UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2009-2010
DE ROL VAN EFFLUXPOMPEN BIJ REFRACTAIRE EPILEPSIE AAN DE HAND VAN EEN KINETISCH MODEL VOOR 11
C-DESMETHYLLOPERAMIDE
Sarah RAEMDONCK Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. Apr. Filip De Vos Commissarissen Prof. J. Van Bocxlaer Dr. B. De Geest
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2009-2010
DE ROL VAN EFFLUXPOMPEN BIJ REFRACTAIRE EPILEPSIE AAN DE HAND VAN EEN KINETISCH MODEL VOOR 11
C-DESMETHYLLOPERAMIDE
Sarah RAEMDONCK Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. Apr. Filip De Vos Commissarissen Prof. J. Van Bocxlaer Dr. B. De Geest
AUTEURSRECHT “De auteur en promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
1 juni 2010
Promotor Prof. dr. Apr. Filip De Vos
Auteur Sarah Raemdonck
DANKWOORD
Graag wil ik Prof. dr. Apr. Filip De Vos bedanken om mij de kans te geven om alle experimenten in zijn laboratorium uit te voeren en het ter beschikking stellen van de gebruikte materialen en methoden. Verder wil ik mijn dank betuigen aan Lieselotte Moerman omdat haar deur altijd voor mij openstond. Uiteindelijk zou ik graag mijn ouders vermelden voor hun steun tijdens mijn masterproef.
INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING
1
1.1. EPILEPSIE
1
1.2. DE ATP BINDING CASSETTE (ABC) DRUG EFFLUXTRANSPORTERS
2
1.2.1. Multidrug Resistance type 1 P-glycoproteïne (ABCB1)
3
1.2.2. De Multidrug Resistentie Proteïnes
4
1.2.3. Breast Cancer Resistance Proteïne (BCRP)
5
1.3. VERMINDERDE CONCENTRATIE VAN AED‟S IN DE HERSENEN ALS MOGELIJKE OORZAAK VAN REFRACTAIRE EPILEPSIE
6
1.3.1. Overexpressie van effluxtransporters in refractair hersenweefsel
6
1.3.2. Anti-epileptische geneesmiddelen die substraten zijn voor de effluxtransporters 1.4. POSITRON EMISSIE TOMOGRAFIE
6 9
1.4.1. Techniek
9
1.4.2. Tracers
11
1.4.2.1.
18
11
1.4.2.2.
Tracers voor studie P-gp effluxpompen
11
F-FDG
1.5. BEELDVORMING MET MAGNETISCHE RESONANTIE
13
1.6. EPILEPTISCHE RATTEN ALS DIERMODEL
14
1.7. KINETISCHE MODELLERING
15
2. OBJECTIEVEN
16
3. MATERIAAL EN METHODEN
17
3.1. GEBRUIKTE TECHNIEKEN
17
3.1.1. UV-spectrofotometer
17
3.1.2. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
17
3.1.3. Gamma counter
18
3.2. SYNTHESE EN KWALITEISTCONTROLE VAN 11
C-DESMETHYLLOPERAMIDE
18
3.2.1. Synthese van 11CH4 in het cyclotron
19
3.2.2. Synthese van11CH3I
19
3.2.3. Synthese en opzuivering van 11C-dLop
20
3.3. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ WILD-TYPE EN P-GLYCOPROTEINE KONCK-OUT MUIZEN
21
3.3.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring
21
3.3.2. Metabolietenstudies
21
3.3.3. PET scan
21
3.3.4. Standardized Uptake Values (SUV’s)
22
3.3.5. Kinetisch model
22
3.3.6. Vergelijken van de ROI op de 11C-scan met de bloedcounter data 3.4. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ SPRAGUE DAWLEY RATTEN
23 24
3.4.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring
24
3.4.2. Metabolietenstudies
24
3.4.3. PET scan
24
3.4.4. Scoren van epileptische ratten
25
3.5. STATISTISCHE ANALYSE
25
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE
26
4.1. SYNTHESE EN KWALITEISCONTROLE VAN 11
C-DESMETHYLLOPERAMIDE
26
4.2. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ WILD-TYPE MUIZEN EN P-GLYCOPROTEINE KNOCK-OUT MUIZEN
26
4.2.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring
26
4.2.2. Metabolietenstudies
28
4.2.3. Arteriële input curves
30
4.2.4. PET beelden
33
4.2.5. SUV’s
34
4.2.6. Kinetisch model
35
4.3. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ SPRAGUE DAWLEY RATTEN
37
4.3.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring
37
4.3.2. Metabolietenstudies
38
4.3.3. Kinetisch model en PET scan
39
4.3.4. Scoren van epileptische ratten
41
5. CONCLUSIES
43
6. LITERATUURLIJST
45
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN Acetonitrile
ACN
Adenosine Trifosfaat
ATP
Adenosine Trifosfaat Binding Cassette
ABC
Anti-epileptisch middel
AED
Bloed-hersen barrière
BBB
Breast cancer resistance protein
BCRP
Cerebrospinaal vocht
CSF
Computertomografie
CT
Covariantie
COV
Cytochroom P enzym
CYP
Desmethylloperamide
dLop
Dimethylformamide
DMF
Dimethylsulfoxide
DMSO
Driedimensionele
3D
Fluorodesoxyglucose
FDG
Glycosylatie
GS
High Performance Liquid Chromatography
HPLC
Knock-out
KO
Magnetic Resonance Imaging
MRI
Messenger ribonucleïnezuur
mRNA
Methyl
Me
Muis behandeld met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine
CYCLO
Muis behandeld met fysiologische oplossing
FYSIO
Multidrug resistance protein
MRP
Normal Phase
NP
Nuclear Magnetic Resonance
NMR
Nucleotide bindend domein
NBD
P-glycoproteïne
P-gp
Positron emissie tomografie
PET
Region Of Interest
ROI
Retentietijd
RT
Reverse Phase
RP
Standaarddeviatie
SD
Standardized uptake value
SUV
Transmembranaire domein
TMD
Transmembranaire lus
TML
Transmembranaire segment
TMS
Transport deficiënte-ratten
TR-
Ultraviolet
UV
Waterstof
H
Wild-type
WT
1. INLEIDING 1.1. EPILEPSIE Epilepsie is een neurologische aandoening die ongeveer 1 tot 2% van de bevolking treft. Het is een chronische en vaak progressieve hersenaandoening gekarakteriseerd door periodieke en onvoorspelbare epileptische aanvallen. Een epileptische aanval wordt gekenmerkt door een abnormale excessieve of synchrone activiteit van de neuronen in de hersenen. Deze aanvallen kunnen veralgemeend zijn waarbij beide hersenhemisferen betrokken zijn of partieel waarbij de oorsprong zich situeert in één of meerdere delen van één van beide hemisferen. Het meest voorkomend getroffen deel in de hersenen is de temporale lob (Löscher & Potschka, 2002; Duncan et al., 2006). Bij meer dan 30% van de patiënten met epilepsie worden de aanvallen onvoldoende onder controle gehouden met een geneesmiddelbehandeling (Kwan & Brodie, 2000; Kwan & Sander, 2004; Dedeurwaerdere et al., 2007). Dit wordt gedefinieerd als farmacoresistente, refractaire of hardnekkige epilepsie, die geassocieerd wordt met verhoogde morbiditeit en mortaliteit. Patiënten met refractaire epilepsie ondervinden geen effect van behandeling, waarbij aanvallen periodiek blijven terugkomen ondanks een therapie met verschillende antiepileptische middelen (AED‟s) (Kwan & Brodie, 2005).
Bij deze epileptische
patiënten is de kans dat een tweede AED, na het falen van een eerste, de aanvallen zal controleren 10% of lager (Kwan & Brodie, 2000; Löscher & Potschka, 2002; Kwan & Sander, 2004). De kennis van de mogelijke onderliggende symptomen die tot deze vorm van epilepsie leiden blijft ontoereikend. Dit bemoeilijkt het eenduidig definiëren van refractaire epilepsie (Regesta & Tanganelli, 1999). Enkele klinische symptomen worden geassocieerd met het optreden van refractaire epilepsie, zoals het optreden van aanvallen in het eerste levensjaar en een hoge frequentie van aanvallen voor en tijdens de behandeling. Bovendien worden ook het type aanvallen, hersenschade en de ernst ervan geassocieerd met refractaire epilepsie (Regesta & Tanganelli, 1999; Kwan & Brodie, 2000). De oorzaak van farmacoresistente epilepsie lijkt multifactorieel en variabel te zijn en kan zowel genetische als omgevingsfactoren inhouden. Drie algemene oorzaken kunnen zijn: (1) overexpressie van effluxtransporters in de hersenen waardoor er een 1
verminderde concentratie is van AED‟s, (2) structurele afwijkingen van de hersenen en (3) verandering van het neuronale netwerk, maar ook de functie en samenstelling van receptoren waarop AED‟s inwerken (Kwan & Brodie, 2005). De eerste hypothese steunt op een mechanisme waarbij AED‟s met verschillende structuren via hetzelfde principe uit de hersenen worden weggepompt. Dit kan een verklaring zijn waarom refractaire epilepsiepatiënten resistent zijn voor heel wat AED‟s met een verschillend werkingsmechanisme (Kwan & Brodie, 2005). 1.2. DE ATP BINDING CASSETTE (ABC) DRUG EFFLUXTRANSPORTERS Vooraleer stoffen de hersenen kunnen binnenkomen moeten ze de bloed-hersen barrière (BBB) of de barrière tussen bloed en cerebrospinaal vocht passeren (CSF). Deze
anatomische
barrières
worden
gevormd
door
dicht
aaneengesloten
endotheelcellen die via tight junctions met elkaar verbonden zijn (Betz et al., 1994; Pardridge, 1999; Schinkel & Jonker, 2003). De penetratie van hydrofiele, polaire, proteïne gebonden of componenten met hoog moleculair gewicht wordt hierdoor beperkt. Andere stoffen zoals apolaire, niet ionische, sterk hydrofobe stoffen kunnen makkelijk doorheen de BBB penetreren via passieve diffusie (Potschka & Löscher, 2001; Löscher & Potschka, 2002). Efflux van stoffen uit de hersenen kan naast passieve diffusie ook via carrier gemedieerd transport (Pardridge, 1999; Spector, 2000). Multidrug transporters van de Adenosine Trifosfaat (ATP)- Binding Cassette (ABC) superfamilie in de endotheliale cellen van de BBB spelen daarbij een belangrijke rol. De ABC effluxtransporters zijn transmembranaire glycoproteïnen die een verscheidenheid aan lichaamsstoffen, geneesmiddel conjugaten en metabolieten uit de cellen kunnen pompen. Deze effluxtransporters beschermen de cellen en weefsels tegen natuurlijk voorkomende
toxines
en
xenobiotica
door
hun
transport
uit
de
cel
te
vergemakkelijken (Schinkel & Jonker, 2003; Hofmann & Löscher, 2007). Op deze manier beperken ze de accumulatie van lipofiele en andere stoffen in de hersenen (Fromm, 2000; Spector, 2000). De efflux van deze stoffen gebeurt op een actieve, ATP afhankelijke manier en kan dus tegen een concentratiegradiënt gebeuren, doordat de nodige energie geleverd wordt door de hydrolyse van ATP. De belangrijkste proteïnen die tot de ABC effluxtransporters behoren zijn P-
2
glycoproteïne (P-gp), multidrug resistance protein (MRP) en breast cancer resistance protein (BCRP) (Schinkel & Jonker, 2003). 1.2.1. Multidrug Resistance type 1 P-glycoproteïne (ABCB1) Deze drug transporter is initieel ontdekt als een membraantransporter met een belangrijke rol bij resistentie tegen chemotherapeutica in verschillende types van tumoren (Potschka & Löscher, 2001). P-gp is een transmembranair glycoproteïne actief effluxsysteem dat bij de mens gecodeerd wordt door de MDR1 genen en bij knaagdieren door mdr1a en mdr1b genen (Potschka & Löscher, 2001, Kwan & Brodie, 2005). P-gp is een integraal membraanproteïne bestaande uit 2 homologe helften die elk bestaan uit een transmembranair domein bestaande uit 6 segmenten en één nucleotide bindend domein of ABC eenheid (figuur 1.1.) (Kwan & Brodie, 2005). Dit glycoproteïne komt voornamelijk voor ter hoogte van organen met excreterende functie zoals de adrenale cortex, de galkanaaltjes in de lever en de epitheelcellen van de maag. Ook ter hoogte van de endotheelcellen van de capillaire vasculatuur in de testes, de placenta en de BBB heeft P-gp een beschermende functie door zijn apicaal voorkomen (Cordon-Cardo et al., 1989; Beaulieu et al., 1997; Potschka & Löscher, 2001; Schinkel & Jonker, 2003; Kwan & Brodie, 2005). Deze P-glycoproteïnen hebben dus een fysiologische functie in de normale weefsels, namelijk de excretie en/of bescherming van weefsels tegen natuurlijk voorkomende toxines of xenobiotica (Jette et al., 1995; Potschka & Löscher, 2001). Een opvallende eigenschap van P-gp is de verscheidenheid aan substraten die het kan transporteren, waaronder een aantal stoffen die gebuikt worden voor therapeutische doeleinden (Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005a/b; Hoffmann & Löscher, 2007). Deze substraten zijn meestal lineaire of circulaire organische moleculen. De meest efficiënt getransporteerde moleculen zijn ongeladen of zwak basisch, maar ook sommige zure componenten zoals methotrexaat en fenytoïne kunnen getransporteerd worden. De enige gemeenschappelijke dominant van de P-gp substraten is hun amfifiel karakter (Schinkel & Jonker, 2003; Kwan & Brodie, 2005).
3
FIGUUR 1.1. VOORSTELLING VAN DE STRUCTUUR VAN P-GLYCOPROTEINEN (Kwan & Brodie, 2005)
1.2.2. De Multidrug Resistentie Proteïnes In de klasse van MRP‟s kunnen 9 soorten onderscheiden worden (MRP1 tot MRP9). MRP1 bevindt zich voornamelijk ter hoogte van de choroïd plexus epitheliale cellen van de bloed-CSF barrière als een basolaterale effluxtransporter. MRP2 daarentegen bevindt zich apicaal in de celmembraan. De voornaamste substraten van deze twee zijn glutathionconjugaten en organische amfifatische anionen (Löscher & Potschka, 2002; Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005c). MRP3 komt vooral in de nier en darm voor en bevindt zich basolateraal in de celmembraan (Schinkel & Jonker, 2003). MRP4 en MRP5 kunnen zowel apicaal als basolateraal voorkomen (Löscher & Potschka, 2005a). De MRP‟s kunnen op basis van hun structuur onderverdeeld worden in twee groepen (figuur 1.2.). MRP1, MRP2, MRP3 en MRP6 behoren tot de eerste groep en zijn opgebouwd uit drie transmembranaire
domeinen
(TMD).
Het
eerste
TMD
bestaat
uit
vijf
transmembranaire segmenten (TMS) waarbij het amino-uiteinde geglycosyleerd is. Het tweede en derde TMD, elk bestaande uit zes TMS bevatten een nucleotide bindend domein (NBD), waaraan ATP kan gebonden worden. Ze bevatten bovendien een tweede glycosylatie. Tot de tweede groep van MRP‟s behoren MRP4 en MRP5. Deze zijn opgebouwd uit twee TMD bestaande uit zes TMS die telkens een NBD bevat. Ook deze hebben een glycosylatie die zich bevindt ter hoogte van de vierde transmembranaire lus (TML) (Schinkel & Jonker, 2003; Löscher & Potschka, 2005b).
4
1.2.3. Breast Cancer Resistance Proteïne (BCRP) Het BCRP is een subklasse van de ABC familie en zo genoemd omwille van zijn overexpressie in borstkankercellijnen. Er is een overlap tussen de BCRP substraten en deze van P-gp, MRP1 en MRP2. BCRP‟s bevinden zich voornamelijk in de placenta, epitheelcellen van de maag, galkanaaltjes, darmen en de microbloedvaten in de hersenen. Er is dus een grote overeenkomst in weefseldistributie met P-gp waardoor ze ongeveer dezelfde functie hebben (Maliepaard et al., 2001; Schinkel & Jonker, 2003). Het BCRP is opgebouwd uit een transmembranair domein bestaande uit zes transmembranaire segmenten. Het TMD bevat een nucleotide bindend domein en heeft een glycosylatie.
FIGUUR 1.2. SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE GLYCOPROTEINEN VAN DE ABC MULTIDRUG TRANSPORTFAMILIE MET GLYCOSYLATIE (GS) (Löscher & Potschka, 2005c)
5
1.3. VERMINDERDE CONCENTRATIE VAN AED‟S IN DE HERSENEN ALS MOGELIJKE OORZAAK VAN REFRACTAIRE EPILEPSIE De verminderde concentratie van AED‟s in de hersenen is een mogelijke oorzaak van refractaire epilepsie. Daarvoor moet voldaan zijn aan twee voorwaarden: 1) overexpressie van effluxtransporters en 2) AED‟s moeten substraten zijn van P-gp of MRP. 1.3.1. Overexpressie van effluxtransporters in refractair hersenweefsel In vitro studies toonden de overexpressie van de effluxtransporters P-gp, MRP1 en MRP2 aan in bepaalde delen van de hersenen bij patiënten met refractaire epilepsie (Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005a/b). Uit vergelijking van messenger ribonucleïnezuur (mRNA), coderend voor effluxtransporters, afkomstig van hersenweefsel van farmacoresistente en normale patiënten werd door Tischler (2005) een overexpressie van P-gp, MRP1 en MRP2 waargenomen bij het hersenweefsel afkomstig van de refractaire epilepsiepatiënten. Vergelijkbare resultaten
werden
bekomen
uit
immunohistochemische
studies
waarbij
de
overexpressie zich voornamelijk lokaliseerde ter hoogte van het capillair endotheel en de astrocyten (Tischler et al., 1995; Pardridge et al., 1997; Sisodiya et al., 2002). Bovendien treedt bij epileptische aanvallen een verminderde BBB functie op, waardoor
overexpressie
van
P-gp
op
de
astrocyten
als
een
extra
verdedigingsmechanisme kan gezien worden (Potschka & Löscher, 2001; Sisodiya et al., 2002; Löscher & Potschka, 2005a/b/c). De vraag blijft echter of de overexpressie geïnduceerd wordt door epilepsie, AED gebruik, frequente aanvallen of constitutief aanwezig is of veroorzaakt wordt door een combinatie van deze elementen (Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005a/b/c). 1.3.2. Anti-epileptische geneesmiddelen die substraten zijn voor de effluxtransporters Het aantonen of een stof een substraat is voor de effluxtransporters kan gebeuren op verschillende manieren. Deze technieken zijn cellijnen, microdialyse of het gebruik van knock-out muizen of ratten met elk hun voor- en nadelen (Löscher & 6
Potschka, 2002; Kwan & Brodie, 2005). De resultaten bekomen uit deze testen zijn niet altijd éénduidig. Methode 1: cellijnen met effluxtransporters Uit studies blijkt dat carbamazepine geen P-gp substraat is in muizen en bij de mens, terwijl fenytoïne en levetiracetam wel P-gp sustraten zijn in muizen maar niet bij de mens. Bovendien binden deze niet op MRP2 (Baltes et al., 2007b). Natriumvalproaat blijkt ook geen substraat te zijn voor P-gp, MRP1 en MRP2 in tegenstelling tot eerder uitgevoerde studies (Baltes et al., 2007a). In recenter uitgevoerde studies blijkt dat lamotrigine, fenobarbital, levetiracetam en fenytoïne substraten zijn voor P-gp en carbamazepine niet. Bovendien zouden levetiracetam en fenobarbital substraten zijn van MRP‟s (Luna-Tortos et al., 2008). Een overexpressie van effluxtransporters op cellijnen is niet altijd representatief voor de in vivo situatie en moeten daarom met voorzichtigheid benaderd worden (Löscher & Potschka, 2002; Kwan & Brodie, 2005). Methode 2: microdialyse Microdialyse is een in vivo studie waarbij onderzoek wordt gedaan naar de extracellulaire concentratie van AED‟s in de hersenen na toedienen van een P-gp inhibitor. Hierbij werd een verhoogde hoeveelheid fenytoïne en carbamazepine gezien in de hersenen. Dit kan wijzen op actief transport van anti-epileptische geneesmiddelen door effluxtransporters (Potschka & Löscher, 2001; Löscher & Potschka, 2002). Daarnaast blijken felbamaat, lamotrigine en fenobarbital substraten voor P-gp te zijn (Löscher & Potschka, 2002). Het toedienen van P-gp inhibitoren ter verhoging van de AED concentratie in de hersenen kan een nieuwe toepassing zijn in de therapie bij epilepsie (Löscher & Potschka, 2005a/b/c). Er zijn reeds een aantal inhibitoren gekend, die het transport van cytotoxische en andere substraten inhiberen. Tot deze groep behoren verapamil, een calciumkanaalblokker en cyclosporine, een immunosuppressivum die zelf ook substraten zijn waardoor ze competitieve inhibitoren worden genoemd. Ze zorgen naast P-gp inhibitie voor tal van andere effecten en zijn niet selectief voor P-gp. Ze kunnen de farmacokinetiek van gelijktijdig toegediende stoffen beïnvloeden wat een nadelig effect kan hebben bij instellen van therapie (Potschka & Löscher, 2001; 7
Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005a/c). Tot een tweede generatie van P-gp blokkers behoren PSC 883, een cyclosporine analoog, GF 120918 en LY335979. Deze hebben een grotere P-gp inhibirende activiteit en zijn dus zeer effectieve inhibitoren (Schinkel & Jonker, 2003). PSC 833 heeft als nadeel dat het kan inwerken op bepaalde cytochroom P enzymen (CYP) en zo het algemeen metabolisme kan inhiberen of induceren. Een derde generatie van P-gp inhibitoren met als voorbeeld probenecid zijn selectief en oefenen geen invloed uit op het metabolisme. Bovendien wordt probenecid beschouwd als een selectieve MRP1 en MRP2-blokker (Potschka & Löscher, 2001; Löscher & Potschka, 2002; Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005a/c). Methode 3: knock-out muizen en ratten Knock-out (KO) muizen zijn genetisch gemanipuleerd waarbij één of meerdere genen coderend voor effluxtransporters uitgeschakeld zijn. Het gebrek van bepaalde effluxtransporters bij knock-out muizen kan leiden tot compensatiemechanismen zoals de opregulatie van andere transporters (Kwan & Brodie, 2005; Löscher & Potschka, 2005a; Hoffman & Löscher, 2007). De substraten voor MRP2 kunnen onderzocht worden door gebruik te maken van transport deficiënte-ratten (TR-) die natuurlijke mutaties voor MRP2 vertonen. De substraten voor P-gp kunnen onderzocht worden door gebruik te maken van mdr1a (-/-) P-gp knock-out muizen (Löscher & Potschka, 2005a). Hieruit is gebleken dat fenytoïne, fenobarbital, natriumvalproaat en vigabatrine geen substraten voor P-gp zijn in vergelijking met carbamazepine, gabapentine en topiramaat (Sills et al., 2001). Daarnaast is aangetoond dat fenytoïne wel interactie vertoont met MRP2 en natriumvalproaat geen substraat is voor MRP1 en MRP2. Resultaten bekomen via bovenstaande technieken zijn vaak uiteenlopend. Dit kan aan de basis liggen van het feit dat heel wat AED‟s substraten zijn voor de effluxtransporters (Luna-Tortos et al., 2008). Fenytoïne, carbamazepine, fenobarbital, gabapentine en topiramaat kunnen als zwakke substraten van de effluxtransporter Pgp beschouwd worden in tegenstelling tot levetiracetam (Löscher & Potschka, 2005a/b).
8
Uit deze resultaten kan men stellen dat er onduidelijkheid is over het feit of bepaalde AED‟s substraten zijn van P-gp of andere transporters. Er is dus een blijvende noodzaak aan meer studies. 1.4. POSITRON EMISSIE TOMOGRAFIE 1.4.1. Techniek Positron emission tomography (PET) is ontdekt in 1970 (Phelps et al., 1975). PET is een niet-invasieve beeldvormingstechniek die gebruik maakt van externe detectoren om de driedimensionele (3D) distributie en kinetiek van geïnjecteerde componenten in beeld te brengen (Aboagye et al., 2001). De geïnjecteerde stoffen worden gelabeld met een kortlevend positron uitstralend radio-isotoop (Aboagye et al., 2001; Elsinga et al., 2004; van den Hoff, 2005; Kannan et al., 2009). Deze radioisotopen – het “label” – kunnen corresponderende stabiele isotopen vervangen waardoor er een grote klasse aan PET tracers kan gevormd worden waarvan het in vivo gedrag ongewijzigd is in vergelijking met hun natuurlijk voorkomende component (¹²C vervangen door de positron uitstraler ¹¹C). Ook andere chemische elementen kunnen vervangen worden zoals H door
18
F. Dit geeft aanleiding tot tracers waarvan
het chemisch gedrag afwijkend is van de oorspronkelijke substantie. Op deze manier is het mogelijk om tracers te maken met de gewenste eigenschappen (van den Hoff, 2005). De meest gebruikte positron uitzenders zijn
15
O, 13N, 11C en 18F. Deze hebben
een halfleven tussen de 2.05 (15O), 20 (11C) en 109.7 minuten (18F). Door hun korte halfleven moeten de isotopen geproduceerd worden nabij de PET scanner, meestal in het cyclotron (Schnöckel et al., 2009). Bij PET wordt een radioactief gemerkte molecule geïnjecteerd. Deze molecule wordt de tracer genoemd. De radioactieve tracers zijn substanties die gelabeld zijn met een radioactief atoom om de verdeling in weefsels te meten na intraveneuze injectie. De tracers zijn meestal opgebouwd uit twee componenten: (1) een molecule die aan de specifieke target bindt en (2) een radioactief isotoop die de detectie mogelijk maakt (Kannan et al., 2009; Schnöckel et al., 2009). Deze radionucliden ondergaan β+-verval met uitstraling van een positron. Dit is het anti-deeltje van een elektron of een anti-elektron en kan een kleine afstand afleggen in het weefsel vooraleer het annihileert met een beschikbaar elektron. De energie equivalent met deze annihilatie wordt omgezet in twee gamma fotonen met elk een energie van 9
511keV die in tegengestelde richting bewegen. Dit paar van fotonen kan dan gedetecteerd worden (figuur 1.3.). Vervolgens wordt een beeld gevormd afhankelijk van de plaats en de intensiteit van de invallende fotonen op de detector. Er kan zo een statische scan gemaakt worden die de weefseldistributie op een bepaald tijdstip in kaart brengt of een dynamische scan waarbij over een bepaalde tijd een continue serie van scans wordt uitgevoerd (van den Hoff, 2005; Kannan et al., 2009; Schnöckel et al., 2009).
FIGUUR 1.3. PRINCIPE VAN EEN PET SCANNER. LINKS: POSITRON VERVAL MET UITZENDING VAN TWEE GAMMA STRALEN. RECHTS: ANNIHILATIEPLAATS NA INVALLEN TWEE FOTONEN OP DE DETECTOREN (Schnöckel et al., 2009)
De voorbije jaren is er een toegenomen interesse in de PET techniek te wijten aan fundamentele verschillen tussen deze en andere tomografische technieken zoals Computertomografie (CT) en Magnetic Resonance Imaging (MRI). Deze twee laatste methoden maken gebruik van de fysische eigenschappen van het organisme zoals de weefselafhankelijke absorptie van X-stralen bij de CT scan om anatomische structuren zichtbaar te maken. Beelden die bekomen worden via CT of MRI maken het enkel mogelijk om indirecte conclusies te trekken betreffende biologische processen. PET daarentegen detecteert de verdeling en de dynamische herverdeling van specifieke tracers welke de eigenschap hebben specifiek te zijn voor speciale biochemische processen en fysiologische transportstappen. Het geeft een beeld van bijvoorbeeld de werkende hersenen. Bovendien wordt in PET de tracer gebruikt in pico of nanomolaire hoeveelheid in tegenstelling tot CT en MRI waarbij macroscopische hoeveelheden worden gebruikt. CT en MRI kunnen echter wel 10
complementaire informatie geven omdat deze een hoge resolutie hebben in tegenstelling
tot
beeldvorming
gebaseerd
op
radionucliden
die
een
hoge
gevoeligheid heeft, maar een beperkte resolutie (van den Hoff, 2005; Schnöckel et al., 2009). 1.4.2. Tracers 18
1.4.2.1.
F-FDG
De meest gebruikte
18
F gelabelde tracer in onderzoek naar epilepsie is 18F-
fluorodesoxyglucose (18F-FDG).
18
F- FDG is gelijkaardig aan het natuurlijk
voorkomend suiker glucose met de additie van een radioactief fluor atoom. Na injectie van
18
F-FDG volgt het de biochemische route van glucose en wordt
opgenomen in de cellen en gefosforyleerd. Resultaat is dat
18
F-FDG in de cellen
gevangen blijft en zo het glucose gebruik van cellen of bepaalde regio‟s in kaart brengt.
18
F-FDG is echter wel geen specifieke tracer aangezien alle levende cellen
glucose verbruiken (Dedeurwaerdere et al., 2007; Schnöckel et al., 2009).
18
F-FDG
wordt naast het onderzoek naar epilepsie gebruikt voor vele toepassingen zoals de visualisatie van tumoren en inflammatie, neurologische en cardiovasculaire aandoeningen.
18
F-FDG-PET wordt frequent gebruikt bij epileptische patiënten in
parallel met MRI om de epileptische zone te identificeren. Ter hoogte van de epileptische zone is de opname van
18
F-FDG lager dan in andere zones van de
hersenen. 1.4.2.2.
Tracers voor studie P-gp effluxpompen
Een optimaal gelabeld substraat voor het in beeld brengen van P-gp‟s in de hersenen moet aan drie criteria voldoen: (1) selectiviteit voor P-gp, (2) het gevormde signaal moet voldoende groot zijn en (3) het signaal moet radiochemisch zuiver zijn. De selectiviteit van het ligand als substraat voor P-gp is cruciaal. Het derde criterium is noodzakelijk omdat PET geen onderscheid kan maken tussen radioactiviteit afkomstig van het ligand of van metabolieten. De aanwezigheid van deze metabolieten kan nagegaan worden in diermodellen. De eerste tracer getest voor het in vivo in beeld brengen van de P-gp functie was colchicine, een alkaloïd. De opname van colchicine gelabeld met 3H in de methoxy groep van de koolstofring werd bekeken bij immunosuppressieve muizen. 11
Colchicine gevoelige tumoren vertoonden twee maal meer opname van radioactiviteit dan de P-gp positieve of niet gevoelige tumoren. Colchicine blijkt dus nuttig om in vivo resistente tumoren te onderscheiden van geneesmiddel gevoelige op basis van de opname van radiogelabelde P-gp substraten. Daarnaast blijkt ¹¹C-colchicine een bruikbaar radionuclide te zijn voor het in beeld brengen van P-gp functie in menselijke tumoren via PET. Het probleem van ¹¹C-colchicine is dat het een weinig specifieke radiotracer is waardoor kleine veranderingen in P-gp functie moeilijk te detecteren zijn. Na colchicine werd ¹¹C-daunorubicine ontwikkeld als radiotracer voor de niet-invasieve studie van de P-gp functie. Dit is een anti-kanker geneesmiddel en toonde een zestien keer hogere opname in geneesmiddel gevoelige tumorcellen dan in tumoren met een P-gp overexpressie (Elsinga et al., 2004). Een andere tracer ontdekt voor de niet-invasieve studie van P-gp functie is ¹¹C-verapamil. Verapamil is een calciumkanaalblokker dat zowel substraat (in lage concentratie) als inhibitor (in hoge concentratie) is van P-gp. In knock-out (KO) muizen werd een tien maal hogere opname gezien van
11
C-verapamil dan in wild-
type muizen (WT). Ook de opname in normale tumorcellen was hoger dan in cellen met een P-gp overexpressie. ¹¹C-verapamil wordt daarom vaak gebruikt om de P-gp functie te onderzoeken. Deze radiogelabelde stof heeft twee isomeren R en S. Deze isomeren worden op gelijkaardige manier door P-gp getransporteerd. Echter, het R isomeer blijk een betere tracer te zijn voor in vivo studies omdat het een lager metabolisme en lagere affiniteit heeft voor calciumkanalen dan het S isomeer (Elsinga et al., 2004; Kannan et al., 2009). ¹¹C-carvedilol, een β-receptor antagonist, blijkt een betere tracer te zijn dan ¹¹C-verapamil. Carvedilol is minder lipofiel waardoor het minder bindt aan plasmaproteïnen en een betere kinetiek vertoont. ¹¹C-carvedilol bindt selectiever op P-gp en is gevoeliger dan ¹¹C-verapamil. De metabolisatie van ¹¹C-carvedilol naar radioactieve metabolieten kan echter tot misleidende resultaten leiden, maar deze metabolieten zijn hydrofiel waardoor er slechts weinig opname is in de hersenen. De evaluatie van de P-gp functie in de hersenen wordt door deze metabolieten dus minimaal beïnvloed (Elsinga et al., 2004). Loperamide,
een
opiaatreceptor
agonist
en
zijn
metaboliet
N-
desmethylloperamide zijn beide goede substraten van P-gp (figuur 1.4.) (Lazarova et 12
al., 2008; Kannan et al., 2009). ¹¹C-loperamide is omwille van zijn veiligheid en zijn makkelijke radiosynthese een frequent gebruikte radiotracer. N-desmethylloperamide wordt
nu
vaker
gebruikt.
Ook
¹¹C-desmethylloperamide
(11C-dLop)
wordt
gemetaboliseerd door demethylatie met vorming van een enkelvoudige koolstof radiometaboliet zoals ¹¹C-methanol. Deze radiometabolieten kunnen geoxideerd worden en het lichaam verlaten onder de vorm van koolstofdioxide waardoor ze PET niet beïnvloeden. De andere metabolieten kunnen bepaald worden via diermodellen en daarna in rekening gebracht worden (Lazarova et al., 2008).
FIGUUR 1.4. STRUCTUUR VAN LOPERAMIDE MET R1 = R2 = METHYL (Me) EN NDESMETHYLLOPERAMIDE MET R1 = METHYL EN R2 = WATERSTOF (H)
1.5. BEELDVORMING MET MAGNETISCHE RESONANTIE Magnetic Resonance Imaging (MRI) of vroeger ook Nuclear Magnetic Resonance (NMR) genoemd is ontdekt in 1946. MRI is een niet-invasieve techniek die gebruik maakt van de magnetische eigenschappen van een nucleair partikel meestal waterstof (H). De interactie van het partikel met een extern magnetisch veld en radiogolven wordt gebruikt om een gedetailleerd beeld van het lichaam te vormen. Ons lichaam is voor 90% opgebouwd uit waterstofatomen aanwezig in water en vet. Dit atoom is opgebouwd uit een kern met daaromheen elektronenschillen. De kern van dit waterstofatoom bestaat uit een proton dat een positieve lading heeft en om zijn eigen as draait. Deze beweging wordt ook wel de protonspin of de kernspin genoemd. In de normale situatie hebben deze protonen een willekeurige oriëntatie in het lichaam. Het aangebrachte extern magnetisch veld zal de protonen richten volgens de lijn van dit magneetveld (figuur 1.5.). Tijdens het maken van een MRI scan wordt een kortdurende radiogolf of radiofrequentie puls ingeschakeld dat de richting van de protonen verandert. Na 13
uitschakelen van deze puls keren de protonen terug naar hun oorspronkelijke positie. Deze terugkeer zorgt voor uitzending van signalen door het lichaam die kunnen opgevangen worden. De radiofrequentie puls wordt verschillende malen herhaald om voldoende informatie te bekomen. De uitgezonden signalen worden door een computer verwerkt rekening houdend met de plaats waar ze vandaan komen en de sterkte. Het uiteindelijk resultaat is een zwart-wit beeld (Barentsz, 1998).
FIGUUR
1.5.
DE
ORIENTATIE
VAN
DE
WATERSTOFATOMEN
IN
AF-
EN
AANWEZIGHEID VAN EEN EXTERN MAGNETISCH VELD
1.6. EPILEPTISCHE RATTEN ALS DIERMODEL Epileptische diermodellen worden gebruikt om de basismechanismen die leiden tot epilepsie en farmacoresistentie beter te begrijpen. Bovendien kunnen modellen die de chronische hersendysfunctie simuleren en leiden tot epilepsie gebruikt worden in de zoektocht naar nieuwe, efficiëntere geneesmiddelen (Löscher, 2002). Epilepsie kan bij deze ratten geïnduceerd worden door een aantal verschillende stimuli. Deze zijn kaïnaat, pilocarpine (Goodman, 1998; Löscher, 1999) of gebruik makend van elektrische shocken ter hoogte van de amygdala of hippocampus. Kaïnaat is een analoog van glutamaat en pilocarpine is een muscarine agonist. Deze kunnen systemisch geïnjecteerd worden, maar micro-injectie of intraventriculaire injectie zijn ook mogelijk. Meestal worden ze echter intraperitoneaal (IP) geïnjecteerd (Seegers et al., 2002). Het voordeel van kaïnaat en pilocarpine is dat 60% van de dieren een status epilepticus ontwikkeld. De status epilepticus gaat gepaard met ongecontroleerde en onvoorspelbare aanvallen wat gelijkaardig is aan de situatie bij 14
epileptische patiënten. Het nadeel van deze stimuli is dat men voor het evalueren van een aanval moet wachten tot de dieren een aanval doen. Bovendien is het aantal aanvallen per dier zeer verschillend. De chemische of elektrische stimuli zorgen dat een hoog aantal van de dieren spontane aanvallen ontwikkeld na een latentie periode. Een nadeel van elektrische shocken is de hoge mortaliteit gedurende de status epilepticus en de agressiviteit van de overlevenden door destructie van delen van het limbisch systeem. Het voordeel echter van deze methode is dat men de epilepsie kan teweegbrengen wanneer men maar wil (Löscher, 2002). Het toedienen van elektrische impulsen kan niet alleen bij ratten gebeuren maar ook bij muizen, katten en honden waar het ook epilepsie veroorzaakt. Epilepsie die geïnduceerd wordt door elektrische of chemische methoden is zeer gelijkaardig aan de klinische conditie in mensen en is daarom nuttig om te gebruiken (Sato et al., 1990; Löscher, 1999). 1.7. KINETISCHE MODELLERING Een kinetisch model wordt gebruikt om biochemische processen van een tracer in een weefsel (bijvoorbeeld de hersenen) te beschrijven. Het gedrag van de tracer wordt vaak beschreven aan de hand van kinetische compartimenten. Het transport van een molecule van en naar het compartiment kan beschreven worden door eerste-orde kinetiek. Het volledige proces wordt uitgedrukt als een mathematisch model. Met behulp van dit model wordt de hoeveelheid radioactieve concentratie en de snelheid van uitwisseling in elk compartiment bepaald. Voor het opstellen van het kinetisch model zijn een arteriële plasma input curve en de weefsel responscurve nodig. De input functie wordt bekomen via het nemen van bloedstalen, gereconstrueerde beelden van PET of een databese. De PET beelden leveren de radioactieve concentratie in elk compartiment en maken het mogelijk de weefsel responscurve op te stellen. De input curve en weefsel responscurve leveren de data nodig voor het opstellen van een kinetisch model van de tracer en het berekenen van de snelheidsconstanten. Deze leveren de fysiologische parameters die het gedrag van de tracer in het weefsel karakteriseren (van den Hoff, 2005; Watabe et al., 2006).
15
2. OBJECTIEVEN Epilepsie is een neurologische aandoening gekarakteriseerd door epileptische aanvallen. Het grootste probleem bij de behandeling van epilepsie is refractaire epilepsie. Een mogelijke verklaring van refractaire epilepsie is de overexpressie van effluxtransporters, zoals P-glycoproteïnen in de hersenen. Meer inzicht in de Pglycoproteïne functie ter hoogte van de bloed-hersen barrière kan bekomen worden via het opstellen van een kinetisch model voor een tracer die getransporteerd wordt door deze transporters zowel in muizen als in ratten.
11
C-desmethylloperamide wordt
als tracer gebruikt, die reeds in de literatuur vermeld wordt als effectieve tracer voor onderzoek naar P-glycoproteïnen (Lazarova et al., 2008). Om het kinetisch model op te stellen is er een arteriële plasma input curve nodig. Deze input curve kan bekomen worden uit scan beelden na tekenen van een Region Of Interest rond het linkerventrikel van het hart of via arteriële blood sampling met behulp van een bloedcounter. Beide methoden werden reeds in de literatuur beschreven (Green et al., 2004; Convert et al., 2007). Deze date leveren de bloedcurve en deze wordt door correctie voor plasma/volbloed verhouding en metabolieten omgezet tot de plasma input curve. Naast de plasma input curve wordt ook de weefsel activiteitscurve bekomen via tekenen van een ROI rond de hersenen en ingeladen in het kinetisch modelleringsprogramma PMOD. Het best passende kinetisch model met bijhorende parameters kan vervolgens bepaald worden. Het kinetisch model wordt opgesteld bij knock-out muizen, wild-type muizen en wild-type muizen voorbehandeld met cyclosporine ter validatie van de tracer. Het kinetisch model wordt eerst bepaald bij muizen en daarna bij ratten aangezien er geen KO ratten ter beschikking zijn. Vervolgens wordt de P-gp functie geëvalueerd in epileptsiche ratten en gewone ratten. Door vergelijken van de verschillende parameters bekomen uit het kinetisch model kan hopelijk een indicatie of parameter gevonden worden om de expressie van P-gp‟s te bepalen uit het kinetisch model.
16
3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1. GEBRUIKTE TECHNIEKEN 3.1.1. UV-spectrofotometer UV-spectroscopie is een chemische analysetechniek waarbij door meten van de absorbantie van ultraviolet licht (UV-licht) de concentratie van een bepaalde stof in een te analyseren monster bepaald wordt. Sommige chemische stoffen kunnen licht van een bepaalde golflengte van het spectrum absorberen. De absorbantie is recht evenredig met de concentratie van de licht-absorberende stof volgens de wet van Lambert-Beer: A=ε.c.L Waarin:
A: absorbantie ε: molaire extinctie coëfficiënt c: concentratie van de te onderzoeken stof L: afgelegde weg van het licht
3.1.2. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC is een scheidingsmethode waarbij bestanddelen gescheiden worden op basis van hun polariteit en affiniteit. Het is een vorm van vloeistofchromatografie bestaande uit een mobiele fase of het eluens en de stationaire fase of de pakking van de kolom waarover het eluens loopt. De mobiele fase of loopvloeistof wordt bij HPLC onder hoge druk door de sterk gepakte kolom geperst. De hoge druk en goed contact van eluens met de stationaire fase zorgen voor een relatief snelle scheiding en een goede resolutie. Naargelang de affiniteit voor het eluens en de kolom zullen de componenten een bepaalde graad van retentie vertonen. Er bestaan twee vormen van HPLC: (1) Normal Phase (NP) en (2) Reverse Phase (RP). Bij NP is de kolom gevuld met kleine polaire silica deeltjes en is het oplosmiddel apolair zoals bijvoorbeeld hexaan. Polaire verbindingen zullen langer vastgehouden worden door de kolom aan de silica dan de niet polaire verbindingen. De niet polaire moleculen bewegen dus sneller doorheen de kolom en hebben een kortere retentietijd (RT). 17
Bij RP is de silica gewijzigd door toevoeging van lange koolstofketens (C8C18) om de silica minder polair te maken. Het oplosmiddel is polair (water/alcohol). Er zal een sterke aantrekkingskracht zijn tussen het polair oplosmiddel en de polaire verbindingen in het mengsel. De aantrekking tussen de gemodificeerde silica is kleiner en de polaire moleculen zullen mee bewegen met het oplosmiddel. De niet polaire verbindingen zullen zich aangetrokken voelen tot de gemodificeerde silica. Ze vertonen een hogere affiniteit met de kolom en hebben bijgevolg een langere retentietijd. 3.1.3. Gamma counter De gamma counter maakt het mogelijk om radioactiviteit kwantitatief te bepalen. Het detecteert de gamma stralen uitgezonden door een radionuclide en de gamma stralen interageren met een scintillatie kristal dat aanwezig is in de detector. Het scintillatiemateriaal zal door invallen van gamma straling exciteren met vrijkomen van lichtfotonen die door de PMT gedetecteerd wordt en omgezet wordt in een elektrisch signaal dat vervolgens versterkt wordt. Elke invallende straal wordt aldus geregistreerd. 3.2. SYNTHESE EN KWALITEISTCONTROLE VAN 11
C-DESMETHYLLOPERAMIDE
De synthese startte met de aanmaak van ¹¹CH4 in het cyclotron. Het vervolg van de synthese gebeurde met een semi-automatische module in een hotcell (figuur 3.1.).
18
FIGUUR 3.1. SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE WERKING VAN DE
11
C-
MODULE
3.2.1. Synthese van 11CH4 in het cyclotron De synthese van ¹¹CH4 gebeurde uitgaande van 1170 mL
14
N-stikstofgas. Het
cyclotron (Cyclone 18 Twin, IBA) versnelde de protonen die door een flinterdunne aluminiumfolie (500 µm dikte) de target, gevuld met stikstofgas, bereikten. De protonenbundel had een intensiteit van 14 µA en er werd gedurende 30 minuten bestraald. Deze protonen hadden voldoende kinetische energie voor interactie met een 14N-kern met vorming van ¹¹C en een α-deeltje: 14
N + 1p
11
C + 42α
In de target bevond zich niet enkel stikstofgas maar ook een hoeveelheid (5.5%) waterstofgas wat zorgde voor de vorming van ¹¹CH4. Daarnaast werd ¹¹CO2 gevormd door de kleine hoeveelheid zuurstof aanwezig in de target. Het gevormde ¹¹CH4 werd dan met behulp van helium naar de hotcell gebracht voor verdere reactie. Een ander gevormd product was NH3 ontstaan door reactie van waterstofgas en stikstof onder bepaalde druk en bij verhoogde temperatuur. 3.2.2. Synthese van11CH3I Het ¹¹CH4 werd geadsorbeerd in een PoraPak spiraal gekoeld in vloeibaar argon. Het startmateriaal N2 en H2, hadden een veel lager kookpunt dan argon 19
waardoor ze niet vastgehouden werden in de spiraal en deze verlieten door spoelen met heliumgas. Een bijproduct dat werd gevormd, NH3, heeft een vergelijkbaar kookpunt als ¹¹CH4 (respectievelijk -33°C en -164°C), maar werd door P2O5 geïnactiveerd.
Vervolgens
wegdiffundeert. Het
werd
de
spiraal
opgewarmd
waardoor
¹¹CH4
11
CH4 wordt gemengd met jood (ontstaan door I2 kristallen te
verwarmen tot 60°C) en omgezet tot
11
CH3I door reactie in een oven van 600°C.
¹¹CH3I-gas werd vervolgens geadsorbeerd op een PoraPak. Het niet gereageerde ¹¹CH4 onderging deze cyclus opnieuw om het reactierendement op te drijven. Deze cyclus werd beëindigd nadat de activiteit op de PoraPak P gedurende 30 seconden stabiel bleef. 3.2.3. Synthese en opzuivering van 11C-desmethylloperamdie De
PoraPak
werd
opgewarmd
waardoor
het
geadsorbeerde
¹¹CH3I
overgebracht werd naar een ijsgekoeld reactievat. Het reactievat bevatte een mengsel bestaande uit 3 µmol didesmethylloperamideoplossing (60 µL in dimethylformamide (DMF)) als precursor, 188 µL dimethylsulfoxide (DMSO), en 2 µL tetrabutylammoniumhydroxide (TBAH) als base. De reactie ging door bij 30°C gedurende 10 minuten. Hierbij grijpt via een SN2-reactie een N-methylering plaats. Vervolgens werd het reactiemengsel geïnjecteerd op een HPLC C18 kolom (250 x 10 mm, 10 µm) (Grace Smart) met als eluens natriumacetaat 20 mM/ acetonitrile 30/70 (v/v) met een pH van 4.5. De detectie van de componenten uit het reactiemengsel gebeurde met behulp van een radioactiviteitsmeter en een Knauer 2500 UV-spectrofotometer bij 220 nm. De opvangen fractie die ¹¹C-dLop bevatte werd vervolgens aangelengd met 45 mL fosfaatbufferoplossing (PBS (Lonza, Belgium) phoshpated buffered saline: 0.0095M) . Dit mengsel werd over een Alltech Prevail C18-SepPak gestuurd die gepreconditioneerd was met 1 mL ethanol en 10 mL water. De SepPak werd daarna gespoeld met 10 mL water voor injectie en 1 mL ethanol om de tracer af te elueren.
20
3.3. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ WILD-TYPE EN P-GLYCOPROTEINE KNOCK-OUT MUIZEN 3.3.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring WT muizen (n = 3 per tijdspunt) werden geïnjecteerd met 4.80 – 5.55 MBq 11
C-dLop (300 µL) en gedood na 0.5, 1, 2, 3, 5 en 10 minuten. Bloed werd
afgenomen door cardiale punctie en gecentrifugeerd (3000g) gedurende 10 minuten. Plasma werd afgepipetteerd en gemeten op radioactiviteit net zoals de pellet. 3.3.2. Metabolietenstudies WT en KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing of met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine, 30 minuten voor tracerinjectie werden geïnjecteerd met 22.2 MBq 11C-dLop. De muizen (n = 3 per tijdspunt) werden gedood op tijdstippen 1, 10 en 30 minuten na tracerinjectie. Hersenen werden verwijderd en bloed werd via cardiale punctie afgenomen. Plasma (200 µL) werd afgepipetteerd na 6 minuten centrifugatie (3000g). 800 µL en 1 mL acetonitrile werden toegevoegd aan respectievelijk de hersenen en het plasma. Beiden werden gevortext gedurende 1 minuut, 3 minuten gecentrifugeerd (3000g) en de radioactiviteit werd gemeten. Vervolgens werd het supernatans afgepipetteerd en eveneens gecontroleerd op radioactiviteit. De analyse van het supernatans werd uitgevoerd met HPLC. Een Grace Econosphere C18 kolom (250 x 10 mm, 10 µm) werd gebruikt in combinatie met een mobiele fase bestaande uit een mengsel van natriumacetaat 20mM/ acetonitrile 30/70 (v/v) met een pH van 4.5. De flow was ingesteld op 7 ml/min. De geëlueerde fracties werden om de 30 seconden opgevangen en de radioactiviteit werd in de fracties bepaald. 3.3.3. PET scan WT muizen (n = 3 per behandeling) werden iv geïnjecteerd met fysiologische oplossing of 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine, 30 minuten voor tracerinjectie. Vervolgens werd 25.9 MBq
11
C-dLop in een staartvene geïnjecteerd en een
dynamische PET scan werd opgenomen gedurende 30 minuten. Na de ¹¹C-dLop scan werden de muizen geïnjecteerd met 18.5 MBq
18
F-FDG. 20 minuten na deze
injectie werd een statische PET scan gedurende 20 minuten opgenomen. KO muizen (n = 3) werden op dezelfde manier gescand als de WT muizen maar kregen geen 21
voorbehandeling. Gedurende de volledige scan procedure werd de temperatuur van de muizen op 37°C gehouden, de positie van de muizen in de field of view van de camera werd niet gewijzigd. De muizen werden geanesthesieerd met een mengsel van isofluraan (1.5%) en O2. De PET data werden opgedeeld in frames van 12 x 5s, 6 x 10s, 4 x 1m, 2 x 2m, 2 x 5m en 1 x 10m en verder geanalyseerd met het programma PMOD (Zurich). Op de gereconstrueerde beelden bekomen uit de
18
F-FDG-scan werd een
Region Of Interest (ROI) getekend rond het linkerventrikel van het hart. Deze ROI werd gekopieerd naar de opgenomen
11
C-dLop-scan. Deze ROI werd gebruikt voor
de bepaling van de linkerventrikel input functie. Daarnaast werd een ROI getekend rond de hersenen om de weefsel tijd-activiteit curve te bepalen. Vervolgens werd dit ingeladen in de kinetische tool van het programma PMOD (Zurich) en verder geanalyseerd. 3.3.4. Standardized Uptake Values (SUV’s) Voor de tijdsactiviteitscurves van
11
C-dLop in de hersenen gebeurde de
berekening via standardized uptake values (SUV‟s). De SUV‟s werden berekend via volgende formule: SUV = (A x BW) / ID Waarin:
A: verval gecorrigeerde activiteit concentratie in de hersenen in kBq/cc ID: geïnjecteerde dosis van ¹¹C-dLop in kBq BW: lichaamsgewicht van de muis in gram
3.3.5. Kinetisch model Het ideale compartimentele model voor
11
C-dLop werd bepaald door het
testen van een één-compartimenteel en een twee-compartimenteel model. Figuur 3.2.A toont een één-compartimenteel model waarbij K1 en k2 staan voor de snelheid van het transport van het plasma naar de hersenen en de snelheid van outflow van de hersenen naar het plasma. K2 staat voor de combinatie van passieve diffusie en actief transport door effluxtransporters zoals P-gp en MRP. De wiskundige formules 22
verbonden aan deze modellen zijn V1 = K1 x Cplamsa en V2 = k2 x Chersenen. Ondanks het feit dat er geen metabolisatie is van
11
C-dLop in de hersenen (zie 4.2.2.) werd het
twee-compartimenteel model (figuur 3.2.B, met invoering van k3 en k4) toch bekeken omdat interactie van
11
C-dLop in de hersenen mogelijk was. Deze interactie kan
aspecifiek zijn maar ook interactie met opiaatreceptoren is mogelijk. De PMOD software werd gebruikt om de evenwichtsconstanten te bepalen. De hersen tijdactiviteit curves werden gefit aan de modellen door gebruik te maken van de nietlineaire least-square methode. A
K1 Cplasma
Chersenen k2
B
K1 Cplasma
k3 Chersenen
k2
Cgebonden k4
FIGUUR 3.2. SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EEN EEN- (A) EN TWEECOMPARTIMENTEEL MODEL (B) MET EVENWICHTSCONSTANTEN K1, k2, k3 EN k4
3.3.6. Vergelijken van de ROI op de 11C-scan met de bloedcounter data WT muizen werden verdoofd met isofluraan (1.5%)/O2 en een 60 cm lange catheter werd ingebracht (PE10) in de carotis arterie om bloedafname mogelijk te maken. De catheter werd gevuld met fysiologische oplossing. Het uiteinde werd verbonden
met
een
naald
en
spuit
(1
mL).
De
canule
werd
in
de
radioactiviteitsdetector geplaatst en de spuit (1 mL) in de pomp. PET scan en bloedcounter werden gestart voor 30 minuten en 25.9 MBq
11
C-dLop werd
geïnjecteerd. Gedurende 30 minuten vloeide het bloed doorheen de detector met een snelheidsconstante van 10 µL/min. Daarna werd geïnjecteerd met 18.5 MBq 18FFDG in een staartvene. 20 minuten na deze injectie werd gedurende 20 minuten statisch gescand. Gedurende deze procedures waren de dieren onder anesthesie en veranderde hun positie in de field of view niet. 23
3.4. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ SPRAGUE DAWLEY RATTEN 3.4.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring Bij Sprague Dawley ratten (n = 3) werd na injectie van 37 MBq
11
C-dLop in
een staartvene onder verdoving met isofluraan (1.5%)/O2 bloed gecollecteerd door cardiale punctie. De bloedafnames gebeurden op 1, 2.5, 5, 10, 15 en 30 minuten. Het afgenomen bloed werd gewogen en geteld in de Cobra gamma counter. Vervolgens werd het bloed gedurende 6 minuten gecentrifugeerd (3000g). Het bovenstaande plasma werd afgepipetteerd van de onderstaande pellet en de radioactiviteit werd in beide fracties gemeten met de gamma counter. 3.4.2. Metabolietenstudies Sprague Dawley ratten (n = 3 per tijdspunt) werden voorbehandeld met fysiologische oplossing of met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine in een staartvene en na 30 minuten intraveneus (iv) geïnjecteerd met 37 MBq
11
C-
desmethylloperamide. Onder verdoving (isofluraan (1.5%)/O2) werd bij de ratten op 1, 2.5, 5, 10, 15 en 30 minuten na tracerinjectie bloed afgenomen door cardiale punctie. De bloedstalen werden 5 minuten gecentrifugeerd (3000g) en 200 µL plasma werd afgepipetteerd. Aan het plasmastaal werd 200 µL acetonitrile (ACN) toegevoegd en na vortexen werd gedurende 3 minuten gecentrifugeerd (3000g). Vervolgens werd 250 µL van het supernatans verwijderd, aangelengd tot 6 mL water en op een pregeconditioneerde SepPak gebracht. Het preconditioneren van de SepPak gebeurde met 3 mL ethanol gevolgd door 5 mL water. Nadat de vloeistof over de light tC18 SepPak (Waters, USA) was gebracht werd deze gewassen met 3 mL 22/78 (v/v) ACN/H2O en vervolgens afgeëlueerd met 3 mL ethanol. Alle fracties werden geteld in de Cobra gamma counter. 3.4.3. PET scan Bij een Sprague Dawley rat (n = 1) werd onder verdoving met isofluraan (1.5%)/O2 een catheter (PE50) ingebracht in de arteria femoralis om bloedafname mogelijk te maken. Het ene uiteinde van de catheter werd verbonden met een naald en spuit (1 mL). De dieren werden vervolgens naar de PET scanner gebracht waar de canule in de detector werd geplaatst en de spuit (1 mL) in de pomp. PET scan en bloedcounter werden gestart en
11
C-dLop 37 MBq werd iv geïnjecteerd. PET data 24
werden net zoals bij muizen opgedeeld in frames van 12 x 5s, 6 x 10s, 4 x 1m, 2 x 2m, 2 x 5m en 1 x 10m. De data werden verder geanalyseerd met PMOD (Zurich). Het ideale compartimentele model voor
11
C-dLop werd bepaald door testen
van een één- en twee-compartimenteel model (zie 3.3.5. Kinetisch model). 3.4.4. Scoren van epileptische ratten De Racine schaal (RS) is één van de meest frequent gebruikte methoden om de intensiteit van een epileptische aanval in een epileptisch knaagdier model te bepalen. RS bestaat uit 5 intensiteitsniveaus gebasseerd op het gedrag van de dieren gedurende een aanval. De 5 niveaus zijn: 1) mond- en gezichtsbewegingen, 2) knikken met het hoofd, 3) voorpoot clonus, 4) op achterste poten staan en 5) op achterste poten staan en vallen (Lüttjohann et al., 2009) Het scoren van epileptische ratten werd uitgevoerd bij 29 ratten, geïnjecteerd met kaïnaat in november 2009. Het aantal aanvallen fase 4 en 5 volgens de schaal van Racine werd gedurende één dag geobserveerd en genoteerd. Na het scoren werd een homogene groep van epileptische ratten geselecteerd voor verder onderzoek. 3.5. STATISTISCHE ANALYSE Alle berekende parameters, verschillen tussen WT muizen met en zonder cyclosporine en KO muizen werden getest met een tweezijdige ongepaarde Student t-test. De grens van statistische significantie werd vastgelegd op 5% .
25
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. SYNTHESE EN KWALITEISCONTROLE VAN 11
C-DESMETHYLLOPERAMIDE
De radiochemische zuiverheid van
11
C-desmethylloperamide bedraagt meer dan
95%. De specifieke activiteit is gemiddeld 72 GBq/µmol met een aangemaakte hoeveelheid van gemiddeld 925 MBq. 4.2. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ WILD-TYPE EN P-GLYCOPROTEINE KNOCK-OUT MUIZEN 4.2.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring Om het kinetisch model voor
11
C-dLop te bepalen moet de bloed input functie,
bekomen uit het linkerhartventrikel gecorrigeerd worden zodat een plasma input functie bekomen wordt. De bloed input functie wordt daarom gecorrigeerd voor plasma/volbloed verhouding enerzijds en metabolieten anderzijds. De verhouding van de activiteit van
11
C-dLop in het plasma ten opzichte van de activiteit in het bloed
werd hiervoor bepaald. Figuur 4.1. toont de verhouding van plasma op volbloed in functie van de tijd. 0.5 minuut na injectie van 11C-dLop bedraagt deze verhouding van de activiteit in het plasma ten opzichte van radioactiviteit in het bloed 0.64 ± 0.04. Deze ratio neemt vervolgens af tot 0.49 ± 0.06 op tijdstip 1 minuut. Er treedt een stabilisatie op vanaf 3 minuten na injectie van
11
C-dLop. Als gemiddelde ratio tracer
in plasma op tracer in volbloed werd 0.64 bekomen en deze zal gebruikt worden om de bloedcurve om te zetten tot de plasmacurve.
Plasma/volbloed
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0
2
4 6 Tijd (minuten)
8
10
FIGUUR 4.1. VERHOUDING VAN 11C-DESMETHYLLOPERAMIDE ACTIVITEIT IN PLASMA VERSUS VOLBLOED IN FUNCTIE VAN DE TIJD (MINUTEN). DE GEMIDDELDE WAARDEN MET SD VAN DRIE MUIZEN WORDT WEERGEGEVEN 26
De bloedklaring van
11
C-dLop bij muizen uitgedrukt als % geïnjecteerde dosis
per gram volbloed in functie van de tijd wordt weergegeven in figuur 4.2. De bloedklaringscurves van WT muizen voorbehandeld met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine als met fysiologische oplossing vertonen hetzelfde verloop, maar de waarden bij WT muizen voorbehandeld met cyclosporine liggen voor alle tijdspunten hoger dan voor WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing. WT muizen voorbehandeld met cyclosporine vergeleken met WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing zijn niet statistisch significant verschillend op tijdstippen 1,10 en 60 minuten (p waarden respectievelijk 0.11, 0.10, 0.016 en 0.05 op tijdstippen 1, 10, 30 en 60 minuten). Bij KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing is de bloedklaringscurve analoog aan de curve voor WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing met uitzondering van het eerste tijdspunt. Uit de p waarden valt te besluiten dat WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing vergeleken met KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing niet statistisch significant verschillend zijn (p waarden respectievelijk 0.05, 0.70, 0.70 en 0.43 op tijdstippen 1, 10, 30 en 60 minuten). Er wordt bovendien geen statistisch significant verschil gezien op tijdstippen 10, 30 en 60 minuten tussen KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing en WT muizen voorbehandeld met cyclosporine (p waarden 0.02, 0.08, 0.15 en 0.05 op tijdstippen 1, 10, 30 en 60 minuten). KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing hebben een lagere bloedklaringscurve dan KO muizen voorbehandeld met cyclosporine maar tonen onderling geen statistisch significant verschil aangezien de p waarden op tijdstippen 1, 10, 30 en 60 minuten respectievelijk 0.13, 0.18, 0.31 en 0.14 bedragen. Data bekomen bij KO muizen hebben een grotere standaarddeviatie vermoedelijk te wijten aan het feit dat KO muizen onderling zeer verschillend zijn. Het afwijkende verloop in bloedklaring tussen muizen voorbehandeld met en zonder cyclosporine kan verklaard worden doordat cyclosporine naast een blokker voor P-gp ook een cytostaticum is dat inwerkt op verschillende mechanismen van het lichaam (Schinkel & Jonker, 2002). De bloedklaring van
11
C-dLop in cyclosporine voorbehandelde muizen kan
dus beïnvloed worden door het effect van cyclosporine op de binding van de tracer aan de rode bloedcellen.
27
4,0 3,5
% ID/gram
3,0 2,5 2,0
WT fysio
1,5
WT cyclo KO fysio
1,0
KO cyclo
0,5 0,0 0
10
20
30
40
50
60
Tijd (minuten)
FIGUUR 4.2. DE BLOEDKLARING VAN
11
C-DLOP (ALS % GEINJECTEERDE DOSIS
(ID)/GRAM MET SD IN FUNCTIE VAN DE TIJD IN MINUTEN) IN WT MUIZEN VOORBEHANDELD MET FYSIOLOGISCHE OPLOSSING (♦) OF CYCLOSPORINE (■) EN IN KO MUIZEN VOORBEHANDELD MET FYSIOLOGISCHE OPLOSSING (▲) OF CYCLOSPORINE (X)
4.2.2. Metabolietenstudies 11
C-dLop kan in het lichaam gemetaboliseerd worden tot radioactieve en niet
radioactieve metabolieten. Aangezien bij PET geen verschil onderscheiden kan worden tussen de bestudeerde tracer en een metaboliet is het noodzakelijk om de plasmacurve bekomen uit scandata of via bloedafnames te corrigeren voor de gevormde metabolieten. Metabolieten worden bepaald bij KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing of 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine. Na injectie van de geëxtraheerde fractie uit bloed op HPLC worden twee radioactieve componenten gevisualiseerd met retentietijd (RT) A en B (figuur 4.3.). De RT van B komt overeen met de RT van desmethylloperamide standaard na injectie op HPLC. De component A is polairder dan component B aangezien het een kortere RT heeft. De fractie van deze polaire component A neemt toe van 1 tot 30 minuten na injectie van de tracer in tegenstelling tot de fractie van
11
C-dLop die
afneemt in functie van de tijd. Component A kan dus als een metaboliet van beschouwd worden. Deze gevormde metaboliet is waarschijnlijk
11
C-dLop
11
C-methanol zoals
ook aangegeven in de literatuur (Lazarova et al., 2008). 28
A
B
60,0
% metabolieten
50,0 40,0 30,0
1 min
20,0
10 min
10,0
30 min
0,0 0
5 10 Tijd (minuten)
15
FIGUUR 4.3. METABOLISATIE VAN 11C-DLOP IN HET PLASMA
Het percentage intact
11
C-dLop in het bloed bij KO en WT muizen
voorbehandeld met fysiologische oplossing of met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine wordt weergegeven in tabel1. Tabel 1. % intact
11
C-dLop met SD op tijdstippen 1, 10 en 30 minuten voor WT
muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing (WT fysio) of 50 mg/kg cyclosporine (WT cyclo) en KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing (Ko fysio) of 50 mg/kg cyclosporine (KO cyclo). 1 min
SD
10 min
SD
30 min
SD
WT fysio
95,2
1,1
72,1
4,5
52,7
3,4
WT cyclo
97,9
10,3
52,6
3,2
20,5
8,2
KO fysio
94,0
3,1
58,6
15,8
39,3
14,0
KO cyclo
95,1
1,7
43,3
2,0
31,5
13,0
KO muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing of cyclosporine tonen onderling net zoals WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing of cyclosporine onderling geen statistisch significant verschil in metabolisatie (p waarden 0.50, 0.17 en 0.60 voor KO muizen en 0.98, 0.09, 0.29 voor WT muizen op tijdstippen 1, 10 en 30 minuten). Bovendien zijn KO en WT muizen voorbehandeld met cyclosporine niet statistisch significant verschillend. Cyclosporine heeft zoals het
29
muizenras geen invloed op de metabolisatie van
11
C-dLop in het bloed. Bijgevolg zijn
WT muizen voorbehandeld met cyclosporine representatief voor alle muizen. Na 30 minuten is nog 97% ± 0.71 van het oorspronkelijke product in de hersenen aanwezig. De metabolisatie van
11
C-dLop in de hersenen is bij alle geteste
muizen verwaarloosbaar. Het is belangrijk de metabolieten in de hersenen te bepalen aangezien de weefselcurve moet bepaald worden voor het opstellen van het kinetisch model. De fractie van radioactieve metabolieten in de hersenen moet dus gekend zijn om de juiste weefselcurve te kunnen invoegen in het kinetisch modelleringssoftware pakket. 4.2.3. Arteriële input curves Om tot een arteriële plasma input curve te komen wordt gestart vanuit een arteriële bloedcurve. Deze kan bekomen worden op twee verschillende manieren, door een geschikte ROI te tekenen rond het linkerventrikel van het hart of door de bloedcounter. Aangezien ¹¹C-dLop geen typische tracer voor het hart is, is het linkerventrikel moeilijk te zien op de ¹¹C-scan. Bovendien wordt de aflijning van het linkerventrikel bemoeilijkt door de hoge opname van tracer in de longen. Dit probleem werd opgelost door een bijkomende
18
F-FDG scan uit te voeren. Deze
tracer vertoont goede opname in het myocard van het hart. Figuur 4.4. geeft de ROI rond het hart getekend op de ROI wordt gekopieerd op de
18 -
F FDG-scan. Deze
11
C-dLop-scan. Na uitzetten van de activiteit in de ROI
in functie van de tijd wordt de bloedcurve bekomen en deze wordt vergeleken met de curve bekomen uit de bloedcounter data (figuur 4.5.).
30
FIGUUR 4.4. REGION OF INTEREST (ROI) TER HOOGTE VAN HET LINKERVENTRIKEL VAN HET HART OP EEN 18F-FDG-SCAN
140,0
Activiteit (µCi/mL)
120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 0
5
10
15 Tijd (minuten)
20
25
30
FIGUUR 4.5. BLOEDCURVE BEPAALD VIA BLOEDCOUNTER (♦) EN VIA ROI OP DE
11
C-
DLOP-SCAN (■) UITGEZET ALS ACTIVITEIT IN µCi/mL IN FUNCTIE VAN DE TIJD IN SECONDEN
Een andere manier om de arteriële bloed input curve te bekomen is via bloedcounter. Figuur 4.5. toont de bloedcurve en curve bekomen uit het linkerventrikel uitgezet als activiteit (µCi/ml) in functie van de tijd. Beide curven hebben dezelfde vorm, ze stijgen lineair tot ze hun maximum bereiken en zijn daarna exponentieel dalend. De data bekomen via de bloedcounter zijn verschillend van de
31
data van de scan te wijten aan dispersie. De dispersie constante kan berekend worden via de formule (Convert et al., 2007): Τdisp = (Spanv X e-Kv x v + Plateauv ) x ( 1 – e-KD x d) Waarin:
τdisp: dispersie constante in seconden Spanv: startpunt Kv: snelheidsconstante van het exponentieel dalende gebied v: snelheid van de bloedafname in µL/min Plateauv: eindpunt van de exponentiële curve KD: exponentiële groeiconstante d: afstand van het dier tot de detector
De werkelijke bloed tijd-activiteit curve wordt berekend via de formule (Convert et al., 2007): Werkelijke bloed tijd-activiteit curve = g(t) + τdisp X (dg/dt) Waarin:
g(t): gemeten activiteit in µCi/mL Τdisp: dispersie constante in seconden dg/dt: afgeleide van de gemeten activiteit (µCi/mL) op de tijd in seconden
De berekende dispersie constante voor de bloedcounter, teruggevonden in de literatuur (Convert et al., 2007) is 4.0 seconden. Na correctie van de bloedcounter data voor dispersie is er een minimaal verschil met de oorspronkelijke curve (figuur 4.6.). Deze vaststelling kan te wijten zijn aan een fout in de formule. De formule van τdisp kan namelijk herleid worden tot Plateauv x 1 aangezien e-x gelijk is aan nul en kan geschrapt worden uit de formule. Als de berekende dispersie juist zou zijn dan zou de grafiek hoger liggen. Er kan besloten worden dat er een fout zit in de formule van de dispersie constante en dat overleg nodig is met een expert om de juiste aanpassingen te kunnen uitvoeren.
32
4500
Activiteit (nCi/µL)
4000 3500 3000 2500 bloodcounter correctie dispersie
2000 1500
bloodcounter correctie
1000 500 0 0
500
1000
1500
2000
Tijd (seconden)
FIGUUR 4.6. CURVE VAN DE BLOEDCOUNTER MET EN ZONDER CORRECTIE VOOR DISPERSIE UITGEZET ALS ACTIVITEIT IN nCi/µL IN FUNCTIE VAN DE TIJD IN SECONDEN
De oppervlaktes onder de curves (AUC) van de bloedcurve bekomen via bloedcounter en deze bekomen via het linkerventrikel worden berekend en het verschil in AUC (uitgedrukt als een percentage) bedraagt 14.33%. Aangezien Green et al. (2004) een AUC verschil rapporteerden tussen bloedcurves uit bloedafnames en uit scan van 18%, kan besloten worden dat het bekomen AUC verschil van 14.33% acceptabel is. Bovendien dient opgemerkt te worden dat door uitvoeren van een dispersiecorrectie het verschil in AUC in alle waarschijnlijkheid nog verder zal dalen. Aangezien de plasma input curve bekomen via de bloedcounter niet volledig correct is wordt verder gewerkt met de plasma input curve bekomen uit het linkerventrikel van het hart. 4.2.4. PET beelden Het verschil in opname van
11
C-dLop in de hersenen is bij de geteste muizen
duidelijk te zien op de scan beelden (figuur 4.7.). Een „zwart gat‟, corresponderend met afwezigheid van een radioactief signaal, wordt gezien ter hoogte van de hersenen bij WT muizen zonder voorbehandeling met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine, te wijten aan het transport van de tracer uit de hersenen door de effluxtransporters zoals P-gp. De WT muizen voorbehandeld met cyclosporine 33
vertonen net zoals de KO muizen echter wel tracer opname ter hoogte van de hersenen door respectievelijk blokkage van P-gp‟s in de hersenen als door de afwezigheid van P-gp‟s in de hersenen.
FIGUUR 4.7. PET BEELDEN VAN KNOCK-OUT MUIS (A), WILD-TYPE MUIS ZONDER (B) EN MET CYCLOSPORINE VOORBEHANDELING (50 mg/kg LICHAAMSGEWICHT, 30 MINUTEN VOOR TRACER INJECTIE) (C), NA INTRAVENEUZE INJECTIE VAN 20,0 ± 2,0 MBq 11C-DESMETHYLLOPERAMIDE. DE HERSENEN ZIJN AANGEDUID OP DE FIGUUR.
4.2.5. SUV’s SUV‟s in de hersenen worden berekend om het verschil in toegediende activiteit van 11C-dLop en verschil in lichaamsgewicht tussen muizen uit te middelen. Figuur 4.8. geeft de SUV in de hersenen van WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing of 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine en KO muizen. WT muizen zonder cyclosporine voorbehandeling hebben een gemiddelde SUV in de 34
hersenen van 0.25 g/ml ± 0.076. Terwijl SUV in de hersenen bij KO muizen en WT muizen met cyclosporine voorbehandeling hoger zijn (respectievelijk 0.63 g/ml ± 0.195 en 0.49 g/ml ± 0.145). Er wordt geen statistisch significant verschil (alle p waarden > 0.05 op alle tijdstippen) bekomen tussen KO muizen en WT muizen voorbehandeld met cyclosporine wat verklaard kan worden door de grote variabiliteit tussen KO muizen wat leidt tot grote SD op de gemeten data. Er kan dus worden besloten dat het verschil in SUV‟s tussen KO muizen en muizen voorbehandeld met cyclosporine vergeleken met de SUV‟s van WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing een goede indicatie van de functionaliteit van P-gp in de hersenen is. Er worden hogere SUV‟s bekomen bij muizen met geblokkeerde P-gp‟s of waarbij de P-gp‟s afwezig zijn.
SUV (g/mL)
A 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
WT fysio WT cyclo KO
0
5
10
15
20
25
30
Tijd (minuten)
FIGUUR
4.8.
STANDARDIZED
UPTAKE
VALUES
(SUV‟s)
VAN
11
C-
DESMETHYLLOPERAMIDE IN GRAM PER MILLILITER IN FUNCTIE VAN DE TIJD IN WILD-TYPE MUIZEN VOORBEHANDELD MET FYSIOLOGISCHE OPLOSSING (♦), WT MUIZEN VOORBEHANDELD MET CYCLOSPORINE (50 mg/kg LICHAAMSGEWICHT) (■) EN KO MUIZEN (▲) IN DE HERSENEN
4.2.6. Kinetisch model Het beste model voor alle geteste muizen om de data van de
11
C-dLop-scan te
fitten is het één-compartimenteel model. Tabel 2. toont de bekomen parameters van het één-compartimenteel model voor de bestudeerde muizen met alle tijdspunten van de scan inbegrepen. K1 is in WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing 35
kleiner dan in KO muizen en WT muizen voorbehandeld met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine in tegenstelling tot k2 die in alle muizen niet statistisch verschillend is (p > 0.05 respectievelijk 0.80, 0.73 en 0.83 voor fysio t.o.v. KO, fysio t.o.v. cyclo en KO t.o.v. cyclo). Het verschil tussen WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing en KO muizen of cyclosporine voorbehandelde WT muizen wordt ook gezien in de K1/k2 verhouding (p waarden respectievelijk 0.011, 0.001 en 0.84 voor fysio t.o.v. KO, fysio t.o.v. cyclo en KO t.o.v. cyclo). Aangezien er geen verschil in k2 is zoals verwacht, kan aangenomen worden dat K1 beschouwd mag worden als een pseudo K1. K1 is, onder de bestudeerde omstandigheden, namelijk een combinatie van passieve diffusie doorheen de BBB en het actief naar buiten pompen van stoffen door P-gp‟s, wat beschouwd mag worden als een snel proces. De bekomen k2 is voornamelijk een weerspiegeling van de laatste minuten in de dynamische scan en staat voor de trage diffusie vanuit de hersenen naar de bloedbaan. Als kinetische modellering enkel wordt uitgevoerd op de data bekomen gedurende de eerste 2 minuten van de scan, dan wordt een hogere k2 gezien bij de WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing, in vergelijking met de WT voorbehandeld met cyclosporine en de KO muizen (Tabel 3.). Tabel 2.: Overzicht van de parameters bekomen uit een één-compartimenteel model voor de bestudeerde muizen, alle tijdspunten in rekening gebracht. WT = wildtype muis, KO = knock-out muis en CYCLO = WT muis voorbehandeld met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine, 30 minuten voor tracerinjectie, %COV = percentage covariantie
WT1 WT2 WT3 KO1 KO2 KO3 CYCLO1 CYCLO2 CYCLO3
K1 (ml/cc/min) 0,053 0,044 0,096 0,193 0,225 0,191 0,248 0,120 0,183
%COV 25,25 12,72 28,22 17,14 10,53 13,65 10,25 10,87 10,24
k2 (1/min) 0,15 0,10 0,27 0,12 0,09 0,10 0,15 0,06 0,09
% COV 51,35 28,39 46,77 33,30 22,97 28,96 19,46 27,41 23,15
K1/k2 0,36 0,46 0,36 1,58 2,38 1,90 1,66 1,90 2,13
36
Tabel 3.: Overzicht van de parameters bekomen uit een één-compartimenteel model, tijdspunten tussen 0 en 2 minuten in beschouwing genomen . WT = wild-type muis, KO = knock-out muis en CYCLO = WT muis voorbehandeld met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine, 30 minuten voor tracerinjectie, %COV = percentage covariantie
WT1 WT2 WT3 KO1 KO2 KO3 CYCLO1 CYCLO2 CYCLO3
K1 (ml/cc/min) 0,572 0,313 0,960 1,576 0,656 0,900 0,514 0,432 0,446
%COV 78,67 15,69 27,84 7,83 7,38 15,12 9,72 14,80 16,02
k2 (1/min) 8,00 8,00 8,00 5,36 1,74 2,99 1,17 2,11 1,31
% COV 83,11 10,32 27,00 2,52 7,83 18,70 14,92 18,35 25,52
K1/k2 0,07 0,04 0,12 0,29 0,38 0,30 0,44 0,20 0,34
k2 bedraagt bij WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing nu 8 min-1 in tegenstelling tot lagere waarden die gezien worden bij KO muizen en muizen voorbehandeld met cyclosporine. Deze grotere k2 is dus een goede indicator van de P-gp functie want WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing bevatten meer functionele P-gp‟s dan de andere twee groepen en pompen dus meer
11
C-dLop
naar buiten. Bovendien is de verhouding K1/k2 niet statistisch verschillend tussen KO muizen en WT muizen voorbehandeld met cyclosporine (p waarde 0.96), maar is er wel een duidelijk verschil met de WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing (p waarde voor KO t.o.v. fysio 0.002 en voor cyclo t.o.v. fysio 0.05). De K1/k2 verhouding is dus een goede parameter voor het bestuderen van de P-gp functie via het kinetisch model van 11C-dLop. 4.3. EXPERIMENTEN UITGEVOERD BIJ SPRAGUE DAWLEY RATTEN 4.3.1. Plasma/volbloed verhouding en bloedklaring Figuur 4.9. toont de verhouding van plasma op volbloed in functie van de tijd. De eerste minuut na injectie van
11
C-dLop is de gemiddelde verhouding van de
activiteit van de tracer in het plasma op de activiteit van de tracer in het bloed 0.97 ± 37
0.07. 2.5 minuten na injectie van de tracer neemt deze waarde af tot 0.87 ± 0.08. Het minimum wordt bereikt 5 minuten na injectie van de tracer en bedroeg 0.76 ± 0.35. Er treedt een stabilisatie op 10 minuten na injectie van 11C-dLop.
Plasma/volbloed
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0
5
10
15
20
25
30
Tijd (minuten)
FIGUUR 4.9. PLASMA OP VOLBLOED VAN
11
C-DLOP IN FUNCTIE VAN DE TIJD
(MINUTEN) MET SD
Figuur 4.10. toont de gemiddelde bloedklaring van drie ratten. De bloedklaring
Counts/g bloed
is stabiel na 10 minuten en is exponentieel dalend.
4000,0 3000,0 2000,0 1000,0 0,0 0
10
20
30
Tijd (minuten)
FIGUUR 4.10. GEMIDDELDE BLOEDKLARING VAN
11
C-DLOP VAN DRIE RATTEN
UITGEZET ALS COUNTS PER GRAM BLOED IN FUNCTIE VAN DE TIJD (MINUTEN) MET SD
4.3.2. Metabolietenstudies Het
gemiddelde
percentage
11
C-dLop
bij
ratten
voorbehandeld
met
fysiologische oplossing of 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine wordt gegeven in figuur 4.11. De metabolisatie van
11
C-dLop in ratten voorbehandeld met fysiologische
oplossing of met cyclosporine vertoont geen statistisch significant verschil (p
38
waarden > 0.05 respectievelijk 0.44, 0.11, 0.44, 0.37, 0.99 en 0.46 op tijdstippen 1, 2.5, 5, 10, 15 en 30 minuten). 100,0 90,0
% 11C-dLop
80,0 70,0 60,0 50,0 40,0
rat fysio
30,0
rat cyclo
20,0 10,0 0,0 0
5
10
15
20
25
30
Tijd (minuten)
FIGUUR 4.11. % VOORBEHANDELD
11
C-DLOP IN FUNCTIE VAN DE TIJD (MINUTEN) IN RATTEN MET
FYSIOLOGISCHE
OPLOSSING
(♦)
EN
RATTEN
VOORBEHANDELD MET 50 mg/kg LICHAAMSGEWICHT CYCLOSPORINE (■)
4.3.3. Kinetisch model en PET scan Tabel 4.: Overzicht van de parameters van een één- en twee-compartimenteel model van een bestudeerde rat.
K1 (mL/ccm/min) k2 (1/min) k3 (1/min) k4 (1/min)
1-comp 6,43 8,00
2-comp 6,15 8,00 0,03 0,00
De parameters tonen aan dat K1 zowel bij het één- als twee-compartimenteel model rond de 6 mL/ccm/min ligt en dat k2 8 min-1 bedraagt. De andere parameters (k3 en k4) zijn voor het twee-compartimenteel model zodanig klein dat ze te verwaarlozen zijn. De fitting voor de compartimentele modellen is niet ideaal (figuur 4.13.) daardoor wordt verder gewerkt met het eenvoudigste compartimenteel model, het één-compartimenteel model. Bovendien vertoont het twee-compartimenteel model geen betere fitting en zijn de
parameters K1 en k2 voor beide
39
compartimentele modellen hetzelfde. De k2 waarde is groot wat erop wijst dat de tracer direct terug uit de hersenen wordt gepompt, wat ook verklaard wordt door het „zwarte gat‟ op de PET scan (figuur 4.12).
FIGUUR 4.12. PET BEELD VAN EEN RAT. DE HERSENEN ZIJN OMCIRKELD
Figuur 4.13. toont de hersendata, de plasmacurve en de gefitte curve van de hersenen van de bestudeerde compartimentele modellen. De eerste grafiek bekomen uit het één-compartimenteel model toont dat de gefitte hersencurve dezelfde vorm heeft als de plasmacurve met verschil dat de plasmacurve iets hoger ligt. Dit wijst erop dat de hoeveelheid
11
C-dlop die in het plasma terechtkomt ook de
hersenen bereikt en er vervolgens weer wordt uitgepompt. Het kinetisch model wordt bepaald aan de hand van één onderzochte rat zonder rekening te houden met de dispersie. In de toekomst moet er gecorrigeerd worden voor dispersie en moeten meerdere ratten onderzocht en vergeleken worden. Aangezien het metabolisme bij ratten trager is dan bij muizen kan vermoed worden dat het proces van uitpompen door P-gp‟s trager verloopt. De volledige data kunnen daardoor gebruikt worden om K1 en k2 te bepalen en er is dus geen sprake van een pseudo K1.
40
FIGUUR 4.13. HERSENDATA (groen), PLASMACURVE (rood) EN GEFITTE CURVE (blauw) VAN EEN EEN- EN TWEE-COMPARTIMENTEEL MODEL
4.3.4. Scoren van epileptische ratten Het aantal epileptische aanvallen per rat gedurende één dag observatie verschilt sterk ondanks het feit dat alle ratten op dezelfde dag met dezelfde hoeveelheid kaïnaat werden geïnjecteerd (tabel 5.). Kaïnaat beschadigd de hersenen en veroorzaakt een status epilepticus die gedurende lange tijd aanhoudt. De abnormale elektrische activiteit van de status epilepticus bestaat uit het spontaan vuren van de gestimuleerde groep van neuronen die epileptische activiteit nabootst en aanleiding geeft tot een klinisch waarneembare aanval. De beschadiging in de hersenen veroorzaakt door kaïnaat zal niet bij alle ratten even groot zijn wat tot de grote verschillen in het aantal epileptische aanvallen leidt. Bovendien treden de aanvallen spontaan op zodat bij een andere dagobservatie ratten met geen aanvallen dan toch aanvallen zullen doen. Er zal een homogene groep gekozen worden die verder wordt gebruikt om het kinetisch model op te stellen. Deze homogene groep bestaat uit ratten met 4 tot 6 aanvallen. De ratten met een hoger aantal aanvallen worden niet gekozen omwille van de hogere kans op mortaliteit.
41
Tabel 5.: aantal aanvallen per rat
rat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
aantal aanvallen 5 5 4 1 4 4 0 0 1 9
rat 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
aantal aanvallen 6 1 0 8 8 4 0 0 6 0
rat 21 22 23 24 25 26 27 28 29
aantal aanvallen 0 5 0 0 2 0 0 5 0
42
5.
CONCLUSIES Om meer inzicht te krijgen in refractaire epilepsie kan de P-glycoproteïne functie ter hoogte van de bloed-hersen barrière onderzocht worden via het 11
opstellen van een kinetisch model voor ratten. Na metabolietenstudies van
11
het plasma/volbloed evenwicht van
11
C-desmethylloperamide bij muizen en
C-desmethylloperamide en de bepaling van C-desmethylloperamide wordt het kinetisch
model voor deze tracer bepaald via PET. De verhouding van de activiteit van
11
C-desmethylloperamide in het plasma op
de tracer activiteit in het volbloed wordt bepaald om de plasma input functie te bekomen. De verhouding plasma/volbloed is voor alle geteste muizen gemiddeld rond de 0.64. Deze waarde wordt gebruikt als correctiefactor in het kinetisch model. Het plasma/volbloed evenwicht van 11C-dLop wordt snel ingesteld. Metabolieten van
11
C-desmethylloperamide worden niet gedetecteerd in de
hersenen bij muizen tot op 30 minuten na tracerinjectie. In het plasma wordt een polaire metaboliet gedetecteerd, hoogstwaarschijnlijk
11
C-methanol, waarvan de
fractie steeds toeneemt van 1 tot en met 30 minuten na tracerinjectie. De metabolisatie bij ratten verloopt trager dan deze bij muizen wat verklaard kan worden door het algemeen trager metabolisme van ratten. Het kinetisch model wordt opgesteld voor WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing, WT muizen voorbehandeld met 50 mg/kg lichaamsgewicht cyclosporine en mdr1a P-glycoproteïne KO muizen evenals voor ratten. De kinetiek van 11C-desmethylloperamide ter hoogte van de bloed-hersen barrière wordt het best beschreven door een één-compartimenteel kinetisch model voor alle types muizen en voor ratten voorbehandeld met fysiologische oplossing. De parameters K1 en k2 bedragen respectievelijk 0.380 mL/ccm/min en 8 min-1 voor WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing, 1.044 mL/ccm/min en 3.36 min-1 voor KO muizen en 0.464 mL/ccm/min en 1.53 min-1 voor WT muizen voorbehandeld met cyclosporine. Deze parameters bedragen bij de rat 6.43 mL/ccm/min en 8 min-1. Bij P-gp knock-out muizen en muizen voorbehandeld met cyclosporine is het transport van
11
C-dLop uit de hersenen dus kleiner dan bij de WT muizen wat zich uit in de
kleinere k2 waarde. Bovendien wordt er geen statistisch verschil gezien in de verhouding K1/k2 bij KO muizen en WT muizen voorbehandeld met cyclosporine, 43
maar is er wel een duidelijk verschil met de WT muizen voorbehandeld met fysiologische oplossing. K1/k2 kan dus als een goede parameter beschouwd worden voor de P-glycoproteïne functie. Het algemene besluit luidt dat het kinetisch model voor 11C-desmethylloperamide bij muizen een geschikt model is om de aanwezigheid van P-glycoproteïnen te onderzoeken. Verder onderzoek bij ratten voorbehandeld met cyclosporine en epileptische ratten is nodig om meer inzicht te krijgen in de P-glycoproteïne functie bij refractaire epilepsie.
44
6.
LITERATUURLIJST
Aboagye, E.O.; Price, P.M.; Jones, T. (2001). In vivo pharmacokinetics and pharmacodynamics in drug development using positron-emission tomography. Drug Discovery Today, 6, 293-302 Baltes, S.; Fedrowitz M.; Tortós, C. L.; Potschka, H.; Löscher, W. (2007a). Valproic acid is not a substrate for P-glycoprotein of multidrug resistance proteins 1 and 2 in a number of in vitro and in vivo transport assays. J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 320, 331-343 Baltes, S.; Gastens, A. M.; Fedrowitz, M.; Potschka, H.; Kaever, V.; Löscher, W. (2007b). Differences in the transport of antiepileptic drugs phenytoin, levetiracetam and carbamazepine by human and mouse P-glycoprotein. Neuropharmacology, 52, 333-346 Barentsz, J.O. (1998). Magnetic resonance imaging. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde, 3 Beaulieu, E.; Demeule, M.; Ghitescu, L.; Beliveau, R. (1997). P-glycoprotein is strongly expressed in the luminal membranes of the endothelium of blood vessels in het brain. Biochem. J., 326, 76-79 Betz, A.L.; Goldstein, G.W.; Katzman, R. (1994). Blood-brain-cerebrospinal fluid barriers. Basic Neurochemistry, Molecular, Cellular, and Medical aspects, 5, 681-699 Convert, L.; Morin-Brassard, G.; Cadorette, J.; Archambault, M.; Bentourkia, M.; Lecomte, R. (2007). A new tool for molecular imaging: the microvolumetric β blood counter. J. Nucl. Med., 48, 1197-1206 Cordon-Cardo, C.; O‟Brien, J.P.; Casals, D.; Rittman-Grauer, L.; Biedler, J.L.; Melamed, M.R.; Bertino, J.R. (1989). Multidrug-resistance gene (P-glycoprotein) is expressed bij endothelial cells at blood-brain barrier sites. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 86, 695-698 Dedeurwaerdere, S.; Jupp, B.; O‟Brien, T. J. (2007). Positron emission tomography in basic epilepsy research: a view of the epileptic brain. Epilepsia, 48(suppl.4), 56-64 45
Duncan, J. S.; Sander, J. W.; Sisodiya, S. M.; Walker, M. C. (2006). Adult Epilepsy. Lancet, 367, 1087-1100 Elsinga, P. H.; Hendrikse, N. H.; Bart, J.; Vaalburg, W.; van Waarde, A. (2004). PET studies on P-glycoprotein function in the blood-brain barrier: how it affects uptake and binding of drugs within the CNS. Current Pharmaceutical Design, 10, 1493-1503 Fromm, M.F. (2000). P-glycoprotein a defense mechanism limiting oral bioavailability and CNS accumulation of drugs. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 38, 69-74 Goodman, J.H. (1998). Experimental models of status epilepticus. CRC Press, Boca Raton, 95-125 Green, L.A.; Nguyen, K.; Berenji, B.; Iyer, M.; Bauer, E.; Barrio, J.R.; Namavari, M.; Satymurthy, N.; Gambhir, S.S. (2004). A tracer kinetic model for
18
F-FHBG for
quantitating herpes simplex virus type 1 thymidine kinase reporter gene expression in living animals using PET. J. Nucl. Med., 45, 1560-1570 Hoffmann, K.; Löscher, W. (2007). Upregulation of brain expression of P-glycotrotein in MRP2-deficient TR- rats resembles seizure-induced up-regulation of this drug efflux transporter in normal rats. Epilepsia, 48, 631-645 Jette, L.; Murphy, G.F.; Leclerc, J.M.; Beliveau, R. (1995). Interaction of drugs with Pglycoprotein in brain capillaries. Biochem. Pharmacol., 50, 1701-1709 Kannan, P.; John, C.; Zoghbi, S.S.; Halldin, C.; Gottesman, M.M.; Innis, R.B.; Hall, M.D.
(2009).
Imaging
the
function
of
P-glycoprotein
with
radiotracers:
pharmacokinetics and in vivo applications. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 86, 368-377 Kwan, P.; Brodie, M. J. (2000). Early identification of refractory epilepsy. N. Engl. J. Med., 342, 314-319 Kwan, P.; Sander, J. W. (2004). The natural history of epilepsy: an epidemiological view. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 75, 1376-1381 Kwan, P.; Brodie, M. J. (2005). Potential role of drug transporters in the pathogenesis of medically intractable epilepsy. Epilepsia, 46, 224-235
46
Lazarova, N.; Zoghbi, S. S.; Hong, J.; Seneca, N.; Tuan, E.; Gladding, R. L.; Liow, J.S.; Taku, A.; Innis, R. B.; Pike, V. W. (2008). Synthesis and evaluation of [N-methyl11
C]N-desmethyl-loperamide as a new and improved PET radiotracer for imaging P-
gp function. J. Nucl. Med., 51, 6034-6043 Löscher, W. (1999). Animal models of epilepsy and epileptic seizures. Antiepileptic drugs: handbook of experimental pharmacology, 19-62 Löscher, W. (2002). Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research, 50, 105-123 Löscher,
W.;
Potschka,
H.
(2002).
Role
of
multidrug
transporters
in
pharmacoresistance to antiepileptic drugs. J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 301, 7-14 Löscher, W.; Potschka, H. (2005a). Blood-brain barrier active efflux transporters: ATP-binding cassette gene family. NeuroRx, 2, 86-98 Löscher, W.; Potschka, H. (2005b). Drug resistance in brain diseases and the role of drug efflux transporters. Nature Reviews Neuroscience, 6, 591-602 Löscher, W.; Potschka, H. (2005c). Role of efflux transporters in the brain for drug disposition and treatment of brain diseases. Progress in Neurobiology, 76, 22-76 Luna-Tortós, C.; Fedrowitz, M.; Löscher, W. (2008). Several major antiepileptic drugs are substrates for human P-glycoprotein. Neuropharmacology, 55, 1364-1375 Lüttjohann, A.; Fabene, P.F.; van Luijtelaar, G. (2009). A revised Racine‟s scal for PTZ-induced seizures in rats. Physiology & Behavior, 98, 579-586 Maliepaard, M.; Scheffer, G.L.; Faneyte, I.F.; van Gastelen, M.A.; Pijnenborg, A.C.L.M.; Schinkel, A.H.; van de Vijver, M.J.; Scheper, R.J.; Schellens, J.H.M. (2001). Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein in normal human tissues. Cander res., 61, 3458-3464
47
Pardridge, W. M.; Golden, P. L.; Kang, Y. S.; Bickel, Y. (1997). Brain microvascular and astrocyte localisation of P-glycoprotein. J. of Neurochemistry, 68, 1278-1285 Pardridge, W. M. (1999). Blood-brain barrier biology and methodology. J. of Neurovirology, 5, 556-569 Phelps, M.E.; Hoffman, E.J.; Mullani, N.A. (1975). Application of annihilation coincidence detection to transaxial reconstruction tomography. J. Nucl. Med., 16, 210-224 Potschka, H.; Löscher, W. (2001). In vivo evidence for P-glycoprotein-mediated transport of phenytoin at the blood-brain barrier of rats. Epilepsia, 42, 1231-1240 Regesta, G.; Tanganelli, P. (1999). Clinical aspects and biological bases of drugresistant epilepsies. Epilepsy Research, 34, 109-122 Sato, M.; Racine, R.J.; McIntyre, D.C. (1990). Kindling: basic mechanisms and clinical validity. Electroenceph. Clin. Neurophysiol., 76, 459-472 Schinkel, A. H.; Jonker, J. W. (2003). Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews, 55, 329 Schnöckel, U.; Hermann, S.; Stegger, L.; Law, M.; Kuhlmann, M.; Schober, O.; Schäfers, K.; Schäfers, M. (2009). Small-animal PET: a promising, non-invasive tool in pre-clinical research. J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 74, 50-54 Seegers, U.; Potschka, H.; Löscher, W. (2002b). Transient increase of P-glycoprotein expression in endothelium and parenchyma of limbic brain regions in the kainate model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research, 51, 257-268 Sills, G. J.; Kwan, P.; de Lange, E. C. M.; Butler, E.; Brodie, M. J. (2001). Pglycoprotein-mediated antiepileptic drug transport: a role in refractory epilepsy? Epilepsia, 47(suppl.7), 83 Sisodiya, S. M.; Lin, W.-R.; Harding, B. N.; Squier, M. V.; Thom, M. (2002). Drug resistance in epilepsy: expression of drug resistance proteins in common causes of refractory epilepsy. Brain, 125, 22-31
48
Spector, R. (2000). Drug transport in the mammalian central nervous system: multiple complex systems. A critival analysis and commentary. Pharmacology, 60, 58-73 Tischler, D. M.; Weinberg, K. I.; Hinton, R.; Barbaro, N.; Annett, G. M.; Raffel, C. (1995). MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia, 36, 1-6 Van den Hoff, J. (2005). Principles of quantitative positron emission tomography. Amino Acids, 29, 341-353 Watabe, H.; Ikoma, Y.; Kimura, Y.; Naganawa, M.; Shidahara, M. (2006). PET kinetic analysis – compartmental model. Annals of Nucl. Med., 20, 583-588
49
50
