Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013 – 2014
Ontrafelen van de interacties tussen rijst en de plantparasitaire nematode Hirschmanniella oryzae
Eline Van Vlasselaer Promotor: Prof. dr. Godelieve Gheysen Tutor: Lander Bauters
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie
De auteur, tutor en promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van de auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.
Auteur: Eline Van Vlasselaer
Promotor: Prof. Dr. Godelieve Gheysen
Tutor: Ir. Lander Bauters
6 juni 2014
Woord vooraf Mijn opleiding van zes jaar komt stilaan ten einde. Tijdens de eerste drie jaar van mijn opleiding behaalde ik mijn bachelor in biochemie en biotechnologie. Toen ik mijn bachelor diploma behaalde, twijfelde ik of ik de juiste keuze had gemaakt. Al snel kwam ik tot een conclusie dat ik op 18-jarige leeftijd een te snelle keuze had gemaakt. Ik besloot om te veranderen van richting, maar dit ging niet zonder slag of stoot. Ik koos ervoor om mijn master in bioingenieurswetenschappen met afstudeerrichting cel- en genbiotechnologie te behalen, maar dit ging niet zonder een voorbereidingsprogramma. Na het slagen in mijn voorbereidingprogramma kon ik eindelijk beginnen aan mijn master in de bioingenieurswetenschappen. Na mijn eerste kennismaking met de echte ingenieursvakken wist ik dat ik de juiste beslissing had gemaakt. In mijn voorlaatste jaar moest ik mijn keuzes indienen voor mijn thesis onderwerp. Al snel kwam ik bij de onderwerpen die professor Godelieve Gheysen aanbood. Zowel voor mijn eerste als tweede keuze koos ik voor het onderwerp van Lander Bauters zodat ik mijn kans verhoogde om zeker in de vakgroep van Moleculaire Biotechnologie terecht te komen. Ik kreeg het onderwerp en in augustus 2013 begon ik aan mijn eindwerk. Al snel kon ik mijn kennis omzetten in de praktijk . Niet enkel intellectueel heb ik mijn kennis verder uitgebreid, maar ook op sociaal vlak ben ik gegroeid. Het was mijn eerste ervaring met wetenschappelijk onderzoek, dat ik waarschijnlijk zal verder zetten na het behalen van mijn diploma. Deze masterproef kon niet tot stand komen zonder de hulp van bepaalde mensen. Ik zou graag mijn promotor prof. Godelieve Gheysen bedanken, door haar kon ik een jaar lang aan dit onderwerp werken. Natuurlijk mag ik mijn tutor Lander Bauters niet vergeten. Hij heeft mij een jaar lang geholpen met elk probleem dat zich voordeed, hij heeft mij verscheidende technieken aangeleerd en stond altijd klaar om alle vragen te beantwoorden. Ook Silke Nowak zou ik graag bedanken. Zij was diegene die klaar stond wanneer Lander niet aanwezig was of geen tijd had wegens zijn drukke agenda als assistent. Tot slot wil ik graag alle andere medewerkers bedanken van het laboratorium, want iedereen stond altijd klaar voor hulp en uitleg wanneer het nodig was. Ik zou via deze weg ook graag enkele mensen willen bedanken die mij de kans hebben gegeven voor het behalen van mijn diploma. Eerst en vooral mijn ouders die mij tijdens deze zes jaar altijd gesteund hebben, maar ook mijn familie en vrienden die steeds in mij geloofden wanneer er zich moeilijke periodes voordeden. Dank u! Eline Van Vlasselaer 6 juni 2014
Inhoudsopgave Lijst met afkortingen ............................................................................................................................... 1 Samenvatting........................................................................................................................................... 3 Algemene inleiding .................................................................................................................................. 4 Literatuurstudie ....................................................................................................................................... 5 1.
Nematoden.................................................................................................................................. 5 1.1
Algemeen............................................................................................................................. 5
1.2
Morfologie van de nematode .............................................................................................. 7
1.3
Levenscyclus ........................................................................................................................ 8
1.4
Symptomen en management van Hirschmanniella oryzae ............................................... 11
2.
Oryza sativa ............................................................................................................................... 12
3.
Plant-nematode interacties ....................................................................................................... 13
4.
3.1
Algemeen........................................................................................................................... 13
3.2
Celwand modificerende eiwitten ...................................................................................... 15
3.3
Protease............................................................................................................................. 16
3.4
Bescherming van de nematode ......................................................................................... 16
3.5
Effectoren die invloed hebben op de hormoonpathways ................................................ 18
Transformatie ............................................................................................................................ 20 4.1
Algemeen........................................................................................................................... 20
4.2
Agrobacterium gemedieerde transformatie ..................................................................... 21
Materiaal en methode........................................................................................................................... 23 1.
2.
Oppikken van een gen uit een cDNA-bank ................................................................................ 23 1.1
Oppikken van een gen via PCR .......................................................................................... 23
1.2
Ligatie in pGEM-T-vector ................................................................................................... 24
1.3
Heat-shock transformatie van DH5α E. coli-cellen............................................................ 24
1.4
Kolonie-PCR ....................................................................................................................... 25
1.5
Plasmide-extractie ............................................................................................................. 26
1.6
Additie van attb-sites ........................................................................................................ 27
Gatewaycloning ......................................................................................................................... 27 2.1
BP reactie........................................................................................................................... 27
2.2
LR-reactie ........................................................................................................................... 28
3.
Triparentale mating ................................................................................................................... 28
4.
DNA extractie van de migratorische nematode H. oryzae ........................................................ 29
5.
In situ hybridisatie ..................................................................................................................... 30
5.1
Media................................................................................................................................. 30
5.2
Protocol ............................................................................................................................. 31
6.
Aanmaak van heat-shock competente Agrobacterium............................................................. 34
7.
Transiënte transformatie van tabaksplanten ............................................................................ 34
8.
7.1
Transformatie van Agrobacterium .................................................................................... 34
7.2
Infiltratie ............................................................................................................................ 35
Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie....................................................................... 36 8.1
Protocol ............................................................................................................................. 36
8.2
Media................................................................................................................................. 38
Resultaten ............................................................................................................................................. 41 1.
2.
Oppikken en analyse van Hirschmanniella oryzae effectorgenen (PEF’s) ................................ 41 1.1.
Oppikken van verschillende genen uit de cDNA-bank ...................................................... 41
1.2.
In situ hybridisatie ............................................................................................................. 42
Analyse van een Hirschmanniella oryzae kandidaat effector gen, PEF 15 ................................ 43 2.1.
Sequentie-analyse ............................................................................................................. 44
2.2.
Oppikken van het gen uit een cDNA-bank ........................................................................ 48
2.3. Analyse van mogelijke afweersuppressie door PEF15 via Agrobacterium-gemedieerde transformatie van tabaksplanten .................................................................................................. 49
3.
2.4.
Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie ............................................................... 52
2.5.
Oppikken van het gen op DNA-niveau .............................................................................. 53
Analyse van chorismaatmutase en isochorismatase................................................................. 55
Discussie ................................................................................................................................................ 59 Toekomstperspectieven ........................................................................................................................ 64 Referenties ............................................................................................................................................ 66 Bijlagen ..................................................................................................................................................... i I.
Primers ......................................................................................................................................... i
II.
Score-tabel PEF15 met Avr3a en R3a ..........................................................................................iii
III. Resultaten Fisher exact test PEF15 met Avr3a en R3a .................................................................v IV. Score-tabel PEF15 met Gp-RBP-1 en Gpa2................................................................................ viii V.
Resultaten Fisher exact test PEF15 met Gp-RBP-1 en Gpa2 ....................................................... xi
VI. Score-tabel ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (1) ......................................................... xiv VII. Resultaten Fisher exact test ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2(1) ................................ xvi VIII. Score-tabel ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (2) ....................................................... xviii IX. Resultaten Fisher exact test ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (2) .............................. xxi
X.
PEF15-homologen ................................................................................................................... xxiv
XI. Volledige alignering van PEF15 en homologe sequenties uit M. incognita en M. hapla ......... xxv
Lijst met afkortingen 2,4-D = 2,4-dichloor-fenoxy-azijnzuur ABA =abscisinezuur cDNA = copy DNA CIM = callus inducerend medium CLE = CLV like elements CLV3 = CLAVATA3 CM = chorismaatmutase DAMPs = damage-associated molecular patterns DEPC = Diethylpyrocarbonate DNA = desoxyribonucleïnezuur dNTP = desoxyribonucleotidetrifosfaat EDTA = ethyleendiaminetetra - azijnzuur EST = expressed sequence tag ET = ethyleen EtBr = Ethidiumbromide ETI = effector triggered immunity GHF = glycosyl hydrolase family GST = glutathione-S-transferase HGT = horizontale gentransfer HR = hypersensitive respons IAA = indol-3-azijnzuur ICM = isochorismatase ICS = isochorismaatsynthase ISH= in situ hybridisatie JA = jasmonaat
1
KAT = katalytische domein LB = luria broth MAMPs = microbial associated molecular patterns MES = 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid NB-LRR = nucleotide binding- leucine rich repeat NBT = Nitro Blue Tetrazolium chloride NOSP = no signal peptide OD = optische densiteit PCR = polymerase kettingreactie PAL = fenylalanine ammonium lyase PAMP = pattern associated molecular pattern PRR = pattern recognition receptors PTI = PAMP triggered immunity Rif = rifampicine ROS = reactive oxygen species SA = salicylzuur SDS = Sodium Dodecyl Sulfate SOC = sub optima broth with catabolic repression Spec =spectinomycine TAE = Tris-Acetaat-EDTA T-DNA = transfer-DNA Ti = tumor-inducerend UV = ultraviolet Vir =bacteriële virulentieproteïnen X-gal = x-galactose Y2H= Yeast-two-hybdrid YEB= yeast extract broth
2
Samenvatting In deze masterproef werden de interacties tussen de plant Oryza sativa en de nematode Hirschmanniella oryzae bestudeerd. Hiertoe werd eerst de literatuur bestudeerd om een overzicht te krijgen over het onderwerp. Deze literatuurstudie zal eerst en vooral een focus leggen op nematoden in het algemeen, de morfologie en de levenscycli van verschillende nematoden, maar met een nadruk op de migratorische nematode Hirschmanniella oryzae. De symptomen en management van Hirschmanniella oryzae zullen ook kort besproken worden. Vervolgens zal kort iets meer verteld worden over Oryza sativa. Een groot deel van de literatuurstudie zal een weergave zijn van verschillende plant-pathogene interacties, waarbij eerst algemeen deze interacties worden besproken om vervolgens op bepaalde interacties dieper in te gaan. Tenslotte wordt de transformatie van rijstplanten kort besproken. Tijdens deze masterproef werd getracht om potentiële effectoren te identificeren. Aan de hand van verschillende criteria werden deze genen geselecteerd uit een EST-databank. Voor deze genen werden primers ontwikkeld die gebruikt werden om het gen op te pikken uit een cDNA bank. Wanneer deze genen succesvol konden opgepikt worden, werd een in situ hybridisatie uitgevoerd om na te gaan of deze genen tot expressie komen in de klieren. Wanneer dit het geval was, werden deze genen verder onderzocht. Zo werd een mogelijk effectorgen opgepikt (PEF15). Hiermee werden verschillende Agrobacterium-gemedieerde tabaksinfiltraties uitgevoerd. Uit deze resultaten konden we concluderen dat PEF15 geen suppressie vertoonde van de hypersensitieve respons. Binnen het tijdskader van de masterproef kon geen volledige Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie worden afgewerkt, maar de eerste scheuten werden gevormd. Aan de hand van een sequentieanalyse werd PEF15 zoveel mogelijk geanalyseerd. Naast het oppikken van potentiële effectorgenen werd ook de focus gelegd op twee eiwitten, namelijk chorismaatmutase (CM) en isochorismatase (ICM). Om na te gaan of ze een effect hadden op de plantenafweer van de rijstplant werd een Agrobacterium-gemedieerde transiënte tabakstransformatie uitgevoerd. Hieruit werd geconcludeerd dat CM en ICM de hypersensitieve respons onderdrukten. Dit suggereert dat CM en ICM belangrijk zijn voor Hirschmanniella oryzae om de rijstplant succesvol te kunnen infecteren.
3
Algemene inleiding In deze masterproef werd getracht de interacties tussen rijst en de plant-parasitaire nematode Hirschmanniella oryzae te ontrafelen. Hirschmanniella oryzae is een migratorische nematode en onderzoek op deze nematode is op dit ogenblik beperkt. Het labo Toegepaste Moleculaire Genetica is er in geslaagd om een EST-databank van Hirschmanniella oryzae aan te maken. Deze EST-databank wordt gebruikt om de kennis over Hirschmanniella oryzae verder uit te breiden. Dit kan doordat men de EST-bank kan gebruiken om potentiële effectorgenen te zoeken. De plaats van expressie van deze potentiele effectorgenen werd nagegaan met behulp van een in situ hybridisatie. We zijn vooral geïnteresseerd in effectorgenen die tot expressie komen in de faryngeale klieren van de nematoden. De expressie van een “possible effector gene” (PEF15), werd met behulp van een in-situ hybridisatie aangetoond in de klieren van de nematoden. Hiermee werd verder onderzoek uitgevoerd om de functie van dit gen te ontrafelen. Enerzijds werd er nagegaan of PEF15 de hypersensitieve respons kan onderdrukken bij tabak, anderzijds werd PEF15 tot expressie gebracht in rijstplanten om na te gaan of PEF15 de rijstplant gevoeliger zou maken voor een infectie met Hirschmanniella oryzae. Er werd ook aandacht besteed aan de analyse van de sequentie van PEF15. Daarnaast werd nagegaan of dit gen in andere parasitaire nematoden terug te vinden is en werd geprobeerd de structuur van PEF15 op te helderen. Er werd reeds aangetoond dat chorismaatmutase tot expressie gebracht wordt in de klieren van de nematoden en dat het hier gebruikte isochorismutase specifiek is voor plant-parasitaire organismen. Er werd nagegaan of deze twee genen gebruikt worden om de plant succesvol te infecteren. Deze genen spelen een rol in de biosynthese van salicylzuur, een hormoon dat belangrijk is bij de plantenafweer. Er werd nagegaan of deze twee genen de hypersensitieve respons kunnen onderdrukken en zo een mogelijke functie hebben in het ontregelen van de plantenafweer.
4
Literatuurstudie 1. Nematoden 1.1
Algemeen
Nematoden of rondwormen behoren tot het uitgebreide fylum van de Nematoda en kunnen ingedeeld worden in drie categorieën naargelang hun levensstijl; vrijlevende, plant-parasitaire en dierparasitaire nematoden. Zowel de vrijlevende als de dierparasitaire nematoden zullen niet verder besproken worden. De nadruk zal voornamelijk liggen op de plant-parasitaire species. Deze kunnen worden opgedeeld in twee grote categorieën; de ectoparasitaire die niet in het plantenweefsel migreren en de endoparasitaire nematoden die minstens een deel van hun levenscyclus in de plant doorbrengen. Verder kunnen de endoparasitaire nematoden opgesplitst worden in sedentaire en migratorische species. De sedentaire nematoden migreren in de plant, induceren de vorming van een voedingsplaats
en
worden
immobiel.
Ze
worden
verder
ingedeeld
in
de
cyst-
of
wortelknobbelnematoden. De migratorische nematoden zullen de wortel binnendringen en migreren doorheen het weefsel tijdens hun levenscyclus (Haegeman et al. 2012b). Plant-parasitaire nematoden gebruiken hun stylet, een naaldachtige structuur, om mechanische schade te veroorzaken of om celwanden uit elkaar te duwen en zo te migreren doorheen het plantenweefsel (Haegeman et al. 2012b). Plant-parasitaire nematoden hebben een heel arsenaal aan effectoreiwitten die gesecreteerd worden via hun stylet in de plant. Deze eiwitten helpen de nematode om de plant succesvol te infecteren door bijvoorbeeld de celwand af te breken of het verdedigingsmechanisme van de waardplant te ontregelen. De nadruk in deze studie zal voornamelijk liggen op migratorische nematoden waarbij Hirschmanniella oryzae als voorbeeld zal gebruikt worden. Hirschmanniella oryzae heeft als belangrijkste gastheer Oryza sativa. De nematode is aangepast aan anaerobe condities waardoor ze gemakkelijk kan overleven wanneer de rijstvelden onder water komen te staan. Naast het feit dat deze nematode zich aangepast heeft aan anaerobe omstandigheden, kan H. oryzae ongeveer zeven maanden overleven in een vochtige bodem in afwezigheid van een rijstplant (Bridge, Plowright, and Peng 2005), daardoor zijn ze de meest abundante nematoden in overstroomde rijst-ecosystemen (Babatola 1981; Maung et al. 2010). Naast H. oryzae zal ook verwezen worden naar Meloidogyne species, een sedentaire wortelknobbelnematode. De Meloidogyne species hebben onder andere dezelfde gastheer als H. oryzae. Hierover zijn al verschillende studies uitgevoerd en de volledige genoomsequenties van twee gerelateerde wortelknobbelnematoden zijn eerder gepubliceerd, namelijk Meloidogyne incognita 5
(Abad et al. 2008) en Meloidogyne hapla (Opperman et al. 2008). Recente studies in het laboratorium toegepaste moleculaire biotechnologie op de universiteit Gent hebben, met behulp van het gesequeneerde transcriptoom, meer licht geworpen op de overlevingsstrategieën van H. oryzae (Bauters et al. 2014). Zowel de cyst- als wortelknobbelnematoden dringen de wortel binnen en induceren een voedingsplaats. Het grootste deel van hun levenscyclus blijven ze immobiel en migreren ze niet. Het onderscheid tussen beide nematoden is dat cystnematoden een syncytium vormen en terwijl de wortelknobbelnematoden een gal met reuzencellen vormen. Zowel het syncytium als de reuzencellen zijn meercellige voedingsplaatsen. Het verschil ligt echter in het feit hoe de meercellige voedingsplaats bekomen wordt. Bij de reuzencellen vinden herhaaldelijke kerndelingen plaats in afwezigheid van celdeling terwijl bij een syncytium naburige cellen worden geïncorporeerd in het syncytium door de afbraak van naburige celwanden (Lambert and Bekal 2002). Bij de cystnematode zal het lichaam van de vrouwelijke nematode opzwellen en doorheen de wortel barsten. De nematoden zullen hierdoor zichtbaar worden voor het blote oog. De mannelijke nematoden zullen de vrouwelijke bevruchten waarna ongeveer 200 tot 400 eitjes zich ontwikkelen die voor het grootste deel in het lichaam aanwezig blijven. Tenslotte sterven de vrouwelijke nematoden, waarna de cuticula begint te verharden en zo een cyste vormt (Tylka 1995). De wortelknobbelnematoden vormen reuzencellen die fungeren als voedingsplaats. Hier zal het lichaam niet afsterven en de cuticula niet verharden, maar leggen de nematoden hun eitjes af in een gelatineuze matrix aan de wortel. De migratorische nematoden zullen in tegenstelling tot de wortelknobbel- en cystnematoden geen syncytium of reuzencellen maken. Ze zullen de plant infecteren, maar worden niet immobiel tijdens hun levenscyclus. Migratorische nematoden voeden zich met het cytoplasma van de cellen tijdens het migreren door de wortel, waardoor celdood optreedt (Davis et al. 2000). Twee gekende voorbeelden van migratorische nematoden zijn de Pratylenchus en Radopholus species.
6
1.2
Morfologie van de nematode
Eén van de redenen waarom nematoden interessant zijn voor biologisch onderzoek, naast het feit dat ze schade aanrichten aan gewassen, is hun eenvoudige anatomie en het feit dat nematoden transparant zijn. Plantparasitaire nematoden hebben een bilaterale symmetrie en meten ongeveer 250 µm tot 12 mm in de lengte en 15 tot 25 µm in de breedte. Nematoden zijn triploblastisch. Dit wil zeggen dat ze drie lichaamslagen hebben namelijk het ectoderm, het mesoderm en het endoderm. De basisanatomie van een nematode is een buis binnenin een andere buis. Ze zijn omringd door een buitenste laag, namelijk de cuticula die gesecreteerd wordt vanuit de onderliggende hypodermis. De spieren zijn longitudinaal vastgehecht
aan de
hypodermis waardoor
nematoden enkel kunnen bewegen in de dorsale ventrale richting. De binnenste buis of het spijsverteringskanaal, loopt Figuur 1. Het basislichaamsplan van vanaf
het
hoofd
tot
aan
de
staart.
Tussen
vrouwelijke
en
mannelijke
het nematoden (Lambert and Bekal
spijsverteringskanaal en de lichaamswand bevindt zich een
2002).
vloeistof. Deze vloeistof voorziet een druk waardoor de lichaamsvorm kan worden behouden en het laat eveneens beweging van de nematoden toe. Aan de kopregio bevindt zich een naald, namelijk de stylet, die de nematoden gebruiken om de celwanden van de plantencellen te doorprikken. Hierdoor kunnen ze voedsel onttrekken aan de plant en kunnen ze eiwitten en metabolieten secreteren in de plant. De stylet staat in verbinding met de oesophagus of de slokdarm die op zijn beurt in verbinding staat met de ingewanden. De ingewanden eindigen in de anus bij de vrouwelijke nematoden en in de cloaca bij de mannelijke nematoden. Aan de slokdarm zijn drie speekselklieren gehecht die zorgen voor de productie van effectoren die met behulp van de stylet in de plant worden gesecreteerd. Vanaf het midden tot aan de achterkant van de nematoden kan men de voorplantingsorganen terugvinden. De meeste nematodespecies hebben zowel mannelijke als vrouwelijke nematoden, maar sommige nematoden kunnen zich ook via parthenogenese voorplanten, zoals Meloidogyne incognita. Bij de mannelijke nematoden worden de testes gekenmerkt door de aanwezigheid van spiculen. Spiculen zijn skeletachtige naalden die tijdens de paring worden gebruikt om sperma in de vagina van de vrouwelijke nematoden te injecteren (Lambert and Bekal 2002). Het basislichaamsplan kan men terugvinden in figuur 1.
7
1.3
Levenscyclus
1.3.1
Migratorische nematoden: H. oryzae
Hirschmanniella oryzae is een migratorische plant-parasitaire nematode die zich in de wortels van de gastheer bevindt. Zowel de larven als de adulte nematoden kunnen de wortel binnendringen op een bepaalde afstand van de worteltip en zich vrij rond bewegen in de luchtkanalen tussen de radiale lamellen van het parenchym. Na een aantal dagen zullen de vrouwtjes eitjes leggen die vier tot vijf dagen in de wortel uitkomen. Een schematische voorstelling van de levenscyclus van H. oryzae kan men terugvinden in figuur 2.
Figuur 2. Schematische voorstelling van de levenscyclus van migratorische nematoden (Kyndt et al., in press)
Adulten planten zich seksueel voor. Uit een studie van Karakas bleek bovendien dat de levenscyclus kan voltooid worden in 33 dagen onder gnotobiotische omstandigheden bij een temperatuur van 28°C. De levenscyclus wordt beschouwd van het J2 tot het volgende J2 stadium. Men inoculeerde negen dagen oude rijstwortels met nematoden van het J2-stadium. De J2 beweegt zich doorheen de wortel en begint zich te voeden. Na ongeveer 12 tot 24 uur voeden, wordt de J2 immobiel en ongeveer drie dagen na de inoculatie komt men in de M2-fase, waarbij de tweede vervelling heeft plaats gevonden. Deze vervellingsperiode (M2) neemt ongeveer twee dagen in beslag waarbij deze zichtbaar wordt binnenin de oude cuticula. De larve blijft groeien tot ze beperkt wordt door de oude cuticula die tenslotte openbarst. Het vervellingsproces kan ingedeeld worden in twee fasen; synthese 8
van de nieuwe cuticula door de hypodermis, gevormd binnenin de oude cuticula en het proces waarbij de oude cuticula doorbroken wordt en de larve eruit migreert. Bij het derde juveniele stadium (J3) begint het voeden terug en negen dagen na inoculatie start de derde vervellingsfase (M3). Het M3 stadium duurt ongeveer drie dagen en resulteert in het J4 stadium, waarbij de J4 zich terug begint te voeden aan de wortel, gevolgd door de vierde vervelling (M4). Vanaf deze fase wordt het verschil tussen mannelijke en vrouwelijke nematoden zichtbaar. Beide beginnen aan de vierde vervelling na 19 dagen. Bij zowel de mannelijke als de vrouwelijke nematode duurt de vervellingsfase 6 dagen. Bij de mannelijke nematoden worden de gonaden, de spicula en het caudale alae gevormd, terwijl bij de vrouwelijke nematoden de vrouwelijke gonaden en vulva gevormd worden. Onmiddellijk na het migreren uit de oude cuticula worden de mannelijke nematoden aangetrokken tot de vrouwelijke, waarbij de mannelijke nematoden zich rond de vrouwelijke nematoden zullen bewegen. Ze beginnen te wrijven met de laterale zijde van hun lip regio, deze beweging gaat door tot de bursa de vulva regio bereikt heeft. De mannelijke nematoden zullen voor- en achteruit bewegen tot wanneer de spicula door de vulva is gepenetreerd. De paring duurt ongeveer 6 tot 10 minuten waarbij de bevruchting plaats vindt. Eitjes beginnen zich te vormen binnen de vrouwelijke uterus. Vooraleer vrouwelijke nematoden hun eitjes afleggen stoppen ze met zich te voeden. Het afleggen van eitjes duurt ongeveer drie minuten. De eerste eitjes worden gelegd 27 dagen na inoculatie (Karakas 2004). 1.3.2
Wortelknobbel- en cystnematoden
De levenscyclus van de wortelknobbelnematoden wordt samengevat in figuur 3. De vrouwelijke nematoden leggen hun eitjes af in een gelatineuze matrix van glycoproteïnes. Deze matrix zorgt ervoor dat de eitjes bij elkaar gehouden worden en beschermt ze tegen extreme omgevingsfactoren. Binnen het ei vindt de embryogenese plaats tot het tweede juveniele stadium (J2). De J2 worden infectieus, zullen de gastheer zo snel mogelijk lokaliseren, penetreren net boven de worteltip en bewegen zich intercellulair door het weefsel. Door het stimuleren van cellen van het protoxyleem en protophloëem zullen de cellen differentiëren in gespecialiseerde voedingscellen, reuzencellen. Wanneer de reuzencel geïnitieerd is, krijgt men een shift naar een sedentaire nematode. Na het doorlopen van een J3- en J4-stadium wordt het adulte stadium bereikt. Zowel bij het J3- en J4stadium ontbreekt de stylet waardoor er niet kan gevoed worden aan de gastheercellen. Tussen elk J-stadium gebeurt een vervelling waarbij de cuticula vernieuwd wordt. Afhankelijk van de omgevingscondities kan de levenscyclus voltooid worden in ongeveer 20 dagen (Abad et al. 2009). Onder gunstige omstandigheden zullen de J2 uit hun eitjes komen en een nieuwe gastheer
9
infecteren. Wortelknobbelnematoden planten zich voornamelijk voor via parthenogenese, dit in tegenstelling tot de cyst- en migratorische nematoden die zich seksueel voorplanten. De cystnematoden hebben een analoge levenscyclus als de wortelknobbelnematoden waarbij er vier juveniele stadia en vier vervellingsstadia worden doorlopen. Het grote verschil tussen wortelknobbelnematoden en cystnematoden, is dat deze laatste een syncytium zullen vormen in plaats van reuzencellen en dat de vrouwtjes buiten de wortel zichtbaar worden met het blote oog. De eitjes worden afgezet in een gelatineuze matrix binnenin de vrouwelijke nematode die aan de buitenkant van de wortel hangt. De eerste vervelling van het J1- tot J2-stadium in de eitjes gebeurt binnenin
het
vrouwelijk
lichaam
waardoor
ze
beschermd
worden
tegen
ongunstige
omgevingsfactoren. Net zoals bij de migratorische nematoden zullen de eitjes enkel uitkomen onder gunstige omstandigheden en zo een nieuwe gastheer infecteren. Het grote verschil tussen wortelknobbel/cystnematoden en migratorische nematoden is dat wortelknobbel/cystnematoden een voedingsplaats induceren en niet verder doorheen de wortel migreren, waardoor er geen necrose optreedt. Ze zijn immobiel tijdens een groot deel van hun levenscyclus.
Figuur 3. Schematische voorstelling van de levenscyslus van cyst- (a) en wortknobbelnematode (b) (Williamson and Gleason 2003).
10
1.4
Symptomen en management van Hirschmanniella oryzae
De symptomen van Hirschmanniella oryzae zijn moeilijk te interpreteren. Er worden in de meeste gevallen geen zichtbare symptomen waargenomen. Er kan wel chlorosis, groeiachterstand, verminderde droge stof gehalten en verlate bloei voorkomen (Babatola and Bridge 1979; Babatola and Bridge 1980; Ichinohe 1988; Khuong 1987). H.oryzae verkiest om de wortel binnen te dringen via de laterale wortels of via de worteltip en migreert doorheen het aerenchym. Wanneer H. oryzae door de wortel migreert zal hij een pad van necrotische cellen achterlaten. Door het necrotisch weefsel en een secundaire invasie van micro-organismen zullen de rijstwortels bruin kleuren (Babatola and Bridge 1980). Hirschmanniella oryzae kan onder controle gehouden worden door verschillende technieken toe te passen, zoals het braak leggen van het land, onkruidbestrijding, het gebruik van resistente cultivars, rotatie met niet-gastheerplanten en via chemische bestrijding. Uit onderzoek is gebleken dat opbrengstverliezen groter zijn in arme bodems, daarom is het aangewezen om de nutritionele status van de bodem te bevorderen (Mathur and Prasad 1972). Naast het opwaarderen van de bodem kan men het braak leggen van de bodem toepassen voor de bestrijding van Hirschmanniella spp. Onderzoek heeft aangetoond dat de grond minstens 12 maanden braak moet liggen in natte condities. In droge condities moet deze periode nog verlengd worden. Tevens moet de bodem vrij zijn van andere gewassen en onkruiden die als gastheer kunnen functioneren. Onkruiden zijn een goede gastheer voor de nematode en een goede onkruidbestrijding zal de nematodenpopulatie terugdringen, zelfs tijdens de groei van rijst (Bridge, Plowright, and Peng 2005). Naast de afwezigheid van onkruiden is de tijd van aanplanting cruciaal. Uit een onderzoek in 1991 is gebleken dat er minder H. oryzae aanwezig was in de basmati rijst in Punjab als die aangeplant werd midden-juli in plaats van midden-juni (Randhawa et al. 1991). Een andere methode om de verspreiding van Hirschmanniella oryzae tegen te gaan is gewasrotatie. Men moet er wel rekening mee houden dat dit enkel mogelijk is wanneer een nat seizoen van rijstproductie gevolgd wordt door een droog seizoen waarbij men een ander gewas teelt. In continue rijstsystemen is gewasrotatie niet mogelijk. Afhankelijk van het gewas dat men gebruikt kan men het risico op schade door Hirschmanniella spp. terugdringen. Er zijn drie gewassen (Sesbania rostrata, Sphenoclea zeylanica en Aeschynomene afraspera) die de populatie van H. oryzae kunnen onderdrukken. Bovendien hebben ze als bijkomend voordeel dat ze het stikstofgehalte in de bodem
11
kunnen verhogen (Germani, Reversat, and Luc 1983; Hendro, Prot, and Madamba 1992; Mohandes, Rao, and Sahu ; Prot et al. 1992). Een andere mogelijkheid is het gebruik van resistente rijstcultivars. Uit een onderzoek van 270 cultivars bleek dat er 6 waren die een verlaagde aantal H. oryzae in hun wortelsysteem hadden (Park, Han, and Lee 1970). Deze variëteiten kunnen als resistent ten opzichte van H. oryzae beschouwd worden. Dan is er nog de optie om de nematoden chemisch te bestrijden. Al moet er rekening gehouden worden met de wetgeving voor het gebruik van bepaalde pesticiden, die het verbod legt op het gebruik van bepaalde chemicaliën zoals methylbromide.
2. Oryza sativa Rijst behoort tot het genus van Oryza waarbij er 2 gedomesticeerde species en 22 wilde verwanten bestaan. De gecultiveerde species zijn Oryza sativa en Oryza glaberrima. Oryza sativa wordt wereldwijd geteeld terwijl Oryza glaberrima voornamelijk geteeld wordt in West-Afrika (International Rice Research Institute, 2001. Rice Research and Production in the 21st Century). De nadruk zal voornamelijk liggen op de interactie tussen nematoden en Oryza sativa. Oryza sativa is een monocotyl die als modelplant kan dienen in onderzoek naar de plant-pathogene interacties. Het is het belangrijkste voedingsgewas ter wereld aangezien het voedselzekerheid geeft voor meer dan de helft van de wereldpopulatie (Fernandez, Casaban, and De Waele 2013). De wereldproductie van rijst bedroeg 672 miljoen ton in 2010 en rijst kan geteeld worden in vijf ecosystemen: irrigated, upland, rainfed lowland, deepwater en tidal wetlands. Meer dan 90% van de wereldproductie, ongeveer 142 x 106 ha is gelokaliseerd in Azië (DAP,2011). Verder kan Oryza sativa onderverdeeld worden in de twee belangrijkste subsoorten namelijk Oryza sativa subspecies japonica en Oryza sativa subspecies indica. Nematoden zijn de belangrijkste pest op deze gewassen en er zijn meer dan 35 genera en 130 species van plant-parasitaire nematoden geassocieerd met rijst (Haegeman et al. 2012b; Prot and Rahman 1994). Doordat de volledige genoomsequentie van rijst gekend is, kan het als een model dienen voor de interactie tussen nematoden en monocots (Goff et al. 2002). Elk van de vijf ecosystemen heeft specifieke plant-parasitaire nematoden. Eén van de belangrijkste plant-parasitaire nematoden op rijst is H. oryzae. Deze parasiet tast ongeveer 58% van de rijstproductie aan waardoor H. oryzae 25% opbrengstverlies kan veroorzaken
(Hollis and
Keoboonrueng 1984). H. oryzae is volledig aangepast aan flooding condities waardoor het de meest 12
voorkomende nematode is in flooding/irrigated rijstsystemen (Bridge, Plowright, and Peng 2005). Door socio-economische veranderingen en milieuveranderingen is het watergebrek in Zuidoost-Azië gestegen. Dit heeft ervoor gezorgd dat er een verschuiving is gekomen van traditionele paddysystemen,
die
een
grote
hoeveelheid
water
gebruiken,
naar
waterbesparende
rijstproductiesystemen. Daardoor worden andere species bevoordeeld zoals bijvoorbeeld Meloidogyne graminicola, een wortelknobbelnematode (De Waele D. and Elsen 2007). De meeste wortelknobbelnematoden veroorzaken geen diagnostische symptomen op rijst. Dit zorgt ervoor dat infecties bovengronds niet direct zichtbaar zijn.
3. Plant-nematode interacties 3.1
Algemeen
Tijdens de interacties tussen de nematoden en zijn gastheer worden heel wat signalen uitgewisseld. Plant-parasitaire nematoden secreteren effectoren die geproduceerd worden in de klieren van de nematoden en die vervolgens in de plant gebracht worden door de stylet. Deze effectoren helpen om de gastheer succesvol te infecteren. Er zijn verschillende soorten effectoren;
celwand modificerende enzymen; bv beta-1,4-endoglucanase
proteasen; bv cysteïneprotease
effectoren voor de bescherming van de nematode tegen fytotoxines; bv glutathione-Stransferase
suppressie van het plantenimmuunsysteem; bv SPRYSEC-eiwitten
effectoren die de hormoonpathway gaan manipuleren; bv chorismaatmutase
De meeste effectoren worden gesecreteerd in het plantenweefsel door de stylet. De drie faryngeale kliercellen staan in verbinding met de stylet, analoog aan het bacterieel type III secretiesysteem waarbij de gelijkaardige effectoren geleverd worden aan de gastheer via een pilus (Alfano and Collmer 2004). De drie faryngeale kliercellen, waarvan één dorsaal en twee subventraal gelegen zijn, secreteren het grootste deel van de effectoren. Naast de productie van eiwitten door de faryngeale kliercellen zijn er nog andere organen die eiwitten kunnen secreteren, namelijk de amfiden en de hypodermis. De hypodermis zal eiwitten afscheiden aan de cuticula. In figuur 4 kan men de belangrijkste organen die gebruikt worden voor de secretie van effectoren terugvinden. Niet alle gesecreteerde eiwtten zijn effectoren. Er is een indicatie nodig dat de gesecreteerde eiwitten een actieve functie zullen vervullen in het plantenweefsel om parasitisme te promoten zoals de inductie van de plantenafweer of veranderingen in de plantencelstructuur en -functie. (Haegeman et al. 2012b). De meeste 13
effectoren bevatten een N-terminaal signaalpeptide waardoor ze kunnen gesecreteerd worden. Echter niet alle effectoren bevatten een N-terminaal signaalpeptide. In de aardappelcystnematode Globodera rostochiensis is een peroxidase geïdentificeerd waarbij het N-terminaal signaalpeptide ontbrak. Men veronderstelt dat deze eiwitten kunnen gesecreteerd worden door de nematode door een nog ongekend mechanisme (Robertson et al. 2000). In een andere aardappelcystnematode namelijk Globodera pallida is een annexine gen teruggevonden dat gesecreteerd wordt zonder de aanwezigheid van een signaalpeptide (Luca Fioretti et al. 2001). Niet enkel in Globodera species zijn effectoren teruggevonden zonder N-terminaal signaalpeptide, maar ook in wortelknobbelnematoden bijvoorbeeld een 14-3-3 eiwit, teruggevonden zonder signaalpeptide. Het 14-3-3 eiwit speelt een potentieel een rol spelen bij plant-parasitaire interacties omdat het ook door verschillende dierparasitaire nematoden gesecreteerd wordt (Jaubert et al. 2002). Het is opmerkelijk dat sommige eiwitten, zoals celwand modificerende enzymen, bij bepaalde species aanwezig zijn, terwijl ze bij andere nematoden niet terug te vinden zijn (Jones, Furlanetto, and Kikuchi 2005). Veel van deze genen zijn sterk homoloog aan bacteriële sequenties waardoor men veronderstelt dat deze genen via horizontale gentransfer (HGT) verworven zijn door de nematoden. Dit kan doordat sommige nematoden in dezelfde niche leven als bepaalde bacteriën. Doordat de meeste genen tot grotere genfamilies behoren veronderstelt men dat na HGT verschillende genduplicaties hebben plaats gevonden (Davis, Haegeman, and Kikuchi 2011). Buiten HGT zijn herhaaldelijke puntmutaties en positieve selectie belangrijk wanneer men de evolutie van effectoren wil bestuderen. Puntmutaties zijn veranderingen in de aminozuursequentie van het eiwit. Door een veranderende aminozuursequentie kan de functie van het eiwit beïnvloed worden. Een andere manier om een groot gamma aan effectoren te produceren is alternatieve splicing. Dit houdt in dat er verschillende splice sites gebruikt worden waar bepaalde intronen niet zullen worden uitgespliced. Hierdoor zal een gen kunnen coderen voor verschillende eiwitten (Rosso and Grenier 2011).
14
Figuur 4. Schematische voorstelling van organen die belangrijk zijn bij de secretie van effectoren (a) dorsale klieren (b) hypodermis/cuticula (c) subventrale klieren (d) amfiden (Haegeman et al. 2012b)
3.2
Celwand modificerende eiwitten
De plantencelwand is een dikke sterke structuur gevormd door een extensief netwerk van cellulose microfibrillen, hemicellulose, pectines en eiwitten (Cosgrove 2005). Nematoden zullen de celwand mechanisch beschadigen met hun stylet en scheiden vervolgens een gamma aan effectoren uit om de celwand af te breken of te modificeren (Haegeman et al. 2012b).
Celwand afbrekende enzymen
Het eerst ontdekte enzym voor de degradatie van celwanden was beta-1,4-endoglucanase (Smant et al. 1998a) dat cellulose zal afbreken, de belangrijkste component van de celwand. Sindsdien zijn verschillende glycosylhydrolase family 5 (GHF5) cellulasen geïdentificeerd in verschillende nematode species. Naast het beta-1,4-endoglucanase zijn er andere celwand afbrekende enzymen geïdentificeerd in verschillende nematodenspecies. Een aantal voorbeelden zijn pectaatlyase, poygalacturonase, xylanase, arabinogalactan-endo-1,4-betagalactosidase en arabinase. Al deze genen zijn sterk homoloog aan bacteriële genen waardoor men denkt dat deze zijn verworven door horizontale gentransfer (Haegeman et al. 2012b).
Celwand modificerende eiwitten
Nematoden zullen naast enzymen die de celwand gaan afbreken, ook andere eiwitten produceren, zoals expansines en cellulose bindende eiwitten. Expansines zullen de niet-covalente bindingen 15
tussen polysachariden verbreken waardoor ze toegankelijker worden voor hydrolytische enzymen. Cellulose bindende eiwitten zijn reeds geïdentificeerd in wortelknobbel- en cystnematoden maar hun potentiële rol in migratie is nog niet opgehelderd. In Heterodera schachtii is het aangetoond dat het cellulosebindend eiwit kan binden met het pectinmethylesterase van de plant. Het pectinmethylesterase kan het niveau van methylesterificatie van pectine in de celwand verminderen. Men veronderstelt dat het cellulose bindend eiwit de activiteit van het plantenzyme zal verhogen (Haegeman et al. 2012b). 3.3
Protease
Een andere mogelijke groep van effectoren zijn proteasen. Nematoden coderen een groot gamma aan proteasen, maar er worden slechts enkele gesecreteerd. Het is mogelijk dat protease eiwitten de celwandeiwitten of eiwitten betrokken in de plantenafweer afbreken. Voor een eiwit, gelijkaardig aan aspartylproteasen gesecreteerd door Meloidogyne incognita, heeft men aangetoond dat het accumuleert aan de wand van de reuzencellen (Vieira et al. 2011). In het secretoom van M. incognita zijn cysteïne proteasen teruggevonden (Bellafiore et al. 2008). Cysteïne zorgt voor disulfide bruggen in het eiwit, wanneer deze verbroken worden zal het eiwit zijn structuur verliezen en bijgevolg zijn functie. 3.4
Bescherming van de nematode
Alle endoparasitaire nematoden komen in contact met het afweermechanisme van de plant. Ze moeten dit proberen te onderdrukken of ontwijken om te kunnen overleven. Hiervoor hebben ze verschillende strategieën ontwikkeld. Voor sedentaire nematoden is de bescherming van de voedingsplaats essentieel, omdat ze zich voeden aan levend plantenweefsel. Planten produceren een reeks toxines met anti-pathogene activiteit, zoals bijvoorbeeld phytoalexines, isoflavonoïden en terpenoïden. Uit een onderzoek van Campbell bleek dat dierparasitaire nematoden glutathione-S-transferase (GST) gebruiken om toxische componenten af te breken (Campbell et al. 2001). Alhoewel er nog geen biochemische data is kan men veronderstellen dat GST ook belangrijk is voor plant-parasitaire nematoden (Dubreuil et al. 2007). Een andere strategie om een directe aanval door de plant te onderdrukken of te ontwijken is het interactiemechanisme tussen de plant en de pathogeen. Het interactiemechanisme kan gezien worden als een zig-zag model waarbij men verschillende fases kan onderscheiden. Het zig-zag model wordt weergegeven in figuur 5. In een eerste fase zal de plant microbial/pathogen-associated molecular patterns (MAMPs/PAMPs) herkennen die eigen zijn aan bepaalde pathogenen. Deze MAMPS/PAMPS worden specifiek herkend door de pattern recognition receptors (PRRs) van de 16
plant. Een klassiek voorbeeld van een PAMP is het 22 aminozuur lange epitoop in flagelline, een structureel eiwit van het bacterieel flagellum (Smant and Jones 2011). De herkenning van MAMPs/PAMPs door PRRs zal PAMP-triggered immunity (PTI) activeren. De pathogenen proberen de activatie van PTI te verhinderen door effectoren te secreteren. Deze effectoren zullen interfereren met de PTI-respons en dit zal resulteren in het zogenaamde effector triggered susceptibility (ETS). Wanneer echter één van de effectoren herkend wordt door een plant NB-LRR (nucleotide binding leucine rich repeat) eiwit zal de effector-triggered immunity (ETI) respons geactiveerd worden. Door een aanhoudende ETI respons kan de plant resistent worden tegen een specifieke pathogeen. Dit resulteert meestal in een hypersensitieve respons (HR) waarbij lokale celdood optreedt. Via horizontale gentransfer werden de eerste effectoren verworven en door mutatie in reeds verworven genen kunnen pathogenen nieuwe strategieën ontwikkelen om ETI te ontwijken (Jones and Dangl 2006). Dit zig-zag model kan ook toegepast worden op nematoden. Een ander soort moleculen die kan herkend worden door de plant zijn damage-associated molecular patterns (DAMPs). DAMPs zijn afbraakproducten van de celwand die kunnen ontstaan wanneer een nematode (of een andere pathogeen) de plant tracht te infecteren. Endoparasitaire nematoden secreteren een reeks effectoren die de celwand kunnen degraderen. De afbraakproducten kunnen herkend worden door de plant als signalen die het afweermechanisme zullen activeren.
Figuur 5. Het Zig-Zag model waarbij de continue evolutie bij zowel waardplant als pathogeen beschreven wordt. PAMP: Pathogen Associated Molecular Patterns, PTI: PAMP Triggered Immunity, ETS: Effector Triggered Susceptibility, ETI: Effector Triggered Immunity, HR: hypersensitive respons (Jones and Dangl 2006).
Met behulp van transcriptoom- en genoomanalyses zijn kandidaateffectoren onderzocht, meestal behoren deze tot grote genfamilies. Een voorbeeld van een dergelijke genfamilie zijn de SPRYSECproteïnen van de aardappelcystnematoden G. rostochiensis en G. pallida. Voor één van deze genen, 17
SPRYSEC19, heeft men aangetoond dat het eiwit interageert met dat van een tomaat resistent gen homoloog (SWF15). Aangezien de HR niet geactiveerd wordt, ondanks de interactie tussen SWF15 en SPRYSEC19, is het mogelijk dat SPRYSEC19 interageert met SWF15 of andere mogelijke eiwitten die de ETI zullen onderdrukken (Rehman et al. 2009). Verscheidene plant-parasitaire nematoden, waaronder de migratorische nematoden, produceren chorismaatmutase (CM) dat een invloed zal uitoefenen op het afweermechanisme van de plant. 3.5
Effectoren die invloed hebben op de hormoonpathways
Plantenhormonen of fytohormonen zijn kleine signaalmoleculen die verschillende processen regelen in de plant; zoals het afweermechanisme, plantgroei en ontwikkeling. Nematoden secreten ook effectoren die op de hormoonpathways kunnen inwerken.
Salicylzuur, jasmonaat, ethyleen en abscisinezuur
In een studie van Nahar et al. werd de rol van salicylzuur (SA), jasmonaat (JA), ethyleen (ET) en abscisinezuur (ABA) beschreven. De studie onderzocht de rol van deze fytohormomen op de plantenafweer wanneer de gastheer rijst geïnfecteerd werd met H. oryzae. In de rijstafweer tegen H. oryzae zijn minstens drie pathways, namelijk SA, JA en ET belangrijk terwijl ABA een antagonistische rol heeft. ABA zal ervoor zorgen dat de rijstplant vatbaarder wordt voor migratorische nematoden. De resultaten bekomen uit de studie tonen aan dat de balans tussen deze hormonen belangrijk is voor de rijst- H. oryzae interactie. Salicylzuur kan geproduceerd worden via twee pathways, de fenylpropanoïd- en de isochorismaatpathway. Via de fenylpropanoidpathway worden nog andere moleculen geproduceerd, namelijk flavonoïden en lignine. Deze moleculen zijn belangrijk voor de plant en vormen de eerste barrière voor de pathogeen (Dixon et al. 2002). Afhankelijk van het type pathogeen zal een complex netwerk tussen de hormonen zorgen voor een efficiënte afweerreactie. Algemeen wordt aangenomen dat SA-afhankelijke afweer actief is tegen pathogenen met een biotrofe levensstijl, terwijl JA/ET-afhankelijke afweer vooral belangrijk is tegen necrotrofe pathogenen (Glazebrook 2005). Dit is een veralgemeende voorstelling, maar vaak is het afhankelijk van het organisme welke pathway belangrijk is voor de afweer van de plant. Bij de biotrofe M. graminicola heeft men aangetoond dat de JA/ET pathway een belangrijker positief effect heeft dan de SA pathway (Nahar et al. 2011).
Chorismaatmutase
Er zijn verschillende plantpathogenen die chorismaatmutase (CM) produceren. Chorismaat is de precursor in de biosynthese van aromatische aminozuren, maar chorismaat is ook belangrijk voor de 18
productie van indol-3-azijnzuur (IAA) en salicylzuur, een afweer-gerelateerde component (Williamson and Gleason 2003). Chorismaatmutase is een belangrijke regulator in de shikimaat pathway, waarbij chorismaat omgezet wordt naar lignine of fytoalexines (Hu, Meng, and Wise 2009). Het chorismaat kan ook omgezet worden via twee verschilelnde pathways naar salicylzuur, de fenylpropanoïd- en de isochorismaatbiosynthese-pathway (Wildermuth et al. 2001). De fenylpropanoidbiosynthesepathway zal chorismaat met behulp van het CM omzetten naar een intermediair in de productie van fenylalanine. Deze pathway zal minder efficient SA produceren dan de isochorismaatpathway omdat naast SA ook lignine, flavonoiden en fytoalexines worden gevormd. De isochorismaatpathway is verantwoordelijk voor ongeveer 90% van de productie van salicylzuur (Vogt 2010). Men veronderstelt dat CM zorgt dat chorismaat niet meer omgezet wordt naar salicylzuur via de isochorismaatpathway. Dit heeft als gevolg dat er minder salicylzuur geproduceerd wordt, waardoor het afweermechanisme verstoord wordt. De biosynthese van salicylzuur is weergegeven in figuur 6.
Figuur 6. Schematische voorstelling van de salicylzuurbiosynthesepathways. De synthese van SA is mogelijk via fenylalanine of via isochorismaat. CM: chorismaatmutase, ICM: isochorismatase, ICS: isochorismaat synthase, IPL: isochorismaat pyruvaat lyase, SA: salicylzuur, PAL
Enerzijds zal CM een invloed hebben op de salicylzuur pathway maar anderzijds zal CM ook de auxine homeostase manipuleren. Chorismaat is een precursor voor auxine. Men veronderstelt dat CM ervoor zal zorgen dat chorismaat afgebroken wordt, waardoor er minder efficiënt salicylzuur gevormd wordt. Dit zou leiden tot een verhoogd auxine niveau. 19
Een
Effectoren die gelijkaardig zijn aan fytohormonen andere
manier
waarop
nematoden
de
hormoonpathways
beïnvloeden
is
door
plantpeptidehormonen na te bootsen. Hierdoor kunnen ze de plantsignaalpathway blokkeren, moduleren of nabootsen. De clavata signaalcomponenten (CLV) zijn specifiek voor het plantenrijk en behoren tot een grote genfamilies, waaronder receptor-like kinase (CLV1), receptor-like protein (CLV2) en CLV3/ENDOSPERM REGION (ESR)-gerelateerde eiwitten die samen CLE (CLV like elements) genoemd worden. In alle CLV gemedieerde processen veronderstelt men dat CLE-peptiden ofwel cellulaire differentiatie processen promoten of onderdrukken om het evenwicht tussen celproliferatie en -differentiatie te behouden. Men veronderstelt dat het nematode CLE-peptide de voedingsplaats beschermt door celdeling en -differentiatie te reguleren (Mitchum, Wang, and Davis 2008). Verschillende cystnematoden produceren eiwitten met een C-terminaal motief gelijkaardig aan het plant CLAVATA3 (CLV3) peptide. In cystnematoden worden de genen die coderen voor gesecreteerde CLV3-like eiwitten specifiek tot expressie gebracht in de dorsale kliercellen(Haegeman et al. 2012b). Verschillende studies bevestigen dat de cystnematode CLE peptiden biologisch actieve plant CLE-peptiden nabootsen en op die manier de plant CLE signaalpathways kunnen stimuleren (Bakhetia, Urwin, and Atkinson 2007;Wang et al. 2005). Naast CLE-peptiden, die intensief bestudeerd zijn, is er bewijs dat nematoden andere plantenhormonen produceren, maar functionele studies ontbreken hier nog. Cytokinines en geconjugeerd auxine werden teruggevonden in secreties van M. incognita en H. schachti; maar hun functie moet nog verder onderzocht worden (De Meutter J. et al. 2005; De Meutter J. et al. 2003).
4. Transformatie 4.1
Algemeen
Het doel van transformatie is een bepaald gen transiënt of stabiel tot expressie te brengen in de plant om zo een gewijzigd fenotype te verkrijgen. Er zijn verschillende methoden die kunnen onderverdeeld worden in twee grote categorieën: de directe en de indirecte methoden. Het grote verschil tussen de directe en indirecte methodes is dat indirecte methoden gebruik maken van Agrobacterium tumefaciens of Agrobacterium rhizogenes om het DNA in de plant te introduceren. Bij directe methoden, zoals micro-injectie, waarbij het gen van interesse rechtstreeks in de cel wordt geïnjecteerd, maakt men geen gebruik van een Agrobacterium. De nadruk wordt voornamelijk gelegd op Agrobacterium gemedieerde transformatie. Deze methode zal gebruikt worden om rijst te transformeren zodat het een gewenst gen stabiel tot expressie brengt, hierbij selecteert men voor cellen die het gen stabiel in het genoom geinsereerd hebben. Hier 20
zijn in de praktijk al enkele toepassingen, zoals bijvoorbeeld Golden rice waarbij men de nutritionele kwaliteit van rijst zou verhoogd heeft. Golden rice bevat een hoger gehalte aan β-caroteen, dat een precursor van vitamine A is. Zo tracht men het tekort aan vitamine A te verminderen zodat blindheid en andere vitamine A-gerelateerde aandoeningen vermeden kunnen worden (Chen, Lin, and Zhang 2009) Een ander voorbeeld waarbij Agrobacterium gemedieerde transformatie gebruikt wordt, is de transiënte transformatie. Transiënte transformatie is van voorbijgaande aard en het gen zal niet in het genoom insereren waardoor het gen niet wordt doorgegeven op de dochtercellen zoals bij stabiele transformatie. Men zal transiënte transformatie gebruiken als een snelle test bijvoorbeeld om de mogelijke onderdrukking van de hypersensitieve respons na te gaan. Hierbij wordt nagegaan of de genen die nu transiënt tot expressie komen, de hypersensitieve respons van de plant kunnen onderdrukken. Dit wordt voornamelijk gebruikt om de functie van bepaalde effectoreiwitten na te gaan. 4.2
Agrobacterium gemedieerde transformatie
Bij Agrobacterium gemedieerde transformatie zal men gebruik maken van de Gram-negatieve bacterie A. tumefaciens. A. tumefaciens kan van nature de plant transformeren en is de veroorzaker van de kroongalziekte. Het zal de plant transformeren met een DNA-segment, namelijk het transferDNA (T-DNA), van het tumor-inducerend (Ti)-plasmide (Gelvin 1998). Het plasmide is ongeveer 200 kb groot. Het T-DNA codeert voor genen die betrokken zijn in de hormoonbiosynthese en de synthese van opines. Vanuit de bacterie kunnen er meerdere T-DNA kopijen overgebracht worden naar de plantencel waarmee de bacterie contact heeft gemaakt. Het T-DNA kan stabiel geïntegreerd worden in het plantengenoom waardoor een transgene plant wordt bekomen. Het T-DNA is geflankeerd door een rechter- en linkerborder die belangrijk zijn voor transformatie. De vir-genen die gelegen zijn op het Ti-plasmide coderen voor bacteriële virulentieproteïnen (vir) en zijn belangrijk voor het produceren van het T-DNA en transfer naar de plantencelkern (Tzfira et al. 2004). Het proces van T-DNA-transfer en -integratie kan onderverdeeld worden in verschillende stappen (Figuur 7). Het proces begint met de vasthechting van de bacterie aan de plantencel en dit gebeurt via een netwerk van cellulosevezels die geproduceerd worden door de bacterie. De plant zal hierdoor signaalmoleculen uitscheiden die de transcriptie van de vir-regio induceren. Deze plantensignalen bestaan uit fenolische componenten zoals acetosyringone. Het herkennen van deze plantensignalen gebeurt door het VirA/VirG complex en dit complex zal alle genen van de vir-regio activeren. Het VirG eiwit dient als een transcriptiefactor. VirD1 en VirD2 zijn betrokken bij de productie van de enkelstrengige T-DNA moleculen, waarbij het VirD2 covalent zal gebonden worden aan het 5’ 21
uiteinde van het T-DNA. Dit complex wordt het T-DNA complex genoemd en zal getransporteerd worden uit de bacterie via een secretiesysteem. Bovendien zullen de VirE eiwitten geëxporteerd worden uit de bacterie en aan het enkelstrengig T-DNA binden in de gastheercel. De binding van de VirE eiwitten aan het T-DNA zal het T-DNA beschermen tegen de inwerking van nucleasen en zorgt voor de juiste vorm voor het transport naar de nucleus. Het T-DNA gaat de nucleus binnen via het nucleaire porie complex (NPC). Het T-DNA zal ontmanteld worden en integreren in het genoom (Tzfira et al. 2004). Bij het genereren van een transgene plant wordt gebruikt gemaakt van een TDNA-vector waarbij de genen die coderen voor de hormoonsynthese en de opine-biosynthese vervangen worden door het gen van interesse en eventueel een selectiemerker.
Figuur 7. Een model voor Agrobacterium-gemedieerde gentransfer. Het transformatieproces bestaat uit verschillende stappen en begint met (1) vasthechting aan de plantencel via een cellulosenetwerk. (2) Specifieke plantensignalen worden via VirA/VirG VirG herkend en zullen Agrobacterium aantrekken. (3) Activatie van de andere vir-genen. (4) Er wordt een T-DNA gegenereerd door VirD1/D2 en (5) het VirD2-DNA complex wordt samen met andere Vir-eiwitten overgebracht naar het cytoplasma van de plant. (6) Associatie met VirE2 (7) gevolgd door import van het T-DNA in de nucleus. In de stappen (8), (9) en (10) zal het T-DNA migreren naar het punt van integratie, de vireiwitten laten los en het T-DNA integreert in het plantengenoom (Tzfira et al. 2004).
22
Materiaal en methode 1. Oppikken van een gen uit een cDNA-bank 1.1
Oppikken van een gen via PCR
Het oppikken van een gen uit een cDNA-bank wordt uitgevoerd met genspecifieke primers. De primers per gen kunnen terug gevonden worden in bijlage I Primers. PCR-instellingen: Programma
reactiemengsel
5’ 30” 40” 60” 10’
0,8 µL cDNA-bank 1,5 µL Forward primer (5mM) 1,5 µL Reverse primer (5mM) 1,5 µL dNTP’s (5mM) (Life Technologies) 2,5 µL Extrabuffer (VWR) 0,1 µL Taq-polymerase (VWR) 17,6 µL H2O
94°C 94°C 55°C 72°C 72°C
35 cycli
Het resultaat van de PCR kan men analyseren door het PCR-product te laden op een 1,5% agarosegel. De agarosegel giet men in een opvangbakje waarin een kam geplaatst wordt die zorgt voor het vormen van verschillende slotjes in de gel. De gestolde gel wordt overgebracht in een elektroforesebak met TAE-buffer (Tris-Acetaat-EDTA). Het geamplificeerd DNA wordt gemengd met 3 µL loading dye en hiervan wordt 10 µL in de slotjes gepipetteerd. Bij elke gel wordt in 1 slotje 5 µL DNA-ladder (MassRuler, Thermo Scientific) gepipetteerd om de grootte van de fragmenten mee te vergelijken. Tenslotte wordt de gel gelopen gedurende 20 min bij een voltage van 135 mV.
Nadien wordt de gel overgebracht naar een ethidiumbromide-bad (EtBr) gedurende 15 min om het DNA zichtbaar te maken. Na 15 min wordt de gel naar de Geldoc (Bio-Rad) overgebracht waar met behulp van UV-licht, een digitale camera en QuantityOne-Software een foto wordt genomen van de aanwezige bandjes.
23
1.2
Ligatie in pGEM-T-vector
Om de geampliceerde DNA-fragmenten verder te kunnen gebruiken wordt een ligatie uitgevoerd door de volgende producten (Promega©) samen te voegen en overnacht te incuberen bij 4°C. In figuur 8 wordt een schematische voorstelling van de pGEM-T vector weergegeven. 3 µL 2,5 µl 0,5 µL 0,5 µL
PCR-product 2x ligasebuffer pGEM-T easy vector T4-DNA-ligase
Figuur 8. De pGEM-T vector. Er is een multikloningssite aanwezig met lacZ. Amp: ampicillineresistentie. Ori: origin of replication
1.3
Heat-shock transformatie van DH5α E. coli-cellen
Na de ligatie voert men een hitteschok transformatie uit zodat de vector kan opgenomen worden in de hitteschok competente cellen.
Ontdooi 50 µL hitteschok competente cellen op ijs
Voeg 4 µL ligatieproduct toe en incubeer 10 min op ijs
Plaats het mengsel 45 seconden in een warmwaterbad dat verwarmd is tot exact 42°C
Plaats het mengsel gedurende 1 min op ijs
Voeg het mengsel in de laminaire flow toe aan 1 mL steriel SOC-medium in een steriel bacteriekweekbuisje
Incubeer 1 uur bij 37°C op de schudder
Plaat 150 µL opgegroeide cellen uit op LB-medium met aangepast antibioticum
Incubeer overnacht bij 37°C
De getransformeerde cellen zijn DH5α E. coli cellen die nadien opgekweekt kunnen worden. Het LBmedium dat men hier gebruikt bevat 100 µg/mL carbenicilline en 40 µL van een 20 mg/mL X-gal oplossing. X-gal zorgt ervoor dat de negatieve kolonies, die het insert niet bevatten, blauw kleuren.
24
Samenstelling LB-medium voor 500 mL:
Weeg 12,5 g LB BROTH HIGH SALT (Duchefa) af en los op in 500 mL gedestilleerd water
Autoclaveer en bewaar bij kamertemperatuur
Opmerking: voor vast LB-medium wordt 1,5% agar toegevoegd
Samenstelling SOC-medium voor 100 mL:
Los 2,00 g trypton, 0,50 g gistextract en 0,50 g NaCl op in 97 mL gedestilleerd water
Voeg 1 mL 1 M NaCl en 0,25 mL 1 M KCl toe
Autoclaveer en laat afkoelen tot kamertemperatuur
Voeg 1 mL gefiltersteriliseerde Mg2+- stockoplossing toe in de flow (20,33 g MgCl2.6H2O + 24,65 g MgSO4.7H2O oplossen in 100 mL gedestilleerd water, filtersteriliseren bij kamertemperatuur)
Voeg 1 mL 2M gefiltersteriliseerd glucose-stockoplossing toe in de flow
Leng zonodig aan tot 100 mL met steriel gedestilleerd water
Filterteriliseer over een 0,2 µm filter
Check de pH, aanpassen tot pH 7 met 10 M NaOH
Bewaar bij 4°C
1.4
Kolonie-PCR
Nadat de competente cellen zijn opgegroeid op een LB-plaat met aangepaste antibioticum, wordt een kolonie-PCR uitgevoerd ter controle van de ingebouwde fragmenten. Hiervoor schraapt men met een steriele tip een kolonie af en maakt men een afdruk op een nieuwe plaat LB-medium met aangepast antibioticum. Nadien plaats men de tip in een PCR buisje met 10 µL gedestilleerd water en pipetteert men goed op en neer. Per construct schraapt men minstens 8 verschillende kolonies af. Vervolgens worden de bacteriën gelyseerd door 10 min te incuberen bij 94°C. Nadien wordt een PCR uitgevoerd volgens volgende PCR-instellingen. Programma
Reactiemengsel
5’ 30” 50” 60” 5’
10 µL gelyseerde bacteriën 0,5 µL dNTP’s (5 mM) (Life Technologies) 0,5 µL Forward primer (5mM) 0,5 µL Reverse primer (5mM) 3 µL Extrabuffer (VWR) 0,1 µL Taq-polymerase (VWR) 15,4 µL H2O
94°C 94°C 55°C 72°C 72°C
35 cycli
25
Het resultaat van de PCR kan men analyseren door het PCR-product te scheiden op een 1,5% agarosegel en te visualiseren door middel van EtBr en de Geldoc. De positieve kolonies worden van de LB-plaat afgeschraapt met een steriele tip en overgebracht naar een steriel bacteriekweekbuisje met 5 mL vloeibaar medium en het aangepaste antibioticum. De bacteriekweekbuisje worden overnacht geïncubeerd bij 37°C op een schudder. In deze kolonie-PCR wordt gewerkt met SP6- en T7-primers die binden op de pGEM-T vector, net naast het insert. Het aangepast antibioticum is carbenicilline met een concentratie van 100 µg/mL. 1.5
Plasmide-extractie
Na het opgroeien van de positieve kolonies wordt een plasmide-extractie uitgevoerd volgens de Genelute™ Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich).
Tevens wordt 750 µL bacteriesuspensie toegevoegd aan 750 µl 50% glycerol om een glycerolstock aan te maken. Dit staal kan bewaard worden bij -80°C. Na de plasmide-extractie wordt de concentratie en de zuiverheid van het plasmide bepaald met behulp van de Nanodrop (Thermo Scientific) met de elutiebuffer als blanco. Bij voldoende hoge concentratie en zuiverheid maakt men de stalen klaar voor sequenering. De stalen worden verdund tot een finale concentratie van 100 ng/µL en 20 µL hiervan wordt opgestuurd naar LGC genomics (Duitsland). De ontvangen sequenties worden door middel van de online tool Vecscreen te vinden op de website van NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) gezuiverd van vectormateriaal. Vervolgens wordt een blast uitgevoerd op de gekregen sequentie ten opzichte van de sequentie uit de EST-databank. Deze blast wordt uitgevoerd door de online tool blastn te gebruiken op de website van NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). De sequenties worden gebruikt als basis voor het bepalen van de eiwitsequentie wanneer het gen in een expressievector werd geligeerd. Met behulp van de online Expasy-Translate tool worden de zes mogelijk readings frame bekomen en wordt nagegaan of het eiwit in het juiste frame aanwezig is.
26
1.6
Additie van attb-sites
Voor het uitvoeren van een gatewaycloning wordt gestart met de additie van attb sites aan het insert. Dit gebeurt aan de hand van 2 opeenvolgende PCR-reacties via primers met overhangende uiteinden. PCR1-instellingen: Programma
Reactiemengsel
1’ 15” 25” 1’30” 15” 25” 1’30” 5’
1 µL 1 µL 1 µL
94°C 94°C 45°C 72°C 94°C 54°C 72°C 72°C
5 cycli
15 cycli
plasmide-extract (1:50 verdunning) dNTP’s (5 mM) (Life technologies) Forward primer (5mM) (genspecifiek F primer met een deel van attb1) 1 µL Reverse primer (5mM) (genspecifiek R primer met een deel van attb2) 3 µL Extrabuffer (VWR) 0,5 µL Taq-polymerase (VWR) 22,5 µL H2O
PCR2 instellingen: Programma
Reactiemengsel
1’ 15” 25” 1’30” 15” 25” 1’30” 5’
3 µL PCR1 1 µL dNTP’s (5 mM) (Life technologies) 1 µL attb1 primer (5mM) 1 µl attb2 primer (5mM) 3 µL Extrabuffer (VWR) 0,5 µL Taq polymerase (VWR) 20,5 µL H2O
94°C 94°C 45°C 72°C 94°C 54°C 72°C 72°C
5 cycli
15 cycli
2. Gatewaycloning 2.1 -
BP reactie Ligatie Voeg volgende componenten samen in een 1,5 mL Eppendorf-buisje op kamertemperatuur en meng: 2 µL Attb-PCR product 2 µL Donor vector (pDNR221) 1 µL BP CLONASE II enzyme (Life Technologies)
Microcentrifugeer kort en incubeer overnacht bij 25°C
27
-
Hitteschok transformatie van DH5 alfa E. coli-cellen
-
Volgens protocol 2.1.3 met LB-medium met 50 ng/mL kanamycine.
Kolonie-PCR
Volgens het protocol 2.1.4 met genspecifieke primers en vloeibaar medium met 50 µg/mL kanamycine.
-
Plasmide-extractie
2.2 -
LR-reactie Ligatie
-
Voeg volgende componenten samen in een 1,5 mL Eppendorf op kamertemperatuur en meng: 2 µL Plasmide-extract uit 2.2.3 2 µL Destination vector 1 µL LR CLONASE II enzyme (Life Technologies) Microcentrifugeer kort en incubeer overnacht bij 25°C
Hitteschok transformatie van DH5 alfa E. coli-cellen
-
Volgens het protocol 2.1.5
Volgens protocol 2.1.3 met LB-medium met aangepaste antibiotica.
Kolonie-PCR
Volgens het protocol 2.1.4 met genspecifieke primers en vloeibaar LB medium met aangepaste antibiotica
-
Plasmide-extractie
Volgens het protocol 2.1.5
3. Triparentale mating
Maak 3 vloeibare culturen (2ml) in bacteriekweekbuisje: o
Donorstam: de transformatievector in E. coli overnacht incuberen bij 37°C in vloeibaar LB-medium met aangepaste antibiotica afhankelijk van de gebruikte vector
o
Helperstam: E. coli HB101 pAK2013 overnacht incuberen bij 37°C in vloeibaar LB-medium met 25 µg/mL kanamycine
o
Acceptorstam: Agrobacterium tumefaciens EHA105 2 dagen incuberen bij 28°C in vloeibaar YEB-medium met 100 µg/mL rifampicine
Meng van elke stam 100 µL en breng een druppel van 100 µL over naar een YEB-plaat. De druppel niet uitplaten maar aan de lucht laten drogen
Incubeer de plaat overnacht bij 28°C
28
Schraap een deel van het bacteriemengsel van de plaat en los op in 1 mL vloeibaar YEB medium. Maak een tienvoudige verdunning van 10-1 tot en met 10-4 en plaat 100 µL uit van elke verdunning op een YEB-plaat die de aangepaste antibiotica bevatten
Incubeer 2 dagen bij 28°C in het donker
Controleer of de kolonies het fragment bevatten aan de hand van een kolonie-PCR volgens sectie in 2.4.1
Groei de positieve kolonies overnacht op in 5 mL vloeibaar YEB-medium bij 28°C
Meng 750 µL van de bacteriesuspensie met 750 µL 50 % glycerol en bewaar bij -80°C
Samenstelling YEB-medium voor 1L:
Los 5g Beef-extract, 1g Bacto- yeast extract , 5g Bacto peptone en 5g sucrose op in 1L gedestilleerd water
Autoclaveer
Voeg 2 mL 1M gefiltersteriliseerde MgSO4 toe
Opmerking: voor vast YEB-medium wordt 1,5% agar toegevoegd
4. DNA extractie van de migratorische nematode H. oryzae
Extraheer de nematoden uit de rijstwortels volgens de Baermann funnel methode
Los de pellet van de nematoden op in 1 volume (200 µL) extractiebuffer zonder Proteinase K, en soniceer 3 keer 10 seconden
Voeg 1 volume extractiebuffer met Proteinase K toe
Incubeer 1 uur bij 65°C
Voeg 1 volume van een 24:1 chloroform:isoamylalcohol mengsel en 1 volume fenol toe
Vortex en centrifugeer 10 minuten bij maximale snelheid
Breng de bovenste laag over naar een vers 1,5 mL Eppendorf-buisje
Voeg 2 volumes 24:1 chloroform:isoamylalcohol-mengsel toe
Vortex en centrifugeer 10 min bij maximale snelheid
Breng de bovenste laag over naar een vers 1,5 mL Eppendorf-buisje
Voeg 5 µL RNAse A (10 mg/mL) en incubeer 10 min bij 37°C
Voeg 0,7 volume isopropanol toe om het DNA te precipiteren en incubeer een paar minuten bij kamertemperatuur
Centrifugeer 30 min bij 4°C
Verwijder het supernatans en was de pellet met 70% ethanol
Droog de pellet aan de lucht en los op in water 29
Samenstelling DNA-extractiebuffer zonder Proteinase K: 200 mM tris-HCl pH 8 10 mM EDTA 400 mM NaCl 2% SDS Samenstelling DNA-extractiebuffer met Proteinase K: voeg 20 mg/mL Proteinase K toe bij de buffer
5. In situ hybridisatie 5.1
Media Tabel 1. Samenstelling M9-buffer.
Component Na2HPO4 KH2PO4 NaCl MgSO4.7H2O pH
Hoeveelheid 6g/L 3g/L 5g/L 0,25g/L 7,0
Tabel 2. Samenstelling hybridisatiebuffer (40 mL). Bewaren bij -20°C
Component Geïoniseerd formamide 20x SSC 10% blocking buffer 20% SDS 100x Denhardt’s oplossing 0,1 M EDTA pH 8 10 mg/mL Fish Sperm DN Gist tRNA DEPC water
Hoeveelheid 20 mL 8 mL 4 mL 4 mL 0,4 mL 0,4 mL 0,8 mL 0,25 mL 2,15 mL
Tabel 3. Paraformaldehyde in M9-buffer. Bewaren bij -20°C
Component Paraformaldehyde M9-buffer
Hoeveelheid 0,5g 25 mL
30
Tabel 4. Samenstelling Maleic acid buffer.
Component Maleic acid NaCl pH
Concentratie 0,1 M 0,15 M 7,5
Tabel 5. Samenstelling 1x SSC-buffer.
Component NaCl Na2-citraat pH 5.2 -
Concentratie 150 mM 15 mM 7,0
Protocol Maken van gelabelde probes
Instellingen PCR1
Programma
1’ 30” 30” 45” 5’
94 °C 94°C 54°C 72°C 72°C
Reactiemengsel
35 cycli
Instellingen PCR2
Programma
1’ 30” 30” 45” 5’
1 µL 1:100 miniprep plasmide template 1 µL MgCl2 0,8 µL Forward primer (5mM) 0,8 µL Reverse primer (5mM) 0,8 µL dNTP’s (5mM) (Life technologies) 3 µL Key buffer 0,2 µL Taq-Polymerase (VWR) 22,4 µL H2O
94°C 94°C 54°C 72°C 72°C
Reactiemengsel
35 cycli
1,5 µL product PCR 1 1,5 µL MgCl2 0,8 µL Forward primer (sense probe) OF Reverse primer (antisense probe) 2 µL DIG gelabelde dNTP’s (Roche) (5mM) 5 µL Key buffer 0,2 µL Taq-Polymerase (VWR) 37,8 µL H2O
Vanaf de volgende stap (fixatie van nematoden) moet RNAse vrij gewerkt worden.
31
-
-
Fixatie van nematoden
Verzamel de nematoden in M9-buffer en centrifugeer aan 2000 rpm
Voeg 0,5 mL M9-buffer en 1,5 mL 4% paraformaldehyde in M9-buffer bij de pellet
Laat overnacht (15-16 uur) fixeren op de rotator bij 4°C
Laat 4 uur extra fixeren bij kamertemperatuur
Snijden van nematoden
Spin de gefixeerde nematoden af bij 8000 rpm en los de pellet op in 500 µl M9-buffer
Leg enkele druppels op een glaasje onder de binoculaire microscoop met behulp van een pasteurpipet
Snij de nematoden met het aquariumpompje met scheermes circa 3 keer in de 2 richtingen
Breng de gesneden nematoden over in een RNAse-vrij epje, spoel het draagglaasje na met enkele druppels M9-buffer
-
Permeabilisatie
Was de nematoden 3 keer met 2 mL M9-buffer en centrifugeer telkens 1 min bij 8000 rpm
Maak 1 mL proteïnase K oplossing van 1 mg/mL opgelost in 1 mL M9-buffer en voeg dit toe aan de nematodenpellet
Laat 40 min incuberen op de rotator bij kamertemperatuur
Centrifugeer 1 min bij 8000 rpm en verwijder het supernatans
Was de pellet met 1 mL M9-buffer, centrifugeer 1 min bij 8000 rpm, verwijder het supernatans en tik de pellet los
Bevries de pellet op ijs voor 15 min
Los de pellet op in 1 mL koude methanol en incubeer 30 seconden op ijs
Centrifugeer 30 seconden bij 13000 rpm, verwijder het supernatans en tik de pellet los
Los de pellet op in 1 mL koude aceton en incubeer 1 min op ijs
Centrifugeer 1 min bij 13000 rpm, verwijder de aceton tot ongeveer 100 µL over is en voeg druppelsgewijs DEPC water tot 200 µL
-
Hybridisatie
Centrifugeer 1 min bij 8000 rpm en verwijder het supernatans
Voeg 500 µl hybridisatiebuffer toe, centrifugeer 1 min bij 8000 rpm en verwijder het supernatans 32
Los de pellet op in 500 µL hybridisatiebuffer en prehybridiseer minstens 20 min bij 47°C
Denatureer de probes door ze 5 min te incuberen in kokend water en zet ze erna direct op ijs (gebruik “safelocks” buisje van 0,5 mL)
Voeg indien nodig nog wat hybridisatiebuffer toe aan de nematoden en verdeel ze over de epjes met probes zodat er minstens 250 µL in elk epje zit
-
Hybridiseer overnacht bij 47°C
Wassen
Was 3 keer 15 min met 4x SSC bij hybridisatietemperatuur en centrifugeer telkens 50 seconden bij 8000 rpm
Was 3 keer 20 min met 0,1x SSC + 0,1% SDS bij hybridisatietemperatuur en centrifugeer telkens 50 seconden bij 8000 rpm
-
Kleuren
Was 1 min met maleic acid buffer en centrifugeer 4 min bij 3000 rpm
Incubeer 30 min in 1% Boehringer blocking reagens in maleic acid buffer
Incubeer 2 uur in 1:1000 antidigoxigenin antilichaam in 1% Boehringer blocking reagens in maleic acid buffer
Was 3 keer 15 min met maleic acid buffer met 0,01% Tween-20 en centrifugeer telkens 4 min bij 3000 rpm
Was kort in alkalisch fosfatase detectiebuffer en centrifugeer 4 min bij 3000 rpm
Kleur de nematoden overnacht verpakt in zilverpapier op een donkere plaats bij kamertemperatuur met circa 100 µL kleuroplossing ( na toevoeging niet meer schudden) 3,4 µL NBT stock (100 mg/mL) 3,5 µl X-fosfaat stock (50 mg/mL) 1 ml alkalisch fosfatase detectiebuffer
-
Bekijken onder de microscoop
Leg 10 µL gekleurde nematoden op een draagglaasje
Leg een dekglaasje erop en verzegel met nagellak
Bekijk onder de microscoop (10x:400X voor foto’s)
Indien de nematoden voldoende gekleurd zijn, laat ze uitzakken en was ze 2 keer met bidest
33
6. Aanmaak van heat-shock competente Agrobacterium
Maak 50 mL LB aan in een 250 mL fles
Groei Agrobacterium op in 5 mL LB overnacht bij 28°C in het donker met 25 µg/mL gentamycine ( in de aanwezigheid van het VirG-plasmide)
Voeg 2 mL van de opgekweekte Agrobacterium bij het 50 mL medium
Schud bij 28°C tot een OD600 tussen 0,5 – 1,0 bereikt is (optimum is 0,6)
Incubeer 10 min op ijs
Centrifugeer 5 min op 3000 g bij 4°C
Verwijder het supernatans
Los de pellet op in 1 mL 20 mM CaCl2
Centrifugeer 5 min op 3000 g bij 4°C, verwijder het supernatans en los de pellet op in 1 mL 20 mM CaCl2
Centrifugeer 5 min op 3000 g bij 4°C, verwijder het supernatans en los de pellet op in 1 mL 20 mM CaCl2
Breng 100 µL over naar een 1,5 mL Eppendorf-buisje dat vooraf op ijs bewaard werd
Bevries in vloeibare stikstof
Bewaar bij -80°C
7. Transiënte transformatie van tabaksplanten 7.1 -
Transformatie van Agrobacterium Hitteschok transformatie van hitteschok competente Agrobacteria
Ontdooi heat-shock competente Agrobacteria op ijs
Voeg 1 µg van het plasmide toe aan de cellen
Bevries in vloeibare stikstof
Incubeer het mengsel exact 5 min in een warmwaterbad van 37°C
Voeg 1 mL LB-medium toe en schud 2 uur bij 28°C in het donker
Centrifugeer 30 seconden bij maximale snelheid, verwijder het supernatans tot ongeveer 100 µL overblijft in het Eppendorf-buisje en los de pellet hierin op
Plaat 100 µL uit op LB-platen met de aangepaste antibiotica
Incubeer 2-3 dagen bij 28°C in het donker
34
-
Kolonie-PCR
Gebruik hetzelfde protocol als in puntje 2.1.4 voor de kolonie-PCR voor E. coli-cellen maar los de kolonies op in 15 µL in plaats van 10 µL water
Na 10 min incubatie bij 94°C, microcentrifugeer de PCR-buisjes tot er een pellet ontstaat en breng 10 µL van het supernatans over naar nieuwe PCR-buisjes
-
7.2
Gebruik de nieuwe PCR-buisjes voor de kolonie-PCR zoals beschreven in puntje 2.1.4
Glycerolstock maken
Meng 750 µL van de opgegroeide positieve kolonies op in 750 µL 50% glycerol
Bewaar bij -80°C Infiltratie
Groei op in 5 mL vloeibaar LB-medium met aangepaste antibiotica overnacht in het donker bij 28°C op de schudder ( ’s morgens starten) o
Agrobacterium AgI + R3a (Kanamycine 50 µg/mL)
o
Agrobacterium AgI + Avr3a (kanamycine 50 µg/mL)
o
Lege Agrobacterium GV3101 met het VirG plasmide (Gentamycine 25 µg/mL)
o
Agrobacterium
GV3101
met
pK7WG2+GFP
(Gentamycine
25
µg/mL
en
met
pK7WG2+gen
(gentamycine
25
µg/mL
en
spectinomycine 100 ng/mL) o
Agrobacterium
GV3101
spectinomycine 100 µg/mL)
Centrifugeer 10 min op 3000 rpm bij kamertempertuur
Verwijder het supernatans en los de pellet op in 10 mL vers gemaakte infiltratiebuffer
Herhaal de vorige stappen en los de pellet op in 3 mL infiltratiebuffer
Meet de OD600 van een 1:10 verdunning van de verschillende Agrobacterium-culturen
Verdun met infiltratiebuffer tot OD 1.5, voor R3a en Avr3a moet de finale OD 0.6 zijn
Incubeer 3 u bij kamertemperatuur in het donker
Maak de volgende infiltratieoplossingen o
1:1:1 GFP+R3a + Avr3a
o
1:1:1 lege Agro + R3a + Avr3a
o
1:1:1 gen + R3a + Avr3a
Maak een gaatje met een naald in het blad van een tabaksplaat tussen de nerven
Infiltreer met een spuit aan de achterkant van het blad (zijn ideaal 15 planten en per plant 3 bladeren infiltreren met alle oplossingen) 35
Infiltreer 2 bladeren van 2 planten met de controles o
1:2 Avr3a + infiltratiebuffer
o
1:2 R3a + infiltratiebuffer
o
1:2 GFP + infiltratiebuffer
o
1:2 gen + infiltratiebuffer
Evalueer 2 dagen na infiltratie door middel van een score van 1 of 0, waarbij 1 de geïnfiltreerde zone hypersensitieve respons (HR) vertoont
Voer een statistische analyse uit en gebruik hiervoor een Fisher’s exact test
Samenstelling infiltratiebuffer: Voor 100 mL : 1 mL van 1 M MgCl2 2 mL van 0,5 M MES 200 µL van 0,1 M acetosyringone
8. Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie 8.1 -
Protocol Steriliseren en zaaien van rijstzaadjes
De rijstzaden worden ontdaan van hun zaadhuid
Aanmaak van 500 mL 4% natriumhypochlorietoplossing met 10 druppels Tween 20
Het zaad wordt in een 50 mL proefbuis gedaan en gesteriliseerd met 70% ethanol
De ethanol na 5 min verwijderen en 50 mL natriumhypochloriet toevoegen
De proefbuis 30 min op rotator bij kamertemperatuur plaatsen
De zaadjes drogen en per 10 op een petrischaal met CIM-medium plaatsen. De petrischalen dichtmaken met Leucopore-tape
-
-
Incubeer in het donker bij 30°C voor 3-4 weken
Selectie van embryogeen callus
Selecteer de losse callusstukjes (klein, rond , lichtgeel, hard)
Breng de goede callusstukjes over naar vers CIM-medium
Incubeer in het donker bij 30°C voor vier dagen
Inoculatie met Agrobacterium
Via triparentale mating zie puntje 2.3 wordt de correcte vector in Agrobacterium overgebracht
De Agrobacterium-stam opgroeien op vast LB-medium met aangepaste antibiotica 36
Incubeer voor 48 uur bij 28°C
Voeg 1mL/L acetosyringone van een 100 mM stock toe aan AA-1 medium
Pipetteer 21 mL van AA-1+acetosyringone in een steriele Falcon-proefbuis
Schraap Agrobacterium af en voeg toe aan de 21 mL AA-1+ acetosyringone
Vortex tot een homogene oplossing van Agrobacterium
Meet de optische densiteit (OD) (600 nm) en gebruik AA-1+acetosyringone als blanco
Verdun de oplossing in de proefbuis tot een OD van 1-1,2
Breng de callus over van de petriplaten naar de proefbuis, laat incuberen voor 5-8 min bij kamertemperatuur
-
-
Plaats de callus naar de R2-comasmedium en pipetteer het teveel aan oplossing weg.
De petriplaten laten drogen aan de lucht in de flow
Maak de petriplaten dicht met Leucopore-tape
Incubeer in het donker bij 26°C voor 4 dagen
Transfer naar selectiemedium
Voeg 500 µl timentin toe aan 500 ml steriel water
Schraap de callus af in een 50 mL steriel proefbuis en was dit met de timentin-oplossing
Herhaal tot de wasvloeistof helder blijft
Breng de gewassen callus over naar N6-selectiemedium
Maak de petriplaten dicht met Leucopore-tape
Incubeer bij 30°C met continue belichting voor 3 weken
Transfer naar pre-regeneratiemedium
Breng de goede callus over (hard, geen bruinkleuring) naar pre-regeneratiemedium (2030 per plaat)
-
Maak de petriplaten dicht met leucopore
Incubeer bij 30°C met continue belichting voor 2 weken
Transfer naar regeneratiemedium
Breng de kleine stukjes over van 1 transgeen callus (callus die duidelijk vermeerderd is) naar 1 kwadrant van een petriplaat
Maak de petriplaten dicht met Leucopore-tape
Incubeer bij 30°C met continue belichting voor 2 weken
37
-
Transfer van scheuten naar wortelgroeimedium
Selecteer de gezondste scheuten van elk event
Snij de wortel tot ongeveer 1 cm en breng ze over naar wortelgroei-buisjes (ongeveer 0,5 cm diep in het medium)
-
Maak de buisjes dicht
Incubeer bij 30°C met continu belichting voor 2 weken
Transfer van in vitro rijstplantjes naar volle grond
Vul potten met aarde en bevochtig ze met water
Verwijder de plantjes uit de buisjes en verwijder het te veel aan agar
Plant de plantjes voorzichtig in de potten
Incubeer bij 26°C, 16 uur licht voor een fotoperiode (bedek de plantjes met plastiek de eerste 3 dagen voor een hogere relatieve vochtigheid)
8.2
Media
Tijdens de transformatie van rijst met behulp van Agrobacterium worden er verschillende media gebruikt. Alle componenten worden samengevoegd in de juiste hoeveelheden of concentratie en opgelost in gedestilleerd water. De agar of agarose SPI werd pas toegevoegd nadat het medium op de juiste pH was gebracht. Het op pH brengen wordt uitgevoerd met 1 M HCl of 1 M KOH. Vervolgens wordt de oplossing geautoclaveerd. Na het autoclaveren worden alle vetgedrukte componenten toegevoegd. Deze componenten worden gesteriliseerd door ze over een 0,22 µm filter in een steriele proefbuis te filteren. Tabel 6. Samenstelling callus-inducerend medium (CIM)
Component Chu N6 zouten met vitaminen Sucrose Caseïnehydrolysaat Proline 2,4-D (2 mg/mL) Agarose SPI pH
Hoeveelheid 3,95 g/L 30 g/L 1 g/L 1,5 mg/L 2 mg/L 8 g/L 5,8
38
Tabel 7. Samenstelling Aminozuren 20x stock
Component L-glutamine L-asparaginezuur L-arginine Glycine Milipore water
Hoeveelheid 17,52 g 5,32 g 3,48 g 0,15 g 1000 mL
Tabel 8. Samenstelling Agrobacterium-verdunnings buffer (AA-1).
Component MS zouten Sucrose Glucose Caseïnehydrolysaat Aminozuren (20x stock) pH
Hoeveelheid 4,19 g/L 68,5 g/L 36 g/L 0,5 g/L 50 mL/L 5,2
Tabel 9. Acetosyringone-oplossing
Component 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenon 97% 70% ethanol
Hoeveelheid 0,195 g 10 mL
Tabel 10. Samenstelling R2-COMAS medium.
Component Hoeveelheid MS-zouten 2,43 g/L B5-vitamine 1 mL/L Sucrose 20 g/L Glucose 10 g/L Caseïne hydrolysaat 1 g/L Micro-agar 7 g/L pH 5,2 Tabel 11. Samenstelling N6-selectiemedium.
Component Chu N6 zouten vitaminen Sucrose Glucose Caseïnehydrolysaat 2,4-D (2 mg/mL) Acetosyringone pH
met
Hoeveelheid 3,95 g/L 30 g/L 10 g/L 1 g/L 2 mg/L 1 mL/L 5,8
39
Tabel 12. Samenstelling N6 pre-regeneratiemedium.
Component Hoeveelheid Chu N6 zouten met vitaminen 3,95 g/L Sucrose 30 g/L Caseïnehydrolysaat 1 g/L Proline 1,5 g/L 2,4-D (2 mg/mL) 1 mg/L Agarose SPI 8 g/L Basta 80 mg/L Timentin 300 mg/L pH 5,8 Tabel 13. Samenstelling N6-regeneratiemedium
Component AA aminozuren Chu N6 zouten met vitaminen Sucrose Caseïne hydrolysaat CuSO4 2,4-D (2 mg/mL) Agarose SPI Zeatin (10 mg/mL stock) pH
Hoeveelheid 50 mL/L 2,0 g/L 20 g/L 1 g/L 40 µM 1 mg/L 8 g/L 1 mg/L 5,8
Tabel 14. Samenstelling rijst-wortelgroeimedium
Component Hoeveelheid ½ MS zouten 2,15 g/L ½ B5 vitaminen (1000x 0,5 mL/L stock) Sucrose 10 g/L MES 0,5 g/L Micro agar 8 g/L
40
Resultaten 1. Oppikken en analyse van Hirschmanniella oryzae effectorgenen (PEF’s) Om de interactie tussen rijst en de plant-parasitaire nematode Hirschmaniella oryzae te ontrafelen werd getracht om verschillende genen, die voldoen aan bepaalde criteria, op te pikken uit een cDNA bank. Om na te gaan waar deze genen tot expressie kwam, werd een in situ hybridisatie uitgevoerd. Een in situ-hybridisatie is een techniek die gebruikt wordt om de plaats van expressie zichtbaar te maken in de nematoden. De gebruikte criteria en technieken, alsook de bekomen resultaten worden verder besproken in onderstaande paragrafen. 1.1. Oppikken van verschillende genen uit de cDNA-bank Het kloneren van verschillende mogelijke effectorgenen, PEF’s (possible effector), gebeurde volgens het protocol beschreven onder 1 Oppikken van een gen in het onderdeel Materiaal en methoden. De gebruikte primers voor het oppikken van deze genen vindt men terug in bijlage I primers. Voor de selectie van PEF’s moesten deze aan bepaalde voorwaarden voldoen. Eerst en vooral mochten deze genen geen similariteit vertonen met genen uit niet plant-parasitaire organismen. Wanneer er toch homologen aanwezig zouden zijn in niet plant-parasitaire organismen kon dit duiden op een algemeen gen dat niet specifiek genoeg is om de nematoden te helpen op de plant te parasiteren. Het mocht wel homologen hebben in andere plant-parasitaire organismen, maar dit was geen vereiste. Met behulp van SignalP 4.0 werd nagegaan of er een N-terminaal signaalpeptide aanwezig was voor het gen. Dit N-terminaal signaalpeptide is nodig voor secretie. Na secretie zal het afgeknipt worden en het matuur eiwit zal zijn functie uitvoeren zonder signaalpeptide. Er werd ook op de afwezigheid van een transmembranair domein gescreend. Wanneer het eiwit een transmembranair domein heeft zal het zich verankeren in een membraan en zal het niet gesecreteerd kunnen worden. Verder werd er gekeken of de sequentie voor het volledige eiwit aanwezig was, vanaf het start- tot het stopcodon, dit om fusie-PCR en genome walking te vermijden. Deze twee technieken zijn niet enkel arbeidsintensief maar ook tijdrovend. Tenslotte werd gekozen voor contigs die uit meer dan 25 reads bestonden omdat dit gecorreleerd is met een hoge expressie waardoor het gen makkelijker op te pikken is. De selectie van deze verschillende genen gebeurde op basis van een EST-bank. Op die manier werden verschillende PEF’s geselecteerd; namelijk PEF 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 29. Van deze 19 genen werden er maar 12 geligeerd in een pGEM-T vector. Van deze 12 vectoren werd getracht probes aan te maken voor de in situ hybridisatie. Daartoe werden eerst de stappen beschreven onder 1.3 Heat-shock transformatie van DHα E. coli-
41
cellen, 1.4 Kolonie-PCR , 1.5 Plasmide-extractie in het onderdeel Materiaal en methoden doorlopen. 1.2. In situ hybridisatie Een in situ hybridisatie (ISH) is een standaardtechniek die gebruikt wordt om de plaats van expressie van een gen zichtbaar te maken in de nematoden. Het is een algemene techniek die gebruikt wordt in de functionele analyse van gekloneerde genen in nematoden. Van de verschillende genen die opgepikt werden, kon enkel voor PEF3, 4, 7, 12,15, 18, 19 en 22 succesvol probes gemaakt worden volgens het protocol beschreven in 5.2 Protocol in situ hybridisatie in het onderdeel Materiaal en methoden. In figuur 9 worden enkele resultaten van de ISH weergegeven. In deze voorbeelden kan men een duidelijk signaal waarnemen. Men ziet echter geen expressie in de klieren van de nematoden, waarschijnlijk worden deze genen tot expressie gebracht in de darm van de nematoden. Deze resultaten sluiten echter niet uit dat het gen zwakker tot expressie komt in de klieren. Er zijn bijkomende ISH nodig om het resultaat te bevestigen. Voor PEF3, 4, 7, 12, 18, 19 en 22 is er geen expressie waar te nemen in de klieren.
Figuur 9. In situ hybridisatie. Resultaten van in situ hybridisatie van PEF3 (A), PEF4 (B) en PEF7 (C). Er is geen expressie te zien in de klieren.
In figuur 10 kan men de expressie van PEF 15 waarnemen. Het is duidelijk dat PEF15 tot expressie komt in de klieren.
42
Figuur 10. In situ hybridisatie van PEF15. Expressie van PEF15 in de klieren van de nematode H. oryzae in (A) en (B°.
2. Analyse van een Hirschmanniella oryzae kandidaat effector gen, PEF 15 De expressie van PEF15 in de faryngale klieren van de nematoden werd aangetoond aan de hand van een in situ hybridisatie. Doordat verschillende versies van PEF15 werden opgepikt, werd eerst een sequentie-analyse uitgevoerd. In de sequentie-analyse werd nagegaan of er homologen terug konden gevonden worden in andere plant-parasitaire nematoden, bacteriën of fungi. Aan de hand van homologen, teruggevonden in M.incognita en M. hapla, werd een alignering uitgevoerd en een fylogenetische boom opgesteld. De kenmerken van PEF15 en zijn homologen werden nagegaan en tenslotte werd getracht om meer informatie te bekomen over de secundaire en tertiaire structuur van het eiwit. Vervolgens werd PEF15 opnieuw opgepikt uit de cDNA-bank om de sequentie te kloneren in verschillende vectoren die enerzijds gebruikt werden in een Agrobacterium-gemedieerde transïente transformatie
van
tabaksplanten
en
anderzijds
in
Agrobacterium-gemedieerde
stabiele
rijsttransformatie. Met behulp van de Agrobacterium-gemedieerde transformatie van tabaksplanten werd nagegaan of PEF15 een effect heeft op de plantenafweer. Hierbij werd nagegaan of PEF15 de hypersensitieve respons van de plant kan vertragen of onderdrukken. Het doel van de Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie is om PEF15 tot stabiel tot expressie te brengen in rijst. Op deze getransformeerde rijst kunnen dan verder infectieproeven uitgevoerd worden om na te gaan of de overexpressie van PEF15 de plant vatbaarder maakt voor infectie door H. oryzae.
43
Als laatste werd getracht om de verschillende versies van PEF15 op te pikken op DNA niveau. Door de vergelijking van de DNA sequentie met de cDNA sequentie kunnen de posities van de introns geïdentificeerd worden. 2.1. Sequentie-analyse De eiwitsequentie van de korte en lange versie is respectievelijk weergegeven in figuur 15 en figuur 16. Voor de verdere analyse van de sequentie werd gewerkt met de lange versie van PEF15.
MTTTKLLLLSLLVMGALVERSAATLCSATRPPGNSKSNSASQQAKECDVDT ICACQAVSTTSSPALTASSSTASSSPSSSPSSSSASSSSAAPNTTLASTASTGF TASMANEPCPCILMQELLNMKYLYLSSSQQVIFDGCLDEIRVILVDVTITIQ MKVVQNRVGHQEPLQKVSGHQACVEIQKNTPAGAECMSCAQRAPASIP PTPISLWHPLIRPVNAT Figuur 11. Eiwitsequentie korte versie van PEF15. Groen: signaalpeptide Geel: serine-rijk domein.
MTTTKLLLLSLLVMGALVERSAATLCSATRPPGNSKSNSASQQAKECDVDTICACQAVSTTSSPAL TASSSTASSSPSSSPSSSSASSSSAAPNTTLASTASTGFTASMANEPCPCILMQELLNMKYLYLSSSQ QVIFDGCLDEIRVILVDVTITIQMKVVQNRVGHQEPLQKVSGHQACVEIQKNTPAGAECMSCAQ RAPASIPPTPISLWHPLIRPVNSNLTMALANGTANDVCGSGSSAVIVSMLGRAKKVLKKYTPGYD KGRKLGWLKKAFVKNLFVLNPSIEACVRNVTIPGFGKFDQFLSLCDQYENTGAMNGSLLNGTASN CVLIQSLNNSLNSNATVNSTDAATLQEGMDYISNLTVYFNQVTDVVLRLKFVSAQFSMLSSQCRV LLNSFDIIGSVLAIDFSDVVVSSHFCDNDGCGNMTLGGGSMSYPEECSLDTVYNISDVEEACQTW NDNVLPTIYNTTISLFSARNSFNSYFNGIRTCVRGSTAPYNGAALTDLNARYTCAKYYVTNYAANQ PSLHAKWLAVELYNVFIETATTVTFSNLGGFCGCS Figuur 12. Eiwitsequentie lange versie PEF15. Groen: signaalpeptide. Geel: Serine-rijk domein.
Om na te gaan of PEF15-homologen heeft in andere plant-parasitaire nematoden werd een tblastn gebruikt tegen de EST-databank van nematoden op de NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Hieruit bleek dat er hits gevonden werden in andere plant-parasitaire nematoden, namelijk in Pratylenchus vulnus, Radopholus similis, Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, M. hapla en M. chitwoodi. Dit is een eerste indicatie dat PEF15 belangrijk zou kunnen zijn voor de interactie van de nematode met zijn waardplant. Via een blast-tool op de website van wormbase (http://www.wormbase.org/tools/blast_blat) werd een blast uitgevoerd van PEF15 tegen het genoom van enkele niet plant-parasitaire nematoden zoals Caenorhabditis elegans, Trichinella. spiralis, Strongyloides ratti, Onchocerca volvulus, Loa loa, Ascaris suum en Brugia malayi. In geen enkele van deze nematoden werden hits teruggevonden. Dit geeft een bijkomende bevestiging dat 44
PEF15 enkel aanwezig is in plant-parasitaire nematoden en dus belangrijk is voor de infectie van de plant. Tenslotte werd een blast uitgevoerd van PEF15 tegen de database van M. incognita en M. hapla. Er werden 13 homologe sequenties teruggevonden in de genomen van M. incognita en 6 homologe sequenties in M. hapla die terug te vinden zijn in bijlage X PEF15 homologen. Vervolgens werd via SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) nagegaan of alle homologe sequenties een signaalpeptide bevatten. Van deze 19 homologe sequenties waren er 15 sequenties met een voorspeld signaalpeptide. Met deze sequenties, die men terug kan vinden in bijlage X PEF15homologen werd verder gewerkt. Deze sequenties werden ingevoerd in Bioedit waar ze werden gealigneerd met ClustalW. De volledige alignering kan men terugvinden in bijlage XI volledige alignering. In figuur 17 kan men de meest geconserveerde regio’s terugvinden. Uit deze alignering blijkt dat bepaalde aminozuren sterk geconserveerd zijn. De geconserveerde regio’s zijn aangeduid met een pijl. In de andere gevallen vertonen de aminozuren gelijkaardige eigenschappen, maar kan de sequenties lichtjes verschillen tussen de homologen. De belangrijke geconserveerde residuen werden teruggevonden tussen positie 231 en 411 van de aminozuursequentie.
45
Figuur 13. Alignering van PEF15 en homologe sequenties met signaalpeptide uit M. icognita en M. hapla. Alignering oopt van aminozuur 231 tot en met aminozuur 411. De pijlen duiden eventuele geconserveerde residuen aan. Enkel voor deze aminozuren zijn de sequenties volledig gelijk aan elkaar. In de andere gevallen kunnen er verschillen optreden in sequentie, maar bevatten de aminozuren gelijkaardige eigenschappen.
46
Van deze gealigneerde sequenties werd via ClustalW (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) een alignering uitgevoerd om vervolgens een fylogenetische boom te verkrijgen weergegeven in figuur 18. Uit deze fylogenetische boom kan men afleiden dat PEF15 een sterkere verwantschap vertoont met homologen uit M. hapla dan met M. incognita.
Figuur 14. Fylogenetische boom van PEF15 en homologe sequenties met signaalpeptide uit M. incognita en M. hapla.
Vervolgens
is
gekeken
naar
de
eiwiteigenschappen
van
PEF15
via
Protparam
(http://web.expasy.org/protparam/). Hiervoor werd het mature eiwit gebruikt, dit betekent het volledig eiwit zonder signaalpeptide. Uit deze on-line tool kon men het aantal aminozuren en moleculair gewicht aflezen. Hieruit blijkt dat het gaat om een eiwit dat bestaat uit 535 aminozuren met een moleculair gewicht van 57037,4 dalton. Hieruit kon ook de samenstelling van de aminozuursequentie afgelezen worden. Hieruit bleek dat PEF15 voor 13,1% uit serine bestaat. De eiwiteigenschappen werden op analoge manier onderzocht voor de homologe sequenties. Hieruit blijkt dat ongeveer een gemiddelde 10% van het eiwit bestaat uit serine voor de homologe sequenties. Dit geeft een indicatie dat het eiwit een serine-rijk domein kon bevatten. Aan de hand van ExpasyProsite (http://prosite.expasy.org/) werden verschillende eiwitpatronen onderzocht. Hieruit blijkt dat er een serine-rijk domein aanwezig is bij PEF15. Dit serine-rijk domein wordt aangeduid op figuur 14 en figuur 15 respectievelijk voor de korte en de lange versie van PEF15. De homologe sequenties werden op analoge manier geanalyseerd en hieruit blijkt dat 7 van de 15 47
homologe sequenties een serine-rijk domein bevatten. De homologe sequenties zijn terug te vinden in bijlage X. PEF15 homologen. Tenslotte werd de secundaire en tertiaire structuur van PEF15 nagegaan. Voor de secundaire structuur werd het online programma Psipred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) gebruikt. Het resultaat is weergegeven in figuur 19. Hieruit kon men voor PEF15 de lokalisatie van α-helices (paars) en β-sheets (geel) lokaliseren.
Figuur 15. Schematische voorstellig van de secundaire structuur van PEF15 zonder signaalpeptide. De voorspelde α-helices zijn in het paars aangeduid, de voorspelde β-sheets in het geel.
Voor
de
tertiaire
structuur
werd
Phyre2
(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) gebruikt. Dit programma voorspelt op basis van homologe sequenties de tertiaire structuur. Slechts 3% van de sequentie werd gebruikt om een structuur op te stellen, dus zijn de voorspellingen niet bruikbaar. 2.2. Oppikken van het gen uit een cDNA-bank Wanneer PEF15 nog eens vermenigvuldigd werd door dezelfde primers die gebruikt werden om de in situ hybridisatie uit te voeren werd er geen stopcodon gevonden in de sequentie. Door sequentieanalyse van verschillende kolonies kon er aangenomen worden dat er verschillende versies waren van het gen. Men zal verder gaan met de korte sequentie die opgepikt werd door de forward primer PEF15F en reverse primer PEF15R1. De langere versie werd opgepikt door dezelfde forward primer, maar een andere reverse primer namelijk PEF15R2. Niet enkel de korte en lange versie werd opgepikt, maar ook telkens de versie met en zonder signaalpeptide. Het gen werd opgepikt zonder signaalpeptide omdat het mature eiwit in de plant geen signaalpeptide meer bevat. Het signaalpeptide is enkel nodig voor secretie via de stylet. Na het oppikken van het gen uit de cDNA bank werden er attb-sites aan de sequentie geligeerd volgens het protocol beschreven in 1.6 addities van attb-sites in het onderdeel Materiaal en methoden. De gebruikte primers vindt men terug in de bijlage I Primers waarbij PEF15attBR1 de reverse primer is voor de korte versie van PEF15 en PEGF15attBR2 de reverse primer is voor de lange versie van PEF15. De addities van attb-sites was noodzakelijk om de sequentie succesvol via gatewaycloning te kloneren. Tijdens de gatewaycloning werden de sequenties in een gepaste vector gekloneerd. De vector die gebruikt werd voor 48
tabakstransformatie was pK7WG2. De vector die gebruikt werd om rijst te transformeren was pMBb7Fm21GW-UBIL. Beide vectoren bevatten het gen voor resistentie tegen spectinomycine. Na de LR-reactie beschreven volgens het protocol 2.2 LR-reactie werden voor beide vectoren een concentratie van 50 µg/ml spectinomycine gebruikt worden. 2.3. Analyse van mogelijke afweersuppressie door PEF15 via Agrobacteriumgemedieerde transformatie van tabaksplanten Voor de Agrobacterium gemedieerde transformatie werd het protocol beschreven in 7. Transiënte transformatie van tabaksplanten in het onderdeel Materiaal en methoden uitgevoerd. Naast het R3a en Avr3a paar werd ook het Gpa2 en Gp-RBP-1 paar getest.
Avr3A en Gp-RBP-1 zijn
respectievelijk een effector van Phytophthora infestans en Globodera pallida en het R3a en het Gpa2 zijn hun resistentiegenen uit aardappel. Deze resistentiegeven coderen voor NB-LRR eiwitten en belangrijk zijn voor de herkenning van effectoren. Wanneer deze NB-LRR eiwitten de respectievelijke effectoren herkennen word een effector-triggerd immuniteit geactiveerd. Dit zal tenslotte leiden tot een hypersensitieve respons. Gp-RBP-1 zal enkel de hypersensitieve respons induceren in de aanwezigheid van Gpa2 (Sacco et al. 2009). Voor het Gpa2 en Gp-RBP-1 paar werden dezelfde antibiotica gebruikt als voor het R3a en Avr3A paar beschreven in 7. Transiënte transformatie van tabaksplanten in het onderdeel Materiaal en methoden. Enkel van de korte PEF15-versie werd zowel het gen met signaalpeptide en zonder signaalpeptide getest. Voor de langere versie werd enkel het gen zonder signaalpeptide succesvol gekloneerd in de pK7WG2 vector. Na de klonering van PEF15 in de pK7WG2 vector werden 13 planten geïnfiltreerd volgens het schema in figuur 11 (A) voor de korte versie. Voor de lange versie werden 7 planten geïnfiltreerd volgens het schema in figuur 11 (B). Er werden ook controles in het experiment opgenomen zoals beschreven in het protocol 7.2 Infiltratie uit het onderdeel Materiaal en methoden.
49
Figuur 16. Proefopzet van Agrobacterium gemedieerde transformatie van tabaksplanten. De proefopzet van PEF15 voor de korte versie (A) en voor de lange versie (B). Gfp: infiltratie met mix van Agrobacterium AgI + R3a, Agrobacterium AgI + Avr3a en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+GFP. Leeg: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + R3a, Agrobacterium AgI + Avr3a en de lege Agrobacterium GV3101 met het VirG plasmide. SP: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + R3a, Agrobacterium AgI + Avr3a en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ korte versie van PEF15 met signaalpeptide (A) of + lange versie van PEF15 met signaalpeptide (B). NoSP: infiltratie met mengsel Agrobacterium AgI + R3a, Agrobacterium AgI + Avr3a en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ korte versie van PEF15 zonder signaalpeptide.
Na enkele dagen werden de tabaksbladeren gescoord, de score tabel kan men terugvinden in bijlage II Score-tabel PEF15 met Avr3a en R3a. Op deze scores werd eerst een statistische test uitgevoerd om na te gaan of er een significant verschil is tussen de verschillende infiltraties. Voor het uitvoeren van deze testen werden geen scores weggelaten. Wanneer er zonder het weglaten van eventuele errors in de infiltratie toch kon aangetoond worden dat er hypersensitieve respons was, was dit resultaat krachtiger. Om de scores statistisch te analyseren werd geopteerd voor een Fisher exact test via het programma SPSS. Voor elk gen waren er twee controles, de lege Agrobacterium GV3101 met het VirG-plasmide en Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP. Het gen dat geïnfiltreerd was, werd vergeleken tegenover beide controles. In bijlage III Resultaten Fisher exact test PEF15 met Avr3a en A3a vindt u de cross-tabel en de pwaarde van de Fisher exact test terug. Voor de korte versie van PEF15 zonder SP werd respectievelijk voor de lege Agrobacterium GV3101 en Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP p-waarden bekomen van 0,610 en 1,000. Voor de korte versie met SP werd respectievelijk voor de lege Agrobacterium GV3101 en Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP p-waarden bekomen van 0,437 en 1,000. Deze p-waarden zijn groter dan het 5% significantieniveau waardoor er aangenomen kan worden dat er geen verschil is tussen de twee stalen. Dit betekent dat er geen suppressie optreedt met de korte versie van PEF15 voor het R3a en Avr3A paar. Voor de lange versie van PEF15 met SP werd voor zowel de lege Agrobacterium GV3101 als de Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP een p-waarde bekomen van 1. Deze p-waarden zijn groter 50
dan het 5% significantieniveau waardoor er ook hier kan aangenomen worden dat de lange versie met signaalpeptide geen suppressie vertoont van de hypersensitieve respons. Naast het testen van het R3a en Avr3a paar werd ook het Gpa2 en Gp-RBP-1 paar gebruikt om de hypersensitieve respons op te wekken in tabak. Voor de tabaksinfiltratie werden dezelfde constructen gebruikt als bij de eerste tabaksinfiltratie met R3a en Avr3A zodat beide tabaksinfiltraties analoog verliepen. Na de klonering van de verschillende constructen in de pK7WG2 vector werden 16 planten geïnfiltreerd volgens het schema in figuur 12 (A) voor de korte versie. Voor de lange versie werden 11 planten geïnfiltreerd volgens het schema in figuur 12 (B). Er werden ook controles in het experiment opgenomen zoals beschreven in het protocol 7.2 Infiltratie uit het onderdeel Materiaal en methoden.
Figuur 17. Proefopzet van Agrobacterium gemedieerde transformatie van tabaksplanten. De proefopzet van PEF15 voor de korte versie (A) en voor de lange versie (B). Gfp: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+GFP. Leeg: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + GpRBP-1 en de lege Agrobacterium GV3101 met het VirG plasmide. SP: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ korte versie van PEF15 met signaalpeptide (A) of + lange versie van PEF15 met signaalpeptide (B). NoSP: infiltratie met mengsel Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gpa2 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ korte versie van PEF15 zonder signaalpeptide.
Na zeven dagen werden de tabaksbladeren gescoord, de score-tabel kan men terugvinden in bijlage IV Score-tabel PEF15 met Gp-RBP-1 en Gpa2. Op deze scores werd een statistische test uitgevoerd om na te gaan of er een significant verschil is tussen verschillende infiltraties. Dezelfde methoden en controles werden gebruikt als het voorgaand experiment. In bijlage V Resultaten Fisher exact test PEF15 met Gp-RBP-1 en Gpa2 zijn de cross-tabel en de pwaarde van de Fisher exact test terug te vinden. Voor de korte versie van PEF15 zonder SP werd respectievelijk voor de lege Agrobacterium GV3101 en Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP een p-waarde bekomen van 0,032 en 1,000. Voor de korte versie met SP werd respectievelijk voor de lege Agrobacterium GV3101 en Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP een p-waarde bekomen van 0,032 en 1,000. Voor de lange versie van PEF15 met SP werd voor zowel de lege Agrobacterium GV3101 als de Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP respectievelijk een p-waarde bekomen van 51
0,000 en 1,000. Deze p-waarden voor zowel de korte sequentie als de lange sequentie vergeleken met de Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP zijn groter dan het 5% significantieniveau waardoor er aangenomen kan worden dat er geen verschil is tussen de twee groepen. Echter wanneer men de p-waarden bekijkt wanneer de lege Agrobacterium GV3101 als controle gebruikt wordt, ziet men duidelijk dat de p-waarde kleiner zijn dan het 5% significantieniveau. Dit wijst dat er een verschil is tussen beide groepen. Deze kleine p-waarden kunnen echter verklaard worden door het feit dat de aanwezigheid van een eiwit een effect kan hebben op de hypersensitieve respons. Daarvoor dient men altijd de Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP in te sluiten als controle. De aanwezigheid van een willekeurig eiwit kan de snelheid van de hypersensitieve respons veranderen en daarom moet men altijd het construct vergelijken met zowel een lege Agrobacterium GV3101 als met een Agrobacterium GV3101 die een eiwit tot expressie brengt waarvan geweten is dat het geen effect heeft op de hypersensitieve respons. Algemeen kan men aanvaarden dat zowel de korte als de lange versie van PEF15 geen suppressie van de hypersensitieve respons veroorzaakt. 2.4. Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie Om na te gaan welk effect de expressie van het nematodengen PEF15 heeft op de rijstplant werd een Agrobacterium gemedieerde rijsttransformatie uitgevoerd. Rijst werd getransformeerd met verschillende versies van PEF15, de korte versie en lange versie met signaalpeptide. Met behulp van deze overexpressielijnen kan men dan door middel van infectieproeven nagaan of PEF15 een invloed heeft op de verdedigingsmechanismen van de plant. De rijstcalli werden getransformeerd met de pMBb7Fm21GW-UBIL vectoren die de verschillende constructen bevatten. De rijstzaadjes werden gezaaid op callus inducerend medium (CIM) om getransformeerd te worden met de vector. De calli doorliepen verschillende stappen van het protocol beschreven in 8.1 protocol Agrobacterium-gemedieerde rijsttransformatie uit het onderdeel Materiaal en methoden. Na enkele weken gegroeid op regeneratiemedium vertoonden de brokjes geen groene verkleuring of scheutvorming, maar gingen ze afsterven. Daardoor moest de eerste poging om rijst te transformeren afgebroken worden. De tweede poging was een groter succes, waarbij de callus op regeneratiemedium groen kleurde. In figuur 13 kan men calli terugvinden die zich in het beginstadia bevinden en waar scheuten zullen gevormd worden. Het was echter niet mogelijk om binnen het tijdskader de volledig rijsttransformatie af te werken. In de volgende stap in het protocol zouden de scheuten worden overgebracht naar wortelgroeimedium en vervolgens naar potgrond. Wanneer de rijstplanten voldoende gegroeid zijn, kan men dan een RT-qPCR uitvoeren om na te gaan of de rijstplanten succesvol zijn getransformeerd en het gen PEF15 tot expressie brengen. 52
Figuur 18. Verschillende stadia van calli op regeneratiemedium. (a) onverkleurde calli (b) eerste indicatie van scheutvorming door groenkleuring van de calli (c) eerste stadia van scheutvorming (d) callus met een scheut.
2.5. Oppikken van het gen op DNA-niveau Doordat er verschillende versie van het PEF15-gen konden opgepikt worden op cDNA-niveau, werd getracht om het gen op te pikken op DNA niveau. Hiervoor werd hetzelfde protocol gevolgd als 1. Oppikken van een gen maar dit keer werd DNA gebruikt als template. Dit DNA, reeds aanwezig in het labo, was afkomstig uit een DNA-extractie van één nematode. De gebruikte primers vindt men terug in de bijlage I primers. Aangezien verondersteld werd dat er twee of meerdere versies waren van het gen, werden verschillende reverse primers gebruikt. Voor het oppikken van het gen werd steeds dezelfde forward primer gebruikt, maar de reverse primer kon verschillen van construct tot construct. Voor de korte versie en lange versie werden respectievelijk PEF15R1 en PEF15R2 gebruikt. Aangezien er niet in geslaagd werd om de lange versie van PEF15 op te pikken op DNA-niveau met dezelfde primer die gebruikt werd om het gen op cDNA-niveau op te pikken werden nieuwe primers gemaakt. Aan de hand van het programma primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) en de cDNA-sequentie werden verschillende primers ontwikkeld voor de langere versie van het gen. Deze 53
primers; PEF15R3, PEF15R4 en PEF15R5 vindt men terug in bijlage I Primers. De primers werden getest
op
de
vorming
van
hairpinstructuren
door
het
programma
Oligocalc
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html). Voor PEF15R3 kon men een vorming van een hairpinstructuur waarnemen. Deze hairpinstructuur was echter maar 3 baseparen groot zodat er toch besloten werd om deze primer te gebruiken voor het oppikken van de lange versie van PEF15. Na enkele mislukte pogingen om het gen op te pikken met de nieuwe primers werden opnieuw primers ontwikkeld, PEF15R6 en PEF15R7. Met behulp van deze vijf nieuwe reverse primers voor PEF15 was het nog steeds niet mogelijk om de lange versie van PEF15 op te pikken op het DNAextract van één nematode. Om zeker te zijn of het niet aan de kwaliteit van het DNA-extract lag, werd een DNA-extractie uitgevoerd volgens het protocol beschreven in 4. DNA-extractie van de migratorische nematoden H. oryzae in het onderdeel Materiaal en methoden. Vervolgens werd opnieuw een PCR uitgevoerd maar als template werd nu het nieuwe DNA-extract gebruikt. Om zeker te zijn of het niet aan de samenstelling lag van één van de gebruikte oplossingen werd een controle ingesloten, namelijk het oppikken van chorismaatmutase. Het resultaat van de PCR is weergegeven in figuur 14. Hieruit kan men besluiten dat het niet aan het DNA-extract of aan de gebruikte oplossingen ligt omdat het de controle in laan 6 werd opgepikt.
Figuur 19. Resultaat PCR op DNA-extract van H. oryzae. In laan 1 tot en met laan 5 verschillende primer combinaties voor het oppikken van de lange versie van PEF15. In laan 6 controle met primers voor chorismaatmutase. L: DNA ladder.
Tenslotte werd om de lange versie van PEF15 op te pikken op DNA-niveau werd het PCR programma aangepast. Hierbij werd de elongatietijd verhoogd tot 2 minuten en 30 seconden. Dit had echter geen effect op het resultaat van de PCR omdat nog steeds geen bandje werd waargenomen wanneer het PCR-product op gel werd geanalyseerd. Voor de korte versie werd er wel in geslaagd om het op te pikken op DNA-niveau met dezelfde primers die gebruikt werden voor de in situ hybridisatie. Hieruit bleek dat de sequentie op cDNA- en DNA-niveau gelijk waren. Het ontbreken van introns in het gen zou kunnen wijzen op een bacteriële
54
contaminatie. Dit kunnen we echter uitsluiten omdat aangetoond werd dat het wel degelijk tot expressie komt in de nematode.
3. Analyse van chorismaatmutase en isochorismatase Chorismaatmutase en isochorismatase zijn twee enzymen die een rol spelen in de biosynthesepathway van salicylzuur. Het is reeds aangetoond dat salicylzuur belangrijk is voor de hypersensitieve respons in de plant. Het eventuele effect van CM of ICM werd nagegaan aan de hand van een Agrobacterium-gemedieerde transformatie van tabaksplanten. Chorismaat kan omgezet worden naar salicylzuur via twee pathways namelijk de isochorismaatpathway en de fenylpropanoïdpathway. Wanneer chorismaatmutase via de stylet van de nematoden in de plant terecht komt, zou dit chorismaat kunnen omzetten naar onder andere fenylalanine. Dit zorgt voor een minder efficiënte productie van salicylzuur waardoor de verdediging van de plant niet optimaal is. Naast chorismaatmutase is ook het gen dat codeert voor isochorismatase teruggevonden in het transcriptoom van H. oryzae. Wanneer chorismaat via de isochorismaat-pathway salicylzuur produceert kan het isochorismatase isochorismaat afbreken, waardoor er minder isochorismaat beschrikbaar is voor de productie van salicylzuur. Hierdoor kunnen er gereduceerde levels van salicylzuur ontstaan waardoor de verdediging van de plant niet optimaal is. Om na te gaan of chorismaatmutase en isochorismatase de hypersensitieve respons van de plant kunnen onderdrukken werd het protocol beschreven in 7. Transiënte transformatie van tabaksplanten uit het onderdeel Materiaal en methoden uitgevoerd. Het R3a en Avr3A paar in dat protocol werd echter vervangen door het Gpa-2 en Gp-RBP-1 paar omdat uit communicatie met Lander Bauters bleek dat Kat, ICM en NoSP geen suppressie vertoonden van de hypersensitieve respons opgewekt door het R3a en Avr3a paar. Figuur 20 toont de structuur terug van chorismaatmutase. Hieruit blijkt dat het eiwit bestaat uit een signaalpeptide gevolgd door een histidine- en serine-rijk domein met daar aansluitend een katalytisch domein. Om na te gaan welk deel van het gen verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de eventuele suppressie van de hypersensitieve respons werden verschillende constructen gemaakt. In het eerste construct, Kat, werd enkel het katalytisch domein van chorismaatmutase gekloneerd in de pK7WG2 vector. In het tweede construct werd het volledig gen zonder signaalpeptide in de pK7WG2 vector gekloneerd. De scores van het eerste experiment zijn terug te vinden in bijlage VI Score-tabel ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (1). In het experiment werden telkens drie bladeren per plant geïnfiltreerd
55
volgens figuur 21. In totaal werden 15 planten geïnfiltreerd en enkel de lege Agrobacterium GV3101 met het VirG-plasmide werd gebruikt als controle.
Signaalpeptide Histidine- en serine-rijk domein Chorismaatmutase katalytisch domein Figuur 20. Schematische voorstelling van CM, bestaande uit een signaalpeptide gevolgd door een histidine- en serine-rijk domein met aansluitend het katalytisch domein.
Figuur 21. Proefopzet van Agrobacterium gemedieerde transformatie van tabaksplanten. De proefopzet van ICM, Kat en NoSP. Leeg: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Lege Agrobacterium GV3101 met het VirG plasmide. ICM: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pk7WG+ ICM. Kat: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ kat. NoSP: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ NoSP. ICM: isochorismatase, Kat: katalytisch domein van chorismaatmutase, NoSP, chorismaatmutase zonder signaalpeptide
Vervolgens werd een Fisher exact test uitgevoerd om na te gaan of er een statistisch verschil is tussen het gen, hier ICM, Kat of NoSP en de controle. In bijlage VII Resultaten Fisher exact test ICM, Kat & NoSP (1) vindt men cross-tabel en de p-waarden van de Fisher-exact test terug. De p-waarden waren voor ICM, Kat en NoSP zijn respectievelijk 0,008, 1 en 0,000. De p-waarden voor ICM en NoSP zijn kleiner dan het 5% significantieniveau. Dit wijst er op dat er een significant verschil is tussen beide groepen. Zowel ICM en NoSP zorgen voor suppressie van de hypersensitieve respons van de plant. Het katalystisch domein kon op zich geen suppressie veroorzaken. Dit kan wijzen op het feit dat het histidine- en serine-rijk domein nodig is voor een eventuele binding van het eiwit aan het doel-planteneiwit.
56
Aangezien er maar één enkele controle was ingesloten en slechts 15 planten werden geïnfiltreerd, werd het experiment herhaald. De scores van het tweede experiment zijn terug te vinden in de bijlage VIII Score-tabel ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (2). In dit experiment werden 18 planten geïnfiltreerd volgens figuur 22 (A) en 15 planten volgens figuur 22 (B). In totaal werden respectievelijk voor A en B van figuur 22 er 45 en 61 bladeren geïnfiltreerd.
Figuur 22. Proefopzet van Agrobacterium-gemedieerde transformatie van tabaksplanten. De proefopzet van Kat en NoSP (A) en ICM (B). Leeg: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Lege Agrobacterium GV3101 met het VirG plasmide. Gfp: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pg7WG+GFP. Kat: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + GpRBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ kat (A). NoSP: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ NoSP (A). ICM: infiltratie met mengsel van Agrobacterium AgI + Gpa2, Agrobacterium AgI + Gp-RBP-1 en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+ ICM (B). ICM: isochorismatase, Kat: katalytisch domein van chorismaatmutase, NoSP, chorismaatmutase zonder signaalpeptide.
Hierop werd terug een Fisher exact test uitgevoerd. ICM, Kat en NoSP werden vergeleken met zowel de lege Agrobacterium GV3101-vector met het VirG-plasmide als met de Agrobacterium GV3101vector met pg7WG+GFP, de twee controles die ingesloten waren in het experiment. De crosstabel en de p-waarden vindt men terug in bijlage IX Resultaten Fisher exact test ICM, Kat & NoSP met GpRBP-1 en Gpa2 (2). De p-waarden waarbij de lege Agrobacterium GV3101-vector vergeleken werd met ICM, Kat of NoSP waren voor alle drie de stalen 0,000. Dit duidt op significant verschil tussen beide groepen. Bij de tweede controle waar Agrobacterium GV3101-vector met pg7WG+GFP vergeleken werd met ICM, Kat of NoSP bekwam men respectievelijk p-waarden uit van 0,001, 0,029 en 0,044. Deze p-waarden zijn kleiner dan het 5% significantieniveau dus hier kan men eveneens een significant verschil waarnemen tussen beide groepen. De p-waarde liggen hoger dan de p-waarden bekomen met lege Agrobacterium GV3101 vector omdat er veel infiltratie plaatsen een waarde van 0 scoorden. Dit zorgt voor hogere p-waarden omdat het verschil tussen beide groepen kleiner is. Men kan dus besluiten dat zowel isochorismatase, het katalytische domein van chorismaatmutase en het chorismaatmutase zonder signaalpeptide de hypersensitieve respons kunnen onderdrukken. In 57
het eerste experiment zag men dat het katalytisch domein van chorismaatmutase niet voldoende was om de hypersensitieve respons te onderdrukken. In het tweede experiment werd statisch bewezen dat dit echter wel het geval is. Men zal dit experiment nog een derde maal moeten herhalen om te tonen welke deel verantwoordelijk is voor de suppressie van de hypersensitieve respons. In figuur 23 kan men duidelijk zien wanneer de hypersensitieve respons onderdrukt wordt en wanneer de score “nul” wordt gegeven aan een infiltratieplaats
Figuur 23. Voorbeeld van een hypersensitieve respons (A) en het onderdrukken van een hypersensitieve respons (B) ten opzichte van twee controles. De infiltratieplaatsen zijn volgens de proefopzet zoals weergeven in figuur 22 (A). De twee controles hier zijn de lege Agrobacterium GV3101 met het VirG plasmide en Agrobacterium GV3101 met pK7WG2+GFP aan de rechterzijde van het blad. Aan de linkerzijde van de blad zijn er twee infiltratieplaatsen die t Agrobacterium die Kat of NoSP tot expressie brengt. In (A) ziet men dat alle vier de infiltratieplaatsen een hypersensitieve respons vertonen, men zal dus een score van 1 geven aan deze vier plaatsen. In (B) ziet men enkel aan de rechterzijde van het blad ter hoogte van de twee controles een hypersensitieve respons. Men zal dus enkel een score van 1 geven voor de twee controles. Aan de linkerzijde van het blad waar de infiltratieplaatsen van Kat en NoSP zich bevinden ziet men een onderdrukking van de hypersensitieve respons en kan men een waarde van 0 toekennen.
58
Discussie Nematoden hebben verschillende types effectoren, maar niet alle effectoren zijn reeds geïdentificeerd. De beste gekende effectoren zijn celwand modificerende eiwitten. De eerste geïdentificeerde effector was beta-1,4-endoglucanase die cellulose kan afbreken in de plantencelwand (Smant et al. 1998b). Transcriptoomanalyses worden steeds vaker gebruikt om nieuwe kandidaat-effectorgenen op te sporen (Haegeman et al. 2012a). Voor de migratorische nematode H. oryzae is nog maar net een transcriptoomanalyse uitgevoerd (Bauters et al. 2014). Deze data kan gebruikt worden als basis voor het onderzoek naar effectoren van dit organisme. Een eerste indicatie dat genen coderen voor mogelijke effectoren, is de aanwezigheid van een signaalpeptide en de afwezigheid van een transmembranair domein. Een bijkomende indicatie is wanneer het gen voorkomt in andere plant-parasitaire nematoden of organismen, maar niet in organismen met een andere levensstijl. Dit suggereert dat deze genen belangrijk zijn voor de interactie tussen de plant en de pathogeen. Wanneer aan deze criteria voldaan is, kan men de lokalisatie van expressie nagaan met behulp van in situ hybridisatie. Potentiële effectorgenen zullen meestal tot expressie komen in de faryngeale kliercellen van de nematode omdat de eiwitten van hieruit gesecreteerd kunnen worden in het plantenweefsel. In M. incognita werd aangetoond dat beta-1,4-endoglucanase tot expressie kwam in de subventrale klieren van de nematoden en zo kan gescreteerd worden via de stylet (Bellafiore et al. 2008). In een studie van Haegeman et al. werd aangetoond dat verschillende potentiële effectoren zoals pectaatlyase, c-type lectine tot expressie komen in de subventrale klieren van de nematoden van M. graminicola (Haegeman et al. 2012a). Via in situ hybridisatie werd de expressie van PEF15 aangetoond in de kliercellen, wat een indicatie is van een mogelijke functie als effector. De volgende stap in de identificatie van mogelijke effectorgenen is de functie achterhalen. Aangezien er gezocht wordt naar nieuwe potentiële effectoren is er weinig geweten over de functie van deze genen, wat het onderzoek niet eenvoudig maakt. Voor gekende effectoren is het mogelijk om de functie te voorspellen door het uitvoeren van een blast tegen publieke databases. De sequentie van PEF15 vertoont geen homologie met gekende genen, maar heeft wel homologen in andere plant-parasitaire nematoden. Dit versterkt de hypothese dat PEF15 belangrijk kan zijn voor de interactie tussen pathogeen en waardplant. Aangezien effectoren verschillende functies kunnen hebben waaronder onder andere een effect op de plantenafweer, kan men dit testen in een Agrobacterium-gemedieerde transiënte transformatie op tabak. Dit kan een eerste indicatie geven of dit eiwit een effect heeft op de plantenafweer. Uit de resultaten van dit experiment blijkt dat PEF15 geen effect heeft op de hypersensitieve respons van tabak veroorzaakt door het Gpa2 en Gp-RBP-1 paar en het R3a en Avr3A paar . Dit sluit echter niet 59
uit dat PEF15 een rol kan spelen in de plantenafweer. Vervolgens kan PEF15 tot expressie gebracht worden in rijst om de functie in de plant te achterhalen. In het verleden zijn er al verschillende studies uitgevoerd waarbij een effector tot expressie gebracht werd in de gastheer om een beter inzicht te krijgen in de functie van het eiwit. In een studie van Jaouannet et al., heeft men een transgene Arabidopsis thaliana gegenereerd die een dubbelstrengig hairpin RNA homoloog van het calreticuline van M. incognita tot expressie bracht. Hierdoor werd het calrecticuline in de nematoden gesilenced wanneer het zich voedde aan de plant. Dit toonde aan dat de expressie van calreticuline in Arabidopsis thaliana de plant vatbaarder maakt voor een infectie met M. incognita (Jaouannet and Rosso 2013). Er zijn al rijstplanten getransformeerd om na te gaan of de aanwezigheid van een gen effect heeft op de rijstplant zoals transgene rijst die een cysteïneprotease inhibitor tot expressie brengt. Deze transgene rijst vertoont een verhoogde resistentie tegen M. incognita (P.Vain 1998). Net zoals in bovenvermelde onderzoeken, werd ook binnen het onderzoek van deze thesis getracht om wat meer licht te werpen op de functie van PEF15 door transgene rijstplanten te maken die dit gen tot overexpressie brengen. De gegenereerde transgene rijstplanten konden niet meer verder bestudeerd worden binnen de beschikbare tijdspanne. Binnen het tijdskader konden calli getransformeerd worden met PEF15 en werden de eerste scheuten geregenereerd. In de volgende stap zullen de scheuten overgezet worden naar wortelgroeimedium en tenslotte naar potgrond. Wanneer de rijstplanten zijn overgezet naar potgrond kan een RT-PCR uitgevoerd worden om na te gaan of de rijstplanten het gen tot expressie brengen.
Uit
sequentieanalyse
bleek
dat
er
homologen
aanwezig
waren
in
enkele
wortelgalnematoden, maar niet in andere vrijlevende of dierparasitaire nematoden. Dit kan er opnieuw op wijzen dat het gen belangrijk is voor de interactie van de nematode met de plant. Aan de hand van de alignering werden geconserveerde residuen geïdentificeerd. Om na te gaan of deze residuen belangrijk zijn voor het eiwit moet eerst de functie van dit eiwit bestudeerd worden. Op deze manier kan achterhaald worden of dit eiwit een enzymatische functie heeft. Indien dit het geval is, is het aannemelijk dat de één of meerdere van deze geconserveerde residuen katalytisch actief is. Daarna kan men aan de hand van mutanten, die een mutatie bevat in één van deze residuen, nagaan of het residu wel degelijk nodig is voor de eventuele activiteit van het eiwit. Verder kon een serinerijk domein worden teruggevonden in PEF15 en verscheidene homologen. Er konden geen homologen teruggevonden worden in plant-parasitaire fungi of bacteriën. Dit kan erop wijzen dat het gen specifiek is voor nematoden. Aangezien er verschillende versies van PEF15 blijken te bestaan, moet men trachtten het gen op te pikken op DNA-niveau om dit verder te analyseren . Men kan aan de hand van bijvoorbeeld bio-informatica tools nagaan of het gen alternatieve splicing ondergaat. 60
Verder gebeurde ook nog analyse van twee nematoden genen die belangrijk zijn in de pathway voor de productie van salicylzuur, namelijk chorismaatmutase en isochorismatase. Salicylzuur is belangrijk bij afweer tegen pathogenen. De productie van salicylzuur is weergegeven in figuur 6 en vindt plaats in de chloroplasten van de plant (Garcion et al. 2008). Salicylzuur kan in planten door twee onafhankelijke
pathways
geproduceerd
worden,
de
fenylpropanoid-
en
de
isochorismaatbiosynthesepathway, waarbij chorismaat het primaire metaboliet is (Vogt 2010). Chorismaat wordt geproduceerd door de shikimaatpathway (Hu, Meng, and Wise 2009). Er zijn verschillende vormen van CM die zowel in het cytoplasma als in de plastiden voorkomen van de plant, maar de volledige shikimaatpathway komt enkel in de plastiden voor (Doyle and Lambert 2003). Dit zal er voor zorgen dat er een competitie optreedt voor chorismaat tussen het cytoplasmatische chorismaatmutase en chorismaatmutase aanwezig in de plastiden (Eberhard et al. 1996). De fenylpropanoïdpathway kan naast salicylzuur nog andere belangrijke moleculen van de plant produceren, zoals bijvoorbeeld flavonoïden en lignine, waardoor deze pathway minder efficiënt salicylzuur zal produceren. Bijgevolg is de productie van salicylzuur bij een infectie door pathogenen voor
90%
afkomstig
uit
de
isochorismaatbiosynthesepathway
(Vogt
2010).
De
isochorismaatbiosynthese pathway zal chorismaat omzetten naar isochorismaat en isochorismaat zal uiteindelijk omgezet worden naar salicylzuur. Wanneer chorismaatmutase gesecreteerd wordt vanuit de nematoden in het cytosol van de plant kan dit het chorismaat uit de plastiden wegmetaboliseren (Doyle and Lambert 2003). Hierdoor wordt de hoeveelheid chorismaat, dat dient als substraat voor de biosynthese van salicylzuur, verlaagd in de plastiden (Djamei et al. 2011). Chorismaatmutase zal chorismaat omzetten naar fenylalanine in het cytoplasma waardoor de productie van salicylzuur wordt verminderd. Hierdoor wordt de productie van salicylzuur gestuurd in de richting van de fenylpropanoïdpathway. Dit kan leiden tot een lagere productie van salicylzuur bij infectie van de plant met pathogenen. Bovendien is het mogelijk dat isochorismatase gesecreteerd in het cytoplasma het isochorismaat kan wegmetaboliseren uit de plastiden waardoor isochorismaat omgezet wordt. Hierdoor zou het kunnen dat er minder isochorismaat beschikbaar is voor de productie van salicylzuur in de plastiden. Het is dus mogelijk dat beide enzymen leiden tot een minder efficiënte productie van salicylzuur en zo de plant gevoeliger maken voor infectie. De expressie van chorismaatmutase is reeds aangetoond in verscheidene wortelgalnematoden, zoals Meloidygne javanica, die chorismaatmutase injecteren in de plant (Doyle and Lambert 2003). In de studie van Doyle en Lambert hebben ze het CM gen van M. javanica tot expressie gebracht in soja en veronderstellen ze dat CM gesecreteerd wordt door de nematoden op het moment dat plantencellen 61
gemodificeerd worden voor parasitisme. (Doyle and Lambert 2003). De auteurs suggereren dat CM actief is in het cytoplasma waardoor de shikimaatpathway veranderd wordt (Doyle and Lambert 2003). Naast wortelgalnematoden en migratorische nematoden zijn er al chorismaatmutase genen terug gevonden bij de cystnematode Heterodera glycines (Bekal, Niblack, and Lambert 2003). Aangezien transgene soja die CM uit H. glycines tot overexpressie brengen de biosynthese van auxine onderdrukt, wordt er verondersteld dat ook andere plantcomponenten die belangrijk zijn in de plantenafweer zoals salicylzuur en fytoalexines, die geproduceerd worden vanuit chorismaat, worden onderdrukt (Bekal, Niblack, and Lambert 2003). Men veronderstelt dat sedentaire nematoden deze effectoren gaan secreteren om hun voedingsplaats te maken en om de plantenafweer van de plant te ontregelen (Hewezi and Baum 2013). Migratorische nematoden maken geen speciale voedingsplaats aan, maar zullen effectoren gebruiken om de plantenafweer te manipuleren in hun eigen voordeel (Oliver and Solomon 2010). Het chorismaatmutase van H. oryzae bevat een Nterminaal signaalpeptide en de expressie in de klieren is reeds aangetoond via in situ hybridisatie (Bauters et al. 2014). Niet H. oryzae brengen CM tot expressie maar ook andere migratorische nematoden zoals Pratylenchus coffeae bevatten CM in hun transcriptoom (Haegeman, Joseph, and Gheysen 2011). Dit geeft een indicatie dat CM een belangrijke rol kan spelen bij het infectieproces van migratorische nematoden. Om na te gaan of CM en ICM van H. oryzae belangrijk zijn voor de suppressie van de plantenafweer werd
een
Agrobacterium
gemedieerde
transiënte
transformatie
gedaan
van
tabak.
Chorismaatmutase bestaat uit een signaalpeptide gevolgd door een histidine-serine rijk domein met aansluitend het katalytisch domein. Om na te gaan of elk deel nodig is voor een eventuele functie in de waardplant werden verschillende constructen gemaakt. Het eerste construct bevatte het volledige gen met uitzondering van het signaalpeptide. Het tweede construct bevatte enkel het katalytisch domein van chorismaatmutase. Door gebruik te maken van deze twee constructen werd nagegaan of het histidine-serine rijk domein belangrijk was voor de eventuele functie van het eiwit. Uit een eerste tabaksinfiltratie bleek dat zowel isochorismatase als het volledige chorismaatmutase zonder signaalpeptide suppressie veroorzaakte van de hypersensitieve respons. Dit geeft een eerste indicatie dat zowel chorismaatmutase als isochorismatase een rol spelen in de interactie tussen plant en pathogeen. Aangezien enkel het katalytische domein van chorismaatmutase geen suppressie gaf, kan men veronderstellen dat het histidine-serine rijk domein belangrijk is voor het onderdrukken van de hypersensitieve respons. Dit histidine-serine rijk domein kan belangrijk zijn voor binding van het substraat aan chorismaatmutase.
62
Om zeker te zijn dat de eerste tabaksinfiltratie geen vals positief resultaat gaf, werd er een tweede tabaksinfiltratie uitgevoerd. In deze tweede tabaksinfiltratie werd een tweede controle ingevoerd en werden een groter aantal planten geïnfiltreerd. Net zoals bij de eerste tabaksinfiltratie vertoonden isochorismatase en het volledige chorismaatmutase zonder signaalpeptide suppressie van de hypersensitieve respons. Maar ook enkel het katalytisch domein van chorismaatmutase was in staat om de hypersensitieve respons te onderdrukken, dit in tegenstelling tot de eerste tabaksinfiltratie. Hieruit kan men besluiten dat enkel het katalytisch domein voldoende is om suppressie te veroorzaken. Deze suppressie kan veroorzaakt worden door een verminderde productie van salicylzuur. Het is mogelijk dat CM en ICM in het cytoplasma het chorismaat uit de plastiden onttrekken, wat kan leiden tot een minder efficiënte productie van salicylzuur. Men kan hierbij spreken van een “chorismaatcompetitiemodel” (Bekal, Niblack, and Lambert 2003). Een verlaagde hoeveelheid salicylzuur kan aanleiding geven tot een verminderde hypersensitieve respons aangezien salicylzuur een onmisbare component is in de hypersensitieve respons. Het is reeds aangetoond dat salicylzuur onmisbaar is bij een virusinfectie bij de aardappel (Baebler et al. 2014). In deze studie heeft een transcriptoomanalyse de centrale rol van SA bij virusinfectie bevestigd. De afwezigheid van SA zal leiden tot een significant verschil op transcriptoomniveau, waardoor er een vertraging optreedt in activatie van genen die belangrijk zijn voor de plantrespons zoals genen die coderen voor receptoren of MAPK-kinasen. Receptoren en MAPK kinasen spelen een belangrijk rol in signalisatie (Baebler et al. 2014). Natuurlijk is het moeilijk om het mechanisme van een virusinfectie te veralgemenen naar een infectie met nematoden, maar het heeft wel een indicatie dat SA zeer belangrijk is bij een infectie van de plant door een pathogeen. In de studie van Djamei heeft men aangetoond dat chorismaatmutase van Ustilago maydis kan opgenomen worden door de plantencel en zich kan verspreiden naar andere cellen en de metabolische status van de cellen kan veranderen door metabolische “priming” (Djamei et al. 2011). In dit geval is chorismaatmutase een virulentiefactor (Djamei et al. 2011). Om zeker te zijn dat chorismaatmutase en isochorismatase wel degelijk suppressie geven van de hypersensitieve respons is nog een derde herhaling nodig. Bij plant-pathogenen studies wordt elk experiment best minstens drie maal herhaald worden om zeker te zijn dat het de resultaten wel degelijk juist waren. Er is een eerste indicatie dat chorismaatmutase en isochorismatase een belangrijke rol speelt in de suppressie van de plantenafweer om zo de rijstplant succesvol te infecteren. Er zijn echter nog bijkomende experimenten nodig om deze hypothese te bevestigen, maar chorismaatmutase en isochorismatase zijn aanwezig in verschillende plant geassocieerde pathogenen en zouden kunnen dienen als middel om de plantafweer tegen te gaan.
63
Toekomstperspectieven Zowel voor PEF15 als voor chorismaatmutase en isochorismatase is het interessant om verder onderzoek uit te voeren. PEF15 komt tot expressie in de faryngeale klieren en heeft homologen in andere plant-parasitaire nematoden. Deze bevindingen wijzen erop dat PEF15 gesecreteerd wordt doorheen de stylet in de plantencel en helpt om de plant succesvol te infecteren. Een nadeel dat geassocieerd is met PEF15 is dat er verschillende versies van het eiwit gevonden zijn. Bij verder onderzoek zou men kunnen opteren om verder te werken met de lange versie van het eiwit omdat hierop de homologie in andere plant-parasitaire nematoden werd nagegaan. Wegens tijdsgebrek slaagde ik er niet in om tijdens de duur van mijn masterproef de rijstplanten die PEF15 tot overexpressie brengen te analyseren. Binnen enkele weken zouden deze plantjes groot genoeg moeten zijn om de eerste analyses op uit te voeren. De eerstvolgende stap in het onderzoek naar PEF15 zijn infectieproeven. Hierbij zal nagegaan worden of de getransformeerde rijstplanten die PEF15 tot overexpressie brengen gevoeliger zijn voor infectie met H. oryzae dan de wild type planten. Als de getransformeerde planten gevoeliger zijn voor infectie is dit een bijkomend bewijs voor het feit dat PEF15 belangrijk is voor de infectie van H. oryzae bij rijst. Men kan aan de hand van een RTqPCR de genexpressie van bepaalde rijstgenen nagaan die belangrijk zijn voor de verdediging van de waardplant (zoals bijvoorbeeld genen die betrokken zijn in de synthese van salicylzuur of genen waarvan de expressie beïnvloed wordt door SA) Dit zal men doen voor zowel de rijst die PEF15 tot expressie brengt als rijst die getransformeerd is met een lege vector die als controle gebruikt kan worden. Tenslotte kan men ook de bindingspartners van PEF15 trachten te achterhalen. Men kan gebruik maken van de techniek YEAST-2-HYBRID. Deze techniek kan enkel bindingspartners van het eiwit achterhalen wanneer deze interactie in de kern kan gebeuren, maar het is niet geweten waar PEF15 gelokaliseerd is in de plantencel. Een andere mogelijke techniek is om het gen te labelen met een tag, bijvoorbeeld een his-tag. Deze his-tag heeft een hoge affiniteit voor een Nikkel-kolom. Het eiwit met de his-tag zal hierdoor weerhouden worden aan de Nikkel-kolom, samen met zijn bindingspartner(s). Daarna zal men het eiwit losmaken ter hoogte van de his-tag, waardoor het eiwit en zijn bindingpartners van de Nikkel-kolom loskomen. Tenslotte kunnen de bindingspartners geïdentificeerd worden aan de hand van massaspectrometrie. Wanneer de bindingspartners van PEF15 achterhaald kunnen worden, kan men nagaan of deze bindingspartners een functie vervullen in bepaalde pathways van de plant. Dit kan een indicatie geven over de mogelijke functie van PEF15 of de pathway waar PEF15 een invloed kan op hebben. Uit de eerste resultaten blijkt dat chorismaatmutase en isochorismatase de hypersensitieve respons in de tabaksplanten onderdrukken. Er is een derde herhaling nodig om deze resultaten te bevestigen.
64
Wanneer deze resultaten kunnen bevestigd worden, is het interessant om verder onderzoek uit te voeren op deze twee genen. De eerste stap is het maken van rijst die CM en ICM van Hirschmaniella oryzae tot expressie brengt. Deze stap werd al uitgevoerd in het labo. Vervolgens kan men op de getransformeerde rijst infectieproeven uitvoeren om na te gaan of de getransformeerde rijst gevoeliger is voor infectie met Hirschmanniella oryzae. Wanneer de getransformeerde rijst gevoeliger is voor de infectie met H. oryzae geeft dit een bijkomend bewijs dat de nematode CM en ICM een rol spelen in het infectieproces. Men veronderstelt dat CM en ICM een effect hebben op de biosynthesepathway van salicylzuur. Men kan aan de hand van verschillende RT-qPCR experimenten trachten te voorspellen welke genen precies in deze pathway worden op- of neergereguleerd. Men kan ook gaan kijken of CM en ICM geen effect hebben op andere hormoonpathways aan de hand van RT-qPCR. Naast het feit dat bepaalde genen zullen op- of neergereguleerd worden door ICM of CM kan men ook eventuele bindingspartners gaan identificeren van CM en ICM. Hiervoor zal men CM als ICM moeten labelen met een tag, bijvoorbeeld een His-tag zodat CM of ICM samen met hun bindingspartner kunnen weerhouden worden een Nikkel-kolom. De mogelijke bindingspartners van CM of ICM kunnen bijkomende informatie geven of CM en/of ICM misschien ook in andere pathways een mogelijke rol spelen.
65
Referenties 1. Abad, P., P. Castagnone-Sereno, M. N. Rosso, J. de Almeida-Engler, and B. Favery. 2009. Invasion, feeding and development. In Root-knot nematodes, eds. Perry, R. N., M. Moens, and J. L. Starr, 163-181. (Oxfordshire: CAB). 2. Abad, P., J. Gouzy, J. M. Aury, P. Castagnone-Sereno, E. G. Danchin, E. Deleury, L. PerfusBarbeoch et al. 2008. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nat.Biotechnol. 26, no. 8:909-915. 3. Alfano, J. R. and A. Collmer. 2004. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annual Review of Phytopathology 42:385-414. 4. Babatola, J. O. 1981. Effect of Ph, oxygen and temperature on the activity and survival of Hirschmanniella Spp. Nematologica 27, no. 3:285-291. 5. Babatola, J. O. and J. Bridge. 1979. Pathogenicity of Hirschmanniella oryzae, Hirschmanniella spinicaudata and Hirschmanniella imamuri on rice. Journal of Nematology 11, no. 2:128-132. 6. Babatola, J. O. and J. Bridge.. 1980. Feeding behavior and histopathology of Hirschmanniella oryzae, H. imamuri, and H. spinicaudata on rice. Journal of Nematology 12, no. 1:4853. 7. Baebler, S., K. Witek, M. Petek, K. Stare, M. Tusek-Znidaric, M. Pompe-Novak, J. Renaut et al. 2014. Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-genemediated response against Potato virus Y infection in potato. Journal of Experimental Botany 65, no. 4:1095-1109. 8. Bakhetia, M., P. E. Urwin, and H. J. Atkinson. 2007. QPCR analysis and RNAi define pharyngeal gland cell-expressed genes of Heterodera glycines required for initial interactions with the host. Mol.Plant Microbe Interact. 20, no. 3:306-312. 9. Bauters, L., A. Haegeman, T. Kyndt, and G. Gheysen. 2014. Analysis of the transcriptome of Hirschmanniella oryzae to explore potential survival strategies and host-nematode interactions. Molecular Plant Pathology 15, no. 4:352-363. 10. Bekal, S., T. L. Niblack, and K. N. Lambert. 2003. A chorismate mutase from the soybean cyst nematode Heterodera glycines shows polymorphisms that correlate with virulence. Molecular Plant-Microbe Interactions 16, no. 5:439-446. 11. Bellafiore, S., Z. X. Shen, M. N. Rosso, P. Abad, P. Shih, and S. P. Briggs. 2008. Direct identification of the Meloidogyne incognita secretome reveals proteins with host cell reprogramming potential. Plos Pathogens 4, no. 10. 12. Bridge, J., R. A. Plowright, and D Peng. 2005. Nematode parasites of rice. In Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture, eds. Luc, M., R. A. Sikora, and J. Bridge, 87-130. (Wallingford, Oxfordshire: CABI publishing). 13. Campbell, A. M., P. H. Teesdale-Spittle, J. Barrett, E. Liebau, J. R. Jefferies, and P. M. Brophy. 2001. A common class of nematode glutathione S-transferase (GST) revealed by the theoretical proteome of the model organism Caenorhabditis elegans. Comp Biochem.Physiol B Biochem.Mol.Biol. 128, no. 4:701-708. 66
14. Chen, H., Y. J. Lin, and Q. F. Zhang. 2009. Review and prospect of transgenic rice research. Chinese Science Bulletin, no. 54:4049-4068. 15. Cosgrove, D. J. 2005. Growth of the plant cell wall. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 6, no. 11:850-861. 16. Davis, E. L., A. Haegeman, and T. Kikuchi. 2011. Degradation of the Plant Cell Wall by Nematodes. In Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions, eds. Jones, J., G. Gheysen, and D. J. P. Ferguson, 255-272. (Dundee: Springer). 17. Davis, E. L., R. S. Hussey, T. J. Baum, J. Bakker, A. Schots, M. N. Rosso, and P. Abad. 2000. NEMATODE PARASITISM GENES. Annual Review of Phytopathology 38:365-396. 18. De Meutter J., T. Tytgat, E. Prinsen, G. Gheysen, Onckelen H. Van, and G. Gheysen. 2005. Production of auxin and related compounds by the plant parasitic nematodes Heterodera schachtii and Meloidogyne incognita. Commun.Agric.Appl.Biol.Sci. 70, no. 1:51-60. 19. De Meutter J., T. Tytgat, E. Witters, G. Gheysen, Onckelen H. Van, and G. Gheysen. 2003. Identification of cytokinins produced by the plant parasitic nematodes Heterodera schachtii and Meloidogyne incognita. Molecular Plant Pathology 4, no. 4:271-277. 20. De Waele D. and A. Elsen. 2007. Challenges in tropical plant nematology. Annual Review of Phytopathology 45:457-485. 21. Dixon R. A., L. Achnine, P. Kota, C. J. Liu, M. S. Reddy, and L. Wang. 2002. The phenylpropanoid pathway and plant defence-a genomics perspective. Molecular Plant Pathology 3, no. 5:371-390. 22. Djamei, A., K. Schipper, F. Rabe, A. Ghosh, V. Vincon, J. Kahnt, S. Osorio et al. 2011. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature 478, no. 7369:395-398. 23. Doyle, E. A. and K. N. Lambert. 2003. Meloidogyne javanica chorismate mutase 1 alters plant cell development. Molecular Plant-Microbe Interactions 16, no. 2:123-131. 24. Dubreuil, G., M. Magliano, E. Deleury, P. Abad, and M. N. Rosso. 2007. Transcriptome analysis of root-knot nematode functions induced in the early stages of parasitism. New Phytol. 176, no. 2:426-436. 25. Eberhard, J., T. T. Ehrler, P. Epple, G. Felix, H. R. Raesecke, N. Amrhein, and J. Schmid. 1996. Cytosolic and plastidic chorismate mutase isozymes from Arabidopsis thaliana: molecular characterization and enzymatic properties. Plant Journal 10, no. 5:815821. 26. Fernandez, L., M. T. N. Casaban, and D. De Waele. Life cycle of the root-knot nematode Meloidogyne graminicola at different temperature under non-flooded conditions. 2013. Archives of Phytopathologogy and Plant Protection. 27. Garcion, C., A. Lohmann, E. Lamodiere, J. Catinot, A. Buchala, P. Doermann, and J. P. Metraux. 2008. Characterization and biological function of the ISOCHORISMATE SYNTHASE2 gene of Arabidopsis. Plant Physiol 147, no. 3:1279-1287. 28. Gelvin, S. B. 1998. Agrobacterium VirE2 proteins can form a complex with T strands in the plant cytoplasm. Journal of Bacteriology 180, no. 16:4300-4302. 67
29. Germani, G., G. Reversat, and M. Luc. 1983. Effect of Sesbania rostrata on Hirschmanniella oryzae in flooded rice. Journal of Nematology 15, no. 2:269-271. 30. Glazebrook, J. 2005. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annual Review of Phytopathology 43:205-227. 31. Goff, S. A., D. Ricke, T. H. Lan, G. Presting, R. Wang, M. Dunn, J. Glazebrook et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 296, no. 5565:92-100. 32. Haegeman, A., L. Bauters, T. Kyndt, M. M. Rahman, and G. Gheysen. 2012a. Identification of candidate effector genes in the transcriptome of the rice root knot nematode Meloidogyne graminicola. Molecular Plant Pathology. 33. Haegeman, A., S. Joseph, and G. Gheysen. 2011. Analysis of the transcriptome of the root lesion nematode Pratylenchus coffeae generated by 454 sequencing technology. Mol.Biochem.Parasitol. 178, no. 1-2:7-14. 34. Haegeman, A., S. Mantelin, J. T. Jones, and G. Gheysen. 2012b. Functional roles of effectors of plant-parasitic nematodes. Gene. 35. Hendro, M. E., J.-C. Prot, and C. P. Madamba. Population dynamics of Hirschmaniella mucronata and H. oryzae on Sesbania rostrata, Aeschynomene afraspera and rice cv. IR 58. [15], 167-172. 1992. Fundamental and Applied Nematology. 36. Hewezi, T. and T. J. Baum. 2013. Manipulation of plant cells by cyst and root-knot nematode effectors. Mol.Plant Microbe Interact. 26, no. 1:9-16. 37. Hollis, J. P. and S. Keoboonrueng. Nematode parasites on rice. In:Nickle, W.R.(ed.). 95-146. 1984. Plant and Insect Nematodes. Marcel Dekker, New York. 38. Hu, P. S., Y. Meng, and R. P. Wise. 2009. Functional contribution of chorismate synthase, anthranilate synthase, and chorismate mutase to penetration resistance in barleypowdery mildew interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions 22, no. 3:311320. 39. Ichinohe, M. 1988. Current research on the major nematode problems in Japan. Journal of Nematology 20, no. 2:184-190. 40. Jaouannet, M. and M. N. Rosso. 2013. Effectors of root sedentary nematodes target diverse plant cell compartments to manipulate plant functions and promote infection. Plant Signal.Behav. 8, no. 9. 41. Jaubert, S., T. N. Ledger, J. B. Laffaire, C. Piotte, P. Abad, and M. N. Rosso. 2002. Direct identification of stylet secreted proteins from root-knot nematodes by a proteomic approach. Molecular and Biochemical Parasitology 121, no. 2:205-211. 42. Jones, J. D. and J. L. Dangl. 2006. The plant immune system. Nature 444, no. 7117:323-329. 43. Jones, J. T., C. Furlanetto, and T. Kikuchi. 2005. Horizontal gene transfer from bacteria and fungi as a driving force in the evolution of plant parasitism in nematodes. Nematology 7:641-646.
68
44. Karakas, M. 2004. Life cycle and mating behavior of Hirschmanniella oryzae (nematoda: Pratylenchidae) on excised Oryzae sativa roots. Fen Bilimleri Dergisi 25, no. 1:1-6. 45. Khuong, N. B. 1987. Hirschmanniella spp in rice fields of Vietnam. Journal of Nematology 19, no. 1:82-84. 46. Lambert, K. and S. Bekal. 2002. Introduction to plant-parasitic nematodes. The Plant Health Instructor. 47. Luca Fioretti, Andrew Warry, Andrew Porter, Patrick Haydock, and Rosane Curtis. 2001. Isolation and localisation of an annexin gene (gp-nex) from the potato cyst nematode, Globodera pallida. Nematology 3(1):45-54. 48. Mathur, V. K. and S. K. Prasad. Role of the rice root nematode, Hirschmaniella oryzae in rice culture. 2[Indian Journal of Nematology], 158-169. 1972. 49. Maung, Zin THu Zar, Pyone Pyone Kyi, Yi Yi Myint, and D. De Waele. 2010. Occurence of the rice root nematode Hirschmanniella oryzae on monsoon rice in Myanmar. Tropical Plant Pathology 35, no. 1:3-10. 50. Mitchum, M. G., X. Wang, and E. L. Davis. 2008. Diverse and conserved roles of CLE peptides. Current Opinion in Plant Biology 11, no. 1:75-81. 51. Mohandes, C., Y. S. Rao, and S. C. Sahu. Cultural control of rice root nematode (Hirschmaniella spp.) with Sphenoclea zeylandica. Proceeding of the Indian Academy of Sciences (Animal sciences). [90], 373-376. 52. Nahar, K., T. Kyndt, Vleesschauwer D. De, M. Hofte, and G. Gheysen. 2011. The jasmonate pathway is a key player in systemically induced defense against root knot nematodes in rice. Plant Physiol 157, no. 1:305-316. 53. Oliver, R. P. and P. S. Solomon. 2010. New developments in pathogenicity and virulence of necrotrophs. Current Opinion in Plant Biology 13, no. 4:415-419. 54. Opperman, C. H., D. M. Bird, V. M. Williamson, D. S. Rokhsar, M. Burke, J. Cohn, J. Cromer et al. 2008. Sequence and genetic map of Meloidogyne hapla: A compact nematode genome for plant parasitism. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105, no. 39:14802-14807. 55. P.Vain, B. Worland M. C. Clarke G. Richard M. Beavis H. Liu A. Kohli M. Leech J. Snape P. Christou H. Atkinson. Expression of an engineered cysteine proteinase inhibitor (Oryzacystatin-I Delta D86) for nematode resistance in transgenic rice plants. 96[2], 266-271. 1998. Theoretical and Applied Genetics. 56. Park, J. S., S. C. Han, and Y. B. Lee. [Studies on the ecology and feeding preference of Hirschmaniella Oryzae]. [13], 93-98. 1970. Research Reports of the Office of Rural Development, Korea, Plant Environment. 57. Prot, J. C., I. R. S. Soriano, D. M. Matias, and S. Savary. 1992. Use of green manure crops in control of Hirschmanniella mucronata and H. oryzae in irrigated rice. Journal of Nematology 24, no. 1:127-132.
69
58. Prot, J.-C. and M. L. Rahman. 1994. Nematode ecology, economic importance, and management in rice ecosystems in South and Southeast Asia. In Rice pest science and management, eds. Teng, P. S., K. L. Heong, and K. Moody, 129-144. (Manilla: IRRI). 59. Randhawa, N, I Singh, P. K. Sakhuja, and S. S Malhi. Effect of date of transplanting of basmati rice cultivars and spacing on the population build-up of rice root nematode, Hirschmaniella oryzae. [21], 131-135. 1991. Indian journal of nematology. 60. Rehman, S., W. Postma, T. Tytgat, P. Prins, L. Qin, H. Overmars, J. Vossen et al. 2009. A Secreted SPRY Domain-Containing Protein (SPRYSEC) from the Plant-Parasitic Nematode Globodera rostochiensis Interacts with a CC-NB-LRR Protein from a Susceptible Tomato. Molecular Plant-Microbe Interactions 22, no. 3:330-340. 61. Robertson, L., W. M. Robertson, M. Sobczak, J. Helder, E. Tetaud, M. R. Ariyanayagam, M. A. Ferguson, A. Fairlamb, and J. T. Jones. 2000. Cloning, expression and functional characterisation of a peroxiredoxin from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis. Mol.Biochem.Parasitol. 111, no. 1:41-49. 62. Rosso, M. N. and E. Grenier. 2011. Other Nematode Effectors and Evolutionary Constraints. In Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions, eds. Jones, J., G. Gheysen, and D. J. P. Ferguson, 287-307. (Dundee: Springer). 63. Sacco, M. A., K. Koropacka, E. Grenier, M. J. Jaubert, A. Blanchard, A. Goverse, G. Smant, and P. Moffett. 2009. The Cyst Nematode SPRYSEC Protein RBP-1 Elicits Gpa2-and RanGAP2-Dependent Plant Cell Death. Plos Pathogens 5, no. 8. 64. Smant, G. and J. Jones. 2011. Suppresion of Plant Defence bij Nematodes. In Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions, eds. Jones, J., G. Gheysen, and D. J. P. Ferguson, 273-272. (Dundee: Springer). 65. Smant, G., J. P. W. G. Stokkermans, Y. T. Yan, J. M. de Boer, T. J. Baum, X. H. Wang, R. S. Hussey et al. 1998a. Endogenous cellulases in animals: Isolation of beta-1,4endoglucanase genes from two species of plant-parasitic cyst nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, no. 9:4906-4911. 66. Smant, G., J. P. W. G. Stokkermans, Y. T. Yan, J. M. de Boer, X. H. Wang, R. S. Hussey, F. J. Gommers et al. 1998b. Endogenous cellulases in animals: Isolation of beta-1,4endoglucanase genes from two species of plant-parasitic cyst nematodes . Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, no. 95:4906-4911. 67. Tylka, G. Soybean cyst nematode. Iowa State University, University Extension . 1995.
68. Tzfira, T., J. X. Li, B. Lacroix, and V. Citovsky. 2004. Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models. Trends in Genetics 20, no. 8:375-383. 69. Vieira, P., E. G. Danchin, C. Neveu, C. Crozat, S. Jaubert, R. S. Hussey, G. Engler et al. 2011. The plant apoplasm is an important recipient compartment for nematode secreted proteins. Journal of Experimental Botany 62, no. 3:1241-1253. 70. Vogt, T. 2010. Phenylpropanoid biosynthesis. Mol.Plant 3, no. 1:2-20.
70
71. Wang, X., M. G. Mitchum, B. Gao, C. Li, H. Diab, T. J. Baum, R. S. Hussey, and E. L. Davis. 2005. A parasitism gene from a plant-parasitic nematode with function similar to CLAVATA3/ESR (CLE) of Arabidopsis thaliana. Molecular Plant Pathology 6, no. 2:187191. 72. Wildermuth, M. C., J. Dewdney, G. Wu, and F. M. Ausubel. 2001. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature 414, no. 6863:562-565. 73. Williamson, V. M. and C. A. Gleason. 2003. Plant-nematode interactions. Current Opinion in Plant Biology 6, no. 4:327-333.
71
Bijlagen I.
Primers
Naam PEF1 F PEF1 R PEF3 F PEF3 R PEF4 F PEF4 R PEF6 F PEF6 R PEF7 F PEF7 R PEF9 F PEF9 R PEF10 F PEF10 R PEF11 F PEF11 R PEF12 F PEF12 R PEF13 F PEF13 R PEF15 F met SP PEF15attb F met SP PEF15attb F zonder SP PEF15attb R1 PEF15attb R2 PEF15 R1 PEF15 R2 PEF15 R3 PEF15 R4 PEF15 R5 PEF15 R6 PEF15 R7 PEF16 F PEF16 R PEF17 F PEF17 R PEF18 F PEF18 R PEF19 F PEF19 R PEF22 F PEF22 R PEF23 F PEF23 R PEF25 F PEF25 R
5’ 3’ sequentie AAGATGTTGTCTTTGAAGAACTTGG TCAAATCAAATGAGTATGGCTATGA ATGAACAAAACAAAACTTGTGGTC TTAGTTCCAGCAGTTTCCTGGT ATGGCAGCAGCAGCATC TTAAATACCAACGCACAGCAA ATGCGATTCTGCTCCGTT TCATTGCTCATCCTCGGC ATGGCCAAATTTACAGCTAGC TTATATAATAAAAAAACCCTCGAAGA ATGATGTCCCGTTCTTTGATTT CTAATTTTGGTGCTTCAATTGC ATGAACACAAAGATTATCACCAATT TTAGAAAGCAAATTGTGCAGC ATGCAAACTAAATCTTCTAAGATTGTAG CTACACCTTACCGTTATTCTTGC GGAATGCTGCTTCCAATCAT AGGAGGATCAGTTGCACCAA TGGCGAAAAATGCCAATAAG CCATCAAAATCAATGCATCCT ATGACAACCACCAAACTCCTC AAAAAGCAGGCTTCACCATGACAACCACCAAACTCC AAAAAGCAGGCTTCACCATGCTGTGTTCCGCCACCCGT AGAAAGCTGGGTTTCAGGTTGCATTCACCG AGAAAGCTGGGTT GTTGTTCGTTCAACTGCAGC TCAGGTTGCATTCACCG GTTGTTCGTTCAACTGCAGC GCTGCAATTTTTGCCTTCTC CCATTCCTTCATtCCTTCACA CCTTCACATTGTTGTTGTTCG TCTTCCTCTCTCCAT TCCTTCA CCT TCATTCCTTCACATTGTTG ATGAAGGCTGCTTTGGCTT TTATATTGACCACACTTGCTTTGG TGCTGATTTATGATTATTCAAGTTTT GTTTCAACGCAGATTCAGCA GGGGGAAATCATGTTCAAGT TTTAACAGTTGGCGATGTCC AACCAAATTATGAGAAACATCCTCTT TTCTCAGTTTAAGCGACGATTTT CACCTCGATGAGGGTGAAAT TTTTTACAACACTCCACTTTGCTT GAAAAATGAAGTTGGCATTGG GAAAAATGAAGTTGGCATTGG AACGATGAAGCTCCTTGTGC TGACTTCTTAGTAGAAGAAAGCAGCA i
PEF26 F PEF26 R PEF27 F PEF27 R PEF29 F PEF29 R AttB1 AttB2 SP6 T7
TTTTTAAAGATGAAGATTAGCTCTTTT TTATTTTGCTACCAGCTTTGC GATGATTCGGACGTCAAAGA TGCAGAGGGAATACATTACGG ATGCGCAGCACTTCCTTG TCATTCCTTTTTCTCGTCCTTT ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGC TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGG
ii
II.
Score-tabel PEF15 met Avr3a en R3a
Tabel 1. Score-tabel van de korte versie van PEF15 met en zonder signaalpeptie met Avr3a en R3a.
Plant 1
GFP 0 1 1
LEEG 1 0 1
kort met SP 1 0 1
kort zonder SP 0 0 1
2
1 1 1
1 0 1
1 0 1
1 1 0
3
1 1 1
1 1 0
1 1 1
0 1 1
4
1 1 1
0 1 1
0 1 1
1 1 0
5
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
6
0 0 0
1 1 1
1 1 1
1 1 1
7
1 0 1
0 1 0
1 0 0
1 1 1
8
1 0 1
0 0 1
1 1 1
0 1 1
9
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
10
0 1 1
0 1 1
1 1 1
1 1 1
11
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
12
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
13
0 0 1
0 0 0
0 0 0
0 0 0
iii
Tabel 2. Score-tabel van de lange versie van PEF15 met signaalpeptide met Avr3a en R3a.
Plant 1
LEEG 1 1 1
GFP 1 1 1
Lang met SP 1 1 1
Lang met SP 1 1 1
2
0 1 1
0 1 1
0 1 1
0 1 1
3
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
4
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
5
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
6
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
7
1 1
1 1
1 1
1 1
iv
III.
Resultaten Fisher exact test PEF15 met Avr3a en R3a
Figuur 1. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van de korte versie van PEF15 zonder signaalpeptide en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van de korte versie van PEF15 zonder signaalpeptide en vector met Gfp als controle.
v
Figuur 2. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van de korte versie van PEF15 met signaalpeptide en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van de korte versie van PEF15 met signaalpeptide en vector met Gfp als controle.
vi
Figuur 3. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van de lange versie van PEF15 met signaalpeptide en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van de lange versie van PEF15 met signaalpeptide en vector met Gfp als controle.
vii
IV.
Score-tabel PEF15 met Gp-RBP-1 en Gpa2
Tabel 1. Score-tabel van de korte versie van PEF15 met en zonder signaalpeptide met Gp-RBP-1 en Gpa2.
PLANT 1
LEEG 1 1 1
GFP 1 1 1
kort met SP 1 1 0
kort zonder SP 1 1 0
2
1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
3
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 1 0
1 1 1 1 1 0
4
1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
1 0 1 1 1
6
0 1 1 1
0 1 1 0
0 1 1 0
0 1 1 0
7
1 0 1
0 0 0
0 0 1
0 0 1
8
1 1 1 1 1
0 1 1 1 1
1 1 1 0 1
0 0 1 1 1
9
0 1 0
0 1 0
0 1 0
0 1 0
10
1 0 1 1
1 0 1 1
1 0 1 0
1 0 1 1
11
0 0 0 1
0 0 0 1
0 0 0 1
0 0 0 1
5
viii
12
1 1 1 1 1
0 1 1 1 1
0 1 0 1 1
0 1 1 1 1
13
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
14
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
15
0 1 1
0 1 0
0 1 0
0 1 0
16
1 1 1 1
0 0 0 1
0 0 1 1
0 0 1 1
Tabel 2. Score-tabel van de lange versie van PEF15 met signaalpeptide met Gp-RBP-1 en Gpa2.
PLANT 1
LEEG 1 1 1 1
GFP 0 0 0 1
LANG met SP 0 0 1 1
LANG met SP 0 0 1 1
2
1 0 1
1 0 1
1 0 0
1 0 0
3
0 1 1
0 0 0
0 0 0
0 0 0
4
1 1 1
0 1 0
0 1 0
1 0 1
5
0 1 1 1
0 1 1 1
1 1 1 1
0 1 1 1
6
1 1 1 1
0 1 1 1
0 1 1 0
1 1 1 0
ix
7
1 1 1 1 1
1 1 1 0 0
1 1 1 0 0
1 1 1 1 0
8
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
9
1 1 1
1 1 1
1 1 0
1 0 1
10
1 1 1 1 1 0
1 0 1 1 1 0
1 0 1 1 1 0
1 1 1 1 1 0
11
x
V.
Resultaten Fisher exact test PEF15 met Gp-RBP-1 en Gpa2
Figuur 1. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van de korte versie van PEF15 met signaalpeptide en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van de korte versie van PEF15 met signaalpeptide en vector met Gfp als controle.
xi
Figuur 2. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van de korte versie van PEF15 zonder signaalpeptide en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van de korte versie van PEF15 zonder signaalpeptide en vector met Gfp als controle.
xii
Figuur 3. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van de lange versie van PEF15 met signaalpeptide en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van de lange versie van PEF15 met signaalpeptide en vector met Gfp als controle.
xiii
VI.
Score-tabel ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (1) PLANT 1
LEEG 1 1 1
ICM 1 0 1
KAT 1 1 1
NOSP 0 0 0
2
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
3
1 1 1
1 1 1
1 1 0
1 0 0
4
1 1 1
0 0 0
1 1 0
0 0 0
5
1 1 1
1 1 0
1 1 1
1 1 0
6
1 1 1
0 0 0
1 1 0
0 0 0
7
1 0 1
0 0 0
1 1 1
0 0 0
8
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
9
0 1 0
0 0 0
0 1 1
1 0 0
10
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
11
1 1 1
1 1 1
1 1 1
0 1 1
12
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
13
0 1 1
0 1 1
0 1 1
1 0 1
14
1 1 1
1 0 0
1 1 1
0 0 0 xiv
15
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
xv
VII.
Resultaten Fisher exact test ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2(1)
Figuur 1. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van ICM met de lege vector als controle.
Figuur 2. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van Kat met de lege vector als controle
xvi
Figuur 3. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van NoSP met de lege vector als controle.
xvii
VIII.
Score-tabel ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (2)
Tabel 1. Score-tabel van Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2.
Plant 1
Leeg 1 1 1 1
GFP 1 1 0 1
Kat 1 0 0 0
NoSP 1 1 0 1
2
1 1 1
0 1 1
0 1 0
0 1 0
3
1 1 1 1
1 0 1 1
1 0 1 0
1 0 1 1
4
1 1
1 1
1 0
1 0
5
1 1 1 1
1 0 1 1
1 1 1 1
1 0 1 1
6
1 1 1
1 1 0
0 0 0
0 0 0
7
1 1 1
1 1 1
0 1 1
0 1 1
8
1 1 1
0 1 1
0 0 0
0 0 0
9
1 1 1 1
1 1 1 0
1 0 1 0
1 1 1 0
10
1 0 1 1
1 0 1 1
1 0 1 1
1 0 1 1
11
1 1 1
1 1 1
1 0 1
1 0 1
12
0 1 1
0 0 0
0 0 0
0 0 0
xviii
13
1 0 1 0
0 0 1 0
0 0 1 0
0 0 0 0
14
1 1 1
0 1 0
0 0 0
0 0 0
15
1 1 1
1 1 1
0 1 1
1 1 1
16
1 1 0 1
1 1 0 0
1 1 0 0
1 0 0 0
17
0 1 1
0 1 0
0 1 0
0 0 1
18
1 1 1 1
1 1 1 0
1 0 1 1
1 0 1 0
Tabel 2. Score-tabel van ICM met Gp-RBP-1 en Gpa2.
PLANT 1
LEEG 1 1 1 1
GFP 1 1 1 1
ICM 1 0 0 1
ICM 0 0 0 1
3
1 1 1 1
0 1 0 1
1 1 1 0
0 1 1 0
4
1 1 1
1 1 1
1 1 0
0 1 1
5
1 0 0 1
1 0 1 0
1 0 0 0
1 0 0 0
6
0 1
1 0
0 0
1 0
7
1 0 1
0 1 0
0 0 0
0 0 0
2
xix
8
1 1 1
1 1 1
1 1 0
1 1 0
9
1 1 1 1
1 0 1 0
1 0 1 1
1 0 1 0
10
1 0 1 1
1 0 1 1
1 0 1 1
1 0 1 1
11
0 0 0
1 0 0
0 0 0
0 0 0
12
1 0 0
1 0 0
0 0 0
0 0 0
13
0 0 1
0 0 1
0 0 0
0 0 0
14
1 1 1 1 1
0 1 0 1 1
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
15
xx
IX.
Resultaten Fisher exact test ICM, Kat & NoSP met Gp-RBP-1 en Gpa2 (2)
Figuur 1. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van ICM en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van ICM en vector met Gfp als controle.
xxi
Figuur 2. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van Kat en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van Kat en vector met Gfp als controle
xxii
Figuur 3. Crosstabel (A) en p-waarde Fisher exact test (B) van NoSP en de lege vector als controle. Crosstabel (C) en p-waarde Fisher exact test (D) van NoSP en vector met Gfp als controle
xxiii
X.
PEF15-homologen
PEF15 prot:Minc19198a prot:Minc18675 prot:Minc10633 prot:Minc09257a prot:Minc11836a prot:Minc11836c prot:Minc01998e prot:Minc01998a prot:Minc01998b prot:Minc01998d prot:Minc10630 prot:Minc13358 Mh10g200708_Contig1105_20663..22451 Mh10g200708_Contig1001_7693..9508 Mh10g200708_Contig1105_40398..42185 Mh10g200708_Contig1452_15234..17856 Mh10g200708_Contig1452_8525..10805 Mh10g200708_Contig2646_1486..2492
signaalpeptide Ja Nee x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
serine-rijk domein Ja Nee X x x x x x x X X X X x x X x x X x x
xxiv
XI.
Volledige alignering van PEF15 en homologe sequenties uit M. incognita en M. hapla
xxv
