Interacties tussen goedaardige en pathogene Verticillium isolaten in tomaat

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013 – 2014

Interacties tussen goedaardige en pathogene Verticillium isolaten in tomaat

Jasper Depotter Promotor: Prof. dr. ir. M. Höfte Tutor: ir. L. Tyvaert

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: landbouwkunde

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

“The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results of this thesis.”

Gent, 6 juni 2014

Prof. dr. ir. M. Höfte

Jasper Depotter

Woord Vooraf De finish is bereikt! Het was een mooie tocht. Ik heb bergen beklommen, sprintjes getrokken, maar vooral kunnen genieten van het uitzicht. De route zou me zwaar gevallen zijn zonder de mensen die m’n rugzak hielpen dragen. Het waren zij die me motiveerden als ik moe was en de weg wezen toen ik verloren liep. Aan hen wil ik dit A4’tje toewijden. Eerst en vooral zou ik prof. dr. ir. Monica Höfte willen bedanken. Ze gaf me de kans om onderzoek te verrichten in het labo fytopathologie. Dank u voor het vertrouwen. Vervolgens wil ik mijn tutor ir. Lien Tyvaert bedanken voor de vlotte samenwerking. Zij heeft mij alle kneepjes van het vak geleerd en heeft heel veel tijd vrijgemaakt om me te begeleiden. Veel in deze thesis heb ik aan u te danken. Merci! Prof. dr. ir. Marie-Christine Van Labeke heeft me de toestemming gegeven om de gaschromatograaf van het labo te gebruiken. Hiervoor zou ik u willen bedanken. Dr. ir. Soraya de Carvalho França stond me altijd bij met goede raad en had veel interesse voor het onderzoek dat ik deed. Muito obrigado! Ir. Silke Deketelaere wil ik bedanken voor het nalezen van mijn thesis. Daarnaast wil ik iedereen van het labo fytopathologie bedanken voor alle hulp die ik van jullie gekregen heb. Een speciale vermelding voor het Ekiden fytopathologie loopteam dat het trouwens fantastisch heeft gedaan! Ik wil mijn medethesisgenoot Son bedanken om samen deze ervaring te delen. Je bleef altijd positief ondanks het vele werk dat we soms hadden! Yves, met mijn eerste loon betaal ik alle telefoonkosten terug die je gemaakt hebt in de bachelorjaren om mijn vragen tijdens de examens te beantwoorden. Samen met Jonathan, Francis, Kris en Emile merci voor de geweldige tijd aan de UGent. Voor de wekelijkse sportieve ontspanning wil ik Matthias en Emile bedanken om elke week opnieuw achter het balletje/shuttle aan te lopen zonder de moed te verliezen. Mijn kotgenote en tevens zus mag ook niet in dit lijstje ontbreken. Dank je Hanne voor de luchtige gesprekken die we ’s avonds konden voeren na een zware dag. De laatste en belangrijkste personen in deze bedanking zijn mijn ouders. Niet alleen voor mijn thesis maar ook voor mijn hele studie. Dank je om Hanne, Sander en ik altijd op de eerste plaats te zetten.

I

Samenvatting Verticillium species veroorzaken verwelking bij een groot aantal gewassen. Het species V. dahliae is een belangrijke pathogeen bij de grondgebonden tomatenteelt. De symptomen zijn chlorose, V-vormige vergeling van de bladeren, bladval, dwerggroei, verwelking en vasculaire verkleuring. De opbrengst daalt doordat er kleinere en minder vruchten gevormd worden. De bestrijding is niet eenvoudig daar V. dahliae microscleroten vormt die jarenlang levensvatbaar blijven in de bodem. In België werd in de bodem een Verticillium isolaat (Vt305) teruggevonden die geassocieerd werd met verminderde Verticillium verwelking bij bloemkool, veroorzaakt door V. longisporum. Verder onderzoek toonde aan dat Vt305 een endofytische levenswijze had en Verticillium symptomen in bloemkool kon reduceren. Dit isolaat werd op basis van de rDNA ITS regio als V. isaacii gekarakteriseerd. In Nederland werd uit een bodem met biologische tomatenteelt in kas het isolaat VSO1 geïsoleerd en tevens op basis van de rDNA ITS regio als V. isaacii gekarakteriseerd. In deze studie werd de rol van Vt305 en VSO1 in de interactie van V. dahliae met tomaat onderzocht. Recent werd de taxonomie van Verticillium aangepast en is karakterisatie op basis van meerdere genregio’s accurater. Vt305 en VSO1 werden gekarakteriseerd op basis van 4 genregio’s: actine (ACT), elongatiefactor 1-alfa (EF), glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GPD) en tryptofaan synthase (TS). Beide isolaten waren het meest gerelateerd met het species V. isaacii. Tot op heden zijn geen waardplanten gekend waarvoor isolaten van V. isaacii pathogeen zijn. Tijdens de drie plantenproeven werd de plantengroei geëvalueerd na inoculatie met Vt305, VSO1 en V. dahliae. Vt305 en VSO1 werden één week voor V. dahliae geïnoculeerd en V. dahliae werd in twee verschillende concentraties toegediend. De symptoomontwikkeling werd opgevolgd en de invloed op de ethyleenproductie van de plant werd nagegaan via gaschromatografie. De kolonisatie van de Verticillium isolaten werd bepaald door de hoeveelheid Verticillium DNA in het plantenweefsel te kwantificeren via kwantitatieve PCR (qPCR). Daarnaast werd ook de expressie van zes afweergenen van de plant gekwantificeerd: ETR4 (ethyleen receptor), PTI5 (ethyleen responsfactor), PR-1a (PR-1 eiwit isoform), GLUA (β1,3-glucanase), CHI3 (chitinase), en ACO4 (1-aminocyclopropaan-1-carboxylzuur oxidase). Tot slot werd in vitro het direct antagonisme tussen de verschillende Verticillium isolaten nagegaan. Bij enkel inoculatie met Vt305 of VSO1 ontwikkelden de planten geen typische Verticillium symptomen en koloniseerden Vt305 en VSO1 de wortel, het hypocotyl en de stengel. Hierdoor kan besloten worden dat Vt305 en VSO1 endofyten zijn bij tomaat. Vt305 en VSO1 reduceerden de dwerggroei en vasculaire verkleuring van de tomatenplanten.

II

In plantenproef 3 beschermde Vt305 de planten tegen de symptomen van V. dahliae in de lage concentratie en reduceerde het de kolonisatie van V. dahliae in het hypocotyl. Bij preinoculatie met Vt305 was er geen significant verschil te zien in de expressie van de afweergenen t.o.v. enkele inoculatie met V. dahliae in de lage concentratie. Hierbij werd de expressie van GLUA en CHI3 in de wortel en van GLUA, CHI3, PTI5 en PR-1a in het hypocotyl wel gereduceerd door Vt305. Bij inoculatie met V. dahliae in de hoge concentratie reduceerde Vt305 de vasculaire verkleuring van het hypocotyl en het aantal planten met symptoomontwikkeling. Nochtans werd geen reductie in de kolonisatie van V. dahliae door Vt305 in het hypoctyl waargenomen. Pre-inoculatie met Vt305 kon wel de expressie van ETR4 en CHI3 in de wortel reduceren en stimuleerde daarnaast ook de expressie van ACO4 in het hypocotyl bij inoculatie van V. dahliae in de hoge concentratie. De in vitro proef toonde aan dat er geen direct antagonisme was tussen de drie Verticillium isolaten. Mogelijks interfereert Vt305 met de ethyleenpathway in de tomatenplant. Competitie en geïnduceerde resistentie zijn de meest aannemelijke mechanismen waarmee Vt305 de plant beschermt tegen Verticillium verwelking.

III

Abstract Verticillium species cause wilt in a broad host range of plants. V. dahliae is an important pathogen in the soil-borne cultivation of tomato. The symptoms are chlorosis, V-shaped discoloration of the leaves, leaf fall, stunting, wilting and vascular discoloration. The consequence is a lower yield due to the reduction of the size and amount of the tomatoes. The management of V. dahliae is difficult because it produces microsclerotia as survival structures in the soil. Verticillium isolate Vt305 was found in a Belgian soil and was associated with the reduction of Verticillium wilt in cauliflower, caused by V. longisporum. Further research demonstrated that Verticillium Vt305 is an endophyte in cauliflower and can control the pathogen V. longisporum in this host. Based on the rDNA ITS region this isolate was characterized as V. isaacii. Another Verticillium isolate was isolated soil in a greenhouse where organic tomatoes were cultured in the Netherlands. This isolate was also characterized as V. isaacii based on the rDNA ITS region. In this report the role of Vt305 and VSO1 in the interaction of V. dahliae with tomato was investigated. Recently, the taxonomy of Verticillium was revised. The characterization is based on 4 additional partial sequences of the protein coding genes: actin (ACT), elongatiefactor 1alpha (EF), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD) and tryptophan synthase (TS). Both isolates were most related to V. isaacii. Currently there are no V. isaacii isolates reported to be pathogenic. During the three plant experiments the plant growth was evaluated after inoculation with Vt305, VSO1 and V. dahliae. Vt305 and VSO1 were inoculated one week before V. dahliae and V. dahliae was inoculated in two concentrations. Symptom development was evaluated and influence on the ethylene production of the plants was measured by gas chromatography. The colonization of the Verticillium isolates was determined by the quantification of the fungal DNA in the plant tissue using quantitative PCR (qPCR). Furthermore the expression of six defense genes of the plant was quantified: ETR4 (ethylene receptor), PTI5 (ethylene responsefactor), PR-1a (PR-1 eiwit isoform), GLUA (β-1,3-glucanase), CHI3 (chitinase) and ACO4 (1aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase). During the last experiment the direct antagonism between the Verticillium isolates was investigated. The plants with single inoculation of Vt305 or VSO1 developed no typical Verticillium symptoms while both isolate were able to colonize the roots, hypocotyl and stem of the tomato plants. This behavior corresponds to an endophytic lifestyle. Both Vt305 and VSO1 reduced the stunting and vascular discoloration of the tomato plants.

IV

During the last plant experiment the isolate Vt305 controlled V. dahliae in the low concentration and reduced the colonization of the pathogen in the hypocotyl. Pre-inoculation with Vt305 before the low concentration of V. dahliae could not significantly alter the expression of defense genes compared to single inoculation of V. dahliae. Although the expression of GLUA and CHI3 in the roots and of GLUA, CHI3, PTI5 and PR-1a in the hypocotyl was reduced. The experiments with V. dahliae in the high concentration showed a reduction of vascular discoloration by Vt305 and the number of the plants with symptoms was reduced by Vt305. The pre-inoculation of Vt305 did not reduce the colonization of V. dahliae in the hypocotyl of the plants inoculated with the high concentration of V. dahliae and reduced the expression of ETR4 and CHI3 in the roots. Furthermore the ACO4 gene was upregulated in the hypocotyl by the pre-inoculation with Vt305. The experiment in vitro showed no direct antagonism between the three Verticillium isolates. Vt305 possibly interferes with the ethylene pathway in plants. Competition and induced resistance are the most likely mechanisms by which Vt305 tomato protects against Verticilllium wilt.

V

Inhoudsopgave Inleiding .......................................................................................................................... 1 Literatuurstudie .............................................................................................................. 3 1

Verticillium verwelking bij tomaat ...................................................................................... 4

2

Verticillium .......................................................................................................................... 4

3

Levenscyclus ........................................................................................................................ 5

4

Fylogenie ............................................................................................................................. 6

5

Taxonomie........................................................................................................................... 7 5.1

V. dahliae ................................................................................................................................. 7

5.2

V. isaacii ................................................................................................................................... 7

6

Genoomanalyse V. dahliae ................................................................................................. 8

7

Interactie van Verticillium met tomaat ............................................................................... 9

8

7.1

Fysische en chemische barrières ............................................................................................. 9

7.2

Signalering in de plant na Verticillium infectie ...................................................................... 10

7.2.1

Ethyleen ......................................................................................................................................10

7.2.2

Jasmijnzuur .................................................................................................................................11

7.2.3

Salicylzuur ...................................................................................................................................12

7.2.4

Auxine .........................................................................................................................................12

Bestrijding van V. dahliae ................................................................................................. 13 8.1

Inleiding ................................................................................................................................. 13

8.2

Resistentiemechanismen ...................................................................................................... 13

8.3

Biologische bestrijding .......................................................................................................... 14

8.3.1

Antagonistische werking van schimmels ....................................................................................15

8.3.2

Antagonistische werking van Verticillium species ......................................................................16

VI

Materiaal en Methoden ................................................................................................19 1

Media en nutriëntenoplossingen...................................................................................... 20

2

Verticillium species ........................................................................................................... 21 2.1

Oorsprong isolaten ................................................................................................................ 21

2.2

Opgroeien Verticillium isolaten ............................................................................................. 21

2.3

Karakterisatie Verticillium VSO1 en Verticillium Vt305 ......................................................... 21

2.4

Sporensuspensie bereiden van de Verticillium isolaten........................................................ 24

3

Interactieproeven ............................................................................................................. 25

4

Plantenmateriaal ............................................................................................................... 26

5

6

7

4.1

Cultivar .................................................................................................................................. 26

4.2

Ontsmetten zaden ................................................................................................................. 26

4.3

Voorbereiden potgrond-zand mengsel ................................................................................. 26

4.4

Opgroeien kiemplanten......................................................................................................... 26

4.5

Infectie: worteldipmethode .................................................................................................. 26

Plantenproeven ................................................................................................................. 27 5.1

Proefopstelling ...................................................................................................................... 27

5.2

Staalname .............................................................................................................................. 29

DNA analyse ...................................................................................................................... 30 6.1

DNA extractie van Verticillium uit plantenmateriaal ............................................................ 30

6.2

Kwantificatie van Verticillium in plantenweefsel d.m.v. qPCR .............................................. 31

RNA analyse ...................................................................................................................... 32 7.1

RNA extractie ......................................................................................................................... 32

7.2

DNase behandeling ............................................................................................................... 33

7.3

Opzuiveren RNA-oplossing .................................................................................................... 33

7.4

cDNA synthese....................................................................................................................... 33

7.5

Kwantificatie van RNA expressie d.m.v. qPCR ....................................................................... 34

8

Ethyleenmetingen ............................................................................................................. 36

9

Statistische dataverwerking .............................................................................................. 36

VII

Resultaten en Discussie.................................................................................................37 1.

Inleiding ............................................................................................................................. 38

2.

Karakterisatie .................................................................................................................... 39 2.1.

3.

Plantenproef 1 .................................................................................................................. 40 3.1.

4.

Evaluatie van de planten gedurende de proef ............................................................................40

3.1.2.

Vasculaire verkleuring en ethyleenproductie .............................................................................42

Plantenproef 2 .................................................................................................................. 44 Evaluatie van de planten gedurende de proef ............................................................................45

4.1.2.

Vasculaire verkleuring in het hypocotyl en de stengel ...............................................................47

4.1.3.

Ethyleenproductie bovengronds plantenmateriaal ....................................................................49

4.1.4.

Moleculaire kwantificering van de Verticillium species ..............................................................50

Interactieproef .................................................................................................................. 53 Resultaten.............................................................................................................................. 53

Plantenproef 3 .................................................................................................................. 55 6.1.

7.

Resultaten.............................................................................................................................. 45

4.1.1.

5.1.

6.

Resultaten.............................................................................................................................. 40

3.1.1.

4.1.

5.

Resultaten.............................................................................................................................. 39

Resultaten.............................................................................................................................. 56

6.1.1.

Evaluatie van de planten gedurende de proef ............................................................................56

6.1.2.

Vasculaire verkleuring in het hypocotyl en de stengel ...............................................................57

6.1.3.

Moleculaire kwantificering van de Verticillium species ..............................................................58

6.1.4.

Genexpressie afweergenen ........................................................................................................60

Discussie ............................................................................................................................ 64 7.1.

Karakterisatie Vt305 en VSO1 ............................................................................................... 64

7.2.

Potentieel van Vt305 en VSO1 als biologische bestrijdingsagent tegen V. dahliae .............. 64

7.3.

Bestrijdingsmechanisme Vt305 en VSO1 .............................................................................. 65

Besluit ............................................................................................................................68 Literatuurlijst .................................................................................................................70 Bijlagen ..................................................................................................................................... 80

VIII

Lijst met afkortingen ABA

Abscisinezuur

ACC

1-AminoCyclopropaan-1-Carboxylzuur

ACT

Actine

Ave1

Avirulentie bij tomaten met het Ve1 gen

BR

Brassinosteroïden

C

Controleplanten

cDNA

complement Desoxyribonucleïnezuur

CK

Cytokinine

Ct

Cycle treshold

d.m.v.

door middel van

DNA

Desoxyribonucleïnezuur

dpi

dagen post inoculatie

dsDNA

dubbelstrengig Desoxyribonucleïnezuur

EF

Elongatiefactor 1-alfa

ET

Ethyleen

ETR4

Ethyleen receptor 4

GA

Gibberelline

GGT

Glucaan GlucosylTransferase

GPD

Glyceraldehyde-3-Fosfaat Dehydrogenase

IAA

Indol-3-azijnzuur

ITS

Internal Transcribed Spacer

JA

Jasmijnzuur

LS

Afstamming-specifiek

m.b.v.

met behulp van

MAD

Median Absolute Deviation

Nep1

Necrose- en ethyleen-inducerende peptide 1

NLP

Necrose- en ethyleen-inducerende peptide 1-achtig eiwit

NPP1

Necrose-inducerend Phytophthora eiwit

o.a.

onder andere

ORF

Open Reading Frame IX

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato Dextrose Agar

PR

Pathogeniteit gerelateerde

qPCR

quantitative Polymerase Chain Reaction

rDNA

ribosomaal Desoxyribonucleïnezuur

RLP

Receptor-achtig eiwit

RNA

Ribonucleïnezuur

SA

Salicylzuur

SAM

S-AdenosylMethionine

SAR

Systemisch verworven resistentie

t.o.v.

ten opzichte van

TAE

Tris-Acetaat-EDTA

Tm

annealing temperatuur

TS

Tryptofaan Synthase

Tub

β-tubuline

UGent

Universiteit Gent

VdNLP1

Necrose- en ethyleen-inducerende peptide 1-achtig eiwit 1 van V. dahliae

VdNLP2

Necrose- en ethyleen-inducerende peptide 1-achtig eiwit 2 van V. dahliae

X

Inleiding

V. dahliae is een belangrijke pathogeen in de grondgebonden tomatenteelt en kan tot aanzienlijke opbrengstverliezen leiden. De planten worden via de wortels geïnfecteerd waarna verwelkingssymptomen zich ontwikkelen. De bestrijding is niet eenvoudig doordat V. dahliae microscleroten vormen die jarenlang levensvatbaar blijven in de bodem. In Ardooie (West-Vlaanderen, België) werd in de bodem een Verticillium isolaat (Vt305) teruggevonden die geassocieerd werd met verminderde Verticillium verwelking bij bloemkool, veroorzaakt door V. longisporum. Verder onderzoek toonde een beschermende werking van Vt305 in bloemkool tegen V. longisporum aan. Vt305 had een endofytische levenswijze en kon Verticillium symptomen in bloemkool reduceren. Dit isolaat was op basis van de rDNA ITS regio 100% gelijk met V. isaacii. Uit een bodem afkomstig van Tinte (ZuidHolland, Nederland) met biologische tomatenteelt in kas werd het isolaat VSO1 geïsoleerd en tevens op basis van de rDNA ITS regio als V. isaacii gekarakteriseerd. Recent werd de taxonomie van Verticillium aangepast en is karakterisatie op basis van meerdere gengregio’s accurater. In het eerste deel van deze studie werden daarom meerdere genregio’s vanVt305 en VSO1 gesequeneerd. Tot op heden zijn geen waardplanten gekend waarvoor isolaten van V. isaacii pathogeen zijn. Bovendien blijkt Vt305 een mogelijks biologische bestrijdingsagent van Verticillium verwelking in bloemkool. Daarom werd in deze studie tevens de rol van Vt305 en VSO1 onderzocht in de interactie van V. dahliae met tomaat. De plantengroei van tomaat werd geëvalueerd na inoculatie van Vt305, VSO1 en V. dahliae. De ethyleenproductie, geassocieerd met symptoomontwikkeling, van de planten werd gemeten met de gaschromatograaf. De kolonisatie van deze isolaten in het plantenweefsel werd via qPCR opgevolgd. Verder werd in deze studie gefocust op het beschermingsmechanisme van Vt305 en VSO1 tegen Verticillium verwelking. Het direct antagonisme tussen de verschillende isolaten werd in vitro nagegaan. Tot slot werd ook de genexpressie van enkele ethyleen gerelateerde afweergenen gekwantificeerd.

___________________________________________________________________________ Inleiding 2

Literatuurstudie

1 Verticillium verwelking bij tomaat Tomaat (Lycopersicon esculentum) is wereldwijd een belangrijk tuinbouwgewas. In Europa zijn er twee gangbare teeltsystemen namelijk de grondloze en de grondgebonden teelt. In Vlaanderen en Nederland wordt tomaat voornamelijk op substraat geteeld op een areaal van respectievelijk 500 ha en 1691 ha (FAOSTAT 2012). Daarnaast is er een beperkt areaal met biologische teelt in vollegrond. De teelt situeert zich in Vlaanderen voornamelijk in de streek rond de veilingen van Mechelen en Hoogstraten. In de mediterrane landen is de tomatenproductie grotendeels grondgebonden. De plantpathogene schimmel V. dahliae veroorzaakt Verticillium verwelking bij tomaat. V. dahliae is een bodempathogeen en vormt overlevingsstructuren die gedurende lange tijd levensvatbaar zijn. De symptomen zijn chlorose, V-vormige vergeling van de bladeren, bladval, dwerggroei, verwelking en vasculaire verkleuring. De infectie van Verticillium in de tomatenteelt leidt tot kleinere en minder vruchten met een opbrengstverlies tot gevolg. Verticillium verwelking vormt een probleem in de grondgebonden teeltsystemen in de mediterrane landen en recent ook in de biologische tomatenteelt in Nederland (Cuijpers et al. 2008). De bestrijding van V. dahliae is door het bodemgebonden karakter niet eenvoudig. Resistente tomatenrassen worden in Zuid-Europa gebruikt om Verticillium te onderdrukken (Tello 1999).

2 Verticillium Het genus Verticillium behoort tot het fylum van de ascomyceten en bevat 10 species. V. dahliae en V. albo-atrum zijn economisch gezien de belangrijkste pathogene species (Klosterman et al. 2009). Verticillium heeft een breed waardplantenspectrum. Het is een bodempathogeen die via de wortels de plant infecteert en vervolgens de xyleemvaten van planten koloniseert. Door de obstructie van de vaatbundels veroorzaakt Verticillium verwelkingssymptomen bij zijn waardplant (Fradin & Thomma 2006). Naast virulente Verticillium species zijn er ook species met een endofytische levenswijze. Een endofyt is een bacterie of een schimmel die de plant koloniseert zonder zichtbare symptomen te ontwikkelen (Petrini 1991). De waardplant kan hierbij verschillende voordelen ondervinden zoals tolerantie t.o.v. een pathogeen. Er werd reeds aangetoond dat endofytische Verticillium spp., die behoren tot wat voorheen V. tricorpus werd genoemd, waardplanten kunnen beschermen tegen pathogene Verticillium spp. (Robinson et al. 2007; Qin et al. 2008; Tyvaert et al. 2014).

___________________________________________________________________________ Literatuurstudie 4

3 Levenscyclus Verticillium is een monocyclische schimmel zonder een beschreven geslachtelijk stadium. De levenscyclus is weergegeven in Figuur 1.1. Verticillium spp. kunnen gemelanizeerde overlevingsstructuren vormen die gedurende lange tijd in de bodem overleven. Naargelang het species zijn dit: rustmycelium, microscleroten en/of chlamydosporen (Schnathorst 1981; Inderbitzin et al. 2011). De kieming van de overlevingsstructuren wordt gestimuleerd door wortelexudaten waarbij één of meerdere hyfen uit de overlevingsstructuren gevormd worden. De hyfen koloniseren het worteloppervlak en dringen binnen via de worteltoppen, wortelhaartjes, laterale wortels, verwondingen of langs natuurlijke openingen. Eenmaal de wortel binnengedrongen, groeien de hyfen inter- en intracellulair verder om het xyleem te bereiken (Huisman 1988). In de xyleemvaten produceert Verticillium conidiën die kunnen kiemen en naburige xyleemcellen penetreren. Verticillium expandeert op deze wijze in de vaatbundels en koloniseert uiteindelijk het xyleem van de wortels, stengels en bladeren. De kolonisatie van de plant gebeurt typisch in cyclussen van proliferatie en eliminatie. Dit kolonisatiepatroon wordt weerspiegeld in de ontwikkeling van symptomen (Heinz et al. 1998; Chen et al. 2004; Robb et al. 2007).

Figuur 1.1: Levenscyclus van V. dahliae (Rowe & Powelson 2002)


4 Fylogenie De fylogenie van Verticillium is gebaseerd op de ribosomaal internal transcribed spacer (ITS) regio en gedeeltelijke sequenties van de genen: actine (ACT), elongatiefactor 1-alfa (EF), glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GPD) en tryptofaan synthase (TS) (Inderbitzin et al. 2011). Op basis van deze genen zijn er twee grote groepen binnen Verticillium te onderscheiden: Clade Flavexudans en Clade Flavnonexudans. Morfologisch kunnen deze twee groepen onderscheiden worden op basis van respectievelijk de aan- of afwezigheid van gele hyfale pigmenten (Figuur 1.2) (Inderbitzin et al. 2011). Clade Flavexudans bevat V. albo-atrum, V. tricorpus, V. zaregamsianum, V. isaacii en V. klebahnii. De overige Verticillium species V. nubilum, V. dahliae, V. longisporum, V. alfalfae en V. nonalfalfae behoren tot Clade Flavnonexudans.

Figuur 1.2: Verticillium kolonies op PDA medium. Links: Clade Flavexudans met gele hyfale pigmenten (V. isaacii Vt305) en en rechts: Clade Flavnonexudans zonder gele hyfale pigmenten (V. dahliae JR2)


5 Taxonomie De taxonomie van Verticillium werd recent herzien door Inderbitzin et al. (2011) en nieuwe species werden gedefinieerd. V. tricorpus werd opgesplitst in drie species die morfologisch niet te onderscheiden zijn van elkaar: V. tricorpus, V. isaacii en V. klebahnii. Daarnaast werd ook Verticillium albo-atrum opgesplitst in 3 species die morfologisch niet te onderscheiden zijn: V. albo-atrum, V. alfalfae en V. nonalfafae. De belangrijkste species in het kader van deze studie, V. dahliae en V. isaacii, worden hier verder besproken.

5.1 V. dahliae V. dahliae is het meest abundant en wijdverspreid van alle Verticillium species (Pegg & Brady 2002; Inderbitzin et al. 2011) en zorgt voor verwelking van planten in gematigde en subtropische klimaatregio’s. V. dahliae heeft een breed waardplantenspectrum en kan zowel één- als meerjarige gewassen infecteren (Pegg & Brady 2002; Klosterman et al. 2009). V. dahliae produceert microscleroten die tot 14 jaar in de bodem kunnen overleven (Wilhelm 1955). Pathogene V. dahliae isolaten voor tomaat worden onderverdeeld in 2 rassen: ‘race 1’ isolaten zijn niet pathogeen voor tomaat met de Ve-locus, het resistentie gen in tomaat (Schaible et al. 1951), terwijl ‘race 2’ isolaten dit wel zijn (Bender & Shoemaker 1984; Nachmias et al. 1987). V. dahliae race 2 is algemeen minder agressief in tomatencultivars zonder de Ve-locus dan V. daliae race 1 (Armen & Schoemaker 1985).

5.2 V. isaacii V. isaacii werd recent gedefinieerd door Inderbitzin et al. (2011) en verder onderzoek is nodig om het waardplantenspectrum te bepalen. Tot op heden zijn de isolaten die tot dit species behoren niet-pathogeen. Qin et al. (2008) toonden de endofytische levenswijze van V. isaacii aan bij sla en artisjok. V. isaacii kan zowel rustmycelium, chlamydosporen als microscleroten vormen.


6 Genoomanalyse V. dahliae V. dahliae is een hemibiotroof en induceert celdood bij planten. In het genoom van V. dahliae werd een eiwitfamilie met een necrose-inducerend Phytophthora eiwit (NPP1) domein ontdekt die negen necrose- en ethyleen-inducerende peptide 1 (Nep1)-achtige eiwitten (NLP) bevatten. Twee daarvan (VdNLP1 en VdNLP2) induceerden necrotische bladlesies en stimuleerden het beschermingsmechanisme van de plant. V. dahliae mutanten met een deletie in VdNLP1, VDNLP2 of in beide genen bleven echter virulent bij katoen (Zhou et al. 2012). Genoomanalyse wees op het belang van glucaan glucosyltransferase (GGT) bij de kolonisatie van het xyleem door V. dahliae. Het GGT gen werd teruggevonden bij 3 xyleem koloniserende pathogene species: V. dahlia, V. albo-atrum en Fusarium oxysporum. GGT homologe genen werden bij Gram-negatieve bacteriën teruggevonden en spelen een rol bij de osmoseregulatie van de omgeving rond het periplasma. Buiten xyleem koloniserende pathogene schimmels en een schimmel-pathogeen bij insecten werden geen andere eukaryotische organismen met dit gen teruggevonden. Dit toont aan dat GGT een rol speelt in de osmotische stabiliteit van V. dahliae tijdens de kolonisatie van het xyleem. V. dahliae mutanten, zonder productie van GGT, induceerden minder specifieke Verticillium symptomen bij tabak dan het wild-type isolaat (Klosterman et al. 2011). Comparatieve genoomanalyse toonde aan dat V. dahliae meer verschillende pectinolytische en andere polysacharide-afbrekende enzymen produceert dan andere ascomyceten. Dit illustreert het vermogen van V. dahliae om plantencellen af te breken. Pectine wordt in het xyleem geproduceerd van geïnfecteerde planten en verhindert de kolonisatie van V. dahliae. De productie van pectinolytische enzymen helpt de pathogeen mogelijks deze barrière te overbruggen (Klosterman et al. 2011). V dahliae plant zich vegetatief voort en seksuele recombinatie komt niet voor. De genetisch variatie binnen V. dahliae is afkomstig van dynamische afstamming-specifieke (LS) regio’s in het genoom. Hierbij wordt genetisch materiaal zowel inter- als intrachromosomaal herverdeeld. De LS regio’s bevatten genen die bijdragen tot de virulentie van de pathogeen. V. dahliae heeft t.o.v. V. albo-atrum 4 additionele LS regio’s. Dit verklaart mogelijks het breder waardplantenspectrum en verspreiding van V. dahliae. (Klosterman et al. 2011; de Jonge et al. 2013).


7 Interactie van Verticillium met tomaat Planten beschikken over zowel constitutieve als induceerbare beschermingsmechanismen tegen pathogenen van zowel fysische als chemische aard. Na infectie van een pathogeen wordt een complex verdedigingsmechanisme geactiveerd. Plantenhormonen hebben hierbij een signalerende en regulerende rol. Cultivars met een snelle activering van deze beschermingsrespons kunnen Verticillium tolereren of onderdrukken (Heinz et al. 1998; Pegg & Brady 2002).

7.1 Fysische en chemische barrières Veel Verticillium infecties beperken zich tot de cortex en bereiken het vasculair weefsel niet (Huisman 1988). De suberine in de endodermis fungeert hierbij als een natuurlijke barrrière tegen verdere verspreiding van Verticillium (Talboys 1958). De plant zet daarnaast lignine af in de epidermis, cortex en rond de hyfe waardoor de pathogeen wordt ingesloten (Griffiths 1971). Als Verticillium het xyleem toch bereikt, beschermt de plant zich door suberine op de celwanden af te zetten om horizontale verspreiding van de schimmel in het vasculair weefsel te voorkomen (Robb et al. 1989). Daarnaast worden er gels, gums en tylose in de vaatbundel afgezet (Benhamou 1995). Deze obstructies trachten de verspreiding van de pathogeen te verhinderen. Het succes van de bescherming is afhankelijk van de snelheid en graad van deze beschermingsresponses. Als echter veel xyleemvaten tegelijkertijd geïnfecteerd zijn en geen nieuwe gevormd worden, kan de waterstroom in de plant in gedrang komen (Talboys 1972). Geïnfecteerde planten accumuleren daarnaast antimicrobiële componenten zoals pathogeniteit gerelateerde (PR) eiwitten, fytoalexines en fenolische componenten (Bell 1969; Benhamou 1995; Daayf et al. 1997; Talboys 1972; Williams et al. 2002). De interactie tussen de fysische en chemische beschermingsmechanismen gebeurt zeer efficiënt. De schimmel wordt door fysische barrières ingesloten in het xyleem waarna antimicrobiële moleculen vrijgesteld worden die bijdragen tot de eliminatie van de pathogeen (Sinha & Wood 1967; Dixon & Pegg 1969; Benhamou 1995; Gold & Robb 1995; Chen et al. 2004).


7.2 Signalering in de plant na Verticillium infectie De rol van de hormonen salicylzuur (SA), jasmijnzuur (JA) en ethyleen (ET) bij de plantrespons op biotische stress, zoals pathogeen infecties, werd reeds uitvoerig bestudeerd. Recent werd meer onderzoek gedaan naar abscisinezuur (ABA), auxine, gibberelline (GA), cytokinine (CK), brassinosteroïden (BR) en peptide hormonen die ook betrokken zijn in de signalering van de verdedigingsrespons in de plant. 7.2.1 Ethyleen ET is een gasvormig hormoon dat betrokken is bij fysiologische processen van de plant zoals kieming van zaden, bloei, senescentie en vruchtrijping. Daarnaast wordt dit hormoon gevormd als respons op abiotische of biotische stress (o.a. pathogeen infectie). ET wordt geproduceerd uit het aminozuur methionine dat door het enzym S-adenosylmethionine (SAM) synthase wordt omgezet tot SAM (Figuur 1.3). Vervolgens katalyseert 1-aminocyclopropaan-1carboxylzuur (ACC) synthase de vorming van de ringstructuur bij de omzetting van SAM tot ACC. De laatste stap is de zuurstofafhankelijke omzetting van ACC in ET, gekatalyseerd door ACC oxidase (Yang & Hoffman 1984).

Figuur 1.3: De ET biosynthese pathway in planten (Ruduś et al. 2013) ET wordt gevormd bij zowel compatibele als niet-compatibele plant-pathogeen interacties en induceert de synthese en accumulatie van verdedigingsproteïnen zoals chitinases (PR-3), β1,3-glucanases (PR-2) en PR-1 (Felix & Meins 1987; Vögeli et al. 1988; Eyal & Fluhr 1992; Lawton et al. 1995). ET kan echter de effecten van een pathogeen zowel versterken als afzwakken (Abeles et al. 1992; Arshad & Frankenberger 2002). Robison et al. (2001a) stelden een model voor waarbij ET twee verschillende functies kan hebben tijdens de ontwikkeling van een plantenziekte: (1) een transiënte ethyleenproductie op of kort na het tijdstip van inoculatie induceert een resistente plant-pathogeen interactie, (2) de productie van een hoge hoeveelheid ET draagt na een succesvolle pathogeenaanval bij tot de ontwikkeling van symptomen. De afname van deze tweede ET piek kan de symptomen van een bacterie- of schimmelinfectie reduceren.


Ciardi et al. (2000) stelden vast dat ET-ongevoelige tomatenplanten virulente Xanthomonas spp. beter konden tolereren. Verder werd reeds aangetoond dat de transformatie van tomatenplanten met ACC deaminase, wat ET biosynthese voorkomt, leidde tot significant minder Verticillium symptomen (Robison et al. 2001b). Een verminderde expressie van de ethyleen receptor 4 (ETR4) in tomaat resulteerde ook in een reductie van Verticillium verwelking (Pantelides et al. 2010). Deze resultaten doen vermoeden dat zowel ET productie als de perceptie van ET door de plant een belangrijke rol spelen in de symptoomontwikkeling. Er werd in vitro aangetoond dat V. dahliae ET kan produceren (Tzeng & DeVay 1984). Eerder onderzoek aan het labo fytopathologie van de UGent toonde aan dat ethyleenproductie van Cochliobolus miyabeanus een virulentiefactor is bij rijst. Het blokkeren van de ethyleenbiosynthese van C. miyabeanus reduceerde de symptoomvorming van brown spot en de ethyleenproductie van de rijstplant (Van Bockhaven et al. n.d.). Zowel C. miyabeanus (Xiao et al. 1991) als Verticillium produceren toxines. Bij Verticillium stimuleren deze de ethyleenproductie van de plant. De symptomen veroorzaakt door de toxines van Verticillium zijn vergelijkbaar met deze van planten behandeld met ET (Cronshaw & Pegg 1976). Dit toont aan dat ET weldegelijk geassocieerd is met de symptoomontwikkeling door Verticillium. 7.2.2 Jasmijnzuur JA speelt een belangrijke rol in het verdedigingsmechanisme van planten. JA wordt samen met ET geassocieerd met het verdedigingsmechanisme tegen necrotrofe pathogenen. Verschillende studies toonden aan dat de JA concentratie lokaal toeneemt als reactie op een pathogeen infectie of een verwonding en dat de uitwendige toepassing van JA de expressie van PR genen induceert (Lorenzo & Solano 2005; Wasternack 2007). Bij Verticillium is er weinig onderzoek verricht naar de rol van JA in het verdedigingsmechanisme van de plant. Arabidopsis thaliana mutanten, ongevoelig voor JA, toonden geen verschil in symptoomontwikkeling bij infectie van V. dahliae in vergelijking met de controleplanten (Veronese et al. 2003). Bij JA deficiënte tomatenplanten nam de gevoeligheid voor V. dahliae wel toe (Thaler et al. 2004). Verder onderzoek moet duidelijkheid brengen over de rol van JA in het verdedigingsmechanisme van de plant tegen Verticillium.


7.2.3 Salicylzuur Naast ET en JA is SA een derde belangrijk hormoon in het verdedigingsmechanisme van planten. De SA biosynthese in de plant kan via twee pathways verlopen met chorismaat als precursor (Wildermuth 2006; Vlot et al. 2009). SA activeert de systemisch verworven resistentie (SAR) (Delaney et al. 1994) via het systemisch transport van methyl salicylaat (Park et al. 2007). SA en JA/ET zijn wederzijds antagonistisch hoewel er ook synergetische interacties werden gerapporteerd (Kunkel & Brooks 2002). SA stimuleert de productie van PR eiwitten (Malamy et al. 1990). Net zoals bij JA is er nog maar weinig onderzoek verricht rond de rol van SA in het verdedigingsmechanisme van de plant tegenover Verticillium. De uitschakeling van de SAR bij A. thaliana mutanten toonde geen verschil in symptomen met de wild-type na infectie met Verticillium (Veronese et al. 2003). Verder onderzoek is nodig om de rol van SA in het beschermingsmechanisme van de plant tegen Verticillium te achterhalen. 7.2.4 Auxine Auxine vertegenwoordigt een groep van chemische verbindingen waarvan indol-3-azijnzuur (IAA) de meest abundante is bij hogere planten. Auxine heeft meerdere functies waaronder het stimuleren van de groei en apicale dominantie. Plantenwortels zijn gevoeliger voor IAA fluctuaties dan andere plantendelen. Uitwendige toediening van IAA kan, afhankelijk van de concentratie, zowel de wortelgroei stimuleren als inhiberen (Davies 1995; Leveau & Lindow 2005). Verschillende micro-organismen in de rhizosfeer kunnen de auxineconcentratie beïnvloeden door auxine te consumeren of produceren (Dullaart 1970; Patten & Glick 2002; Leveau & Lindow 2005; Gravel et al. 2007). De IAA productie van V. dahliae werd in vitro aangetoond (Bhaskaran 1972). Auxine kan de ethyleenproductie in de plant beïnvloeden door het enzym ACC synthase te stimuleren wat de groei-inhibitie van planten bij hoge auxine concentraties zou verklaren (Hansen & Grossmann 2000). Het gebruik van groeiregulatoren met naftaleenazijnzuur (auxine analoog) reduceerde de verwelkingssymptomen en stengelkolonisatie door V. dahliae bij aardappel (Corsini et al. 1989). Moleculair onderzoek bij tomaat toonde een inductie van auxine gerelateerde genen aan na infectie van V. dahliae (van Esse et al. 2009). Verder onderzoek is echter nodig om de rol van auxine binnen het Verticillium-waardplant complex te achterhalen.


8 Bestrijding van V. dahliae 8.1 Inleiding Bestrijding van V. dahliae is niet eenvoudig doordat curatieve middelen niet beschikbaar zijn en microscleroten gevormd worden die gedurende vele jaren levensvatbaar zijn in bodem. Daarnaast is het een monocyclische pathogeen, waarbij het belangrijk is primair inoculum te bestrijden. Bodemfumigantia en vooral methylbromide zijn een efficiënt middel in de bestrijding van microscleroten maar veelvuldig toepassen is niet rendabel (Klosterman et al. 2009). Daarnaast laat de strengere wetgeving producten zoals methylbromide niet meer toe, wat de bestrijding bemoeilijkt. Er bestaan fysische alternatieven voor het gebruik van bodemfumigantia zoals stomen en solarisatie. Stomen is een dure techniek en kan bijgevolg niet elk jaar toegepast worden. Bodemsolarisatie beperkt zich in Europa tot de mediterrane regio door de specifieke vereisten voor zonlicht en temperatuur (Höfte 2013). Daarnaast blijkt de incorporatie van organisch materiaal de kiemkracht van Verticillium microscleroten te reduceren. De werkingsmechanismen zijn nog niet volledig opgehelderd. Debode et al. (2005) toonden aan dat de incorporatie van ligninerijk materiaal in de bodem het aantal kiemkrachtige microscleroten doet afnemen. Het mechanisme zou gebaseerd zijn op de lignine-melanine hypothese. Lignine degraderende organismen breken mogelijks de melanine af. Melanine beschermt microscleroten tegen biotische en abiotische stress (Debode et al. 2005). In de praktijk kan Verticillium verwelking van tomaat bestreden worden door gebruik van resistente cultivars. Daarnaast is het onderzoek naar biologische bestrijding recent sterk toegenomen.

8.2 Resistentiemechanismen Resistentie is de meest aangewezen methode om Verticillium verwelking te voorkomen. Slechts voor enkele gewassen is er een monogenetisch resistentiegen beschreven, waaronder het Ve-locus bij tomaat dat Verticillium verwelking door race 1 type species controleert (Schaible et al. 1951; Pegg & Brady 2002). De resistentie wordt gemedieerd door het Ve1 gen dat codeert voor een receptor-achtig eiwit (RLP) membraanreceptor (Kawchuk et al. 2001; Fradin et al. 2009). Deze receptoren activeren de immuunrespons bij herkenning van Verticillium race 1 effectoren. Race 1 onderscheidt zich van race 2 door de aanwezigheid van het Ave1 (avirulentie bij tomaten met het Ve1 gen) open reading frame (ORF). Deze Ave1 ORF activeert de Ve1 gemedieerde resistentie bij tomaat en draagt ook bij tot de virulentie van Verticillium race 1 bij niet resistente cultivars (de Jonge et al. 2012).


Bij infectie van Verticillium race 1 in een resistente tomatencultivar wordt een hypersensitieve reactie waargenomen waarbij de productie van antifungale elementen en fysische barrières wordt geïnduceerd. De H2O2 hoeveelheid neemt kort na infectie toe gevolgd door de productie van peroxidase wat niet voorkomt bij gevoelige plant-pathogeen interactie. Het metabolisme van de fenylpropanoïden wordt tevens geïnduceerd waardoor de hoeveelheid ferulinezuur, p-coumarinezuur, vannilline en p-hydroxybenzaldehyde in de wortels van de resistente planten toeneemt. Daarnaast worden de activiteit van fenylalanine-ammonium lyase en de synthese van lignine bij de resistente planten geïnduceerd. Deze responsen zijn ook aanwezig in gevoelige planten maar met een lagere intensiteit en snelheid (Gayoso et al. 2010). Recente studies toonden aan dat het gebruik van resistente tomatencultivars in de vollegrondsteelt Verticillium race 1 verdringt ten voordele van het race 2 type (Maruthachalam et al. 2010; Papaioannou et al. 2013).

8.3 Biologische bestrijding Chemische gewasbeschermingsmiddelen hebben nefaste gevolgen voor het milieu en het risico op resistentie is reëel. Omwille van deze bezorgdheid en het ontbreken van adequate chemische gewasbeschermingsmiddelen, wordt biologische bestrijding als alternatief aangewend. De stimulans om biologische bestrijdingsproducten te ontwikkelen is bij bodemgebonden pathogenen groter dan ooit. Antagonistische micro-organismen, die biologische bescherming kunnen bieden, worden vaak uit ziektewerende gronden of compost geïsoleerd. In de biologische bestrijding van Verticillium loopt er onderzoek omtrent zowel bacteriële als schimmelantagonisten (Höfte 2013). Tabel 1.1 geeft enkele antagonistische microorganismen tegenover Verticillium weer.


Tabel 1.1: Enkele antagonistische micro-organismen tegen virulente Verticillium spp. Antagonist Waardplant Referentie Bacteriën Pseudomonas chlororaphis aardappel Berg et al. (2001) Bacillus spp. aardappel en aubergine Tjamos et al. (2004) Serratia plymuthica aardbei Kurze et al. (2001) Streptomyces spp. aubergine Bubici et al. (2013) Bacillus subtilis tomaat El-Rafai et al. (2003) Pseudomonas fluorescens tomaat El-Rafai et al. (2003) Schimmels Verticillium tricorpus aardappel Davis et al. (2000) Robinson et al. (2007) Talaromyces flavus aubergine Marois et al. (1982) Verticillium isaacii bloemkool França et al. (2013) Tyvaert et al. (2014) artisjok en sla Qin et al. (2008) Inderbitzin et al. (2011) Fusarium oxysporum paprika Veloso & Díaz (2012) Trichoderma spp. tomaat El-Rafai et al. (2003) Regragui & Lahlou (2005) Jabnoun-Khiareddine et al. (2009) Verticillium dahliae tomaat Shittu et al. (2009) 8.3.1 Antagonistische werking van schimmels In heel wat ziektewerende bodems zijn er schimmels gevonden met een antagonistische werking tegen pathogenen. De beschermende werking is gebaseerd op antibiotica productie, parasitisme, hypovirulentie of competitie door de schimmel. Bij Verticillium werd al veel onderzoek verricht naar de antagonistische werking van Talaromyces flavus. T. flavus is een ascomyceet die oppervlakkig aan de wortels van planten gebonden is. Deze schimmel beschermt de plant tegen Verticillium door een combinatie van antibiose, parasitisme en competitie (Tjamos & Fravel 1997). De resultaten uit deze studies zijn inconsistent en variëren van een goed bestrijdingseffect (Marois et al. 1982) tot geen bestrijdingseffect (Spink & Rowe 1989).


Trichoderma is een andere schimmel met een bestrijdingseffect tegen Verticillium. Het behoort tot de stam van de ascomyceten en heeft een brede microbiële antagonistische werking. Trichoderma koloniseert de oppervlakte of cortex van een plantenwortel. Het werkingsmechanisme is een combinatie van verschillende factoren waaronder antibiose, mycoparasitisme en competitie (Lorito et al. 1993; Regragui & Lahlou 2005). Avirulente Fusarium oxysporum kunnen naast Fusarium verwelking ook de symptomen van Verticillium onderdrukken bij paprika. F. oxysporum stimuleert het verdedigingsmechanisme van de plant, maar de exacte werkingswijze is nog niet achterhaald. (Veloso & Díaz 2012) 8.3.2 Antagonistische werking van Verticillium species Er werden reeds endofytische Verticillium isolaten geïdentificeerd die planten kunnen beschermen tegen Verticillium verwelking. Inoculatie van de endofyten voor inoculatie met pathogene Verticillium species heeft een effectievere werking tegen de pathogeen dan een gecombineerde inoculatie (Schnathorst & Mathre 1966; Robinson et al. 2007; Qin et al. 2008; Shittu et al. 2009). V. dahliae Shittu et al. (2009) onderzochten de antagonistische werking van een endofytisch V. dahliae isolaat tegenover een sterk virulent V. dahliae isolaat. De tomatenplanten geïnoculeerd met de endofyt waren groter dan de controlegroep en de ziektesymptomen bleven minimaal. Door de pre-inoculatie met het endofytisch isolaat werd de kolonisatie van het sterk virulent isolaat in de stengel beperkt en werden de symptomen gereduceerd. De endofyt kon de tomatenplant vrij snel koloniseren. In de tomatenwortels was er meer DNA van de endofytische V. dahliae dan van de virulente aanwezig bij pre-inoculatie met de endofyt. (Shittu et al. 2009). V. tricorpus groep De V. tricorpus groep bevat drie species: V. tricorpus, V. isaacii en V. klebahnii. In de nieuwe voorgestelde taxonomie werd V. tricorpus in deze species opgesplitst (Inderbitzin et al. 2011). Davis et al. (2000) onderzochten ziektewerende bodems in Californië waar een reductie van Verticillium verwelking bij aardappelen werd geconstateerd. Na het isoleren van verschillende micro-organismen, werd V. tricorpus geassocieerd met een lagere ziekte-incidentie (Davis et al. 2000).


Robinson et al. (2007) onderzochten de antagonistische werking van V. tricorpus tegenover Verticillium verwelking bij aardappelen, veroorzaakt door V. dahliae. Het V. tricorpus isolaat veroorzaakte zelf minimale symptomen bij aardappelen. Er werd een reductie van symptomen waargenomen bij co-inoculatie met beide isolaten. Wanneer de inoculatie met V. tricorpus eerder plaatsvond, was de reductie hoger (Robinson et al. 2007). Op basis van morfologie werd vastgesteld dat de aanwezigheid van V. tricorpus in de bodem van Ardooie (België) geassocieerd is met verminderde Verticillium verwelking bij bloemkool, veroorzaakt door V. longisporum. Verticillium Vt305 werd geïsoleerd uit dit veld en toonde op basis van de rDNA ITS regio 100% gelijkenis met V. isaacii (PD343) (França et al. 2013). Tyvaert et al. (2014) hebben dit isolaat als antagonist tegen V. longisporum getest. Vt305 koloniseerde bloemkool zonder hierbij symptomen te vormen en werd als een endofyt beschouwd. De preinoculatie van bloemkoolplanten met Vt305 kon de symptomen en kolonisatie door V. longisporum reduceren (Tyvaert et al. 2014). Beschermingsmechanisme De mechanismes waarmee endofytische Verticillium isolaten planten beschermen zijn nog niet achterhaald. Direct antagonisme is waarschijnlijk uit te sluiten omdat het endofytisch V. dahliae isolaat de groei van het virulente V. dahliae isolaat niet beïnvloedde op PDA medium (Shittu et al. 2009). Competitie voor infectieplaatsen en geïnduceerde resistentie worden als meest plausibele mechanismes naar voor geschoven (Robinson et al. 2007; Qin et al. 2008; Shittu et al. 2009). Aimé et al. (2013) schreef de beschermende werking van een endofytische Fusarium oxysporum isolaat tegen Fusarium verwelking bij tomaat toe aan geïnduceerde resistentie. De endofyt induceerde een priming-effect in de tomatenwortels waardoor de daaropvolgende inoculatie met het virulente F. oxysporum isolaat een sterkere expressie gaf van drie afweergenen die coderen voor een zure extracellulaire chitinase (CHI3), een zure extracellulaire β-1,3-glucanase (GLUA) en een PR-1 eiwit isoform PR-P6 (PR-1α) (Aimé et al. 2013). Shittu et al. (2009) schreef de beschermende werking van een endofytisch V. dahliae isolaat toe aan een sterkere inductie van specifieke afweergenen. Bij inoculatie met de endofyt was de expressie van Ve2, fenylalanine ammonium-lyase, cycline afhankelijke kinase en chitinase IV 2 tot 7 keer hoger dan bij de inoculatie met een sterk virulent V. dahliae isolaat (Shittu et al. 2009).


Qin et al. (2008) wezen op het belang van de competitie voor infectieplaatsen en geïnduceerde resistentie bij de biologisch bescherming door V. tricorpus. Bij co-inoculatie van V. tricorpus en V. dahliae werden de typische Verticillium symptomen gereduceerd en was er een betere groei in vergelijking met sla enkel met V. dahliae geïnoculeerd. Als V. tricorpus voor V. dahliae geïnoculeerd werd, leidde dit tot een betere bescherming. V. tricorpus heeft dus voldoende tijd nodig om het worteloppervlak te koloniseren (Qin et al. 2008). Enkele van deze V. tricorpus isolaten werden opnieuw gekarakteriseerd op basis van de nieuwe voorgestelde taxonomie als V. isaacii (Inderbitzin et al. 2011).


Materiaal en Methoden

1 Media en nutriëntenoplossingen Het potato dextrose agar (PDA) medium werd bereid door 39 g PDA op te lossen in 1 L gedestilleerd water. Het voedingsmedium werd gedurende 21 min bij 121 °C en 103,4 kPa geautoclaveerd. Tabel 2.1 geeft de samenstelling van Hoagland nutriëntenoplossing weer. Hierbij werden eerst de stockoplossingen bereid, waaruit vervolgens de nutriëntenoplossing werd klaargemaakt. De planten kregen deze oplossing een- tot tweemaal per week toegediend. Tabel 2.1: Samenstelling Hoagland nutriëntenoplossing Component KH2PO4 KNO3 Ca(NO3)2.4H2O MgSO4.7H2O Fe-EDTA:  FeSO4  EDTA micro-elementen:  boorzuur  mangaanchloride.4H2O  zinksulfaat.7H2O  kopersulfaat.5H2O  molybdeenzuur (85%)

Hoeveelheid van Stockoplossing stockoplossing voor 1 L (g/L) nutriëntenoplossing (mL) 136,00 1 101,10 5 236,15 5 246,48 2 4 7,20 9,31 1 2,68 1,81 0,22 0,08 0,02

___________________________________________________________________________ Materiaal en Methoden 20

2 Verticillium species 2.1 Oorsprong isolaten De Verticillium species, gebruikt in deze studie, werden eerder geïsoleerd uit plantenmateriaal of uit de bodem (Tabel 2.2). Het isolaat Vt305 werd reeds in de literatuur beschreven en op basis van de rDNA ITS regio als V. isaacii gekarakteriseerd (França et al. 2013). V. dahliae JR2 werd gekarakteriseerd als een race 1 type door Fradin et al. (2009). Het isolaat VSO1 werd geïsoleerd door het labo fytopathologie van de UGent in samenwerking met het Louis Bolk Instituut (Driebergen, Nederland). Op basis van de morfologie werd VSO1 gekarakteriseerd als een Verticillium isolaat uit de V. tricorpus groep. De karakterisatie op basis van de rDNA ITS regio toonde aan dat het om V. isaacii ging. Tabel 2.2: Overzicht van gebruikte Verticillium isolaten Species Isolaat Waardplant/ Locatie afkomst V. isaacii Vt305 Grond Ardooie, België V. dahliae JR2 Tomaat Ontario, Canada V. isaacii

VSO1

Grond

Tinte, Nederland

Referentie França et al. (2013) Fradin et al. (2009) Labo fytopathologie UGent

2.2 Opgroeien Verticillium isolaten De verschillende Verticillium isolaten werden opgegroeid op PDA medium. Hiertoe werd een plug actief groeiend mycelium overgeënt op een petriplaat met PDA medium m.b.v. een kurkboor en entnaald. De petriplaat werd nadien afgesloten met parafilm en in het donker geïncubeerd bij kamertemperatuur.

2.3 Karakterisatie Verticillium VSO1 en Verticillium Vt305 In 2011 werd de taxonomie van Verticillium herzien (Inderbitzin et al. 2011). De karakterisatie van de Verticillium species gebeurde op basis van vijf genregio’s: ACT (actine), EF (elongatiefactor 1-alfa), GPD (glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase), TS (tryptofaan synthase) en rDNA ITS (internal transcribed spacer). De rDNA ITS regio’s van VSO1 en Vt305 werden al bepaald door respectievelijk het labo fytopathologie van UGent en França et al. (2013). De karakterisering van deze twee isolaten werd in deze studie vervolledigd.


Een plugje mycelium werd met een steriele naald in een epje (0,5 mL) met 40 µL NaOH (0,25 M) gebracht voor de DNA extractie. De stalen werden vervolgens in een kokend waterbad geplaatst gedurende 30 s waarna 40 µL HCl (0,25 M), 20 µL Tris-HCl (0,5 M, pH 8) en 20 µL Nonidet P-40 (0,25% gewicht/volume) werden toegevoegd. Tot slot werden ze voor een tweede keer gedurende 2 min in het kokend waterbad gebracht. De kwaliteit en concentratie van de DNA-oplossing werd nagegaan met de NanoDrop spectrofotometer ND-1000 (Isogen Life Science, De Meern, Nederland). Een eerste PCR reactie werd uitgevoerd om de TS regio van Vt305 en VSO1 en de EF van Vt305 te amplificeren. De PCR werd uitgevoerd met de Flexcycler versie 1.3 (Analytik Jena, Jena, Duitsland) in een reactievolume van 50 µL per staal, de samenstelling is weergegeven in Tabel 2.3. De gebruikte primers en bijhorende annealing temperatuur (Tm) zijn in Tabel 2.4 terug te vinden. De volgende cyclus werd doorlopen: 10 min bij 94 °C, gevolgd door 35 cycli van 1 min bij 94 °C, 1 min bij Tm en 1 min bij 72 °C. Daarna volgde de finale extensie van het PCR product: 10 min bij 72 °C. Het PCR-product werd vervolgens bewaard bij 4 °C. Tabel 2.3: Samenstelling van het reactievolume voor de PCR Component DNA (10-100 ng/µL) PCR-buffer1 dNTP mix (10 mM)2 Primer forward (10 µM) Primer reverse (10 µM) Taq-polymerase (5 u/mL)3 Q-solution4 Nucleasevrij water5

Hoeveelheid (µL) 4 5 1 3,5 3,5 0,3 10 22,7

1

5X Colorless GoTaq® Reaction Buffer (Promega, Madison, VS) dNTP Mix (Promega, Madison, VS) 3 GoTaq® DNA Polymerase (Promega, Madison, VS) 4 5X Q-Solution (Qiagen, Hilden, Duitsland) 5 Nuclease-Free Water (Promega, Madison, VS) 2


Tabel 2.4: Primers gebruikt bij de amplificatie van de Verticillium karakteriserende genregio’s (Inderbitzin et al. 2011) Primer Genregio Sequentie Tm (°C) 5’–TAA TTC ACA ATG GAG GGT AGG-3’ VActf Actine 60 5’-GTA AGG ATA CCA CGC TTG G-3’ VActr Actine 60 5’-AAC GTC GTC GTC ATC GGC CAC G-3’ VEFf Elongatiefactor-1-alfa 601/702 5’-CCA CGC TCA CGC TCG GCC TT-3’ VEFr Elongatiefactor-1-alfa 601/702 Glyceraldehyde-3-fosfaat 5’-GGC ATC AAC GGT TTC GGC C-3’ VGPDf2 70 dehydrogenase Glyceraldehyde-3-fosfaat 5’-GTA GGA GTG GAC GGT GGT CAT GAG-3’ VGPDr 70 dehydrogenase 5’-GCG CTG CAA GGC CGA GAA C-3’ VTs3f Tryptofaan synthase 59 5’-GCG GAA CGA GAC GGC CTC C-3’ VTs3r Tryptofaan synthase 59 1 2

Tm gebruikt bij de amplificatie van Vt305 Tm gebruikt bij de amplificatie van VSO1

Een tweede PCR reactie werd uitgevoerd om de genregio’s GPD (VSO1 en Vt305), ACT (VSO1 en Vt305) en EF (VSO1) te amplificeren met de Phusion High-Fidelity PCR Kit (Thermo Scientific, VS). De PCR werd uitgevoerd met de Flexcycler versie 1.3 (Analytik Jena, Jena, Duitsland) in een reactievolume van 50 µL per staal, de samenstelling is weergegeven in Tabel 2.5. De gebruikte primers en bijhorende Tm zijn in Tabel 2.4 terug te vinden. Het volgend temperatuurprofiel werd doorlopen: 30 s bij 98 °C, gevolgd door 35 cycli van 30 s bij 98 °C, 30 s bij Tm en 30 s bij 72 °C. Daarna volgde de finale extensie van het PCR product: 10 min bij 72°C en dit product werd dan bewaard bij 4°C. Tabel 2.5: Samenstelling van het reactievolume voor de Phusion High-Fidelity PCR Component DNA (10-100 ng/µL) 5x Phusion GC Buffer dNTPs (10 mM) Primer forward (10 µM) Primer reverse (10 µM) Phusion DNA polymerase DMSO Nucleasevrij water1 1

Hoeveelheid (µL) 4 10 1 2,5 2,5 0,5 1,5 28

Nuclease-Free Water (Promega, Madison, VS)

Het PCR product werd samen met een blauw/oranje 6x loading dye (Promega, Madison, VS) gepipetteerd op een 1,5% agarose gel in TAE (Tris-Acetaat-EDTA) buffer. Daarnaast werd ook een ladder als lengte-merker geladen (Promega, Madison, VS). De DNA-fragmenten werden op basis van grootte gescheiden door ze gedurende 25 min onder stroom te plaatsten (100 µV). De DNA-fragmenten werden gevisualiseerd met EtBr en de lengte van het fragment werd bepaald m.b.v. de ladder (Figuur 2.1). ___________________________________________________________________________ Materiaal en Methoden 23

Om het PCR product op te zuiveren werd gebruik gemaakt van de E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (Omega bio-tek, Norcross, VS) en werd de concentratie opnieuw bepaald met de NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science, De Meern, Nederland). De DNA stalen werden verdund tot 20 ng/mL en vervolgens opgestuurd naar LGC Genomics GmbH (Berlijn, Duitsland) om de sequentie van de genregio’s te bepalen. De sequentie data werden verwerkt met de BioEdit software (versie 7.1.9, Tom Hall) en geblast in Genbank om het species van de isolaten te bepalen (Genbank 2014).

Figuur 2.1: Agarose gel met gevisualiseerde DNA bandjes voor ACT (588 bp)

2.4 Sporensuspensie bereiden van de Verticillium isolaten Twee weken na inoculatie van het PDA medium werden de sporen geoogst. Er werd 5 mL steriel gedestilleerd water op het medium gebracht en m.b.v. een spatel werden de sporen losgemaakt. De suspensie werd dan over een steriel kaasdoek met maaswijdte 0,5 mm gefilterd. Het aantal sporen in de suspensie werd geteld met een haematocytometer, type Bürker. Onder een lichtmicroscoop werd het aantal sporen in de centraal vierkant bepaald voor beide telkamers. De gemiddelde hoeveelheid van de twee tellingen werd vermenigvuldigd met 1x104 om het aantal sporen per mL te bepalen. De sporenoplossing werd dan tot de gewenste concentratie verdund en gebruikt om de planten te inoculeren (1x104 of 1x106 sporen/mL).


3 Interactieproeven Tijdens de interactieproeven werd het direct antagonisme tussen de verschillende isolaten in vitro onderzocht. Hierbij werd een plug (∅ = 9 mm) actief groeiend mycelium van een twee weken oude kolonie op elke helft van een petriplaat met PDA medium geplaatst (Figuur 2.2). De platen werden vervolgens lichtdicht afgesloten met aluminiumfolie en geïncubeerd bij 18 of 25 °C. De myceliumgroei werd 14 (18 °C) of 12 dpi (25 °C) geëvalueerd. De interactieproeven hadden 5 behandelingen met 6 herhalingen (Tabel 2.6).

Figuur 2.2: Drie petriplaten van de interactieproef bij 18 °C 14 dpi. Het isolaat links op de plaat is Vt305 en het isolaat rechts is V. dahliae Tabel 2.6: De vijf isolatencombinaties bij de interactieproef op PDA medium Behandeling 1 2 3 4

5

Linker helft

Vt305

VSO1

V. dahliae

Vt305

VSO1

Rechter helft

Vt305

VSO1

V. dahliae

V. dahliae

V. dahliae


4 Plantenmateriaal 4.1 Cultivar Voor de plantenproeven werd de tomatencultivar MoneyMaker gebruikt. Deze cultivar beschikt niet over het Ve1 gen en is dus gevoelig voor V. dahliae race 1 (Fradin et al. 2009).

4.2 Ontsmetten zaden De zaden werden oppervlakkig gesteriliseerd om aanwezige micro-organismen af te doden. De zaden werden 1 min in 70% ethanol en vervolgens 15 min in 1% NaOCl gebracht. Daarna werden ze viermaal gedurende 1 min met steriel water gewassen en uiteindelijk gedroogd op steriel filterpapier in de laminaire flow.

4.3 Voorbereiden potgrond-zand mengsel De planten werden opgegroeid in een substraat van potgrond en rivierzand (verhouding 1:1). Dit mengsel werd tweemaal geautoclaveerd gedurende 1 h bij 121 °C en 103,4 kPa met 24 h tussen de eerste en de tweede keer.

4.4 Opgroeien kiemplanten De ontsmette tomatenzaden werden gezaaid in bakjes (15 cm op 20 cm) met het substraat van potgrond en rivierzand. Er werden 16 zaden per bakje gezaaid. De tomatenzaden werden 1 cm diep in het substraat (dikte: 4 cm) geplaatst. Het substraat werd vervolgens bevochtigd met 100 mL kraantjeswater. De bakjes werden dan omsloten met een transparante folie, om verdamping van vocht te voorkomen, en vervolgens in de groeikamer geplaatst. Na gemiddeld 7 dagen kiemden de plantjes en werd de folie verwijderd. De kiemplantjes groeiden zo verder tot hun eerste bladstadium.

4.5 Infectie: worteldipmethode In het eerste bladstadium werden de planten uit het substraat gehaald en werden de wortels gewassen met kraantjeswater om het substraat te verwijderen. De planten werden vervolgens geïnoculeerd door de wortels gedurende 5 min in een sporenoplossing te dippen. Tijdens de worteldip werd de sporenoplossing voortdurend geschud om het contact tussen de sporen en de wortels te optimaliseren en bezinking van de sporen te voorkomen. Na inoculatie werd elk kiemplantje in een aparte pot (∅ = 9 cm) geplant met ±250 g substraat. Vervolgens werd 50 mL kraantjeswater toegediend en werden de plantjes terug in de groeikamer geplaatst. Na 7 dagen vond de tweede infectie op dezelfde wijze plaats.


5 Plantenproeven 5.1 Proefopstelling Plantenproef 1 In deze proef werd de plantengroei van tomaat geëvalueerd na inoculatie met Vt305, VSO1 en V. dahliae. De inoculatie met Vt305 en VSO1 vond een week eerder plaats dan die met V. dahliae (Tabel 2.7). De sporenconcentratie tijdens elke inoculatie was 1x106 sporen/mL. De planten werden vervolgens in een groeikamer geplaatst bij 18 °C met een dag/nacht regime van 16/8. De stalen werden op drie verschillende tijdstippen genomen: 7, 14 en 29 dpi. Per staalname werden er telkens 4 planten geoogst. Tabel 2.7: De behandelingen met Verticillium species bij plantenproef 1 Behandeling

Aantal planten

Eerste inoculatie

Tweede inoculatie

C

12

steriel water

steriel water

Vt305

12

Vt305 (1x106 sporen/ml)

steriel water

VSO1

12

VSO1 (1x106 sporen/ml)

steriel water

Vd

12

steriel water

V. dahliae (1x106 sporen/ml)

Vt305 + Vd

12



VSO1 + Vd

12




Plantenproef 2 In deze proef werd de invloed van de sporenconcentratie van V. dahliae bij de inoculatie nagegaan. Net zoals in de vorige plantenproef vonden de inoculaties met Vt305 en VSO1 een week eerder plaats dan die met V. dahliae (Tabel 2.8). De sporenconcentratie tijdens de worteldip bedroeg voor Vt305 1x106 sporen/mL en voor V.dahliae werden twee concentraties gebruikt (1x104 en 1x106 sporen/mL). De planten werden vervolgens in een groeikamer geplaatst bij 25 °C met een dag/nacht regime van 16/8. Bij deze proef werden op drie verschillende tijdstippen stalen genomen: 6, 13 en 27 dpi. Per staalname werden er telkens 4 planten geoogst. Tabel 2.8: De behandelingen met Verticillium species bij plantenproef 2 Behandeling

Aantal planten

Eerste inoculatie

Tweede inoculatie

C

12

steriel water

steriel water

Vt305

12


steriel water

VSO1

12


steriel water

Vd(4)

12

steriel water


Vt305 + Vd(4)

12



VSO1 + Vd(4)

12



Vd(6)

12

steriel water


Vt305 + Vd(6)

12



VSO1 + Vd(6)

12




Plantenproef 3 In deze proef werd de genexpressie van enkele afweergenen in tomaat nagegaan bij inoculatie met Vt305 en V. dahliae. De inoculatie met Vt305 was ook in deze proef een week eerder dan deze met V. dahliae (Tabel 2.9). De sporenconcentratie tijdens de worteldip bedroeg voor Vt305 1x106 sporen/mL en voor V.dahliae werden twee concentraties gebruikt (1x104 en 1x106 sporen/mL). De planten werden vervolgens in een groeikamer geplaatst bij 25 °C met een dag/nacht regime van 16/8. Bij deze proef werden op twee verschillende tijdstippen stalen genomen: 7 en 21 dpi. Per staalname werden er telkens 6 planten geoogst. Tabel 2.9: De behandelingen met Verticillium species bij plantenproef 3 Behandeling

Aantal planten

Eerste inoculatie

Tweede inoculatie

C

12

steriel water

steriel water

Vt305

12


steriel water

Vd(4)

12

steriel water


Vt305 + Vd(4)

12



Vd(6)

12

steriel water


Vt305 + Vd(6)

12



5.2 Staalname Bij elke staalname werd eerst de lengte van de planten bepaald door de afstand te meten tussen de basis van het hypocotyl en het laatst ontwikkelde blad. Daarnaast werd het aantal bladeren per plant geteld. De wortels werden vervolgens uit het substraat gehaald en voorzichtig gewassen om het substraat te verwijderen. Daarna werd het vers gewicht van de plant bepaald om vervolgens het boven- en ondergronds gedeelte te scheiden en apart te wegen. Het hypocotyl en de stengel werden overlangs doorgesneden om de vasculaire verkleuring te scoren (Figuur 2.3). Naargelang het aandeel van het hypocotyl en de stengel met vasculaire verkleuring werden de planten gescoord: score 0 = 0% verkleuring, score 1 = 025% verkleuring, score 2 = 25 - 50% verkleuring, score 3 = 50 - 75% verkleuring en score 4 = 75 - 100% verkleuring.


De scoring van de stalen voor RNA extractie werd gebaseerd op de vasculaire verkleuring van het stengelstuk tussen de cotyledonen en het tweede blad. Dit om het RNA in het geanalyseerde plantenmateriaal zo weinig mogelijk te beïnvloeden. De wortel, hypocotyl en stengel (internodium tussen blad 2 en 3) van elke plant werden bewaard bij -80 °C voor verdere analyses. Wanneer ethyleenmetingen werden uitgevoerd, werd de vasculaire verkleuring van het plantenmateriaal pas na de meting gescoord. Het bovengronds gedeelte van de tomatenplant werd namelijk afgesneden en overnacht bewaard (4 °C) in een proefbuis van 200 mL met 25 mL kraantjeswater om de volgende dag de ethyleenmetingen uit te voeren.

Figuur 2.3: Vasculaire verkleuring van het hypocotyl door V. dahliae (1x106 sporen/ml) bij tomaat 29 dpi

6 DNA analyse 6.1 DNA extractie van Verticillium uit plantenmateriaal Het plantenmateriaal werd eerst gegrind in vloeibare stikstof. De daaropvolgende DNA extractie gebeurde met de Invisorb ® Spin Plant Mini Kit zoals in de handleiding werd beschreven (STRATEC, Molecular, Invitec, Berlijn, Duitsland). De kwaliteit en concentratie van de DNA-oplossing werd nagegaan met de NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science, De Meern, Nederland). Daarna werden de stalen bewaard bij -20 °C voor verdere analyses.


6.2 Kwantificatie van Verticillium in plantenweefsel d.m.v. qPCR De qPCR (kwantitatieve PCR) werd uitgevoerd met het Mx3005P Real-Time PCR System (Stratagene, Waldbronn, Duitsland). In een 96 Well-plaat werd in elke well een reactievolume van 50 µL gepipetteerd, waarvan de samenstelling is weergegeven in Tabel 2.10. De primers voor Vt305, VSO1 en V. dahliae zijn in Tabel 2.11 weergegeven. De primers werden verdund naar een finale concentratie van 200 µM voor V. dahliae en 300 µM voor Vt305 en VSO1. De primers binden naargelang hun nucleotidesequentie specifiek op de rDNA ITS regio van V. dahliae of Vt305/VSO1. De detectie gebeurde via het fluorescerend signaal afkomstig van een kleurstof in de GoTaq qPCR master mix (Promega, Madison, VS). Deze kleurstof is een dubbelstrengig DNA (dsDNA) bindende kleurstof die bij binding sterk fluoresceert. Als de fluorescentie een bepaalde drempelwaarde overschrijdt, werd het cyclusnummer (Cycle threshold, Ct) toegekend. Met behulp van een ingesloten standaardreeks konden uiteindelijk de Ct-waarden van de ongekende stalen gelinkt worden aan de hoeveelheden DNA. De standaardreeks was gebaseerd op zes concentraties waarvan de hoogste, 10 6 fg DNA/reactievolume, telkens tienmaal werd verdund tot uiteindelijk 10 fg DNA/reactievolume. De qPCR had het volgend temperatuurprofiel: 2 min bij 50 °C, 10 min bij 95 °C gevolgd door 40 cycli van 15 s bij 95 °C en 1 min bij 60 °C. Tot slot werd het PCR product afgesmolten met de volgende cyclus: 15 s bij 95 °C, 15 s bij 60 °C en 15 s bij 95 °C. De niet-specifieke binding van de kleurstof in de GoTaq qPCR master mix (Promega, Madison, VS) heeft het voordeel dat het op eender welk stuk dsDNA bindt, waardoor er geen specifieke probes ontwikkeld moeten worden. Het nadeel hierbij is dat de kleurstof ook bindt met niet-specifieke producten. Om na te gaan of er geen niet-specifieke producten geamplificeerd werden, kunnen de smeltcurves gecontroleerd worden. Het voorkomen van pieken bij verschillende temperaturen wijst op de aanwezigheid van ongewenste amplificatieproducten en duidt er bijgevolg op dat de PCR reactie niet correct verliep. Tabel 2.10: Samenstelling van het reactievolume voor de qPCR van DNA Component DNA (5 ng/µL) Primer forward Primer reverse H201 GoTaq qPCR master mix2 1 2

Hoeveelheid (µL) 5 1 1 18 25

Nuclease-Free Water (Promega, Madison, VS) (Promega, Madison, VS)


Tabel 2.11: Gebruikte primers bij de kwantificering van Vt305, VSO1 en V. dahliae Primer Doelorganisme Genregio Sequentie Referentie rDNA Debode et 5’-CCG GTG TTG GGG ATC TAC T-3’ VtF4 Vt305 en VSO1 ITS-regio al. (2011) rDNA Debode et 5’-GTA GGG GGT TTA GAG GCT G-3’ VtR2 Vt305 en VSO1 ITS-regio al. (2011) rDNA Banno et al. 5’-CCG CCG GTC CAT CAG TCT CTC TG-3’ VdF1 V. dahliae ITS-regio (2011) rDNA Banno et al. 5’-GGG ACT CCG ATG CGA GCT GTA AC-3’ VdR1 V. dahliae ITS-regio (2011)

7 RNA analyse 7.1 RNA extractie De periode voor de extractie werden de plantenstalen bij -80 °C bewaard om degradatie van het RNA te voorkomen. Voor de RNA extractie werden 3 stalen gepoold en vervolgens gegrind. Het plantenmateriaal werd hierbij koud gehouden met vloeibare stikstof. In de eerste stap werd 1 mL TRI reagent® (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS) aan 100 mg gegrind plantenmateriaal toegevoegd en dan gedurende 1 min gehomogeniseerd met een vortex. Na een incubatie van 5 min bij kamertemperatuur werd 0,2 mL chloroform bij elk staal gepipetteerd. De stoffen werden gemengd door de stalen 15 s te schudden. Na een tweede incubatieperiode bij kamertemperatuur van 2 à 3 min, werden de stalen gecentrifugeerd (4 °C, 15 min, 12 000 g). De oplossingen verdeelden zich in 2 fasen met onderaan de fenol-chloroform fase en bovenaan de doorzichtige waterige fase. Het RNA bevond zich in de waterige fase. Er werd telkens 500 µL van het supernatant overgebracht in een nieuw epje. Om het RNA te laten bezinken werd er 0,5 mL isopropanol aan elke staal toegevoegd waarna het 15 s werd geschud. De stalen werden vervolgens 10 min bij kamertemperatuur geïncubeerd en daarna 10 min gecentrifugeerd (4 °C, 12 000 g). Tijdens de centrifuge bezonk het RNA waarbij zich een gelachtige pellet vormde. Het supernatant werd voorzichtig verwijderd en de pellet werd gewassen met 1 mL 75% ethanol. Met een vortex werd het staal geagiteerd totdat de pellet loskwam (max. 10 s) en vervolgens gecentrifugeerd (4 °C, 10 min, 7000 g). Opnieuw werd het supernatant voorzichtig verwijderd. Tot slot werd de RNA pellet 10 min gedroogd in de laminaire flow, waarna het werd opgelost in 40 µL DEPC behandeld RNAase-vrij Milli Q water (Promega, Madison, VS). De stalen werden voor verdere analyses bewaard bij -80 °C.


7.2 DNase behandeling De RNA-oplossingen werden behandeld met de TURBO DNA-freeTM kit (Ambion, Foster City, VS) om DNA contaminanten te verwijderen. Bij de stalen werd 4 µL 10X TURBO DNase buffer en 2 µL DNase toegevoegd waarna ze werden geschud. De stalen werden vervolgens gedurende 20 à 30 min bij 37 °C geïncubeerd. De afbraak van de DNA werd daarna gestopt door 8 µL DNase Inactivation Reagent in elk epje te pipeteren. De stalen werden geschud en vervolgens 2 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Tot slot werden de stalen gecentrifugeerd (20 °C, 90 s, 10 000 g) om het DNase Inactivation Reagent te laten bezinken, waarna het supernatant werd bewaard bij -80 °C.

7.3 Opzuiveren RNA-oplossing Om de zuiverheid van de RNA-oplossingen te bepalen werd de absorptie bij een golflengte van 230, 260 en 280 nm bepaald met de NanoDrop spectrofotometer ND-1000 (Isogen Life Science, De Meern, Nederland). De absorptieverhoudingen 260/230 en 260/230 moeten tussen 1,8 en 2,1 liggen voor een optimale kwaliteit. Bij waarden onder de 1,5 werden de RNAoplossingen opgezuiverd met onderstaand protocol. De stalen werden aangelengd tot 50 µL met DEPC behandeld RNAase-vrij Milli Q water (Promega, Madison, VS) waarna 5 µL 3 M natriumacetaat en 110 µL 70% ethanol werd toegevoegd. De stalen werden daarna 30 à 60 min bij -80 °C geplaatst en vervolgens gecentrifugeerd (4 °C, 30 min, 15 000 g), waarna het supernatant voorzichtig werd verwijderd. Tot slot werd de gedroogde pellet terug opgelost met 40 µL DEPC behandeld RNAase-vrij Milli Q water (Promega, Madison, VS). De RNA-oplossingen werden voor verdere analyses bewaard bij -80 °C.

7.4 cDNA synthese Het RNA werd naar complement DNA (cDNA) omgezet met de High-Capacity cDNA Reverse transcription Kit (Applied Biosystems, VS). De RNA-oplossingen werden hierbij verdund tot 2 µg RNA/mL met DEPC behandeld RNAase-vrij Milli Q water (Promega, Madison, VS). De cDNA synthese werd uitgevoerd met een Thermocycler (Bio-rad, Nazareth, België) en er werd hierbij een reactievolume van 20 µL gehanteerd (Tabel 2.12). De volgende cyclus werd doorlopen: 10 min bij 25 °C, 120 min bij 37 °C en 5 min bij 85 °C. De cDNA-oplossingen werden voor lange bewaring bij -80 °C geplaatst.


Tabel 2.12: Samenstelling van het reactievolume bij de cDNA synthese Component Hoeveelheid (µL) RNA (2 µg/10µL) 10 10X RT Random Primers 2 25X dNTP Mix (100 mM) 0,8 RNase Inhibitor 1 2 µL 10X RT buffer 2 H201 4,2 1

Nuclease-Free Water (Promega, Madison, VS)

7.5 Kwantificatie van RNA expressie d.m.v. qPCR De qPCR werd uitgevoerd met een Mx3005P Real-Time PCR System (Stratagene, Waldbronn, Duitsland). Een reactievolume van 25 µL werd gebruikt om de cDNA concentratie van de merkergenen te bepalen (Tabel 2.13). De gegevens van de gebruikte primers van de onderzochte genen zijn in Tabel 2.14 weergegeven. De qPCR had het volgend temperatuurprofiel: 15 min bij 94 °C gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 94 °C, 1 min bij de Tm en 1 min bij 72 °C. Tot slot werd een smeltcurve gevormd door de volgende cyclus te doorlopen: 15 s bij 95 °C, 15 s bij 60 °C en 15 s bij 95 °C. De detectiewaarden van de wortelstalen werden genormaliseerd aan deze van het GPD (glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase) referentiegen van tomaat (U97257). Bij de hypocotylstalen was dit t.o.v. het TUB (β-tubuline) referentiegen van tomaat (DQ205342). Het GPD en TUB gen werden niet beïnvloed door de verschillende inoculaties. De detectiewaarden van de merkergenen van de controleplanten werden gebruikt als calibrator. De Cq-waarde van elk gen werd gemeten en de expressie van de genen in de verschillende stalen werd berekend met 2-∆∆Cq om de relatieve expressie t.o.v. de calibrator te bekomen. Tabel 2.13: Samenstelling van het reactievolume voor de qPCR van cDNA Component cDNA (10 ng/µL) Primer forward (3 µM) Primer reverse (3 µM) H201 GoTaq qPCR master mix2 1 2

Hoeveelheid (µL) 2 2,5 2,5 5,5 12,5

Nuclease-Free Water (Promega, Madison, VS) (Bio-connect, Huissen, Nederland)


Tabel 2.14: De gebruikte primers bij de kwatificatie van de expressie van enkele afweergenen Primer Functie Sequentie ToegangsTm Referentie nummer (°C) Aimé et al. LeTUBf β-tubuline 5’-AAC CTC CAT TCA GGA GAT GTT T-3’ DQ205342 58 (2013) Aimé et al. LeTUBr β-tubuline 5’-TCT GCT GTA GCA TCC TGG TAT T-3’ DQ205342 58 (2013) Balaji et al. 5’-ATG CTC CCA TGT TTG TTG TGGGapdh-f GPD U97257 58 GTG-3’ (2008) Balaji et al. 5’-TTA GCC AAA GGT GCA AGG CAGGapdh-r GPD U97257 58 TTC-3’ (2008) Pantelides et al. 5’-GGA AGC CCA ATG AGA ATA AAALeETR4-F ETR4 AY600438 58 CTG-3’ (2010) Pantelides et al. 5‘-CTA CTC CCT CCA CTA CTC GCALeETR4-R ETR4 AY600438 58 ACA-3’ (2010) Balaji et al. 5’-GAG AGT ATG GCT AGG TAC GTTPti5f Pti 5 U89256 58 CG-3’ (2008) Balaji et al. 5’-TAA GTA GTG CCT TAG CAC CTCPti5r Pti 5 U89256 58 GC-3’ (2008) Kavroulakis et al. 5’-CAA TTC GTT TCC AGG TTT TG-3’ LeCHI3f chitinase Z15141 58 (2006) Kavroulakis et al. 5’-ACT TTC CGC TGC AGT ATT TG-3’ LeCHI3r chitinase Z15141 58 (2006) β-1,3Kavroulakis et al. 5’-TAT AGC CGT TGG AAA CGA AG-3’ LeGLUAf M80604 58 glucanase (2006) β-1,3Kavroulakis et al. 5’-TGA TAC TTT GGC CTC TGG TC-3’ LEGLUAr M80604 58 glucanase (2006) Kavroulakis et al. 5’-CCA AGA CTA TCT TGC GGT TC-3’ LePR-1Af PR-1 AJ011520 58 (2006) Kavroulakis et al. 5’-GAA CCT AAG CCA CGA TAC CA-3’ LePR-1Ar PR-1 AJ011520 58 (2006) ACC Balaji et al. 5’-CCG GGC AGG TAG CAA ATT AAAYL991 AB013101 54 AGA T-3’ oxidase (2008) ACC Balaji et al. 5’-GTC CTA TTA AAA CAT AAA CAA ATTYL992 AB013101 54 CCC CC-3’ oxidase (2008)


8 Ethyleenmetingen De proefbuizen met het bovengronds plantenmateriaal werden ±4 h voor aanvang van de ethyleenmetingen luchtdicht afgesloten met een rubberen dop. De ethyleenconcentratie in de proefbuizen werd vervolgens bepaald d.m.v. gaschromatografie (Interscience, TraceGC ultra, Breda, Nederland). De stalen werden met een spuit voorzien van een injectienaald genomen. De naald doorprikte de rubberen dop waarna 3 mL lucht uit de proefbuis werd opgezogen en geïnjecteerd in de gaschromatograaf. De analyseresultaten werden gekwantificeerd t.o.v. een standaardcurve die op basis van 2 ethyleenconcentraties (0,4 ppm en 1 ppm) werd opgesteld.

9 Statistische dataverwerking De data werden statistisch verwerkt met de software van SPSS statistics 22. De onderlinge relaties tussen de behandelingen werden nagegaan. Als nulhypothese werd gesteld dat er geen verschil was tussen de verschillende behandelingen en deze werd getest op het 5% significantieniveau. De normaliteit en gelijkheid van varianties van de data werd nagegaan m.b.v. de Kolmogorov-Smirnov toets en de Levene toets. Bij een normale verdeling en gelijke varianties, werd de One-Way ANOVA toets met Tukey HSD als Post Hoc toets toegepast om de gemiddelden te vergelijken. Niet-parametrische toetsen werden gebruikt wanneer de steekproefverdeling niet normaal verdeeld was of de varianties niet gelijk waren. Hierbij werd de Kruskal-Wallis toets gebruikt om meerdere behandelingen met elkaar te vergelijken en de Mann-Whitney toets om twee behandelingen onderling te vergelijken. De correlatie tussen de verschillende symptomen werd met een Pearson correlatie test nagegaan.


Resultaten en Discussie

1. Inleiding Er werd reeds aangetoond dat het isolaat Verticillium Vt305 een endofyt is bij bloemkool en bloemkool kan beschermen tegen de pathogeen V. longisporum (Tyvaert et al. 2014). Het gebruik van niet-pathogene Verticillium isolaten als biologische bestrijder van Verticillium verwelking is daarom een veelbelovende strategie. In deze studie werd de rol van Vt305 in de interactie met tomaat onderzocht. Daarnaast werd ook het isolaat VSO1, afkomstig van de bodem met biologische tomatenteelt in kas, in deze studie gebruikt. Vt305 en VSO1 werden reeds op basis van de ITS regio gekarakteriseerd als V. isaacii (França et al. 2013 en labo fytopathologie UGent, respectievelijk). Omdat de ITS regio tussen Verticillium species niet steeds verschillend is en karakterisatie op basis van meerdere loci accurater is, werden beide isolaten verder gekarakteriseerd op basis van meerdere loci (Inderbitzin et al. 2011; Inderbitzin & Subbarao 2014). Een preliminaire studie toonde aan dat Vt305 en VSO1 niet pathogeen waren voor tomaat. In deze studie werd een proef uitgevoerd om de invloed van Vt305, VSO1 en V. dahliae na te gaan op de plantengroei van tomaat. Daarnaast werd nagegaan of pre-inoculatie van Vt305 of VSO1 de tomatenplanten kon beschermen tegen V.dahliae. In de tweede plantenproef werd de eerste proef herhaald en tevens werd V. dahliae in een lagere concentratie geïnoculeerd. De invloed van Vt305 en VSO1 op de symptoomontwikkeling en kolonisatie van V. dahliae werd nagegaan. Het direct antagonisme tussen de niet-pathogene isolaten (Vt305 en VSO1) en V. dahliae werd in vitro onderzocht. Tot slot werd bij een derde plantenproef de expressie van enkele afweergenen in tomaat gekwantificeerd na inoculatie met V. dahliae en werd de invloed van pre-inoculatie met Vt305 nagegaan.

___________________________________________________________________________ Resultaten en Discussie 38

2. Karakterisatie Vt305 en VSO1 werden reeds op basis van de ITS regio als V. isaacii gekarakteriseerd. In deze studie werden nog vier andere genregio’s beschouwd: actine (ACT), elongatiefactor 1-alfa (EF), glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GPD) en tryptofaan synthase (TS). De nucleotidesequenties van deze genregio’s werden geblast in Genbank (2014).

2.1. Resultaten Vt305 en VSO1 waren het meest gerelateerd met V. isaacii isolaat PD343. De EF genregio was het sterkst gedifferentieerd met een gelijkenis van respectievelijk 97% en 95% voor Vt305 en VSO1 t.o.v. V. isaacii PD343 (Tabel 3.1). Tabel 3.1: Nucleotidenovereenkomst van VSO1 en Vt305 met V. isaacii (PD343) volgens Inderbitzin et al. (2011) in de genregio’s: ACT, EF, GPD en TS Isolaat ACT EF GPD TS Species VSO1 100% 95% 100% 100% V. isaacii Vt305 99% 97% 99% 99% V. isaacii


3. Plantenproef 1 In proef 1 werd de plantengroei van de tomaten opgevolgd na inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae. Daarnaast werd nagegaan of pre-inoculatie met de niet-pathogene isolaten (Vt305 en VSO1) de plant kon beschermen tegen Verticillium verwelking. De tomatenplanten werden in het eerste bladstadium een eerste maal geïnoculeerd via de worteldipmethode. Eén week later volgde een tweede inoculatie. De wortels van de controleplanten (C) werden tweemaal in steriel water gedipt. Bij de behandeling Vt305 en VSO1 werden de planten een eerste maal geïnoculeerd met respectievelijk isolaat Vt305 (106 sporen mL-1) en VSO1 (1x106 sporen mL-1), de tweede maal werden de wortels in steriel water gedipt. De vierde behandeling (Vd) bestond uit een eerste worteldip in steriel water, gevolgd door inoculatie met V. dahliae (1x106 sporen mL-1). Dan waren er nog twee behandelingen ((Vt305+Vd) en (VSO1 + Vd)) waarbij de wortels een eerste maal geïnoculeerd werden met respectievelijk isolaat Vt305 (1x106 sporen mL-1) en VSO1 (1x106 sporen mL-1) en een tweede maal met V. dahliae (1x106 sporen mL-1). Per staalname werden vier planten per behandeling geoogst en beoordeeld (7, 14 en 29 dpi). Het aantal bladeren, de lengte, het wortelgewicht, het bovengronds gewicht, het totaal gewicht en de vasculaire verkleuring van elke plant werden bepaald. Tot slot werd de ethyleenproductie van de tomatenplanten, geassocieerd met symptoomontwikkeling, bepaald.

3.1. Resultaten 3.1.1. Evaluatie van de planten gedurende de proef Inoculatie met Vt305 en VSO1 had geen invloed op de groei van de tomatenplanten (Figuur 3.1). V. dahliae induceerde wel symptomen vanaf 14 dpi. Bij de staalname 29 dpi waren 50 % van de planten met enkele inoculatie van V. dahliae lichter van kleur waarbij de pre-inoculatie met VSO1 dit reduceerde tot 25% van de planten. Pre-inoculatie met Vt305 stimuleerde de symptomen door V. dahliae daar 75% van de planten lichtgroen verkleurden en 25% van de planten dwerggroei vertoonden.


Het bovengronds- en wortelgewicht gaven dezelfde tendens weer als het totaal plantgewicht, waardoor enkel dit laatste wordt weergegeven in Figuur 3.1. Tussen de behandelingen waren er geen significante verschillen. Dit is te wijten aan het beperkt aantal herhalingen per behandeling met als gevolg een hoge graad van variantie. Vt305 en VSO1 veroorzaakten geen dwerggroei of gewichtsreductie en beide isolaten zijn dus niet pathogeen voor tomaat. V. dahliae reduceerde het vers gewicht van de tomatenplanten, weliswaar niet significant. Bij pre-inoculatie met Vt305 en VSO1 werd deze reductie tevens waargenomen.

25,0

a'' a'' a''

vers gewicht (g)

20,0

a'' a''

15,0

C

a''

Vt305 VSO1 Vd

10,0

Vt305+Vd 5,0

a a a a a a

a' a' a' a' a' a'

VSO1+Vd

0,0 7 dpi

14 dpi

29 dpi

Figuur 3.1: De invloed van enkele inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305/VSO1 met V. dahliae op het totaal plantgewicht van tomaat 7, 14 en 29 dpi. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305 en VSO1: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + water; Vd: water + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd en VSO1+Vd: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1.De planten werden 7, 14 en 29 dpi geoogst. Voor eenzelfde staalname zijn de behandelingen met eenzelfde letter significant niet verschillend bij P<0,05 met de Tukey (7 en 14 dpi) en de Kruskal-Wallis toets (29 dpi). De balken geven het gemiddelde weer en de foutvlaggen de standaardfout.


3.1.2. Vasculaire verkleuring en ethyleenproductie Bij de staalname 7 dpi werd enkel vasculaire verkleuring vastgesteld in de stengel van de planten met pre-inoculatie van VSO1 gevolgd door inoculatie met V. dahliae (Figuur 3.2a). Vanaf 14 dpi ontwikkelden alle planten enkel geïnoculeerd met V. dahliae vasculaire verkleuring (Figuur 3.2b). VSO1 kon de vasculaire verkleuring significant reduceren 14 dpi en pre-inoculatie met Vt305 leidde tot minder ernstige verkleuring bij 1 plant. Bij de laatste staalname was er geen symptoomreductie meer door pre-inoculatie met Vt305 en VSO1 (Figuur 3.2c). Inoculatie met enkel Vt305 of VSO1 induceerde geen vasculaire verkleuring. De vasculaire verkleuring was significant negatief gecorreleerd met het totaalgewicht van de tomatenplanten 29 dpi (R2 = -0,725; p = 0,000). Er waren geen significante verschillen voor de ethyleenproductie tussen de behandelingen (Figuur 3.2d). V. dahliae kon de ethyleenproductie van de tomatenplanten stimuleren en preinoculatie met Vt305 kon dit voorkomen. Vt305 en VSO1 hadden geen invloed op de ethyleenproductie. De ethyleenproductie was significant positief gecorreleerd met de vasculaire verkleuring (R2 = 0,612; p = 0,001) en significant negatief met het totaalgewicht van de plant (R 2 = -0,722 ; p = 0,000). Het was mogelijk dat Vt305 en VSO1 een invloed hadden op de vroege symptoomontwikkeling door V. dahliae. De symptomen waren minder ernstig of er waren minder planten met symptomen maar het verschil was klein t.o.v. inoculatie met enkel V. dahliae. Door de hoge concentratie van de pathogeen bij inoculatie konden Vt305 en VSO1 de plant waarschijnlijk onvoldoende beschermen.


(a) a

a

(b) a

a

14 dpi

a

3 2 1

aantal planten

2 1 0

a

c

ab

b

3 2 1

(d)

29 dpi b

b

b

a

a

29 dpi

a ethyleenproductie (nl/g.u)

(c)

3

c

0

0

4

c

4

aantal planten

aantal planten

4

a

7 dpi

a

4,5

a 3 1,5

a

a

a

a

0

Figuur 3.2: De invloed van enkele inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305/VSO1 met V. dahliae op de vasculaire verkleuring (7, 14 en 29 dpi) en de ethyleenproductie (29 dpi) van tomatenplanten. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305 en VSO1: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + water; Vd: water + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(6) en VSO1+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. (a),(b) en (c) vasculaire verkleuring waargenomen respectievelijk 7, 14 en 29 dpi. De vasculaire verkleuring werd gescoord: score 0 = 0% vasculaire verkleuring , score 1 = 0-25% vasculaire verkleuring , score 2 = 25-50% vasculaire verkleuring , score 3 = 50-75% vasculaire verkleuring en score 4 = 75-100% vasculaire verkleuring . Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 volgens de Mann-Whitney toets. (d) Ethyleenproductie: de planten werden 29 dpi geoogst en de ethyleenproductie werd de daaropvolgende dag gemeten. Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 volgens de Kruskal-Wallis toets. De balken geven het aantal planten weer.


4. Plantenproef 2 In de vorige proef konden de niet-pathogene Verticillium isolaten (Vt305 en VSO1) onvoldoende bescherming bieden tegen V. dahliae. Dit kwam waarschijnlijk doordat V. dahliae in hoge concentratie geïnoculeerd werd. In deze proef werden daarom twee verschillende concentraties van V. dahliae gebruikt bij inoculatie. Enerzijds werd het verschil in ziektedruk bij tomaat door inoculatie met de verschillende concentraties nagegaan. Anderzijds werd de invloed van de niet-pathogene Verticillium isolaten op de kolonisatie van V. dahliae nagegaan. De tomatenplanten werden in het eerste bladstadium een eerste maal geïnoculeerd via de worteldipmethode. Eén week later volgde een tweede inoculatie. De wortels van de controleplanten (C) werden tweemaal in steriel water gedipt. Bij de behandeling Vt305 en VSO1 werden de planten een eerste maal geïnoculeerd met respectievelijk isolaat Vt305 (106 sporen mL-1) en VSO1 (1x106 sporen mL-1), de tweede maal werden de wortels in steriel water gedipt. De vierde behandeling (Vd(4)) bestond uit een eerste worteldip in steriel water, gevolgd door inoculatie met V. dahliae (1x104 sporen mL-1). Dan waren er twee behandelingen (Vt305+Vd(4) en VSO1 + Vd(4)) waarbij de wortels een eerste maal geïnoculeerd werden met respectievelijk isolaat Vt305 (1x106 sporen mL-1) en VSO1 (1x106 sporen mL-1) en een tweede maal met V. dahliae (1x104 sporen mL-1). Bij de behandeling Vd(6) werden de wortels een eerste maal gedipt in steriel water, gevolgd door inoculatie met V. dahliae (1x106 sporen mL1). De laatste twee behandelingen (Vt305+Vd(6) en VSO1 + Vd(6)) bestonden uit een eerste worteldip met respectievelijk isolaat Vt305 (1x106 sporen mL-1) en VSO1 (1x106 sporen mL-1), gevolgd door een inoculatie met V. dahliae (1x106 sporen mL-1). Bij elke staalname werden vier planten per behandeling geoogst en beoordeeld (6, 13 en 27 dpi). Tijdens de beoordeling werden het aantal bladeren, de lengte, het wortelgewicht, het bovengronds gewicht, het totaal gewicht, de bladvergeling en de vasculaire verkleuring van elke plant bepaald. Nadien werd de ethyleenproductie van de tomatenplanten gemeten tijdens de eerste en tweede staalname. Het bovengronds plantenmateriaal werd in een afgesloten proefbuis geïncubeerd waarna de ethyleenconcentratie werd gemeten. Tot slot werd de kolonisatie in het plantenweefsel van de drie isolaten bepaald door hun DNA in de wortel, hypocotyl en stengel met qPCR te kwantificeren.


4.1. Resultaten 4.1.1. Evaluatie van de planten gedurende de proef Bij de eerste staalname werd geen verschil tussen de behandelingen waargenomen. De typische dwerggroei ontwikkelde vanaf 13 dpi. Inoculatie met V. dahliae in de lage concentratie veroorzaakte bij 25% van de planten dwerggroei, bij de hoge concentratie was dit 50% (Figuur 3.3). Pre-inoculatie van Vt305 of VSO1 in combinatie met de lage concentratie van V. dahliae kon de dwerggroei voorkomen (Figuur 3.4a en 3.4b). De resultaten van de bladvergeling toonden geen significante verschillen of tendensen tussen de behandelingen (data niet weergegeven). Het totaal-, bovengronds- en wortelgewicht hadden dezelfde tendens waardoor enkel het totaal plantgewicht wordt weergegeven (Figuur 3.4c). Bij de eerste staalname waren er geen significante verschillen tussen de behandelingen. Het gewicht van de planten geïnoculeerd met V. dahliae in hoge concentratie was 13 dpi significant lager t.o.v. de controleplanten. Deze gewichtsreductie werd door de pre-inoculatie van Vt305 en VSO1 gereduceerd maar niet significant. Deze tendens werd bij de laatste staalname niet meer waargenomen. Bij planten geïnoculeerd met V. dahliae in lage concentratie waren er geen significante verschillen. De sporenconcentratie van V. dahliae had geen significante invloed op het gewicht van de planten met een enkele inoculatie. Er was wel een tendens dat een hogere infectiedosis het gewicht meer reduceerde.

Figuur 3.3: De invloed van enkele inoculatie met V. dahliae in de lage concentratie op de plantengroei van tomaat 13 dpi. De wortels werden tijdens het eerste bladstadium gedipt in steriel water en een week later in een sporenoplossing van V. dahliae (1x104 sporen/mL). Linkse plant vertoont typische dwerggroei en de 3 rechtse planten waren niet van de controleplanten te onderscheiden.


(a)

C

Vt305

Vd(4)

Vt305+Vd(4)

Vd(6)

Vt305+Vd(6)

C

VSO1

Vd(4)

VSO1+Vd(4)

Vd(6)

VSO1+Vd(6)

(b)

(c)

40,0

a'' a''a'' a'' a'' a''

35,0

vers gewicht (g)

30,0

a'' a'' a''

C Vt305

VSO1

25,0

Vd(4) 20,0

Vt305+Vd(4)

15,0

VSO1+Vd(4)

a' a' ab' ab' ab' ab' ab' b' ab'

10,0

5,0

Vd(6) Vt305+Vd(6)

a a aa a a a a a

VSO1+Vd(6)

0,0 6 dpi

13 dpi

27 dpi

Figuur 3.4: De invloed van enkele inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305/VSO1 met V. dahliae op de plantgroei (13 dpi) en het totaal plantgewicht (6, 13 en 27 dpi) van tomaat waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305 en VSO1: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en VSO1+Vd(4): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x104 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(6) en VSO1+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. Dwerggroei door V. dahliae in behandeling Vd(4) en Vd(6). (a) Effect van Vt305 op dwerggroei 13 dpi. (b) Effect van VSO1 op dwerggroei 13 dpi. (c) Totaal plantgewicht. De planten werden geoogst 6, 13 en 27 dpi. Voor eenzelfde staalname zijn de behandelingen met eenzelfde letter significant niet verschillend bij P<0,05 met de Tukey toets. De balken geven het gemiddelde weer en de foutenvlaggen de standaardfout.


4.1.2. Vasculaire verkleuring in het hypocotyl en de stengel Figuur 3.5 geeft de resultaten van de vasculaire scoring weer. Bij de staalname 27 dpi werd de vasculaire verkleuring in het hypocotyl en de stengel apart gemeten. Beide plantendelen volgden dezelfde tendens waardoor enkel de resultaten van het hypocotyl weergegeven worden. De planten enkel geïnoculeerd met Vt305 of VSO1 ontwikkelden tijdens de proef geen vasculaire verkleuring. Er waren geen significante verschillen tussen de planten geïnoculeerd met de hoogste en de laagste concentratie van enkel V. dahliae, maar er waren steeds minder planten met vasculaire verkleuring bij inoculatie met de laagste concentratie. De pre-inoculatie van Vt305 of VSO1 met de hoogste concentratie van V. dahliae veroorzaakte geen significante verschillen maar kon 6 dpi het aantal planten met vasculaire verkleuring reduceren en 13 dpi zorgde de pre-inoculatie voor minder ernstige verkleuring. Bij de planten met pre-inoculatie voor V. dahliae in lage concentratie waren er 6 en 13 dpi minder planten met vasculaire verkleuring t.o.v. de planten met enkel inoculatie van V. dahliae in de lage concentratie. In de laatste staalname was er geen symptoomreductie door Vt305 of VSO1. Er was een significant negatieve correlatie tussen de vasculaire verkleuring en het totale plantgewicht gedurende de hele proef (27 dpi: R2 = -0,559; p = 0,000).


aantal planten

4

b

b

b

ab

b

b

b

ab

b

b

b

ab

6 dpi

b

b

a

a

ab

b

a

a

a

b

a

a

a

3

2 1 0

13 dpi aantal planten

4

b

3

2 1 0

aantal planten

4

27 dpi

ab

3 2 1 0

Figuur 3.5: De invloed van enkele inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305/VSO1 met V. dahliae op de vasculaire verkleuring van de tomatenplanten 6, 13 en 27 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305 en VSO1: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en VSO1+Vd(4): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL1 + 1x104 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(6) en VSO1+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. De planten werden 6, 13 en 27 dpi geoogst. De grafieken geven bij 6 en 13 dpi de vasculaire verkleuring van zowel het hypocotyl als de stengel weer en bij 27 dpi enkel van het hypocotyl. De vasculaire verkleuring werd gescoord: score 0 = 0% vasculaire verkleuring , score 1 = 0-25% vasculaire verkleuring , score 2 = 25-50% vasculaire verkleuring , score 3 = 50-75% vasculaire verkleuring en score 4 = 75-100% vasculaire verkleuring . Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 volgens de Mann-Whitney toets. De balken geven het aantal planten weer.


4.1.3. Ethyleenproductie bovengronds plantenmateriaal Tussen de behandelingen was er geen significant verschil in ethyleenproductie van de planten (Figuur 3.6). Bij de planten geïnoculeerd met V. dahliae in de hoge concentratie, al dan niet met pre-inoculatie van Vt305 of VSO1, was de ethyleenproductie 13 dpi hoger dan de bij de planten van de andere behandelingen. De ethyleenproductie was significant positief gecorreleerd met de vasculaire verkleuring (13 dpi: R2 = 0,353 ; p = 0,035) en significant negatief gecorreleerd met het totaalgewicht (13 dpi: R2 = -0,610; p = 0,000).

ethyleen productie (nl/g.u)

6 dpi a

5,0

a

4,0 3,0 2,0

a

a

a

a

a

a

a

1,0 0,0

13 dpi ethyleen productie (nl/g.u)

5,0 4,0 3,0 2,0

a a

a

a

a

a

a

a

a

1,0 0,0

Figuur 3.6: De invloed van enkele inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305/VSO1 met V. dahliae op de ethyleenproductie van de tomatenplanten 6 en 13 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305 en VSO1: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en VSO1+Vd(4): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x104 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(6) en VSO1+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. De planten werden 6 en 13 dpi geoogst en de ethyleenproductie werd de daaropvolgende dag gemeten. Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 volgens de Kruskal-Wallis toets. De balken geven de mediaan weer en de foutenvlaggen de MAD.


4.1.4. Moleculaire kwantificering van de Verticillium species Figuur 3.7 toont de resultaten van de DNA kwantificering in de wortel en het hypocotyl 27 dpi. De data van de stengel zijn niet weergegeven daar de detectie van Vt305 en VSO1 beperkt was tot enkele planten. Zowel de isolaten Vt305 en VSO1 als V. dahliae werden in de wortel, hypocotyl en stengel gedetecteerd. Tussen de behandelingen was er geen significant verschil in de hoeveelheid Verticillium DNA, noch in de wortel, noch in het hypocotyl en de stengel. In de wortel was de hoeveelheid Vt305 en VSO1 DNA bij de enkele inoculatie respectievelijk een factor 55 en 570 hoger dan de hoeveelheid V. dahliae DNA bij de planten met een enkele inoculatie in de hoge concentratie. In tegenstelling tot de wortel was de hoeveelheid V. dahliae DNA in het hypocotyl gelijkaardig met de hoeveelheid Vt305 en VSO1 DNA. V. dahliae werd voor zowel de wortel, het hypocotyl als de stengel in minder planten gedetecteerd bij inoculatie met de lage concentratie dan met de hoge concentratie. Pre-inoculatie met Vt305 of VSO1 had geen effect op de kolonisatie van V. dahliae voor beide concentraties in de wortel en het hypocotyl. In de stengel werd V. dahliae bij 4 planten gedetecteerd bij pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae in de hoge concentratie, terwijl er bij inoculatie met enkel V. dahliae en pre-inoculatie van VSO1 slechts in 3 planten detectie waren. Er werd telkens in 1 stengel V. dahliae gedetecteerd bij inoculatie met de lage concentratie, al dan niet na pre-inoculatie. V. dahliae verminderde het aantal planten met detectie van Vt305 en VSO1 DNA in het hypocotyl. Er was in respectievelijk 25% en 75% van de planten geen detectie van Vt305 en VSO1 wanneer V. dahliae in de lage concentratie werd geïnoculeerd. Inoculatie met de hoge concentratie reduceerde het aantal planten met detectie van Vt305 en VSO1 met respectievelijk 25 en 50%. Vt305 en VSO1 werden in de stengel bij respectievelijk twee en drie planten gedetecteerd bij verschillende behandelingen.


Er werden significante correlaties gevonden voor de hoeveelheid Verticillium DNA in de wortel. De hoeveelheid Vt305 DNA was negatief gecorreleerd met het aantal bladeren van de tomatenplant (R2 = -0,734 ; p = 0,024) en de hoeveelheid VSO1 DNA was positief gecorreleerd met het bovengronds- en totaalgewicht (respectievelijk R2 = 0,864 ; p = 0,001 en R2 = 0,814 ; p = 0,002). De hoeveelheid V. dahliae DNA in de wortel was positief gecorreleerd met de vasculaire verkleuring (R2 = 0,447; p = 0,048) en de plantlengte (R2 = 0,444; p = 0,050). In het hypocotyl was de hoeveelheid Vt305 DNA negatief gecorreleerd met het aantal bladeren van de tomatenplant (R2 = -0,666; p = 0,035). De hoeveelheid VSO1 DNA was positief gecorreleerd met: de plantlengte (R2 = 0,933; p = 0,002), het aantal bladeren van de tomatenplant (R2 = 0,778; p = 0,039) en de vasculaire verkleuring van zowel het hypocotyl als de stengel (beide R2 = -0,823; p = 0,023). De hoeveelheid V. dahliae DNA in het hypocotyl was negatief gecorreleerd met het bovengrond plantgewicht (R2 = -0,502; p = 0,048). Er werden geen correlaties gevonden voor hoeveelheid Verticillium DNA in de stengel. In deze plantenproef werden Vt305 en VSO1 in de plant gedetecteerd zonder symptomen te induceren. Beide isolaten kunnen hierdoor als endofyt bij tomaat beschouwd worden. Zowel Vt305 en VSO1 konden de wortels goed koloniseren maar de bescherming was onvoldoende om de kolonisatie van V. dahliae in het bovengronds plantenweefsel tegen te gaan. Uit de symptomen bleek dat er een beperkte bescherming was tot en met 13 dpi door Vt305 en VSO1, maar deze verdween 27 dpi. Dit bevestigde de resultaten van de DNA kwantificering. In een volgende proef wordt eerst nagegaan of er een direct antagonisme is tussen de Verticillium isolaten en bij een volgende plantenproef is het interessant om na te gaan welke genen opgereguleerd worden kort na infectie.


V. tricorpus groep (a)

(c)

27 dpi 250,0 200,0 150,0

100,0

4 4

50,0

2*

3

4

4 ng DNA/g weefsel

2

3,0

4 4

2,0

4

4

27 dpi 2

80,0

3

70,0

3

20,0

2 15,0

4 1

ng DNA/g weefsel

30,0

0,0

4,0

(d)

27 dpi

5,0

5,0

0,0

(b)

10,0

2

6,0

1,0

0,0

25,0

27 dpi 7,0

3** ng DNA/g weefsel

ng DNA/g weefsel

V. dahliae

60,0 50,0

4

40,0 30,0 20,0 10,0

1

1 4

4

0,0

Figuur 3.7: De invloed van enkele inoculatie met Vt305, VSO1 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305/VSO1 met V. dahliae op de hoeveelheid Verticillium DNA in de wortel (a en c) en het hypocotyl (b en d) van de tomatenplanten 27 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. Vt305 en VSO1: 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en VSO1+Vd(4): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x104 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(6) en VSO1+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 of VSO1 mL-1 + 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. De planten werden 27 dpi geoogst. (a) kwantificering van Vt305 en VSO1 DNA in de wortel, (b) kwantificering van Vt305 en VSO1 DNA in het hypocotyl, (c) kwantificering van V. dahliae DNA in de wortel en (d) kwantificering van V. dahliae DNA in het hypocotyl. Er waren 4 herhalingen per behandeling met uitzondering van: * = 2 en ** = 3 herhalingen. De behandelingen zijn niet significant te onderscheiden van elkaar bij P<0,05 volgens de Kruskal-Wallis toets. De balken geven de mediaan weer, de foutenvlaggen de MAD en het getal boven elke balk het aantal planten met detectie per behandeling.


5. Interactieproef Tijdens de eerste twee plantenproeven boden Vt305 en VSO1 onvoldoende bescherming om Verticillium verwelking tegen te gaan en werd de kolonisatie van Vt305 en VSO1 in het hypocotyl door V. dahliae gereduceerd. Dit wijst erop dat V. dahliae de groei van Vt305 en VSO1 mogelijks inhibeert. In deze proef werd het directe antagonisme van V. dahliae met Vt305 en VSO1 in vitro nagegaan. Op beide helften van een petriplaat met PDA medium werd een plug actief groeiend mycelium geplaatst. Bij behandeling Vd, Vt305 en VSO1 werd de diameter van respectievelijk V. dahliae JR2, V. isaacii Vt305 en V. isaacii VSO1 geëvalueerd in combinatie met een plug van hetzelfde isolaat. Bij de combinaties Vd+Vt305 en Vd+VSO1 werd de diameter van V. dahliae bepaald in aanwezigheid van respectievelijk Vt305 en VSO1. Dan was er behandeling Vt305+Vd waarbij de diameter van Vt305 bepaald werd onder invloed van V. dahliae. De laatste combinatie (VSO1+Vd) geeft de diameter van VSO1 weer in aanwezigheid van V. dahliae.

5.1. Resultaten Figuur 3.8 geeft enkel de resultaten van de interactieproef bij 25 °C weer. Bij de behandelingen Vd, Vt305 en VSO1 van de interactieproef bij 18 °C werd er slechts één plug per plaat geplaatst, wat de interpretatie moeilijk maakt. De groei van de Vt305 en VSO1 werd niet beïnvloed door V. dahliae. Andersom beïnvloedden de Vt305 en VSO1 ook de groei van V. dahliae niet. Direct antagonisme is als beschermingsmechanisme tegen Verticillium verwelking uit te sluiten. In een volgende proef wordt naar de expressie van enkele afweergenen gekeken om de interactie van de isolaten met de plant te bepalen.


35,0 30,0

a

a

a

a'

Vd+Vt305

Vd+VSO1

Vt305

a'

a''

a''

diameter (mm)

25,0 20,0 15,0 10,0 5,0

0,0 Vd

Vt305+Vd

VSO1

VSO1+Vd

Figuur 3.8: Direct antagonisme tussen de endofytische isolaten (Vt305 en VSO1) en V. dahliae in vitro 12 dpi. Elke petriplaat werd geïnoculeerd met twee myceliumpluggen, op iedere helft één. Vd: diameter V. dahliae in aanwezigheid van V. dahliae; Vd + Vt305: diameter V. dahliae in aanwezigheid van Vt305; Vd+VSO1: diameter V. dahliae in aanwezigheid van VSO1; Vt305: diameter Vt305 in aanwezigheid van Vt305; Vt305+Vd: diameter Vt305 in aanwezigheid van V. dahliae; VSO1: diameter VSO1 in aanwezigheid van VSO1 en VSO1+Vd: diameter VSO1 in aanwezigheid van V. dahliae. Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 met de Tukey toets. De balken geven de gemiddelde diameter van het mycelium weer en de foutenvlaggen de standaardfout.


6. Plantenproef 3 In de vorige plantenproef konden de endofytische Verticillium isolaten (Vt305 en VSO1) de planten enkel beschermen kort na inoculatie met V. dahliae in de lage concentratie. Daarnaast had de pre-inoculatie met Vt305 of VSO1 geen invloed op de ethyleenproductie van het bovengronds plantenweefsel. Bij de interactieproef werd aangetoond dat direct antagonisme tussen de Verticillium isolaten uit te sluiten is. Het is mogelijk dat de endofytische isolaten tomaat beschermen tegen V. dahliae door het afweermechanisme van de plant te induceren of te primen. In deze proef werd daarom de proefopzet van plantenproef 2 herhaald en werd er gefocust op de expressie van ethyleen-gerelateerde afweergenen. Iedere behandeling had 6 herhalingen en enkel Vt305 werd als endofytisch isolaat gebruikt. De tomatenplanten werden in het eerste bladstadium een eerste maal geïnoculeerd via de worteldipmethode. Eén week later volgde een tweede inoculatie. De wortels van de controleplanten (C) werden tweemaal in steriel water gedipt. Bij de behandeling Vt305 werden de planten een eerste maal geïnoculeerd met isolaat Vt305 (1x106 sporen mL-1), de tweede maal werden de wortels in steriel water gedipt. De derde behandeling (Vd(4)) bestond uit een eerste worteldip in steriel water, gevolgd door inoculatie met V. dahliae (1x104 sporen mL-1). Dan was er een behandeling (Vt305+Vd(4)) waarbij de wortels een eerste maal geïnoculeerd werden met isolaat Vt305 (1x106 sporen mL-1) en een tweede maal met V. dahliae (1x104 sporen mL-1). Bij de behandeling Vd(6) werden de wortels een eerste maal gedipt in steriel water, gevolgd door inoculatie met V. dahliae (1x106 sporen mL-1). De laatste behandeling (Vt305+Vd(6)) bestond uit een eerste worteldip met isolaat Vt305 (1x106 sporen mL-1), gevolgd door een inoculatie met V. dahliae (1x106 sporen mL-1). De planten werden op twee tijdstippen geoogst en beoordeeld: 7 en 21 dpi. Tijdens de beoordeling werden het aantal bladeren, de lengte, het wortelgewicht, het bovengronds gewicht, het totaal gewicht, de bladvergeling en de vasculaire verkleuring van elke plant bepaald. Nadien werden de wortel en het hypocotyl van elke plant tijdens de eerste staalname bewaard om vervolgens de expressie van enkele afweergenen te bepalen. Bij de planten van de staalname 21 dpi werd tot slot het DNA van Vt305 en V. dahliae gekwantificeerd in de wortel, hypocotyl en stengel met qPCR.


6.1. Resultaten 6.1.1. Evaluatie van de planten gedurende de proef De inoculaties hadden de eerste week na inoculatie een andere invloed op de groei van de kiemplantjes t.o.v. de eerdere plantenproeven. Pre-inoculatie van Vt305 in combinatie met V. dahliae in de lage concentratie leidde tot significant lichtere planten dan enkele inoculatie met V. dahliae in de lage concentratie 6 dpi. De planten tijdens de inoculatie waren mogelijks niet homogeen. Zoals in de vorige plantenproef toonden de resultaten van de bladvergeling geen significante verschillen of tendensen tussen de behandelingen (data niet weergegeven). Figuur 3.9 toont het effect van de behandelingen op het totaalgewicht van de planten 21 dpi. Het bovengronds gewicht gaf geen significant verschil tussen de behandelingen. De planten geïnoculeerd met V. dahliae, zowel bij de enkele als gecombineerde inoculaties, hadden significant lichtere wortels dan de controleplanten. De concentratie van V. dahliae bij inoculatie had geen invloed op het wortelgewicht. Bij pre-inoculatie met Vt305 werd het totaalgewicht van de planten minder gereduceerd door V. dahliae in de lage concentratie, weliswaar niet-significant. 21 dpi 35,0

a

a

vers gewicht (g)

30,0 25,0

b

ab

Vd(4)

Vt305+Vd(4)

b

b

Vd(6)

Vt305+Vd(6)

20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 C

Vt305

Figuur 3.9: De invloed van enkele inoculatie met Vt305 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae op het totaal plantgewicht van tomaat 21 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305: 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en Vt305+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1.De planten werden 21 dpi geoogst. Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 met de Tukey toets. De balken geven het gemiddelde weer en de foutvlaggen de standaardfout.


6.1.2. Vasculaire verkleuring in het hypocotyl en de stengel Figuur 3.10 toont de resultaten van de vasculaire verkleuring van het hypocotyl 21 dpi. Bij de staalname 7 dpi werd de vasculaire verkleuring van het stengelstuk tussen het hypocotyl en de tweede knoop gescoord. Het hypocotyl en internodium tussen blad 2 en 3 werden gebruikt voor de RNA extractie en konden niet doormidden gesneden worden om de verkleuring waar te nemen. De planten enkel geïnoculeerd met Vt305 ontwikkelden tijdens de proef geen vasculaire verkleuring. Bij de staalname 7 dpi zorgde de pre-inoculatie met Vt305 voor een significante reductie van de vasculaire verkleuring door V. dahliae in de hoge concentratie. Bij de staalname 21 dpi had één van de planten geïnoculeerd met V. dahliae in de hoge concentratie geen verkleuring bij pre-inoculatie met Vt305. Pre-inoculatie met Vt305 kon de vasculaire verkleuring voorkomen bij de lage concentratie van V. dahliae 7 en 21 dpi. Er was een significant negatieve correlatie tussen de vasculaire verkleuring en het totale plantgewicht gedurende de hele proef (21 dpi: R2 = -0,422; p = 0,012). 21 dpi

6 5 4 3 2 1 0

c

bc

c

a

b aantal planten

aantal planten

7 dpi c

6 5 4 3 2 1 0

c

c

bc

c

a

ab

Figuur 3.10: De invloed van enkele inoculatie met Vt305 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae op de vasculaire verkleuring van tomatenplanten 7 en 21 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305: 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en Vt305+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. De planten werden 7 en 21 dpi geoogst. De grafiek bij 7 dpi geeft het percentage vasculaire verkleuring weer van het stengelstuk tussen het hypocotyl en de tweede knoop en bij 21 dpi van het hypocotyl. De vasculaire verkleuring werd gescoord: score 0 = 0% vasculaire verkleuring , score 1 = 0-25% vasculaire verkleuring , score 2 = 25-50% vasculaire verkleuring , score 3 = 50-75% vasculaire verkleuring en score 4 = 75-100% vasculaire verkleuring . Behandelingen met eenzelfde letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 met de Mann-Whitney toets. De balken geven het aantal planten weer.


6.1.3. Moleculaire kwantificering van de Verticillium species Figuur 3.11 geeft de resultaten van de DNA kwantificering in de wortel en het hypocotyl weer 21 dpi. De data van de stengel zijn niet weergegeven daar de detectie van Vt305 beperkt bleef tot enkele planten. Net zoals in de vorige proef kon isolaat Vt305 de wortel, hypocotyl en stengel koloniseren en werd de endofytische levenswijze van Vt305 bevestigd. De hoeveelheid Verticillium DNA in de wortels van de planten geïnoculeerd met Vt305 was een factor 40 hoger dan met V. dahliae in de hoge concentratie, bij enkelvoudige inoculatie. In het hypocotyl was de DNA hoeveelheid van de twee Verticillium isolaten ongeveer gelijk. Een hogere concentratie bij de inoculatie met V. dahliae had een significant positieve invloed op de kolonisatie van dit species in de wortel en het hypocotyl. De pre-inoculatie met Vt305 had geen invloed op de kolonisatie van de wortels door V. dahliae na inoculatie van de lage concentratie. Na inoculatie met de hoge concentratie werd de kolonisatie van V. dahliae significant gestimuleerd bij pre-inoculatie met Vt305 in de het hypocotyl. Het aantal planten met detectie van V. dahliae in het hypocotyl en de stengel was lager door pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae in de lage concentratie. In de stengel werd er één plant gedetecteerd met V. dahliae na enkel inoculatie met de lage concentratie, terwijl na pre-inoculatie met Vt305 er geen enkele plant met detectie was. Bij V. dahliae in de hoge concentratie hadden 5 stengels detectie van V. dahliae al dan niet na pre-inoculatie met Vt305. V. dahliae, geïnoculeerd in de hoge of lage concentratie, reduceerde het aantal planten met detectie van Vt305 DNA in het hypocotyl met 33 %. V. dahliae geïnoculeerd in de hoge concentratie, stimuleerde de kolonisatie van Vt305 in het hypocotyl significant meer dan de lage concentratie. In de stengel waren er slechts 2 planten met detectie van Vt305, beiden geïnoculeerd met Vt305 en V. dahliae in de lage concentratie. Er werden significante correlaties gevonden voor de hoeveelheid Verticillium DNA in de wortel. De hoeveelheid Vt305 DNA was positief gecorreleerd met de plantlengte (R2 = 0,501; p = 0,034). Daarnaast was er een positieve correlatie tussen de hoeveelheid V. dahliae DNA en de vasculaire verkleuring van het hypocotyl (R2 = 0,592; p = 0,003). De hoeveelheid Vt305 DNA in het hypocotyl was niet significant gecorreleerd met andere eigenschappen van de plant. In de stengel was de hoeveelheid V. dahliae DNA significant positief gecorreleerd met de vasculaire verkleuring in de stengel (R2 = 0,670; p = 0,024).


Vt305 (a)

V. dahliae (c)

21 dpi 1.600,0

6

600,0 400,0

25,0

15,0 10,0 5,0

0,0

0,0

4 a

100,0 80,0

60,0 40,0 20,0 0,0

6 b

(d)

21 dpi

6 ab

6 a

20,0

200,0

(b)

ng DNA/g weefsel

ng DNA/g weefsel

6

4 b

5 b

21 dpi 50,0

ng DNA/g weefsel

ng DNA/g weefsel

30,0

1.200,0

800,0

6 a

35,0

6

1.400,0

1.000,0

21 dpi

6 a

40,0 30,0

6 b

20,0 10,0

6 c

1*

0,0

Figuur 3.11: De invloed van enkele inoculatie met Vt305 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae op de hoeveelheid Verticillium DNA in de wortel (a en c) en het hypocotyl (b en d) van de tomatenplanten 21 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. Vt305: 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en Vt305+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. De planten werden 21 dpi geoogst. (a) kwantificering van Vt305 DNA in de wortels, (b) kwantificering van Vt305 DNA in het hypocotyl, (c) kwantificering van V. dahliae DNA in de wortels en (d) kwantificering van V. dahliae DNA in het hypocotyl. Er waren 6 herhalingen per behandeling met uitzondering van: * = 5 herhalingen. Behandelingen met eenzelfde letter of zonder letter zijn significant niet verschillend bij P<0,05 volgens de Mann-Whitney toets. De balken geven de mediaan weer, de foutenvlaggen de MAD en het getal boven elke balk het aantal planten met detectie per behandeling


6.1.4. Genexpressie afweergenen Het effect van de inoculatie van Vt305 of V. dahliae op het gemiddelde expressieniveau van 6 afweergenen werd nagegaan. Voor V. dahliae werd tevens het effect van de verschillende concentraties bij inoculatie op de expressie opgevolgd. Daarnaast werd onderzocht of preinoculatie van Vt305 voor V. dahliae een invloed had op de genexpressie door V. dahliae. Figuur 3.12 toont het gemiddelde expressieniveau van ETR4, PTI5, PR-1a, GLUA, CHI3, en ACO4 in de wortel en het hypocotyl van tomaat 6 dpi. Er werden 3 planten gepoold en er waren telkens 2 technische herhalingen. De detectiewaarden van de wortelstalen werden genormaliseerd aan deze van het GPD (glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase) referentiegen, bij de hypocotylstalen was dit t.o.v. het TUB (β-tubuline) referentiegen. Beide referentiegenen werden niet beïnvloed door de verschillende inoculaties. De afweergenen GLUA en CHI3 coderen respectievelijk voor β-1,3-glucanase (PR-2) en chitinase (PR-3). Deze enzymen spelen een rol in het verdedigingsmechanisme van de plant daar ze de celwanden van schimmel kunnen afbreken. ETR4 en ACO4 spelen een rol bij respectievelijk de ethyleenperceptie en -productie. Het ETR4 gen codeert voor een ethyleenreceptor en het ACO4 gen codeert voor ACC oxidase wat een sleutelenzym is in de ethyleenbiosynthese van de plant. Het PR-1a gen codeert voor een pathogeniteit gerelateerd eiwit (PR-1) en PTI5 codeert voor een ethyleen responsfactor (Pti5). Bij de planten enkel geïnoculeerd met Vt305 werd de ETR4 expressie in de wortels gereduceerd, maar de expressie van de overige genen was niet significant verschillend van de controleplanten. De expressie van ETR4 en CHI3 was hoger in de wortel en het hypocotyl van planten enkel geïnoculeerd met V. dahliae in de hoge concentratie. De genen PTI5, GLUA en ACO4 waren bij deze behandeling enkel in het hypocotyl opgereguleerd en PR-1a enkel in de wortel. De expressie van PR-1a en van PTI5 en GLUA was gestimuleerd in respectievelijk de hypocotyl en de wortel, weliswaar niet significant. Pre-inoculatie met Vt305 kon het expressieniveau van ETR4 en CHI3 in de plantenwortels significant verlagen t.o.v. de planten enkel geïnoculeerd met V. dahliae in de hoge concentratie. Deze tendens werd ook bij PTI5, PR-1a en GLUA teruggevonden maar de genexpressie was niet signicant gereduceerd. In het hypocotyl stimuleerde de pre-inoculatie met Vt305 de expressie van ACO4 bij de planten geïnoculeerd met V. dahliae in de hoge concentratie. Bij de planten geïnoculeerd met V. dahliae in de lage concentratie, zowel zonder als met preinoculatie van Vt305, werden geen significante verschillen waargenomen in het expressieniveau van de genen t.o.v. de controleplanten. De genexpressie van GLUA en CHI3 werd wel gestimuleerd in de wortel en het hypoctyl na inoculatie van enkel V. dahliae in de lage concentratie. Deze tendens werd tevens waargenomen voor de genen PTI5 en PR-1a in het hypocotyl. Na pre-inoculatie met Vt305 kon deze stimulatie in genexpressie van GLUA, CHI3, PTI5 en PR-1a niet meer waargenomen worden.


In deze plantenproef werd aangetoond dat Verticillium Vt305 tomaat kan beschermen tegen Verticillium verwelking, na inoculatie met V. dahliae in de lage concentratie. De pre-inoculatie met Vt305 kon kolonisatie en symptoomontwikkeling door V. dahliae in het hypocotyl voorkomen en de expressie van enkele afweergenen was lager. De pre-inoculatie met Vt305 reduceerde ook de symptomen en vasculaire verkleuring door V. dahliae in de hoge concentratie. Vt305 kon de expressie van enkele afweergenen door V. dahliae in de wortel verlagen. wortel (a)

hypocotyl (g)

ETR4

3,5

a

2,5 2,0

b

1,0

c

0,5

bc

bc

c

2,0

b

b

(h)

PTI5

b b

6,0 4,0

a a

a

a

a

PTI5

50,0

a expressieniveau

8,0

expressieniveau

3,0

0,0

(b)

0,0

a

4,0

1,0

0,0

2,0

a

5,0

expressieniveau

expressieniveau

3,0

1,5

ETR4

6,0

a

40,0

ab

30,0 20,0

ab

10,0

b

b

b

0,0


wortel (c)

hypocotyl (i)

PR-1a 600,0

a expressieniveau

expressieniveau

400,0 300,0 200,0

0,0

(d)

b

b

expressieniveau

90,0

a a

a

a

a

16000,0

a

12000,0 8000,0 4000,0

b

b

b

50,0 40,0 30,0

b

20,0

250,0

c

c

a

200,0 150,0 100,0 50,0

c

a

300,0

a

c

CHI3

350,0

60,0

expressieniveau

b

GLUA

(k)

CHI3

0,0

ab

0,0

(e)

10,0

b

b

expressieniveau

expressieniveau

120,0 60,0

b

20000,0

a

150,0

0,0

2000,0

0,0

180,0

30,0

3000,0

(j)

GLUA

210,0

ab

4000,0

1000,0

b

b

a

5000,0

500,0

100,0

PR-1a

6000,0

0,0

b

b

b

b


wortel

expressieniveau

1,6 1,2 0,8 0,4 0,0

(l)

ACO4 a a

ACO4

4,0

a

a a a

a

expressieniveau

(f)

hypocotyl

3,0

b

2,0

c 1,0

c

c c

0,0

Figuur 3.12: De invloed van enkele inoculatie met Vt305 of V. dahliae en pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae op de expressie van enkele afweergenen in de wortel (a-f) en het hypocotyl (g-l) van de tomatenplanten 27 dpi waarbij V. dahliae in twee verschillende concentraties werd toegediend. De wortels werden tweemaal geïnoculeerd via de worteldipmethode met één week tussen beide inoculaties. C: water + water (controleplanten); Vt305: 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + water; Vd(4) en Vd(6): water + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1; Vt305+Vd(4) en Vt305+Vd(6): 1x106 sporen van Vt305 mL-1 + 1x104 of 1x106 sporen van V. dahliae mL-1. Het expressieniveau werd genormaliseerd t.o.v. de gemiddelde kwantitatieve cyclus (Cq) van het GPD (wortel) en het TUB gen (hypocotyl). De genexpressie van de behandelingen werd dan vergeleken met de controleplanten volgens 2-∆∆Cq. De functie van de afweergenen: ETR4 = ethyleenreceptor, PTI5 = ethyleen responsfactor, PR-1a = PR-1 eiwit isoform, GLUA = β-1,3-glucanase, CHI3 = chitinase en ACO4 = ACC oxidase. Behandelingen met verschillende letter zijn significant verschillend bij P<0,05 met de Tukey toets. De balken geven het gemiddelde expressieniveau van de afweergenen weer en de foutenvlaggen de standaarddeviatie (n=2, technische herhalingen).


7. Discussie 7.1. Karakterisatie Vt305 en VSO1 De ITS regio is voor sommige Verticillium species identiek en kan tevens variëren binnen hetzelfde species waardoor identificatie niet eenvoudig is. Recent werd de controverse rond de taxonomie van Verticillium bestudeerd (Inderbitzin & Subbarao 2014) en de elongatiefactor 1–alpha (EF) wordt als een goede kandidaat beschouwd voor identificatie. De karakterisatie wees uit dat zowel Vt305 als VSO1 het meest gerelateerd waren met V. isaacii maar niet 100% gelijk waren met dit species. De EF genregio toonde bij deze twee isolaten de grootste afwijking. Deze genregio varieert met maximum één nucleotide binnen de V. isaacii isolaten uit de studie van Inderbitzin et al. (2011). Dit wijst erop dat Vt305 en VSO1 mogelijks tot ongedefinieerde species behoren. Vt305 en VSO1 zijn het meest gerelateerd met de V. isaacii isolaten PD343 en PD610, beiden niet pathogeen voor respectievelijk artisjok en sla (Qin et al. 2008). Bovendien kon het isolaat PD610 sla beschermen tegen V. dahliae.

7.2. Potentieel van Vt305 en VSO1 als biologische bestrijdingsagent tegen V. dahliae Het V. dahliae isolaat JR2 kon de typische Verticillium symptomen veroorzaken bij tomaat zoals dwerggroei en vasculaire verkleuring in de stengel. In eerder onderzoek met hetzelfde isolaat werden gelijkaardige symptomen beschreven (Fradin et al. 2009). De moleculaire kwantificatie toonde aan dat V. dahliae zowel de wortel, hypocotyl als stengel kon koloniseren en dat de hoeveelheid V. dahliae DNA in de wortel en hypocotyl bepalend was voor de vasculaire verkleuring in het hypocotyl en de stengel. De isolaten Vt305 en VSO1 veroorzaakten geen vasculaire verkleuring bij tomaat en konden hierbij zowel de wortel, hypocotyl als stengel koloniseren. Wat maakt dat beide Verticillium isolaten endofytisch zijn bij tomaat (Petrini 1991). Tijdens plantenproef 3 kon Vt305 de planten beschermen tegen vasculaire verkleuring en verwelkingssymptomen door V. dahliae in de lage concentratie. Bij V. dahliae in de hoge concentratie kon de endofyt Vt305 de vasculaire verkleuring reduceren. Deze resultaten zijn gelijkaardig met de eerder beschreven bescherming van Vt305 tegen Verticillium verwelking bij bloemkool, veroorzaakt door V. longisporum (Tyvaert et al. 2014). Dit toont aan dat het gebruik van het Verticillium isolaat Vt305 als biologische bestrijdingsagent van Verticillium verwelking een veelbelovende strategie is.


In de eerste twee plantenproeven konden de isolaten Vt305 en VSO1 de planten onvoldoende beschermen tegen V. dahliae. Tot 2 weken na inoculatie van de pathogeen werden de symptomen wel gereduceerd door de endofytische isolaten maar daarna konden de typische Verticillium symptomen zich ook in de planten na pre-inoculatie met deze isolaten ontwikkelen. Indien deze endofyten in de praktijk zouden gebruikt worden als biologische bestrijder van V. dahliae bij tomaat, zou dit kunnen betekenen dat de symptomen uitgesteld worden en bijgevolg ook de opbrengstverliezen gereduceerd worden.

7.3. Bestrijdingsmechanisme Vt305 en VSO1 Er is maar weinig geweten over de mechanismen waarmee de endofytische Verticillium isolaten planten beschermen tegen Verticillium verwelking. Uit de interactieproef blijkt dat direct antagonisme geen rol speelt in de interactie tussen Vt305 of VSO1 met de pathogeen V. dahliae. In eerder onderzoek werd het direct antagonisme tussen een zwak en een sterk pathogeen V. dahliae isolaat ook uitgesloten (Shittu et al. 2009). In het hypocotyl kon pre-inoculatie met Vt305 de kolonisatie van V. dahliae in de lage concentratie verhinderen. Het verschil tussen de kolonisatie van V. dahliae in de hoge en lage concentratie bij pre-inoculatie met Vt305, wijst op een verschil in beschermingsmechanisme. De lagere competitiviteit van V. dahliae in de lage concentratie verklaart mogelijks de afname in aantal stalen met detectie van V. dahliae in het hypocotyl. Eerder onderzoek wees op competitie voor infectiezones aan het worteloppervlak als mogelijk beschermingsmechanisme van een endofytische Verticillium isolaat tegen Verticillium verwelking (Robinson et al. 2007; Qin et al. 2008). Geïnduceerde resistentie werd tevens gesuggereerd als mogelijk beschermingsmechanisme (Shittu et al. 2009). Ethyleen (ET) speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van Verticillium symptomen. Er werd reeds aangetoond dat na Verticillium infectie de ethyleenproductie van de plant toeneemt. Door de ethyleenproductie van de tomatenplant te verlagen, werden de verwelkingssymptomen door V. dahliae gereduceerd (Robison et al. 2001b). In plantenproef 3 kon V. dahliae, geïnoculeerd in de hoge concentratie, de ethyleenproductie van de plant stimuleren (niet significant). Mogelijks wordt deze stimulatie door fytotoxines, afgescheiden door de pathogeen veroorzaakt. Er werd reeds aangetoond dat V. dahliae fytotoxines produceert (Meyer et al. 1994). Het aanbrengen van opgezuiverde toxines van V. albo-atrum op afgesneden tomatenbladeren veroorzaakte de typische Verticillium symptomen zoals chlorose en necrose. Dit zijn ook de typische symptomen die veroorzaakt worden door ET op het plantenmateriaal aan te brengen (Mansoori & Smith 2005; Fradin & Thomma 2006). Daarnaast produceert V. dahliae in cultuur zelf ET (Tzeng & DeVay 1984). De ethyleenproductie van V. dahliae kan dus een virulentiefactor zijn bij tomaat zoals reeds aangetoond voor C. miyabeanus bij rijst (Van Bockhaven et al. n.d.).


Mogelijks kunnen Vt305 en VSO1 interfereren met de ethyleenpathway in de tomatenplant. Robison et al. (2001b) toonden aan dat getransformeerde tomatenplanten met een ACC deaminase productie in de wortel, de symptomen door V. dahliae reduceren terwijl de bovengrondse productie dit niet deed. Hieruit blijkt dat ethyleenproductie in de wortels belangrijk is voor de symptoomontwikkeling van Verticillium (Robison et al. 2001b). Bovendien werd de symptoomontwikkeling verlaat, wat ook tijdens de proeven werd waargenomen. De ethyleenproductie van het bovengronds plantgedeelte werd niet op een consistente wijze gereduceerd door de endofytische isolaten. Het is dus mogelijk dat de endofytische isolaten de ethyleenproductie in de wortel kon reduceren. Daarom zou het interessant zijn om de ethyleenproductie in de plantenwortels na te gaan. Eerder werden ACC deaminase producerende bodembacteriën beschreven als groeibevorderend voor planten. Deze bacteriën reduceren de ethyleenproductie in de wortels wat leidt tot resistentie van de plant tegen stress (Glick et al. 1998; Compant et al. 2005). Recent werd ook ACC deaminase teruggevonden in de schimmels Penicillium citrinum, Trichoderma asperellum T203 en Trichoderma atroviride (Jia et al. 1999; Gravel et al. 2007; Viterbo et al. 2010). Deze schimmels beschermen tevens planten tegen pathogenen en er wordt gesuggereerd dat de productie van ACC deaminase hieraan bijdraagt. Mogelijks produceren ook Vt305 en VSO1 dit enzym en kunnen zij op deze wijze de plant beschermen. De werking van ACC deaminase in het bovengrond plantgedeelte wordt mogelijks gemaskeerd door ACC oxidase. De expressie van het ACO4 gen, coderend voor ACC oxidase, werd in het hypocotyl verhoogd bij pre-inoculatie met Vt305 bij V. dahliae in de hoge concentratie. ACC oxidase heeft een hogere affiniteit voor ACC dan ACC deaminase (Glick et al. 1998). Het isolaat Vt305 kon de expressie van het ETR4 gen in de wortel reduceren, zowel bij een enkele inoculatie als bij pre-inoculatie met V. dahliae. ETR4 codeert voor een ethyleenreceptor. Eerder onderzoek toonde aan dat een afname in activiteit van het ETR4 gen de symptomen door V. dahliae reduceerde (Pantelides et al. 2010). De afname in ETR4 transcriptie in de wortel kan de symptoomreductie bij pre-inoculatie met Vt305 verklaren. De verminderde ethyleenproductie of het verminderd aantal ethyleenreceptoren door Vt305 heeft mogelijks een invloed op andere ethyleen-gerelateerde processen. ET induceert de synthese en accumulatie van pathogeniteit gerelateerde eiwitten zoals PR-1, β-1,3-glucanase en chitinase (Felix & Meins 1987; Vögeli et al. 1988; Eyal & Fluhr 1992; Lawton et al. 1995). De genexpressie van PR-1a, GLUA en CHI3 was bij pre-inoculatie met Vt305 gereduceerd in de wortel, zowel in de hoge als lage V. dahliae concentratie. Eerder onderzoek toonde aan dat pre-inoculatie van een endofytisch met een virulent isolaat van F. oxysporum deze genen in de tomatenwortels induceren. Het ging om een priming-effect daar enkele inoculatie met het endofytisch isolaat de expressie van PR-1a, GLUA en CHI3 niet beïnvloedde. Het endofytisch isolaat kon de tomatenplant tegen Fusarium verwelking beschermen. Hierbij werd de kolonisatie van het virulent isolaat in de wortel door de pre-inoculaite met de endofyt gereduceerd (Aimé et al. 2013).


Het isolaat Vt305 kon de kolonisatie van V. dahliae in de hoge concentratie niet inhiberen. In het hypocotyl was de hoeveelheid V. dahliae na pre-inoculatie van Vt305 significant hoger dan de enkele inoculatie met V. dahliae in de hoge concentratie. De afname van de expressie van PR eiwitten in de wortel door Vt305 verklaart mogelijks de betere kolonisatie daar de afweergenen GLUA en CHI3 enzymen produceren die de celwand van schimmels afbreken.


Besluit

Er kan besloten worden dat Vt305 en VSO1 endofyten zijn die een rol spelen in de interactie van V. dahliae met tomaat. Beide endofytische isolaten waren het meest gerelateerd met V. isaacii. De mogelijk endofytische levenswijze van dit species werd reeds bij sla en artisjok aangetoond. Zowel Vt305 als VSO1 reduceerden Verticillium symptomen de eerste twee weken na inoculatie met V. dahliae. In de laatste plantenproef voorkwam Vt305 vasculaire verkleuring en dwerggroei bij de planten geïnoculeerd met V. dahliae in lage concentratie. Uit de resultaten van de kwantificatie van het DNA in het plantweefsel via qPCR blijkt dat alle isolaten de plant kunnen koloniseren. De incidentie van Vt305 en VSO1 in de stengel was laag t.o.v. V. dahliae. Het aantal planten met detectie in het hypocotyl werd gereduceerd door de pre-inoculatie van Vt305 met V. dahliae in de lage concentratie. In de hoge concentratie van V. dahliae bleek Vt305 de hoeveelheid V. dahliae in het hypocotyl te stimuleren. Direct antagonisme tussen de Verticillium species kan uitgesloten worden. De in vitro groei van V. dahliae werd niet beïnvloed door deze van Vt305 of VSO1. Andere mogelijke mechanismen zijn competitie of geïnduceerde resistentie. De ethyleenpathway kan bij de geïnduceerde resistentie een rol spelen. De endofyten Vt305 en VSO1 hadden geen effect op de ethyleenproductie van tomaat. Dit in tegenstelling tot V. dahliae die de ethyleenproductie stimuleerde. Hoewel eerdere studies uitwezen dat ethyleen dezelfde symptomen als Verticillium induceert, kon pre-inoculatie de verhoogde ethyleenproductie niet consistent reduceren in het bovengronds plantenmateriaal. Het reduceren van de ethyleenproductie in de wortel blijkt belangrijk te zijn om Verticillium symptomen te voorkomen. In een volgende plantenproef zou het interessant zijn om de ethyleenproductie van de wortels op te meten. Daarnaast is onderzoek naar de ethyleenproductie van de Verticillium isolaten aangeraden om de mogelijke rol van ethyleen als virulentiefactor te bepalen. Vt305 kon de expressie van de ETR4 ethyleenreceptor in de wortel onderdrukken. Dit betekent een verlaagde gevoeligheid voor ethyleen en dit verklaart mogelijks de beschermende werking van Vt305. Vt305 onderdrukte tevens de expressie van het PR-1 eiwit, β-1,3-glucanase, chitinase en de ethyleen responsfactor in de wortel. De inducerende werking van ethyleen op synthese en accumulatie van deze PR eiwitten wijst op een gereduceerde ethyleenproductie of -perceptie van tomaat bij inoculatie met Vt305. Onderzoek naar de expressie van andere genen zou het beschermingsmechanisme van Vt305 nog beter in kaart brengen. Tot slot zou VSO1 als bescherming tegen Verticillium verwelking verder onderzocht moeten worden.

___________________________________________________________________________ Besluit 69

Literatuurlijst

Abeles, F. B., Morgan, P. W., & Saltveit, Mikal, E. J. (1992). Ethylene in plant biology. New York: Academic Press. Aimé, S., Alabouvette, C., Steinberg, C., & Olivain, C. (2013). The endophytic strain Fusarium oxysporum Fo47: a good candidate for priming the defense responses in tomato roots. Molecular Plant-Microbe Interactions, 26, 918–926. Armen, J., & Schoemaker, P. B. (1985). Histopathology of resistant and susceptible tomato cultivars inoculated with Verticillium dahliae (Kleb.) races 1 and 2. Phytopathology, 75, 1361–1362. Arshad, M., & Frankenberger, W. T. J. (2002). Ethylene: Agricultural sources and application. New York: Kluwer Academic / Plenum Publishers. Balaji, V., Mayrose, M., Sherf, O., Jacob-Hirsch, J., Eichenlaub, R., Iraki, N., Manulis-Sasson, S., Rechavi, G., Barash, I., & Sessa, G. (2008). Tomato transcriptional changes in response to Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis reveal a role for ethylene in disease development. Plant Physiology, 146, 1797–809. Banno, S., Saito, H., Sakai, H., Urushibara, T., Ikeda, K., Kabe, T., Kemmochi, I., & Fujimura, M. (2011). Quantitative nested real-time PCR detection of Verticillium longisporum and V. dahliae in the soil of cabbage fields. Journal of General Plant Pathology, 77, 282–291. Bell, A. A. (1969). Phytoalexin production and Verticillium wilt resistance in cotton. Phytopathology, 59, 1119–1127. Bender, C. G., & Shoemaker, P. B. (1984). Prevalence of Verticillium wilt of tomato and virulence of Verticillium dahliae race 1 and race 2 isolates in Western North Carolina. Plant Disease, 68, 305–309. Benhamou, N. (1995). Ultrastructural and cytochemical aspects of the response of eggplant parenchyma cells in direct contact with Verticillium-infected xylem vessels. Physiological and Molecular Plant Pathology, 46, 321–338. Berg, G., Fritze, a, Roskot, N., & Smalla, K. (2001). Evaluation of potential biocontrol rhizobacteria from different host plants of Verticillium dahliae Kleb. Journal of Applied Microbiology, 91, 963–971. Bhaskaran, R. (1972). In vitro production of indole-3-acetic acid by Verticillium dahliae. Science and Culture, 38, 523. Bubici, G., Marsico, A. D., D’Amico, M., Amenduni, M., & Cirulli, M. (2013). Evaluation of Streptomyces spp. for the biological control of corky root of tomato and Verticillium wilt of eggplant. Applied Soil Ecology, 72, 128–134. Chen, P., Lee, B., & Robb, J. (2004). Tolerance to a non-host isolate of Verticillium dahliae in tomato. Physiological and Molecular Plant Pathology, 64, 283–291. ___________________________________________________________________________ Literatuurlijst 71

Ciardi, J. A., Tieman, D. M., Lund, S. T., Jones, J. B., Stall, R. E. & Klee, H. J. (2000). Response to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in tomato involves regulation of ethylene receptor gene expression. Plant Physiology, 123, 81–92. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clément, C., & Barka, E. A. (2005). Use of plant growthpromoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Applied and Environmental Microbiology, 71, 4951–4959. Corsini, D. L., Thompson, C., & Pavek, J. J. (1989). The effect of plant growth regulators on Verticillium wilt of potato. American Potato Journal, 66, 125–136. Cronshaw, D. K., & Pegg, G. F. (1976). Ethylene as a toxin synergist in Verticillium wilt of tomato. Physiological Plant Pathology, 9, 33–44. Cuijpers, W., Janmaat, L., & van der Burgt, G.-J. (2008). Bodemgezondheid in de biologische kasteelt, Deel 2: ziektewerendheid tegen bodemgebonden schimmels. Driebergen: Louis Bolk Instituut. Daayf, F., Nicole, M., Boher, B., Pando, A., & Geiger, J. P. (1997). Early vascular defense reactions of cotton roots infected with a defoliating mutant strain of Verticillium dahliae. European Journal of Plant Pathology, 103, 125–136. Davies, P. J. (1995). The plant hormone concept: concentration, sensitivity, and transport. In: Plant hormones: physiology, biochemistry, and molecular biology. Davies P. J. (ed.) . Dordrecht: Kluwer. Davis, J. R., Everson, D. O., Sorensen, L. H., & Schneider, A. T. (2000). Associations of Verticillium tricorpus with Soil Suppressiveness of Verticillium Wilt of Potato. In: Advances in Verticillium Research and Disease Management. Tjamos E.C., Rowe R.C., Heale J.B., Fravel D.R (ed.). St Paul, Minnesota: American Phytopathological society. Debode, J., Clewes, E., De Backer, G., & Höfte, M. (2005). Lignin is involved in the reduction of Verticillium dahliae var. longisporum inoculum in soil by crop residue incorporation. Soil Biology and Biochemistry, 37, 301–309. Debode, J., Van Poucke, K., França, S. C., Maes, M., Höfte, M., & Heungens, K. (2011). Detection of multiple Verticillium species in soil using density flotation and real-time polymerase chain reaction. Plant Disease, 95, 1571–1580. de Jonge, R., Bolton, M. D., Kombrink, A., van den Berg, G. C. M., Yadeta, K. A., & Thomma, B. P. H. J. (2013). Extensive chromosomal reshuffling drives evolution of virulence in an asexual pathogen. Genome Research, 23, 1271–1282. de Jonge, R., van Esse, H. P., Maruthachalam, K., Bolton, M. D., Santhanam, P., Saber, M. K., Zhang, Z., Usami, T., Lievens, B., Subbarao, K. V., & Thomma, B. P. H. J. (2012). Tomato immune receptor Ve1 recognizes effector of multiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109, 5110–5115. ___________________________________________________________________________ Literatuurlijst 72

Delaney, T. P., Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., & Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science, 266, 1247–1250. Dixon, G. R., & Pegg, G. F. (1969). Hyphal lysis and tylose formation in tomato cultivars infected by Verticillium albo-atrum. Transactions of the British Mycological Society, 53, 109–118. Dullaart, J. (1970). The bioproduction of indole-3-acetic acid and related compounds in root nodules and roots of Lupinus luteus and by its microbial symbiont. Acta Botanica Neerlandica, 19, 573–615. El-Rafai, I. M., Asswah, S. M. W., & Awdalla, O. A. (2003). Biocontrol of some tomato disease using some antagonistic microorganisms. Pakistan Journal of Biological Sciences, 6, 399–406. Eyal, Y. S. O., & Fluhr, R. (1992). Dark-induced accumulation of a basic pathogenesis-related (PR-1) transcript and a light requirement for its induction by ethylene. Plant Molecular Biology, 19, 589–599. FAOSTAT (2012). www.faostat.fao.org (geraadpleegd: 3 maart 2014). Felix, G., & Meins, F. J. (1987). Ethylene regulation of β-1,3-glucanase in tobacco. Planta, 172, 386–392. Fradin, E. F., & Thomma, B. P. H. J. (2006). Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V. albo-atrum. Molecular Plant Pathology, 7, 71–86. Fradin, E. F., Zhang, Z., Ayala, J. C. J., Castroverde, C. D. M., Nazar, R. N., Robb, J., Liu, C.-M., & Thomma, B. P. H. J. (2009). Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology, 150, 320–332. França, S. C., Spiessens, K., Pollet, S., Debode, J., De Rooster, L., Callens, D., & Höfte, M. (2013). Population dynamics of Verticillium species in cauliflower fields: influence of crop rotation, debris removal and ryegrass incorporation. Crop Protection, 54, 134–141. Gayoso, C., Pomar, F., Novo-Uzal, E., Merino, F., & de Ilárduya, O. M. (2010). The Vemediated resistance response of the tomato to Verticillium dahliae involves H2O2, peroxidase and lignins and drives PAL gene expression. BMC Plant Biology, 10, 232. Genbank. (2014). National Center of Biotechnology Information. www.ncbi.nlm.nih.gov (geraadpleegd: 12 mei 2014) Glick, B., Penrose, D., & Li, J. (1998). A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria. Journal of Theoretical Biology, 190, 63–68. ___________________________________________________________________________ Literatuurlijst 73

Gold, J., & Robb, J. (1995). The role of the coating response in Craigella tomatoes infected with Verticillium dahliae, races 1 and 2. Physiological and Molecular Plant Pathology, 47, 141–157. Gravel, V., Antoun, H., & Tweddell, R. J. (2007). Growth stimulation and fruit yield improvement of greenhouse tomato plants by inoculation with Pseudomonas putida or Trichoderma atroviride: possible role of indole acetic acid (IAA). Soil Biology and Biochemistry, 39, 1968–1977. Griffiths, D. A. (1971). The development of lignitubers in roots after infection by Verticillium dahliae Kle. Canadian Journal of Microbiology, 17, 441–444. Hansen, H., & Grossmann, K. (2000). Auxin-induced ethylene triggers abscisic acid biosynthesis and growth inhibition. Plant Physiology, 124, 1437–1448. Heinz, R., Lee, S. W., Saparno, A., Nazar, R. N., & Robb, J. (1998). Cyclical systemic colonization in Verticillium-infected tomato. Physiological and Molecular Plant Pathology, 52, 385–396. Höfte, M. (2013). Geïntegreerde bestrijding van gewasbeschadigers: plantenziekten. Cursus, Labo Fytopathologie, Universiteit Gent. Huisman, O. C. (1988). Seasonal colonization of roots of field-grown cotton by Verticillium dahliae and V. tricorpus. Phytopathology, 78, 708–716. Inderbitzin, P., Bostock, R. M., Davis, R. M., Usami, T., Platt, H. W., & Subbarao, K. V. (2011). Phylogenetics and taxonomy of the fungal vascular wilt pathogen Verticillium, with the descriptions of five new species. PloS One, 6, e28341. Inderbitzin, P., & Subbarao, K. V. (2014). Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology, 104, 564–574. Jabnoun-Khiareddine, H., Daami-Remadi, M., Ayed, F., & El Mahjoub, M. (2009). Biological control of tomato Verticillium wilt by using indigenous Trichoderma spp . The African Journal of Plant Science and Biotechnology, 3, 26–36. Jia, Y.-J., Kakuta, Y., Sugawara, M., Igarashi, T., Oki, N., Kisaki, M., Shoji, T., Kanetuna, Y., Horita, T., Matsui, H., & Honma, M. (1999). Synthesis and degradation of 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid by Penicillium citrinum. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 63, 542–549. Kavroulakis, N., Papadopoulou, K. K., Ntougias, S., Zervakis, G. I., & Ehaliotis, C. (2006). Cytological and other aspects of pathogenesis-related gene expression in tomato plants grown on a suppressive compost. Annals of Botany, 98, 555–564.

___________________________________________________________________________ Literatuurlijst 74

Kawchuk, L. M., Hachey, J., Lynch, D. R., Kulcsar, F., van Rooijen, G., Waterer, D. R., Robertson, A., Kokko, E., Byers, R., Howard, R. J., Fischer, R., & Prüfer, D. (2001). Tomato Ve disease resistance genes encode cell surface-like receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98, 6511–6515. Klosterman, S. J., Atallah, Z. K., Vallad, G. E., & Subbarao, K. V. (2009). Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species. Annual Review of Phytopathology, 47, 39–62. Klosterman, S. J., Subbarao, K. V, Kang, S., Veronese, P., Gold, S. E., Thomma, B. P. H. J., Chen, Z., Henrissat, B., Lee, Y.-H., Park, J., Garcia-Pedrajas, M. D., Barbara, D. J., Anchieta, A., de Jonge, R., Santhanam, P., Maruthachalam, K., Atallah, Z., Amyotte, S. G., Paz, Z., Inderbitzin, P., Hayes, R. J., Heiman, D., Young, S., Zeng, Q., Engels, R., Galagan, J., Cuomo, C. A., Dobinson, K. F., & Ma, L.-J. (2011). Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathogens, 7, e1002137. Kunkel, B. N., & Brooks, D. M. (2002). Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Current Opinion in Plant Biology, 5, 325–331. Kurze, S., Bahl, H., Dahl, R., & Berg, G. (2001). Biological control of fungal strawberry diseases by Serratia plymuthica HRO-C48. Plant Disease, 85, 529–534. Lawton, K., Weymann, K., Friedrich, L., Vernooij, B., Uknes, S., & Ryals, J. (1995). Systemic acquired resistance in Arabidopsis requires salicylic acid but not ethylene. Molecular Plant-Microbe Interactions, 8, 863–870. Leveau, J. H. J., & Lindow, S. E. (2005). Utilization of the plant hormone indole-3-acetic acid for growth by Pseudomonas putida Strain 1290. Applied and Environmental Microbiology, 71, 2365–2371. Lorenzo, O., & Solano, R. (2005). Molecular players regulating the jasmonate signalling network. Current Opinion in Plant Biology, 8, 532–540. Lorito, M., Harman, G. E., Hayes, C. K., Broadway, R. M., Tronsmo, A., Woo, S. L., & Di Pietro, A. (1993). Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma harzianum: antifungal activity of purified endochitinase and chitobiosidase. Phytopathology, 83, 302–307. Malamy, J., Carr, J. P., Klessig, D. F., & Raskin, I. (1990). Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection. Science, 250, 1002–1004. Mansoori, & Smith, C. J. (2005). Verticillium-toxins: their role in pathogenesis. Journal of Agricultural Science and Technology, 7, 103–114. Marois, J. J., Johnston, S. A., Dunn, M. T., & Papavizas, G. C. (1982). Biological control of Verticillium wilt of eggplant in the field. Plant Disease, 66, 1166–1168.


Maruthachalam, K., Atallah, Z. K., Vallad, G. E., Klosterman, S. J., Hayes, R. J., Davis, R. M., & Subbarao, K. V. (2010). Molecular variation among isolates of Verticillium dahliae and polymerase chain reaction-based differentiation of races. Phytopathology, 100, 1222–1230. Meyer, R., Slater, V., & Dubery, A. (1994). A phytotoxic protein-lipopolysaccharide complex produced by Verticillium dahliae. Phytochemistry, 35, 1449–1453. Nachmias, A., Buchner, V., Tsror, L., Burstein, Y., & Keen, N. (1987). Differential phytotoxicity of peptides from culture fluids of Verticillium dahliae races 1 and 2 and their relationship to pathogenicity of the fungi on tomato. Phytopathology, 77, 506–510. Pantelides, I. S., Tjamos, S. E., & Paplomatas, E. J. (2010). Insights into the role of ethylene perception in tomato resistance to vascular infection by Verticillium dahliae. Plant Pathology, 59, 130–138. Papaioannou, I. A., Ligoxigakis, E. K., Vakalounakis, D. J., Markakis, E. A., & Typas, M. A. (2013). Phytopathogenic, morphological, genetic and molecular characterization of a Verticillium dahliae population from Crete, Greece. European Journal of Plant Pathology, 136, 577–596. Park, S.-W., Kaimoyo, E., Kumar, D., Mosher, S., & Klessig, D. F. (2007). Methyl salicylate is a critical mobile signal for plant systemic acquired resistance. Science, 318, 113–116. Patten, C. L., & Glick, B. R. (2002). Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3795–3801. Pegg, G. F., & Brady, B. L. (2002). Verticillium Wilts. Wallingford: CABI publishing. Petrini, O. (1991). Fungal endophytes of tree leaves. In: Microbial Ecology of Leaves. Andrews J. H. & Hirano S. S. (ed.), New York: Springer. Qin, Q., Vallad, G. E., & Subbarao, K. V. (2008). Characterization of Verticillium dahliae and V . tricorpus Isolates from Lettuce and Artichoke. Plant Disease, 92, 69–77. Regragui, A., & Lahlou, H. (2005). Effect of salinity on in vitro Trichoderma harzianum antagonism against Vertcillium dahliae. Pakistan Journal of Biological Sciences, 8, 872–876. Robb, J., Lee, B., & Nazar, R. N. (2007). Gene suppression in a tolerant tomato-vascular pathogen interaction. Planta, 226, 299–309. Robb, J., Powell, D. A., & Street, P. F. S. (1989). Vascular coating: a barrier to colonization by the pathogen in Verticillium wilt of tomato. Canadian Journal of Botany, 67, 600–607.


Robinson, N., Platt, H. W., & Hale, L. R. (2007). Interactions of various Verticillium species in combination with V. albo-atrum on Verticillium wilt disease development in potato. American Journal of Potato Research, 84, 133–141. Robison, M. M., Griffith, M., Pauls, K. P., & Glick, B. R. (2001a). Dual role for ethylene in susceptibility of tomato to Verticillium wilt. Journal of Phytopathology, 149, 385–388. Robison, M. M., Shah, S., Tamot, B., Pauls, K. P., Moffatt, B. A., & Glick, B. R. (2001b). Reduced symptoms of Verticillium wilt in transgenic tomato expressing a bacterial ACC deaminase. Molecular Plant Pathology, 2, 135–145. Rowe, R. C., & Powelson, M. L. (2002). Potato early dying: management challenges in a changing production environment. Plant Disease, 86, 1184–1193. Ruduś, I., Sasiak, M., & Kępczyński, J. (2013). Regulation of ethylene biosynthesis at the level of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) gene. Acta Physiologiae Plantarum, 35, 295–307. Schaible, L., Cannon, O. S., & Waddoups, V. (1951). Inheritance of resistance to Verticillium wilt in a tomato cross. Phytopathology, 41, 986–990. Schnathorst, W. C. (1981). Life cycle and epidemiology of Verticillium. In: Fungal wilt diseases of plants. Mace M. E., Bell A. A., & Beckman C. H. (ed.). New York: Academic Press. Schnathorst, W. C., & Mathre, D. E. (1966). Cross-protection in cotton with strains of Verticillium albo-atrum. Phytopathology, 56, 1204–1209. Shittu, H. O., Castroverde, D. C. M., Nazar, R. N., & Robb, J. (2009). Plant-endophyte interplay protects tomato against a virulent Verticillium. Planta, 229, 415–426. Sinha, A. K., & Wood, R. K. S. (1967). An analysis of responses of resistant and of susceptible tomato plants to Verticillium infection. Annals of Applied Biology, 59, 143–154. Spink, D. S., & Rowe, R. C. (1989). Evaluation of Talaromyces flavus as a biological control agant against Verticillium dahliae in potato. Plant Disease, 73, 230–236. Talboys, P. W. (1958). Some mechanisms contributing to Verticillium-resistance in the hop root. Transactions of the British Mycological Society, 41, 227–241. Talboys, P. W. (1972). Resistance to vascular wilt fungi. Proceedings of Royal Society B: Biological Sciences, 181, 319–332. Tello, J. C. (1999). Tomato production in Spain without methyl Bromide. In: Methyl bromide alternatives for North African and Southern European countries. United Nations Environment Programme.


Thaler, J. S., Owen, B., & Higgins, V. J. (2004). The role of the jasmonate response in plant susceptibility to diverse pathogens with a range of lifestyles. Plant Physiology, 135, 530–538. Tjamos, E. C., & Fravel, D. R. (1997). Distribution and establishment of the biocontrol fungus Talaromyces flavus in soil and on roots of solanaceous crops. Crop Protection, 16, 135–139. Tjamos, E. C., Tsitsigiannis, D. I., Tjamos, S. E., Antoniou, P. P., & Katinakis, P. (2004). Selection and screening of endorhizosphere bacteria from solarized soils as biocontrol agents against Verticillium dahliae of solanaceous hosts. European Journal of Plant Pathology, 110, 35–44. Tyvaert, L., França, S. C., Debode, J., & Höfte, M. (2014). The endophyte Verticillium Vt305 protects cauliflower against Verticillium wilt. Journal of Applied Microbiology, 116, 1563–1571. Tzeng, D. D., & DeVay, J. E. (1984). Ethylene production and toxigenicity of methionine and its derivatives with riboflavin in cultures of Verticillium, Fusarium and Colletotrichum species exposed to light. Physiologia Plantarum, 62, 545–552. Van Bockhaven, J., De Vleesschauwer, D., Cristescu, S., Kikuchi, S., & Höfte, M. (n.d.). Ethylene production by Cochliobolus miyabeanus as a virulence strategy during rice infection. Niet gepubliceerd. van Esse, H. P., Fradin, E. F., de Groot, P. J., de Wit, P. J. G. M., & Thomma, B. P. H. J. (2009). Tomato transcriptional responses to a foliar and a vascular fungal pathogen are distinct. Molecular Plant-Microbe Interactions, 22, 245–258. Veloso, J., & Díaz, J. (2012). Fusarium oxysporum Fo47 confers protection to pepper plants against Verticillium dahliae and Phytophthora capsici, and induces the expression of defence genes. Plant Pathology, 61, 281–288. Veronese, P., Narasimhan, M. L., Stevenson, R. a., Zhu, J.-K., Weller, S. C., Subbarao, K. V., & Bressan, R. a. (2003). Identification of a locus controlling Verticillium disease symptom response in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 35, 574–587. Viterbo, A., Landau, U., Kim, S., Chernin, L., & Chet, I. (2010). Characterization of ACC deaminase from the biocontrol and plant growth-promoting agent Trichoderma asperellum T203. FEMS Microbiology Letters, 305, 42–48. Vlot, A. C., Dempsey, D. A., & Klessig, D. F. (2009). Salicylic acid, a multifaceted hormone to combat disease. Annual Review of Phytopathology, 47, 177–206. Vögeli, U., Meins, F. J., & Boller, T. (1988). Co-ordinated regulation of chitinase and β-1,3glucanase in bean leaves. Planta, 174, 364–372.


Wasternack, C. (2007). Jasmonates: an update on biosynthesis, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. Annals of Botany, 100, 681– 697. Wildermuth, M. C. (2006). Variations on a theme: synthesis and modification of plant benzoic acids. Current Opinion in Plant Biology, 9, 288–296. Wilhelm, S. (1955). Longevity of the Verticillium wilt fungus in the laboratory and field. Phytopathology, 45, 180–183. Williams, J. S., Hall, Sharon, A., Hawkesford, M. J., Beale, M. H., & Cooper, R. M. (2002). Elemental sulfur and thiol accumulation in tomato and defense against a fungal vascular pathogen. Plant Physiology, 128, 150–159. Xiao, J. Z., Tsuda, M., Doke, N., & Nishimura, S. (1991). Phytotoxins produced by germinating spores of Bipolaris oryzae. Phytopathology, 81, 58–64. Yang, S. F., & Hoffman, N. E. (1984). Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. Annual Review of Phytopathology, 35, 155–189. Zhou, B.-J., Jia, P.-S., Gao, F., & Guo, H.-S. (2012). Molecular characterization and functional analysis of a necrosis- and ethylene-inducing, protein-encoding gene family from Verticillium dahliae. Molecular Plant-Microbe Interactions, 25, 964–975.


Bijlagen

Bijlage 1 Correlaties plantenproef 1 Correlaties 7 dpi Plantlengte Plantlengte

Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Wortelgewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gewicht Pearson Correlation bovengronds Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation hypocotyl+stengel Sig. (2-tailed) N *: Correlation is significant at the 0,05 level (2-tailed) **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

Aantal bladeren 1

24 0,496* 0.014 24 0,088 0,681 24 0,694** 0,000 24 0,647** 0,001 24 -0,413* 0,045 24

0,496* 0,014 24 1 24 0,365 0,079 24 0,664** 0,000 24 0,660** 0,000 24 -0,357 0,087 24

Wortelgewicht 0,088 0,681 24 0,365 0,079 24 1 24 0,537** 0,007 24 0,637** 0,001 24 -0,095 0,659 24

Gewicht bovengronds 0,694** 0,000 24 0,664** 0,000 24 0,537** 0,007 24 1 24 0,992** 0,000 24 -0,445* 0,029 24

Totaal gewicht 0,647** 0,001 24 0,660** 0,000 24 0,637** 0,001 24 0,992** 0,000 24 1 24 -0,420* 0,041 24

Vasculaire verkleuring -0,413* 0,045 24 -0,357 0,087 24 -0,095 0,659 24 -0,445* 0,029 24 -0,420* 0,041 24 1 24

____________________________________________________________________________________________________________________ Bijlage 1: Correlaties plantenproef 1

Correlaties 14 dpi Plantlengte Plantlengte

Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Wortelgewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gewicht Pearson Correlation bovengronds Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation hypocotyl+stengel Sig. (2-tailed) N *: Correlation is significant at the 0,05 level (2-tailed) **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

Aantal bladeren 1

24 0,753** 0.000 24 0,296 0,161 24 0,761** 0,000 24 0,747** 0,000 24 -0,361 0,083 24

0,753** 0,000 24 1 24 0,423* 0,039 24 0,652** 0,001 24 0,662** 0,000 24 -0,121 0,573 24

Wortelgewicht 0,296 0,161 24 0,423* 0,039 24 1 24 0,480* 0,018 24 0,578** 0,003 24 -0,034 0,873 24

Gewicht bovengronds 0,761** 0,000 24 0,652** 0,001 24 0,480* 0,018 24 1 24 0,993** 0,000 24 -0,683** 0,000 24

Totaal gewicht 0,747** 0,000 24 0,662** 0,000 24 0,578** 0,003 24 0,993** 0,000 24 1 24 -0,640** 0,001 24

Vasculaire verkleuring -0,361 0,083 24 -0,121 0,573 24 -0,034 0,873 24 -0,683** 0,000 24 -0,640** 0,001 24 1 24



Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Wortelgewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gewicht Pearson Correlation bovengronds Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation hypocotyl+stengel Sig. (2-tailed) N Ethyleen productie Pearson Correlation plant Sig. (2-tailed) N **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

1 24 0,520** 0,009 24 -0,126 0,558 24 0,268 0,206 24 0,231 0,278 24 0,065 0,763 24 0,252 0,235 24

Aantal bladeren 0,520** 0,009 24 1 24 0,036 0,867 24 0,311 0,139 24 0,287 0,173 24 -0,164 0,444 24 -0,003 0,989 24

Wortelgewich t -0,126 0,558 24 0,036 0,867 24 1 24 0,813** 0,000 24 0,847** 0,000 24 -0,665** 0,000 24 -0,717** 0,000 24

Gewicht bovengronds 0,268 0,206 24 0,311 0,139 24 0,813** 0,000 24 1 24 0,998** 0,000 24 -0,718** 0,000 24 -0,709** 0,000 24

Totaal gewicht 0,231 0,278 24 0,287 0,173 24 0,847** 0,000 24 0,998** 0,000 24 1 24 -0,725** 0,000 24 -0,722** 0,000 24

Vasculaire verkleuring 0,065 0,763 24 -0,164 0,444 24 -0,665** 0,000 24 -0,718** 0,000 24 -0,725** 0,000 24 1 24 0,612** 0,001 24

Ethyleen productie 0,252 0,235 24 -0,003 0,989 24 -0,717** 0,000 24 -0,709** 0,000 24 -0,722** 0,000 24 0,612** 0,001 24 1 24



Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Wortelgewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gewicht Pearson Correlation bovengronds Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation hypocotyl+stengel Sig. (2-tailed) N Ethyleen productie Pearson Correlation plant Sig. (2-tailed) N **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

1 36 -0,081 0,638 36 0,170 0,322 36 0,517** 0,001 36 0,480** 0,003 36 -0,213 0,212 36 -0,183 0,284 36

Aantal bladeren -0,081 0,638 36 1 36 0,431** 0,009 36 0,448** 0,006 36 0,465** 0,004 36 -0,165 0,336 36 -0,253 0,136 36

Wortelgewicht 0,170 0,322 36 0,431** 0,009 36 1 36 0,695** 0,000 36 0,779** 0,000 36 -0,219 0,200 36 -0,618** 0,000 36

Gewicht bovengronds 0,517** 0,001 36 0,448** 0,006 36 0,695** 0,000 36 1 36 0,992** 0,000 36 -0,510** 0,001 36 -0,679** 0,000 36

Totaal gewicht 0,480** 0,003 36 0,465** 0,004 36 0,779** 0,000 36 0,992** 0,000 36 1 36 -0,482** 0,003 36 -0,699** 0,000 36

Vasculaire verkleuring -0,213 0,212 36 -0,165 0,336 36 -0,219 0,200 36 -0,510** 0,001 36 -0,482** 0,003 36 1 36 0,498** 0,002 36

Ethyleen productie -0,183 0,284 36 -0,253 0,136 36 -0,618** 0,000 36 -0,679** 0,000 36 -0,699** 0,000 36 0,498** 0,002 36 1 36



Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Wortelgewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gewicht Pearson Correlation bovengronds Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation hypocotyl+stengel Sig. (2-tailed) N Ethyleen productie Pearson Correlation plant Sig. (2-tailed) N *: Correlation is significant at the 0,05 level (2-tailed) **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

1 36 0,190 0,266 36 0,365* 0,028 36 0,634** 0,000 36 0,628** 0,000 36 -0,178 0,298 36 -0,259 0,127 36

Aantal bladeren 0,190 0,266 36 1 36 0,205 0,231 36 0,369* 0,027 36 0,364* 0,029 36 0,021 0,902 36 -0,364* 0,029 36

Wortelgewicht 0,365* 0,028 36 0,205** 0,231 36 1 36 0,606** 0,000 36 0,692** 0,000 36 -0,352* 0,035 36 -0,273 0,107 36

Gewicht bovengronds 0,634** 0,000 36 0,369* 0,027 36 0,606** 0,000 36 1 36 0,994** 0,000 36 -0,593** 0,000 36 -0,629** 0,000 36

Totaal gewicht 0,628** 0,000 36 0,364* 0,029 36 0,692** 0,000 36 0,994** 0,000 36 1 36 -0,588** 0,000 36 -0,610** 0,000 36

Vasculaire verkleuring -0,178 0,298 36 0,021 0,902 36 -0,352* 0,035 36 -0,593** 0,000 36 -0,588** 0,000 36 1 36 0,353* 0,035 36

Ethyleen productie -0,259 0,127 36 -0,364* 0,029 36 -0,273 0,107 36 -0,629** 0,000 36 -0,610** 0,000 36 0,353* 0,035 36 1 36



Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation hypocotyl Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation stengel Sig. (2-tailed) N *: Correlation is significant at the 0,05 level (2-tailed) **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

1 36 0,047 0,787 36 0,199 0,244 36 0,392* 0,018 36 0,308 0,067 36

Aantal bladeren

Totaal gewicht

0,047 0,787 36 1

0,199 0,244 36 0,001 0,995 36 1

36 0,001 0,995 36 0,234 0,170 36 0,109 0,526 36

36 -0,559** 0,000 36 -0,565** 0,000 36

Vasculaire verkleuring hypocotyl 0,392* 0,018 36 0,234 0,170 36 -0,559** 0,000 36 1 36 0,887** 0,000 36

Vasculaire verkleuring stengel 0,308 0,067 36 0,109 0,526 36 -0,565** 0,000 36 0,887** 0,000 36 1 36

Vt305 DNA wortel /hypocotyl -0,053/0,256 0,893/0,476 9/10 -0,734*/-0,666* 0,024/0,035 9/10 -0,572/-0,085 0,108/0,815 9/10 0,252/-0,016 0,513/0,966 9/10 0,023/-0,104 0,953/0,775 9/10

VSO1 DNA wortel /hypocotyl 0,154/0,933** 0,651/0,002 11/7 -0,382/0,778* 0,246/0,039 11/7 0,814**/-0,459 0,002/0,301 11/7 -0,263/0,823* 0,434/0,023 11/7 -0,343/0,823* 0,301/0,023 11/7

V. dahlia DNA wortel /hypocotyl 0,444*/0,045 0,050/0,870 20/16 0,213/-0,059 0,367/0,827 20/16 0,174/-0,496 0,462/0,051 20/16 0,357/0,278 0,122/0,297 20/16 0,447*/0,461 0,048/0,073 20/16



Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Aantal bladeren Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Wortelgewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gewicht Pearson Correlation bovengronds Sig. (2-tailed) N Totaal gewicht Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Vasculaire verkleuring Pearson Correlation stengel Sig. (2-tailed) N *: Correlation is significant at the 0,05 level (2-tailed) **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

Aantal bladeren 1

36 0,559** 0.000 36 0,386* 0,020 36 0,661** 0,000 36 0,670** 0,000 36 -0,040 0,816 36

0,559** 0,000 36 1 36 0,279 0,100 36 0,360* 0,031 36 0,375* 0,024 36 0,097 0,574 36

Wortelgewicht 0,386* 0,020 36 0,279 0,100 36 1 36 0,433** 0,008 24 0,552** 0,000 36 0,140 0,416 36

Gewicht bovengronds 0,661** 0,000 36 0,360* 0,031 36 0,433** 0,008 36 1 36 0,991** 0,000 36 -0,281 0,097 36

Totaal gewicht 0,670** 0,000 36 0,375* 0,024 36 0,552** 0,000 36 0,991** 0,000 36 1 36 -0,238 0,161 36

Vasculaire verkleuring -0,040 0,816 36 0,097 0,574 36 0,140 0,416 36 -0,281 0,097 36 -0,238 0,161 36 1 36



Pearson Correlation 1 Sig. (2-tailed) N 35 Aantal bladeren Pearson Correlation 0,369* Sig. (2-tailed) 0.029 N 35 Wortelgewicht Pearson Correlation 0,083 Sig. (2-tailed) 0,634 N 35 Gewicht Pearson Correlation 0,636** bovengronds Sig. (2-tailed) 0,000 N 35 Totaal gewicht Pearson Correlation 0,504** Sig. (2-tailed) 0,002 N 35 Vasculaire verkleuring Pearson Correlation -0,046 hypocotyl Sig. (2-tailed) 0,794 N 35 *: Correlation is significant at the 0,05 level (2-tailed) **: Correlation is significant at the 0,01 level (2-tailed)

Aantal bladeren

Wortelgewicht

Gewicht bovengronds

Totaal gewicht

Vasculaire verkleuring

0,369* 0,029 35 1

0,083 0,634 35 -0,023 0,894 35 1

0,636** 0,000 35 0,279 0,105 35 0,680** 0,000 35 1

0,504** 0,002 35 0,201 0,246 35 0,835** 0,000 35 0,971** 0,000 35 1

-0,046 0,794 35 0,279 0,105 35 0,474** 0,004 35 -0,357* 0,035 35 -0,422* 0,012 35 1

35 -0,023 0,894 35 0,279 0,105 35 0,201 0,246 35 0,279 0,105 35

35 0,680** 0,000 35 0,835** 0,000 35 0,474** 0,004 35

35 0,971** 0,000 35 -0,357* 0,035 35

35 -0,422* 0,012 35

35

Vt305 DNA wortel /hypocotyl 0,501*/-0,201 0,034/0,491 18/14 0,068/-0,243 0,787/0,402 18/14 -0,128/-0,465 0,613/0,094 18/14 0,089/-0,497 0,727/0,071 18/14 0,021/-0,522 0,934/0,056 18/14 -0,081/0,176 0,749/0,546 18/14

V. dahlia DNA wortel /hypocotyl 0,170/-0,284 0,438/0,254 23/18 0,073/-0,354 0,741/0,150 23/18 0,216/-0,089 0,323/0,724 23/18 -0,053/-0,306 0,811/0,216 23/18 -0,006/-0,289 0,978/0,244 23/18 0,592**/-0,107 0,003/0,672 23/18


Interacties tussen goedaardige en pathogene Verticillium isolaten in tomaat

Recommend Documents