Ontwikkeling van een dopinganalyse voor AICAR aan de hand van GC-C-IRMS

Ontwikkeling van een dopinganalyse voor AICAR aan de hand van GC-C-IRMS

Lisa KONINCKX

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo Begeleider: Michael Polet Vakgroep: Klinische biologie, microbiologie en immunologie

Academiejaar 2013-2014

Ontwikkeling van een dopinganalyse voor AICAR aan de hand van GC-C-IRMS

Lisa KONINCKX

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo Begeleider: Michael Polet Vakgroep: Klinische biologie, microbiologie en immunologie

Academiejaar 2013-2014

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

Handtekening student

Lisa Koninckx

Handtekening promotor

Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo

Voorwoord Tijdens mijn hele periode in Gent en in het bijzonder gedurende het laatste jaar, heb ik heel wat hulp en steun gekregen van een hele groep mensen. Graag zou ik deze mensen willen bedanken. Op de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo bedanken, om mij de mogelijkheid te geven mijn thesis te maken in het DoCoLab. Ik heb mijn thesis kunnen schrijven in een erg boeiende en leerrijke omgeving en daar ben ik erg dankbaar voor. Verder wil ik mijn begeleider Michael Polet bedanken voor alle hulp. Bedankt, om mij alles uit te leggen, mijn masterproef regelmatig te verbeteren en mijn vele vragen te beantwoorden tijdens het voorbije jaar, zowel tijdens het praktische werk als bij het schrijven van mijn masterproef. Zonder deze hulp was ik er zeker niet in geslaagd dit eindresultaat te behalen. Ook zou ik alle medewerkers van het DoCoLab willen bedanken. Aan iedereen heb ik gedurende het voorbije jaar wel eens een vraag gesteld en steeds stonden zij klaar om deze vragen te beantwoorden. Mieke, Otis, Jasper, Stijn en Karel, mijn medestudenten in het DoCoLab wil ik bedanken voor de leuke babbels tussendoor. Zij maakten van mijn aanwezigheid in het DoCoLab een erg aangename tijd. Mijn medestudenten van de Biomedische wil ik bedanken voor alle fijne momenten de voorbije vijf jaar, die mijn studententijd in Gent tot een onvergetelijke tijd gemaakt hebben. Tot slot wil ik mijn ouders, familie en vrienden bedanken voor alle steun en aanmoediging, zowel tijdens dit jaar als de voorgaande jaren. Zonder jullie was dit zeker niet gelukt. In het bijzonder zou ik ook mijn gidsen-vrienden willen bedanken om het mogelijk te maken mijn laatste scoutsjaar nog te combineren met mijn laatste jaar aan de UGent. Het laatste jaar ben ik minder aanwezig kunnen zijn dan de voorgaande jaren en daar was enorm veel begrip voor.

Bedankt allemaal!

Afkortingenlijst AICAR

5-amino-4-imidazolecarboxyamide ribonucleoside

AMPK

Adenosine monofosfaat geactiveerd proteïne kinase

APCI

Atmosferische druk chemische ionisatie

API

Atmosferische druk ionisatie

C

Koolstof

CID

Collision induced dissociation

CIR

Koolstof isotopen ratio

DoCoLab

Doping controle laboratorium

DMF

N-N-dimethylformamide

EA-IRMS

Elemental analyser – isotopen ratio massa spectrometrie

ERC

Endogene referentie component

ESI

Electrospray ionisatie

GC-C-IRMS

Gas chromatografie – isotopen ratio massa spectrometrie

GC-MS

Gas chromatografie – massa spectrometrie

HAc

Azijnzuur

HPLC-FC

Hoge druk vloeistof chromatografie – fractie collectie

IFCC

Internationale Federatie voor Klinische Chemie

IMP

Inosine 5’-monofosfaat

IS

Interne standaard

LC-MS

Vloeistof chromatografie – massa spectrometrie

LC-MS/MS

Vloeistof chromatografie – tandem massa spectrometrie

LLE

Vloeistof vloeistof extractie

MBDMA

1,1,3,3-tetramethoxypropaan

MRM

Multiple reaction monitoring

MSTFA

N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide

MTBSTFA

N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide

m/z

Massa/lading verhouding

OFN

Zuurstofvrije stikstof

PNP

Purine nucleoside fosforylase

QqQ

Triple quadrupool

RSD

Relatieve standaard afwijking

RT

Retentietijd

SD

Standaard afwijking

SIM

Single ion monitoring

SOP

Standard operating procedure

SPE

Vaste fase extractie

SRM

Single reaction monitoring

TC

Target compound

VPDB

Vienna Pee Dee Belemnite

WADA

Wereld Anti-Doping Agentschap

ZMP

5-amino-4 imidazolecarboxyamide-1-β-ribofuranosyl 5’monofosfaat

Inhoudsopgave Samenvatting .................................................................................................................................... 1 Summary .......................................................................................................................................... 2 1.

Inleiding .................................................................................................................................... 3 1.1.

Doping in sport .................................................................................................................. 3

1.2.

Endogene componenten als doping ................................................................................... 3

1.3.

AICAR ............................................................................................................................... 4

1.4.

Vloeistof chromatografie - massa spectrometrie ............................................................... 7

1.4.1.

Vloeistof chromatografie ............................................................................................ 7

1.4.2.

Massaspectrometer ..................................................................................................... 7

1.4.2.1.

Ionenbron: Electrospray ionisatie (ESI) .............................................................. 7

1.4.2.2.

Massa-analysator: Triple quadrupool ................................................................. 8

1.4.3. 1.5.

Isotopen ratio massa spectrometrie .................................................................................. 10

1.6.

Validatie kwantitatieve bepaling van AICAR met LC-MS/MS ...................................... 14

1.6.1.

Lineariteit ................................................................................................................. 15

1.6.2.

Juistheid .................................................................................................................... 15

1.6.3.

Herhaalbaarheid ....................................................................................................... 15

1.6.4.

Reproduceerbaarheid ................................................................................................ 16

1.6.5.

Matrix – effect (ion suppression) ............................................................................. 16

1.7.

Validatie isotopen ratio bepaling van AICAR met GC-C-IRMS .................................... 16

1.7.1.

Precisie ..................................................................................................................... 16

1.7.2.

Lineariteit ................................................................................................................. 17

1.8. 2.

Dilute-and-shoot ....................................................................................................... 10

Probleemstelling .............................................................................................................. 17

Materiaal en methode .............................................................................................................. 18 2.1.

Producten en reagentia ..................................................................................................... 18

2.2.

Instrumenten .................................................................................................................... 18

2.2.1.

LC-MS/MS ............................................................................................................... 18

2.2.2.

HPLC-FC ................................................................................................................. 20

2.2.3.

GC-MS ..................................................................................................................... 21

2.2.4.

GC-C-IRMS ............................................................................................................. 21

2.3.

Urinestalen ....................................................................................................................... 22

2.4.

Kwantitatieve bepaling van AICAR in urine met LC-MS/MS ....................................... 22

2.4.1.

Staalvoorbereiding ................................................................................................... 22

2.4.2.

Validatie ................................................................................................................... 22

2.5.

2.4.2.1.

Lineariteit .......................................................................................................... 22

2.4.2.2.

Juistheid, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................... 22

2.4.2.3.

Matrix-effect (ion suppression)......................................................................... 23

Isotopen ratio bepaling van AICAR in urine met GC-C-IRMS ...................................... 23

2.5.1.

Staalvoorbereiding δ15N – bepaling van AICAR ..................................................... 23

2.5.2.

Staalvoorbereiding δ13C – bepaling van AICAR ..................................................... 26

2.5.3.

Validatie δ13C – bepaling ......................................................................................... 27

2.5.3.1.

Precisie .............................................................................................................. 27

2.5.3.2.

3.

Lineariteit .......................................................................................................... 27

2.5.4.

δ N en δ13C – bepaling van synthetisch AICAR .................................................... 28

2.5.5.

Correctiefactor bepalen aan de hand van androsteron ............................................. 28

15

Resultaten en discussie ........................................................................................................... 30 3.1.

Kwantitatieve bepaling van AICAR in urine met LC-MS/MS ....................................... 30

3.1.1.

3.1.1.1.

Lineariteit .......................................................................................................... 30

3.1.1.2.

Juistheid ............................................................................................................ 31

3.1.1.3.

Herhaalbaarheid ................................................................................................ 32

3.1.1.4.

Reproduceerbaarheid ........................................................................................ 32

3.1.1.5.

Matrix – effect (ion suppression) ...................................................................... 33

3.1.2. 3.2.

Validatie kwantitatieve bepaling AICAR in urine ................................................... 30

Bepaling endogene concentratie AICAR in urine .................................................... 34

Isotopen ratio bepaling van AICAR in urine met GC-C-IRMS ...................................... 38

3.2.1.

Bepalen van δ15N in AICAR .................................................................................... 38

3.2.2.

Bepalen van δ13C in AICAR .................................................................................... 40

3.2.2.1.

Validatie ............................................................................................................ 40

3.2.2.1.1. Precisie ........................................................................................................... 40 3.2.2.1.2. Lineariteit ....................................................................................................... 42 3.2.2.2.

Bepalen van δ13C .............................................................................................. 44

4.

Algemeen besluit .................................................................................................................... 48

5.

Referentielijst .......................................................................................................................... 49

Samenvatting 5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleoside (AICAR) is een endogene component die wordt gevormd als intermediair tijdens de de novo purine synthese. De molecule is een activator van adenosine monofosfaat geactiveerd proteïne kinase (AMPK), waardoor het een gelijkaardig effect als training vertoont bij muizen. Omwille van deze eigenschap is er heel wat aandacht voor deze molecule in de sportwereld als prestatiebevorderend middel. Aangezien AICAR een endogene molecule is, is het moeilijk om misbruik vast te stellen. Deze masterproef heeft als doel het opstellen van een dopinganalyse voor AICAR. Een vloeistof chromatografie tandem massa spectrometrie (LC-MS/MS) methode werd ontwikkeld en gevalideerd om zo kwantitatief de concentraties AICAR in urine te kunnen bepalen. Op basis van een populatie van 888 urinestalen (631 sporters, 257 niet-sporters) werd een referentielimiet opgesteld van 5 µg/mL. Deze grens kan in de toekomst gebruikt worden om verdachte stalen af te zonderen voor gas chromatografie – isotopen ratio massa spectrometrie (GC-C-IRMS). Een GC-C-IRMS methode werd ontwikkeld met een staalvoorbereiding op basis van hoge druk vloeistof chromatografie (HPLC), derivatisatie en gas chromatografie massa spectrometrie (GCMS). De methode gebaseerd op stikstofisotopen leverde niet de verwachtte resultaten op. De δ15N – waarden van endogeen AICAR vertoonden een te grote overlap met de δ15N – waarden van exogeen AICAR, waardoor de methode niet bruikbaar is voor confirmatie van dopingmisbruik. Vervolgens werd de methode aangepast naar een alternatieve methode op basis van koolstofisotopen. Na het toepassen van een correctiefactor berekend via androsteron werden onrealistische δ13C – waarden bekomen. Het bepalen van een correctiefactor via androsteron bleek niet mogelijk te zijn, vermoedelijk wegens een te groot verschil in de structuur van de molecule. Verder werden er meer koolstofatomen geïntroduceerd door het derivatiseren dan er oorspronkelijk in de moleculen aanwezig waren, wat zorgde voor extra variatie bij de bepaling van δ13C – waarden. Ook werd slechts een klein verschil waargenomen tussen de δ13C – waarden van exogeen en endogeen gederivatiseerd AICAR. Voor AICAR werd er een referentielimiet opgesteld van 5 µg/mL, die gebruikt kan worden als drempelwaarde om verdachte stalen door te verwijzen naar GC-C-IRMS. Een GC-C-IRMS methode op basis van stikstofisotopen blijkt niet mogelijk te zijn. Een GC-C-IRMS methode op basis van koolstofisotopen is niet bruikbaar onder zijn huidige vorm. 1

Summary BACKGROUND: 5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleoside (AICAR) is an intermediate of the de novo purine synthesis. AICAR is an activator of adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK). Due to its assumed performance enhancing properties, its use has been prohibited in sports by the World Anti-Doping Agency (WADA). Given that AICAR is an endogenous molecule, it is difficult to establish abuse. A doping analysis for AICAR has been developed and validated. METHODS: Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS/MS) was used for the quantitative determination of AICAR concentrations in 888 urine samples. A gas chromatographycombustion-isotope ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS) method was developed and validated for AICAR either based on nitrogen isotopes and carbon isotopes. RESULTS: The quantitative determination of AICAR concentrations in human urine resulted in a reference limit of 5 µg/mL. Urine samples showing AICAR concentrations above this level need to be confirmed by GC-C-IRMS. The difference between δ15N – values of endogenous and exogenous AICAR was too small for confirmation of AICAR abuse. δ13C – values of endogenous and exogenous AICAR showed too much variation caused by the derivatization. This variability of the result was too large to use the method for doping analysis. CONCLUSIONS: 5 µg/mL seems to be a good reference limit for the selection of AICAR samples that need to be confirmed on GC-C-IRMS. A GC-C-IRMS analysis based on nitrogen isotopes is not possible. A GC-C-IRMS analysis based on carbon isotopes shows too much variation caused by derivatization. This method is not useful in doping analysis under its current form.

2

1. Inleiding 1.1. Doping in sport Binnen het sportmilieu wordt er veel aandacht besteed aan het verbeteren van de sportieve prestaties. Dit kan op verschillende manieren bereikt worden, bijvoorbeeld door trainingen en aangepaste diëten. Sommige sporters wenden zich echter tot verboden substanties. Om het gebruik van doping in sport onder controle te houden werd in 1999 het Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA) opgericht. Het WADA is verantwoordelijk voor verschillende activiteiten, zoals opleidingen, anti-doping campagnes en wetenschappelijk onderzoek. Dit met als doel een dopingvrije sport te bekomen. (1) Elk jaar wordt er door het WADA een lijst met verboden producten opgesteld, ook wel gekend als ‘The Prohibited List’. Deze lijst omvat alle producten die aangeduid worden als dopingproducten. De lijst bestaat uit verschillende categorieën, waarbij onder andere een onderscheid gemaakt wordt tussen producten die enkel verboden zijn in-competitie (bv. cannabinoïden of stimulantia) en producten die altijd verboden zijn, zowel in-competitie als buiten-competitie (bv. anabole steroïden of peptide hormonen). (2) Controle op het gebruik van doping wordt uitgevoerd door geaccrediteerde WADA labo’s. Het Doping Controle Laboratorium (DoCoLab) is één van deze 32 geaccrediteerde labo’s. Naast controle op doping voert het DoCoLab ook heel wat onderzoek naar nieuwe technieken uit. (1)

1.2. Endogene componenten als doping Op de lijst met verboden producten zijn zowel exogene als endogene componenten terug te vinden. Exogene componenten kunnen niet door het menselijke lichaam geproduceerd worden. Een voorbeeld hiervan is stanozolol. Endogene componenten daarentegen kunnen wel door het lichaam geproduceerd worden, hiervan is testosteron een voorbeeld. (2) Wanneer dopingproducten ingenomen worden, zullen deze gemetaboliseerd worden in het menselijke lichaam. Het product en/of zijn metabolieten zullen in de urine teruggevonden kunnen worden. De detectie van een exogene component in urine kan als bewijs gebruikt worden voor

3

dopinggebruik, aangezien de bewuste component onder normale omstandigheden niet kan voorkomen in het lichaam. Voor endogene componenten is dit anders, omdat hun aanwezigheid in urine wel natuurlijk is. Wanneer er referentiewaarden beschikbaar zijn, kunnen deze gebruikt worden om afwijkende stalen (bv. zeer hoge concentraties) aan te duiden als ‘abnormaal’. Eén verhoogde waarde voor een endogene component ten opzichte van een populatiegrens kan echter niet gebruikt worden als sluitend bewijs voor misbruik. Een pathologie zou immers aan de basis kunnen liggen van de verhoogde excretie. Confirmatie van de natuurlijke of synthetische oorsprong van endogene componenten is dan ook nodig. Momenteel wordt gas chromatografie - isotopen ratio massa spectrometrie (GC-C-IRMS) hiervoor gebruikt, met behulp van deze techniek kan de isotopen ratio bepaald worden. De isotopen ratio zal doorgaans verschillend zijn voor exogene dan wel endogene stoffen. (3)

1.3. AICAR 5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleoside kortweg AICAR genoemd, is een endogeen geproduceerde component (figuur 1). (4,5) Naast AICAR is deze component ook gekend onder de naam acadesine. (6) De molecule is opgebouwd uit een aminoimidazole ring en een ribofuranose residue. AICAR wordt gevormd als intermediaire component in de de novo purine synthese. (4) Na productie kan de molecule een fosforylatie ondergaan door adenosine kinase tot 5-amino-4imidazolecarboxyamide-1-β-ribofuranosyl 5’-monofosfaat (ZMP). Vervolgens wordt deze molecule gemetaboliseerd tot inosine 5’-monofosfaat (IMP) en gebruikt voor de synthese van nucleïnezuren. IMP kan uiteindelijk verder degraderen tot hypoxanthine, xanthine en urinezuur (figuur 2). (5,7) Naast de gemetaboliseerde vorm kan AICAR ook rechtstreeks worden uitgescheiden in urine, dit gebeurt in variërende concentraties afhankelijk van de voedings- en gezondheidsstatus. (4)

Figuur 1. AICAR (5)

4

Figuur 2. Metabolisme AICAR

Vroeger was er voornamelijk interesse voor AICAR omwille van een mogelijk effect bij cardiovasculaire aandoeningen. Op basis hiervan werden in het verleden reeds klinische studies uitgevoerd om de veiligheid, tolerantie en farmacokinetiek van AICAR te bestuderen. Zowel intraveneuze als orale toediening van AICAR vertoonde goede tolerantie bij mensen. Na intraveneuze toediening werd 8% van de dosis teruggevonden in urine, bij orale toediening was dit minder dan 5%. Dit wijst erop dat AICAR een erg lage orale beschikbaarheid heeft. De component heeft een snelle plasma clearance, een halfwaardetijd (t1/2) van 1 à 2 uur en een lage eiwitbindende capaciteit. (6) AICAR zal dan ook snel gemetaboliseerd worden en zich verder verspreiden over de verschillende lichaamsweefsels. Het gebruik van radioactief gemerkte AICAR moleculen bevestigde deze hypothese. (8) Momenteel ligt de aandacht eerder bij de metabole eigenschappen van AICAR. In de geneeskunde worden fase 2 klinische studies uitgevoerd naar medisch gebruik van AICAR als behandeling voor metabole aandoeningen en obesitas. (4,5) 5

Training zorgt voor de activatie van allerlei transcriptie regulatoren en serine-threonine kinases die zullen bijdragen tot de metabolische herprogrammering van spieren. Eén van de belangrijkste serine-threonine kinases is adenosine monofosfaat geactiveerd proteïne kinase (AMPK). (9) Na activatie stimuleert AMPK de genexpressie van skeletspieren, oxidatieve processen en de productie van mitochondriën. AICAR is een natuurlijke AMPK activator. Het onderzoek van Narkar et al. onderzocht het effect van AICAR toediening bij muizen. Na inname konden de muizen 23% verder en 44% langer lopen zonder extra training. AICAR toediening resulteert in de verhoogde expressie van 32 genen die het uithoudingsvermogen positief beïnvloeden. Omwille van zijn biologische functie is AICAR een mogelijk target bij de behandeling van metabole aandoeningen, obesitas en een potentieel prestatie bevorderend middel. (4,9) Op basis van deze eigenschap wordt AICAR ook wel eens ‘exercise pill’ genoemd. (10) Hoewel er geen studie uitgevoerd werd naar de prestatiebevorderende effecten bij mensen en vermoedelijk erg hoge dosissen van deze dure molecule noodzakelijk zijn, waren de positieve effecten in muizen voldoende voor het WADA om de substantie toe te voegen aan de verboden lijst. Bij het toevoegen aan de verboden lijst in 2009 viel AICAR onder de categorie ‘gene doping’, momenteel is het echter terug te vinden bij de categorie ‘metabolic modulators’. (5,10) Bovendien is het misbruik van AICAR door atleten realiteit geworden. Zo wordt AICAR via het internet aangeboden als ‘research chemical’ en werd het al verscheidene keren door de Belgische douane in pakketten onderschept. (11) Kwalitatieve bepaling van AICAR als bewijs voor dopingmisbruik is niet voldoende, aangezien AICAR een endogene component is die in variërende concentraties voorkomt in urine. Een onderzoek bij 499 topsporters toonden een gemiddelde AICAR concentratie van 2186 ng/mL met een standaarddeviatie van 1655 ng/mL aan. 3% van de resultaten vertoonde concentraties boven de 6000 ng/mL. Op basis van deze resultaten werd er besloten dat een concentratie van meer dan 20 µg/mL niet afkomstig is van een endogene productie. De mogelijkheid bestaat echter dat een hoge concentratie veroorzaakt worden door een pathologie, zoals bijvoorbeeld vitamine B12 of foliumzuurdeficiënties, leukemie of hypoxanthine guanine fosforibosyl transferase deficiëntie. (5) Het opstellen van referentiewaarden met vloeistofchromatografie – massa spectrometrie (LC-MS) kan een oplossing bieden om ‘verdachte’ stalen te selecteren. Deze dienen echter steeds verder onderzoek te ondergaan om na te gaan of de molecule van synthetische of natuurlijke oorsprong is 6

en zo misbruik te confirmeren. Een mogelijke methode om synthetisch en natuurlijk AICAR te differentiëren is IRMS naar analogie met testosterondetectie. (4,5)

1.4. Vloeistof chromatografie - massa spectrometrie 1.4.1. Vloeistof chromatografie Bij chromatografie worden verschillende componenten van elkaar gescheiden door ze te verdelen over verschillende fasen. Enerzijds de stationaire of vaste fase, die meestal gecoat is op silicapartikels die zich binnenin de kolom bevinden. Anderzijds de mobiele fase die zich in een bepaalde richting voortbeweegt over de stationaire fase. Bij vloeistof chromatografie (LC) bestaat de mobiele fase uit een vloeistof. De scheiding is gebaseerd op basis van verschillen in affiniteit tussen de mobiele en de vaste fase. Wanneer de mobiele fase polair is en de stationaire fase apolair, zullen de polaire moleculen sneller van de kolom elueren dan de apolaire moleculen. Wanneer de polariteitsgradiënt van de mobiele fase gewijzigd wordt doorheen de tijd kan een nog betere scheiding van de componenten bekomen worden. (12) Aangezien AICAR een polaire molecule is zal deze bij omkeer fase chromatografie relatief snel van de kolom elueren. (13) Dergelijke analyse wordt momenteel vaak gekoppeld aan een massa spectrometer.

1.4.2. Massaspectrometer Een massaspectrometer bestaat uit verschillende onderdelen: een ionenbron, een massa-analysator en een massa-detector. 1.4.2.1. Ionenbron: Electrospray ionisatie (ESI) Bij het koppelen van vloeistofchromatografie aan een massaspectrometer wordt gebruik gemaakt van atmosferische druk ionisatie (API) als ionenbron. De meest gebruikte API zijn atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) en electrospray ionisatie (ESI). Voor de kwantitatieve bepaling van AICAR wordt er gebruik gemaakt van ESI (figuur 3). Dit is een zeer zachte ionisatie techniek, waarbij een moleculair ion gevormd wordt. (14,15)

7

Figuur 3. Schematische voorstelling van electrospray ionisatie (15)

Vloeibare oplossingen worden omgezet tot gasvormige ionen via een capillair onder atmosferische druk. Tussen het uiteinde van het capillair en een tegen-elektrode wordt een hoge elektrische potentiaal aangelegd. Met behulp van dit elektrisch veld kan er verstrooiing optreden van het staal, hierdoor ontstaat een nevel van geladen druppels. Ook het gebruik van stikstofgas zorgt voor extra verneveling en stuwing van de ionen richting de tegen-elektrode. Door het verdampen van het aanwezige solvent zullen de gevormde druppels steeds kleiner worden. Uiteindelijk worden de ionen via een verhit capillair naar de analysator geleid. Tijdens dit traject zal het overblijvende solvent verder verdampt worden tot de ionen volledig overgebracht zijn naar de gasfase (figuur 3). (14,15) 1.4.2.2.Massa-analysator: Triple quadrupool Na de ionisatie worden de verschillende ionen gescheiden op basis van hun massa-tot-ladingverhouding (m/z) met behulp van een massa-analysator. Verschillende massa-analysators zijn bruikbaar, bijvoorbeeld een quadrupool (figuur 4). Dergelijke massa-analysator bestaat uit vier parallelle elektroden, opgedeeld in twee paren. Over één paar wordt gelijksstroom aangelegd, over het andere wordt wisselspanning aangelegd. De ionen worden doorheen de massa-analysator geleid via een oscillerende beweging. Enkel die ionen die een stabiele oscillerende beweging vertonen zullen worden verder geleid, de andere ionen worden geneutraliseerd en blijven ondetecteerbaar. (14,15) 8

Figuur 4. Schematische voorstelling van een quadrupool (16)

Wanneer drie quadrupools achter elkaar geplaatst worden, spreekt men van een triple quadrupool (QqQ). De eerste quadrupool wordt doorgaans gebruikt om precursorionen met een bepaalde m/z verhouding te selecteren. Vervolgens zullen de geselecteerde precursorionen worden verder geleid naar de tweede quadrupool. In deze quadrupool zal de zogenaamde ‘collision induced dissociation’ (CID) plaatsvinden, waarbij de geselecteerde precursorionen verder gefragmenteerd zullen worden. In de derde quadrupool zal opnieuw massa-selectie plaatsvinden, dit keer van de gevormde fragmentionen. Deze zullen later gedetecteerd en gekwantificeerd kunnen worden. (14,15) Een triple quadrupool kan op verschillende wijzen gebruikt worden. Enerzijds kan er, net als bij het gebruik van slechts één quadrupool, een volledig spectrum geanalyseerd worden (‘full scan’) of één specifiek ion gedetecteerd worden. Dit laatste wordt ook wel omgeschreven als ‘single ion monitoring’ (SIM). Anderzijds is ‘single reaction monitoring’ (SRM) een mogelijkheid. Hierbij wordt in de eerste quadrupool een precursorion geselecteerd. Dit precursorion zal vervolgens in de tweede quadrupool gefragmenteerd worden. In de derde quadrupool zal er vervolgens opnieuw één production geselecteerd worden. Voor dit onderzoek zal er echter gebruik gemaakt worden van ‘multiple reaction monitoring’ (MRM). Dit is een toepassing gelijkend op SRM, maar gedurende de analyse worden meerdere ionen geselecteerd. (14)

9

1.4.3. Dilute-and-shoot Dilute-and-shoot is een methode waarbij de urine rechtstreeks geïnjecteerd wordt op de kolom, zonder een uitgebreide staalvoorbereiding. Bij deze methode zal er enkel een verdunningsstap worden uitgevoerd, waardoor zowel de concentratie van AICAR als de matrix verdund zal worden. Aangezien AICAR gemakkelijk ioniseert is deze zelfs in lage concentraties meetbaar. De verdunde matrix zal echter een daling van de matrix effecten opleveren. Naast de verdunning wordt er geen extra staalvoorbereiding, zoals bijvoorbeeld een hydrolyse, uitgevoerd. Het voordeel van deze methode is de snellere en eenvoudigere staalvoorbereiding. (13,17)

1.5. Isotopen ratio massa spectrometrie

Figuur 5. Schematische voorstelling van een GC-C-IRMS (3)

GC-C-IRMS wordt gebruikt om isotopen ratio’s te bepalen. Isotopen ratio’s kunnen bepaald worden voor koolstof, stikstof of waterstof. Voor dopingcontrole wordt echter voornamelijk de isotopen ratio van koolstof bepaald (en soms van waterstof). Het toestel is opgebouwd uit verschillende onderdelen. Het eerste deel omvat een gaschromatograaf (GC), die gebruikt wordt om verschillende componenten van elkaar te scheiden. Vervolgens is hieraan een verbrandingsoven gekoppeld. Deze zal de componenten omzetten tot CO2 en H2O of N2. Enkel het CO2 gedeelte zal in de IRMS verder geanalyseerd worden bij de bepaling van de koolstof isotopen ratio (CIR) (figuur 5). Bij de bepaling van stikstof isotopen ratio echter zal N2 verder geanalyseerd worden. (3,18,19)

10

Het IRMS gedeelte bestaat uit een ionenbron, massa-analysator en een detector. In de ionenbron zal CO2 omgezet worden tot CO2+˙ en N2 tot N2+. De opgewekte ionen zullen door de massaanalysator verder geleid worden naar de detector van de IRMS. Massaselectie gebeurt op basis van magnetisme, waarbij de verschillende m/z-waarden gescheiden en gedetecteerd worden in verschillende Faraday cups. Op basis van deze m/z waarden kan de isotopen ratio bepaald worden (figuur 6). (3,18,20)

Figuur 6. Schematische voorstelling van IRMS (20)

GC-C-IRMS is de methode die bij dopingonderzoek gebruikt wordt om het onderscheid te maken tussen endogene en exogene componenten. Momenteel wordt de techniek voornamelijk gebruikt voor de detectie van endogene steroïden, bijvoorbeeld testosteron. (3) De methode is gebaseerd op een verschil in CIR tussen exogene en endogene steroïden. De basis voor het verschil in CIR ligt bij planten. Tijdens de fotosynthese maken planten gebruik van koolstof. Afhankelijk van de pathway die ze hiervoor gebruiken kunnen we planten opdelen in verschillende groepen. Het gebruik van een bepaalde groep planten bij de productie van synthetische of natuurlijke producten zal invloed hebben op de CIR van het gevormde product (figuur 7). (3,18,21,22) De CIR wordt uitgedrukt tegenover een referentiewaarde voor koolstof, namelijk Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB), als δ13C - waarde volgens volgende formule:

11

( 𝛿 13𝐶 [‰] =

13

13 𝐶⁄ 𝐶⁄ 12𝐶 )𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 − ( 12𝐶 )𝑠𝑡𝑑 ∗ 1000 13𝐶 ( ⁄12𝐶 )𝑠𝑡𝑑

Bepaalde factoren binnen een individu kunnen de isotopen ratio beïnvloeden, onder andere het dieet (figuur 7). (23) Om hiervoor te corrigeren wordt de isotopen ratio bekeken als een verschil ten opzichte van een endogene referentie component (ERC) volgens onderstaande vergelijking: ∆[‰] = 𝛿 13𝐶𝐸𝑅𝐶 − 𝛿 13𝐶𝑇𝐶 waarbij TC staat voor de component die bestudeerd wordt (target compound). Als ERC wordt meestal een precursor van de TC gebruikt, waarvan de isotopen ratio niet zal wijzigen na inname van de TC. Exogeen geproduceerde componenten vertonen doorgaans verlaagde isotopen ratio’s ten opzichte van endogeen geproduceerde componenten. Na inname zal de isotopen ratio van de TC dan ook wijzigen, terwijl de isotopen ratio van de ERC constant blijft. Een verschil groter dan 3‰ wordt door WADA beschouwd als een positief resultaat. (21,22)

Figuur 7. Isotopen ratio (δ13C en δ15N) van verschillende diëten (aangepast van (22,24–27))

12

De CIR kan enkel correct bepaald worden voor zuivere componenten. Alvorens een GC-C-IRMS analyse kan uitgevoerd worden bij urinestalen, zijn er dan ook heel wat zuiverings- en concentratiestappen nodig (vb. vaste fase extractie (SPE), hydrolyse, vloeistof-vloeistof extractie (LLE), derivatisatie en hoge druk vloeistof chromatografie – fractie collectie (HPLC-FC)). (3,18) Aangezien een GC-C-IRMS analyse een lange en intensieve staalvoorbereiding vereist, is het belangrijk om eerst een kwantitatieve analyse van de stalen te doen, zodat de ‘verdachte’ stalen die geconfirmeerd dienen te worden met GC-C-IRMS afgezonderd kunnen worden en enkel deze stalen verder onderzocht dienen te worden. Een extra moeilijkheid treedt op bij het ontwikkelen van een GC-C-IRMS methode voor AICAR. De molecule bevat drie alcohol functies, één amine, één amide en negen koolstof atomen. (5) De erg hoge polariteit van deze component maakt het moeilijk om deze op GC te brengen. Enkel indien er een derivatisatie wordt uitgevoerd, waarbij de polaire groepen omgezet worden naar apolaire groepen, is dergelijke GC-analyse mogelijk. In het ideaal geval, worden alle polaire groepen gederivatiseerd. Indien dit toch niet volledig zou gebeuren kan er tailing optreden. Deze tailing zal ervoor zorgen dat de isotopen ratio minder nauwkeurig bepaald kan worden en er meer variatie zal optreden Bij het derivatiseren van de polaire groepen worden extra koolstofatomen aangebracht op de molecule. Deze toegevoegde koolstofatomen zullen een andere isotopen ratio vertonen dan deze van de component zelf. Wanneer de CIR bepaald wordt, dient er dan ook een correctiefactor toegevoegd te worden voor de gebruikte derivatisatie. Bij de analyse van steroïden wordt dit reeds uitgevoerd. De polaire groepen worden gederivatiseerd door acetylering, waarbij er twee extra koolstofatomen toegevoegd worden per alcohol groep. De correctiefactor wordt berekend door de CIR van de gederivatiseerde vorm te vergelijken met die van de niet gederivatiseerde vorm. (21,22) Ook bij de isotopen ratio bepaling van AICAR dient een correctiefactor toegepast te worden. Aangezien AICAR slechts uit negen koolstofatomen bestaat en er veel koolstofatomen geïntroduceerd worden bij het derivatiseren, zal deze correctiefactor een grote invloed hebben op de isotopen ratio. De correctiefactor voor AICAR kan echter niet op dezelfde manier bepaald worden als bij steroïden, aangezien het niet mogelijk is de niet-gederivatiseerde vorm op GC-CIRMS te brengen omwille van de hoge polariteit. Als alternatief zou het meten van de stikstof isotopen ratio misschien een oplossing kunnen bieden. AICAR bevat vier stikstofatomen en de klassieke GC derivatisatie reagentia hebben er geen. Het 13

enzym purine nucleoside fosforylase (PNP) kan gebruikt worden om het ribose van de molecule af te splitsen. Op deze manier worden reeds 3 van de 5 polaire groepen verwijdert zonder dat er verlies optreedt van stikstofatomen. (28) Aangezien de stikstof isotopen ratio net als de CIR gevoelig is aan externe factoren zoals het dieet, is het ook bij AICAR aangewezen gebruik te maken van een ERC (figuur 7). De belangrijkste bron van stikstofatomen bij mens en dier is de afbraak van proteïnen afkomstig uit de voeding tot aminozuren (figuur 2). Deze aminozuren worden gebruikt om andere proteïnen te vormen in het lichaam. Proteïnen breken vervolgens af tot ureum, dat via de nieren uitgescheiden kan worden in de urine. Ureum kan gebruikt worden als ERC bij de analyse van AICAR. Tijdens het opnemen van stikstof uit de voeding en het omzetten van aminozuren naar andere componenten treedt er isotopen fractionering op. Deze 15N isotopen fractioneringsprocessen in het lichaam zijn erg complex. In het algemeen zal de δ15N – waarde stijgen per trofisch niveau, waarbij de hoogste δ15N – waarden terug te vinden zullen zijn op de hoogste niveaus in de voedselketen. Deze stijging wordt veroorzaakt door de grotere fractionering bij stikstofafvoer door productie van ureum en urinezuur, dan de fractionering veroorzaakt door opname van stikstof uit voeding. (25,26,29) Aangezien mensen hoog staan in de voedselketen, zou de δ15N – waarde van AICAR ook eerder hoog moeten zijn. In tegenstelling tot deze hoge endogene waarde is exogeen AICAR meestal gesynthetiseerd uit planten precursoren met lage trofische niveaus en elke extra stap in de chemische synthese van AICAR zou moeten leiden tot een verdere daling van 15N. Er kan dan ook verwacht worden dat exogene en endogene δ15N – waarden verschillend van elkaar zullen zijn. In het ideale geval is er geen overlap tussen de exogene en endogene waarden, bij δ13C is dit soms wel het geval (figuur 7).

1.6. Validatie kwantitatieve bepaling van AICAR met LC-MS/MS Alvorens een analyse methode in gebruik genomen kan worden, dient deze gevalideerd te worden. Hierbij wordt er nagegaan of de methode voldoende betrouwbaar is. Voor deze methode zijn vooral de lineariteit, de juistheid, de herhaalbaarheid, de reproduceerbaarheid en het matrix-effect belangrijk. Richtlijnen voor de methodevalidatie van kwantitatieve analyses zijn terug te vinden in de Standard Operating Procedures (SOPs) van het DoCoLab.

14

1.6.1. Lineariteit Voor een analytische methode is lineariteit belangrijk aangezien het een mathematisch verband aantoont tussen de piekoppervlakte en de concentratie van de component in het monster. Om lineariteit aan te tonen wordt er een kalibratiecurve opgesteld door blanco urinestalen aan te rijken met de te onderzoeken component. Voor elke kalibratiecurve worden minimaal 6 niveaus gebruikt. De kalibratiecurve wordt beschreven volgens de mathematische formule y = ax + b; waarbij 𝑦=

piekoppervlakte component piekoppervlakte IS

x = theoretische concentratie component a = richtingscoëfficiënt (helling) b = intercept Aangezien AICAR een endogene component, is wordt water gebruikt om de kalibratiecurve op te stellen. Het is hierbij wel nodig aan te tonen dat de richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve in water en de kalibratiecurve in urine niet significant verschillend zijn.

1.6.2. Juistheid De juistheid is de mate van overeenkomst tussen de gemiddelde waarde verkregen uit een reeks analysen en de ware waarde. Dit wordt meestal uitgedrukt als de procentuele afwijking van het gemiddelde van de gemeten waarde en de ware concentratie, ook wel de onjuistheid (% afwijking). +/- 20% wordt gehanteerd als grens voor de maximale aanvaardbare grenzen voor de onjuistheid. 𝑥̅ − 𝑤𝑎𝑟𝑒 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒 𝑗𝑢𝑖𝑠𝑡ℎ𝑒𝑖𝑑 (%) = ( ) ∗ 100 𝑤𝑎𝑟𝑒 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒

1.6.3. Herhaalbaarheid De herhaalbaarheid is de mate waarin resultaten zullen overeenstemmen onder identieke omstandigheden. Minimaal zullen hier 3 stalen voor worden getest. Deze worden aangereikt op het niveau van de laagste kalibrator en de hoogste kalibrator. De herhaalbaarheid wordt uitgedrukt door de relatieve standaardafwijking (RSD). De herhaalbaarheid mag ten hoogste gelijk zijn aan 2/3 RSDmax. 15

∑( 𝑥𝑖 − 𝑥 )2 𝑆𝐷 = √ 𝑛−1 𝑅𝑆𝐷 =

𝑆𝐷 𝑥̅

𝑅𝑆𝐷𝑚𝑎𝑥 = 2(1−0,5𝑙𝑜𝑔𝐶)

1.6.4. Reproduceerbaarheid De reproduceerbaarheid is de mate van overeenstemming tussen resultaten die verkregen zijn met dezelfde methode maar uitgevoerd onder andere omstandigheden, zoals een ander tijdstip of een andere laborant. Hiervoor worden dezelfde metingen als voor de herhaalbaarheid opnieuw uitgevoerd op verschillende dagen door verschillende laboranten. De reproduceerbaarheid mag ten hoogste gelijk zijn aan de RSDmax.

1.6.5. Matrix – effect (ion suppression) Bij een matrix-effect zullen bepaalde componenten uit de matrix de signaalintensiteit van de component onderdrukken of versterken. Om dit na te gaan worden 6 blanco urinestalen aangerijkt met de te bepalen component en de interne standaard. Vervolgens worden de piekoppervlakten van de te bepalen component ten opzichte van de interne standaard in de urine stalen vergeleken met de piekoppervlakten ten opzichte van de interne standaard in een referentiestaal. Hierbij wordt het corrigerend vermogen van de interne standaard geëvalueerd. Het matrix-effect mag na correctie maximaal 20% bedragen.

1.7. Validatie isotopen ratio bepaling van AICAR met GC-C-IRMS 1.7.1. Precisie De herhaalbaarheid geeft de mate van overeenstemming tussen onafhankelijke resultaten onder identieke omstandigheden weer. De reproduceerbaarheid geeft de mate van overeenstemming tussen onafhankelijk resultaten onder verschillende omstandigheden weer. In dit geval bij verschillende concentraties over verschillende batchen. (30)

16

1.7.2. Lineariteit De lineariteit geeft aan binnen welk bereik de isotopen ratio bepaald kan worden onafhankelijk van de concentratie van de te bepalen component. (30)

1.8. Probleemstelling AICAR is een endogene component die onder normale omstandigheden reeds voorkomt in urine. Een kwalitatief onderzoek kan dan ook niet gebruikt worden om dopingmisbruik vast te stellen. De concentratie AICAR aanwezig in urine kan bepaald worden door gebruik te maken van LC-MS/MS. Wanneer uitzonderlijk hoge concentraties vastgesteld worden zullen deze vermoedelijk veroorzaakt worden door misbruik. Dit dient echter bevestigd te worden door een confirmatieanalyse aangezien hoge concentraties ook door bijvoorbeeld een pathologie veroorzaakt kunnen worden. In deze masterproef wordt getracht referentiewaarden op te stellen voor ‘normale’ concentraties AICAR in urine, zowel bij sporters als bij niet-sporters. Deze referentiewaarden kunnen later gebruikt worden bij de screening naar ‘verdachte’ stalen. Het finale doel is het opstellen van een IRMS methode, zodat synthetisch AICAR gedifferentieerd kan worden van natuurlijk AICAR om zo misbruik aan te tonen.

17

2. Materiaal en methode 2.1. Producten en reagentia AICAR en een interne standaard (IS) voor LC-MS/MS voor AICAR (13C215N) werden aangekocht bij TRC (Toronto, Canada). Verder werd er ook een referentie standaard voor AICAR aangekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Verenigde Staten). Hypoxanthine, N-tert-butyldimethylsilyl-Nmethyltrifluoroacetamide

(MTBSTFA),

1,1,3,3-tetramethoxypropaan

(MBDMA),

N-N-

dimethylformamide (DMF), azijnzuur (HAc), 37% zoutzuur (HCl), urinezuur, androsteron en het enzym purine nucleoside fosforylase (PNP) werden eveneens aangekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Verenigde Staten). N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) werd verkregen via Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland). 5-aminoimidazole-4-carboxamide (AICA) werd aangekocht bij Acros organics (Geel, België). Acetonitril (ACN), methanol (MeOH) en water als LC-MS reagens werden aangekocht via J.T.Baker (Deventer, Nederland). Ureum (δ15N = 20,17‰, σ = 0,08‰) en caffeïne#1 (δ15N = -2,90‰, σ = 0,03‰; δ13C = -35,05‰, σ = 0,02‰) werden gebruikt als IS voor IRMS. Beiden werden verkregen via de Indiana University (Bloomington, IN, Verenigde Staten). Ammonium formiaat (NH4CHO2) en mierenzuur (HCOOH) werd

bekomen

bij

Fisher

Scientific

(Leicestershire,

Verenigd

Koninkrijk).

Dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat, natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat en fosforzuur werden aangekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Gassen die gebruikt worden (helium, koolstofdioxide, zuurstofgas en stikstofgas) werden bekomen via Air Liquide (Aalter, België). Er werden verschillende filters gebruikt van Millipore (Darmstadt, Duitsland). Een 0,22 µm steriflip filter, een 10K filter en een 0,45 µm filter. Een 0,1 M fosfaatbuffer met pH 7 werd bereid door 140 g dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat en 28 g natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat op te lossen in 2000 mL gedistilleerd water en bij te stellen met fosforzuur.

2.2. Instrumenten 2.2.1. LC-MS/MS Voor de kwantitatieve bepaling van AICAR in urine werd er gebruik gemaakt van een Surveyor plus (Thermo Scientific, Bremen, Duitsland). Deze werd gekoppeld aan een TSQ Quantum

18

Discovery MAX triple quadrupool massa spectrometer (Thermo Scientific, Bremen, Duitsland). Als kolom werd er gebruikt gemaakt van een Phenomenex Luna NH2 met een lengte van 50 mm, een interne diameter van 2,0 mm en een partikelgrootte van 3 µm (Torrance, CA, Verenigde Staten). Mobiele fase A bestond uit H20, 0,1% HAc. Mobiele fase B bestond uit ACN, 0,1% HAc. Er werd een flow gebruikt van 0,3 mL/min. De gebruikte gradiënt is weergegeven in tabel 1. Er werd 20 µL per staal geïnjecteerd. Tabel 1. Gradiëntelutie LC-MS/MS

Tijd (min)

Mobiele fase A (%)

Mobiele fase B (%)

0

5

95

1

5

95

4

15

85

4,1

100

0

6

100

0

6,1

5

95

8

5

95

De massa spectrometer werd gebruikt in positieve modus met MRM. Als collision gas werd stikstof gebruikt (1,5 mTorr). De belangrijkste massaspectrometrische parameters voor AICAR en zijn IS zijn weergegeven in tabel 2. Tabel 2. Parameters massa spectrometer

AICAR

IS

Precursor ion

Fragment ion

Collision offset

MH+ (m/z)

(m/z)

(V)

259

110

23

259

127

11

259

242

11

262

112

20

262

129

10

262

244

15

19

2.2.2. HPLC-FC Tijdens de staalvoorbereiding voor de GC-C-IRMS analyse werd er gebruikt gemaakt van een scheiding via HPLC. Deze scheiding werd uitgevoerd op een Surveyor (Thermo Scientific, Bremen, Duitsland) gekoppeld aan een Gilson FC 204 fractie collector (Gilson, Middleton, WI, Verenigde Staten). Voor HPLC A werd een Phenomenex Gemini C18 kolom met een lengte van 150 mm, een interne diameter van 10 mm en een partikelgrootte van 5 µm gebruikt (Phenomenex, Torrance, CA, Verenigde Staten). Mobiele fase A bestond uit H2O 5 mM ammonium formiaat, 0,05% mierenzuur. Mobiele fase B bestond uit 9/1 ACN/H20 5 mM ammonium formiaat, 0,05 % mierenzuur. Er werd een flow gebruikt van 5 mL/min. De gebruikte gradiënt is weergegeven in tabel 3. Er werd 500 µL geïnjecteerd per staal. Fotodiode array detectie werd uitgevoerd bij 245 en 285 nm. Als retentietijd (RT) merkers werd er gebruik gemaakt van AICAR, urinezuur en hypoxanthine. Deze RT- merkers werden gebruikt om de collectievensters te bepalen. Tabel 3. Gradiëntelutie HPLC A

Tijd (min)

Mobiele fase A (%)

Mobiele fase B (%)

0

100

0

7

100

0

8

0

100

12

0

100

13

100

0

18

100

0

Voor HPLC B werd een Phenomenex Gemini C18 kolom gebruikt met een lengte van 150 mm, een interne diameter van 4,6 mm en een partikelgrootte van 5 µm (Phenomenex, Torrance, CA, Verenigde Staten). Voor de mobiele fase werden dezelfde solventen gebruikt als bij HPLC A. Er werd een flow gebruikt van 1 mL/min. De gebruikte gradiënt is weergegeven in tabel 4. Er werd 100 µL geïnjecteerd per staal. Fotodiode array detectie werd uitgevoerd bij 245 en 285 nm. Als RT- merkers werd er gebruik gemaakt van AICA en hypoxanthine.

20

Tabel 4. Gradiëntelutie HPLC B

Tijd (min)

Mobiele fase A (%)

Mobiele fase B (%)

0

100

0

3

100

0

4

0

100

8

0

100

9

100

0

14

100

0

2.2.3. GC-MS Om de zuiverheid van de componenten en de intensiteit van de pieken na te gaan, werd een GCMS analyse uitgevoerd. Er werd hiervoor een Agilent 6890 GC gekoppeld aan een 5975B VI MSD (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, Verenigde Staten). Een DB-17 MS kolom werd gebruikt met lengte van 30 meter, een interne diameter van 0,250 mm en een filmdikte van 0,25 µm (Agilent, Technologies, Palo Alto, CA, Verenigde Staten). Helium werd gebruikt als draaggas met een flow van 1,4 mL/min. Er werd 2 µL per staal geïnjecteerd. Dit werd opgespoten met behulp van een Gerstel PTV injector (Mülheim am der Rühr, Duitsland) in pulsed splitless modus met gedurende 0,2 min een druk van 18 psi. De temperatuur van de injector werd met 720°C/min verhoogd van 70°C tot 300°C, 2 min stabiel gehouden op 300°C en volgens met 720°C/min verhoogd tot 400°C. De initiële oventemperatuur was 70°C en werd behouden gedurende 0,1 min, vervolgens werd de temperatuur verhoogd met 10°C/min tot 160°C en met 25°C/min tot 310°C. De totale run duurde 17,1 min. Er werd een full scan massaspectrum gemeten.

2.2.4. GC-C-IRMS Voor de eigenlijke GC-C-IRMS analyse werd er gebruik gemaakt van een Agilent 7890A GC (Palo Alto, CA, Verenigde Staten) gekoppeld aan een Thermo GC-Isolink, een Thermo Conflo IV interface en een Thermo Scientific MAT253 IRMS (Bremen, Germany). Voor deze analyse werd er gebruik gemaakt van dezelfde GC-instellingen als bij de full scan GC-MS analyse.

21

2.3. Urinestalen De niet-sporter urinestalen zijn afkomstig van het Universitaire Ziekenhuis Gent. De urinestalen van atleten zijn afkomstig uit de routine screenings van het DoCoLab. Urinestalen die positief werden bevonden voor één of meerdere dopingsubstanties tijdens de routine screening werden niet meegenomen in deze referentiepopulatie.

2.4. Kwantitatieve bepaling van AICAR in urine met LC-MS/MS 2.4.1. Staalvoorbereiding Voor een kwantitatieve bepaling van AICAR in urine met behulp van LC-MS/MS werd een nieuwe methode ontwikkeld. Er werd 50 µL urine toegevoegd aan 450 µL acetonitril met 0,1% azijnzuur. Vervolgens werd deze oplossing gecentrifugeerd. Na het centrifugeren werd 50 µL van deze oplossing afgenomen en overgebracht in een nieuwe vial. Hierbij werd nog 50 µL interne standaard (20 µg/mL, 0,1% azijnzuur in acetonitril) toegevoegd. Bij elke analyse werd er ook een kalibratiecurve (0,1; 0,3; 0,8; 1,5; 2,5 en 4 µg/mL) opgesteld in water. Op basis van deze kalibratiecurve werd de hoeveelheid AICAR in de urinestalen bepaald.

2.4.2. Validatie 2.4.2.1. Lineariteit Om de lineariteit te testen tussen 0,1 en 4 µg/mL werden drie kalibratiecurven opgesteld in water. Het water werd hiervoor aangerijkt op 0,1; 0,3; 0,8; 1,5; 2,5; en 4 µg/mL. Vervolgens werd bovenstaande staalvoorbereiding uitgevoerd en werden de stalen geanalyseerd. Er werden ook drie kalibratiecurven opgesteld in urine. Deze kalibratiecurven bestonden uit dezelfde kalibratiepunten en werden op dezelfde wijze bereid en geanalyseerd. Om de gemiddelde kalibratiecurve in water en in urine te vergelijken werd er gebruik gemaakt van een onafhankelijke t-test, deze werd uitgevoerd in SPSS versie 22. 2.4.2.2. Juistheid, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid De juistheid, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden getest op concentratieniveau 0,1; 1,5; en 4 µg/mL. Voor elke concentratieniveau werd water in drievoud aangerijkt met AICAR. 22

Vervolgens werd bovenstaande staalvoorbereiding uitgevoerd. Om de reproduceerbaarheid te testen werd dit proces herhaald op 3 verschillende dagen door verschillende personen. 2.4.2.3. Matrix-effect (ion suppression) Om het matrix-effect te bepalen werden zes urinestalen en een waterstaal aangerijkt op 1,5 µg/mL. Vervolgens werden deze stalen als ook de niet-aangerijkte urinestalen geanalyseerd.

2.5. Isotopen ratio bepaling van AICAR in urine met GC-C-IRMS 2.5.1. Staalvoorbereiding δ15N – bepaling van AICAR Bij de staalvoorbereiding van de IRMS-analyse van AICAR werd er gewerkt met een AICAR fractie, een ureum fractie en een urinezuur/hypoxanthine fractie. Om AICAR te collecteren werd een aliquot urine gebruikt dat ongeveer 10 µg AICAR bevat. (Er wordt maximaal een volume van 5 mL urine genomen.) De voorkeur gaat uit naar dergelijke concentratie opdat de stalen binnen het optimale bereik van de IRMS zouden passen. De benodigde hoeveelheden urine werden berekend aan de hand van de concentraties bekomen uit de kwantitatieve bepaling van AICAR. De urinestalen werden achtereenvolgens gefilterd met een 0,2 µm steriflip en een 5 mL 10K filter. Vervolgens werd de urine gedroogd met zuurstofvrije stikstof (OFN) op 60°C en werd er 200 à 350 µL H20 5mM ammonium formiaat, 0,05% mierenzuur toegevoegd. Deze oplossing werd opnieuw gefilterd met een 0,45 µm microfilter en aangelengd tot 500 µL H2O 5 mM ammonium formiaat, 0,05% mierenzuur. Om ureum, urinezuur en hypoxanthine te collecteren werd een aliquot van 100 µL urine gebruikt. Hierbij werd 400 µL H2O 5 mM ammonium formiaat, 0,05% mierenzuur toegevoegd. Vervolgens werd dit gefilterd met een 0,45 µm microfilter. Beide aliquots ondergingen vervolgens een eerste scheiding met behulp van HPLC (HPLC A). Er werd telkens 500 µL geïnjecteerd. De collectievensters werden bepaald aan de hand van een HPLCstandaard (tabel 5). Deze HPLC-standaard werd bereid door 100 µL AICAR (100 µg/mL), 100 µL urinezuur (100 µg/mL) en 100 µL hypoxanthine (100 µg/mL) samen te voegen, te drogen met OFN op 40°C en vervolgens aan te lengen met 500 µL H2O 5 mM ammonium formiaat, 0,05% 23

mierenzuur. Afhankelijk van de RT bekomen voor de verschillende componenten in deze standaard, kan indien nodig het collectievenster aangepast worden. Voor ureum werd geen standaard gebruikt. Deze fractie werd steeds gecollecteerd tussen 1,4 tot 3,4 min. Tabel 5. Collectievensters voor verschillende componenten

Component

RT standaard (min)

Collectievenster (min)

Ureum

-

1,4 – 3,4

Urinezuur

3,6

2,6 – 4,6

Hypoxanthine

5,6

4,6 – 7,0

AICAR

8,2

7,4 – 9,0

AICA

2,6

2,3 – 3,4

De AICAR fractie werd na de HPLC gecollecteerd, gedroogd met OFN op 60°C, opgelost in 500 µL MeOH en 5 min op rollen geplaatst. Vervolgens werd deze fractie overgebracht naar een epje en gedroogd onder OFN op 40°C. 90 µL 0,1 M fosfaatbuffer en 10 µL PNP werd toegevoegd, waarna de stalen overnacht bewaard werden op 56°C. Door middel van deze enzymreactie werd het ribose van de molecule gesplitst, waarbij AICAR omgevormd werd tot AICA (figuur 8). De volgende dag werd de oplossing overgebracht op een 0,45 µm microfilter. Opnieuw werd er een scheiding met HPLC (HPLC B) uitgevoerd op de AICAR fractie. Een tweede HPLC-standaard werd bereid door 50 µL AICA (100 µg/mL) en 100 µL hypoxanthine samen te voegen, te drogen met OFN op 40°C en vervolgens aan te lengen met 500 µL H2O 5 mM ammonium formiaat, 0,05% mierenzuur. Deze HPLC-standaard werd opnieuw gebruikt om de collectievensters te bepalen (tabel 5). Aan de tweede HPLC-standaard werd ook hypoxanthine toegevoegd. Dit om te controleren of er geen endogeen hypoxanthine vanuit het PNP-mengsel gecollecteerd werd tijdens de fractiecollectie. Tijdens de verdere staalvoorbereiding zal AICA immers omgevormd worden naar hypoxanthine (figuur 8). Indien hypoxanthine uit het PNPmengsel mee gecollecteerd wordt, kan dit resulteren in fouten in de isotopen ratio. Na de tweede HPLC werd de fractie gecollecteerd, gedroogd met OFN op 60°C en opgelost in 200 µL H2O. Vervolgens werden de stalen overgebracht in vials en gedroogd onder vacuüm. 100 µL diethoxymethyl acetaat (DEMA) werd toegevoegd aan de vials, waarna ze gedurende 1 uur geïncubeerd werden op 120 °C en nadien gedroogd werden onder vacuüm. 100 µL IS ureum werd 24

toegevoegd en de stalen werden gedroogd onder OFN 40°C. Tot slot werd 20 µL MTBSTFA toegevoegd en werden de stalen geïncubeerd op 130°C gedurende 20 min. 2 µL van het staal werd geïnjecteerd op de GC.

Figuur 8. Staalvoorbereiding AICAR fractie

De urinezuur/hypoxanthine fractie werd na collectie gedroogd, opgelost in 200 µL H2O, overgebracht in een vial en opnieuw gedroogd onder vacuüm. Vervolgens werd er 150 µL IS ureum toegevoegd en gedroogd onder OFN op 40°C. Tot slot werd er 25 µL DMF-MTBSTFA (1:1) toegevoegd en werden de stalen geïncubeerd op 130°C gedurende 20 min.

Figuur 9. Staalvoorbereiding urinezuur fractie

25

Bij de ureum fractie werd na collectie 500 µL afgenomen en overgebracht naar een nieuwe proefbuis, vervolgens werd dit gedroogd met OFN op 60°C. Een ringsluitingsreactie werd uitgevoerd met 50 µL H2O, 50 µL 0,3 M MBDMA en 80 µL 37% HCl gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na de ringsluitingsreactie werden de stalen gedroogd met OFN op 40°C, overgebracht in vials met 200 µL H2O en opnieuw gedroogd. Vervolgens werd 100 µL IS cafeïne#1 (100 µg/mL) toegevoegd en opnieuw gedroogd. Tot slot werd 25 µL MTBSTFA toegevoegd en werden de stalen geïncubeerd op 130°C gedurende 20 min.

Figuur 10. Staalvoorbereiding ureum fractie

IS ureum werd bereid door 250 µL ureum (100 µg/mL) per staal te drogen met OFN op 60°C. Vervolgens werd een ringsluitingsreactie uitgevoerd met 50 µL H20, 50 µL 0,3 M MBDMA en 80 µL 37% HCl gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tot slot werd de IS gedroogd met OFN op 40°C en opnieuw opgelost in 250 µL MeOH. Deze IS wordt enerzijds gebruikt om concentraties aanwezig in een staal te vergelijken met de concentratie van de IS op GC-MS. Op deze manier kan nagegaan worden of de concentraties binnen het lineaire bereik van de IRMS liggen. Anderzijds wordt de IS gebruikt als standaard voor de δ15N bepaling. De IS bezit immers een gekende δ – waarde. Ook IS cafeïne#1 werd omwille van deze redenen gebruikt.

2.5.2. Staalvoorbereiding δ13C – bepaling van AICAR Voor de analyse van koolstofisotopen is de staalvoorbereiding erg gelijkenaardig aan de staalvoorbereiding beschreven voor stikstofisotopen. Ureum is een geschikte ERC bij de bepaling van stikstofisotopen, aangezien ureum verantwoordelijk is voor stikstofafvoer in het lichaam. Voor de bepaling van koolstofisotopen is de component echter geen geschikte ERC. De ureum fractie werd dan ook niet meer gecollecteerd. Bij de AICAR fractie en de urinezuur/hypoxanthine fractie werd er niet gewerkt met een IS ureum. IS ureum is immers geen geschikte IS bij de koolstofisotopen bepaling, IS cafeïne#1 is dit wel omwille van zijn gelijkaardige structuur. 26

Voor de AICAR fractie werd dezelfde staalvoorbereiding uitgevoerd. Er werd echter geen 100 µL DEMA en 60 µL IS ureum toegevoegd, maar 12,5 µL IS cafeïne #1. Hierna werd de AICAR fractie gedroogd en werd er 25 µL MSTFA toegevoegd en gedurende 20 min op 130°C geplaatst. Opnieuw werd er 2 µL van het staal geïnjecteerd op de GC. Voor de urinezuur/hypoxanthine fractie werd dezelfde staalvoorbereiding uitgevoerd. Er werd echter geen 75 µL IS ureum toegevoegd, maar 25 µL cafeïne #1. Vervolgens werd de fractie gedroogd onder OFN 40°C en werd er 25 µL DMF-MSTFA (1:1) toegevoegd en gedurende 20 min op 130°C geplaatst. Er werd 2 µL van het staal geïnjecteerd op de GC.

2.5.3. Validatie δ13C – bepaling 2.5.3.1. Precisie De precisie van de IRMS-analyse werd bepaald door bij drie batchen met drie verschillende concentratieniveaus de δ13C te bepalen. Er werd een laag, gematigd en hoog concentratieniveau getest met telkens zes stalen per niveau. De verschillende niveaus hadden een concentratie van respectievelijk 2 µg/mL, 20 µg/mL en 100 µg/mL. Water werd aangerijkt met AICAR en vervolgens werd de gekende staalvoorbereiding doorlopen. Finaal werd de δ13C waarde bepaald. Ook voor urinezuur werd de precisie getest, dit bij een concentratie van 100 µg/mL. De precisie werd geanalyseerd in urine, hiervoor werden 10 urinestalen aangerijkt met AICAR. Vijf stalen op 2 µg/mL en vijf stalen op 4 µg/mL. Vervolgens werd de gekende staalvoorbereiding uitgevoerd op deze tien urinestalen en uiteindelijk werd de δ13C waarde hiervan bepaald. 2.5.3.2. Lineariteit De lineariteit werd gecontroleerd zowel voor urinezuur als voor AICA. Voor een reeks van 15 stalen met een stijgende concentratie urinezuur of AICA werd de δ13C waarde bepaald (tabel 6). Voor AICAR werd een concentratiebereik van 15 tot 90 µg/mL getest. Voor urinezuur werd een concentratiebereik van 40 tot 320 µg/mL getest. Het benodigde volume AICAR (100 µg/mL) of urinezuur (100 µg/mL) werd overgebracht in een vial, waarna het gedroogd werd onder OFN op 40°C. Vervolgens werden AICAR gederivatiseerd met MSTFA en urinezuur met DMF-MSTFA (1:1).

27

Tabel 6. Concentratiebereik lineariteitsbepaling IRMS

Concentratieniveau

Concentratie AICA (µg/ml)

1

15

Concentratie Urinezuur (µg/ml) 40

2

20

60

3

25

80

4

30

100

5

35

120

6

40

140

7

45

160

8

50

180

9

55

200

10

60

220

11

65

240

12

70

260

13

75

280

14

80

300

15

90

320

2.5.4. δ15N en δ13C – bepaling van synthetisch AICAR Om de δ - waarde te bepalen van synthetisch AICAR werd 100 µL AICAR (100 µg/mL) gedroogd in een epje. Vervolgens werd de staalvoorbereiding voor de AICAR fractie uitgevoerd vanaf de PNP reactie. Er werden standaarden gebruikt die aangekocht werden bij twee verschillende leveranciers, namelijk TRC en Sigma. De overige twee stalen waren afkomstig van de douane.

2.5.5. Correctiefactor bepalen aan de hand van androsteron Om de correctiefactor te bepalen werd de δ13C – waarde bepaald van ongederivatiseerd en gederivatiseerd androsteron. Op basis van deze resultaten werd vervolgens de correctiefactor berekend. Om de δ13C – waarde te bepalen van ongederivatiseerd androsteron werd 20 µL androsteron (100 µg/mL) overgebracht in een vial, gedroogd onder OFN op 40°C en opnieuw

28

opgelost in 100 µL 1:1 tolueen – hexaan. Om de δ13C – waarde te bepalen van gederivatiseerd androsteron werd 20 µL androsteron (100 µg/mL) overgebracht in een vial, gedroogd onder OFN op 40°C en opnieuw opgelost in 100 µL MSTFA. Deze oplossing werd gedurende 20 min bij 130°C geplaatst. Vervolgens werd de oplossing afgekoeld en geïnjecteerd op de GC.

29

3. Resultaten en discussie 3.1. Kwantitatieve bepaling van AICAR in urine met LC-MS/MS 3.1.1. Validatie kwantitatieve bepaling AICAR in urine 3.1.1.1. Lineariteit Om de lineariteit te bepalen werden drie kalibratiecurven in water en drie kalibratiecurven in urine opgesteld. Vervolgens werd voor beide matrices een gemiddelde kalibratiecurve berekend. De gemiddelde kalibratiecurven werden uitgezet in figuur 11. In tabel 7 wordt voor beide gemiddelde kalibratiecurven de richtingscoëfficiënt en R² weergegeven. Binnen dit bereik wordt er een lineair verband aangetoond voor AICAR met een correlatiecoëfficiënt van 0,9977 in urine en 0,9985 in water. Dit resultaat is beter dan de vooropgestelde 0,98. Meestal wordt de lineariteit in de eigenlijke matrix bepaald (urine) om beïnvloedende factoren mee in rekening te brengen. Aangezien het in deze analyse echter gaat om een endogene component, namelijk AICAR, kan urine niet gebruikt worden als matrix om de kalibratiecurve op te stellen. Urine bevat immers steeds een bepaalde hoeveelheid AICAR, waardoor de aangerijkte concentraties steeds verhoogd zullen worden en een verschuiving van de kalibratiecurve zullen veroorzaken (figuur 11). Om na te gaan of water bruikbaar is als alternatieve matrix werd een ongepaarde t-test uitgevoerd om de richtingscoëfficiënten te vergelijken. Met een betrouwbaarheidsniveau van 95% werd een p-waarde van 0,261 bekomen. Deze waarde is groter dan het significantieniveau 0,05 en toont aan dat de richtingscoëfficiënten van beide kalibratiecurven niet significant verschillend zijn. Uit de resultaten van de ongepaarde t-test kan besloten worden dat water een goed alternatief is voor urine bij het opstellen van een kalibratiecurve. Voor urinestalen waarbij AICAR concentraties hoger dan 4 µg/mL bekomen worden, zal de concentratie opnieuw bepaald moeten worden na verdunning. Boven 4 µg/mL is lineariteit immers niet meer gegarandeerd. Tabel 7. Vergelijking van de kalibratiecurven

Vergelijking

R²

Urine

y = 0,0134572 + 3,2284x 0,9985

Water

y =- 0,191855 + 3,1497x

0,9977 30

Figuur 11. Kalibratiecurve AICAR in water en urine

3.1.1.2. Juistheid De juistheid werd bepaald op de concentratieniveaus 0,1; 1,5 en 4 µg/mL. Deze concentraties werden bereikt door water aan te rijken met AICAR (n = 3). De resultaten worden weergegeven in tabel 8. Tabel 8. Resultaten juistheid

Ware waarde (µg/mL)

Gemiddelde gemeten concentratie (µg/mL)

Procentuele afwijking (%)

0,100

0,095

-5,000

1,500

1,401

-6,622

4,000

3,995

-0,117

De procentuele afwijking is nooit groter dan 20%. De juistheid voldoet dus aan de vooropgestelde specificaties.

31

3.1.1.3. Herhaalbaarheid De herhaalbaarheid werd bepaald op de concentratieniveaus 0,1; 1,5 en 4 µg/mL. Deze concentraties werden bereikt door water aan te rijken met AICAR (n = 3). De resultaten worden weergegeven in tabel 9. Tabel 9. Resultaten herhaalbaarheid

Ware waarde (µg/mL)

Gemiddelde gemeten concentratie (µg/mL)

RSD (%)

2/3 RSDmax

0,100

0,095

2,105

15,085

1,500

1,401

3,334

10,035

4,000

3,995

7,159

8,658

Er wordt voldaan aan de vooropgestelde eisen. De RSD waarden zijn kleiner dan de 2/3 RSDmax waarden die berekend werden.

3.1.1.4. Reproduceerbaarheid De reproduceerbaarheid werd bepaald op de concentratie niveaus 0,1; 1,5 en 4 µg/mL. Deze concentraties werden bereikt door water aan te rijken met AICAR (n = 9). De resultaten worden weergegeven in tabel 10. Tabel 10. Resultaten reproduceerbaarheid

Ware waarde (µg/mL)

Gemiddelde gemeten concentratie (µg/mL)

RSD (%)

RSDmax

0,100

0,094

8,428

22,627

1,500

1,465

6,490

15,053

4,000

3,839

8,077

12,987

Er wordt voldaan aan de vooropgestelde eisen. De RSD is nergens groter dan de RSDmax.

32

3.1.1.5. Matrix – effect (ion suppression) Om de matrix-effecten te testen werden 6 urinestalen aangerijkt op 1,5 µg/mL. Deze 6 urinestalen werden gekozen omwille van hun lage endogene concentraties. De piekoppervlakteverhouding voor AICAR ten opzichte van de interne standaard in een aangerijkte urinestaal werd vergeleken met de piekoppervlakteverhouding bij een aangerijkt waterstaal. De resultaten worden weergegeven in tabel 11. De bekomen eindresultaten in urine mogen maximaal 20% afwijken van het resultaat bekomen in water. In water werd een piekoppervlakteverhouding bekomen van 4,192. De resultaten voor de urinestalen liggen allemaal binnen de vooropgestelde grenzen van 3,354 en 5,030; behalve urinestaal E. Aangezien er reeds endogeen AICAR aanwezig is in urinestalen, gaat het hier om een uitzonderlijke situatie. Wanneer urinestalen aangerijkt worden met AICAR zal de gemeten concentratie AICAR immers steeds hoger liggen dan de concentratie die gemeten wordt bij water dat aangerijkt werd op hetzelfde niveau. De afwijking in de piekoppervlakteverhouding voor urinestaal 6 is dan ook niet te wijten aan een matrix-effect, maar aan de hogere endogene hoeveelheid AICAR aanwezig in dit staal. Uit deze data kan men concluderen dat wanneer er een matrix-effect optreedt in urine, dit gecompenseerd zal worden door de interne standaard. Tabel 11. Resultaten matrix-effecten/ion suppresion

Piekoppervlakte

Gemeten concentratie AICAR (µg/mL)

AICAR

IS

AICAR/IS

1,5 µg/mL AICAR toegevoegd

Urine A

1836238

433852

4,232

1,637

0,080

Urine B

1760559

480819

3,662

1,411

0,171

Urine C

2378105

501866

4,739

1,830

0,134

Urine D

2207356

475589

4,641

1,799

0,178

Urine E

2150133

400825

5,364

2,085

0,254

Urine F

1903576

475094

4,032

1,557

0,023

Water

2916845

616431

4,192

1,621

-

Type staal

Endogene AICAR concentraties

33

3.1.2. Bepaling endogene concentratie AICAR in urine De endogene concentratie AICAR werd bepaald in een reeks urinestalen. Zo werd een dataset van 888 urinestalen bekomen, waarvan 257 niet-sporters en 631 sporters (tabel 12). Indien concentraties verkregen werden buiten het lineaire bereik van de kalibratiecurve (0,1 – 4 µg/mL), werden deze stalen verdund en opnieuw geanalyseerd. Wanneer de resultaten uitgezet werden in een histogram, werd een scheve verdeling met een rechter staart bekomen zowel voor de sporters als voor de niet-sporters (figuur 12 en 13). De hoogste concentraties voor AICAR werden teruggevonden in de populatie sporters. Tabel 12. Resultaten AICAR bepaling

Geslacht

N

Gemiddelde (µg/mL)

SD (µg/mL)

Totaal

631

0,828

0,719

Man

512

0,899

0,748

Vrouw

119

0,522

0,473

Totaal

257

0,445

0,348

Man

140

0,467

0,342

Vrouw

113

0,422

0,349

888

0,717

0,658

Sporter

Niet-sporter TOTAAL

Met behulp van het programma REFVAL, dat aangeraden werd door de Internationale Federatie voor Klinische Chemie (IFCC) (31), werd de 99% bovengrens bepaald voor beide populaties met een betrouwbaarheidsniveau van 95%. Voor de populatie sporters ligt deze grens op 3,074 µg/mL. Voor de populatie niet-sporters ligt deze grens op 1,698 µg/mL. De 631 sporter urinestalen werden at random gekozen uit negatieve routine urinestalen afkomstig van dopinganalyses in het DoCoLab. De populatie sporters bestond hierdoor zowel uit amateurals topsporters. Op deze manier kan de populatie sporters gebruikt worden als representatieve voorstelling van de urinestalen die in het DoCoLab binnenkomen voor dopingcontrole. Aan de hand van de 99% bovengrens die hierboven berekend werd, zal een drempelwaarde van 5 µg/mL gebruikt worden om stalen door te verwijzen naar een IRMS-confirmatie. Deze concentratie ligt iets boven de berekende waarde van 3,074 µg/mL. 34

Figuur 12. Histogram sporters

Figuur 13. Histogram niet-sporters

35

Op deze manier dienen er minder vals positieven geconfirmeerd te worden via de intensieve tijdrovende IRMS procedure. Er worden immers piekconcentraties tot meer dan 100 µg/mL gedurende minstens 10u verwacht na AICAR inname als dopingproduct. (5) Dergelijke concentraties liggen ver boven de drempelwaarde van 5 µg/mL en zullen dus zeker doorverwezen worden naar de IRMS. Een gelijkaardige studie van Thomas et al. berekende een 99% bovengrens van 6,9 µg/mL. Dit verschil in bovengrens kan mogelijks te wijten zijn aan een verschil in samenstelling van de populatie. Voor deze laatste studie werd er uitsluitend gebruik gemaakt van topsporters (n = 459), in tegenstelling tot dit onderzoek waarbij zowel urinestalen van amateur- als topsporters gebruikt werden om een populatieverdeling bij sporters op te stellen. (5) Recentelijk werd in een andere studie opnieuw de AICAR concentratie in urine bepaald bij een referentiepopulatie. (32) Dit keer in een populatie amateursporters van de Duitse Sport Universiteit in Keulen (n = 499). Deze populatie vertoonde een opmerkelijk lagere gemiddelde concentratie AICAR dan het onderzoek van Thomas et al. (5,32) Een trend die we ook doorheen de populaties van dit onderzoek kunnen terugvinden. Bij Piper et al. werd de referentielimit voor AICAR geplaatst op 3,5 µg/mL. (32) Op basis van de referentielimieten uit beide onderzoeken, blijkt 5 µg/mL een goede referentielimiet te zijn voor een populatie van zowel amateur- als topsporters. Binnen de populatie sporters en niet-sporters werd er een verdere onderverdeling gemaakt voor mannen en vrouwen. De resultaten hiervan zijn terug te vinden in tabel 12 en figuur 14 en 15. Binnen de populatie niet-sporters was bij vier urinestalen het geslacht onbekend. Voor de populatie sporters is er een verschil waar te nemen tussen het gemiddelde bij mannen en vrouwen. Dit verschil is veel minder uitgesproken bij de groep niet-sporters. Ook Thomas et al. en Piper et al. geven een verschil weer in AICAR concentratie tussen mannen en vrouwen. (5,32) Indien er een 99% bovengrens bij sporters berekend wordt rekening houdend met het geslacht (betrouwbaarheidsniveau 95%), wordt een concentratie van 3,486 µg/mL bekomen voor mannen en een concentratie van 2,596 µg/mL bekomen voor vrouwen. Deze concentraties liggen beiden onder de opgestelde drempelwaarde van 5 µg/mL. Deze drempelwaarde kan dan ook voor beide geslachten gebruikt worden.

36

Figuur 14. Histogram sporters: mannen en vrouwen

Figuur 15. Histogram niet-sporters: mannen en vrouwen

37

3.2. Isotopen ratio bepaling van AICAR in urine met GC-C-IRMS 3.2.1. Bepalen van δ15N in AICAR Endogene δ15N – waarden van ureum, urinezuur, hypoxanthine en AICAR werden bepaald in urinestalen (n = 14). De gemeten δ15N – waarden voor AICAR vertoonden een waarde tussen de -3,23‰ en -6,85‰, met een gemiddelde van -4,98‰ en een SD van 1,26‰ (tabel 13). Voor de metabolieten van AICAR, hypoxanthine en urinezuur, werd een gemiddelde van respectievelijk -2,67‰ en -1,39‰ teruggevonden en een SD van 0,51‰ en 0,80‰. Voor de verschillende componenten kan een stijgende trend in δ15N – waarden worden teruggevonden doorheen het metabolisme van AICAR. Ureum wordt gebruikt als ERC. Een gemiddelde van 5,78‰ en een SD van 0,77‰ werd hiervoor terug gevonden (tabel 13). Tabel 13. δ15N – waarden van de referentie populatie

Endogene δ15N – waarden (‰ Sample

Ureum

Urinezuur

Hypoxanthine

AICAR

1

6,09

-0,53

-

-4,96

2

6,60

-1,14

-

-3,23

3

4,40

-1,52

-

-5,77

4

5,56

-1,38

-2,32

-5,89

5

5,40

-1,40

-

-6,85

6

6,02

-1,83

-2,63

-3,72

7

5,93

-1,48

-1,69

-6,69

8

7,01

0,14

-

-5,56

9

5,14

-2,24

-3,06

-

10

5,39

-1,91

-2,63

-

11

-

-

-

-3,40

12

-

-

-

-4,03

13

-

-

-

-4,08

14

-

-2,19

-3,33

-

Gemiddelde

5,78

-1,39

-2,67

-4,98

SD

0,77

0,80

0,51

1,26

38

De ontbrekende δ15N – waarden in tabel 13 konden niet bepaald worden omwille van een te lage concentratie van de component in het staal of omwille van een contaminatie van de component. Wanneer de δ15N – waarden uit tabel 13 vergeleken worden met de δ15N – waarden uit de wetenschappelijke literatuur (figuur 7), blijken enkel de δ15N – waarden van ureum overeen te komen. Dit resultaat kan verklaard worden door de wijze waarop de δ15N – waarden uit de literatuur bepaald werden. Wanneer δ15N – waarden bepaald worden op basis van volledige urine, zal de totale δ15N – waarde het nauwst aansluiten bij de δ15N – waarde van de component die het meeste voorkomt in urine. (26) Aangezien ureum in zeer hoge concentraties aanwezig is in urine (95% van alle stikstof in urine), is het dan ook begrijpelijk dat de δ15N – waarden uit de literatuur nauw aansluiten bij de gemeten δ15N – waarden voor ureum. De δ15N – waarden van AICAR wijken erg veel af van de δ15N – waarden van ureum. Omdat deze component slechts in lage hoeveelheden voorkomt in urine zal dit echter weinig invloed hebben op de totale δ15N – waarde in urine. Omwille daarvan is het mogelijk dat de δ15N – waarden van AICAR erg afwijken van deze beschreven in de literatuur. Verder onderzoek is nodig om deze fractioneringsprocessen verder te bestuderen. Ook verschillende exogene AICAR stalen werden onderzocht. De resultaten van de exogene AICAR stalen zijn weergegeven in tabel 14. De δ15N – waarden voor exogeen AICAR liggen tussen de -2,26 ‰ en de -4,40 ‰. Er werden twee standaarden van verschillende leveranciers getest. De overige twee stalen werden verkregen via de douane. Tabel 14. δ15N – waarden van exogeen AICAR

Exogeen AICAR

δ15N AICAR (‰)

AICAR TRC

-4,40

AICAR Sigma

-2,26

AICAR Douane 1

-3,88

AICAR Douane 2

-3,95

Bovenstaande resultaten geven weer dat het bereik van δ15N – waarden bij endogeen AICAR te nauw aansluit bij het bereik van exogeen AICAR. Aangezien de bekomen δ15N – waarden voor endogene en exogene AICAR zo dicht bij elkaar liggen, is het onmogelijk om bij urinestalen te bepalen of het aanwezige AICAR een endogene of exogene oorsprong heeft. Het gebruik van δ15N – waarden voor de confirmatie van AICAR misbruik is dan ook niet mogelijk. 39

Een IRMS-analyse van de verschillende standaarden wordt weergegeven in figuur 16.

Figuur 16. Chromatogram van de standaarden

3.2.2. Bepalen van δ13C in AICAR 3.2.2.1. Validatie 3.2.2.1.1. Precisie Om de precisie te testen van de IRMS-analyse werd de gemiddelde δ13C – waarde berekend voor urinezuur en AICAR op verschillende concentratieniveaus in water. Per concentratieniveau werden zes stalen gemeten. De resultaten worden weergegeven in tabel 15. Om de precisie te evalueren wordt er voornamelijk gekeken naar de SD. Doorgaans kan bij een IRMS-analyse een SD lager dan 0,3‰ beschouwd worden als zeer goed, een SD rond de 0,5‰ als normaal en een SD boven de 0,8‰ als hoog. Voor AICAR en urinezuur liggen de SD’s rond de 0,5‰, waardoor deze beschouwd kunnen worden als normaal. De totale SD (= 40

reproduceerbaarheid) over de verschillende concentratieniveaus heen is eerder hoog, maar nog steeds binnen de specificaties. Tabel 15. Resultaten precisie IRMS-analyse in water

Laag (n =6) Medium (n = 6) Hoog (n =6) TOTAAL

Urinezuur

AICAR

Concentratie (µg/mL)

100

2

Gemiddelde (‰)

-33,71

-30,74

SD (‰)

0,45

0,68

Concentratie (µg/mL)

100

20

Gemiddelde (‰)

-35,08

-31,63

SD (‰)

0,50

0,33

Concentratie (µg/mL)

100

100

Gemiddelde (‰)

-34,94

-31,96

SD (‰)

0,49

0,41

Gemiddelde (‰)

-34,57

-31,45

SD (‰)

0,78

0,71

Tabel 16. Resultaten precisie IRMS-analyse in urine

AICAR Concentratie (µg/mL)

2

Niveau 1

Gemiddelde (‰)

-30,74

(n = 5)

SD (‰)

0,33

Concentratie (µg/mL)

4

Niveau 2

Gemiddelde (‰)

-31,94

(n = 5)

SD (‰)

0,23

Gemiddelde (‰)

-31,34

SD (‰)

0,69

TOTAAL

Ook werden er urinestalen op verschillende concentratieniveaus aangerijkt met AICAR. Per concentratieniveau werden vijf stalen gemeten. Het gemiddelde en de standaarddeviatie zijn per concentratieniveau weergegeven in tabel 16. Het totale gemiddelde bekomen in water (-31,45‰) ligt erg dicht tegen het gemiddelde bekomen in urine (-31,34‰) en beide SD zijn gelijkaardig. Dit

41

wijst erop dat er geen bijkomende variatie (SD) en fractionering (µ) optreedt bij analyse in echte urinestalen. 3.2.2.1.2. Lineariteit De lineariteit van de IRMS-detector werd zowel bepaald voor AICA als voor urinezuur. Voor AICA werd een bereik van 15 - 90 µg/mL getest. In figuur 17 worden de resultaten weergegeven die bekomen werden voor AICA.

Figuur 17. Lineariteit AICA (15-90 µg/mL)

De IRMS-detector vertoont hoofdzakelijk bij de lage concentraties een erg slechte lineariteit. Wanneer echter de laagste concentraties buiten beschouwing gelaten worden, kan er voor een bereik van 40 – 90 µg/mL een lineariteit van -0,13‰/V terug gevonden worden binnen een bereik van 2 tot 10 V (figuur 18). Binnen dit bereik van 2 tot 10 V wordt slecht een maximale verschuiving in δ13C – waarden van 1,12‰ waargenomen. Indien er pieken bekomen worden die niet tussen 2 tot 10 V liggen zal het staal verdund of geconcentreerd moeten worden om een optimale lineariteit te behouden.

42

Figuur 18. Lineariteit AICA (40-90 µg/mL)

Voor urinezuur werd de lineariteit bepaald binnen een concentratiebereik van 40 – 320 µg/mL. In figuur 19 worden de resultaten hiervan weergegeven. Ook bij urinezuur vertonen de laagste concentraties een eerder slechte lineariteit. Wanneer deze concentraties buiten beschouwing gelaten worden, kan er voor een bereik van 140 – 320 µg/mL een lineariteit van -0,003‰/V terug gevonden worden binnen een bereik van 2 – 25 V (figuur 20). Binnen dit bereik van 2 tot 25 V wordt slechts een maximale verschuiving in δ13C – waarden van 0,75‰ waargenomen. Indien de pieken niet binnen het bereik van 2 tot 25 V vallen moet het staal verdund of geconcentreerd worden om een optimale lineariteit te behouden. Naar analogie met AICA zal er voor urinezuur echter ook gewerkt worden met en bereik van 2 – 10 V.

Figuur 19. Lineariteit urinezuur (40-320 µg/mL)

43

Figuur 20. Lineariteit urinezuur (140-320 µg/mL)

3.2.2.2. Bepalen van δ13C Aangezien δ15N – waarden niet voldoende het onderscheid tussen exogene en endogene AICAR kunnen maken, werd er gezocht naar een alternatieve methode om exogeen en endogeen AICAR te differentiëren. Een mogelijkheid hiervoor is het bepalen van de δ13C – waarde van AICAR, naar analogie met testosteron. Om de δ13C – waarde van AICAR te bepalen werden er enkele aanpassingen aangebracht in de staalvoorbereiding van de δ15N – methode. Het bepalen van de δ13C – waarde van AICAR vertoont immers extra moeilijkheden, zoals reeds beschreven werd in de inleiding. Om de molecule op GC te kunnen brengen dient deze eerst gederivatiseerd te worden. Bij de δ13C – methode wordt AICAR gederivatiseerd met MSTFA in plaats van MTBSTFA. Het koppelen van MSTFA aan AICAR zorgt voor de introductie van extra koolstofatomen met een andere CIR. MSTFA introduceert echter minder koolstofatomen dan MTBSTFA en is dan ook een geschikter derivatisatiereagens. Een correctiefactor dient toegepast te worden voor elk koolstofatoom dat toegevoegd wordt aan de molecule. In tegenstelling tot steroïden is het voor AICAR niet mogelijk de ongederivatiseerde vorm op GC-C-IRMS te brengen. Om een correctiefactor te berekenen werd er daarom gebruik gemaakt van androsteron. Androsteron werd zowel in gederivatiseerde als in niet-gederivatiseerde vorm meermaals op GCC-IRMS gebracht, vervolgens werd de δ13C – waarde bepaald. Op basis van de gemiddelden die bekomen werden, kon een correctiefactor berekend worden. Onderstaande formule kan hiervoor gebruikt worden. (22) 44

𝑛𝑐𝑑 𝛿 13𝐶𝑐𝑑 = 𝑛𝑐 𝛿 13𝐶𝑐 + 𝑛𝑑 𝛿 13𝐶𝑑𝑐𝑜𝑟𝑟 Uit bovenstaande vergelijking kan een nieuwe vergelijking gevormd worden, waarmee vervolgens de correctiefactor bepaald kan worden. 𝛿 13𝐶𝑑𝑐𝑜𝑟𝑟 =

(𝑛𝑐𝑑 𝛿 13𝐶𝑐𝑑 − 𝑛𝑐 𝛿 13𝐶𝑐 ) 𝑛𝑑

In bovenstaande vergelijkingen staat n voor het aantal koolstofatomen, δ13C voor de CIR, d voor het derivatisatie reagens, cd voor de gederivatiseerde component, c voor de ongederivatiseerde component en dcorr voor de gederivatiseerde groep en het kinetisch isotoop effect. Ongederivatiseerd androsteron bevat 19 koolstofatomen, MSTFA bevat 3 koolstofatomen en gederivatiseerd androsteron bevat 22 koolstofatomen. Ongederivatiseerd androsteron heeft een gemiddelde δ13C-waarde van -33,20 ‰ (n = 7). Gederivatiseerd androsteron heeft een gemiddelde δ13C-waarde van -37,29 ‰ (n = 7). Op basis van deze δ13C – waarden kan een correctiefactor voor MSTFA als derivatisatiereagens bepaald worden. Deze correctiefactor bedraagt -63,18‰. Tabel 17. Aantal koolstofatomen in urinezuur en AICA

Urinezuur

AICA

ncd

17

16

nc

5

4

nd

12

12

Wanneer de correctiefactor bepaald werd, kan de vergelijking opnieuw herschikt worden, om zo vervolgens de δ13C-waarde van de ongederivatiseerde testcomponenten te bepalen. (𝑛𝑐𝑑 𝛿 13𝐶𝑐𝑑 − 𝑛𝑑 𝛿 13𝐶𝑑𝑐𝑜𝑟𝑟 ) 𝛿 𝐶𝑐 = 𝑛𝑐 13

Het is belangrijk hierbij te onthouden dat AICAR tijdens de staalvoorbereiding behandeld werd met het enzym PNP om zo reeds verschillende polaire groepen af te zonderen. Op deze manier werd het ribose deel van de molecule verwijderd en verloor AICAR reeds vijf van de negen koolstofatomen. Het aantal koolstofatomen in AICA en urinezuur is terug te vinden in tabel 17. Ook het aantal koolstofatomen geïntroduceerd door derivatisatie en het aantal koolstofatomen in de gederivatiseerde componenten worden weergegeven in deze tabel. De verhouding koolstofatomen van de ongederivatiseerde component ten opzichte van de koolstofatomen 45

geïntroduceerd door derivatisatie is erg belangrijk voor het bepalen van de δ13C – waarden. Immers hoe groter het aandeel van de koolstofatomen geïntroduceerd door derivatisatie, hoe meer invloed de correctiefactor zal uitoefenen op de berekening van de δ13C – waarde van de ongederivatiseerde component en hoe groter de variatie op de (berekende) δ13C – waarde van de ongederivatiseerde component. Het gemiddelde en de SD van de endogene δ13C – waarden van AICA en urinezuur worden weergegeven in tabel 18 (n =17). In de kolom ‘Gederivatiseerd’ worden de resultaten weergegeven die bekomen werden via IRMS. In de kolom ‘Gecorrigeerd’ worden de resultaten weergeven die bekomen werden na toepassen van de correctiefactor. Tabel 18. δ13C – waarden van de referentie populatie

Endogene δ13C-waarden (‰) (n = 17)

Gederivatiseerd

Gecorrigeerd

Urinezuur

AICA

Urinezuur

AICA

Gemiddelde

-33,96

-35,76

36,14

46,48

SD

1,26

0,67

4,30

2,67

Minimum

-35,03

-37,50

32,53

39,52

Maximum

-30,61

-34,98

47,55

49,60

Bij exogene AICAR werd ook de δ13C – waarde bepaald. Dezelfde stalen werden getest als bij de δ15N – bepaling. Ook hierbij moest een correctiefactor worden toegepast. De δ13C – waarden zijn weergegeven in tabel 19. Tabel 19. δ13C – waarden van exogeen AICAR

δ13C-waarde (‰) Exogeen AICAR

Gederivatiseerd

Gecorrigeerd

AICAR TRC

-29,67

70,87

AICAR Sigma

-27,79

78,38

AICAR Douane 1

-29,31

72,30

AICAR Douane 2

-31,69

62,77

In tabel 18 en 19 worden de gecorrigeerde δ13C – waarden weergegeven, zowel voor endogeen als voor exogeen AICAR. Voor endogeen AICAR liggen de gecorrigeerde δ13C – waarden tussen 39,52‰ en 49,60‰. Deze waarden zijn onrealistisch voor humane biomoleculen, zoals ook kan 46

worden terug gevonden in figuur 7. Deze onrealistische resultaten wijzen erop dat het gebruik van een correctiefactor berekend via androsteron geen correcte resultaten oplevert. Vermoedelijk is de molecule androsteron te verschillend van de moleculen in deze analyse om een correctiefactor te kunnen berekenen. Een mogelijk alternatief zou het opstellen van een correctiefactor rechtstreeks via AICAR met behulp van een elemental analyzer – isotopen ratio massa spectrometer (EA – IRMS) kunnen zijn. Deze techniek resulteerde immers wel in realistische waarden voor humane biomoleculen bij Piper et al. (32) Een tweede probleem in de methode is de grote variatie die optreedt bij het corrigeren van δ13C – waarden. AICA en urinezuur bezitten respectievelijk slechts 4 en 5 koolstofatomen, door het derivatiseren worden er echter 12 koolstofatomen geïntroduceerd in de moleculen. Proportioneel gezien werden er dus erg veel koolstofatomen geïntroduceerd, wat resulteerde in een erg grote invloed van de correctiefactor met extra variatie in δ13C – waarden tot gevolg. Tot slot is er slechts een klein verschil waar te nemen tussen de δ13C – waarden van gederivatiseerd endogeen en exogeen AICAR. Alles bij elkaar zorgt dit ervoor dat deze methode onder de huidige vorm niet bruikbaar is voor de confirmatie van AICAR. Verder onderzoek is dan ook nodig om een methode op te stellen die wel geschikt is voor detecteren van exogeen AICAR.

47

4. Algemeen besluit Tijdens deze masterproef werd getracht een dopinganalyse op te stellen voor AICAR. Gedurende het eerste deel werd een LC-MS/MS methode ontwikkeld en gevalideerd voor een kwantitatieve bepaling van AICAR in urine. Bij 888 urinestalen werd de concentratie AICAR bepaald (631 sporters, 257 niet-sporters). Aan de hand van de gemeten concentraties werd een 99% bovengrens opgesteld voor AICAR. Voor de populatie sporters bevond deze bovengrens zich op 3,074 µg/mL, voor de populatie niet-sporters bevond deze bovengrens zich op 1,698 µg/mL. Op basis van deze resultaten werd een referentielimiet van 5 µg/mL vast gelegd, die als drempelwaarde gebruikt kan worden om verdachte stalen door te verwijzen naar een IRMS-confirmatie. Gedurende het tweede deel van deze masterproef werd getracht om een IRMS methode te ontwikkelen voor AICAR. Tijdens een eerste fase werd een methode opgesteld op basis van stikstofisotopen. De eerste resultaten toonden echter aan dat de δ15N – waarden van endogeen AICAR te grote overlap vertonen met de δ15N – waarden van exogeen AICAR om een besluit te kunnen vormen over de oorsprong. Confirmatie van AICAR-misbruik was dan ook niet mogelijk op basis van stikstofisotopen. Vervolgens werd de methode voor stikstofisotopen omgevormd naar een methode voor koolstofisotopen. Ook deze methode vertoonde echter problemen. Na toepassen van een correctiefactor berekend via androsteron werden onrealistische δ13C – waarden bekomen. Om de δ13C – waarden op een goede manier te kunnen corrigeren dient een correctiefactor op een andere wijze berekend te worden dan via androsteron. Verder werden er door het derivatiseren van de molecule 12 koolstofatomen geïntroduceerd, terwijl AICA en urinezuur respectievelijk slechts 4 en 5 koolstofatomen bezitten. Het invoeren van een grotere hoeveelheid koolstofatomen dan er oorspronkelijk aanwezig was resulteerde in extra variatie in δ13C – waarden. Tot slot werd er slechts een klein verschil waargenomen tussen de δ13C – waarden van exogeen en endogeen AICAR. Er kan dan ook besloten worden dat de methode onder zijn huidige vorm niet geschikt is voor de confirmatie van AICAR in dopinganalyse.

48

5. Referentielijst 1.

World Anti-Doping Agency. http://www.wada-ama.org/en/ (12/11/2013)

2.

World Anti-Doping Agency. The 2014 Prohibited List. http://www.wada-ama.org/Documents/World_AntiDoping_Program/WADP-Prohibited-list/2014/WADA-prohibited-list-2014-EN.pdf (12/11/2013)

3.

Cawley AT, Flenker U. The application of carbon isotope ratio mass spectrometry to doping control. J mass Spectrom. 2008;43:854–64.

4.

Thevis M, Thomas A, Kohler M. Emerging drugs: mechanism of action, mass spectrometry and doping control analysis. J Mass Spectrom. 2009;44(4):442–60.

5.

Thomas A, Beuck S, Eickhoff JC, Guddat S, Krug O, Kamber M, Schänzer W, Thevis M. Quantification of urinary AICAR concentrations as a matter of doping controls. Anal Bioanal Chem. 2010;396(8):2899–908.

6.

Dixon R, Gourzis J, McDermott D, Fujitaki J, Dewland P, Gruber H. AICA-Riboside : safety, tolerance and pharmacokinetics of a novel adenosine-regulating agent. J Clin Pharmacol. 1991;31:342–7.

7.

Daignan-Fornier B, Pinson B. 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranosyl 5’-monophosphate (AICAR), a highly conserved purine intermediate with multiple effects. Metabolites. 2012;2(4):292–302.

8.

Dixon R, Fujitaki J, Sandoval T, Kisicki J. Acadesine (AICA-Riboside): disposition and metabolism of an adenosine-regulating agent. J Clin Pharmacol. 1993;33:955–8.

9.

Narkar V a, Downes M, Yu RT, Embler E, Wang Y-X, Banayo E, Mihaylova MM, Nelson MC, Zou Y, Juguilon H, Kang H, Shaw RJ, Evans RM. AMPK and PPARdelta agonists are exercise mimetics. Cell. 2008;134(3):405–15.

10.

Fischetto G, Bermon S. From gene engineering to gene modulation and manipulation: can we prevent or detect gene doping in sports? Sports Med. 2013;43(10):965–77.

11.

Thevis M, Geyer H, Thomas A, Schänzer W. Trafficking of drug candidates relevant for sports drug testing: detection of non-approved therapeutics categorized as anabolic and gene doping agents in products distributed via the Internet. Drug Test Anal. 2011;3(5):331–6.

12.

Ettre L. Nomenclature for chromatography ( IUPAC Recommendations 1993 ). Pure Appl Chem. Blackwell Science Ltd; 1995;65(4):819–72.

13.

Guddat S, Solymos E, Orlovius A, Thomas A, Sigmund G, Geyer H, Thevis M, Schänzer W. Highthroughput screening for various classes of doping agents using a new “dilute-and-shoot” liquid chromatography-tandem mass spectrometry multi-target approach. Drug Test Anal. 2011;3(11-12):836–50.

14.

Boyd R, Basic C, Bethem RA. Trace quantitative analysis by mass spectrometry. JW& son's; 2008.

15.

Banerjee S, Mazumdar S. Electrospray ionization mass spectrometry: a technique to access the information beyond the molecular weight of the analyte. Int J Anal Chem. 2012;2012:282574.

16.

Quadrupole & triple quadrupool mass analysis. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html (11/03/2014)

17.

Deventer K, Pozo OJ, Verstraete AG, Van Eenoo P. Dilute-and-shoot-liquid chromatography-mass spectrometry for urine analysis in doping control and analytical toxicology. Trends Anal Chem. 2014;55:1– 13.

18.

Janssens G, Courtheyn D, Mangelinckx S, Prevost S, Bichon E, Monteau F, De Poorter G, De Kimpe N, Le Bizec B. Use of isotope ratio mass spectrometry to differentiate between endogenous steroids and synthetic homologues in cattle: a review. Anal Chim Acta. 2013;772:1–15.

19.

Metges CC, Petzke KJ. Measurement of 15N/14N isotopic composition in individual plasma free amino acids of human adults at natural abundance by gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry. Anal Biochem. 1997;247(1):158–64.

20.

Muccio Z, Jackson GP. Isotope ratio mass spectrometry. Analyst. 2009;134(2):213–22.

49

21.

Van Renterghem P, Polet M, Brooker L, Van Gansbeke W, Van Eenoo P. Development of a GC/C/IRMS method--confirmation of a novel steroid profiling approach in doping control. Steroids. 2012;77(11):1050– 60.

22.

Piper T, Mareck U, Geyer H, Flenker U, Thevis M, Platen P, Schänzer W. Determination of 13 C / 12 C ratios of endogenous urinary steroids : method validation , reference population and application to doping control purposes. 2008;(1):2161–75.

23.

Nardoto GB, Silva S, Kendall C, Ehleringer JR, Chesson L a, Ferraz ESB, Moreira MZ, Ometto JPHB, Martinelli LA. Geographical patterns of human diet derived from stable-isotope analysis of fingernails. Am J Phys Anthropol. 2006;131(1):137–46.

24.

USGS. You are what you eat. http://wwwrcamnl.wr.usgs.gov/isoig/projects/fingernails/results/interpretdata.html

25.

Kelly JF. Stable isotopes of carbon and nitrogen in the study of avian and mammalian trophic ecology. Can J Zool. 2000;27:1–27.

26.

Kuhnle GGC, Joosen AMCP, Kneale CJ, O’Connell TC. Carbon and nitrogen isotopic ratios of urine and faeces as novel nutritional biomarkers of meat and fish intake. Eur J Nutr. 2013;52(1):389–95.

27.

Cawley A, Collins M, Kazlauskas R, Handelsman DJ, Heywood R, Longworth M, Arenas-Queralt A. Stable isotope ratio profiling of testosterone preparations. Drug Test Anal. 2010;2(11-12):557–67.

28.

Bzowska a, Kulikowska E, Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects. Pharmacol Ther. 2000;88(3):349–425.

29.

McCutchan Jr JHJ, Lewis WMJ, Kendall C, Mcgrath CC. Variation in trophic shift for stable isotope ratios of carbon, nitrogen, and sulfur. Oikos. 2003;2:378–90.

30.

Carter JF, Barwick VJ. Good practice guide for isotope ratio mass spectrometry. FIRMS. 2011.

31.

Solberg HE. RefVal: a program implementing the recommendations of the Interantional Federation of Clinical Chemistry on the statistical treatment of reference values. 1995;48:247-256.

32.

Piper T, Thomas A, Baume N, Sobolevsky T, Saugy M, Rodchenkov G, Schänzer W, Thevis M. Determination of 13 C / 12 C ratios of endogenous urinary 5- aminoimidazole-4-carboxamide 1 β -Dribofuranoside ( AICAR ). Rapic Commun Mass Spectrom. 2014;28(11):1194-1202.

50