Ontwikkelen en toepassen van technologie om eiwitcomplexen uit plantencellen te isoleren en analyseren

FACULTEIT WETENSCHAPPEN SCRIPTIE VOORGELEGD TOT HET BEHALEN VAN DE GRAAD VAN LICENTIAAT / MASTER IN DE BIOTECHNOLOGIE Academiejaar 2005-2006

Ontwikkelen en toepassen van technologie om eiwitcomplexen uit plantencellen te isoleren en analyseren

Lopes dos Santos Santiago Guido Promotor: Prof. Dr. Dirk Inzé Co-promotor: Dr. Geert De Jaeger Begeleider: Drs. Jelle Van Leene

VAKGROEP MOLECULAIRE GENETICA VIB-departement Plant Systems Biology

De leden van de leescommissie: Prof. Dr Anna Depicker Dr. Geert De Jaeger Dr. Alain Goossens

Figuur op voorpagina: Overzicht van de TAP-methode met de klassieke CPBZZ-tag. Het linkerpaneel stelt de eerste affiniteitsstap voor en in het rechterpaneel ziet men de tweede affiniteitsstap.

Inhoudstafel

DEEL 1: LITERATUURSTUDIE

1

1.1. Experimentele detectie van eiwit-eiwit interacties 1.1.1. Inleiding

1 1

1.1.2. Detectie op basis van affiniteit 1.1.2.1. Eiwit affiniteitschromatografie 1.1.2.2. Co-immunoprecipitatie 1.1.2.2.1. Voordelen 1.1.2.2.2. Nadelen 1.1.2.3. Affiniteit-Tags (Constans, 2002) 1.1.2.3.1. Epitoop tagging 1.1.2.3.2. Eiwit-tags 1.1.2.3.3. Andere affiniteits-tags 1.1.2.4. Tandem Affinity Purification (TAP) 1.1.2.4.1. Inleiding 1.1.2.4.2. Overzicht van de TAP-methode (Puig et al., 2001) 1.1.2.4.3. Diversiteit en variaties van TAP-tag cassettes 1.1.2.4.3.1. N-terminale Tag (Puig et al., 2001) 1.1.2.4.3.2. De “Split Tag” (Puig et al., 2001) 1.1.2.4.3.3. De Subtractie methode (Puig et al., 2001) 1.1.2.4.3.4. Localization and Affinity Purification (LAP) (Cheeseman et al., 2005) 1.1.2.4.4. Merking van het doelwit proteinemet de TAP-tag (Puig et al., 2001) 1.1.2.4.5. Voordelen en nadelen 1.1.2.5. Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) 1.1.3. Blue-Native PAGE 1.1.4. Yeast 2 Hybrid 1.1.4.1. Voordelen en nadelen 1.1.5. FRET (Fluorescence/Förster detected Resonance Energy Transfer) 1.1.6. Proteïne-microarray analyse 1.1.7. Proteïne display 1.1.7.1. Faag display 1.1.7.2. Cel gebaseerde display (Li, 2000) 1.1.7.3. Peptide-on-DNA/RNA display (Li, 2000)

1 1 2 3 3 3 3 4 4 5 5 5 8 9 10 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 23

1.2. In silico predictie van eiwit-eiwit interacties 1.2.1. Ontwikkelen van eiwit-eiwit interactie databases 1.2.2. Computationele methoden

25 25 25

1.3. RNA-geïnduceerd Gene Silencing (Waterhouse et al., 2002) 1.3.1. Inleiding 1.3.2. Microprojectiel bombardement en agro-infiltratie 1.3.3. Virus geïnduceerde co-suppressie (VIGS) 1.3.4. Amplicon en hairpin RNA transgenen 1.3.5. Transcriptionele co-suppressie 1.3.6. Toepassing van RNAi in TAP, de iTAP-strategie (Forler et al., 2003) 1.3.7. Vectoren voor RNAi

27 27 28 29 29 30 30 31

1.4. Optimalisatie van transgenexpressie via toevoegen van introns 1.4.1. Studies in planten

32 34

DEEL 2: DOELSTELLING

36

DEEL 3: MATERIAAL EN METHODEN

38

3.1. Gebruikte stammen en cellen 3.1.1. Bacteriële stammen

38 38

Inhoudstafel 3.1.2. Plantencellen

38

3.2. Groeimedia

38

3.3. Vectoren 3.3.1. pDONRTM221 (Invitrogen) 3.3.2. pDonrP4P3 3.3.3. pAGRIKOLA

41 41 42 42

3.4. Recombinante DNA-technieken 3.4.1.BAC-isolatie 3.4.2. Fenolextractie 3.4.3. Plasmidebereidingen 3.4.3.1. Nucleobond DNA zuivering (midi) 3.4.3.2. Promega DNA zuivering op kleine schaal (mini) 3.4.3.3. Roche DNA-zuivering op kleine schaal (mini) 3.4.4. PCR 3.4.5. Restrictiedigesten 3.4.6. Ligatie 3.4.7. Gateway™ Klonering 3.4.7.1. De BP- recombinatie reactie 3.4.7.2. De LR-recombinatie reactie 3.4.8. Agarose Gelelektroforese

43 43 45 46 46 48 50 52 55 57 58 58 60 62

3.5. Transformatie 3.5.1. Transformatie van competente E. coli cellen 3.5.2. Transformatie van competente Agrobacterium tumefacians cellen 3.5.3. Transformatie van PSB-d Arabidopsis thaliana cellen

64 64 66 66

3.6. Eiwittechnieken 3.6.1. Eiwitextractie bereiding voor expressie-analyse 3.6.1.1 Proteïne-concentratiebepaling van proteïne-extracten (bereid met HB-buffer) van Arabidopsis celsuspensies volgens de methode van Bradford. 3.6.2. SDS-PAGE 3.6.2.1. De polyacrylamide gel 3.6.2.2. Behandelen van het staal 3.6.3. Western Blot 3.6.4. Immunodetectie 3.6.4.1. Enhanced Chemiluminescence (ECL) detectie 3.6.4.2. Alkalisch fosfatase detectie 3.6.5. TAP (CBPZZ) protocol 3.6.5.1. TAP- zuivering

69 69

DEEL 4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. Optimalisatie van transgenexpressie door toevoeging van introns. 4.1.1. Kloneringsstrategie 4.1.1.1. Oppikken van genen via PCR 4.1.1.2. Constructie van Entry-vectoren 4.1.1.3. Constructie van TAP-expressievectoren met introns 4.1.2. Transformatie naar PSB-d celsuspensie cultuur 4.1.2.1. Transformatie naar Agrobacterium tumefaciens 4.1.2.2. Transformatie naar PSB-d 4.1.3. Expressie analyse 4.2. Silencing d.m.v. RNAi 4.2.1. Kloneringsstrategie 4.2.1.1. Adaptor-PCR 4.2.1.2. BP-recombinatie reactie

70 71 71 74 76 77 78 79 81 83

86 86 86 86 89 94 96 96 96 98 102 102 102 103

Inhoudstafel 4.2.1.3. LR-recombinatie reactie 4.2.2. Supertransformatie naar transgene CDKA;1-TAP lijnen 4.2.2.1. Transformatie naar Agrobacterium tumefaciens 4.2.2.2. Supertransformatie 4.2.3. Expressie analyse 4.3. C-terminale versus N-terminale tagging 4.3.1. Kloneringstrategie 4.3.1.1. Klonering van de 35S promotor in pDonrP4P3 4.3.1.2. De LR- recombinatie reactie voor N-TAP fusies 4.3.2. Transformatie naar PSB-d plantencellen 4.3.3. Expressie analyse 4.3.4. Tandem Affinity Purification

104 106 106 106 107 110 110 110 112 113 114 117

DEEL 5: SAMENVATTING

119

REFERENTIES:

122

Woord vooraf Ik zou graag Prof Dr. Dirk Inzé willen bedanken voor de aangeboden kans om te mogen werken en leren in het PSB departement van het VIB. Dr. Geert De Jaeger wil ik bedanken voor de mogelijkheid die ik heb gekregen om te werken in de ‘Functional Proteomics’ groep, voor zijn begeleiding en zijn aangename lessen in de eerste licentie Biotechnologie.

Jelle Van Leene wil ik bedanken voor zijn uitstekende begeleiding, geduld en de kennis die ik heb gekregen over het praktische werk in een labo. Je had het nooit te druk om me te helpen en daar ben ik je zeer dankbaar voor. Gert Van Isterdael wil ik bedanken voor wat hij mij geleerd heeft en wens hem veel succes met wat hij zal leren als jonge vader. Eveline Van De Slijke bedank ik voor de hulp op mijn hulpeloze momenten. Geert Persiau, bedankt voor het verklappen van je TAP-geheimen. Jan Geerinck wil ik bedanken voor de hulp (met mijn titelblad onder andere) en de geanimeerde gesprekken. Het voltallige Functional Proteomics groep bedank ik voor het warme welkom, jullie waren een toffe groep om mee samen te werken.

Ik wil mijn ouders, Orlando en Idalina bedanken voor wat ze mij geleerd hebben, mijn moeder voor haar geduld, steun doorheen al deze jaren (Querer é Poder!!!). Dank aan: Mijn broer Artinizio en zus Artinizia voor hun steun. Mijn familie in Rotterdam, mijn grootouders Ricardo Francisco Lopes, Maria Adelaide Lopes en Manuel Santos Junior. Mijn broeders Said en Steffen, Inge en Vicky (voor je steun gedurende al deze jaren en de komende jaren…). Mijn collega’s en vrienden Kevin, Rania, Kim Nijs, Kim, Kirsten, Valerie, Emilie, Renske…

De levenslessen getrokken in mijn Stad (Deurne, Linkeroever, Borgerhout), mijn vrienden van weleer: Rachid, Fohad, Mohamed Boulafati, Mohamed Achrak (R.I.P 26/11/02),... Mijn ex-collega’s in Opel Belgium, vooral Mohamed Akkouh en Ibrahim Akkouh.

Ik dank de mensen die mij gesteund hebben en diegene die dat niet hebben gedaan. Dank aan Felino Alve Jesus en Antonio Cottas.

Falen doet zeer, maar opgeven nog meer. Lopes dos Santos Santiago Guido

Deel 1: Literatuurstudie

Deel 1: Literatuurstudie 1.1. Experimentele detectie van eiwit-eiwit interacties 1.1.1. Inleiding Met het vervolledigen van genoomsequeneringen voor 60 prokaryote organismen en verschillende belangrijke eukaryotische organismen, inclusief het menselijk genoom, is de volgende grote uitdaging het ontcijferen van de relaties tussen de individuele genen en het begrijpen van de moleculaire organisatie van cellulaire netwerken. Dit vereist informatie over de stabiele proteïnecomplexen, die de functionele eenheden zijn van de cellulaire moleculaire machinerie en de studie van kortstondige eiwit-eiwit interacties (Shevchenko et al., 2002). Twee sterke benaderingen zijn populair geworden in het bestuderen van eiwit-eiwit interacties. De eerste is de zuivering van proteïnecomplexen via affiniteitschromatografie gekoppeld aan de identificatie van de componenten via massaspectrometrie (MS) en de tweede is het Yeast 2 Hybrid (Y2H) systeem. De veelzijdigheid en gevoeligheid van de two-hybrid en MS-gebaseerde benaderingen hebben geleid tot het gebruik van deze technieken in het groeiende veld van proteomics. Dit gebruik wordt het beste geïllustreerd met het ambitieus project om het gist interactoom te karteren (Gavin et al., 2006). Two-hybrid en MS-gekoppelde technieken bestuderen verschillende aspecten van eiwiteiwit interacties (binaire interacties en proteïne complexvorming respectievelijk), daarom zal enkel door combinatie van de data bekomen uit complementaire technologieën zoals Y2H-en MS-gebaseerde benaderingen het interactoom in zijn volledigheid ontrafeld worden (Causier et al., 2004).

1.1.2. Detectie op basis van affiniteit

1.1.2.1. Eiwit affiniteitsschromatografie Bij affiniteitsschromatografie wordt een celextract over een kolom gestuurd waarop een ligand geïmmobiliseerd is dat specifiek met het doelwitproteïne zal reageren. Het doelwitproteïne bindt op de kolom en de ongewenste eiwitten worden weggewassen. De

1

Deel 1: Literatuurstudie doelwitproteïnen reageren met verschillende substanties: enzymen met substraten, receptoren met liganden, antigenen met antilichamen, enz. Elutie kan op verschillende manieren gebeuren: er wordt een onderscheid gemaakt tussen harde elutie, b.v.b. met hoog zout, extreme pH, ... en zachte elutie, b.v.b. elutie met een protease. Affiniteitsschromatografie is zeer gevoelig maar valse positieven wegens non-specifieke bindingen zijn wel mogelijk. Bij immuno-affiniteitsschromatografie is het ligand een mono- of polyklonaal antilichaam dat het eiwit van interesse specifiek herkent. Het antilichaam wordt covalent gekoppeld aan een dragermatrix bvb. agarose of sepharose. Op deze kolom wordt dan het eiwitextract geladen dat het eiwit van interesse bevat. Het voordeel van immunoaffiniteitsschromatografie is dus dat er geen transformaties nodig zijn. Een nadeel is dat er voor elk eiwit van interesse wel een specifiek antilichaam vereist is, dat dikwijls niet voorhanden is. Deze methode kan dus niet gebruikt worden om op grote schaal eiwitinteracties te gaan bestuderen (Constans, et al. 2002).

1.1.2.2. Co-immunoprecipitatie Co-immunoprecipitatie is een klassieke methode om proteïne-proteïne interacties te detecteren en werd al in letterlijk duizenden experimenten gebruikt. Het basisexperiment is eenvoudig. Cellysaten worden bereid, antilichaam wordt toegevoegd, het antigen word neergeslaan en gewassen en gebonden proteïnen worden geëlueerd en geanalyseerd. Het antigen gebruikt om de antilichamen te maken kan een gezuiverd proteïne (ofwel van natuurlijk weefsel of organisme of gezuiverd na expressie in een ander organisme) of synthetisch peptide gekoppeld aan een drager zijn; het antilichaam kan poly -of monoklonaal zijn. Een andere mogelijkheid is dat het proteïne een epitoop-tag kan dragen waarvoor commerciële antilichamen beschikbaar zijn (HA - en c-Myc-tags zijn algemeen gebruikte tags) of een proteïne-tag (zoals GST) waarvoor parels beschikbaar zijn voor snelle zuivering van de fusieproteïnen en co-zuiverende proteïnen.

2

Deel 1: Literatuurstudie 1.1.2.2.1. Voordelen  Het antigen en de interagerende proteïnen zijn aanwezig in dezelfde relatieve concentraties als gevonden in de cel, dus artificiële effecten door opzettelijke overproductie van de testproteïne worden vermeden  De proteïnen zijn aanwezig in hun natuurlijke staat van posttranslationele modificatie (v.b. fosforylatie).

1.1.2.2.2. Nadelen  Co-immunoprecipiterende proteïnen interageren niet noodzakelijk rechtstreeks met elkaar, aangezien ze deel kunnen uitmaken van grotere complexen.  Co-precipitatie is niet zo gevoelig als andere technieken, zoals proteïneaffiniteitsschromatografie, omdat de hoeveelheid geprecipiteerd doelwitproteïne lager

is

dan

de

hoeveelheid

gezuiverd

doelwitproteïne

in

affiniteitsschromatografie.

1.1.2.3. Affiniteit-Tags (Constans, 2002)

1.1.2.3.1. Epitoop tagging Deze methode is algemeen toepasbaar en geeft de mogelijkheid om laag abundante eiwitten en eiwitcomplexen te zuiveren. Ectopische genexpressie is noodzakelijk en de tag kan de functie van het eiwit beïnvloeden. Gevoeligheid is belangrijk bij epitoop tagging, daarom gebruikt men meestal tandemkopies van de tag, wat kan leiden tot een betere zuivering en dus een hogere gevoeligheid. Voorbeelden van epitoop-tags zijn:  HA-tag : Hemaglutinine tag bindt anti-HA antilichaam.  FLAG



systeem voor zuivering van fusieproteïnen met de FLAG sequentie

(N-AspTyrLysAspAspAspAsp-Lys-C).

Wordt

primair

gebruikt

voor

3

Deel 1: Literatuurstudie proteïnedetectie maar kan ook gebruikt worden voor affiniteitszuivering. Deze tag bindt een anti-FLAG antilichaam.  c-Myc: deze tag bindt anti-Myc antilichaam.

1.1.2.3.2. Eiwit-tags Normaal worden ze gebruikt als een manier om eiwitten of eiwitcomplexen te zuiveren in standaard condities, daarnaast worden ze gebruikt als hulpmiddel om het fusieproteïne meer oplosbaar te maken (voorbeelden zijn maltose binding protein (MBP), glutathione Stransferase (GST) en thioredoxine) of eiwitten te localiseren (bijvoorbeeld green fluorescent protein of GFP). Een nadeel is wel dat de tags zeer groot zijn. Voorbeelden zijn:  GST-tag: één van de meest voorkomende en oudste affiniteitszuivering methodes gebruikt glutathione als ligand  MBP-tag: heeft affiniteit voor amylose  Proteïne A tag (zie 1.1.2.4.)

1.1.2.3.3. Andere affiniteits-tags  Oligohistidine tags: worden gebruikt bij IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography). De affiniteit van histidine imidazool zijketens voor metaal ionen als nikkel, zink en kobalt wordt hier toegepast.  Strep-Tag: deze fusie methode steunt op de bindingsaffiniteit van biotine voor streptavidine of avidine. De strep-tag is een kort peptide dat de chemische eigenschappen van biotine nabootst en bijgevolg ook bindt aan (strept)avidine. Elutie gebeurt door competitie met biotine of het biotine-analoog desthiobiotine.  CBP-tag: deze tag is gebaseerd op de affiniteit van calmoduline voor het calmoduline bindend peptide (CBP). De interactie is afhankelijk van de aanwezigheid van calcium ionen en van dit principe wordt gebruik gemaakt tijdens de elutie. Chelatie of wegnemen van de calcium ionen met EDTA of EGTA leidt tot disruptie van de binding.

4

Deel 1: Literatuurstudie 1.1.2.4. Tandem Affinity Purification (TAP)

1.1.2.4.1. Inleiding De tandem affiniteitszuivering (TAP) is een algemene procedure om proteïnen te zuiveren onder natuurlijke omstandigheden. Via de TAP-tag krijgen we snelle zuivering van proteïnecomplexen uit cellen, zonder op voorhand de compositie, activiteit of functie van het te onderzoeken complex te kennen. TAP in combinatie met massaspectrometrie laat ons toe de proteïnen te identificeren die met het doelwitproteïne interageren en meegezuiverd werden (Rigaut et al., 1999). Sinds Rigaut et al. (1999) de TAP methode en diens toepassing in de zuivering van eiwitcomplexen uit gist beschreven, zijn in de jaren daarna verschillende studies geweest die de toepassing van TAP in verscheidene andere organismen beschrijven. TAPgezuiverde complexen zijn al geïsoleerd geweest uit bacteriën, gist, zoogdiercellen, insectencellen, tabak, rijst en Arabidopsis. Het TAP-systeem werd al toegepast in proteïnecomplex isolatie uit planten in een transiënt expressie systeem en recentelijk heeft men ook stabiel getransformeerde transgene lijnen kunnen maken met geTAP-tagged proteïne. Zulke benadering laat de moleculaire en functionele karakterisatie van de TAPfusie in context van de hele plant toe, evenals de zuivering van proteïnen onder fysiologische condities. De effecten op eiwitcomplex samenstelling, modificaties en activiteit te wijten aan een wijder arsenaal aan groeicondities, stimuli en plantmateriaal gebruikt gedurende de zuivering kunnen geschat worden (Rubio et al., 2005).

1.1.2.4.2. Overzicht van de TAP-methode (Puig et al., 2001)

Fig. 1.1: Voorbeeld van een TAP-tag gefusioneerd aan een bait X (verschillende variaties zijn mogelijk). Figuur overgenomen uit: http://content.febsjournal.org/content/vol270/issue4/cover.shtml

5

Deel 1: Literatuurstudie De TAP-methode omvat de fusie van de TAP-tag aan de doelwitproteïne (X op de figuur 1.1 , ook wel “bait” genoemd) en het binnenbrengen van dit construct in de gastcel of het gastorganisme, zodanig dat het natuurlijke niveau van expressie van het fusieproteïne (doelwitproteïne + tag) behouden wordt. In gist is homologe recombinatie mogelijk en wordt het endogene eiwit volledig vervangen door het geTAP-tagged eiwit, in planten is dit niet zo. Overexpressie van de proteïne kan vaak leiden tot vorming van non-specifieke en/of niet-natuurlijke proteïne-interacties met de gastcel proteïnen. In het kader van deze thesis werd gebruik gemaakt van PSB-d cel suspensie culturen afgeleid van Arabidopsis thaliana, ecotype Landsberg erecta. Deze cellen hebben een 8C– DNA inhoud (C staat voor de DNA inhoud van het ongerepliceerde haploïde chromosoom complement), d.w.z. dat elke gen in meerdere kopijen (8) voorkomt en de competitie met het endogene eiwit dus zeer groot is, wat overexpressie dikwijls noodzakelijk maakt. De TAP-tag bestaat uit het calmoduline binding peptide (CBP) en twee IgG(Immunoglobuline G) bindende domeinen van het Staphylococcus aureus proteïne A, gescheiden door een TEV (Tobacco Etch Virus)-protease klievingsplaats (Figuur 1.1). De TAP-tag (ongeveerd 20 kDa groot) kan C- of N-terminaal aan de doelwitproteïne gefusioneerd worden. De fusieproteïne en geassocieerde componenten worden uit het celextract gerecupereerd door affiniteits-selectie op een sepharose-matrix waarop covalent humane IgG’s gebonden zijn (Figuur 1.2). De proteïne A-tag zal binden met de IgG-matrix. Deze binding is zeer sterk, waardoor we normaal enkel kunnen elueren onder harde condities (vb. lage pH, chaotrope agentia, ...) waarbij complexen uiteenvallen, maar dankzij de TEVklievingplaats is zachte elutie met het zeer specifieke TEV-protease mogelijk. Na het wegwassen van contaminanten met buffers die de fysiologische condities van de cel nabootsen, voegt men TEV-protease toe om het gebonden materiaal vrij te stellen. TEV-protease knipt de TAP-tag zeer specifiek ter hoogte van de 6 aminozuren lange TEV-klievingssite. Het TEV-protease wordt best in de eerste affiniteitsstap gebruikt om ophoping van TEV-protease na de tweede affiniteitsstap te vermijden, waardoor het zuiveren van het complex moeilijk zou worden, wegens de veelvuldige contaminatie met TEV-protease . Het eluens wordt in aanwezigheid van calcium ionen geïncubeerd met agarose parels die een calmodulinemantel bevatten, deze zullen binden met het Calmoduline Bindend Peptide (de CBP-tag ) op de resterende TAP-tag cassette. Deze tweede affiniteitsstap is nodig om zowel het TEV-protease als sporen van achtergebleven contaminanten uit de 6

Deel 1: Literatuurstudie eerste affiniteitsstap te verwijderen. Na het wassen wordt het gebonden materiaal vrijgesteld met EGTA (dit is een molecule die calcium uit de oplossing cheleert en zo de interactie CBP-calmoduline verbreekt) en kan het geanalyseerd worden (Rigaut et al., 1999). Het gewonnen materiaal kan op verschillende manieren geanalyseerd worden (Figuur 1.3) en activiteitstesten op gezuiverde complexen zijn mogelijk (vb. kinase assays). Voor proteïnecomplex karakterisering worden de proteïnen geconcentreerd en tenslotte gefractioneerd op een denaturerende gel gevolgd door identificatie met behulp van MS. Als alternatief voor identificatie van de componenten kunnen Edman-degradatie of Western Blotting gevolgd door immunodetectie gebruikt worden (Puig et al.,2001). De reproduceerbaarheid en de gevoeligheid kunnen verbeterd worden door het gebruik van 2 onafhankelijke methoden van staalbereiding en complementaire MS-procedures. Krogan et al. (2006) gebruikten voor hun onderzoek in gist “matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight” (MALDI-TOF) en data-afhankelijke “liquid chromatography tandem mass spectrometry “ (LC-MS/MS). Dit is vooral interessant bij proteïnen met lage abundantie en daarnaast leverde LC-MS/MS bijkomende identificaties.

Fig. 1.2: Overzicht van de TAP-methode met de klassieke CPBZZ-tag. Het linkerpaneel stelt de eerste affiniteitsstap voor en in het rechterpaneel ziet men de tweede affiniteitsstap. Figuur overgenomen uit: http://content.febsjournal.org/content/vol270/issue4/cover.shtml

7

Deel 1: Literatuurstudie

Fig. 1.3: Proteïne identificatie d.m.v tandem MS. Een eiwitcomplex wordt gescheiden m.b.v 1D-PAGE en de bandjes van interesse worden uit de gel gesneden, vervolgens aan een digestie met trypsine onderworpen. De bekomen peptiden worden via MS partieel gesequeneerd. Het proteïne wordt via eiwitsequentie databanken geïdentificeerd (Droit et al., 2005).

1.1.2.4.3. Diversiteit en variaties van TAP-tag cassettes TAP van proteïnecomplexen gebruikt 2 sequentiële affiniteits-tags om contaminatie van eiwitten die op niet-specifieke wijze interageren met het gemerkte proteïne of de chromatografische matrices te verminderen. Alternatieve TAP-tags met andere affiniteitstags en protease klievingsplaatsen werden ontwikkeld. De originele CBP-TEV-ZZ TAPtag is duidelijk effectief, er zijn al vele proteïnecomplexen mee geïsoleerd, maar er zijn wijzigingen in het originele TAP-tag gemaakt om potentiële problemen met diens onderdelen te voorkomen. Eén van deze problemen is de grootte van de tag, deze zou de werking van de tag kunnen verminderen of de complexvorming met andere eiwitten verhinderen. Er zijn vele interactie- en immuno-affiniteits-tags (grootorde van 5 tot 51 aminozuren) die gebruikt kunnen worden i.p.v CBP en ProtA (Brown et al., 2006). Voorbeelden van kleinere TAP-constructen zijn de “sequential peptide affinity”(SPA)tags, gemaakt door substitutie van het ProtA domein (137 aminozuren) met de 3x FLAG-

8

Deel 1: Literatuurstudie epitoop (22 aminozuren) (Zeghouf et al., 2004) of vervanging van CBP met een spacer en een enkele FLAG-sequentie (Kneusel et al., 2003). Rubio et al. (2005) construeerden een alternatief TAP-systeem, namelijk de TAPa-tag die gelinkt werd aan een subunit van het COP9-signalosoom. De TEV-protease klievingsplaats werd vervangen door de meer specifieke (8 aminozuren) en bij lage temperatuur actieve rhinovirus 3C-protease site. Hierbij kan de tweede purificatiestap uitgevoerd worden via twee verschillende affiniteits-tags, namelijk een zes histidine (6xhis) repeat of negen kopijen van de c-myc tag (9xmyc). In tegenstelling tot de originele TAP-strategie, kunnen alle stappen bij TAPa-zuivering efficiënt uitgevoerd worden bij 4°C i.p.v bij 16°C tijdens TEV-elutie, wat meer stabiele complex isolatie zou moeten toelaten. De laatste elutiestap vergt geen EDTA of EGTA, wat zou moeten helpen zowel bij het behoud van de integriteit van bepaalde complexen als bij het behoud van activiteit van kation-afhankelijke enzymen zoals metalloproteasen. Nog een andere trifunctionele zuiverings-tag werd gemaakt, 65 aminozuren groot, bestaande uit CBP, 6xHis en de 3x haemaglutinine (HA)-epitoop. Deze tag werd gebruikt om interagerende proteïnen in S. cerevisiae te identificeren (Honey et al., 2001). De noodzaak voor kleinere of veranderde TAP-tags voor het isoleren van specifieke proteïnen in natieve complexen zal op empirische basis moeten bepaald worden. Het testen van de functionaliteit van gemerkte proteïnen d.m.v. complementatie van knock-out mutanten kan een indicatie geven van de kans op slagen van de TAP-tag, maar factoren zoals het expressieniveau van de TAP-constructen, de hoeveelheid startmateriaal waaruit complexen worden gezuiverd en het gebruik van N- of C-terminale merking van de “bait” kunnen kritische factoren zijn in het succes van TAP-experimenten (Brown et al., 2006). 1.1.2.4.3.1. N-terminale Tag (Puig et al., 2001)

Fig. 1.4: Schematische voorstelling van de C-en N- terminale TAP-tags. Eventueel kan het NTAP-construct Cterminaal enterokinase bevatten, maar dit is geen vereiste voor de correcte werking van NTAP-fusies (Puig et al., 2001)

9

Deel 1: Literatuurstudie Soms zal de toevoeging van een C- terminale tag aan een gisteiwit via homologe recombinatie diens functie verhinderen en leiden tot een groeidefect of zelfs celdood van de haploïde cel wanneer het eiwit essentieel is en het niveau van activiteit dat behouden werd onvoldoende is om het leefbaar te houden. Dit gebeurt niet frequent, slechts in 5% van de door Puig et al. (2001) geteste proteïnen. Een simpel alternatief is het toevoegen van de tag aan de amino-terminus van het doelwitproteïne. De N-terminale TAP-tag bevat dezelfde modules als de C-terminale TAP-tag, maar in omgekeerde volgorde (Figuur 1.4). Aangezien de Proteïne A module tijdens de eerste affiniteitsstap moet afgekliefd worden, moet het zich bevinden aan de extreme terminus van het proteïne. Er werd ook een enterokinase (EK) klievingsplaats geïntroduceerd stroomafwaarts van het CBP, zodat volledige verwijdering van tag residu’s van het gemerkte eiwit mogelijk is. 1.1.2.4.3.2. De “Split Tag” (Puig et al., 2001) Een tweede variatie van de originele TAP-methode bestaat uit de toevoeging van de 2 functionele helften van de TAP-tag aan 2 verschillende proteïnen van hetzelfde complex. Met andere woorden de Proteïne A en TEV-protease klievingsplaats worden gefusioneerd aan 1 proteïne terwijl CBP gefusioneerd wordt aan een tweede doelwitproteïne. Deze techniek laat de zuivering toe van eiwitcomplexen die 2 gegeven proteïnen bevatten, zelfs wanneer er maar een kleine fractie van de doelwitproteïnen geassocieerd is, m.a.w. wanneer grote fracties vrij of gebonden blijven aan andere complexen. 1.1.2.4.3.3. De Subtractie methode (Puig et al., 2001) Deze strategie is nuttig wanneer 2 of meer complexen een gemeenschappelijke subunit delen, maar enkel 1 van deze complexen ons interesseert. Een proteïne specifiek voor het ongewenste complex wordt gefusioneerd aan ProteïneA (zonder de TEV-klievingsplaats). Terwijl beide complexen worden weerhouden op de eerste IgG-affiniteitsskolom, kan het ongewenste complex niet geëlueerd worden aangezien de ProtA-gemerkte specifieke subunit vastgehecht blijft aan de matrix. Alleen het doelwitcomplex wordt geëlueerd en gezuiverd tijdens de tweede stap.

10

Deel 1: Literatuurstudie 1.1.2.4.3.4. Localization and Affinity Purification (LAP) (Cheeseman et al., 2005) Naast de originele TAP-tag (CBP,TEV, Proteïne A), zijn er nog talrijke andere variaties gebaseerd op andere purificatie-tags mogelijk, inclusief 6xHis (bindt met nikkel), Speptide (bindt aan S proteïne), haemaglutinine (HA)-peptide (herkend door antilichamen tegen HA) en c-myc peptide (herkend door antilichamen tegen c-myc) evenals andere sitespecifieke proteases waaronder Amersham’s PreScission protease 3C (i.p.v. TEV). TAP-tag procedures zijn voornamelijk in gist gebruikt, waar homologe recombinatie efficiënte integratie van de tag aan de C-terminus van de genomische locus in een haploïde stam toelaat. Hoewel er methoden bestaan om vele andere eukaryoten te transformeren, verhindert de lagere efficiëntie van homologe recombinatie (in vergelijking met gist) de high-throughput moleculaire vervangingen om op een effectieve wijze de TAP-tag strategie te gebruiken. Om procedures te ontwikkelen die de analyse van proteïnecomplexen vergemakkelijken in metazoa, inclusief in Caenorhabditis elegans en humane cellen, ontwierpen Cheeseman et al. (2005) een gemodificeerde versie van de TAP-tag, die met behulp van het ‘Green Fluorescent Protein’ (GFP) kan gebruikt worden om proteïnen te lokaliseren in levende cellen. In deze zuiveringsmethode wordt GFP ook gebruikt als eerste purificatie-tag (i.p.v het ZZ-domein van proteïne A in de originele TAP-tag). Omdat dit type van genetische tag kan gebruikt worden voor lokalisatie en affiniteitszuivering, noemen Cheeseman et al., (2005) deze techniek “Localization and affinity purification” (LAP)-tag (Figuur 1.5). Het gebruik van GFP als de primaire purificatie-tag heeft twee bijkomstige voordelen. Ten eerste, getransformeerde cellen of stammen kunnen geïdentificeerd worden door het screenen naar fluorescentie en cellen of stammen die een voldoende hoeveelheid van het fusieproteïne expresseren kunnen geselecteerd worden ofwel door gebruik van een fluorescentiemicroscoop of met behulp van flowcytometrie. Ten tweede de lokalisatie dynamica van het geëxpresseerde fusieproteïne kan dienen als een partiële indicator van diens functionaliteit. Bijvoorbeeld, wanneer het endogene proteïne zich bevindt ter hoogte van de mitotische chromosomen, dan zou de geëxpresseerde LAP-fusie zich ook moeten bevinden ter hoogte van de mitotische chromosomen. Hoewel dit niet het equivalent is van “genetic rescue” in haploïde gistcellen, geeft het enige indicatie of het exogeen geëxpresseerde proteïne de functie behoudt van het endogene proteïne.

11

Deel 1: Literatuurstudie

Fig. 1.5: N-en C- terminale LAP tag: een overzicht van de LAP zuiveringsmethode. Bij het gebruik van de S-proteine elueert men met ureum, gebruikt men 6xHis als tag, dan gebeurt de elutie met EDTA Fig. overgenomen uit (Cheeseman et al., 2005)

De LAP-strategie zou moeten werken in elk organisme waarin het mogelijk is om een stabiele transformant te maken. Deze strategie werd reeds succesvol gebruikt in C. elegans en humane cellen. Het zou mogelijk moeten zijn om deze techniek aan te passen aan Escherichia coli, fungi, Arabidopsis, Drosophila en de meeste andere organismen.

1.1.2.4.4. Merking van het doelwit proteinemet de TAP-tag (Puig et al., 2001) Gewoonlijk kunnen standaard DNA-kloneringprocedures (vb m.b.v restrictie-enzymen of Gateway-kloneringen) gebruikt worden om N- of C-terminale TAP-tag fusies in de juiste expressievector te maken, ‘in frame’ met de coderende regio van het eiwit van interesse. De recombinante expressievector kan transiënt of stabiel in de cel of organisme worden gebracht. In het meest optimale geval zou het gemerkte construct gebruikt moeten worden om het endogene wild type (WT) gen te vervangen, maar dit is niet altijd mogelijk. Wegens de hoge efficiëntie van homologe recombinatie in gist is er geen plasmide nodig om de TAP-tag te fusioneren aan het eiwit van interesse. Polymerase kettingreactie (PCR) fragmenten kunnen gebruikt worden om de TAP-tag direct in het genoom te kloneren. Cterminale TAP-tags worden preferentieel gebruikt, want op deze wijze wordt de expressie van het doelwitproteïne onder de controle van diens natuurlijke promotor geplaatst.

12

Deel 1: Literatuurstudie 1.1.2.4.5. Voordelen en nadelen De complete TAP-zuivering kan in minder dan een dag uitgevoerd worden. De kloneringen, transformaties en het upscalen in plantencelculturen neemt ongeveer 3 maand in beslag. De totale kosten zijn laag, wat toepassingen op grote schaal toelaat. De zuivering bestaat uit 2 zachte elutiestappen, ondanks de sterke binding, nodig voor een hoge opbrengst, en gebeurt in buffers die fysiologische condities van de cel nabootsen. Dit resulteert in het behoud van de integriteit van de complexen. De ganse TAP-procedure gebeurt bij 4°C (behalve TEV-elutie bij 16°C) om eiwitafbraak te vermijden. Wanneer zeer onstabiele eiwitten geTAP-tagged zijn, kan de TEV-elutie ook overnacht bij 4 oC gebeuren. Problemen kunnen ontstaan wanneer een subunit van het doelwitcomplex een TEVprotease klievingsplaats bevat, dit gebeurt zeer zelden gezien de hoge specificiteit van het TEV-protease . EGTA kan de stabiliteit van het complex beïnvloeden en zo de functionele karakterisering van de activiteit van het complex belemmeren, maar niet de subunit identificatie. De TAP-procedure is veelzijdig. Vergeleken met andere tags zoals, de c-myc of HA-tag, geeft TAP hogere opbrengsten van affiniteit-gezuiverde proteïnen en een lagere achtergrond van niet-specifiek geassocieerde proteïnen. (Shevchenko et al., 2002). De TAP-procedure heeft gelijkaardige toepassingen als de Yeast 2 Hybrid methode, maar een verschil is dat onder de gegeven omstandigheden, zowel direct als indirect interagerende componenten in 1 enkel experiment kunnen geïdentificeerd worden. Het TAP-systeem geeft ook een indicatie van de stoichiometrie van de proteïnen in een gegeven complex en laat directe biochemische analyse toe van de gezuiverde proteïnen, in het bijzonder de activiteit van mutante complexen kunnen gemakkelijk geanalyseerd worden. TAP wordt niet enkel gebruikt om eiwit-eiwit interacties te identificeren, maar daarnaast kunnen liganden die meegezuiverd worden ook gekarakteriseerd worden. De relatieve gevoeligheid en foutmarges van de TAP-strategie en het Y2H systeem moeten nog bepaald worden. Vermeldenswaardig is dat alle 10 U1 snRNP (small nucleolar ribonucleoproteïnen) specifieke proteïnen geïdentificeerd werden met de TAP-methode, terwijl geen enkel U1 snRNP-specifiek proteïne werd gevonden met Yeast 2 Hybrid, waarbij 2 verschillende gist U1 snRNP-proteïnen werden gebruikt als “bait” (Rigaut et al., 1999).

13

Deel 1: Literatuurstudie Een eigenschap van de TAP-methode is de mogelijkheid tot automatisering. PCRs, selectie van klonen en het opgroeien van culturen kan worden uitgevoerd door robots. Op deze manier is analyse op grote schaal van proteomen technisch uitvoerbaar, de TAPmethode zou daarom een belangrijke techniek kunnen worden voor proteoom exploratie. Gecombineerd met geautomatiseerde MS-analyse zal de hoeveelheid data voorhanden over proteïne-interacties drastisch stijgen (Puig et al., 2001).

1.1.2.5. Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT)

In parallel met Y2H en proteïnechip technologie zal MS van proteïnecomplexen gezuiverd d.m.v. enkele of tandem affiniteitstappen de nood aan complex specifieke immunoglobulinen elimineren en maakt het de analyse van zeer kleine hoeveelheden op een proteoom-wijde schaal mogelijk. Deze benadering kan uitgevoerd worden onder fysiologische omstandigheden en vervangt de reconstructie van interactie netwerken uit binaire interactie data. De Gavin et al,(2002) en Ho et al. (2002) studies gebruikten SDSPAGE om affiniteit-gezuiverde proteïnemengsels te scheiden voor MS-analyse. Daarbij ontstonden problemen typisch gelinkt aan deze techniek, inclusief beperkingen in de dynamische reikwijdte van detectie, variabele peptide elutie efficiëntie van de polyacrylamide matrix en selectie tegen proteïnen met eigenschappen die analyse door SDS-PAGE verhinderen (e.g. ongewoon hoge of lage moleculaire massa’s, diffuse migratie, co-migratie met contaminanten en zwakke binding aan “stain”). Om deze problemen te omzeilen demonstreerden McCormack et al. (1997) de mogelijkheid om een digest van proteïnecomplexen te analyseren door rechtstreeks gebruik van een 1dimensionale vloeibare chromatografie. Een verbetering van deze methode, namelijk Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT), breidde diens toepassing uit naar grote proteïnecomplexen en is een betrouwbaar alternatief voor gel-afhankelijke proteïnescheiding. MudPIT is afhankelijk van de digestie in een oplossing van het te analyseren proteïnemengsel en van de scheiding van het resulterende complexe peptidemengsel door multidimensionele capillaire chromatografie in parallel met een ion trap massaspectrometer. Deze techniek zorgt voor snelle identificatie van proteïnen die interageren met de gemerkte “bait”. MudPIT is een interessant alternatief voor de traditionele methoden voor snelle identificatie van eiwit-eiwit interacties voor stoichiometrische en substoichiometrische partners. Peng et al. (2003) gebruikten een multidimensionale benadering gelijkaardig aan MudPIT om honderden kandidaat 14

Deel 1: Literatuurstudie geubiquitinyleerde proteïnen in “budding” gistcellen te identificeren. Graumann et al. (2004) konden op een reproduceerbare manier betrouwbare partners voor het gist eiwit Gcn5p (transcriptionele co-activator) identificeren. Ze pasten MudPIT ook succesvol toe bij het snel screenen doorheen een collectie van gemerkte polypeptiden om nieuwe proteïne-interacties te identificeren. Vijfentwintig proteïnen betrokken bij transcriptie en progressie doorheen de mitose werden gemodificeerd met een nieuwe TAP-tag (9xHis – 2 PreScission protease klievingsplaatsen – 9xMyc). TAP-MudPIT analyses van 22 giststammen die deze gemerkte eiwitten expresseerden, brachten 21 interagerende partners voor 21 van de baits aan het licht, een getal dat overeenkomt met de traditionele technieken. Vergelijking van proteïnen geïdentificeerd via verschillende MudPIT-analyses met verschillende baits uit verschillende subcellulaire compartimenten en pathways maakten het uitfilteren van non-specifieke contaminanten mogelijk. Naast de proteïne identificatie, kan een parallelle analyse van post-translationele modificaties worden uitgevoerd. MudPIT in combinatie van MS zou van een gespecialiseerde analytisch chemische omgeving naar een traditioneel celbiologie laboratorium kunnen getransfereerd worden. Routine toepassing van MudPIT stelt celbiologen in staat om onderzoek te doen naar dynamische veranderingen in proteïne interacties als antwoord op specifieke chemische of biologische liganden, verstoring van het milieu of mutaties (Graumann et al., 2004).

1.1.3. Blue-Native PAGE Voor diepgaand onderzoek van eiwitcomplexen ontwikkelden Schägger et al. (2001) een nieuwe, experimentele techniek om de individuele componenten van verschillende eiwitcomplexen te onderzoeken. Door de combinatie van milde detergenten en de kleurstof ‘Coomassie blue’, die het sterk denaturerend detergent SDS (sodium dodecyl sulphate) vervangen, werd het voor het eerst mogelijk om intacte proteïnecomplexen te scheiden via elektroforese. Refererend naar de blauw gekleurde gel en de zachte methode van oplosbaar maken, waarbij natieve en enzymatisch actieve eiwitcomplexen bekomen worden, werd deze techniek Blue Native-Polyacrylamide Gel Elektrophoresis (BNPAGE) genoemd. BN-PAGE is een ladingsshift methode, waar de elektroforetische mobiliteit van een multiproteïne complex bepaald wordt door de negatieve lading van de gebonden Coomassie kleurstof en de grootte en vorm van het complex. De samenstellende eiwitten van een

15

Deel 1: Literatuurstudie complex kunnen in de tweede dimensie verder gescheiden worden via SDS-PAGE. De samenstellende eiwitten van een complex worden op eenzelfde vertikale lijn gescheiden en kunnen visualiseerd worden via kleuring van het gel. Spots kunnen uitgeknipt worden en gesequeneerd via MS.

1.1.4. Yeast 2 Hybrid Analytische studies van eukaryotische transcriptiefactoren waren de inspiratie voor de ontwikkeling van het Yeast 2 Hybrid (Y2H) systeem. Men ontdekte dat het DNA-bindend domein (BD) en het transcriptie-activatie domein (AD) van vele proteïnen functioneel en fysisch gescheiden kon worden. Het BD gaat het proteïne op specifieke DNA-sequenties binnen het genoom binden, terwijl het AD de transcriptie machinerie gaat activeren tot gentranscriptie. Deze modulaire eigenschap werd verder gedemonstreerd wanneer een actieve transcriptiefactor gecreëerd werd door fusie van BD van 1 proteïne aan de AD van een niet gerelateerde proteïne. Later werd aangetoond dat de 2 domeinen niet aanwezig moesten zijn op hetzelfde polypeptide. Transcriptionele activatie onstaat enkel wanneer de 2 domeinen fysisch aan elkaar gelinkt zijn (Figuur 1.6). Fields en Song (1989) ontdekten dat het mogelijk was om BD (bait) en AD (fish of prey) van een transcriptiefactor samen te brengen door het fusioneren van elk aan een paar van fysisch interagerende proteïnen. Deze ontdekking leidde tot het ontstaan van het Y2H-systeem, een genetische methode van eiwit-eiwit interactie onderzoek. Het Y2H-systeem kan gebruikt worden om cDNA-bibliotheken van AD-hybriden te screenen voor identificatie van eiwitten die binden met het eiwit van interesse. Er bestaan verschillende versies van Y2H met DNA-bindende domeinen die afgeleid zijn van de gist GAL4-transcriptiefactor (GAL4-systeem) of het bacteriële repressor proteïne LexA gebruikt in combinatie met E. coli B42 AD (LexA-systeem) (Causier, 2004). Transcriptionele activatiedomeinen zijn afgeleid van het GAL4 proteïne of van het herpes simplex virus VP16 proteïne. Er worden verschillende rapporteergenen gebruikt, namelijk het E. coli LacZ gen en selecteerbare gistgenen (HIS3, LEU2, ADE2). Er zijn verscheidene cDNA-bibliotheken die als fusie met AD gekloneerd zijn, commercieel beschikbaar, zodat het screenen naar eiwitinteracties in vele verschillende organismen of specifieke zoogdierweefsels mogelijk is (Phizicky et al., 1995).

16

Deel 1: Literatuurstudie Een variatie van Y2H is het Yeast Three-Hybrid systeem, deze wordt o.a. gebruikt voor de identificatie van RNA-eiwit interacties. De algemene methode is dat een hybride RNA bindt aan elk van de twee hybride eiwitten. Eens dit complex gevormd is wordt de transcriptie van een reportergen geactiveerd. De expressie van het reportergen kan fenotypisch geïdentificeerd worden of via een eenvoudige biochemische assay. Deze techniek kan gebruik worden wanneer het RNA en eiwit beide gekend zijn of het kan gebruik worden om een “partner” te identificeren wanneer enkel 1 component (RNA of eiwit) gekend is (Zhang et al., 1999).

1.1.4.1. Voordelen en nadelen

Het Y2H systeem is zeer gevoelig en detecteert eiwit-eiwit interacties die niet door andere methodes kunnen gedetecteerd worden. De minimale detecteerbare affiniteit-interactie zal afhangen van variabelen zoals expressieniveau van de hybride proteïnen, het aantal, de sequentie en de schikking van de DNA-bindende sites in het reportergen en de hoeveelheid reporter proteïne nodig voor een detecteerbare fenotype. Een ander voordeel is dat de interacties gedetecteerd worden in een cellulaire omgeving en dus geen biochemische zuivering nodig is. Het gebruik van genetisch-gebaseerde organismen zoals gistcellen als gastheercel voor het bestuderen van interacties laat toe direct te selecteren voor interagerende proteïnen en te screenen voor een groot aantal varianten om diegenen te detecteren die meer of minder sterk zouden kunnen interageren. Het Y2H-systeem is gelimiteerd tot proteïnen die naar de nucleus getranslokeerd worden, wat het gebruik ervan voor bepaalde extracellulaire proteïnen verhinderd. De proteïnen moeten kunnen opgevouwen worden en stabiel kunnen zijn in gistcellen om hun activiteit als fusieproteïnen te behouden. Interacties, afhankelijk van een posttranslationele modificatie die niet voorkomt in gistcellen, zullen niet gedetecteerd worden (Phizicky et al., 1995). Het bestuderen van planteneiwitten in gist lukt dan ook niet altijd. Een groot nadeel is de hoge frequentie aan vals positieven, bvb. wanneer de target of bait transcriptiefactoren zijn, zij bezitten dan namelijk reeds een DB en AD.

17

Deel 1: Literatuurstudie

Fig. 1.6: Twee hybriden worden geconstrueerd: cel a bevat een plasmide dat codeert voor een ‘DNA binding domain’ (BD) dat zal fusioneren met een bepaald doelwitproteïne (target), cel alfa bevat een plasmide dat codeert voor een ‘activation domain’ (AD) dat zal fusioneren aan een bepaald doelwitproteïne (bait). Bij interactie tussen beide cellen zal er trancriptionele activatie optreden wanneer BD en AD elkaar herkennen. In dit geval wordt het lac-Z gen ook overgeschreven Dit gen codeert voor het enzym βgalactosidase, dat in staat is om de kleurloze stof X-gal om te zetten in een blauw gekleurd product. Figuur overgenomen uit: http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Proteomics.html

1.1.5. FRET (Fluorescence/Förster detected Resonance Energy Transfer) Wegens de complexe organisatie en de compartimentalisatie van plantencellen is het zeer waarschijnlijk dat moleculaire gedragingen in een testbuis verschillen met die in een cel, daarom is het van essentieel belang om moleculen in hun natuurlijke omgeving te bestuderen. Verschillende, innovatieve microspectroscopische benaderingen voorzien zulke mogelijkheden, de hoge ruimtelijke resolutie van microscopie combinerend met spectroscopische technieken, om zo informatie te bekomen over het dynamisch gedrag van moleculen. Methoden om interacties te visualiseren kunnen gebaseerd zijn op FRET, bvb. in fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM).

18

Deel 1: Literatuurstudie Bij het bestuderen van het gedrag van eiwitten met spectroscopische methoden is het essentieel om de moleculen te merken met een fluorescente groep. Interactie tussen twee eiwitten kan gevisualiseerd worden wanneer ze gemerkt zijn met de juiste fluoroforen.

Fig. 1.7: wanneer fusie-eiwit A-CFP interageert met B-YFP kan er fluorescentie resonantie energie transfer optreden, detectie van de opgetreden emissie toont interactie tussen A en B aan. Figuur overgenomen uit: http://meds.queensu.ca/qcri/greer/ri_pag.htm

Wanneer de fluoroforen in nauw contact komen met elkaar, kan energie getransfereerd worden door een proces dat FRET (Förster, 1948) wordt genoemd (Figuur 1.7). Dit proces is gebaseerd op het fenomeen dat de excitatie-energie van een donor naar een acceptor molecule wordt overgedragen. FRET treedt op wanneer de emissie - en excitatie spectra van het fluorofore paar overlappen en wanneer de afstand tussen de proteïnen zeer klein is (maximaal 7 nm). Dus interacties tussen eiwitten in grote complexen of het binden van moleculen aan grote transmembrane eiwitten kunnen moeilijk te observeren zijn. FRET is dus ook een goede methode voor het bekomen van informatie over afstanden in macromoleculaire complexen. Fusieconstructen van de proteïnen van interesse met varianten van fluorescente proteïnen kunnen genetisch bereid worden en intracellulaire interacties kunnen geregistreerd worden d.m.v. FRET. Geschikte donor-acceptor paren zijn ‘cyan fluorescent protein’ (CFP) als donor en ‘yellow fluorescent protein’ (YFP) als acceptor. Een nadeel van FRET is de nood aan externe belichting om de fluorescentie-transfer te initiëren wat kan leiden tot achtergrond storing wegens de directe excitatie van de acceptor. Om dit probleem te omzeilen werd BRET (Bioluminiscence Resonance Energy

19

Deel 1: Literatuurstudie Transfer) ontwikkeld. Deze techniek gebruikt het bioluminiscente luciferase ipv CFP om de initiële foton-emissie, compatibel met YFP , te produceren. Microspectroscopische technieken zijn in volle bloei, aangezien ze de enige methoden zijn die ons toelaten binnen de levende cel te kijken (Hink et al., 2002).

1.1.6. Proteïne-microarray analyse Het onderzoeksgebied van proteïne-microarray werd opgestart om het expressieprofiel van proteïnen en hun functie te analyseren (MacBeath, 2002). Om een proteïnechip (biochip) te maken worden natieve eiwitten of eiwitten die tot expressie werden gebracht door genetische manipulatie, gezuiverd en geïmmobiliseerd op een plaat. Arrays zijn een geordende opstelling van individuele stalen (bvb eiwitten), die parallelle analyse van de stalen toelaat. Een hoge dichtheid proteïnechip (de analytische efficiëntie is direct gerelateerd aan de dichtheid) kan gemaakt worden, wanneer proteïnen gescheiden worden door 2D-elektroforese en via elektroblotting op de chip worden aangebracht. Echter, chips, waarop de doelproteïnen rechtstreeks van de gel getransfereerd kunnen worden, zijn voorlopig nog niet beschikbaar. High-throughput analyse van de eiwit-eiwit interactie kan uitgevoerd worden wanneer de proteïnen die interageren met de doelproteïnen op de chip geïdentificeerd worden door MS. De detectiemethode die momenteel de voorkeur draagt is detectie m.b.v fluorescentie . Proteïne-microarrays worden gebruikt voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties, voor de identificatie van substraten van proteïne-kinasen of voor de identificatie van doelwitten van biologisch actieve, kleine moleculen. Deze techniek heeft een groot potentieel voor de high-throughput analyse van proteïnen interagerend met duizenden plantenproteïnen gescheiden door 2D-elektroforese. Het is een belangrijk platform voor functional genomics en wordt tegenwoordig ook vaak gebruikt in medische diagnostiek. Proteïne-microarray analyse heeft te kampen met verschillende problemen, bijvoorbeeld, sommige proteïnen veranderen van conformatie wanneer ze in contact komen met de chip en verliezen zo hun activiteit. Het beschikbaar stellen van op kwaliteit geteste moleculen voor immobilisatie is dus van primair belang. In vele gevallen is de oppervlakte van de plaat chemisch gemodificeerd en zijn de proteïnen covalent geïmmobiliseerd met de modificatie groep. Om deze techniek populairder te maken is het nodig om het materiaal van de chip te verbeteren.(Hirano et al., 2004). Immobilisatie strategieën en inerte

20

Deel 1: Literatuurstudie oppervlakken, geschikt voor het immobiliseren van eiwitten zonder interferentie, moeten ontwikkeld worden. (Honoré et al., 2004) Naast proteïnechips bestaan er ook chips voor antilichamen, antigenen, liganden en koolhydraten (Figuur 1.8) (Zhu et al., 2003).

Fig. 1 8: Toepassingen van proteïne-microarrays. Er bestaan twee soorten, namelijk functionele en analytische arrays. Fig overgenomen uit: www.stat.purdue.edu

1.1.7. Proteïne display Display technologie refereert naar een verzameling van methoden voor het creëren van bibliotheken van biomoleculen die gescreend kunnen worden voor de gewenste

21

Deel 1: Literatuurstudie eigenschappen. Het is een routine methode geworden voor het verrijken van moleculaire diversiteit en het produceren van nieuwe types van proteïnen. De combinatie van de steeds groter wordende variëteit aan bibliotheken met de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om te selecteren voor een wijd arsenaal van gewenste eigenschappen, heeft op grote schaal analyses van eiwit-eiwit en eiwit-substraat interacties, snelle isolatie van antilichamen (of mimetisch antilichaam) zonder immunisatie en functie afhankelijke proteïne-analyse vergemakkelijkt. Verschillende praktische en theoretische uitdagingen moeten nog aangepakt worden voordat display technologie gemakkelijk kan toegepast worden bij proteoom studies (Li, 2000).

Fig. 1.9: Een schematische diagram van een typisch display module en een lijst van de 4 grote display systemen. (Li, 2000)

1.1.7.1. Faag display Faag display maakt gebruik van de capaciteit van fagen om proteïnen gefusioneerd aan een manteleiwit tot expressie te brengen op hun oppervlak (Mullaney et al., 2001). Door het kloneren van bijvoorbeeld willekeurige oligonucleotiden in de coderende sequentie van virale manteleiwitten, kan men een bibliotheek maken van virussen, waarin elk virus een bepaalde peptidesequentie als deel van het manteleiwit presenteert (Figuur 1.9) (Li, 2000). Verschillende banken van genfragmenten of cDNA’s die coderen voor proteïnen of proteïnedomeinen kunnen geëxpresseerd worden (Mullaney et al., 2001). Na constructie van de faagbank wordt deze gescreend met een ligandproteïne of antilichaam om 22

Deel 1: Literatuurstudie specifieke fagen die een bindingspartner expresseren te identificeren. Het antilichaam of ligandproteïne wordt geïmmobiliseerd aan een vast materiaal. Fagen die niet binden worden weggewassen, terwijl gebonden fagen geëlueerd worden en aangewend worden voor re-infectie van E. coli. Door herhaalde cyclussen van affiniteitszuivering wordt een hoge selectiviteit bekomen, ook bij het gebruik van grote en complexe banken. Om bepaalde gewenste display voordelen te bekomen, werden verschillende virale systemen gebruikt, waaronder lysogene filamenteuze fagen, lytische faag lambda, T7 bacteriofaag en T4 bacteriofaag.

1.1.7.2. Cel gebaseerde display (Li, 2000) Bij cel gebaseerde systemen wordt een complementair DNA (cDNA) bibliotheek, die codeert voor verschillende proteïnen, recombinant tot expressie gebracht in cellen en gebeurt selectie via binding van een specifieke ligand op het celoppervlak. Een cel gebaseerde display van grote cDNA bibliotheken in zoogdiercellen vereist efficiënte gentransfer, bijvoorbeeld via een virale vector om DNA te introduceren. In gist en andere prokaryotische systemen is dit een minder groot probleem, want daar gebeurt de transformatie efficiënter. Bijvoorbeeld E. Coli flagelline 26 werd al gebruikt voor display. In beide gevallen wordt de cellulaire gast gebruikt om de modulaire link te bewerkstelligen tussen het coderende DNA en de tentoongestelde peptiden/proteïnen (Figuur 1.9). De waarde van het gebruik van cellulaire gastcellen wordt waarschijnlijk onderschat, want het wordt steeds duidelijker dat post-translationele modificaties van biomoleculen essentieel zijn voor hun functie.

1.1.7.3. Peptide-on-DNA/RNA display (Li, 2000) Peptide-on-plasmid (DNA coderend) is een systeem waar een bibliotheek van plasmiden, willekeurige peptiden gefusioneerd aan een DNA-bindend proteïne expresseert (Figuur 1.9). Omdat de peptide-DNA-bindende proteïnefusie in een gegeven bacterie gecodeerd wordt door het corresponderende plasmide, laat de vorming van modulair gecodeerde peptide-plasmide complexen toe te selecteren voor individuele peptiden van interesse door de recuperatie van het gebonden plasmide.

23

Deel 1: Literatuurstudie In tegenstelling tot de peptide-on-plasmide display start de polysoom display (RNA coderend) met een pool van RNA gesynthetiseerd door transcriptie in vitro. Na in vitro translatie onder de juiste condities, vormen de gesynthetiseerde peptiden een complex met het coderende RNA via een niet-covalente of covalente chemische binding. Covalente chemische binding wordt meestal bereikt door in vitro translatie uit te voeren met een RNA-DNA fusie template waar elke peptide coderende RNA molecule in de bibliotheek individueel gefusioneerd is aan een gemeenschappelijk ssDNA fragment waaraan chemisch een puromycine werd vastgehecht. Onder deze omstandigheden komt de in vitro translatie tot stilstand op het einde van het RNA open leesraam (ORF) en het RNA-DNA knooppunt. Dit laat toe dat het cis-vastgehechte puromycine de ribosomale A-site betreedt en een covalente link vormt met de C-terminus van de corresponderende, groeiende peptideketen. Deze modulaire proteïne – DNA (of RNA) complexen in deze systemen zijn vrij van de selectieve druk van biologische gastheren en bezitten de mogelijkheid tot daaropvolgende biochemische of chemische modificatie van de peptiden.

24

Deel 1: Literatuurstudie 1.2. In silico predictie van eiwit-eiwit interacties De ontwikkeling van systematische bioinformatica benaderingen, die de eiwitfunctie kunnen bepalen en voorspellen en omschrijven hoe deze macromoleculen interageren binnen complexe netwerken, is in volle opmars. Deze bioinformatica methoden bevatten welbekende en nieuwe benaderingen, bvb. ‘data mining’, annotatie d.m.v. sequentie gelijkenis, fylogenetische profilering, metabolisch pathway mapping, ‘gene neighbor’ en domeinnaam fusie analysen. 1.2.1. Ontwikkelen van eiwit-eiwit interactie databases Verschillende werkgroepen hebben geprobeerd databases van eiwit-eiwit interactie data te compileren. Data opslagplaatsen zoals BIND, INTACT, DIP, GRID, SGD en HPRD proberen de kennis van interagerende eiwitten te integreren in een gemakkelijk toegankelijke database. Het primaire doel van deze databases is het extraheren en integreren van de rijkdom aan informatie over eiwit-eiwit interacties beschikbaar in vele verschillende wetenschappelijk journals en in archieven zoals MEDLINE. Deze databases bieden ook hulpmiddelen aan voor het visualiseren van netwerken van interacties (bvb. Cytoscape, Biolayout, Pathway Assist), voor het karteren van pathways doorheen taxonomische takken en voor het genereren van informatie voor kinetische simulaties.

1.2.2. Computationele methoden Voor het voorspellen van functionele associaties (inclusief directe binding), biedt de recente stijging van volledig gesequeneerde genomen unieke mogelijkheden d.m.v. het gebruik van zogenaamde genomische context of niet-homologie gebaseerde interferentie methoden. Deze methoden steunen op het feit dat functioneel geassocieerde proteïnen gecodeerd worden door genen die gelijkaardige selectiedrukken delen. Marcotte et al. (1999) onderzochten op een computationele manier of eiwit-eiwit interacties kunnen herkend worden uit genoomsequenties. Opmerkelijk is dat genen wiens eiwitproducten nauw interageren in de cel vaak gefusioneerd voorkomen in 1 gen, dat codeert voor een samengesteld polypeptide, waardoor de proteïnen een grotere kans hebben om op een productieve wijze met elkaar te interageren. Op deze manier maakt domeinfusie analyse twee verschillende voorspellingen. Het voorspelt enerzijds potentiële eiwit-eiwit interacties en anderzijds voorspelt het eiwitparen die gerelateerde biologische

25

Deel 1: Literatuurstudie functies hebben (bijvoorbeeld proteïnen die participeren in een gemeenschappelijke structureel complex, metabolische pathway of biologisch proces). De genetische vereiste om functioneel geassocieerde genen samen te houden wordt duidelijk wanneer ze fylogenetische geconserveerd zijn. De genen hebben de neiging om ofwel samen aanwezig of samen afwezig te zijn, d.w.z. ze hebben dezelfde fylogenetische profielen. Dit is de computationele methode beschreven door Pellegrini et al. (1999) en Huynen et al. (1998). Bock en Gough (2001) ontwierpen een methode om de reikwijdte van de voorspellingen uit te breidden naar volledige proteomen d.m.v. een computationeel statistisch “learning theory”. In contrast met de hierboven vermelde theorieën, gebruikt de methodologie van Bock en Gough een totaal andere benadering naar de computationele voorspelling van eiwitinteracties. Met behulp van een database van gekende eiwit-eiwit interactieparen werd een “machine learning system” getraind om interacties te herkennen die enkel gebaseerd zijn op de primaire structuur en de geassocieerde fysiologische eigenschappen. De voorspellingsmethodologie genereert een binaire beslissing over de potentiële eiwiteiwit interacties. Dit suggereert de mogelijkheid om startend van de geautomatiseerde identificatie van de genproducten van een cel, de eiwit interactieparen af te leiden. Op deze wijze vergemakkelijken we de identificatie van de functie van het proteïne en de cellulaire signalisatie pathway. Hoewel er veel moeite gestoken is geweest in methodes voor het identificeren van interactie partners, heeft men minder de focus gelegd op het vergelijken van deze interacties met die van 3-dimensionele (3D) structuren. Databases, die verschillende methoden om eiwit interacties te voorspellen integreren, werden ontwikkeld. Bijvoorbeeld, de STRING en POINT databases kunnen interacties voorspellen tussen eiwitten (Droit et al., 2005).

26

Deel 1: Literatuurstudie 1.3. RNA-geïnduceerd Gene Silencing (Waterhouse et al., 2002) 1.3.1. Inleiding Bij ‘reverse genetics’ gaat men uit van een gensequentie en wil men de functie van dit gen bestuderen door de analyse van mutaties in dit gen. Een ‘reverse genetics’ benadering, insertionele mutagenese genaamd, heeft een sleutelrol gespeeld in de studie van Arabidopsis. Twee insertionele mutagenese strategieën werden in Arabidopsis ontwikkeld, één gebaseerd op getransfereerd DNA (T-DNA) en één op transposon tagging. Deze hebben geleid tot verscheidene grote, publiek toegankelijke collecties van Arabidopsis insertiemutanten (bvb. Arabidopsis Stock Centre en de Salk Collectie in de “The Arabidopsis Information Resource” (TAIR)). Het gebruik van insertiemutanten heeft begrensde mogelijkheden. Men kan het bijvoorbeeld niet gebruiken om de functies van gedupliceerde genen te onderzoeken, en vele mutante fenotypes in deze lijnen worden veroorzaakt door disrupties in andere genen dan deze waar de DNA-tag werd geïnsereerd. Een benadering die deze begrenzingen omzeild is RNA-geïnduceerd gene silencing. In planten wordt het post-transcriptional gene silencing (PTGS) genoemd, in fungi quelling en RNA-interferentie (RNAi) in dieren. De essentie van RNA-geïnduceerd gene silencing is de introductie van dubbelstrengig RNA (dsRNA) in een organisme of cel om zo een sequentie specifiek RNA degradatiemechanisme te induceren dat op effectieve wijze het doelwitgen afbreekt. Wanneer natuurlijk voorkomend viraal RNA (dat dsRNA produceert tijdens de replicatie) of zelfcomplementair, enkelstrengig “hairpin” RNA (hpRNA) of dsRNA, geïntroduceerd wordt in een plant, wordt het afgebroken via DICER tot 21 nucleotiden lange dsRNA fragmenten, beter gekend als “small interfering RNA” (siRNAs). Deze siRNA fragmenten worden gebonden door een nuclease bevattende complex, RISC (RNAi-silencing complex) genaamd. Deze degradeert mRNA’s die complementair zijn met de enkelstrengige siRNA dat geassocieerd is met het complex (Figuur 1.10). Een belangrijk aspect van het gebruik van RNAi in plantengenoom onderzoek is de introductie van het silencing-inducerende dsRNA of hpRNA in de cel. Dit RNA kan geleverd worden aan de plantencel door stabiele transformatie van de planten met transgenen die coderen voor hpRNA’s of virale RNA’s. Het kan ook transiënt geleverd worden aan de plantencel door de planten te bombarderen met nucleïnezuur-beklede

27

Deel 1: Literatuurstudie parels, door infectie van plantencellen met transgene Agrobacterium tumefaciens of door infectie van planten met een virus en eventueel een satelliet virus wanneer nodig. Elk methode heeft zijn voor- en nadelen.

Fig. 1.10: Het model van RNA-gemedieerde gensilencing in planten. Dit model is gebaseerd op resultaten van in vitro RNAi studies in dierenextracten. Men denkt dat RNAi bij planten op dezelfde manier werkt, omdat siRNA werd gevonden in planten en planten bezitten homologen van het dierlijke DICER-gen (Waterhouse et al., 2003).

1.3.2. Microprojectiel bombardement en agro-infiltratie Het bombarderen van plantenweefsel met goud - of wolfraampartikels bekleed met DNA, wordt vaak gebruikt bij studie van genexpressie in planten en voor de transformatie van verscheidene monocotyle plantspecies zoals rijst (Oryza sativa). Het DNA of RNA dat elk partikel bekleedt wordt vrijgelaten en geëxpresseerd in de cellen waar het partikel in terecht komt. Wanneer Agrobacterium tumefaciens een plant infecteert, transfereert het delen van diens T-DNA plasmide naar het genoom van de geïnfecteerde plantencellen. Infiltratie van de bladeren met een cultuur van Agrobacterium waarvan het Ti-plasmide het transgen bevat dat codeert voor een endogene plantengensequentie, kan RNAi triggeren tegen het endogene doelwitgen. In de eerste dagen na infiltratie wordt GFP

28

Deel 1: Literatuurstudie overgeëxpresseerd op de plaats van infiltratie, maar na ongeveer drie dagen vervalt deze expressie tot ondetecteerbare niveau’s samengaand met de reductie van endogene doelwitgenexpressie. Deze lokale co-suppressie verspreidt zich doorheen de plant. Op eenzelfde manier, maar sterker, bekomt men co-suppressie met T-DNA’s die hpRNA coderende sequenties bevatten.

1.3.3. Virus geïnduceerde co-suppressie (VIGS) Virussen hebben verschillende eigenschappen die hen bruikbaar maken voor plantenonderzoekers. Het naakte virale RNA van verschillende plantenvirussen kan gebruikt worden in planten om infecties te voorkomen (Waterhouse et al., 2003). Bij VIGS wordt een gensequentie naar keuze ingebracht in een viraal genoom. Infectie van de plant met het gemanipuleerde virus leidt dan tot de systemische silencing van het homologe plantengen. Bijvoorbeeld een plant geïnfecteerd met Potato Virus X (PVX) die een fragment van het phytoene desaturase (PDS) mRNA bevat leidt tot sterk verbleekte bladeren in het bovenste gedeelte van het geïnfecteerde plant. De oorzaak van deze symptomen is de daling in het niveau van het endogene PDS mRNA wat resulteert in lage hoeveelheden van PDS. Hierdoor stopt de carotenoïd productie en is de plant niet meer beschermd tegen verbleking o.i.v. licht (Baulcombe, 1999). Het mechanisme van VIGS is RNA silencing en is een mechanisme van de plant om virussen te bestrijden (RNA-gemedieerd defensie mechanisme). Een volledige virus cDNA kloon kan geïnsereerd worden in een Ti-plasmide, geëxpresseerd onder invloed van een cauliflower mozaïek virus (CaMV) 35S-promotor en in de plant gebracht worden door agroinfiltratie. Zo kan een virusinfectie voorkomen worden d.m.v. RNAi wanneer het T-DNA door de plant wordt overgeschreven.

1.3.4. Amplicon en hairpin RNA transgenen Amplicon en hpRNA-transgenen worden stabiel getransformeerd in planten en ze zorgen ervoor dat de RNAi die ze induceren overgeërfd wordt door de opeenvolgende generaties. Een amplicon codeert voor een virusafgeleid transcript dat een doelwit gensequentie bevat, maar niet noodzakelijk alle virale genen. Het controleert diens eigen replicatie. Het transgeen staat meestal onder controle van de CaMV 35S promotor zodat het amplicon

29

Deel 1: Literatuurstudie RNA tot expressie komt in bijna elke cel van de plant. De getransfecteerde planten vertonen geen symptomen van virusinfectie. De meest efficiënte methode voor ‘knock down’ van plantgenen d.m.v. posttranscriptionele silencing is het expresseren in transgene individuen van hpRNA opgebouwd uit een dubbelstrengige stam met een fragment van het transcript dat geviseerd wordt voor afbraak en een loop met intron sequenties die uit de RNA molecule worden gesplicet (Figuur 1.11) (Hilson et al., 2004).

Fig. 1.11: Een typisch DNA construct voor de expressie van hpRNA’s. Het bevat het “target sequence” in de sense en antisense richting gescheiden door een intron, dit zal via complementaire baseparing resulteren in een hpRNA. Ook een selectiemerker, bvb. GFP is aanwezig voor de selectie van plantencellen die het T-DNA met het DNA construct voor RNAi hebben opgenomen. (Waterhouse et al., 2003).

1.3.5. Transcriptionele co-suppressie Een recentelijk ontdekte eigenschap van RNAi in planten is dat dsRNA sequentiespecifieke DNA-methylatie veroorzaakt. Co-suppressie door VIGS of hpRNA constructen gaat vaak gepaard met methylatie van de coderende regio van het doelwitgen, dit heeft normaal geen direct effect op de transcriptie. Maar in drie RNAi studies in planten, was een genpromotor het doelwit en dit resulteerde in deze gevallen in promotor methylatie. Deze promotor methylatie of verandering in chromatine conformatie vanwege de methylatie van de promotor, affecteert waarschijnlijk de binding van transcriptiefactoren wat leidt tot gereduceerde transcriptie.

1.3.6. Toepassing van RNAi in TAP, de iTAP-strategie (Forler et al., 2003) Dit is de TAP-technologie gecombineerd met RNAi om zo competitie van het corresponderende endogene proteïne te verhinderen. Hierbij wordt het endogene gen getarget voor afbraak via RNAi, terwijl het transgene ‘TAP-tagged’ gen onaangeroerd blijft. De iTAP-strategie leidt tot een hogere opbrengst en specificiteit van de zuivering, daarnaast laat het ook toe onderscheid te maken tussen specifieke en non-specifieke bindingen. De toepassing van de iTAP-techniek laat ons ook toe te controleren of de

30

Deel 1: Literatuurstudie gemerkte proteïnen functioneel zijn. Voor essentiële proteïnes laat iTAP-strategie toe te selecteren voor cellen die gemerkte proteïnen bevatten in hoeveelheden die de levensvatbaarheid herstellen.

1.3.7. Vectoren voor RNAi De pHELLSGATE & pTRV-att P/R vectorenserie gebruikt de snelle, op recombinatie gebaseerde, GatewayTM Technologie. Deze vergemakkelijkt de high-throughput klonering en manipulatie van genbibliotheken die nodig zijn voor de vorming van RNAiconstructen. Deze methode is praktisch voorlopig enkel uitvoerbaar bij Arabidopsis thaliana. Verschillende onderzoeksgroepen zijn bezig met het produceren van middelen die nodig zijn om RNAi te gebruiken als techniek voor high-throughput plantgenoom onderzoek. De CATMA groep (Complete Arabidopsis Transcriptome MicroArray) is bezig met de ontwikkeling van een set van PCR producten , gene-specific sequence tags (GSTs), die elk Arabidopsis gen voorstellen. Ze kunnen gereamplificeerd en gekloneerd worden in Gateway vectoren via de BP-recombinatie reactie. Het AGRIKOLA consortium (Arabidopsis Genomic RNAi Knock-Out Line Analysis) gebruikt deze set van PCR-produkten om in pHELLSGATE vectoren via LRrecombinatie reactie (Figuur 1.12) een genspecifiek RNAi-construct voor elk Arabidopsis gen te genereren, zodat ze op grote schaal in RNAi co-suppressie studies gebruikt kunnen worden.

Fig. 1.12: Via BP-reactie wordt een entry-kloon gegenereerd met het gen van interesse, die dan vervolgens via de LR reactie kan gekloneerd worden in een hpRNA-vector of in een VIGS-vector (Waterhouse et al., 2003).

31

Deel 1: Literatuurstudie 1.4. Optimalisatie van transgenexpressie via toevoegen van introns Een basiseigenschap van de meeste eukaryotische genen is dat ze onderbroken worden door 1 of meer introns, die na transcriptie verwijderd moeten worden om mRNA’s te vormen met intacte open leesramen. Sinds hun ontdekking is er veel gedebatteerd over hun evolutionaire oorsprong en hun functies. Functies die reeds vroeg werden ontdekt zijn de vergemakkelijking van het evolueren van nieuwe genen door “exon shuffling” of duplicatie en expressie van meerdere proteïnen vanuit 1 enkele gen door alternatieve splicing. Tegenwoordig wordt het steeds duidelijker dat introns en hun verwijdering door het spliceosoom vele andere fases van het mRNA metabolisme kunnen beïnvloeden, inclusief de initiële transcriptie van een gen, editing en polyadenylatie van het pre-mRNA, nucleaire export, vertaling en afbraak van het mRNA product. Samen zorgen deze effecten voor een mogelijk verschil in expressie profielen van intron-bevattende en intronloze versies van hetzelfde gen. Alhoewel er geen universele vereiste is aan intronen voor eukaryotische genexpressie, kan de expressie van een transgeen aanzienlijk worden verhoogd door de toevoeging van 1 generisch intron aan het cDNA (Hamer et al., 1979; Gruss et al., 1979; Palmiter et al., 1991). Het werd aangetoond dat introns de transcriptionele efficiëntie van vele genen in een variëteit aan organismen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, een vroege studie toonde aan dat intronloze transgenen in muizen 10 tot honderd maal minder efficiënt worden overgeschreven dan hun intron-bevattende tegenhangers (Brinster et al., 1988). Een manier waarop introns transcriptie kunnen beïnvloeden is door op te treden als opslagplaats voor transcriptionele regulatorische elementen, zoals enhancers en repressoren (Figuur 1.13). Een intron kan de transcriptie reguleren door controle van de DNA toegankelijkheid door modulatie van nucleosoom positie. Eens het DNA is overgeschreven stimuleren de splicing signalen in een intron verder de transcriptie door het verbeteren van RNA pol II initiatie en processiviteit (Figuur 1.13). In gist - en zoogdiercellen kunnen promotor proximale introns de transcriptie initiatie verhogen. U1 small nuclear RNA (snRNA), een goed gekende effector van 5’ splice site herkenning, associeert met algemene transcriptie initiatiefactor TFIIH en is nodig voor de stimulerende effecten van een promotor-proximaal intron op RNA pol II re-initiatie (Le Hir et al., 2003).

32

Deel 1: Literatuurstudie Terwijl specifieke regulatorische elementen worden gevonden in sommige introns, ziet men een meer algemene intron-gemedieerde verhoging (intron mediated enhancement, IME) als resultaat van synergistische interacties tussen factoren die optreden in de verschillende stappen van genexpressie van transcriptie tot translatie. De stabiliteit van het mRNA van een gen met of zonder intron is gelijk, wat er op wijst dat introns mRNA accumulatie eerder verhogen door stijging van de productie dan door daling van afbraak. De gestegen translationele efficiëntie is te wijten aan een gestegen associatie van het mRNA met ribosomen via interacties met de proteïnen van het “exon junction complex” (EJC), die 20 tot 24 nucleotiden stroomopwaarts van het intron in het mRNA worden afgezet gedurende de splicing. Het blijft onduidelijk of de predominante mechanismen waarmee introns de genexpressie beïnvloeden dezelfde zijn in alle organismen of dat ze kunnen verschillen tussen introns in één enkele species. Niettemin, de gelijkheden in de geobserveerde eigenschappen van IME suggereren dat op zijn minst sommige eigenschappen wijd geconserveerd zijn. In tegenstelling tot transcriptionele enhancers, moeten de meeste introns gelokaliseerd zijn binnenin de overgeschreven sequentie om mRNA accumulatie te verhogen in planten en zoogdieren. Echter, de toevoeging van een intron in het primaire transcript is vaak niet genoeg voor IME, aangezien het vermogen van vele introns om de expressie te stimuleren sterk daalt of volledig verloren gaat wanneer deze geplaatst wordt in de 3’UTR (untranslated region). Op 3’ locaties zijn introns beduidend minder effectief bij het verhogen van de expressie, dan wanneer ze dichtbij het begin (5’ uiteinde) van het gen gelegen zijn. Een daling in het vermogen van een intron om expressie te stimuleren wanneer het geplaatst wordt dichtbij het 3’ uiteinde van een transcript werd waargenomen in HeLa cellen, Xenopus, Arabidopsis, rijst en maïs. De diversiteit aan species waar het waargenomen werd suggereert dat de afhankelijkheid van intron lokalisatie een geconserveerd mechanisme van IME weerspiegelt. Hoewel geweten is dat introns op eender welk uiteinde van een gen verschillen in graad waarmee ze de expressie stimuleren, werd het effect van het variëren van de positie van een enkel intron niet stelselmatig getest in eender welk organisme. De aard van de afname in IME wanneer een intron in een gen wordt verplaatst zou moeten helpen om de verschillende modellen te onderscheiden die zouden kunnen uitleggen waarom introns de

33

Deel 1: Literatuurstudie mRNA-accumulatie verhogen aan het begin van een gen en niet aan het einde van de gen (Rose, 2004).

Fig.1.13: Introns kunnen de efficiëntie van transcriptie beïnvloeden op verschillende manieren. Transcriptionele enhancers of repressoren, of nucleosoom positionerende elementen binnenin de introns kunnen de efficiëntie van transcriptie initiatie beïnvloeden. Spliceosoom componenten (groen) die assembleren op een nieuw overgeschreven intron kunnen verder de transcriptie verhogen op niveau van initiatie en elongatie. Figuur overgenomen uit Le Hir et al. (2003).

1.4.1. Studies in planten Het testen van het vermogen van een intron om de expressie te verhogen van een reportergen toonde aan dat introns genexpressie stimuleren op 2 niveau’s in Arabidopsis. Het grootste effect was zichtbaar op gebied van mRNA-accumulatie. De grootte van deze verhoging verschilde tussen introns, maar was afhankelijk van de nabijheid van het intron tot de promotor voor de TRP1 (Tryptophan Biosynthesis 1 gen) en UBQ10 (PolyUbiquitine 10 gen) introns. In mindere mate kunnen de meeste introns ook de translationele opbrengst verhogen omdat de IME op niveau van proteïne-activiteit ongeveer 2 maal groter was dan die gemeten op het niveau van mRNA-accumulatie, ongeacht van de positie of identiteit van het intron. Deze bevindingen steunen op het model dat introns transcriptie stimuleren en ook dat de EJC translatie verhoogt in planten (Rose, 2004). Observaties gedaan door Rose (2002) bij zijn experimenten met het PAT1-intron1 in Arabidopsis suggereren dat, alhoewel splicing niet per se essentieel is voor IME, de intronsequenties moeten interageren met de splicing-machinerie om de mRNAaccumulatie te verhogen. Studies gedaan door Alexandrov et al. (2006) in Arabidopsis tonen aan dat genen met minder dan 4 introns gereduceerde gemiddelde mRNA niveaus vertonen.

34

Deel 1: Literatuurstudie Verhoging van genexpressie door introns is geen algemeen fenomeen aangezien bepaalde natuurlijk voorkomende genen geen introns bevatten en efficiënt worden geëxpresseerd, terwijl sommige intron-inserties in transgenen niet leiden tot verhoging van expressie. In planten wordt verhoging van genexpressie alleen geobserveerd in de meer GC-rijke (monocotyle) genomen. Meer nog, er werd geobserveerd dat variatie in expressieniveau’s zelfs gevonden kan worden in verschillende weefsels binnenin een enkele plant en dat IME een genafhankelijk proces zou zijn (Bourdon et al., 2001). Recente vorderingen in gentransfer naar plantencellen en de ontwikkeling van verschillende reportergenen, maken het mogelijk om de expressie van vreemde genen in mono- en dicotyle plantencellen kwantitatief te onderzoeken. Zo werd het eerste intron van het wonderboon catalase gen, cat-1, geplaatst in de N-terminale regio van de coderende sequentie van het -glucuronidase gen (gus A), het intron-bevattende gus A werd gefusioneerd met de Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S-promoter. Het plasmide met dit construct werd gebruikt om het effect van het intron op de expressie van glucuronidase (GUS) activiteit te onderzoeken in transgene rijst calli en planten (monocotylen) en in transgene tabaksplanten (dicotylen). Het intron-bevattende plasmide verhoogde het niveau van GUS-enzymactiviteit in vergelijking met het intronloze plasmide, 10 tot 40-voudig en 80 tot 90-voudig in transgene rijst protoplasten en transgene rijstweefsels respectievelijk. In contrast hiermee beïnvloedde de aanwezigheid van het intron amper de expressie van de GUS-activiteit in transgene tabaksplanten. Northern blot analyse toonde aan dat het catalase intron efficiënt werd gesplicet in rijstcellen, terwijl transgene tabaksplanten even grote hoeveelheden gesplicete en ongesplicete gus A transcripten bevatte. Het verschil in het effect van het intron op soortvreemdegenexpressie in deze twee species is gecorreleerd met het verschil in de hoeveelheid van matuur gus A transcript geproduceerd in transgene planten en de efficiëntie van intronsplicing. De studies gedaan door Tanaka et al. (1990) suggereren dat de machinerie gebruikt voor de processing van pre-mRNAs zou kunnen verschillen in elke plantenspecie en dat de efficiëntie waarmee een soortvreemd intron wordt gesplicet, beïnvloed wordt door verschillende factoren zoals de sequentie van het intron, de sequentie van het exon dat het intron flankeert en de locatie van het intron binnenin een gen (Tanaka et al., 1990).

35

Deel 2: Doelstelling

Deel 2: Doelstelling Uit onderzoek weet men dat de eukaryote cel op moleculair niveau zeer sterk georganiseerd is. De meeste cellulaire processen worden niet gereguleerd door een reeks eiwitten die onafhankelijk van elkaar werken, maar eerder door eiwitcomplexen. Om deze reden wordt er in de onderzoeksgroep Functionele Proteoomanalyse een technologisch platform ontwikkeld dat moet toelaten om op efficiënte wijze eiwitcomplexen uit plantencellen te isoleren en te analyseren. Als modelsysteem wordt de celcyclus gebruikt. De celcyclus staat onder controle van een universeel geconserveerde moleculaire machinerie. De complexe macromoleculaire stappen van de eukaryotische celcyclus wordt gereguleerd door een klein aantal heterodimere proteïne (serine/threonine) kinasen, deze bevatten een regulatorische subunit (cycline) en een katalytische subunit (cycline dependent kinase CDK). Deze CDK/cycline complexen worden op hun beurt op verschillende manieren en niveau’s gecontroleerd door onder andere posttranslationele modificaties zoals fosforylaties, interacties met andere eiwitten, subcellulaire herlocalisatie en eiwitafbraak. De opheldering van de samenstelling en regulatie van CDK/cycline complexen enerzijds en hun functie tijdens de celcyclus anderzijds is essentieel om te komen tot een fundamenteel begrip van de celcyclus progressie in planten en de rol van celdeling in de ontwikkeling van de plant. Om te komen tot een succesvolle studie van eiwitcomplexen in de plantencelcyclus, is er een bruikbaar modelsysteem nodig. In volledige plantextracten is het gehalte aan eiwitcomplexen die de celcyclus controleren zeer laag. Daarom wordt er gebruik gemaakt van een celsuspensiecultuur van Arabidopsis. Op deze manier bekomen we snel een voldoende massa delende cellen. Voor de isolatie van de complexen wordt gebruik gemaakt van een nieuw ontwikkelde techniek, nl. tandem-affiniteitszuivering (TAP). Eiwitten worden tot expressie gebracht als een fusieproteïne met twee verschillende tags, wat een zeer selectieve twee-stapszuivering toelaat van de complexen waar de geTAP-tagde eiwitten deel van uitmaken. Vervolgens worden de complexen gescheiden via 1D- of 2D-elektroforese en de eiwitten worden geïdentificeerd via massaspectrometrie (MS). Dit gebeurt door de eiwitspots of bandjes uit het gel te knippen, het geëlueerde eiwit te digereren tot peptiden en via MS een massaprofiel van de peptiden te bekomen. Dit profiel wordt vergeleken met een database van voorspelde eiwitprofielen, waarbij een match leidt tot identificatie van het eiwit. Daar er in planten nog geen technologie voorhanden is die homologe recombinatie toelaat, zoals in gist, zal er altijd competitie zijn tussen het recombinante fusie-eiwit en het endogene 36

Deel 2: Doelstelling eiwit voor inbouw in een eiwitcomplex. Optimalisatie van de expressie van het recombinante fusie-eiwit en een daling van de expressie van het corresponderende endogene eiwit, kan leiden tot een verhoogde competitie en bijgevolg een hoger aantal complexen die het fusieeiwit bevatten. In deze thesis proberen we de expressie van ons ‘TAP-tagged’ fusie eiwit te verhogen door het behouden van diens intronen en dus niet te werken met cDNA. We proberen ook de expressie van het endogene gen te verlagen door het endogene mRNA gericht af te breken via een silencing mechanisme opgewekt door een hairpin-RNA dat het 3’UTR target. Een derde luik van deze thesis is het vergelijken van C-terminale versus N-terminale TAP-fusies. Tagging aan de C- of N-terminus kan soms interfereren met de functie van het eiwit of met de inbouw in complexen. Een vergelijking tussen de twee tagging-strategieën, kan een indicatie geven van welke strategie het best toegepast wordt, rekening houdend met een zekere ‘bait’afhankelijkheid.

37

Deel 3: Materiaal en Methoden

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.1. Gebruikte stammen en cellen

3.1.1. Bacteriële stammen 

Escherichia coli DB3.1: Deze stam bevat het gyrA462 allel dat resistentieverleent tegen de toxische effecten van het ccdB gen. Genotype: F- gyrA462 endA1 glnV44 Δ(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1



Escherichia coli DH5: Deze stam is sensitief voor de toxische effecten van het ccdB gen. Genotype: F-φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 deoR, recA1 endA1 hsdR17(rk mk+ phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1



Agrobacterium tumefaciens stam C58C1RifR pMP90: gebruikt om plantencellen te transformeren.

3.1.2. Plantencellen We gebruikten de Arabidopsis thaliana PSB-d cellen (May and Leaver, 1993). De cellen werden in het donker opgegroeid bij 25°C, 130 rpm en om de 7 dag gesubcultiveerd (1 op 10) (Menges and Murray, 2002).

3.2. Groeimedia Alle media worden geautoclaveerd en bewaard op kamertemperatuur. Vanaf dat vitaminen of eventuele antibiotica worden toegevoegd dient het bewaard te worden bij 4°C. Deze worden pas toegevoegd nadat het media geautoclaveerd werd. Alle media kunnen zowel vloeibaar als vast bereid worden. Bij het bereiden van vast medium wordt agar toegevoegd, voordat het medium wordt geautoclaveerd. Nadien wordt het medium in petriplaten gegoten en afgekoeld totdat de agar gestold is.

38

Deel 3: Materiaal en Methoden 

LB (Luria Bertani) is het groeimedium waarin de E. coli in optimale omstandigheden en bij een optimale temperatuur (resp. 37°) kunnen opgroeien. Het vloeibare LB-groeimedium bestaat uit (Sambrook et al.): -

10 g/l NaCl

-

10 g/l Bacto trypton

-

5 g/l Bacto-Yeast extract.

LB+ medium bevat ook nog 0,1% glucose. Alle groeimedia worden gesteriliseerd in de autoclaaf en antibiotica worden toegevoegd bij een temperatuur lager dan 50°C (wegens hitte-instabiliteit van antibiotica). Voor o.a. het bewaren van culturen, platen we deze uit op petriplaten met vast medium. Het vaste medium bestaat uit (Sambrook et al., 1989): - LB+ - 20 g/l agar 

Bij ‘heatshock’-transformatie gebruiken we SOC-medium, dit is een bufferend medium dat veelal gebruikt wordt om maximale transformatie efficiëntie te bekomen in E. coli. 100 ml SOC-medium bestaat uit: - 97 ml H2O - 2 g Bacto Tryptone - 0.55 g Bacto Yeast Extract - 1 ml 10 mM NaCl - 1 ml 10 mM KCl Het geheel wordt gesteriliseerd. Hierna wordt het afgekoeld tot 55°C. 1 ml 2 M Mg ++ (1 M MgCl2, 1 M MgSO4) en 1 ml 2 M glucose worden toegevoegd. De pH van het SOC-medium moet ongeveer 7 zijn en steriele filters worden gebruikt om de oplossing finaal steriel te maken.



Voor het opgroeien van BAC-clones gebruiken we Terrific Broth (TB) groeimedium. - 24 g Bacto®-Tryptone - 48 g Bacto®-Yeast Extract - 8 ml 100 % glycerol - voeg H2O toe aan 1.8 L en autoclaveer 39

Deel 3: Materiaal en Methoden We voegen nog antibiotica toe, namelijk enerzijds chlorampfenicol (stock: 12,5 mg/ml, finale concentratie: 25 g/ml) en kanamycine (stock: 12,5 mg/ml, finale concentratie: 25 g/ml). 

SOB-medium 1L: wordt gebruikt voor de bereiding en transformatie van heat shock competente E. coli cellen (Hanahan, 1983). -

20 g tryptone

-

5 g gist extract

-

0.5 g NaCl

Autoclaveren. Voor gebruik: Voeg 10 ml van filter gesteriliseerde 1M MgCl2 

YEB-medium: wordt gebruikt voor het opgroeien en transformatie van Agrobacterium tumefaciens cellen. -

0,5% beef extract (=lab lemco) 5g

-

0,1% gist extract 1g

-

0,5% peptone 5g/l

-

0,5% sucrose 5g/l

-

2mM MgSO4(2ml/l < 1M stock)

Nadat deze componenten goed gemengd zijn, wordt de pH ingesteld op 7,2. Daarna wordt dit medium geautoclaveerd. Voor o.a. het bewaren van culturen, platen we deze uit op petriplaten met vast medium. Het vaste medium bestaat uit: YEB + Agar (1,5% agar LabM). 

MSMO (1L) medium: Gebruikt voor de transformatie en groei van Arabidopsis thaliana (PSB-d stam) celculturen. -

4,43g MSMO (minimal organic Sigma #M6899)

-

30g Sucrose

-

500 l NAA (1mg/ml stock in 100mM NaOH)

-

50 l Kinetine (1mg/ml stock in DMSO)

Pas de pH aan tot 5,7, gebruik hiervoor 1 M KOH. 

MSMO – agar (0,8%) + Km (50 g/ml), Cb (500 g/ml), Vancomycine (500 g/ml) Per liter medium: -

8 g agar (Plant Tissue Culture, Lab M)

40

Deel 3: Materiaal en Methoden -

4 ml Km (stock 12,5 mg/ml)

-

10 ml Cb (stock 50 mg/ml)

-

10 ml Vancomycine (stock 50 mg/ml)

3.3. Vectoren Voor het kloneren en het tot expressie brengen van een gen kunnen verschillende soorten klonerings- en expressievectoren gebruikt worden. 3.3.1. pDONRTM221 (Invitrogen) Deze vector (Figuur 3.1) dient als ‘entryclone’ in het Gateway® kloneringsysteem. Vanuit deze vector kunnen gewenste DNA-fragmenten gekloneerd worden in verschillende ‘destination’ vectoren. Deze vector bezit de volgende belangrijke kenmerken: 

rrnB T1 en T2 transcriptieterminators: beschermen het gekloneerde gen van expressie

door

vector-gecodeerde

promotors, om mogelijke toxiciteit te reduceren. 

M13 ‘forward’ en M13 ‘reverse priming site’:

laat

sequenering

toe

in

respectievelijk de sense en de anti-sense oriëntatie. 

attP1

en

Lambda

attP2

sites:

Bacteriofaag

afkomstige

recombinatiesequenties

DNAdie

Fig. 3.1: schematische weergave: pDONR221TM Gateway® ‘entryclone’ vector (Invitrogen).

recombinatoriële klonering toelaten van het gen van interesse vanuit een attB bevattend attB-PCR product. 

ccdB-gen: laat negatieve selectie toe voor het plasmide na recombinatie en daaropvolgende transformatie. Het ccdB proteïne interfereert met het E. coli DNA gyrase, waarbij de groei van de meeste E. coli stammen wordt geïnhibeerd. Bij recombinatie wordt het ccdB gen vervangen door het gen van interesse en kan de cel waarbij de recombinatie succesvol verlopen is groeien.



kanamycine resistentiegen: laat selectie toe voor het plasmide in E. coli.

41

Deel 3: Materiaal en Methoden 

CmR gen: nodig voor de propagatie van donor vectoren (geeft zekerheid over de aanwezigheid van de Gateway-cassette )

pDONRTM207 werd ook gebruikt, het enige verschil met pDONRTM221 is dat pDONRTM207 een gentamycine resistentiegen bevat in plaats van een kanamycine resistentiegen.

3.3.2. pDonrP4P3 De pDonrP4P3 vector bezit dezelfde backbone als pDonr 221, maar heeft een ander gatewaycassette, nl. de att-sites attP4 en attP3 . In deze vector werd de ‘cauliflower mozaic’ virus 35S-promotor gekloneerd. Deze entry-vector werd dan gebruikt om de 35S-promotor te kloneren in een N-terminale TAP-destination-vector.

3.3.3. pAGRIKOLA De pAgrikola vector (Hilson et al., 2004) bevat 2 gateway-cloneringscassettes en wordt gebruikt voor het maken van hairpin-constructen (Figuur 3.3). Het RNAi-construct pAgrikola-3’UTR (anti-sense en sense) CDKA;1 (Figuur 3.2) werd geconstrueerd om RNAgeïnduceerd ‘gene silencing’ in onze plantencellen op te wekken. Wegens de dubbele LR-recombinatie reactie kunnen verschillende intermediairen ontstaan, afhankelijk van welke repeats met elkaar recombineren, zal de intron-spacer in de expressiekloon diens originele oriëntatie behouden of een omgekeerde (“geflipte”) oriëntatie bekomen. De plasmiden blijven even effectief ongeacht in welke oriëntatie de introns zitten, dit “intron flippen” is niet meer dan een “cosmetisch ongemak” (Hilson et al., 2004).

Fig. 3.2: Een RNAi-construct voor gene silencing Fig overgenomen uit: Hilson et al.,2004

42

Deel 3: Materiaal en Methoden



pAgrikola is een binaire vector, het bevat 2 ori’s van replicatie, 1 voor in coli en 1 voor in agro cellen.



NptI is een kanamycine resistentie gen (voor selectie in bacteriën).



Bar is een Basta resistentie gen (voor selectie in planten).

Fig. 3.3: pAgrikola een afgeleide van pHellsgate 12 Fig overgenomen uit: Hilson et al.,2004



Pnos is een plantenpromotor



Ocs ter is een terminator van transcriptie



35S-promotor staat in voor de start van transcriptie van het hairpin-construct

3.4. Recombinante DNA-technieken 3.4.1.BAC-isolatie Arabidopsis thaliana bezit 5 chromosomen. Het volledige genoom van de Arabidopsis thaliana werd in verschillende kleine fragmenten gesplitst, vervolgens werd elk fragment gekloneerd in een BAC (bacterial artificial chromosome)-kloon. In de BAC-klones zoeken we onze genen van interesse. Hierna voeren we een ‘polymerase chain reaction’ (PCR) uit en kloneren we het PCR-produkt in plasmide pDONRTM221. Materiaal: 

Solution I:

10mM

EDTA

pH 8 Geautoclaveerd en bewaard op 4°C 

Solution II:

0,2M

NaOH

1%

SDS

Voor elke isolatie vers maken 

Solution III: 50ml 7,5M

K-acetaat

23ml

acetaat

127ml

water

43

Deel 3: Materiaal en Methoden Praktische uitvoering:  Neem met een steriel staafje een kolonie van het petriplaatje met BAC-clones en drop deze in een 500 ml steriele fles met 100 ml TB (Terrific Broth)-medium en antibioticum.  Incubeer 12 tot 18 uren lang bij 37°C en 325 rpm.  Breng de cultuur over in 250 ml centrifuge-flessen en centrifugeer voor 15 min lang bij 4000 tpm (4°C).  De pellets worden geresuspendeerd in 4 ml van solution I.  Mengen en 5 minuten laten staan bij kamertemperatuur.  Voeg 8 ml solution II toe, meng zachtjes (3 à 4 keer omkeren) laten staan voor 5-10 min bij kamertemperatuur.  Voeg 6 ml koude solution III toe, meng zachtjes (3 à 4 keer omkeren) en op ijs plaatsen voor 5-10 min.  Centrifugeer 15 min lang bij 12.000 tpm, verwijder supernatans en filter doorheen “miracloth”.  Voeg 9 ml isopropanol toe aan het supernatans en meng. Centrifugeer 15 min lang bij 9000 tpm.  Giet het supernatans weg en voeg 1,8 ml TE (10mM Tris pH 8 , 50mM EDTA) om de pellet op te lossen. Voeg 0,9 ml 7,5M K-acetaat toe en breng over naar een 50 ml Falcon-tube. Koelen op –70°C gedurende 30 min (of een uur).  Ontdooi en centrifugeer 10 min lang bij 7900 tpm. Voeg supernatans bij 27 ml van 100% ethanol.  Centrifugeer 10 min lang bij 7900 tpm, daarna het precipitaat heroplossen in 0,14 ml 50T / 50E. Voeg 10 l RNAse (10mg/ml), transfereer naar een mircrofuge-tube en zet voor 10 minuten bij 37°C.  Fenolextractie: Hierbij wordt het RNAse verwijderd. De extractie gebeurt steeds in de trekkast en handschoenen verplicht gebruiken.

44

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.4.2. Fenolextractie Benodigdheden:  T10E1  Fenol ( steeds bij 4 graden Celsius bewaren en juist voor gebruik uithalen)  Chloroform / IAA (isoamylalcohol, 24:1 verhouding, bewaren bij KT)

Praktische uitvoering:

De epjes bevatten DNA. Het is de bedoeling via een fenolextractie het DNA zeer zuiver te maken; de enzymen, de zouten,… moeten verwijderd worden. Na de fenolisatie bevinden de eiwitten zich in de fenolfase en het DNA in de waterfase.

1. Het volume van het staal vermeerderen door er T10E1 aan toe te voegen; fenolextractie op een klein volume lukt niet goed (toch wordt het staal niet verdund omdat er later opnieuw geprecipiteerd wordt)  finaal 300 l 2. 300 l fenol toevoegen aan het staal 3. Dekseltjes goed sluiten en gedurende 1 min vortexen 4. 5 min centrifugeren bij 14.000 rpm 5. Bovenste waterige fase overbrengen naar een nieuw epje 6. een gelijk volume chloroform / IAA toevoegen 7. 20 sec vortexen 8. 5 min centrifugeren bij 14.000 rpm 9. Bovenste waterige fase overbrengen naar een nieuwe epje, op het einde vormt de waterige fase een bel en daarin moet je verder pipetteren 10. Voeg 1 g tRNA toe om een groter precipitaat te bekomen 11. DNA concentreren d.m.v. precipitatie (we willen ook de buffer kwijt waarin de restrictiedigest gebeurt is)  DNA volume meten (meestal rond de 270 l, zoeken met pipettor en dan nog eens controleren)  1 / 10 volume 5 M natriumperchloraat (5 M NaClO4) en 1 volume isopropanol toevoegen. Isopropanol loopt snel uit het tipje, dus best eerste keer opnieuw uitblazen en dan snel pipetteren.

45

Deel 3: Materiaal en Methoden 12. Dekseltje goed sluiten, staal goed mengen (niet vortexen) en 15 min centrifugeren bij 14.000 rpm (het DNA gaat precipiteren) 13. DNA zit in de pellet (supernatans afnemen) 14. Pellet wassen met 200 l 70% ethanol (gewoon toevoegen, niet schudden) 15. 5 min centrifugeren bij 14.000 rpm 16. Ethanol afhalen 17. Pellet laten drogen aan de lucht gedurende 10 min of 37 graden Celsius in eppendorfincubator gedurende 5 min. Goed nakijken of de pellet goed droog is! 18. DNA resuspenderen in 10-20 l MQ H2O door op en neer pipetteren of door in de eppendorfincubator te laten schudden (800 rpm) 19. Het DNA is klaar voor gebruik, bewaren bij – 20graden Celsius 20. DNA schatting m.b.v agarosegel of met Nanodrop bij 260 nm.

3.4.3. Plasmidebereidingen 3.4.3.1. Nucleobond DNA zuivering (midi) Bevinden zich in de Nucleobond kit: S1-buffer

100 g / mL

RnaseA (zelf toevoegen)

50 mM

Tris / HCl

10 mM

EDTA

pH 8.0 S2-buffer

S3-buffer

200 mM

NaOH

1%

SDS

2.8 M

Kac

pH 5.1 N2-buffer

100 mM

Tris

900 mM

KCl

15 %

Ethanol

0.15 %

Triton® X-100

gebracht op pH 6.3 met H3PO4 N3-buffer

100 mM

Tris

1.15 M

KCl

15 %

Ethanol

46

Deel 3: Materiaal en Methoden gebracht op pH 6.3 met H3PO4 N5-buffer

1M

KCl

100 mM

Tris

15 %

Ethanol

gebracht op pH 8.5 met H3PO4

Praktische uitvoering: (Nucleobond Midi AX100 voor 'high-copy' plasmiden)  Zet een cultuur in door E.Coli cellen te enten op 30mL LB+ medium met kanamycine  Incubeer overnacht bij 37 o C  Oogst de cellen door centrifugeren, 5 à 10 min bij 3800 tpm  Resuspendeer de bacteriële pellet in 4 mL S1-buffer (bevat Rnase)  Voeg 4 mL S2-Buffer toe: NaOH (verbreekt H-bruggen van dsDNA, hierdoor slaat het DNA neer) en SDS (bindt en ontvouwt eiwitten, waardoor deze neerslaan) gaan de celmembranen openbreken  Voeg 4 mL S3-Buffer toe: deze bevat azijnzuur, waardoor de pH daalt

en het

plasmide DNA wordt opgelost (de H-bruggen worden hersteld), maar het genomisch DNA blijft neergeslagen, het is te groot om weer dubbelstrengig te worden.  Zet de falcon voor 5 min op ijs  Voeg 2,5 ml N2-Buffer toe aan de Nucleobond-kolom voor equilibratie (voorbereidende stap).  Bevochtig een Nucleobond gevouwen filter met 2 ml N2-buffer  Breng het lysaat hierop, deze filtratiestap verwijderd SDS en cellulaire afval  Breng nu het gefilterde lysaat op de kolom  Was de kolom met het opgevangen lysaat met 10 ml N3-buffer  De elutie gebeurt in een nieuwe falcon met 5 ml N5-buffer  Voeg in de falcon 3,5 ml isopropanol (bij kamertemperatuur) toe om het plasmide DNA te precipiteren. Goed mengen.  Centrifugeer 40 min met 7900 tpm bij 4°C (SLA 1500)  Het supernatans voorzichtig weggieten.  Voeg 2 ml 70% ethanol toe om isopropanol en residuele zouten te verwijderen  Centrifugeer 15 min met 7900 tpm bij 4°C

47

Deel 3: Materiaal en Methoden  Supernatans voorzichtig weggieten en DNA pellet aan de lucht laten drogen door de falcon omgekeerd op een stuk papier te plaatsen.  Voeg hierna 100 l water toe.

3.4.3.2. Promega DNA zuivering op kleine schaal (mini) Bevinden zich in de “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” kit: Lysebuffer

0.2 M NaOH 1% SDS

Resuspensiebuffer

50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 10 mM EDTA 100 µg / ml Rnase A (zelf toevoegen)

Neutralisatiebuffer

4.09 M guanidine hydrochloride 0.759 M Kaliumacetaat 2.12 M ‘glacial’ acetaat Final pH is approximately 4.2.

Wasbuffer

162.8 mM kaliumacetaat 22.6 mM Tris-HCl (pH 7.5) 0.109 mM EDTA (pH 8.0) Voeg 170 ml ethanol toe voor de 250-prep systeem De eindconcentraties zullen ongeveer 60% ethanol, 60 mM kaliumacetaat, 8.3 mM Tris-HCl en 0.04 mM EDTA zijn.

48

Deel 3: Materiaal en Methoden Praktische uitvoering:

Vorming van geklaarde lysaat  Oogst de cellen door 1-10ml van een overnacht cultuur 5 min lang te centrifugeren bij 14.000 rpm. Verwijder supernatans. 

Voeg 250 l Cel Resuspensie buffer toen aan de celpellet. Pipeteer op en neer, totdat alles geresuspendeerd is.



Voeg 250 l cellyse buffer toe aan elke staal en 4 maal omkeren om te mengen.



Voeg 350 l neutralisatie buffer toe en 4 maal omkeren om te mengen.



Centrifugeer 10 min lang bij 14.000 rpm.

Binding van plasmide DNA  Insereer een centrifuge kolommetje in een tube 

Giet het lysaat in het kolommetje



Centrifugeer 1 min lang bij 14.000 rpm. De ‘flow through’ mag weggegoten worden. Kolom op een tube brengen.

Wassen  Wassen met 750 l wasbuffer (ethanol werd zelf toegevoegd). 

Centrifugeer 1 min lang bij 14.000 rpm.



Herhaal de wasstap, maar deze keer met 250 l wasbuffer.



Centrifugeer 2 min lang bij 14.000 rpm.

Elutie  Breng de centrifuge kolom over naar een steriele 1,5 ml microcentrifuge tube 

Voeg 100 l nuclease vrij water toe aan de kolom



Centrifugeer 1 min lang bij 14.000 rpm



Bewaar DNA op –20 C

49

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.4.3.3. Roche DNA-zuivering op kleine schaal (mini) Dit protocol geeft zuiverder DNA dan dat van Promega. Er blijven geen proteasen meer achter die zouden kunnen interferen met het LR-clonase in de LR-reactie bijvoorbeeld.

Bevinden zich in het Roche High pure plasmid isolation kit:

Suspensiebuffer

25 ml (80 ml) 50 mM Tris-HCl en 10 mM EDTA, pH 8.0 (25° C)

Rnase A

2.5 mg (8 mg) droog poeder dat moet opgelost worden in Suspensie Buffer

Lyse buffer

25 ml (80 ml) 0.2 M NaOH en 1% SDS

Bindingsbuffer

25 ml (80 ml) 4 M guanidine hydrochloride en 0.5 M kalium acetaat, pH 4.2

Wasbuffer II

10 ml (50 ml); voeg 40 ml (200 ml) absoluut ethanol toe 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5 (25°C) (eindconcentratie na toevoeging van ethanol) Voor stammen met lage nuclease activiteit

Elutie buffer

40 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 (25C)

50

Deel 3: Materiaal en Methoden Praktische uitvoering: 

Zet de bindingsbuffer op ijs (of in de koelkast).



Centrifugeer de bacteriele cellen 30 sec bij 14.000 rpm. Verwijder supernatans.



Voeg 250 l suspensiebuffer (met RNase) aan de stalen.



Resuspendeer de bacteriele pellet en meng goed.



Voeg 250 l lysebuffer toe



Meng zachtjes door de epjes 3 tot 6 maal om te keren.



Incubeer 5 min bij kamertemperatuur.



Voeg 350 l gekoelde bindingsbuffer toe



Meng zachtjes door de epjes 3 tot 6 maal om te keren.



Incubeer 5 min op ijs.



Centrifugeer 10 min bij 14.000 rpm.



Na centrifugatie, insereer je een “high pure filter tube” in een “collection-tube”



Transfereer het supernatans naar het bovenste reservoir van de filtertube



Centrifugeer 1 min bij 14.000 rpm.



Na centrifugatie neem je de filtertube uit de collectietube, verwijder je de flowthrough en steek je de filtertube terug in collectietube.



Voeg 700 l wasbuffer II toe aan het bovenste reservoir van de filtertube



Centrifugeer 30 tot 60 s bij 14.000 rpm en verwijder daarna de flowthrough.



Centrifugeer nog eens 1 min bij 14.000 rpm, zodat overblijvende wasbuffer wordt verwijderd.



Verwijder de collectietube.



Steek de filter tube in een nieuwe epje.



Voeg 100 l elutiebuffer of MilliQ water (dit is aan te raden wanneer je gaat transformeren met behulp van elektroporatie, de elutiebuffer bevat zouten die kunnen leiden tot kortsluiting) toe aan de bovenste reservoir van de filtertube.



Centrifugeer 1 min lang bij 14.000 rpm.



Bewaar DNA bij -20C.

51

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.4.4. PCR De Polymerase Chain Reaction (PCR) wordt gebruikt om in vitro een bepaalde DNAfragment te amplificeren door de omstandigheden van in vivo DNA-replicatie na te bootsen. De techniek berust op de hybridisatie van twee enkelstrengige primers tegen complementaire plaatsen van het gedenatureerde doel-DNA. Met behulp van een enzymatische reactie waarbij gebruik wordt gemaakt van een DNA-polymerase, wordt het tussenliggende DNA gevormd. Voor deze reactie zijn een aantal componenten noodzakelijk, namelijk een enkelstrengige DNA-template, primers (oligonucleotiden waarvan de sequenties complementair zijn met de uiteinden van een bepaalde sequentie van de DNA-template), deoxynucleotide trifosfaten (dNTP’s) en een DNA polymerase enzyme (Figuur 3.4). Enkelstrengig DNA kan verkregen worden door dubbelstrengig DNA te verhitten en zo de beide strengen uit elkaar te smelten. De meeste reactiebuffers bevatten al Mg2+, maar voor sommige buffers moet dit nog aan de reactiemix toegevoegd worden. De meeste polymerasen die gebruikt worden bij PRC-reacties zijn hittestabiel. De polymerase kettingreactie zelf bestaat uit drie thermale stappen: denaturatie, ‘annealing’ en elongatie. Het geheel van deze drie stappen vormt een cyclus, die meermaals herhaald wordt ter amplificatie van de beoogde DNA-sequentie (Figuur 3.4). Tijdens de eerste stap, de denaturatiestap, wordt de temperatuur tot 92-96°C gebracht om de dubbelstrengige DNA-streng te denatureren. DMSO wordt eventueel toegevoegd om het DNA te helpen denatureren. Het is voldoende om de DNA-mix gedurende 3 tot 5 minuten te verhitten tot 95°C om volledig het genomisch DNA te denatureren. Ook de activatie van sommige polymerase enzymen gebeurt tijdens deze eerste stap. ‘Hot Goldstar’, bijvoorbeeld, moet gedurende 10 minuten geactiveerd worden bij 95°C. De denaturatiefase is ook nodig om de secundaire en tertiaire producten (zie verder) van hun template te verwijderen zodat de polymerisatie reactie kan blijven doorgaan met een exponentieel stijgend aantal templates. Bij de tweede stap, de ‘annealing’, wordt de reactiemix op een temperatuur gebracht van 4572°C om de primers te laten binden aan de complementaire sequentie van de DNA-template. De belangrijkste keuze tijdens het opstellen van een PCR programma is die van de “annealing temperatuur”, de temperatuur waarbij de primers zich aan de templaat zullen hechten. Tijdens de eerste vijf cycli moeten de primers eerst de templaat screenen vooraleer de complementaire sequentie gevonden wordt. Hierbij is de temperatuur van groot belang. Indien de temperatuur bij aanhechting te hoog is zal geen “annealing” plaatsvinden. Indien de temperatuur te laag is, zullen de primers hybridiseren met eender welke genomische site met gedeeltelijke

52

Deel 3: Materiaal en Methoden complementariteit. De “annealing” temperatuur kan berekend worden met volgende empirische formule: Tm = 4x (G+C) + 2x (A+T) De optimale ‘annealing’ temperatuur kan echter tot 12°C boven of onder de berekende waarde liggen. Daarom wordt deze stap meestal bij een bepaalde ‘range’ rond de berekende waarde uitgevoerd. De elongatiestap is het opnieuw laten stijgen van de temperatuur tot 72 °C of 68 °C, afhankelijk van het gebruikte polymerase, zodat de eigenlijke polymerisatie ter hoogte van de 3’OH-eindjes van de primers kan plaatsvinden door toevoeging van dNTP’s. Normaal gezien zijn 20 seconden bij 72°C voldoende om een fragment korter dan 50 bp, en 40 seconden voor fragmenten tot 1,2 kb, te verlengen. Standaard wordt gerekend dat het 1 minuut duurt om 1000 basenparen toe te voegen. Wanneer twee verschillende primers, die elk selectief binden met een van de complementaire strengen, toegevoegd worden, dan zal bij de tweede cyclus, de nieuw gevormde DNA-streng ook een templaat vormen voor de andere primer. Op deze manier zal elke nieuwe cyclus het aantal templaten stijgen en zal de synthese van DNA-fragmenten via amplificatie dus exponentieel stijgen. De theoretische exponentiële synthese van een DNA-fragment (N) kan dan berekend worden met volgende formule: N= (2n – 2n)x waarbij : n = het aantal cycli 2n = de primaire en secundaire extensieproducten met onbepaalde lengte x = het aantal kopieën van de oorspronkelijke templaat De primaire extensieproducten ontstaan na de eerste cyclus wanneer de originele DNAtemplate afgeschreven wordt. Secundaire extensieproducten ontstaan door DNA-synthese, na denaturatie van de primaire producten, welke lineair geamplificeerd worden in de volgende cycli. Deze secundaire structuren zijn van onbepaalde lengte. Tijdens de derde cyclus worden de eerste “target” fragmenten van welbepaalde lengte gevormd, door de secundaire producten als template te gebruiken. De lengte en genomische positie van deze fragmenten wordt dus bepaald door de primersequenties.

53

Deel 3: Materiaal en Methoden Na de eerste vier cyclussen (Figuur 3.4) vindt een exponentiële amplificatie van deze “target” fragmenten plaats.

Fig. 3.4.: PCR-principe

De mix nodig voor de polymerisatie reactie bevat de volgende componenten: 

x µl DNA (1 ng / 100 µl) (bij kolonie PCR : enkele cellen toevoegen met een tandenstoker, deze bevatten het template DNA)



1 µl primer forward (stock = 10 µM, finaal = 0,2 µL)



1 µl primer reverse (stock = 10 µM, finaal = 0,2 µL)



2.5 µl DMSO (5% finaal) (eventueel)



DNA polymerase (0,8-1 U / 100 µl)



5 µl reactiebuffer (10x)



2 µl MgCl2 (50 mM) (indien nodig)



1 µl dNTP’s (10 mM)



x µl H2O

Totaal : 50 µl mix

54

Deel 3: Materiaal en Methoden Het PCR-toestel wordt zodanig ingesteld dat een bepaald programma gevolgd wordt, waarbij enkele stappen, de thermale cyclus, een aantal keer herhaald wordt. Programma :

1. x min 95°C 2. x min 95°C



stap 2 tot 4

3. x min Tm +/- 12°C



35 x herhalen

4. x min 68 °C



5. 10 min 68 °C 6. ∞ 4°C

De thermale cyclus mag niet meer dan 40 maal herhaald worden. Bij een groter aantal cycli zou de kans op ongewenste geamplificeerde producten stijgen

3.4.5. Restrictiedigesten Restrictie-enzymen zijn endonucleasen die zich van algemene DNasen onderscheiden doordat ze een bepaalde sequentie herkennen en bijgevolg slechts het DNA verknippen waarin deze sequentie voorkomt. Verknippen van een DNA-molecule met restrictie-enzymen geeft steeds aanleiding tot het ontstaan van een 3’-hydroxyleinde en een 5’-fosfaateinde. Een aantal enzymen knipt midden in de symmetrische herkenningssequentie (palindroom sequentie) en geven ontstaan aan stompe eindjes. Andere enzymen knippen niet middenin maar toch symmetrisch tegenover een denkbeeldig symmetriepunt, zodat ofwel 5’- of 3’-overhangende uiteinden ontstaan. Restrictie-enzymen beschermen bacteriën tegen infecties van virussen, ze vernietigen namelijk

vreemde

DNA

moleculen.

Restrictie-enzymen

fungeren

als

microbiële

immuunsystemen. Restrictie-enzymen komen meestal voor in combinatie met 1 of 2 modificatie enzymen, DNA-methyltransferasen, dat het endogeen DNA beschermt tegen klieving door de eigen restrictie-enzymen. Modificatie-enzymen herkennen dezelfde DNA-sequenties als het restrictie-enzym dat ze begeleiden, maar in plaats van de sequentie te klieven, gaan ze 1 van de bases methyleren in elk van de DNA-strengen. De methyl groepen dringen de grote DNA groeve binnen ter hoogte van de bindingssite en verhinderen zo de interactie met het restrictie-enzym.

55

Deel 3: Materiaal en Methoden Restrictie-enzymen worden onder andere gebruikt om te controleren of DNA-fragmenten in een vector werden opgenomen en of een restrictieplaats-creërende mutatie werd aangebracht. Om de reactie te stoppen kunnen de enzymen geïnactiveerd worden door middel van hitte, fenolisatie of door toevoegen van inhiberende reagentia zoals EDTA of glycerol.

Samenstelling van het restrictie-enzym digest

Een bepaalde hoeveelheid gezuiverd DNA (afhankelijk van de concentratie) wordt gedigereerd met 1 à 2 Units (U, waarbij 1 U overeenkomt met de hoeveelheid enzym nodig om 1 µg DNA te knippen in 1 uur tijd, bij een geschikte temperatuur, in een gegeven eindvolume van 20 of 50 µl in een geschikte buffer) restrictie-enzym in een gepaste 1x reactiebuffer. Voor samengestelde digesten met 2 restrictie-enzymen wordt de buffer aangepast voor de optimale werking van beide enzymen. De enzymen die gebruikt werden in dit thesiswerk zijn vooral afkomstig van New England Biolabs. De digestiemix wordt gedurende 2 uur tot overnacht geïncubeerd bij 37°C in een Thermoblok.

De mix nodig voor de restrictiedigest bevat de volgende componenten: 

x µl DNA (100ng-1000ng)



2 µl Buffer (10x)



2 µl BSA (10x) (indien nodig)



x µl restrictie enzyme A



x µl restrictie enzyme B (eventueel)



x µl H2O

Totaal : 20 µl mix

56

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.4.6. Ligatie Praktische uitvoering

DNA-fragmenten kunnen enzymatisch aan elkaar geligeerd worden, bijvoorbeeld met T4 DNA-ligase bij de ligatie van een DNA-fragment in een opengeknipte vector, wanneer de aan elkaar te ligeren eindjes compatibel zijn. Voor het bepalen van de hoeveelheid insert, wordt volgende berekening toegepast

# nucleotiden vector / # nucleotiden insert = a ng vector / b ng insert

Waarbij 3 x a de hoeveelheid benodigde insert in ng is.

De mix nodig voor de uitgevoerde ligatie bevatte de volgende componenten: 

1 µl 50 ng pKNTAP (vector gebruikt voor N-TAP, opgeknipt met AscI en PacI)



1 µl PCR fragment (digestie ondergaan met AscI en PacI)



5 µl T4 Ligase buffer (5 x)



2,5 µl T4 Ligase



15,5 µl H2O

Totaal : 25 µl mix

Voeg alle componenten samen en incubeer overnacht bij 16°C of een uur bij kamertemperatuur.

57

Deel 3: Materiaal en Methoden

3.4.7. Gateway™ Klonering Gateway™ is een universele kloneringstechnologie gebaseerd op het bacteriofaag  sitespecifieke recombinatie systeem (Landy 1989; Ptashne 1992) dat zorgt voor een snelle en zeer efficiënte manier om heterologe DNA sequenties te transfereren naar een multiple vector-systeem voor functionele analyse en proteïne-expressie. Twee recombinatie-reacties vormen de basis van de Gateway-technologie : de BP-reactie en LR-reactie. In lambda recombinatie-reacties gebeurt de recombinatie-reactie tussen faag lambda en het E. coli chromosoom via specifieke recombinatie (“att” attachment sites) en wordt gekatalyseerd door een mix van recombinatie proteïnen (clonaseTM enzyme mix). Voor de lysogene padweg hebben we de reactie attB x attP  attL x attR gekatalyseerd door BP-clonaseTM (Int, IHF). Voor de lytische padweg hebben we de reactie attL x attR  attB x attP gekatalyseerd door LR-clonaseTM (Int, Xis, IHF).

3.4.7.1. De BP- recombinatie reactie

De BP-recombinatie reactie (Figuur 3.5) vergemakkelijkt de recombinatie van een attBsubstraat (e.g. attB PCR-product of expressiekloon) met een attP-substraat (donor-vector, hierbij wordt er een attL-bevattende entrykloon gevormd. Deze reactie wordt gekatalyseerd door de BP-clonaseTM enzyme-mix, een mengeling van het  Integrase (Int) en de E. coli Integration Host Factor (IHF) proteïnen.

Fig. 3.5: De BP recombinatie reactie

58

Deel 3: Materiaal en Methoden

Benodigdheden: -

Vector: pDONRTM221

-

BP clonaseTM enzyme mix (bewaren op – 80°C)

-

5X BP-clonaseTM reactiebuffer

-

ProteïnaseK oplossing (bewaren op – 80°C): 2 g / l in 10mM Tris HCl, pH 7,5; 20 mM CaCl2 en 50% Glycerol.

Werkwijze:

1. Voor elke BP-recombinatie reactie worden volgende componenten in een 1,5 ml eppendorf gedaan bij kamertemperatuur en gemengd:

-

100 fmol donorvector

-

100 fmol attB bevattend PCR-product

-

4 l BP-buffer

-

x l water

Leng aan tot 16 l 2. Verwijder BP-clonaseTM enzyme mix uit de –80°C diepvries en ontdooi op ijs voor 2 min. Men kan ook 4 l BP-clonase II gebruiken (dit is clonase met buffer samen). Het is belangrijk om een equimolaire hoeveelheid van attB PCR-produkt en donor-vector toe te voegen. 3. Vortex 2 maal 2 sec de BP-clonaseTM enzyme mix. 4. Voeg bij elke staal 4 l BP clonaseTM enzyme mix. Goed mengen door 2 maal 2 sec kort te vortexen. 5. Incubeer de reacties 3 à 4 uur bij 25°C. Afhankelijk van de behoefte kan de duur van de recombinatie reactie verlengd worden tot 18 uur (vooral geschikt voor grote inserts). 6. Voeg 2 l proteïnase K oplossing toe aan elke sample en incubeer 10 min bij 37°C. Dit is nodig om het BP clonase af te breken en aspecifieke recombinatie met het E. coli genoom te voorkomen. 7. Transformeer 5 µL naar 50 µL competent E. coli (e.g. DH5) via heat shock en voeg 950 µL SOC toe, zet 1 uur in shaker bij 37°C en plaat dan de hele reactie uit op LB + Km 50 µg/mL.

59

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.4.7.2. De LR-recombinatie reactie

De LR-recombinatie reactie (Figuur 3.6) vergemakkelijkt de recombinatie van een attL bevattende entry-kloon met een attR bevattende destination vector. Deze reactie wordt gekatalyseerd door LR-clonaseTM enzyme mix, een mengsel van de  Int en Excionase (Xis) proteïnen en de E.coli IHF proteïnen.

Fig. 3.6: De LR recombinatie reactie

Benodigdheden: -

Destination vectoren: pAgrikola, pKNTAP, pKCTAP

-

Entryvectoren

-

LR clonaseTM enzyme mix (bewaren op – 80°C) (plus voor multisite)

-

5X LR clonaseTM reactie-buffer (plus voor multisite)

-

Proteïnase K oplossing (bewaren op – 80°C): 2 g / l in: 10 mM Tris Hcl, pH 7,5; 20 mM CaCl2 , 50% Glycerol.

Werkwijze:

1. Voor elke LR-recombinatie reactie worden volgende componenten in een 1,5 ml eppendorf gedaan bij kamertemperatuur en gemengd:  Gewone LR: bvb pAgrikola x pEntryL1L2-3’ UTR -

1 l pAgrikola (75 ng / l)

-

2 l pEntry L1L2 antisense 3’ UTR

-

1 l LR clonase buffer

-

1 l LR clonase ____ 5 l

60

Deel 3: Materiaal en Methoden  Multisite LR: CTAP -

20-25 fmol attL4 and attR1 entry-vector (met promoter) 20-25 fmol attL1 and attL2 entry-vector (met ORF) 20-25 fmol attR2 and attL3 entry-vector (met TAP-tag) 20-25 fmol destination vector (pKCTAP) Zorg ervoor equimolaire hoeveelheden DNA te gebruiken

-

4 l 5x LR clonase plus buffer

-

x l water Werk in een totale concentratie van 20 l.

 Multisite LR: NTAP -

1 l 150 ng pKNTAP 1 l 50 ng pEntryL4L3-P35S 1 l 50 ng pEntryL1L2-ORF (met stop)

-

4 l 5x LR clonase plus buffer

-

x l water Werk in een totale concentratie van 20 l.

2. Verwijder het LR-clonase (plus) enzyme uit de –80°C diepvries en ontdooi op ijs voor 2 min. 3. Vortex 2 maal 2 sec de LR-clonase (plus) enzyme mix. 4. Voeg nu bij elk staal de LR-clonase (plus) enzyme mix. Goed mengen door 2 maal 2 sec kort te vortexen. 5. Incubeer de reacties 16 uur bij 25°C. 6. Voeg 2 l proteïnase K oplossing toe aan elke sample en incubeer 10 min bij 37°C. 7. Transformeer 5 µL naar 50 µL competent E. coli (e.g. DH5) via heat shock en voeg 950 µL SOC, zet 1 uur in shaker bij 37°C en plaat dan de hele reactie uit op selectieve media.

61

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.4.8. Agarose Gelelektroforese Om DNA te analyseren, bijvoorbeeld bij concentratiebepaling, bij preparatieve zuiveringen, voor het bekijken van een restrictiepatroon, bij controleren van een gevormd PCR-produkt, gebruiken we agarose gelelektroforese. Op een agarosegel kunnen DNA-fragmenten gescheiden worden volgens grootte en lading. Hierbij is de afgelegde weg omgekeerd evenredig met de logaritme van het aantal baseparen en is afhankelijk van de concentratie van de gebruikte agarosegel. Agarose is een lineair suikerpolymeer dat wordt aangekocht in poedervorm.

Gebruikte oplossingen: 10x ladingsbuffer

0.25% broomfenolblauw 50%

glycerol

2%

0.5 M Na2EDTA

0.25% xyleencyanol 10x TAE (5L)

242 g Tris 57.1 mL glacial acetaat 100 mL 0.5 M EDTA pH 8.0

SmartLadder

Agarose: 1,2% agarose in 0,5x TAE

62

Deel 3: Materiaal en Methoden Werkwijze:

Het poeder wordt in een 1,2% (w/v) concentratie opgelost in 0.5 x TAE-buffer en gesmolten door op te koken in de microgolfoven. Achteraf wordt het bewaard in een warmwaterbad bij 60oC. Bij gebruik wordt de vloeibare, hete agarose in een bakje gegoten en een kammetje wordt in de vloeistof geplaatst om slotjes te vormen waar later het staal ingebracht zal worden. Na 30 minuten afkoelen vormt het gestolde agarose een gel. We plaatsen de gel in een bad, gevuld met elektroforesebuffer (0.5 x TAE), waarover we een elektrisch veld kunnen aanleggen. Het staal wordt vermengd met 10X ladingsbuffer en in de slotjes gebracht. DNA is bij neutrale pH negatief geladen en zal dus wanneer het in een elektrisch veld (100 V) komt migreren naar de positieve pool. De scheiding over het gel gebeurt volgens de lengte van de verschillende fragmenten, aanwezig in het staal. Doordat naast de stalen ook een standaard lengtemerker (Smart ladder, Eurogentec) geladen wordt, kunnen we de grootte bepalen van de verschillende fragmenten. Na de elektroforese wordt de gel voor een kwartier

in een badje met 0.007%

ethidiumbromide (zeer carcinogeen!!) gelegd, dit dient voor visualisatie van het DNA onder UV-licht. Het ethidiumbromide gaat intercaleren tussen de GC-baseparen van het DNA. Wanneer de gel onder UV-licht gehouden wordt, licht het ethidiumbromide op met een intensiteit die afhankelijk is van de hoeveelheid DNA in het staal en kunnen we een foto nemen. Aan de hand van de standaard lengtemerker en de totale hoeveelheid ingebracht staal kunnen we afleiden hoeveel ng / µl DNA zich ongeveer in het staal bevindt, aangezien de merker immers een geijkte hoeveelheid van elk lengtefragment bevat.

63

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.5. Transformatie Bij transformatie is het de bedoeling vreemd DNA in een gastheercel binnen te brengen, bijvoorbeeld een plasmide met daarop een antibioticum-resistentiegen en het gen van interesse. De aanwezigheid van het resistentiegen laat toe op een eenvoudige manier en binnen een korte periode enkel die cellen te selecteren, die het betreffende plasmide bevatten. De andere cellen zullen immers afsterven aangezien zij het resistentiegen niet bezitten. Transformatie naar competente bacteriële cellen kan op meerdere manieren gebeuren, zoals elektroporatie en hitte schok transformatie. Vooraleer we DNA kunnen transformeren naar bacteriën moeten de cellen competent gemaakt worden. Competente cellen zijn cellen waarvan de celwand en het cytoplasmatische membraan voorbehandeld zijn, zodat ze in staat zijn plasmiden langs deze weg op te nemen.

3.5.1. Transformatie van competente E. coli cellen Hitte schok (heatshock) transformatie Een veel gebruikte methode voor het maken van competente E. coli cellen is een voorafgaandelijk behandeling met calciumionen. Men vermoedt dat de calciumionen de negatieve ladingen van de fosfolipiden in het celmembraan neutraliseren, waardoor het DNA gemakkelijker doorheen de celwand kan. De cellen worden bij deze methode ook altijd onderworpen aan een hitteschok (‘heat shock’), deze stap is cruciaal voor een efficiënte DNA opname door de cellen.  Zet de benodigde hoeveelheid epjes op ijs, zodat ze al kunnen koelen  100 l competente E. coli cellen (DH5 - of DB3.1 stam werden gebruikt) worden ontdooid op ijs.  De gekoelde epjes vullen met 50 l competente E. coli cellen  Hierbij doe je 5 l van het te transformeren DNA  Schudden door lichtjes te tikken op het epje  Let op: dit alles gebeurt op ijs  Hou het mengsel 5 à 20 min op ijs  In thermoblok voor 42 sec bij 42°C plaatsen  Daarna 2 min op ijs

64

Deel 3: Materiaal en Methoden  Voeg 950 l SOC medium toe  Breng dit mengsel over naar een 12 ml falcon  Zet dit alles 1 uur lang in de shaker bij 37°C  Centrifugeer 10 min lang 3800 rpm  Giet het supernatans weg  Los de celpellet op in 100 l SOC medium  Plaat alles uit op selectief medium (LB+ met antibioticum)  Voeg glaspareltjes toe en schud zodat alles gelijkmatig verspreid wordt  Zet overnacht in een oventje bij 37°C of over weekend bij KT

Transformatie via elektroporatie Bij elektrotransformatie wordt het plasmide in de cellen binnengebracht door een korte elektrische schok toe te dienen. Door de krachtige elektrische puls worden immers gaten geslagen in het celmembraan waardoorheen DNA naar binnen dringt. 

Breng ongeveer 100 ng DNA in een ijskoud elektroporatiecuvet.



Voeg 40 μl op ijs ontdooide competente cellen toe en bewaar de cuvetten steeds op ijs.



Elektroporeer in een elektroporatiekamer bij 200 Ω, 25 μF en 2.5 V tot het toestel een signaal geeft.



Voeg onmiddellijk 1 ml SOC medium aan de cellen om zoveel mogelijk transformanten in leven te houden.



Incubeer 1 uur bij 250 rpm en 37 °C.



Plaat 100 μl uit op LB medium met het juiste selectie-antibiotica.



Incubeer overnacht bij 37°C.

65

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.5.2. Transformatie van competente Agrobacterium tumefacians cellen  Bereid 50ml YEB met antibioticum  Inoculeer met Agrobacterium tumefacians  Groei 24 uur lang bij 28°C  Centrifugeer 2min bij 14.000 rpm  Was de pellet 4 maal met MilliQ water (50ml, 25ml, 12,5ml; 5ml)  Hou de cellen op ijs (max 1 uur)  Elektroporatie: -

Voeg 1 g plasmide DNA aan 200 l bacteriën, zet 1 min op ijs

-

Breng 200 l DNA/bacterie mix in een gekoelde elektroporatie cuvet, eventjes tikken op de bench om luchtbellen te vermijden

-

Na elektroporatie voeg je 800 l YEB toe en transfereer naar een eppendorf

-

Incubeer 2 uur lang bij 28°C op de shaker

-

Plaat verschillende concentraties bacteriën uit: 20, 50 -en 100 l op selectief medium

-

Plaats dan in de oven bij 28°C of de bench voor enkele dagen

3.5.3. Transformatie van PSB-d Arabidopsis thaliana cellen De PSB-d cellen werden getransformeerd via co-cultivatie met Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens is in staat om ‘crown gall’ (tumoren) in planten te veroorzaken. Het doet dit door een deel van zijn genoom, het T-DNA, te integreren in het plantengenoom van geïnfecteerde cellen. Dit T-DNA bevindt zich op een plasmide, het Ti-plasmide, en wordt geflankeerd door een linker en een rechter ‘border’. Op het T-DNA zitten de functies voor het induceren van tumoren. Dit systeem werd omgevormd, zodat het efficiënt gebruikt kan worden voor transformatie van plantencellen. Zo zijn de genen, die de tumoren veroorzaken, uit het T-DNA gehaald en kan men een ander gen in het T-DNA inbrengen. Deze constructen kunnen dan in Agrobacterium tumefaciens getransformeerd worden, waarna A. tumefaciens het T-DNA, dat nu het gen van interesse bevat, stabiel kan integreren in het genoom van de plantencellen (Figuur 3.7). Door op de vector nog een antibioticum resistentiegen te plaatsen, kunnen de cellen die getransformeerd zijn, geselecteerd worden op medium met het antibioticum.

66

Deel 3: Materiaal en Methoden

Fig. 3.7: Agrobacterium gemedieerde plant transfomatie

Praktische uitvoering  We bereiden een 2 ml precultuur met YEB medium (met de benodigde antibiotica) en A. tumefaciens cellen in een 10 ml falcon. Deze wordt overnacht in een shaker gezet bij 28°C.  De volgende dag bereiden we een 20 ml cultuur in een 100 ml erlenmeyer met hierin ons 2 ml precultuur en 18 ml YEB medium met dezelfde antibiotica die gebruikt werden voor ons precultuur. Deze wordt overnacht in een shaker gezet bij 28°C.  De volgende dag wassen we de antibiotica weg uit de 20 ml cultuur.  We doen de cellen in een 50 ml falcon en centrifugeren 15 min bij 4000 rpm. Achteraf supernatans weggieten.  Los de pellet op in 20 ml MSMO dmv vortexen.  Centrifugeer 15 min bij 4000 rpm. Achteraf supernatans weggieten.  Los de pellet op in 20 ml MSMO dmv vortexen.  We bepalen de optische densiteit (OD) bij 600 nm in een spectrofotometer: 1) Vul een cuvet met 1 ml MSMO voor de blancometing 2) Vul een cuvet met 0,5 ml MSMO en 0,5 ml cellen 3) Meten bij OD600nm 4) Berekening van de hoeveelheid MSMO die aan de celpellet moet

67

Deel 3: Materiaal en Methoden worden toegevoegd om een OD van 1 te krijgen via volgende formule: Vbegin . Cbegin (x2) = Veind . Ceind met Veind het toe te voegen volume aan MSMO.  Centrifugeer 15 min bij 4000 rpm. Achteraf supernatans weggieten.  We lossen de pellet op in MSMO zodanig dat de OD600nm = 1.  In een 6-well plaat brengen we 3 ml PSB-D cellen met 200 μl A. tumefaciens cellen en 6 μl acetosyringone (200 M).  Plaats de plaat 2 dagen lang in een 25°C shaker bij 130 rpm in het donker  Transformatie via selectie van calli op plaat: -

Agrobacteria worden eerst weggewassen

-

1 ml uitplaten op MSMO met antibiotica, paar weken laten groeien

-

GFP detectie met Leica MZ16F fluorescentie microscoop

-

Materiaal van de plaat in cultuur brengen in 30 ml MSMO met de agroafdodende antibiotica vancomycine (Vm), carbemicilline (Cb) en het selectieve antibioticum (AB).

-

Om de week het medium verversen (43 ml MSMO met selectief antibioticum + 7 ml celcultuur).

-

Cellen oogsten.

 Rechtstreekse transformatie (alternatief): -

In een 6-well plaat brengen we 7 ml MSMO (+ Cb, Vm, en selectief AB.) samen met 3 ml celcultuur.

-

Breng de totale 10 ml uit een well over naar een 25 ml erlenmeyer.

-

Na een week wordt dit dan overgegoten in een 100 ml erlenmeyer met vers MSMO (+antibiotica) medium (30 ml).

-

Om de week het medium verversen.

-

Cellen oogsten.

68

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.6. Eiwittechnieken Het werken met eiwitten gebeurt steeds op ijs!!!

3.6.1. Eiwitextractie bereiding voor expressie-analyse Oplossingen Extractiebuffer = Homogenisatiebuffer (HB) Eindconc 25mM 15mM 15mM 150mM 15mM 60mM 1mM 0,1% 0,1mM 1mM 1mM 10μg/ml 10μg/ml 10μg/ml 0,1mM 5μg/ml 5μg/ml 5 μg/ml

Tris-HCl pH=7.6 MgCl2 EGTA NaCl pNO2PhePO4 β-glycerophosphate DTT NP-40 Na3VO4 NaF PMSF Leupeptin Aprotinin SBTI Benzamidine Antipain Pepstatin Chymostatin

Stockopl.

25ml

50ml

100ml

1M 1M 0,5M 1M

625μl 375μl 750μl 2,125ml 0,0966g 0,321g 125μl 125μl 25μl 50μl 250μl 25μl 25μl 25μl 25μl 12,5μl 12,5μl 12,5μl

1,25ml 750μl 1,5ml 4,25ml 0,197g 0,6425g 250μl 250μl 50μl 100μl 500μl 50μl 50μl 50μl 50μl 25μl 25μl 25μl

2,5ml 1,5ml 3ml 8,5ml 0,39g 1,285g 500μl 500μl 100μl 200μl 1ml 100μl 100μl 100μl 100μl 50μl 50μl 50μl

200mM 20% 100mM 500mM 100mM 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 100mM 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml

Praktische uitvoering: Extractie van eiwitten voor expressie-analyse:  Epjes met geoogste plantencellen worden uit de –80°C diepvries gehaald en vervoerd in vloeibaar N2.  Voeg in het epje met plantencellen 200 l extractiebuffer toe.  De cellen worden in een mortier geplet.  Vortex de oplossing en breng het epje in vloeibaar N2 (herhaal 2 maal).  Vortex totdat de oplossing ontdooit.  Centrifugeer 15 min bij 14.000 rpm en 4°C.  Neem supernatans af.

69

Deel 3: Materiaal en Methoden  Centrifugeer 15 min bij 14.000 rpm en 4°C.  Doe 200 l supernatans in een nieuw epje.  In een ander epje maken we een 1/20 verdunning: 2 l extract + 38 l water. 3.6.1.1 Proteïne-concentratiebepaling van proteïne-extracten (bereid met HB-buffer) van Arabidopsis celsuspensies volgens de methode van Bradford. Benodigdheden: 

Eiwitextract



100 mg / ml BSA stockoplossing



BIO-RAD kleuroplossing (270 µl / well): – 60 µl BIO-RAD protein-dye – 210 µl steriel water Maak deze oplossing net voor gebruik aan.



NUNC polysorp microtiterplaten



colorimetrische microtiterplaat-reader met Soft Max Pro software

Praktische uitvoering: 

Maak een BSA-oplossing van 100 µg / ml



Neem als blanco 30 µl water (in duplo)



Maak uit de BSA-oplossing van 100 µg / ml volgende standaardreeks in de welletjes van de microtiterplaat aan. Maak de standaardreeks in duplo. – standaard 1 = 1 µg/ml: 3 µl BSA + 27 µl H2O – standaard 2 = 2 µg/ml: 6 µl BSA + 24 µl H2O – standaard 3 = 4 µg/ml: 12 µl BSA + 18 µl H2O – – –

standaard 4 = 6 µg/ml: 18 µl BSA standaard 5 = 8 µg/ml: 24 µl BSA standaard 6 = 10µg/ml: 30 µl BSA

+ 12 µl H2O + 6 µl H2O + 0 µl H2O



Maak van het staal een 1/1200 en een 1/3000 verdunning in steriel H2O: Maak eerst een 1/20 verdunning in H2O in een epje: 2 µl staal + 38 µl H2O. Maak in de microtiterplaat een 1/6 verdunning: 5 µl van het 1/20 verdunde staal + 25 µl steriel H2O Maak in de microtiterplaat een 1/15 verdunning: 2 µl van het 1/20 verdunde staal + 28 µl steriel H2O



Door het toevoegen van de 270 µl kleuroplossing zal dan een laatste 1/10 verdunning gebeuren.

70

Deel 3: Materiaal en Methoden 

Voeg met de multi-chain pipet 270 µl BIO-RAD kleuroplossing toe



Sluit de plaat af en laat 10 min schudden.



Meet de absorptie bij 600 nm m.b.v. de colorimetrische microtiterplaat-reader.

3.6.2. SDS-PAGE Om een eiwit te visualiseren en de vorderingen in de opzuivering duidelijk te kunnen volgen, worden de eiwitten eerst gescheiden via SDS-PAGE. Dit is een vorm van eiwitscheiding waarbij het eiwitmengsel over een polyacrylamide gel gebracht wordt en waarbij de scheiding zal gebeuren op basis van het moleculair gewicht van de eiwitten. Door het SDS (Sodium Dodecyl Sulphate ) in de gebruikte buffers worden de eiwitten volledig ontvouwen en negatief geladen, zodat de scheiding enkel op het moleculaire gewicht van de eiwitten gebaseerd is.

3.6.2.1. De polyacrylamide gel De polyacrylamidegel wordt gevormd door polymerisatie van monomeer acrylamide tot lineaire ketens en door cross-linking van deze ketens met N,N’-methyleen bisacrylamide (BIS) (Figuur 3.8). De resolutie van de gel wordt bepaald door de concentratie van acrylamide en bisacrylamide, hoe meer bisacrylamide, hoe meer cross-linking kan optreden en hoe meer de zeefstructuur van het gel de grotere moleculen afremt. De polymerisatie wordt geïnitieerd door het toevoegen van vrije radicalen (APS, ammonium persulfaat). Ook TEMED wordt toegevoegd om de vrije radicalen te stabiliseren.

Fig. 3.8: polymerisatie van acrylamide en bis-acrylamide

71

Deel 3: Materiaal en Methoden De gel wordt tussen 2 glazen platen gegoten. Bij discontinue elektroforese wordt het gel opgebouwd uit een laag ‘stacking’ gel en een laag ‘running’-of separating gel. De bovenste laag van het gel is de ‘stacking gel’(zie figuur). Hierin bevinden zich de slotjes waarin het staal geladen zal worden (Figuur 3.9). Deze laag zal de eiwitten niet scheiden maar onder andere door de pH en de grofmazigheid van de ‘stacking’ gel zullen de eiwitten zodanig gestapeld worden, vlak boven de separating gel, dat alle eiwitten gelijktijdig zullen vertrekken wanneer ze doorheen de separating gel migreren. In de separating gel zullen de eiwitten met een verschillende snelheid doorheen het gel migreren, afhankelijk van hun moleculair gewicht. De kleinere eiwitten zullen minder geremd worden door de gel, de grotere eiwitten zullen meer afgeremd worden door de ‘cross-linking’ van het polyacrylamide.

Fig. 3.9: SDS-PAGE

72

Deel 3: Materiaal en Methoden Buffersamenstelling Separating gel

MQ H2O 30% Acrylamide 1 M Tris-HCl pH 8,7 10% SDS 10% APS Temed

10 ml 10% 2,75 ml 3,3 ml 3,75 ml

12% 2,05 ml 4,0 ml 3,75 ml

15% 1,05 ml 5 ml 3,75 ml

17% 0,35 ml 5,7 ml 3,75 ml

60 ml 12% 12,3 ml 24 ml 22,5 ml

100 µl 100 µl 10 µl

100 µl 100 µl 10 µl

100 µl 100 µl 10 µl

100 µl 100 µl 10 µl

600 µl 300 µl 30 µl

Stacking gel

MQ H2O 30 % Acrylamide 1 M Tris-HCl pH 6,8 10% SDS 10% APS Temed

10 ml 6,8 ml 1,7 ml 1,25 ml 100 µl 100 µl 10 µl

30 ml 20,4 ml 5,1 ml 3,75 ml 300 µl 150 µl 15 µl

Sample buffer 5x 1 M Tris-HCl pH 6,8 10% SDS 600 mM DTT Bromophenolblauw Glycerol MQ H2O

3,5 ml 1g 0,93 g 1,2 mg 3 ml 3,5 ml

Running buffer 10x, 1000ml, pH 8,3 0,25 M Tris-HCl 30,25 g 1,92 M glycine 144 g 35 mM SDS 10 g MQ H2O Adjust to 1000 ml  voor gebruik 10x verdunnen (100 ml + 900 ml MQ H2O)

73

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.6.2.2. Behandelen van het staal De staaltjes worden, voor ze over de gel te brengen, 10’ opgekookt in sample buffer bij 95°C. Deze bevat SDS, glycerol, broomfenolblauw en DTT. SDS is een anionisch, denaturerend detergens dat eiwitten lineariseert zodat deze geen tertiaire of quaternaire structuur meer vertonen (Figuur 3.10).

Fig. 3.10: linearisatie van het eiwit door middel van SDS

Bovendien wordt de lading die eigen was aan het eiwit volledig gemaskeerd door de negatieve ladingen van het SDS, de eiwitten zullen dus allemaal negatief geladen zijn en zullen migreren naar de positieve pool wanneer ze in een elektrisch veld geplaatst worden. Het DTT zal de eventuele disulfidebruggen van het eiwit verbreken en zo meewerken aan de linearisatie van het eiwit. Er wordt ook broomfenolblauw aan het staal toegevoegd om de migratie van de eiwitten op het gel zichtbaar te kunnen volgen. Glycerol wordt toegevoegd om het staal te ‘verzwaren’ en het laden te vergemakkelijken. Bovendien wordt het staal ook nog gedurende 10 minuten gekookt bij 95°C, dit om optimale denaturatie te bekomen. De gel wordt in elektrodebuffer geplaatst en spanning wordt over het geheel gebracht. De negatief geladen eiwitten migreren naar de positieve pool met een snelheid die omgekeerd evenredig is met hun moleculair gewicht.

74

Deel 3: Materiaal en Methoden Om een zicht te krijgen op het moleculair gewicht van de eiwitten, wordt samen met de staaltjes een proteïne merker geladen. Deze loopt mee samen met de moleculen en aan de hand van de gekende waarden van de merker kan het moleculaire gewicht geschat worden.

Praktische uitvoering 

Glasplaatjes wassen met zeep, vervolgens goed spoelen met water en EtOH, afdrogen met cleenex na 2’ drogen aan de lucht.



Plaats de houder op een staander, breng spacers tussen groot en klein glasplaatje en breng dit in de houder en span deze voorzichtig aan. Controleer of de onderzijde van de 2 glasplaatjes mooi recht is.



Separating gel maken: (10 mL / 2 gels) (handschoenen gebruiken). Opgelet: APS en TEMED pas op einde toevoegen.



Vlug overpipetteren tussen plaatjes (1 cm onder kammetje).



Isobutanol (H2O-saturated) toevoegen om luchtbellen te verwijderen en de ‘running gel’ recht te trekken.



Laten stollen 10’



Isobutanol verwijderen, naspoelen met water, drogen met dun filterpapier (gel niet aanraken)



Stacking gel maken: (5 mL / 2 gels) (handschoenen gebruiken)



Stacking boven separating gel pipetteren.



Kammetje schuin inbrengen, luchtbellen verwijderen; volledig opvullen met stacking.



Laten stollen.



1x SDS-loopbuffer (running buffer) in buffervat vullen.



Kammetje verwijderen en naspoelen met water.



Resterend water met cleenex opzuigen.



Gels vastklikken in elektrodebad.



Eiwitoplossing + ladingsbuffer (+DTT om de S-bruggen te reduceren; 5x) in eppje.



10’ opkoken in incubator bij 95°C.



Laden van gel: 60 g staal.



Loop gel bij 180 V, constante voltage of bij 25 mA per gel, constante ampérage gedurende 1 uur (tot blauw front van de gel gelopen is).

75

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.6.3. Western Blot In deze thesis werd uitsluitend “Wet western blotting” gebruikt. De eiwitten die gescheiden werden op gel, kunnen overgebracht worden op een membraan. Ze zullen naar het membraan migreren onder invloed van een aangelegde spanning naar de positieve pool toe. De niet bezette plaatsen op het membraan moeten nu echter nog bezet worden, zoniet zal het detectie-antilichaam niet-specifiek op het membraan binden.

Buffersamenstelling: Voor 1 L transferbuffer of (wet) blotbuffer: 10x Tris Glycine

100 ml

Water

750 ml

MeOH

150 ml

Zet de buffer koud.

Praktische uitvoering: 

Bereidt voldoende transferbuffer om de transferbuffer tank te vullen en een extra 200 ml om het gel en membraan te equilibreren en om het Whatman 3MM filterpapier nat te maken.



Snijdt de stacking gel uit en verwijder de gel uit diens cassette.



Dompel de gel 10 à 30 min lang in de transferbuffer .



Breng het filterpapier minstens 30 s lang in de transferbuffer.



Knip het Immobilon membraan in het aantal nodige stukken van 6,6 cm x 8,6 cm.



Bevochtig het membraan 15 s lang in methanol.



Plaats het membraan vervolgens 2 min in MQ H2O.



Plaats het membraan vervolgens 5 min in transferbuffer en laat het minstens 5 min equilibreren.



Open het mapje (cassette houder)



Plaats op de zwarte kant een vochtige spons en plaats hierop 2 vochtige Whatman filterpapiertjes.

76

Deel 3: Materiaal en Methoden 

Leg hierop de gel. Plaats op de gel met de holle kant een PolyVinylidine DiFluoride (PVDF) membraan, aandrukken om luchtbellen te vermijden.



Plaats hierop 2 vochtige Whatman filterpapiertjes, aandrukken om luchtbellen te vermijden.



Plaats hierop een vochtige spons. En rol met een pipet heen en weer over dit alles om luchtbellen weg te krijgen en sluit dan het mapje.



Plaats het mapje zo in de transfertank, zodanig dat de gel-zijde van de cassettehouder gericht is naar de kathode (-) en de membraanzijde gericht is naar de anode (+).



Vul de transfer tank met de gekoelde transferbuffer.



Voeg een roermagneet en blok ijs hierbij. Na een uur zal het blok ijs gesmolten zijn en moet deze vervangen worden.



Plaats deze opstelling op een roerplaat.



Verbindt de anode (zwart) en kathode (rood) met de corresponderende ingangen op de transfereenheid.



Stel in: constante ampérage, 270 mA (= 0,27 A) voor 1 uur.



Na een uur vervang je het ijs en gebruik je dezelfde instellingen voor wederom een uur.



Na de transfer verwijder je de cassettehouder uit de tank .

3.6.4. Immunodetectie Standaard immunodetectie wordt uitgevoerd op proteïnen na western blot. Het ongebonden membraan bindingsplaatsen op het vochtige membraan (blot) worden geblokkeerd met blocking reagens. Het membraan wordt geïncubeerd met een primair antilichaam tegen het proteïne van interesse. Vervolgens wordt een secundair antilichaam toegevoegd, geconjugeerd met een enzym, horse radish peroxidase (HRP) of alkalisch fosfatase bijvoorbeeld, dat het primaire antilichaam herkent. Dit enzym wordt gebruikt om de proteïne van interesse te vizualiseren. Met HRP, H2O2 en luminol wordt licht geproduceerd dat opgevangen kan worden op een autoradiogram. Buffersamenstelling: 1L TBT buffer: 10x TBS buffer

100 ml

Water

900 ml

Triton X-100

1 ml 77

Deel 3: Materiaal en Methoden Blocking buffer: Melkpoeder (3%)

1,5g

1x TBT buffer

50 ml

Praktische uitvoering:

Antilichaam incubatie 

Plaats de blot in afgeroomd melk (3%) en zet het voor 1 uur op een shaker bij KT (of overnacht bij 4°C).



Plaats de blot in 10 ml TBS-T buffer (en 3% afgeroomd melk) met de primaire antilichaam oplossing en incubeer 1 uur lang op een shaker bij kamertemperatuur.



Was de blot in 10 ml TBS-T buffer en incubeer 10 min lang op een shaker bij kamertemperatuur.



Was de blot in 10 ml TBS-T buffer en incubeer 5 min lang op een shaker bij kamertemperatuur. Doe dit 2 maal, telkens met verse TBS-T buffer.



Plaats de blot in 10 ml TBS-T buffer (en 3% afgeroomd melk) met de secundaire antilichaam (geconjugeerd met horse radish peroxidase) oplossing en incubeer 1 uur lang op een shaker bij kamertemperatuur.



Was de blot in 10 ml TBS-T buffer en incubeer 10 min lang op een shaker bij kamertemperatuur.



Was de blot in 10 ml TBS-T buffer en incubeer 5 min lang op een shaker bij kamertemperatuur. Doe dit 2 maal, telkens met verse TBS-T buffer.

3.6.4.1. Enhanced Chemiluminescence (ECL) detectie

Detectie met behulp van HRP (Horse Radish Peroxidase) 

Droog de blots tussen 2 papieren doekjes, goed aandrukken (niet langer dan 30s).



Substraat van HRP uit de koelkast (4°C) halen: -

Western Lightning chemiluminescence Reagens plus: Luminol (donker flesje).

-

Western Lightning chemiluminescence Reagens plus: Oxidizing reagent.

78

Deel 3: Materiaal en Methoden 

Per blot: 2 ml luminol + 2 ml oxiderende reagens. Breng dit in een plastieken schaal en laat 1 min schudden.



Droog de blots wederom tussen 2 papieren doekjes, goed aandrukken.



Neem Saran plastiek folie, plaatst het op de filmcassette en plak het onderaan vast.



Plaats hierop de blotjes.



Plooi het niet vastgekleefde gedeelte van de folie over de blotjes en kleef dan de hoekjes vast.



Met behulp van autoradiogrammen (mogen niet in contact komen met licht!) van Amersham maken we in de donkere kamer foto’s.



Maak een kleine vouw in de linker benedenhoek van het autoradiogram en plaats het 5 tot 30 s (of langer bij zwakke detectie) op de blots.



Plaats het belichte autoradiogram horizontaal in de machine.

3.6.4.2. Alkalisch fosfatase detectie

Principe: Onder invloed van alkalisch fosfatase zal BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolylfosfaat) gedefosforyleerd worden. Onder alkalische omstandigheden treedt er dimerisatie op waardoor dehydro-indigo wordt gevormd. Er worden tevens protonen gevormd die NBT (nitroblue tetrazolium) reduceren. Het NBT zal neerslaan onder de diformozan-vorm (onoplosbaar en paars).

Gebruikte oplossingen: 

NBT

30 mg NBT / 1mL 70% DMF



BCIP

15 mg BCIP / 1mL 100% DMF (max. 3 maanden bij 4 oC)



NBT/BCIP-buffer

(max. 3 maanden bij 4 oC)

0.1 M NaHCO3 1 mM MgCl2 pH 9,8

79

Deel 3: Materiaal en Methoden Practische werkwijze: 

Giet de blokbuffer af.



Incubeer het membraan 1h30 in primair antilichaam verdund in blokbuffer.



Was het gel 3x met PBS gedurende 5' in schaaltje.



Voeg secundair antilichaam toe verdund in blokbuffer.



Na toevoegen van het antilichaam dat geconjugeerd is met alkalisch fosfatase (dit kan primair, secundair, tertiair… zijn) opnieuw 3x wassen met PBS gedurende 5'.



Breng het membraan met een pincet over in een blauw schaaltje.

Verdun NBT en BCIP 100x in NBT/BCIP-buffer en incubeer het membraan in deze oplossing tot bandjes duidelijk zichtbaar zijn.

80

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.6.5. TAP (CBPZZ) protocol Materiaal:

1. Buffers: 

Extractiebuffer: 25 mM TrisHCl pH 7,6, 15 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 150 mM NaCl, 15 mM pNO2PhePO4, 60 mM beta-glycerofosfaat, 0.1% NP-40, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 µg / ml leupeptine, 10 µg / ml aprotinine, 5 µg / ml antipaïne, 5 µg / ml chymostatine, 5µg / ml pepstatine, 10 µg / ml SBTI, 0.1 mM benzamidine, 1 µM E64, 5% ethyleenglycol



IgG-Sepharose wasbuffer: 10 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1 % NP-40, 5% ehtyleenglycol



TEV buffer: 10 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1 % NP-40, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1µM E64, 5% ethyleenglycol



Calmodulin bindingsbuffer: 10 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1 % NP-40, 10 mM beta-mercaptoethanol, 1 mM imidazol, 2 mM CaCl2, 1 mM MgAc, 5% ethyleenglycol



Calmodulin elutiebuffer: 10 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1 % NP-40, 10 mM beta-mercaptoethanol, 1 mM imidazol, 25 mM EGTA, 5% ethyleenglycol

81

Deel 3: Materiaal en Methoden 2. Affiniteits matrices: 

IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham)



Calmodulin Affinity resin (Stratagene)

Werkwijze: Maken van eiwitextract: 

Verzamel het plantmateriaal op een glasfilter, in vloeibare stikstof invriezen en bewaren bij -80C. Vul de mortier met vloeibare stikstof en breng hierin het plantmateriaal (circa 15 g / TAP). Plantmateriaal pletten met gekoelde stamper tot kleine brokjes en in falcon in –80°C.



Extraheer het plantmateriaal in extractie buffer door middel van mixen met behulp van de ultra-Turax mixer (3 x 30sec blauwe stand): -

Koel de ultra-Turax mixer staaf eerst in de diepvriezer.

-

De ultra-Turax mixer staaf eerst spoelen met extractiebuffer.

-

Plaats falcons in een beker met ijs en voeg extractie buffer toe (circa 1 ml / gram cellen).

-

Mixen: eerst op de groene stand, eventjes op en neer gaan met de falcon, ga vervolgens naar de blauwe stand, na 30 sec stoppen met mixen, vortex en op ijs koelen.

-

Herhaal drie maal en breng extract in een centrifugebuis

-

Spoel de staaf nog eens met circa 3 ml extractiebuffer na, spoel hiermee de 2 falcons (falcons eerst even centrifugeren bij 1500 rpm) en breng ook in het centrifuge buisje m.b.v p1000 pipet ( blauwe tip afknippen en op en neer pipetteren).





Centrifugeer het extract 20 min lang bij 21.000 rpm in SS34 bij 4°C -

Spoel de centrifuge buisjes vooraf met milliQ water

-

Vul met extract tot circa 2 cm van de rand (equilibreer op 0,5 g)

Centrifugeer vervolgens 45 min in SW-41 (Beckman ultracentrifuge) bij 38000rpm en 4ºC. -

Equilibreer tot 0,01g

-

Breng eerst het supernatans van de vorige centrifuge stap in Beckman polyallomer centrifugatie buisjes.

82

Deel 3: Materiaal en Methoden 3.6.5.1. TAP- zuivering A) Equilibratie van Ig G parels met extractiebuffer (3 x 10 ml) 

Pipetteer 1ml IgG Sepharose 6 Fast Flow (knip het tipje altijd eerst af voor je er beads mee oppipetteert) in een 15ml falcon (circa 500 µl effectieve beads)



Was met 10ml extractiebuffer (20 kolomvolumes)



Spin 1500 rpm in gekoelde centrifuge 1 min lang.



Neem supernatans af en voeg 10 ml extractiebuffer toe (herhaal deze twee laatste stappen 2 maal).



Breng beads over naar 50 ml falcon.

B) Incubatie van Ig G beads met extract, 1 uur lang bij 4°C 

Filtreer het volledige extract over 0,45 m Alltech filter



Meet de eiwitconcentratie van het extract via Bradford (BIORAD protein assay) -

Voeg in de cuvetjes 799 µl H2O + 200 µl Bradford reagens + 1 µl eiwitextract

-

15 min op kamertemperatuur laten staan

-

Blancometing gebeurt in een cuvetje met extractiebuffer (OD bij 595 nm).

-

Elke staal wordt in duplo gedaan. Men neemt dan het gemiddelde optische densiteit (OD) van de stalen.



Voeg het extract (circa 200 milligram proteïne) toe aan de beads en incubeer 1 uur lang op een roterend wiel bij 4C in de koude kamer.

C) Wassen van Ig G Sepharose 

Centrifugeer 1 min bij 1500 rpm en 4°C.



Verwijder supernatans.



Pipetteer beads op met blauw tipje met afgesneden punt (eerst op en neer pipetteren).



Breng beads over in een Miacol kolom en vang de wasbuffer op in een 15 ml falcon.



Spoel de grote falcon met circa 1 ml Ig G wasbuffer.



Was de IgG Sepharose met 1 x 10ml IgG-Sepharose wasbuffer en 1x 5 ml TEV-buffer in de Miacol kolom.



Breng het staal (beads) in een 1,5 ml eppendorf.



Short spin 1500 rpm.



Neem supernatans af.

83

Deel 3: Materiaal en Methoden 

Voeg 500µl TEV-buffer en 100U (1 µl = 10 U) AcTEV (Invitrogen) toe. Incubeer 1 uur lang bij 16C op een draaiend wiel. Voeg na 30 min een extra hoeveelheid 100U AcTEV toe. Bij eiwitten die onstabiel zijn bij 16°C (bvb cyclines) wordt de TEVincubatie overnacht bij 4°C gedaan.



Filter TEV-eluaat over Miacol kolom en vang op in epje.

D) Equilibratie van calmoduline affiniteits resin 

Pipetteer 1ml beads (500 µl effectief beads) (afgesneden tip) in een Miacol kolom



Was met 10 ml calmoduline bindingsbuffer



1 min centrifugeren bij 1500 rpm en neem supernatans af ( herhaal 2 x)



Verdeel de beads gelijkmatig over twee 5 ml falcons



1 min centrifugeren bij 1500 rpm en neem supernatans af

E) Incubatie van TEV-eluaat met calmoduline beads 

Was Ig G beads 2 x met 750 µl CBB (met EDTA vrije Complete protease inhibitor) en vang op bij TEV-eluaat.



Vang het op bij het eluaat in 5 ml buisje.



Voeg 1 mM CaCl2 toe (1 µl van 1 M stock)



Voeg 500 µl beads toe



Incubeer 1 uur op draaiend wiel in de koude kamer



Centrifugeer 1 min bij 1500 rpm



Neem supernatans af.

F) Wassen van calmoduline beads met CBB 

Pipetteer beads in een Miacol kolom.



Was de beads in 10 ml CBB (spoel 5 ml buisje), de wasbuffer wordt opgevangen in een 15 ml falcon.

G) Elutie van calmodulinebeads 

Elueer de kolom met 2,5 ml calmoduline elutiebuffer. Vang op in 5 fracties van 500 µl ( zonder CaCl2 ; met EDTA).



Vang op in 5 ml buisjes en verdeel uit over twee 2 ml epjes



Voeg TCA toe (finaal 25%) om de eiwitten te concentreren.

84

Deel 3: Materiaal en Methoden 

Overnacht op ijs in de koude kamer.



Centrifugeer bij 14.000 rpm



Was pellet 2 x in 0,5 ml Aceton-HCl (aceton gaat de resten TCA verwijderen)



Na het wassen wordt het aceton weggezogen



Laat de pellet op ijs aan de lucht drogen (span over de ijsbak Saran plastiekfolie)



Bewaar de pellet bij – 80°C.

H) Analyse  Analyse van de zuivering: via western blot met -CBP na SDS PAGE  Identificatie van interactoren: -

Scheiding van eiwitten op 4-12% NUPAGE

-

Visualisatie met Coomassie G250

-

Uitsnijden van de bandjes

-

Trypsine digest

-

MS: MALDI-TOF / MSMS

85

Deel 4: Resultaten en discussie

Deel 4. Resultaten en discussie 4.1. Optimalisatie van transgenexpressie door toevoeging van introns. Uit eerdere experimenten weet men dat de expressie van geTAP-tagged bait eiwit onder controle van diens natieve promotor veel lager ligt dan de expressie van het endogene eiwit. Het is echter van primair belang dat de accumulatie van het recombinante eiwit hoog is om in competitie te kunnen treden met het endogene eiwit en zodoende een zuivering te bekomen van een voldoende aantal complexen om de co-gezuiverde eiwitten te kunnen identificeren. Er worden bv. minder interactoren gedetecteerd bij de expressie van het CDKA;1-TAP construct onder controle van een endogene promotor in vergelijking met een constitutieve promotor. Om de expressie van het transgene eiwit onder controle van de endogene promotor te verhogen werden enkele strategieën uitgetest. Een eerste manier was het toevoegen van introns aan de coderende sequentie van de bait, dit zou de mRNA accumulatie kunnen stimuleren en ook de translationele opbrengst kunnen verhogen (zie paragraaf 1.4.).

4.1.1. Kloneringsstrategie 4.1.1.1. Oppikken van genen via PCR

BAC-isolatie Om onze genen met introns op te pikken werden BAC-klonen gebruikt (BAC = bacterial artificial chromosome). Arabidopsis thaliana bezit 5 chromosomen. Het volledige genoom van Arabidopsis thaliana werd in verschillende kleinere fragmenten gesplitst, vervolgens werd elk fragment gekloneerd in een BAC-plasmide. De BAC-klonen werden als template gebruikt om de volgende genen met introns op te pikken: CDKA;1 / CDKB1;1 / CKS;1 / CycD3;1. Eerst werd er dus BAC-plasmide bereid dat vervolgens als template in een adaptor-PCR reactie gebruikt werd: een overnacht cultuur werd ingezet van de BAC-klonen bij 37°C in LB+ medium met chloramphenicol (voor CDKA;1 en CDKB1;1) enerzijds en kanamycine (voor CKS;1 en CycD3;1) anderzijds. Vervolgens werd het BAC-DNA geïsoleerd.

86

Deel 4: Resultaten en discussie Adaptor-PCR: Primers voor het oppikken van onze genen met introns: De primers voor het oppikken van de genen werden geconstrueerd op basis van de sequentieinformatie over de genen, verkregen via de TAIR-homepage (http://www.arabidopsis.org/): de zoekoptie laat toe om het gen van interesse op te sporen, via sequenceviewer kan het gewenste genlocus in beeld gebracht worden. Voor de forward (fwd) primer werd de sequentie vanaf het ATG-startcodon tot een 20-tal nucleotiden stroomafwaarts genomen. De reverse (rev) primer bevat de 20 nucleotiden stroomopwaarts van het stopcodon. Afhankelijk van de finale gewenste TAP-fusie, N- of C- terminaal, werd het stopcodon opgenomen respectievelijk weggelaten. De primers eindigen op G of C nucleotiden omdat deze via 3 waterstofbruggen met hun complemente base gebonden zijn en dus stabieler dan T of A (enkel 2 waterstofbruggen), wat tot een hogere PCR-opbrengst kan leiden.

Specifieke sequenties van de primers voor het oppikken van de 4 genen :

CDKA;1 (chromosoom 3, locus: AT3G48750) Fwd primer: ATGGATCAGGTTGGTGTAAATAG Rev primer: AGGCATGCCTCCAAGATCCTTG

CDKB1;1 (chromosoom 3, locus: AT3G54180) Fwd primer: ATGGAGAAGTACGAGAAGCTAGAGAAGG Rev primer: GAACTGAGACTTGTCAAGGC

CKS;1 (chromosoom 2, locus: AT2G27960) Fwd primer: ATGGGTCAGATCCAGTACTCCG Rev primer: CTTAGCAATCTGAGCTTGGTGC

CycD3;1 (chromosoom 4, locus: AT4G34160) Fwd primer: ATGGCGATTCGGAAGGAGGAAGAAAG Rev primer: TGGAGTGGCTACGATTGCCCATGGC

87

Deel 4: Resultaten en discussie Aan de forward primers werd aan het 5’-uiteinde een attB1-sequentie toegevoegd en bij de reverse primers een attB2-sequentie. Zo werden de genen na adaptor-PCR, met de BAC-klonen als template, aan beide uiteinden verlengd met een att(achment)-sequentie (zie figuur 4.1). Deze att-sites laten homologe recombinatie toe met het plasmide pDonr221. Fig. 4.1: Oppikken van genen en

voorzien

van att-sites via adaptor-PCR M

1

2

3

4

5

6

7

8 M: 2 L Smartladder 1: 10 L PCR mix CDKA;1 zonder stop 2: 10 L PCR mix CDKA;1 met stop

1500 bp 1000 bp 800 bp 600 bp

3: 10 L PCR mix CDKB1;1 zonder stop 4: 10 L PCR mix CDKB1;1 met stop 5: 10 L PCR mix CKS;1 zonder stop 6: 10 L PCR mix CKS;1 met stop 7: 10 L PCR mix CycD3;1 zonder stop

Fig. 4.2: Analyse van adaptor-PCR via agarosegelelektroforese

8: 10 L PCR mix CycD3;1 met stop

De groottes van de opgepikte genen werden ook via de TAIR-website opgespoord: 

CDKA;1 is 2056 bp groot



CDKB1;1 is 1366 bp groot



CKS;1 is 650 bp groot



CycD3;1 is 1399 bp groot

Bij de controle op agarosegel (Figuur 4.2) ziet men bij CDKA;1 (met en zonder stopcodon) onderaan de geamplificeerde primers, wat wijst op het mislukken van de PCR-amplificatie. Eerst werd verondersteld dat er te weinig DNA uit de BAC-klonen was geïsoleerd, maar dit bleek een verkeerde assumptie te zijn. De andere genen werden wel opgepikt (zie Figuur 4.2) De adaptor-PCR werd herhaald, maar nu met genomisch DNA als template. Zo werd alsnog CDKA;1 (met en zonder stopcodon) opgepikt (Figuur 4.3). M

1

2 M: 2 L Smartladder 1: 10 L PCR mix CDKA;1

2000 bp

met stop 2: 10 L PCR mix CDKA;1 zonder stop

Fig. 4.3: Analyse van adaptor-PCR via agarosegelelektroforese

88

Deel 4: Resultaten en discussie 4.1.1.2. Constructie van Entry-vectoren De 4 opgepikte genen werden als volgt via een Gateway™ BP-recombinatie reactie gekloneerd in pDONR221 met productie van de entry-klonen als gevolg.:

Productie van pDONR 221 : E. coli DB3.1 pDONR221 werd overnacht opgegroeid in LB+ met kanamycine (Km) voor Nucleobond Midi AX100 plasmidebereiding (zie paragraaf 3.4.3.1.). De volgende dag werden de cellen geoogst via centrifugatie en werd het plasmide-DNA hieruit bereid. 

De optische densiteit van het plasmide-DNA werd bepaald met een Beckman fotospectrometer bij 260 nm: [DNA] = 50 g/mL x gemeten OD260

De BP-recombinatie reactie: Tijdens de BP-recombinatie reactie (zie paragraaf 3.4.7.1.). is het belangrijk om het PCRproduct en de donor-vector in equimolaire hoeveelheden toe te voegen. Standaard werd 100 fmol gebruikt. 

Van femtomol naar nanogram: 1 ng DNA = (x fmol)(N)(660 fg /fmol) (1 ng/106 fg) waarbij N de lengte van het DNA voorstelt. Bv. CDKA1;1 = 2056 bp + lengte van de 2 att-sites (= 2 x 25bp) = 2106 bp. 100 fmol x 2106 bp x 660/106 = 140 ng (dezelfde berekening voeren we ook uit met de andere genen)





[pDONR 221] = 290 ng/l lengte van pDONR 221 = 4759 bp Dus 100 fmol x 4759 bp x 660/106 = 314 ng



100 fmol  314 ng/290 ng/l  1,1l

Vervolgens werd via Nanodrop de concentratie van ons PCR-product bepaald. Bv. CDKA1;1 zonder stopcodon: 100 fmol CDKA;1 = 140 ng Via Nanodrop : [CDKA;1] = 346,47 ng/l



140 ng / 346,47 ng/l = 0,4 l

Bij de BP-recombinatie reactie werd dus 1,1 l pDONR 221 gebruikt en 0,4 l CDKA;1 (zonder stop)

89

Deel 4: Resultaten en discussie De BP-recombinatie reactie werd overnacht uitgevoerd bij 25°C. Er nam dus een recombinatie reactie plaats tussen de attB-sites van onze genen (het PCR-product) en de attP-sites van pDONR221 (Figuur 4.4). Dit resulteert in een pEntry-plasmide met attL-sites. Vervolgens werd de BP-recombinatie reactie, en dus de gevormde pEntry-plasmiden met de genen naar E. coli DH5 getransformeerd via heatshock. Getransformeerde cellen werden geselecteerd op LB+ Km50 platen. Met behulp van het software programma VectorNTI10 (Invitrogen) werden in parallel de pEntry-plasmiden in silico bekomen na BPrecombinatie reactie (Figuren 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 ). Hierop werd vervolgens een restrictiekaart gevisualiseerd. Deze analyse liet ons toe om transformanten te controleren via restrictiedigest (zie Fig. 4.4: Via BP recombinatie reactie wordt het “control of celldeath” CcdB gen vervangen door het gen van interesse.

paragraaf 3.4.5.), na een mini plasmidebereiding.

Controle restrictiedigest:

Fig. 4.5: pEntry L1L2-CDKA;1-Intron I

Voor “pEntryL1L2-CDKA;1 intron (met en zonder stop)“ werden de restrictie-enzymen BamHI en HindIII (Promega) gekozen omdat ze beide 100% activiteit vertonen in buffer E (Promega). De verwachte fragmenten zijn 3298 bp en 1305 bp groot (Figuur 4.5).

90

Deel 4: Resultaten en discussie attL2 T7 promoter EcoRV (103) T7 primer M13 reverse primer

C D KB 1;1 intron

K an(R )

pEntry L1L2-CDKB1;1 intron

3916 bp XhoI (2645)

attL1 M13 (-20) forward primer M13 (-40) forward primer

Fig. 4.6: pEntry L1L2-CDKB1;1Intron

Voor “pEntryL1L2-CDKB1;1 intron (met en zonder stop)“ werden de restrictie enzymen XhoI en EcoRV (Promega) gekozen omdat ze beide goede activiteit vertonen in buffer D (Promega). De verwachte fragmenten zijn 2540 bp en 1373 bp groot (figuur 4.6).

Fig. 4.7: pEntry L1L2-CKS1Intron

Voor “pEntry L1L2-CKS1 intron (met en zonder stop)“ werden de restrictie enzymen SacII en XmnI (Promega) gekozen omdat ze beide goede activiteit vertonen in buffer C (Promega). De verwachte fragmenten zijn 499 bp en 2686 bp groot (Figuur 4.7).

91

Deel 4: Resultaten en discussie

Fig. 4.8: pEntry L1L2-CycD3;1-Intron

Voor “pEntry L1L2-CycD3;1 intron (met en zonder stop)“ werden de restrictie enzymen XbaI en EcoRV (Promega) gekozen omdat ze beide goede activiteit vertonen in buffer C (Promega). De verwachte fragmenten zijn 1053 bp en 2893 bp groot (figuur 4.8). Na restrictiedigestie werd het restrictie reactiemengsel geladen op agarosegel om te zien of men de verwachte fragmenten bekwam (Figuren 4.9, 4.10, 4.11). M

1

3

2

4

5

6

7

8

9

10

M: 2 L Smartladder 1: 20 L CDKA;1_intron zonder stop

6000 bp 4000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp

2: 20 L CDKA;1_intron zonder stop

1000 bp

5: 20 L CDKA;1_intron met stop

3: 20 L CDKA;1_intron zonder stop 4: 20 L CDKA;1_intron zonder stop

6: 20 L CDKA;1_intron met stop 7: 20 L CDKA;1_intron met stop 8: 20 L CDKA;1_intron met stop 9: 20 L CDKB1;1_intron zonder stop

Fig. 4.9: Analyse van de restrictiedigest van de entry-klonen via agarosegelelektroforese.

M

1

2

3

4

5

6

7

8

10: 20 L CDKB1;1_intron zonder stop

9

10

M

M: 2 L Smartladder 1: 20 L CDKB1;1_intron met stop 4000 bp 2500 bp

2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp

2: 20 L CDKB1;1_intron met stop 3: 20 L CDKB1;1_intron met stop 4: 20 L CDKB1;1_intron met stop

600 bp 400 bp 200 bp

Fig. 4.10: Analyse van de restrictiedigest van de entry-klonen via agarosegelelektroforese.

5: 20 L CKS 1_intron zonder stop 6: 20 L CKS 1_intron zonder stop 7: 20 L CKS 1_intron zonder stop 8: 20 L CKS 1_intron zonder stop 9: 20 L CKS 1_intron met stop 10: 20 L CKS 1_intron met stop

92

Deel 4: Resultaten en discussie M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

M: 2 L Smartladder 1: 20 L CKS 1_intron met stop 2: 20 L CKS 1_intron met stop 3: 20 L CycD3;1_intron zonder stop

2500 bp

4: 20 L CycD3;1_intron zonder stop 1000 bp

5: 20 L CycD3;1_intron zonder stop

600 bp 400 bp

6: 20 L CycD3;1_intron zonder stop 7: 20 L CycD3;1_intron met stop 8: 20 L CycD3;1_intron met stop

Fig. 4.11: Analyse van de restrictiedigest van de entry-klonen via agarosegelelektroforese

9: 20 L CycD3;1_intron met stop 10: 20 L CycD3;1_intron met stop

Kloon 1 t.e.m. 4 en kloon 7 werden gesequeneerd (Figuur 4.9). Kloon 2 t.e.m 9 van figuur 4.10 werden ook gesequeneerd en tenslotte werden uit figuur 4.11 alle klonen gesequeneerd. Andere kolonies van CDKB1;1_intron zonder stop en CDKA;1_intron met stop werden opgegroeid voor een mini DNA plasmidebereiding (zie paragraaf 3.4.3.2.) en hierop werd opnieuw een restrictiedigest op uitgevoerd en daarna op agarose gel gebracht. M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 M: 2 L Smartladder Laan 1 t.e.m 10 bevat 20 L CDKA;1_intron met stop

800 bp 400 bp 200 bp

Fig. 4.12: Analyse van de restrictiedigest van de entry-klonen met CDKA;1_intron met stop via agarosegelelektroforese . M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M: 2 L Smartladder 3000 bp 2000 bp 1500 bp

Laan 1 t.e.m 10 bevat 20 L CDKB1;1_intron zonder stop

Fig. 4.13: Analyse van de restrictiedigest van de entry-klonen met CDKB1;1_intron zonder stop via agarosegelelektroforese

Klonen die het voorspelde bandenpatroon gaven werden gesequeneerd. Van figuur 4.12 (CDKA;1_intron met stop) werden klonen 2 en 7 gesequeneerd en van figuur 4.13 (CDKB1;1_intron zonder stop) werden klonen 3, 6, 7 en 8 gesequeneerd. De resulterende sequenties werden gealigneerd met de voorspelde gensequenties van de TAIR-webstek via

93

Deel 4: Resultaten en discussie Bio-edit. Met behulp van een chromatogram van de sequentiebepaling werden in Finch TV de mogelijke mutaties onderzocht. Er werd verder gewerkt met klonen die geen of enkel ‘silent mutations’ tot gevolg hadden. Dat waren de entry-klonen met CDKA;1_intron zonder stop (kloon 1, fig. 4.9), CDKA;1_intron met stop (kloon 7, fig 4.9) CKS1_intron zonder stop (kloon 5, fig. 4.10), CKS1_intron met stop (kloon 1, fig 11), Cyc D3;1_intron zonder stop (kloon 4, fig. 4.11), Cyc D3;1_intron met stop (kloon 9, fig 11) en CDKB1;1_intron met stop (kloon 3, fig. 4.10). Deze werden opgegroeid in LB+ met kanamycine voor een Nucleobond Midi AX100 DNA plasmidebereiding. Daarna werd de DNA-concentratie bepaald met een fotospectrometer (Nanodrop) bij 260 nm.

4.1.1.3. Constructie van TAP-expressievectoren met introns

De LR-recombinatie reactie: De opgepikte genen met introns werden vervolgens via multisite LR-reactie (zie paragraaf 3.4.7.2.) gerecombineerd met een destination-vector, om zo een expressievector te maken die het gen van interesse gefuseerd aan de TAP-tag bevat onder controle van de endogene promotor. Er werd dus een LR-recombinatie reactie uitgevoerd met drie entry-vectoren en 1 destination-vector, waarvan de pEntryL1L2-gen_intron (CDKA;1 / CDKB1;1 / CKS1 / CycD3;1) zelf gemaakt werden (Figuur 4.14). De entry-plasmiden pEntryL4R1-Pend (promotor), pEntryR2L3-TAP-tag en de destination-vector pKCTAP waren reeds voorhanden. De reactie werd uitgevoerd in LRplus buffer m.b.v. LRplus clonase.

Voor de uitvoering van de reactie werd eerst bepaald hoeveel pEntryL 1 L2-gen_intron vector aan de reactie toegevoegd moet worden, rekening houdend met het feit dat de 3 entryvectoren en de destination-vector opnieuw in equimolaire hoeveelheden (20 fmol) toegevoegd moeten worden: Bv. voor pEntryL1L2-CycD3;1_intron zonder stop: Van femtomol om naar nanogram (zie formule paragraaf 4.1.1.2.) : 20 fmol x 3946 bp x 660/106 = 52 ng Concentratiebepaling van de midiprep gaf: 74,3 ng/L



52 ng / 74,3 ng/L = 0,7L

Dus er werd voor de LR-recombinatie reactie 0,7L pEntryL1L2-CycD3;1_intron zonder stop (52 ng) gebruikt. De berekening werd ook voor de andere plasmiden uitgevoerd.

94

Deel 4: Resultaten en discussie

Fig. 4.14: Een overzicht van het 3 fragment LR recombinatie reactie gebruikt voor de constructie van de C-terminale TAPexpressievectoren.

De LR-reactie mix werd vervolgens getransformeerd naar E. coli DH5 en uitgeplaat op spectinomycine (Sp) bij 37°C overnacht. Voor de multisite-reacties met de genen CKS1_intron en CycD3;1_intron konden na meerdere herhalingen geen kolonies (de LRreactie is hier dus niet gelukt) bekomen worden, voor CDKB1;1_intron en CDKA;1_intron wel. Meestal kunnen er na transformatie van een LR-reactie slechts een aantal (1-50) kolonies bekomen worden, er werd hier dus op de grens gewerkt. Na de nodige optimalisaties, zoals meer zuivere DNA-bereidingen bv., zou het wel mogelijk moeten zijn om ook voor CKS1 en CycD3;1 met introns expressievectoren te maken, maar door tijdsgebrek werd dit niet meer gedaan. De kolonies uit de LR-reactie werden opgegroeid voor miniprep DNA plasmidebereiding, en werden gecontroleerd via restrictiedigest-analyse.

95

Deel 4: Resultaten en discussie Controle restrictiedigest van de LR-reactie: Voor de expressievector met het construct pKCTAP-Pend::CDKA;1_intron-TAP werd een restrictiedigest met HindIII uitgevoerd. Deze digest gaf aanleiding tot 4 fragmenten, nl. 1457 bp, 1629 bp, 2290 bp en 9629 bp (Figuur 4.16). De

expressievector

met

het

construct

pKCTAP-Pend::CDKB1;1_intron-TAP

werd

gedigereerd met EcoRI. Drie fragmenten werden verwacht, nl. 855 bp, 2048 bp en 9708 bp en terug gevonden (Figuur 4.16). M

1

2

M: 2 µL smartladder 10.000 8000 2500 2000 1500 1000 800

bp bp bp bp bp bp bp

1: pKCTAP-Pend::CDKA;1intron-TAP 2: pKCTAP-Pend::CDKB1;1intron-TAP

Fig. 4.16: Het restrictiedigest mengsel (20 L DNA per kloon) werd geanalyseerd via agarosegelelektroforese.

De kolonies uit de LR reactie werden opgegroeid voor midiprep DNA plasmidebereiding in LB+ medium met spectinomycine, waarna de concentratie bepaald werd.

4.1.2. Transformatie naar PSB-d celsuspensie cultuur 4.1.2.1. Transformatie naar Agrobacterium tumefaciens

De expressievectoren werden eerst getransformeerd in Agrobacterium tumefaciens C58C1 RifR pMP90 via elektroporatie (zie paragraaf 3.5.2.). Er werd 1 g van de beide expressievectoren getransformeerd en er werd geselecteerd op YEB-platen met rifampicine, gentamycine en spectinomycine.

4.1.2.2. Transformatie naar PSB-d Het TAP-construct zit tussen twee T-DNA ‘borders’ op de expressievector. Deze ‘borders’ bepalen welk DNA er getransformeerd wordt naar de plantencellen. De andere functies nodig voor transfer van T-DNA naar het genomisch DNA van de plantencel worden voorzien door het pMP90 plasmide in de Agrobacterium-stam. Transformatie van de plantencellen gebeurde

96

Deel 4: Resultaten en discussie door co-cultivatie van de Agrobacterium cellen met 2 dagen oude PSB-d Arabidopsis thaliana cellen in aanwezigheid van acetosyringone. Na twee dagen van co-cultivatie werden de Agro’s weggewassen met MSMO-medium met agro-afdodende antibiotica, alvorens het cocultivaat uit te platen op selectief en agro-afdodend medium (zie paragraaf 3.5.3.). Na 2 weken werden getransformeerde cellen m.b.v. de Leica MZ16F fluorescentie microscoop (met een Zeiss Axiocam werd gefotografeerd) gecontroleerd op GFP-aanwezigheid, wat wijst op een stabiele integratie van het T-DNA in de cel. Voor beide constructen werd transgeen callus gevonden (Figuren 4.17 en 4.18).

Fig. 4.17 : GFP-analyse van plantencellen met T-DNA met de GFP cassette en het Pend::CDKAintron-TAP construct.

Fig. 4.18: GFP-analyse van een callus van plantencellen met het Pend::CDKBintron-TAP construct

GFP-expresserende calli werden opgepikt en op een verse selectieve plaat gebracht als backup. Met de rest van de cellen werden cellijnen gestart in 30 mL MSMO met vancomycine (Vm), carbenicilline (Cb) (deze doden bacteriën) en kanamycine(Km) (doodt de niet-

97

Deel 4: Resultaten en discussie getransformeerde plantencellen). De cellen werden opgegroeid in erlenmeyers en het medium werd wekelijks ververst (43 ml MSMO met Km + 7 ml celcultuur).

4.1.3. Expressie analyse De plantencellen werden geoogst door filtratie van een 2 dagen oude cultuur op een glasfilter en ingevroren bij -80oC. Uit de geoogste cellen werd eiwitextract bereid (zie paragraaf 3.6.1.), en daarna werd via Bradford de eiwitconcentratie bepaald (zie paragraaf 3.6.1.1.). Dit werd per construct in duplo uitgevoerd en uit de twee bekomen waarden werd het gemiddelde berekend. Met BSA werd een ijklijn opgesteld die de hoeveelheid eiwit uitdrukt in g / l en die toelaat de concentratie van eiwitextracten nauwkeurig te bepalen. Bij 100 l eiwitextract werd 25 l (5x) sample buffer aan de eiwitten toegevoegd, dit gaf een totaalvolume van 125 l met 1x sample buffer. Via SDS-PAGE (zie paragraaf 3.6.2.) werden de eiwitten vervolgens gescheiden volgens grootte. Er werd telkens 60 g eiwit per laantje geladen.

Berekening: bv. voor het construct Pcdkb1;1::CDKB1;1intron-TAP mix2 Eiwitconcentratie: 10,9 g / l Men laadt:

60 g eiwit



(60 g / 10,9 g / l) x 1,25 = 6,8 l laden

Na SDS-PAGE werden de eiwitten getransfereerd op een PVDF-membraan via ‘wet Western blotting’ (zie paragraaf 3.6.3.), en vervolgens werden de eiwitten gedetecteerd via immunodetectie (ECL) (zie paragraaf 3.6.4.1.). Als primair antilichaam (AL) werd in eerste instantie anti-CBP (rabbit, 1/1000) gebruikt. Dit AL bindt het calmoduline binding peptide van de TAP-tag. Hierna werd het secundair AL, anti-rabbit geconjugeerd met Horse Radish Peroxidase (HRP, 1/10.000), toegevoegd. Het secundaire AL bindt op het primaire AL. Op deze manier werd het geTAP-tagged eiwit gevisualiseerd. Naast de eiwitextracten van de transgene lijnen met het TAP-construct met introns, werd ook extract geladen van de lijnen met het TAP-construct met enkel de coderende sequentie zonder de introns (cDNA). Als negatieve controle werd een wild type eiwitextract geladen (Figuur 4.19).

98

Deel 4: Resultaten en discussie CDKA WT

- intron

CDKA

CDKA

CDKA

+ intron

+ intron

+ intron

CDKB - intron

CDKB

CDKB

CDKB

+ intron

+ intron

+ intron

75 kDa

50 kDa 37 kDa

3 onafhankelijke lijnen

3 onafhankelijke lijnen

Fig. 4.19: Analyse van transgene expressie via Western blot in transgene culturen getransformeerd met CDKA;1 (met en zonder intron) en CDKB1;1 (met en zonder intron) Negatieve controle: Wild type (WT). In elke laan werd 60g eiwit gescheiden.

De grootte van CDKA;1 is 34 kDa, die van de TAP-tag is 20 kDa, dus verwacht men een bandje bij 54 kDa voor het transgene eiwit. In het laantje met de negatieve controle (WT) is er geen bandje ter hoogte van 54 kDA, maar in de lanen 2 t.e.m 5 wel, dus hier vindt men zoals verwacht CDKA;1-TAP (rode pijl) terug. Er is geen verschil in intensiteit tussen CDKA;1TAP en CDKA;1_intron-TAP (Figuur 4.19). De grootte van CDKB1;1 is 35,3 kDa, dus die van het transgene eiwit is 55,3 kDa. Na vergelijking met het wild type extract ziet men dat het CDKB1;1-TAP (blauwe pijl) met en zonder de introns slechts zeer laag tot expressie komt onder controle van de endogene promotor. Ook hier geen detecteerbaar verschil tussen de constructen met en zonder intron (Figuur 4.19). Om ook een vergelijking te kunnen doen met het endogene CDKA;1, werd bij de volgende expressie-analyse rabbit anti-cdc2a ((1/1000) bindt op CDKA;1) als primair AL en anti-rabbit HRP (1/10.000) als secundair AL gebruikt. Dit laat dus detectie toe van zowel het endogene als het geTAP-tagged CDKA;1. 1

50 kDa

2

3

4

5

1: Pcdka1:CDKA-gs-TAP 2: Pcdka1:CDKA-Intron-TAP

37 kDa

3: Pcdka1:CDKA-Intron-TAP 4: Pcdka1:CDKA-Intron-TAP 5: Negatieve controle: Wild type

25 kDa

Fig. 4.20: Analyse van transgenexpressie via Western blot in transgene culturen getransformeerd met CDKA (met en zonder intron). Van alle extracten werd 60g eiwit geladen.

99

Deel 4: Resultaten en discussie Er is in alle lanen een duidelijke band rond 34 kDa van het endogene CDKA;1. Het geTAPtagged CDKA;1 wordt in alle lanen teruggevonden op de verwachte grootte van 54 kDa (laan1-4) en is afwezig in de negatieve controle (laan 5). Ook met het antilichaam tegen CDKA;1 is het duidelijk dat toevoeging van de endogene introns niet leidt tot een verhoging in eiwit-accumulatie. Wanneer we het niveau van het fusie-eiwit vergelijken met het endogene CDKA;1 niveau, zien we dus duidelijk dat het endogene niveau van expressie niet bereikt kan worden (Figuur 4.20). Om in competitie te treden met het endogene eiwit voor opname in een eiwitcomplex is dit echter essentieel. Want hoe hoger de expressie van het geTAP-tagged eiwit, hoe groter de competitie met het endogene eiwit en hoe meer eiwitcomplexen er bijgevolg gezuiverd kunnen worden. Overexpressie biedt hier een oplossing, maar wordt liefst vermeden, daar dit leidt tot een artificiële situatie, waarin het moeilijker is om gedetecteerde eiwitinteracties te evalueren. Zo is het moeilijk om een onderscheid te maken tussen bona fide interacties en interacties als gevolg van de overexpressie. Ook voor CDKB1;1 werd de expressie-analyse herhaald met anti-cdc2b ((1/2500) bindt op CDKB1;1) als primair AL en anti-rabbit HRP(1/10.000) als secundair AL. 1

2

3

4

5

1: Negatieve controle: Wild type, hiervan werd 10 l geladen = 60g eiwit

50 kDa

2: Pcdkb::CDKB1;1-TAP

37 kDa

3: Pcdkb::CDKB1;1intron-TAP 4: Pcdkb::CDKB1;1intron-TAP 25 kDa

5: Pcdkb::CDKB1;1intron-TAP Fig. 4.21: Analyse van transgenexpressie via Western blot in transgene culturen getransformeerd met CDKB1;1 (met en zonder intron). Van alle extracten werd 60g eiwit geladen

Ook nu was er geen verschil in eiwit-accumulatie (met of zonder introns) merkbaar (Figuur 4.21).

Onder controle van de constitutieve promotor CaMV 35S en in de afwezigheid van introns blijken beide eiwitten echter hoger te accumuleren dan de endogene eiwitten. Men zou hieruit kunnen afleiden dat de gebruikte regulatorische sequenties met introns niet alle cisregulatorische sequenties bevatten die de endogene genen wel hebben. Als endogene promotor werd voor CDKA;1 1662 basen en voor CDKB1;1 494 basen stroomopwaarts van 100

Deel 4: Resultaten en discussie het startcodon gekozen. Enhancer sequenties bevinden zich echter dikwijls enkele kilobasen stroomop- of stroomafwaarts en zijn dus niet opgenomen in ons construct. Een andere mogelijke verklaring is dat het verschil in accumulatie tussen endogeen CDK en recombinant CDK-tag gelegen is aan een verschil in gendosage tussen het endogene gen (8C = 8 kopijen) en het transgen, en dat het toevoegen van introns geen verschil maakt in transgenexpressie. Er moet ook rekening gehouden worden met het feit dat ‘intron mediated enhancement’(zie paragraaf 1.4.) naar alle waarschijnlijkheid een genafhankelijk proces is. Onze observaties bij CDKA;1intron-TAP en CDKB1;1intron-TAP gelden niet per sé voor alle andere genen in Arabidopsis.

101

Deel 4: Resultaten en discussie 4.2. Silencing d.m.v. RNAi Een tweede manier om een hogere verhouding van transgene expressie/endogene expressie te bekomen is het specifiek silencen van de endogene expressie van het eiwit in kwestie d.m.v. RNA-geïnduceerde gene silencing (dit zorgt enkel voor een ‘knock-down’ en niet voor een ‘knock-out’). We hebben deze methode getest op CDKA;1 via transformatie met een RNAiconstruct gericht tegen het 3’UTR (untranslated region) van het endogene gen. Het transgen dat codeert voor het CDKA;1-TAP bevat immers een andere 3’UTR (de 35S transcriptie terminator), waardoor de onderdrukking van genexpressie specifiek gericht kan zijn tegen endogeen CDKA;1. Twee RNAi-hairpinconstructen werden gemaakt met het 3’UTR (sense en anti-sense) van CDKA;1 en supergetransformeerd in transgene celculturen die CDKA;1TAP tot expressie brengen onder controle van de endogene CDKA;1-promoter en onder controle van de constitutieve 35S promotor.

4.2.1. Kloneringsstrategie 4.2.1.1. Adaptor-PCR Via adaptor-PCR met attB bevattende primers werd het 3’UTR van CDKA;1 opgepikt. Als template werd genomisch DNA (10ng en 50ng) genomen. Naast het sense 3’UTR werd eveneens het antisense 3’UTR opgepikt. Op agarosegel werden alle fragmenten teruggevonden (Figuren 4.22 en 4.23). M

1

2

M: Smartladder 1: 1 l (10 ng) genomisch DNA gebruikt. 2: 5 l (50 ng) genomisch DNA gebruikt 600 bp 600 bp

400 bp

400 bp

200 bp

Fig. 4.22: Analyse van de adaptor-PCR

Fig. 4.23: Aanalyse van de adaptor-PCR

(attB1-3’UTR-sense-CDKA;1-attB2)

(attB1-3’UTR-antisense-CDKA;1-attB2)

via

agarosegelelektroforese. Er werd telkens 18

via agarosegelelektroforese.

l PCR product met 2 l ladingsbuffer geladen. .

102

Deel 4: Resultaten en discussie 4.2.1.2. BP-recombinatie reactie Er werd een BP-recombinatie reactie uitgevoerd tussen het PCR-product attB1-3’UTR senseCDKA;1- attB2 en de pDonr207 vector (met gentamycine resistentiegen) met vorming van een entry vector, pEntryL1L2-3’UTR sense-CDKA;1.

PCR produkt AttB1

3’ UTR

AttB 2

AttL1

3’ UTR

AttL1

BP ccdB gen

AttP1

AttP2

pDonr 207

pEntryL1 L2 -3’ UTR sense--CDKA;1 sense

Reactie

Gm

Gm Gm

De gevormde Entry-vectoren (Figuur 4.24) werden vervolgens getransformeerd naar E. coli DH5 en uitgeplaat op LB+ met gentamycine (Gm). Miniprep plasmide DNA bereidingen werden uitgevoerd op 10 kolonies en deze werden getest via een controle restrictiedigest met HindIII en EcoRV. De verwachte fragmenten van 1077 bp en 2640 bp werden teruggevonden (Figuur 4.25). Hin dIII (3536)

a ttL2

3'UTR CDKA;1

a ttL1

pEntry 3`UTR CDKA;1 (sense)

3718 bp

Eco RV (896)

Gm (R)

Fig. 4.24 : pEntryL1L2-3’UTR senseCDKA;1 P c prom ote r

103

Deel 4: Resultaten en discussie M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

M

3000 bp 1000 bp

Fig. 4.25: Analyse van het restrictiemengsel op agarosegel Het restrictiemengsel (20 l + 2 l ladingsbuffer) werd op gel geladen en alle 10 kolonies hebben de juiste grootte. M: 2 l Smartladder

De 10 klonen werden vervolgens verder gecontroleerd via sequenering. Kloon 6 bevatte geen mutaties en werd gebruikt om mee verder te werken. Van deze kloon werd een midiprep plasmide DNA bereiding gedaan en de DNA concentratie werd bepaald. Voor het antisense-construct werd dezelfde werkwijze gehanteerd met een positief resultaat als gevolg (resultaten niet weergegeven).

4.2.1.3. LR-recombinatie reactie Via een dubbele LR-recombinatie reactie tussen pEntryL1L2-3’UTR sense-CDKA;1 en pAgrikola werd het expressieplasmide pAgrikola_3’UTR sense-CDKA;1 geconstrueerd (Figuur 4.29).

3’UTR

ccdB

PCR product

Gateway BP cloning

ccdB entry clone

ccdB

+ intron

ccdB

promoter

ter

35S or inducible

Gateway

double

LR cloning

intron

hpRNA vector

unspliced

spliced

predicted hpRNA structure

Fig. 4.29: Een overzicht van de gevolgde LR kloneringsstrategie.

104

Deel 4: Resultaten en discussie Na transformatie van de LR-reactie naar E. coli DH5α werd er geselecteerd op LB+ Km en van 5 kolonies werd via een miniprep plasmide DNA bereid. Expressievectoren werden gecontroleerd via een restrictiedigest. Er werd geknipt met HindIII, de verwachte fragmenten waren 6712 bp, 209 bp, 205 bp, 1015 bp en 1606 bp groot, deze werden teruggevonden bij analyse op agarosegel (Figuur 4.26).

M

1

2

3

4

5

Fig. 4.26: Controle restrictiedigest op agarose gel 6000 bp

gebracht.

1500 bp 1000 bp

400 bp 200 bp

Van kloon1 werd plasmide DNA bereid via een midi prep.

Ook de Entry-vector met het antisense construct werd op een gelijkaardige manier gebruikt in een dubbele LR-recombinatie reactie om de expressievector pAgrikola_3’UTRantisenseCDKA;1 te construeren. Deze werd gecontroleerd via een restrictiedigest. Er werd geknipt met HindIII. De verwachte fragmenten van 6712 bp, 209 bp, 205 bp, 1015 bp en 1606 bp groot, werden teruggevonden. Klonen 1 tot en met 7 bevatten de verwachte fragmenten, kloon 8 niet (Figuur 4.27). M

1

2

3

4

5

6

7

8

Fig. 4.27: Controle restrictiedigest op agarose gel gebracht. 6000 bp 1500 bp 1000 bp

200 bp

105

Deel 4: Resultaten en discussie 4.2.2. Supertransformatie naar transgene CDKA;1-TAP lijnen 4.2.2.1. Transformatie naar Agrobacterium tumefaciens

Via elektroporatie werden beide expressievectoren getransformeerd naar Agrobacterium tumefaciens C58C1 RifR pMP90.

4.2.2.2. Supertransformatie De agrobacteria met constructen pAgrikola_3’UTRsense-CDKA;1 en pAgrikola_3’UTR antisense-CDKA;1 werden via co-cultivatie gemengd met enerzijds een transgene lijn die het CDKA;1-TAP tot overexpressie brengt en anderzijds een transgene lijn waar het CDKA;1TAP onder controle staat van de endogene promotor. Na de co-cultivatie werd de mix direct in cultuur gebracht zonder wegwassen van de agro’s en zonder uitplaten. Naast de agro-afdodende antibiotica Cb en Vm, werd voor selectie van supertransformanten enerzijds Km (voor selectie van het TAP-construct) en Basta (voor selectie van het hairpin RNAi-construct) gebruikt en anderzijds enkel Basta. Het gebruik van 4 antibiotica gaf een te hoge selectieve druk en met deze strategie konden geen transgene culturen bekomen worden. Dit lukte wel met enkel de Basta-selectie, voor supertransformatie in de transgene lijn met de endogene promotor althans. Met de transgene lijn die het TAPconstruct tot overexpressie brengt, konden geen supertransformanten bekomen worden. Celmateriaal van de Pend::CDKA;1-TAP X pAgrikola-3’UTR_CDKA;1 transgene lijnen met het sense en antisens 3’UTR werden geoogst en bewaard bij -80oC voor verdere expressieanalyse.

106

Deel 4: Resultaten en discussie 4.2.3. Expressie analyse Van het ingevroren celmateriaal werd een eiwitextract gemaakt en 60 µg werd geanalyseerd via SDS-PAGE en western blotting. Als controle werd een gelijke hoeveelheid wild type extract en Pend::CDKA;1(intron)-TAP extract op gel geladen. De Western blot werd geïncubeerd met -cdc2a (primair AL, 1/2500) en -rabbit HRP (secundair AL, 1/10.000), hierdoor werden het endogene en transgene CDKA;1 zichtbaar. 1

2

3

4

5

75 50

CDKA;1-TAP

37 endogeen CDKA;1 25

Fig. 4.28:

Analyse van transgenexpressie via Western blot in transgene culturen Pend::CDKA;1-TAP

supergetransformeerd met pAgrikola-3’UTR_CDKA;1 (sense en antisens 3’UTR). 1. Wild type (60 µg) 2. PA::CDKA;1-TAP (60 µg) 3. PA::CDKA;1intron-TAP (60 µg) 4. PA::CDKA;1-TAP + pAgrikola-3’UTRcdka;1 sense (60 µg) 5. PA::CDKA;1-TAP + pAgrikola-3’UTRcdka;1 anti-sense (60 µg)

Na immunodetectie met een polyklonaal antilichaam dat CDKA;1 herkent, werd duidelijk dat er een significante daling was in de endogene CDKA;1-niveaus met het silencing-construct (Figuur 4.28, laan 4 en 5). Er werd eerst gevreesd dat het transgene CDKA;1 ook ‘down’ gereguleerd zou zijn door een mechanisme van transitieve silencing, daar zowel het hairpinconstruct als het TAP-construct att-sites bevatten. Door vergelijking van de CDKA;1-TAP band, zien we dat dit fenomeen niet opgetreden is. De lagere intensiteit van het endogene CDKA;1 signaal in laan 4 en 5, is niet te wijten aan verschillende hoeveelheden geladen eiwit, daar de cross-reactie banden rond 75 kDa, een gelijkaardige intensiteit hebben (Figuur 4.28).

107

Deel 4: Resultaten en discussie Om deze ‘knock down’ van endogeen CDKA;1 in een celsuspensiecultuur verder te bevestigen, werd de analyse herhaald, maar nu met verschillende verdunningen van de stalen (60 µg, 30 µg, 15 µg en 7.5 µg). 1

2

3

4

5

6

7

8

75 50

CDKA;1-TAP

37 endogeen CDKA;1 25

Gereduceerde endogene CDKA;1 niveau’s Fig. 4.29: Analyse van transgenexpressie via Western blot in transgene culturen Pend::CDKA;1TAP supergetransformeerd met pAgrikola-3’UTR_CDKA;1 (sense en antisens 3’UTR). 1: PSB-d, wild type cellen (15 µg ) 2: PSB-d, wild type cellen (7,5 µg) 3: pA:CDKA;1-TAP (15 µg) 4: pA:CDKA;1-TAP (7,5 µg) 5: pAgrikola_3’UTR sense-CDKA;1 (15 µg) 6: pAgrikola_3’UTR sense-CDKA;1 (7,5 µg) 7: pAgrikola_3’UTR anti-sense-CDKA;1 (15 µg) 8: pAgrikola_3’UTR anti-sense-CDKA;1 (7,5 µg)

De immunoblot met de 2 laagste verdunningen bevestigt duidelijk het vorige resultaat. Het endogene CDKA;1 accumuleert veel lager in de lijnen met het hairpin-construct. Daar CDKA;1 een essentieel eiwit is, is het logisch dat er toch een minimaal basaal niveau van CDKA;1 behouden blijft, opdat de cellen zouden kunnen blijven delen. De niveaus van het transgene CDKA;1 zijn waarschijnlijk te laag om volledig de functie van het endogene CDKA;1 over te nemen (Figuur 4.29). Er is geen verschil waarneembaar in silencing efficiëntie wanneer het sense-constuct vergeleken wordt met het antisense-construct. Daar het sense 3’UTR signalen bevat voor RNA-processing zoals een poly-adenylatie signaal, werd gevreesd dat het hairpin RNA reeds geprocessed zou zijn voordat de hairpin gevormd zou zijn. Aangezien er met het senseconstruct echter ook silencing optreedt, was deze vrees echter ongegrond.

108

Deel 4: Resultaten en discussie Deze 2 culturen zullen verder opgeschaald worden, zodat er voldoende materiaal voor handen is voor een TAP-zuivering en een vergelijking met een TAP-zuivering op de oorspronkelijke cultuur zonder RNAi-construct. Door de verlaagde endogene CDKA;1 niveaus, kan er nu meer competitie zijn tussen het endogene en het transgene eiwit voor inbouw in een eiwitcomplex, met als gevolg dat meer complexen gezuiverd kunnen worden. Een interessant toekomstperspectief is het creëren van een nieuwe expressievector die zowel het RNAi-construct als het TAP-construct bevat binnen hetzelfde T-DNA.

109

Deel 4: Resultaten en discussie 4.3. C-terminale versus N-terminale tagging Soms zal de toevoeging van een C-terminale tag aan een eiwit diens functie verhinderen of de inbouw in complexen onmogelijk maken of significant verminderen. Een simpel alternatief is het toevoegen van de tag aan de amino-terminus van het doelwitproteïne. Toevoeging van een tag kan ertoe leiden dat sommige domeinen gemaskeerd worden en bijgevolg kan dit leiden tot het uitblijven van bepaalde eiwit-interacties. Het is dus mogelijk dat er verschillende interactoren opgepikt zijn als N-terminale versus C-terminale TAP-tagging vergeleken wordt. In deze thesis werden er voor CDKA;1, CDKB1;1, CKS1 en CycD3;1 N-terminale TAPconstructen gemaakt. Voor de C-terminale tag-fusies werden reeds complexen gezuiverd. Door een vergelijking van de complexen die gezuiverd werden met een C- versus Nterminaal getagde bait, kan er vervolgens geëvalueerd worden welke methode de beste resultaten oplevert voor typische celcycluseiwitten.

4.3.1. Kloneringstrategie De entry-vectoren, pEntryL1 L2-orf (+ stopcodon), met CDKA;1_intron, CDKB1;1_intron, CKS1_intron en CycD3;1_intron werden gemaakt met stopcodon en gecontroleerd via sequenering (zie puntje 4.1.1.2.1 ).

4.3.1.1. Klonering van de 35S promotor in pDonrP4P3

Er werd eerst een adaptor-PCR reactie uitgevoerd om de CaMV 35S promotor op te pikken en te flankeren met attB4- en attB3-sites. Hiervoor werden de attB4-PacI primer en de attB3AscI primer gebruikt. Als template werd het pEntryL4R1-P35S plasmide genomen. De 2 restrictiesites werden toegevoegd om eventueel de promotor klassiek te gaan kloneren in de N-terminale destination vector, indien de BP-reactie niet zou lukken. PacI attB4 P35S attB3

PCR AscI

P35S

PacI attB4

AscI attB3

110

Deel 4: Resultaten en discussie

Resterend template na PCR 1500 bp 1000 bp

PacI-attB4-P35S-attB3-AscI



Resterende primers na PCR

Fig. 4.30: Analyse van de PCR-amplificatie van de 35S promoter op agarosegel

Het PCR-product, PacI-attB4-P35S-attB3-AscI, werd op agarose gel gebracht. Zoals verwacht werd het fragment rond de 1200 bp teruggevonden (Figuur 4.30). Daar ongebruikte attB-bevattende primers kunnen interfereren tijdens de BP-reactie, werd het PCR-product eerst gezuiverd m.b.v. een Chromaspin 1000 kolom. Vervolgens werd de BP-recombinatie reactie tussen pDonrP4P3 en attB4-P35S-attB3 uitgevoerd, resulterend in de entry-vector, pEntryL4L3-P35S. De entry-vector werd getransformeerd naar E. coli DH 5 en uitgeplaat op LB+ met Km. Ter controle werd een kolonie PCR uitgevoerd met de primers attB4-P35S-fwd en attB3P35S-rev op 10 kolonies met vector pEntryL4L3-P35S . Dit werd gecontroleerd op agarosegel, de verwachte fragmenten werden teruggevonden rond 1200 bp, behalve bij klonen 1 en 10 (Figuur 4.31). M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

M

1500 bp 1000 bp

Resterende primers

Fig. 4.31: Analyse van het kolonie PCR-product van de 10 kolonies agarose gel.

Een miniprep plasmide DNA bereiding van pEntryL4L3-P35S werd uitgevoerd.

111

Deel 4: Resultaten en discussie Als tweede controle werd een restrictiedigest met EcoRV en SacI gedaan. De verwachte fragmenten waren 24 bp, 151 bp, 172 bp, 197 bp, 865 bp en 2353 bp groot. Het restrictie mengsel werd op agarose gel gebracht. Alle fragmenten werden teruggevonden, enkel die van 24 bp is niet zichtbaar (Figuur 4.32).

2500 bp 800 bp

200 bp

Fig. 4.32: : Analyse van de restrictiedigest op agarosegel.

Alle 10 de klonen werden verder gecontroleerd via sequenering.

4.3.1.2. De LR- recombinatie reactie voor N-TAP fusies

Een LR-recombinatie reactie met de vectoren pKNTAP, pEntryL4 L3-P35S en pEntryL1L2-orf (+stopcodon), met CDKA;1_intron, CDKB1;1_intron, CKS1_intron en CycD3;1_intron werd uitgevoerd (Figuur 4.33), met vorming van een N-terminale TAP-expressievector pKNTAP35S::NTAP-orf (+introns en stopcodon). L3

L4

L1

L2

promotor

gene

pEntry-prom.

pEntry-gene

NTAP CcdB Cm R4

CcdB Cm R3

R1

R2

pKNTAP

promotor NTAP

gene

pExpression-NTAP

Fig. 4.33: De LR-recombinatie reactie waarbij de twee CcdB genen op pKNTAP vervangen worden door een promoter enerzijds en het gen van interesse anderzijds, resulterend in een N-terminale TAP-expressievector.

112

Deel 4: Resultaten en discussie Het LR-reactiemengsel werd getransformeerd naar E. coli DH5 en uitgeplaat op LB+ met Sp. Een miniprep plasmide DNA bereiding van onze klonen werd uitgevoerd en gecontroleerd d.m.v. restrictiedigest. M

CDKA;1-Intron

CKS1-Intron

CDKB1;1-Intron

Cyc D3;1

10000 bp

10000 bp

2500 bp 2000 bp 1000 bp

2000 bp 800 bp 600 bp

600 bp 200 bp

Fig. 4.34: Controle restrictiedigest op agarosegel gebracht

De controle restrictiedigest werd gedaan van: pKNTAP-P35S::CDKA;1-Intron met XbaI en XhoI, de verwachte fragmenten waren 8347 bp, 2188 bp, 1781 bp, 1388 bp en 218 bp. pKNTAP-P35S::CKS1-Intron met EcoRV, de verwachte fragmenten waren 10980 bp, 1327 bp en 197 bp. pKNTAP-P35S::CycD3;1-Intron met XbaI en XhoI, de verwachte fragmenten waren 8347 bp, 2471 bp, 1781 bp, 495 bp en 171 bp. pKNTAP-P35S::CDKB1;1-Intron met SacI, de verwachte fragmenten waren 9413 bp, 2278 bp, 863 bp en 678 bp. De verwachte fragmenten werden alle teruggevonden op de agarose gel (Figuur 4.34).

Vervolgens werd er een midiprep plasmide DNA bereiding van de klonen uitgevoerd en de concentratie werd bepaald. Via elektroporatie werden de goede klonen getransformeerd naar Agrobacterium tumefaciens.

4.3.2. Transformatie naar PSB-d plantencellen De agrobacteria met onze N-terminale expressievectoren, werden getransformeerd naar PSBd cellen via co-cultivatie en getransformeerde cellen werden in cultuur gebracht, zoals voorheen reeds beschreven (4.1.2).

113

Deel 4: Resultaten en discussie 4.3.3. Expressie analyse Eiwitextract werd bereid en 60 µg werd geladen. De eiwitten werden gescheiden via SDSPAGE, en transgeen eiwit werd gedetecteerd via immunodetectie na western blotting met als primair AL rabbit anti-CBP, wat bindt op het calmoduline binding peptide van de TAP-tag. Hierna werd het secundair AL, anti-rabbit geconjugeerd met Horse Radish Peroxidase (HRP), toegevoegd. Als negatieve controle werd wild type extract geladen. WT

1

2

3

4

5

6

7

8

75 kDa 50 kDa

37 kDa

25 kDa

10 kDa

50 kDa

35S:NTAP-CDKA;1 (intron)

35S:NTAP-CDKB1;1 (intron)

Fig. 4.35: Western blot analyse van 35S:NTAP-CDKA;1 (intron) en 35S:NTAP-CDKB1;1 (intron). Boven:

WT: Wild type PSB-d cellen. 1 t.e.m 3: 35S:NTAP-CDKA;1 (intron) 4 t.e.m 8: 35S:NTAP-CDKB1;1 (intron)

Onder: Dezelfde blot, maar met een kortere belichting (5s)

Men ziet een zeer intense band ter hoogte van de N-TAP fusie-eiwitten, bij 54 kDa voor NTAP-CDKA;1 en bij 55,33 kDa voor NTAP-CDKB1;1 (Figuur 4.35).

114

Deel 4: Resultaten en discussie Voor NTAP-CKS1-Intron werd voor immunodetectie als primair AL anti-CKS (1/1000) gebruikt. Op de blot werd dus naast het transgene CKS1, ook het endogene CKS1 gevisualiseerd. Het transgeen CKS1 accumuleert dus veel hoger dan het endogene CKS1. Het CKS1 eiwit is 10,5 kDa groot (zie rode pijl) en de tag is 20 kDa groot. Ter hoogte van de 30,5 kDa ziet men de intense band van 35S:NTAP-CKS1, deze ontbreekt bij het WT (PSB-d) (Figuur.4.36)

PSB-d

35S:NTAP-CKS1-Intron

Fig. 4.36: Western blot met het construct 35S:NTAP-CKS1-intron. 50 kDa 37 kDa

25 kDa 20 kDa 10 kDa

PSB-d

35S:NTAP-CycD3;1 intron

100 kDa 75 kDa

Fig. 4.37: Western blot met het construct 35S:NTAP-CycD3;1-intron

50 kDa

(62,8 kDa).

37 kDa

25 kDa 20 kDa

10 kDa

Voor NTAP-CycD3;1-Intron werd voor immunodetectie als primair AL anti-CBP (1/1000) gebruikt. Ter hoogte van 62,8 kDa (het CycD3;1 eiwit is 42,8 kDa groot en de tag is 20 kDa groot. ) verwacht men in vergelijking met het WT een extra bandje, maar dit is niet het geval. Een mogelijke verklaring is dat het bandje van het fusie eiwit gemaskeerd werd door de crossreactie banden op die hoogte.

115

Deel 4: Resultaten en discussie Ter hoogte van 85 kDa (rode pijl) ziet men echter wel een differentiële band die niet aanwezig is bij het WT, dit kan ook het fusie-eiwit zijn. Soms gebeurt het dat de eiwitten trager migreren doorheen de gel en men ze terugvindt op een hogere positie dan de theoretisch verwachte (Figuur 4.37). Ter hoogte van 32 kDa (blauwe pijl) ziet men een differentiële band, die niet aanwezig is bij het WT, dit kan een degradatieband van het fusie-eiwit zijn, aangezien CycD3;1 een zeer onstabiel eiwit is (Figuur 4.37).

116

Deel 4: Resultaten en discussie 4.3.4. Tandem Affinity Purification De transgene cellijnen met een goede expressie werden vervolgens opgeschaald tot 10 L celcultuur en het celmateriaal werd uiteindelijk geoogst. Wegens contaminatie werd er geen materiaal geoogst voor de 35S::NTAP-CDKA;1 transgene lijn. Oogst: 10 L celcultuur met 35S::NTAP_CKS1_intron geeft 46,55 g celmateriaal 10 L celcultuur met 35S::NTAP_Cyc D3;1_intron geeft 55,25 g celmateriaal 10 L celcultuur met 35S::NTAP_CDKB1;1_intron geeft 50,34 g celmateriaal

Het TAP protocol, zoals beschreven in materiaal en methoden (paragraaf 3.6.5.), werd gebruikt om eiwitcomplexen te zuiveren uit celmateriaal van NTAP-CDKB1;1, NTAP-CKS1 en NTAP-CycD3;1. Elke zuivering werd in duplo uitgevoerd. Gezuiverde eiwitcomplexen werden geconcentreerd via TCA-precipitatie. Vervolgens werd het precipitaat opgekookt in NuPAGE sample buffer en geladen op 4-12% gradiënt NuPAGE gels. Eiwitten werden gevisualiseerd via Coőmassie G kleuring. M

35S::NTAP-CDKB1;1-Intron

35S::NTAP-CKS1-Intron

M

kDa

kDa

188

188

98

98

62

35S::NTAP-CycD3;1-Intron

62

49

49

38

38

28

28

17

17

14

14

6

6

3

3

Fig. 4.38: 4-12% gradiënt NuPAGE gels gekleurd met Coőmassie G

117

Deel 4: Resultaten en discussie De gels werden opgestuurd naar het CEPROMA (Centrum voor proteoomanalyse en massa spectrometrie aan de UA), waar de eiwitten geϊdentificeerd werden via MALDI-TOFTOF. Deze resultaten zijn spijtig genoeg nog niet binnen, maar zullen wel besproken worden tijdens de scriptievoorstelling en toegevoegd worden als addendum aan de thesis.

Wanneer we de coomassies vergelijken van de TAP-eluaten van C-terminaal en N-terminaal getagged CKS1, worden verschillen waargenomen (Figuur 4.39). 1

2

188 kDa 188 kDa 98 kDa 98 kDa 62 kDa

1.

2.

TAP-eluaat 35S::CKS1-TAP TAP-eluaat 35S::NTAP-CKS1

62 kDa

49 kDa

49 kDa

38 kDa

38 kDa

28 kDa

28 kDa

17 kDa 14 kDa

Fig. 4.39: Vgl. TAP-eluaten C- en N- terminaal

17 kDa 14 kDa

6 kDa 6 kDa

Ten eerste zien we een veel intensere band ter hoogte van het TEV-verknipte CKS1 fusieeiwit bij de N-terminale TAP-zuivering (Figuur 4.39). Een mogelijke verklaring is dat de NTAP-tag in de expressievector regulatorische elementen zoals introns en extra ribosoom bindende plaatsen bevat in tegenstelling tot de TAP-tag in de C-terminale expressievectoren, waardoor er in het totaal eiwit-extract reeds voor de zuivering veel meer transgeen eiwit aanwezig is. Finaal wordt er dus ook meer CKS1 gezuiverd. Verder nemen we ook een verschillend bandenpatroon waar tussen de 2 eluaten (Figuur 4.39). Om deze verschillen verder te evalueren en na te gaan of meer of andere complexen werden gezuiverd met Nterminale fusie in vergelijking met C-terminale, is MS-analyse noodzakelijk. Wegens tijdsgebrek konden de resultaten van de MS-analyse hier niet meer opgenomen. Ze zullen later als addendum toegevoegd worden.

118

Deel 5: Samenvatting

Deel 5: Samenvatting Met het volledig sequeneren van verschillende genomen (bv. het Arabidopsis thaliana genoom) heeft er zich een nieuwe uitdaging aangediend, namelijk het ontcijferen van de relaties tussen de individuele genen en het begrijpen van de moleculaire organisatie van cellulaire netwerken. Eiwitinteracties zijn essentieel voor het leven van een cel, de analyse van zulke interacties laat wetenschappers toe de functie van ongekarakteriseerde proteïnen en de genen die ervoor coderen te bepalen. Verschillende methodes zijn er doorheen de jaren ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties te onderzoeken. In de Functionele Proteoom-analyse groep bestudeert men de celcyclus eiwiteiwit interacties van Arabidopsis thaliana m.b.v. tandem affiniteitszuivering (TAP). TAP is een fysische methode waarbij een eiwit wordt gefusioneerd, C- of N-terminaal, met een TAP-tag. Deze tag bestaat uit een Calmoduline bindend peptide (CBP), een TEV (Tobacco Etch Virus)-protease klievingssplaats en twee IgG (Immunoglobuline G) bindende domeinen (ZZ domein) van het Staphylococcus aureus proteïneA, kortom de CBP-TEV-ZZ TAP-tag genoemd. Dit TAP-tagged eiwit wordt tot expressie gebracht in PSB-d celsuspensie culturen, afgeleid van Arabidopsis thaliana ecotype Landsberg erecta, en zal in competitie treden met het endogene eiwit om ingebouwd te worden in eiwitcomplexen. Het TAPcomplex wordt uit de cellen geïsoleerd via 2 affiniteitstappen. Namelijk affiniteitselectie op een IgG sepharose-matrix, waarop de proteïneA-tag zal binden. Na het wegwassen van contaminanten met buffers die de fysiologische condities van de cel nabootsen, voegt men TEV-protease toe om het gebonden materiaal vrij te stellen, het eluens wordt in de tweede affiniteitsstap in aanwezigheid van calcium ionen geïncubeerd met agarose parels die een calmoduline mantel bevatten, deze zullen binden met het Calmoduline Bindend Peptide (de CBP-tag ) op de resterende TAP-tag cassette, na het wassen wordt het gebonden materiaal vrijgesteld met EGTA. De eiwitcomplexen in het extract worden gescheiden via PAGE, de bandjes van interesse worden uit de gel gesneden en onderworpen aan een trypsine digest. De bekomen peptiden worden via massaspectrometrie gedeeltelijk gesequeneerd. De proteïne wordt via eiwitsequentie databanken geïdentificeerd. In deze thesis werden cycline afhankelijke kinasen (CDKA;1 en CDKB1;1), cyclineD3;1 en CDK subunit 1 (CKS1) onderzocht die, in complex met andere eiwitten, uit PSB-d cel suspensie culturen werden gezuiverd. Deze cellen hebben een 8C–DNA inhoud, d.w.z dat

119

Deel 5: Samenvatting elke gen in meerdere kopijen (8) voorkomt en de competitie met het endogene eiwit dus zeer groot is, wat overexpressie dikwijls noodzakelijk maakt. Er werd getracht de expressie van het endogene eiwit te verlagen en die van het transgene fusie eiwit te verhogen om zo meer fusie-eiwit gebonden complexen te kunnen vergaren. Door de introns op te nemen in de chimere genen in de expressievectoren, werd er getracht de genexpressie te verhogen, er is namelijk aangetoond dat introns de transcriptionele efficiëntie van vele genen in een variëteit aan organismen positief beïnvloeden. In ons experiment echter, was er geen verschil in genexpressie tussen de constructen met en de constructen zonder introns (onder controle van de endogene promotor). Dit leidde tot het besluit dat introns bij CDKA;1 en CDKB1;1 geen intron mediated enhancement (IME) veroorzaken, dit besluit mag zeker niet veralgemeend worden omdat er sterke aanwijzingen zijn dat IME genafhankelijk is. Er werden ook experimenten uitgevoerd om de expressie van het endogene CDKA;1 te verlagen door middel van RNA geïnduceerde gene silencing (RNAi), meer bepaald door een mechanisme van post-transcriptional gene silencing (PTGS). RNAi leidt wel enkel tot ‘gene knock-down’, geen volledige silencing (‘gene knock-out’). De introductie van een dubbelstrengig RNA (hairpin RNA in dit geval) in de plantencel, induceert een sequentiespecifiek RNA-degradatie mechanisme dat op effectieve wijze het doelwit gen, CDKA;1, afbreekt. Twee RNAi-hairpinconstructen werden gemaakt met de 3’UTR (sense en anti-sense) van CDKA;1 en supergetransformeerd in transgene celculturen die CDKA;1-TAP tot expressie brengen onder controle van de endogene CDKA;1-promoter. De resultaten uit dit experiment waren veelbelovend, silencing van het endogene CDKA;1 werd waargenomen, zonder dat het effect had op de transgene expressie van CDKA;1-TAP. Een ander luik van het onderzoek was de vergelijking tussen C-TAP en N-TAP fusies. Soms zal de toevoeging van een C-terminale tag aan een eiwit diens functie verhinderen of de inbouw in complexen onmogelijk maken of significant verminderen. Een simpel alternatief is het toevoegen van de tag aan de amino-terminus van het doelwitproteïne. Toevoeging van een tag kan ertoe leiden dat sommige domeinen gemaskeerd worden en bijgevolg kan dit leiden tot het uitblijven van bepaalde eiwit-interacties. Het is dus mogelijk dat er verschillende interactoren opgepikt worden wanneer N-terminale versus C-terminale TAP-tagging vergeleken wordt. De N-terminale TAP-tag bevat dezelfde modules als de C-terminale TAPtag, maar in omgekeerde volgorde. NTAP-CKS1, NTAP-CycD3;1 en NTAP-CDKB1;1 werden getapt, met als bedoeling deze te vergelijken met hun C-terminaal getagde tegenhangers en zo te zien met welke fusie de meeste, biologisch actieve complexen kunnen gezuiverd worden. De resultaten van dit 120

Deel 5: Samenvatting experiment echter, zullen bij het printen van de thesis nog niet voorhanden zijn, ze zullen op een later tijdstip als addendum toegevoegd worden aan de thesis en zullen alleszins besproken worden op de scriptievoorstelling.

121

Referenties

Referenties: 1. Alexandrov, N. N., M. E. Troukhan, V. V. Brover, T. Tatarinova, R. B. Flavell and K. A. Feldmann (2006). "Features of Arabidopsis genes and genome discovered using full-length cDNAs." Plant Mol Biol 60(1): 69-85. 2. Bauer, A. and B. Kuster (2003). "Affinity purification-mass spectrometry. Powerful tools for the characterization of protein complexes." Eur J Biochem 270(4): 570-8. 3. Baulcombe, D. C. (1999). "Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing." Curr Opin Plant Biol 2(2): 109-13. 4. Bock, J. R. and D. A. Gough (2001). "Predicting protein--protein interactions from primary structure." Bioinformatics 17(5): 455-60. 5. Bourdon, V., A. Harvey and D. M. Lonsdale (2001). "Introns and their positions affect the translational activity of mRNA in plant cells." EMBO Rep 2(5): 394-8. 6. Brinster, R. L., J. M. Allen, R. R. Behringer, R. E. Gelinas and R. D. Palmiter (1988). "Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice." Proc Natl Acad Sci U S A 85(3): 836-40. 7. Brown, A. P., V. Affleck, T. Fawcett and A. R. Slabas (2006). "Tandem affinity purification tagging of fatty acid biosynthetic enzymes in Synechocystis sp. PCC6803 and Arabidopsis thaliana." J Exp Bot. 8. Butaye, K. M., I. J. Goderis, P. F. Wouters, J. M. Pues, S. L. Delaure, W. F. Broekaert, A. Depicker, B. P. Cammue and M. F. De Bolle (2004). "Stable high-level transgene expression in Arabidopsis thaliana using gene silencing mutants and matrix attachment regions." Plant J 39(3): 440-9. 9. Camacho-Carvajal, M. M., B. Wollscheid, R. Aebersold, V. Steimle and W. W. Schamel (2004). "Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multiprotein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach." Mol Cell Proteomics 3(2): 176-82. 10. Causier, B. (2004). "Studying the interactome with the yeast two-hybrid system and mass spectrometry." Mass Spectrom Rev 23(5): 350-67. 11. Constans, A. (2002). " Protein Purification II: Affinity Tags." The Scientist 16(4): 37.

122

Referenties 12. Desai, I. M. C. a. A. (2005). "A Combined Approach for the Localization and Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Metazoans." Sci. STKE 2005(266): pl 1. 13. Droit, A., G. G. Poirier and J. M. Hunter (2005). "Experimental and bioinformatic approaches for interrogating protein-protein interactions to determine protein function." J Mol Endocrinol 34(2): 263-80. 14. Eubel, H., H. P. Braun and A. H. Millar (2005). "Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions." Plant Methods 1(1): 11. 15. Fields, S. and O. Song (1989). "A novel genetic system to detect protein-protein interactions." Nature 340(6230): 245-6. 16. Forler, D., T. Kocher, M. Rode, M. Gentzel, E. Izaurralde and M. Wilm (2003). "An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes." Nat Biotechnol 21(1): 89-92. 17. Gavin, A. C., M. Bosche, R. Krause, P. Grandi, M. Marzioch, A. Bauer, J. Schultz, J. M. Rick, A. M. Michon, C. M. Cruciat, M. Remor, C. Hofert, M. Schelder, M. Brajenovic, H. Ruffner, A. Merino, K. Klein, M. Hudak, D. Dickson, T. Rudi, V. Gnau, A. Bauch, S. Bastuck, B. Huhse, C. Leutwein, M. A. Heurtier, R. R. Copley, A. Edelmann, E. Querfurth, V. Rybin, G. Drewes, M. Raida, T. Bouwmeester, P. Bork, B. Seraphin, B. Kuster, G. Neubauer and G. Superti-Furga (2002). "Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes." Nature 415(6868): 141-7. 18. Goderis, I. J., M. F. De Bolle, I. E. Francois, P. F. Wouters, W. F. Broekaert and B. P. Cammue (2002). "A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units." Plant Mol Biol 50(1): 17-27. 19. Graumann, J., L. A. Dunipace, J. H. Seol, W. H. McDonald, J. R. Yates, 3rd, B. J. Wold and R. J. Deshaies (2004). "Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast." Mol Cell Proteomics 3(3): 226-37. 20. Gruss, P., C. J. Lai, R. Dhar and G. Khoury (1979). "Splicing as a requirement for biogenesis of functional 16S mRNA of simian virus 40." Proc Natl Acad Sci U S A 76(9): 4317-21. 21. Hamer, D. H., K. D. Smith, S. H. Boyer and P. Leder (1979). "SV40 recombinants carrying rabbit beta-globin gene coding sequences." Cell 17(3): 725-35. 22. Hanahan, D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids." J Mol Biol 166(4): 557-80. 123

Referenties 23. Hilson, P., J. Allemeersch, T. Altmann, S. Aubourg, A. Avon, J. Beynon, R. P. Bhalerao, F. Bitton, M. Caboche, B. Cannoot, V. Chardakov, C. Cognet-Holliger, V. Colot, M. Crowe, C. Darimont, S. Durinck, H. Eickhoff, A. F. de Longevialle, E. E. Farmer, M. Grant, M. T. Kuiper, H. Lehrach, C. Leon, A. Leyva, J. Lundeberg, C. Lurin, Y. Moreau, W. Nietfeld, J. Paz-Ares, P. Reymond, P. Rouze, G. Sandberg, M. D. Segura, C. Serizet, A. Tabrett, L. Taconnat, V. Thareau, P. Van Hummelen, S. Vercruysse, M. Vuylsteke, M. Weingartner, P. J. Weisbeek, V. Wirta, F. R. Wittink, M. Zabeau and I. Small (2004). "Versatile gene-specific sequence tags for Arabidopsis functional genomics: transcript profiling and reverse genetics applications." Genome Res 14(10B): 2176-89. 24. Hink, M. A., T. Bisselin and A. J. Visser (2002). "Imaging protein-protein interactions in living cells." Plant Mol Biol 50(6): 871-83. 25. Hirano, H., N. Islam and H. Kawasaki (2004). "Technical aspects of functional proteomics in plants." Phytochemistry 65(11): 1487-98. 26. Ho, Y., A. Gruhler, A. Heilbut, G. D. Bader, L. Moore, S. L. Adams, A. Millar, P. Taylor, K. Bennett, K. Boutilier, L. Yang, C. Wolting, I. Donaldson, S. Schandorff, J. Shewnarane, M. Vo, J. Taggart, M. Goudreault, B. Muskat, C. Alfarano, D. Dewar, Z. Lin, K. Michalickova, A. R. Willems, H. Sassi, P. A. Nielsen, K. J. Rasmussen, J. R. Andersen, L. E. Johansen, L. H. Hansen, H. Jespersen, A. Podtelejnikov, E. Nielsen, J. Crawford, V. Poulsen, B. D. Sorensen, J. Matthiesen, R. C. Hendrickson, F. Gleeson, T. Pawson, M. F. Moran, D. Durocher, M. Mann, C. W. Hogue, D. Figeys and M. Tyers (2002). "Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry." Nature 415(6868): 180-3. 27. Honey, S., B. L. Schneider, D. M. Schieltz, J. R. Yates and B. Futcher (2001). "A novel multiple affinity purification tag and its use in identification of proteins associated with a cyclin-CDK complex." Nucleic Acids Res 29(4): E24. 28. Honore, B., M. Ostergaard and H. Vorum (2004). "Functional genomics studied by proteomics." Bioessays 26(8): 901-15. 29. Huynen, M. A. and P. Bork (1998). "Measuring genome evolution." Proc Natl Acad Sci U S A 95(11): 5849-56. 30. Jarvik, J. W. and C. A. Telmer (1998). "Epitope tagging." Annu Rev Genet 32: 60118. 31. Knuesel, M., Y. Wan, Z. Xiao, E. Holinger, N. Lowe, W. Wang and X. Liu (2003). "Identification of novel protein-protein interactions using a versatile mammalian 124

Referenties tandem affinity purification expression system." Mol Cell Proteomics 2(11): 122533. 32. Krogan, N. J., G. Cagney, H. Yu, G. Zhong, X. Guo, A. Ignatchenko, J. Li, S. Pu, N. Datta, A. P. Tikuisis, T. Punna, J. M. Peregrin-Alvarez, M. Shales, X. Zhang, M. Davey, M. D. Robinson, A. Paccanaro, J. E. Bray, A. Sheung, B. Beattie, D. P. Richards, V. Canadien, A. Lalev, F. Mena, P. Wong, A. Starostine, M. M. Canete, J. Vlasblom, S. Wu, C. Orsi, S. R. Collins, S. Chandran, R. Haw, J. J. Rilstone, K. Gandi, N. J. Thompson, G. Musso, P. St Onge, S. Ghanny, M. H. Lam, G. Butland, A. M. Altaf-Ul, S. Kanaya, A. Shilatifard, E. O'Shea, J. S. Weissman, C. J. Ingles, T. R. Hughes, J. Parkinson, M. Gerstein, S. J. Wodak, A. Emili and J. F. Greenblatt (2006). "Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Nature 440(7084): 637-43. 33. Le Hir H, N. A., Moore MJ (2003). "How introns influence and enhance eukaryotic gene expression." Trends in biochemical sciences 28(4): 215-220. 34. Li, M. (2000). "Applications of display technology in protein analysis." Nat Biotechnol 18(12): 1251-6. 35. MacBeath, G. and S. L. Schreiber (2000). "Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination." Science 289(5485): 1760-3. 36. MacBeath, G. (2002). "Protein microarrays and proteomics." Nat Genet 32 Suppl: 526-32. 37. Marcotte, E. M., M. Pellegrini, H. L. Ng, D. W. Rice, T. O. Yeates and D. Eisenberg (1999). "Detecting protein function and protein-protein interactions from genome sequences." Science 285(5428): 751-3. 38. May, M. J. and C. J. Leaver (1993). "Oxidative Stimulation of Glutathione Synthesis in Arabidopsis thaliana Suspension Cultures." Plant Physiol 103(2): 621-627. 39. McCormack, A. L., D. M. Schieltz, B. Goode, S. Yang, G. Barnes, D. Drubin and J. R. Yates, 3rd (1997). "Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level." Anal Chem 69(4): 767-76. 40. Menges, M. and J. A. Murray (2002). "Synchronous Arabidopsis suspension cultures for analysis of cell-cycle gene activity." Plant J 30(2): 203-12. 41. Mullaney, B. P. and M. G. Pallavicini (2001). "Protein-protein interactions in hematology and phage display." Exp Hematol 29(10): 1136-46. 125

Referenties 42. Palmiter, R. D., E. P. Sandgren, M. R. Avarbock, D. D. Allen and R. L. Brinster (1991). "Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice." Proc Natl Acad Sci U S A 88(2): 478-82. 43. Pellegrini, M., E. M. Marcotte, M. J. Thompson, D. Eisenberg and T. O. Yeates (1999). "Assigning protein functions by comparative genome analysis: protein phylogenetic profiles." Proc Natl Acad Sci U S A 96(8): 4285-8. 44. Peng, J., D. Schwartz, J. E. Elias, C. C. Thoreen, D. Cheng, G. Marsischky, J. Roelofs, D. Finley and S. P. Gygi (2003). "A proteomics approach to understanding protein ubiquitination." Nat Biotechnol 21(8): 921-6. 45. Phizicky, E. M. and S. Fields (1995). "Protein-protein interactions: methods for detection and analysis." Microbiol Rev 59(1): 94-123. 46. Puig, O., F. Caspary, G. Rigaut, B. Rutz, E. Bouveret, E. Bragado-Nilsson, M. Wilm and B. Seraphin (2001). "The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification." Methods 24(3): 218-29. 47. Rigaut, G., A. Shevchenko, B. Rutz, M. Wilm, M. Mann and B. Seraphin (1999). "A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration." Nat Biotechnol 17(10): 1030-2. 48. Rose, A. B. (2002). "Requirements for intron-mediated enhancement of gene expression in Arabidopsis." Rna 8(11): 1444-53. 49. Rose, A. B. (2004). "The effect of intron location on intron-mediated enhancement of gene expression in Arabidopsis." Plant J 40(5): 744-51. 50. Rubio, V., Y. Shen, Y. Saijo, Y. Liu, G. Gusmaroli, S. P. Dinesh-Kumar and X. W. Deng (2005). "An alternative tandem affinity purification strategy applied to Arabidopsis protein complex isolation." Plant J 41(5): 767-78. 51. Ruiz, M. T., O. Voinnet and D. C. Baulcombe (1998). "Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing." Plant Cell 10(6): 937-46. 52. Schagger, H. and K. Pfeiffer (2001). "The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes." J Biol Chem 276(41): 37861-7. 53. Shevchenko, A., D. Schaft, A. Roguev, W. W. Pijnappel and A. F. Stewart (2002). "Deciphering protein complexes and protein interaction networks by tandem affinity purification and mass spectrometry: analytical perspective." Mol Cell Proteomics 1(3): 204-12.

126

Referenties 54. Tanaka, A., S. Mita, S. Ohta, J. Kyozuka, K. Shimamoto and K. Nakamura (1990). "Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice but not in tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficient splicing of the intron." Nucleic Acids Res 18(23): 6767-70. 55. Walter, G., K. Bussow, D. Cahill, A. Lueking and H. Lehrach (2000). "Protein arrays for gene expression and molecular interaction screening." Curr Opin Microbiol 3(3): 298-302. 56. Waterhouse, P. M. and C. A. Helliwell (2003). "Exploring plant genomes by RNAinduced gene silencing." Nat Rev Genet 4(1): 29-38. 57. Wesley, S. V., C. A. Helliwell, N. A. Smith, M. B. Wang, D. T. Rouse, Q. Liu, P. S. Gooding, S. P. Singh, D. Abbott, P. A. Stoutjesdijk, S. P. Robinson, A. P. Gleave, A. G. Green and P. M. Waterhouse (2001). "Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants." Plant J 27(6): 581-90. 58. Zeghouf, M., J. Li, G. Butland, A. Borkowska, V. Canadien, D. Richards, B. Beattie, A. Emili and J. F. Greenblatt (2004). "Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes." J Proteome Res 3(3): 463-8.

59. Zhang, B., B. Kraemer, D. SenGupta, S. Fields and M. Wickens (1999). "Yeast three-hybrid system to detect and analyze interactions between RNA and protein." Methods Enzymol 306: 93-113. 60. Zhang, K. W., J. M. Wang and C. C. Zheng (2004). "[The potential role of nuclear matrix attachment regions (MARs) in regulation of gene expression]." Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 20(1): 6-9. 61. Zhu, H. and M. Snyder (2003). "Protein chip technology." Curr Opin Chem Biol 7(1): 55-63.

127