Een derde staal CD4+ T-‐cellen werd geïncubeerd met PerCP-‐anti-‐mouse CD8a. Zo werd gecontroleerd of er nog CD8+ T-‐cellen aanwezig waren 37

in het CD4+ staal. De tweede piek van de rode curve (zie figuur 4.4 rechts), die de CD8+ T-‐ cellen bevat, is klein in vergelijking met de tweede piek van de zwarte curve, die de CD4+ T-‐ cellen bevat. De CD8+ T-‐cellen waren dus niet volledig verwijderd uit het staal maar ze waren slechts minimaal aanwezig.

Figuur 4.4 links: overlap CD4 na zuivering met CD4 voor zuivering Figuur 4.4 rechts: overlap CD4 staining met CD8 met CD4 staining met CD4 De opzuivering van de CD8+ T-‐cellen werd eveneens gecontroleerd aan de hand van 3 stalen. Het eerste staal niet-‐gezuiverde cellen werd geincubeerd met PerCP anti-‐mouse CD8a, net zoals het tweede staal gezuiverde CD8+ T-‐cellen. De eerste piek toont de miltcellen die CD8-‐ zijn terwijl de tweede piek de cellen bevat die CD8+ zijn. De overlap van deze 2 curves (zie figuur 4.5 links) toont aan de CD8+ cellen duidelijk zijn aangerijkt tijdens de opzuivering. Als laatste controle, werden de CD4+ cellen gevisualiseerd, die aanwezig waren in het CD8+ staal. Op figuur 4.5 rechts is een tweede piekje van de rode curve duidelijk zichtbaar. Dit wil zeggen dat de CD4+ cellen niet volledig zijn werwijderd uit het CD8+ staal.

Figuur 4.5 links: overlap CD8 na zuivering met CD8 voor zuivering Figuur 4.5 rechts: overlap CD8 staining met CD4 met CD8 staining met CD8 38

4.4

ELISPOT

Figuur 4.6: ELISPOT plaat CD8 + T-‐cellen getest op IL-‐2 vrijstelling. Voor het meten van de cellulaire immuunrespons gericht tegen het DNA vaccin, maakte men gebruik van de ELISPOT assay. Er werd specifiek getest welk fusieproteïne de beste stimulatie gaf. Eerst werden 3 naïeve muizen getest om te zien of er geen aspecifieke immuunrespons was. De IFN-‐γ en IL-‐4 vrijstelling werd gemeten na stimulatie van de miltcellen door de fusieproteïnen. De ELISPOT procedure nam 2 dagen in beslag waarna het aantal spots werd geteld met behulp van de ELISPOT reader. Het gemiddeld aantal spots per well kan worden afgelezen in tabel 4.2. Het aantal spots varieerde van 0 tot maximum 2. De positieve controle, Concanavalin A, telde gemiddeld 176 spots. Uit deze resultaten kon besloten worden dat de naïeve muizen niet reageerden op de stimulatie door de fusieproteïnen. Er moest dus geen rekening gehouden worden met aspecifieke reacties. Vier BALBc muizen werden 2 maal geïnjecteerd met het pDNA vaccin dat het WNV-‐E gen tot expressie brengt. De miltcellen van de gevaccineerde muizen werden gecollecteerd en gestimuleerd met de fusieproteïnen. Als gevolg van de stimulatie werden cytokinen vrijgesteld. De CD8+ T-‐cellen werden getest op de vrijstelling van IL-‐2 en IFN-‐γ. De vrijstelling van IL-‐4 en IL-‐5 werd bijkomend getest bij de CD4+ T-‐cellen. Analoog als bij de naïeve muizen, werden de spots geteld met behulp van de ELISPOT reader. De 96-‐well plaat gevuld met de CD8+ T-‐cellen vertoonde enkele zwakke responsen. De vrijstelling van IFN-‐γ was in het algemeen het grootst. De well van fusieproteïne 37 telde 16 spots en gaf dus de meeste stimulatie. Ook fusieproteïnen 17, 21, 28, 29 en 31 gaven aanleiding tot stimulatie van de CD8+ T-‐cellen, maar iets zwakker. De IL-‐2 secretie was zwakker in vergelijking met deze van IFN-‐γ. Zeven spots werden geteld bij fusieproteïne 17, wat de grootste respons was bij de 39

CD8 plaat getest op IL-‐2 secretie. De positieve controle telde gemiddeld 117 spots. De twee wells gevuld met de positieve controle zijn dan ook duidelijk te zien op de ELISPOT plaat omwille van het groot aantal spots (zie figuur 4.6). De plaat gevuld met CD4+ T-‐cellen vertoonde een zeer zwakke IL-‐4 en IL-‐5 stimulatie. Analoog als bij de CD8+ T-‐cellen, was de secretie van IFN-‐γ het grootst. De meeste stimulatie was afkomstig van het fusieproteïne 29 maar er was ook enige respons op de fusieproteïnen 15, 17 en 19. De vrijstelling van IL-‐2 was groter dan deze van IL-‐4 en IL-‐5, maar zwakker dan de IFN-‐γ vrijstelling. In het algemeen leidde fusieproteïne 29 tot de meeste stimulatie. Er was zowel een CD8 als een CD4 respons op dit fusieproteïne. Tabel 4.2: Gemiddeld aantal spots/well van de ELISPOT Naiëf GST-‐IC15 GST-‐IC16 GST-‐IC17 GST-‐IC18 GST-‐IC19 GST-‐IC20 GST-‐IC21 GST-‐IC22 GST-‐IC23 GST-‐IC24 GST-‐IC25 GST-‐IC26 GST-‐IC27 GST-‐IC28 GST-‐IC29 GST-‐IC30 GST-‐IC31 GST-‐IC32 GST-‐IC33 GST-‐IC34 GST-‐IC35 GST-‐IC36 GST-‐IC37 GST-‐IC38 GST-‐IC39 GST-‐IC40 GST / conA

IFN-‐γ

IL-‐4 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 172

1 0 1 0 0 1 1 2 1 0 1 2 0 2 1 0 1 0 1 2 0 1 1 0 0 0 2 / 179

CD8 GST-‐IC15 GST-‐IC16 GST-‐IC17 GST-‐IC18 GST-‐IC19 GST-‐IC20 GST-‐IC21 GST-‐IC22 GST-‐IC23 GST-‐IC24 GST-‐IC25 GST-‐IC26 GST-‐IC27 GST-‐IC28 GST-‐IC29 GST-‐IC30 GST-‐IC31 GST-‐IC32 GST-‐IC33 GST-‐IC34 GST-‐IC35 GST-‐IC36 GST-‐IC37 GST-‐IC38 GST-‐IC39 GST-‐IC40 GST / conA E-‐proteïne K19 K27

IFN-‐γ

IL-‐2 2 2 7 1 2 0 3 1 1 1 1 3 1 2 2 2 5 6 1 1 1 2 1 1 1 2 1 2 102 3 1 4

5 1 5 1 1 1 10 2 4 1 3 4 0 7 12 0 7 4 2 3 1 1 16 3 13 6 1 1 132 3 4 1

40

CD4 GST-‐IC15 GST-‐IC16 GST-‐IC17 GST-‐IC18 GST-‐IC19 GST-‐IC20 GST-‐IC21 GST-‐IC22 GST-‐IC23 GST-‐IC24 GST-‐IC25 GST-‐IC26 GST-‐IC27 GST-‐IC28 GST-‐IC29 GST-‐IC30 GST-‐IC31 GST-‐IC32 GST-‐IC33 GST-‐IC34 GST-‐IC35 GST-‐IC36 GST-‐IC37 GST-‐IC38 GST-‐IC39 GST-‐IC40 GST / conA E-‐proteïne K19 K27

IL-‐2

IL-‐4 3 3 3 2 6 1 3 2 2 1 5 3 4 5 3 2 3 2 2 3 0 1 3 3 3 6 2 2 102 4 1 5

IL-‐5 1 1 0 1 1 2 0 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 2 0 1 1 0 0 1 0 98 1 1 2

INFg 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 18 0 0 0

8 1 11 4 8 1 2 0 2 1 1 5 5 6 12 2 3 5 2 6 2 1 5 1 3 3 2 2 132 3 6 2

4.5

ELISA

4.5.1 ELISA E-‐proteïne De humorale immuunrespons na de immunisatie met het DNA vaccin werd geëvalueerd met behulp van een enzyme-‐linked immunosorbent assay. Het serum van de 4 gevaccineerde muizen werd onderzocht naar de aanwezigheid van WNV-‐specifieke IgG. Het antigen, dat werd gecoat op de bodem van de plaat, was het volledige E-‐proteïne. De optische densiteit bij 450 nm van iedere well werd bepaald met de ELISA reader. Zowel de aanwezigheid van IgG1, als IgG2a in het serum werd nagegaan. De resultaten werden geëvalueerd aan de hand van de eindpunt titer. Dit is de verdunning waarbij de OD waarde 41

2x groter is dan de OD-‐waarde van de negatieve controle (zie figuur 4.7). De gemiddelde IgG2a titer was een beetje hoger dan de IgG1 titer en muis 4 vertoonde algemeen de grootste respons. In muizen is een Th1 respons (IFN-‐γ) gelinkt aan IgG2a productie en een Th2 respons (IL-‐4) aan IgG1. Enkel het serum van muis 1 testte negatief voor het IgG1.

Figuur 4.7: Antilichaam titers Eindpunt titer IgG1: muis 1= negatief, muis 2= 2700, muis 3= 900, muis 4= 24300 Eindpunt titer IgG2a : muis 1= 2700, muis 2 = 24300, muis 3 = 300, muis 4= 8100 4.5.2 ELISA fusieproteïnen

Een bijkomende test werd uitgevoerd om na te gaan welk fusieproteïne het best herkend

werd door de antilichamen. Daarvoor werd de ELISA plaat gecoat met de 26 verschillende fusieproteïnen verdund met PBS in plaats van met het volledige E-‐proteïne (zie 4.5.2). Het secundaire antilichaam bestond uit een mengsel van IgG1 en IgG2a. Opnieuw werd de OD-‐ waarde van iedere well bepaald met de ELISA reader. De resultaten werden weergegeven in een blokdiagram (zie figuur 4.7). Het fusieproteïne GST-‐IC35 gaf veruit de beste stimulatie ten opzichte van de andere fusieproteïnen. Ook de fusieproteïnen 34, 36 en 37 gaven aanleiding tot hoge antilichaam titers. De GST-‐tag werd eveneens getest maar reageerde niet met de antilichamen aangezien de OD-‐waarde ongeveer gelijk was aan deze van de negatieve controle. De meeste reactiviteit wordt waargenomen bij de peptiden 30-‐37 wat overeenkomt met het domein III van het E-‐ proteïne. De zwarte lijn op het blokdiagram stelt een cut-‐off voor bepaald door de reactiviteit met het dragermolecule GST. Alles boven deze cut-‐off is positief. 42

Figuur 4.8: Blokdiagram met in de y-‐as de OD en in de x-‐as de fusieprotëinen. 4.6

DNA VACCIN

Figuur 4.9: het plasmide DNA vaccin.

Aangezien het DNA vaccin faalde in het opwekken van een cellulaire immuunrespons, werd via PCR nagegaan of het plasmide nog steeds de gensequentie coderend voor het E-‐ proteïne (zie figuur 4.9) bevat. Het bekomen PCR-‐product werd op een agarosegel geladen, alsook het volledige plasmide om de kwaliteit van het plasmide te controleren. Voor in vivo toepassingen is het namelijk zeer belangrijk dat het plasmide de supercoiled vorm aanneemt. Deze loopt op een agarosegel steeds lager dan lineair pDNA. Een tweede bereiding van het plasmide werd eveneens op gel geplaatst. Voor gelineariseerd plasmide verwachtten we een band van 4488 basebaren en dus moet de band van het supercoiled 43

pDNA lager liggen dan 4500 baseparen. Deze werden dan ook teruggevonden op de foto van de gel (zie figuur 4.10). De gensequentie van het E-‐proteïne bestaat uit ± 1300 baseparen en werd eveneens teruggevonden op de gel op de verwachte plaats. Aan de hand van deze resultaten kon worden besloten dat het plasmide de gensequentie coderend voor het E-‐ proteïne bevat en van goede kwaliteit was voor gebruik in proefdieren.

Figuur 4.10: Agarosegel; de zwarte cirkel omringt het PCR product (=E-‐proteïne sequentie) van de bereiding waarmee werd gewerkt. De rode cirkel omringt het volledige plasmide.

44

5

DISCUSSIE In deze thesis wordt de immunisatie met een plasmide DNA vaccin, dat codeert voor het

WVN E-‐proteïne, onderzocht. DNA vaccins zijn veelbelovend omwille van de voordelen ten op zichte van de conventionele vaccins, zoals het opwekken van een T-‐cel respons. De publicatie van Anne Schneeweiss et al. gaf de aanleiding voor dit onderzoek. Het DNA vaccin, dat codeert voor het E-‐proteïne, van het West Nile Virus bleek protectief te zijn. 5.1

CELLULAIRE IMMUUNRESPONS De cellulaire immuunrespons werd bepaald met een ELISPOT assay. De CD8 + en de CD4 +

T-‐cellen werden gestimuleerd door 26 verschillende fusieproteïnen die samen het E-‐proteïne vormden. De stimulatie was in het algemeen vrij zwak met uitzondering van enkele fusieproteïnen die een kleine stimulatie gaven. Het fusieproteïne 37 gaf aanleiding tot de grootste CD8 respons. De IL-‐2 secretie door de CD8+ T-‐cellen, werd eveneens getest. IL-‐2 is noodzakelijk voor de groei, proliferatie en differentiatie van T-‐cellen en werd minder gesecreteerd dan IFN-‐γ. De secretie van INF-‐γ is een antivirale T-‐cel functie die resistent is tegen functionele uitputting in de loop van een infectie waarbij voortdurend een grote hoeveelheid viraal antigen aanwezig is, terwijl de IL-‐2 productie wel functioneel uitgeput raakt onder deze omstandigheden. In het geval van DNA elektroporatie kan het antigen gedurende een lange periode aanwezig zijn, wat zou kunnen leiden tot uitputting van het aantal antigen-‐specifieke IL-‐2 producerende cellen. De IL-‐4 en IL-‐5 secretie door de CD4+ T-‐ cellen was zeer zwak dus er was weinig of geen Th2-‐respons. Wat onwaarschijnlijk is, aangezien er wel een B-‐cel respons werd gezien. De secretie van INF-‐γ door de CD4+ T-‐cellen was het grootst, wat duidt op een Th1-‐respons. De resultaten konden niet vergeleken worden met de resultaten van het artikel (Schneeweiss et al, 2011), omdat deze anders werden weergegeven. Wij hebben het aantal spots geteld en in het artikel wordt de ‘zwartheid’ van de plaat gedetecteerd, wat waarschijnlijk een overschatting geeft van het resultaat. Aangezien het vaccin faalde in het uitlokken van een cellulaire immuunrespons, wordt er nog een tweede onderzoek gepland. Hierbij zal het DNA vaccin worden geboost met een recombinant proteïne, namelijk het domein III van het E-‐proteïne. In de literatuur wordt hierbij een verhoogde cellulaire respons beschreven maar de reden hiervoor is nog steeds onduidelijk. 45

5.2

HUMORALE IMMUUNRESPONS Het serum van de gevaccineerde muizen werd getest op de aanwezigheid van IgG1 en

IgG2a in een ELISA. Deze neutraliserende antilichamen zijn essentieel voor de controle van WNV infectie in vivo. Eerst werd de respons op het volledige E-‐proteïne getest. Specifieke antilichamen werden gedetecteerd, behalve bij muis 1, die negatief testte voor IgG1. Dit zou te wijten kunnen zijn aan inefficiënte electroporatie waardoor het DNA onvoldoende kon pepetreren in de cel. De andere muizen testten positief voor beide antilichamen. Een humorale immuunrespons volgend op de vaccinatie is dus duidelijk waarneembaar. Om te testen welk fusieproteïne het best herkend werd door de antilichamen werd een tweede ELISA test uitgevoerd met als antigenen de verschillende fusieproteïnen. De meeste reactiviteit werd waargenomen bij de peptiden 30-‐37 wat overeenkomt met het domein III van het fusieproteïne. In de literatuur wordt beschreven dat muizen voornamelijk antilichamen gaan produceren tegen domein III, terwijl de mens eerder gaat reageren met domein II. Dit is niet onverwacht aangezien de species verschillen (Oliphant et al, 2007). De resultaten konden opnieuw niet worden vergeleken met de resultaten beschreven in het artikel. Zowel het soort antigen getest, als de hoeveelheid antigen gecoat op de ELISA plaat was verschillend.

46

6

CONCLUSIE Het plasmide DNA vaccin gericht tegen het West nile virus, werd verondersteld zowel

een humorale als een cellulaire immuunrespons uit te lokken. De cellulaire immuunrepons werd geëvalueerd met behulp van een ELISPOT assay. De CD8+ en CD4+ T-‐cellen werden geïsoleerd uit de miltcellen en vervolgens samengevoegd met de stimulantia (de fusieproteïnen). De secretie van IL-‐2 en INF-‐g door de CD8+ T-‐cellen werd geëvalueerd met behulp van de ELISPOT reader, die de spots/ well telde. Fusieproteïne 37 was de beste stimulans voor de CD8+ T-‐cellen waarbij slechts 16 spots werden geteld. Samenvattend was de cellulaire respons op het DNA vaccin zwak niettegenstaande dat er wel enkele fusieproteïnen een kleine stimulatie gaven. Het vaccin heeft dus gefaald in het uitlokken van een T-‐cel respons. Dit is buiten alle verwachtingen in aangezien een DNA vaccin verondersteld wordt een T-‐cel respons op te wekken. Het DNA werd wel degelijk opgenomen door de cellen aangezien er wel antilichamen werden gevormd. Het vaccin slaagde dus wel in het opwekken van een humorale immuunrespons. De peptiden 30-‐37 gaven aanleiding tot de hoogste antilichaam titers. Deze peptiden komen overeen met het domein III van het E-‐proteïne. 47

7

LITERATUURLIJST

Campbell, G.L., Marfin, A.A., Lanciotti, R.S., Gubler, D.J. (2002). “West Nile virus”, The Lancet infectious diseases 2: 519-‐528. Cevayir, C., Kobiyama, K., Aoshi, T., Takeshita, F., Horii, T., Akira, S., Ishii, K.J. (2011) “Novel strategies to improve DNA vaccine immunogenicity”, Current gene therapy 11: 479-‐484. Chávez, J.H., Pinho dos Reis, V., Silva, J.R., Laure, H.J., Rosa, J.C., Lopes da Fonseca, B.A., Figueiredo, L.T.M. (2013). “Production and diagnostic application of recombinant domain II of West Nile envelope protein in Brazil”, Revista da sociedada brasileira de medicina tropical 46 (1): 97-‐99. Cox, J.H., Ferrari, G., Janetzki, S. (2006). “Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay”, Methods 38: 274–282. Dauhpin, G., Zientara, S. (2007). “West Nile virus: Recent trends in diagnosis and vaccine development”, Vaccine 25 (30): 5563-‐5576. De Filette, M., Ulbert, S., Diamond, M.S, Sanders, N.N. (2012). “Recent progress in West Nile virus diagnosis and vaccination”, Veterinary research 43 (16): 1-‐16. Dong, C., Martinez, G.J. (2010). “T cells: the usual subsets”, Nature reviews immunology, poster. Dunham, S.P. (2002). “The application of nucleid acid vaccines in veterinary medicine”, Research in veterinary schience 73: 9-‐16. Gil, M. (1998). “Plasmid DNA: a new era in vaccinology”, Biochemical pharmacology 55: 1151-‐1153.

48

Goyal, R., Tripathi, S.K., Tyagi, S., Sharma, A., Ram,K.R, Chowdhuri, D.K., Shukla, Y., Kumar, P., Gupta, K.C. (2012). “Linear PEI nanoparticles: efficient pDNA/siRNA carriers in vitro and in vivo”, Nanomedicine 8 (2): 167-‐175. Griffiths, A.J.F., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C., Gelbart, W.M. (2000). Transcription: an overview of gene regulation in eukaryotes. Geraadpleegd op 28 maart 2013 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21780/. Hubálek, Z., Halouzka, J. (1999). “West nile fever – a reemerging mosquito-‐borne viral disease in Europe”, Emerging infectious diseases 5 (5): 643-‐650. Invitrogen product guide Instruction Manual ELISPOT kit : U-‐CyTech biosciences Karmali, P.P., Chaudhuri, A. (2007). “Cationic liposomes as non-‐viral carriers of gene medicines: resolved issues, open questions, and future promises” Med Res Rev. 27 (5): 696-‐ 722. Kutzler, M.A., Weiner, D.B. (2008). “DNA vaccines: ready for prime time”, October 9: 776-‐ 788. Letsch, A., Scheibenbogen, C. (2003). “Quantification and characterization of specific T-‐cells by antigen-‐specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining”, Methods 31:143–149. Mayer, G. (2013) “Immunology – chapter one – Innate (non-‐specific) immunity”, verkregen op 28 maart 2013 van http://www.microbiologybook.org/ghaffar/innate.htm. Min-‐0o, G., Kamimura, Y., Hendricks, D.W., Nabekura, T., Lanier, L.L. (2013). “Natural killer cells: walking three paths down memory lane”, Trends in immunology 1-‐8. Moser, M., Oberdan, L. (2010). “Key concepts in immunology”, Vaccine 28: C2-‐C13. 49

Oliphant, T., Nybakken, G.E., Kyle Austin, S., Xu, Q., Bramson, J., Loeb, M., Throsby, M., Fremont, D.H., Pierson, T., Diamond, M.S. (2007). “Induction of epitope-‐specific neutralizing antibodies against West nile virus”, Journal of virology 81 (21): 11828-‐11839. Rijkers, G.T., Kroese, F.G.M., Kallenberg, C.G.M., Derksen, R.H.W.M. (2009). Immunologie. Houten, Bohn Staflau van Loghum. Rossi, S.L., Ross, T.M., Evans, J.D. (2010). “West Nile virus”, Clin Lab Med 30: 47-‐65. Schneeweiss, A., Chabierski, S., Salomo, M., Delaroque, N., Al-‐Robaiy, S., Grunwald, T., Bürki, K., Liebert, U.G., Ulbert, S. (2011). Vaccine 29: 6352 – 6357. The center for food security and public health. (2009). “West nile virus infection” 1-‐12 Welte, T., Xie, G., Wicker, J.A, Whiteman, M.C., Li, L., Rachamallu, A., Barrett, A., Wang, T. (2011). “Immune response to an attenuated West Nile virus NS4B-‐P38G mutant strain”, Vaccine 29: 4853-‐4861. Zepp, F. (2010). “Principles of vaccine design-‐Lessons from nature”, Vaccine 28: C14-‐C24. Zhang, L., Widera, G., Rabussay, D. (2004). “Enhancement of the effectiveness of elektroporation-‐augmented cutaneous DNA vaccination by a particulate adjuvant”, Biochemistry 63: 369-‐373. 50

BIJLAGE 1: EVENING LECTURES FFW – INTERNALISATION AT HOME Dr. Dirk Van Duppen : Biedt het kiwi model een oplossing voor de financiële problemen van de sociale zekerheid?

De eerste lezing werd gebracht door huisarts Dirk Van Duppen, auteur van ‘De

Cholesteroloorlog’. Het Kiwi-‐model vindt zijn oorsprong bij onze Noorderburen, in Nieuw-‐ Zeeland, en biedt een oplossing voor de hoge kostprijs van medicijnen. Het initiatief ligt bij de overheid, die start met een wetenschappelijke behoefte-‐analyse. Vervolgens worden op basis van objectieve wetenschappelijke criteria en studies (= Evidence-‐based medicine) de beste geneesmiddelen gekozen per klasse, dit door een onafhankelijke commissie. Via een openbare aanbesteding zullen de farmaceutische bedrijven, die deze geneesmiddelen aanbieden, tegen elkaar worden uitgespeeld om een zo laag mogelijke prijs te verkrijgen. Momenteel heeft de arts een grote invloed op de geneesmiddelen die worden verkocht in de apotheek. De artsen worden op hun beurt beïnvloed door de farmaceutische industrie, die de artsen manipuleert om hun product voor te schrijven. Het kiwi-‐model ontkoppelt de arts van de beïnvloeding van de farmaceutische industrie en zal zo de marketingkost drastisch verlagen. Dit geld kan dan worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Ik ben voorstander van dit model nu ik heb gezien dat het in Nederland anders kan, daar zijn pijnstillers tot 25 keer goedkoper. Via het kiwi-‐model kan het geld dat hierdoor wordt uitgespaard, gebruikt worden voor nuttige zaken zoals onderzoek en het creeëren van nieuwe jobs. Dr. Patricia van den Bemt – Hospital Admissions Related to Medication

In de HARM studie worden alle acute hospitalisaties bestudeerd. Vele hospitalisaties zijn

namelijk het gevolg van geneesmiddelengebruik. Geneesmiddelen kunnen schade toebrengen op 2 verschillende manieren; intrinsieke en extrinsieke bijwerkingen. Intrinsieke bijwerkingen of adverse drug reactions (ADR) zijn te wijten aan het geneesmiddel zelf en kunnen niet worden voorkomen. Een voorbeeld is het Softenon-‐drama. Een extrinsieke bijwerking wordt veroorzaakt door verkeerd gebruik van het geneesmiddel, zoals een verkeerde dosis of indicatie. Deze zijn voorspelbaar en vooral te vermijden. De term adverse 51

drug effect omvat de combinatie van de intrinsieke of adverse drug reaction en de extrinsieke of vermijdbare bijwerkingen. Om deze bijwerkingen te bestuderen werd de HARM studie opgezet. Deze prospectieve, multicenter en representatieve studie had als doel de frequentie, risicofactoren en kost van de vermijdbare bijwerkingen te bepalen. De acute opnames werden opgedeeld in HARMs en no-‐HARM’s. De HARMs, die vermijdbaar bleken te zijn, werden aangeduid als de cases. De geplande operaties vormden de controle groep. Het resultaat van de studie was dat 46 % van de HARMs kon voorkomen worden. Er moeten preventieve maatregelen worden genomen om deze vermijdbare bijwerkingen te voorkomen. Ik ben zelf geschrokken van het groot aantal patiënten die schade oplopen door het innemen van medicatie. Een betere samenwerking tussen de arts en apotheker en een goede communicatie tussen arts-‐apotheker en patiënt zou dit probleem moeten reduceren. Vooral oudere en mensen die meerder geneesmiddelen tegelijk innemen moeten beter worden ingelicht over de mogelijke bijwerkingen. Philippe Vanparys – Current alternative methods to animal testing used in pharmaceutical, cosmetic & chemical industry Verschillende in vivo testen zijn reeds vervangen door in vitro testen zoals de huidcorrosie test. Vroeger gebruikte men hiervoor konijnen maar nu zijn er reeds in vitro huidmodellen beschikbaar. Deze zijn van enorm belang maar moeten wel voldoende betrouwbaar zijn. 1959 was het jaar waarin gestart werd met de ontwikkeling van alternatieve testen. De 3 V’s stonden hierin centraal: vervanging, vermindering en verfijning. In 1991 werd ECVAM opgericht; European Centre for the Validation of Alternative Methods. De Europese Unie promoot sterk de ontwikkeling van alternatieve technieken zodat het gebruik van proefdieren geëlimineerd of geminimaliseerd kan worden. Sinds 11 maart is er een totaal verbod op cosmetica die getest wordt op dieren. Cosmetica is immers een luxeproduct en niet levensnoodzakelijk. Mijn persoonlijke visie is dezelfde als die van meneer Vanparys. Er kan geen verbod komen op het gebruik van proefdieren, maar indien er alternatieven zijn, dan moeten deze gebruikt worden. Er zijn nog altijd in vivo testen nodig waarvoor geen alternatief bestaat. Het belangrijkste is nog altijd de veiligheid en de gezondheid van de mens. 52

BIJLAGE 2: PCR (p 33) Tabel 1: PCR programma. Tijd

Temperatuur Aantal

5'00''

95°C

0'30''

95°C

0'30''

52°C

1'00''

72°C

5'00''

72°C

1x

hold

4°C

1x 30x

53

WEST NILE VIRUS VACCINATIE PROJECT T

Recommend Documents