Obecný návod pro laboratorní úlohy z měřicí techniky Práce OX
Obrazová analýza
1
Úvod:
Tyto laboratorní úlohy jsou koncipovány jako seznámení se s principy snímání mikroskopických obrazů a jejich následnou obrazovou analýzou pomocí vhodných softwarových prostředků. Základním předpokladem pro úspěšné provedení obrazové analýzy je správné sejmutí obrazu analyzovaného materiálu. Tento proces je ovlivňován mnoha faktory, z nichž nejdůležitějšími jsou osvětlení, podklad a kvalita snímacích zařízení. Osvětlení je možné zajistit velkou řadou prostředků. Při nasvícení vzorku shora je nejčastěji používáno méně kvalitní, ale pro mnoho aplikací dostačující, osvětlení pomocí páru bodových světlovodných prvků. V tomto případě ovšem mohou sledované částice vrhat nežádoucí stíny, které při kvalitativní obrazové analýze často zkreslují výsledky. Proto se stále více prosazuje používání kruhových osvětlovacích prostředků, u nichž je vznik stínů do jisté míry eliminován. Může se jednat jak o kruhové uspořádání určitého počtu bodových světelných zdrojů, tak o skutečně kruhový zdroj umělého bílého rozptýleného světla, tedy jakousi obdobu klasických zářivek. Zatímco nasvícení materiálu shora se používá při takových analýzách, kdy je třeba sledovat povrchovou strukturu částic nebo jejich barevné rozlišení, podsvícení zdola se používá při analýze vnějšího tvaru a velikosti částic nebo jejich počtu. Spodní osvětlení může zajišťovat jak jednoduché zrcátko, odrážející například světlo ze světlovodů, tak také již běžně komerčně vyráběné plošné moduly zářivek nebo jiných zdrojů světla. Výběr vhodného osvětlovacího prvku samozřejmě vždy záleží na konkrétní aplikaci. Podklad materiálu musí být volen tak, aby co nejvíce kontrastoval s analyzovaným vzorkem. V případě jednobarevných směsí je nejvhodnější použití standardního černého nebo bílého podkladu, který je nejen dostatečně kontrastní, ale napomáhá také při definici bílé nebo černé barvy během analýzy. Aby byla zajištěna maximální eliminace stínů v obraze, je možné použít jako podklad bílý nebo černý semiš, jehož struktura většinu stínů pohltí. Ovšem při mikroskopických analýzách může být struktura tohoto materiálu naopak rušivým elementem. Snímání různobarevných směsí je možné provádět na barevných podložkách, které mohou již v této první fázi analýzy odstranit některé nežádoucí částice tím, že s nimi budou jen velmi málo kontrastovat. Pro analýzy, u nichž je vzorek nasvícen zdola, se jako podklad používají podložní sklíčka potřebných rozměrů. Výběr zařízení, pomocí kterých můžeme sejmout obraz analyzované směsi, je v dnešní době velmi široký. Aby bylo možné obraz následně počítačově zpracovat, je vhodné jej získat přímo v digitální formě. K tomuto účelu slouží digitální fotoaparáty a kamery, které v sobě mají zabudovaný vhodný snímací prvek. V současnosti jsou nejpoužívanějšími typy CCD (Charge-Coupled Device) a CMOS (Complementary Metal-Oxide Semicoductor) senzory. Oba druhy mají svůj zcela základní princip společný: převádějí světelnou energii na elektrickou. Velmi zjednodušeně lze tento proces popsat tak, že tisíce až milióny buněk citlivých na světlo jsou uspořádány do plošné matice. Velikost matice, tedy součin počtu sloupců a řádků matice, udává rozlišovací schopnost jednotlivých přístrojů. Každá buňka převádí světelnou informaci ze své malé části obrazu na elektrický signál. Hodnoty náboje jednotlivých buněk je poté potřeba přečíst. U systému CCD, používaném v této práci, je nakumulovaný náboj ve formě analogového signálu přesouván přes matici tvořenou Shottkyho diodami, která se tedy chová obdobně jako posuvný registr, a jedním rohem matice přechází do vyhodnocovacího zařízení. Analogově/digitální převodník poté převede každou hodnotu buňky do digitální podoby. Protože jsou jednotlivé elementy citlivé především na intenzitu světla a méně na barvu, je
takto získaný obrázek černobílý. Barevného obrázku se většinou dosahuje předřazením příslušného barevného filtru. Pro vytvoření jednoho barevného bodu (pixelu) výsledného snímku proto potřebujeme nejméně tři buňky matice. V praxi se však na jednom pixelu barevného obrazu podílí většinou čtyři buňky CCD senzoru. Je zde totiž dvakrát zařazen zelený filtr, čímž je simulována větší citlivost lidského oka právě na zelenou barvu. Výsledný barevný bod pak vzniká aditivním smícháním těchto tří barev. Nevýhodou CCD detektorů je vzájemné ovlivňování nábojů v sousedních buňkách, malý rozsah intenzit a nemožnost adresovat jednotlivé buňky. Naopak výhodami tohoto detektoru oproti druhému typu je vysoké rozlišení, vysoká rychlost převodu signálu a nízký šum ve výsledném obraze. CCD detektory bývají využívány pro práci na vysoce kvalitních snímcích, s mnoha dokonale zhodnocenými pixely a za vyšší citlivosti ke světlu. Naopak senzory CMOS mívají obrazovou kvalitu nižší, nižší rozlišovací schopnost a nižší citlivost, ale přístroje s těmito senzory jsou mnohem levnější a mají nižší spotřebu energie a proto jsou vhodné pro přístroje, používající jako zdroje energie baterie. Vlastnosti senzoru, díky kterým je světelný signál převáděn na elektrický, jsou sice nejdůležitější, ale ne jedinou charakteristikou snímacího zařízení. Při volbě vhodnosti použití jednotlivých zařízení pro danou aplikaci je nutné brát v úvahu také další schopnosti zařízení. Jedná se například o charakter připojení přístroje k počítači, formát získaných snímků nebo schopnost sejmout digitální videozáznam. Dalším zařízením, které nám pomáhá co nejlépe sejmout obraz sledované směsi, je mikroskop. Kromě klasického světelného mikroskopu je v naší laboratoři používán stereomikroskop. Protože se jeho princip poněkud liší od běžných mikroskopů, bude mu věnováno následujících několik odstavců. Stereomikroskop získal svůj název díky tomu, že je možné sledovaný materiál sledovat oběma očima se zachováním stereoskopického (prostorového) efektu vidění, který je typický pro běžné lidské vidění. Moderní stereomikroskopy jsou vyráběny na základě dvou rozdílných koncepcí. První koncepce je nazývána „Greenough Concept“ (viz obr.1) . Zde jsou dva identické objektivy uspořádány tak, aby jejich optické osy svíraly minimální úhel. Jsou zde tedy generovány dva oddělené obrazy, které jsou sledovány skrz oddělené okuláry. Prostorový obraz se vytváří kombinací těchto dvou obrazů v lidském mozku. Jedná se o jednoduchý, kompaktní a levný systém, který dovoluje provádět základní mikroskopické pozorování na vysoké úrovni. Mikroskop používaný v laboratoři je založen právě na tomto principu.
Druhá koncepce se nazývá „Telescope Concept“ (viz obr.2). V tomto případě jsou paralelně uspořádány dva mikroskopické systémy, ve kterých je světelný signál systémem čoček usměrněn do společného objektivu. Stereoefekt je dosahován kombinací těchto dvou os paprsků. Tento systém je složitější, tedy i dražší, nabízí ovšem možnost použití mnoha přídavných modulů zvyšujících kvalitu a flexibilitu mikroskopických analýz.
Scanner Dalším zařízením používaným v Laboratoři obrazové analýzy je scanner. Jedná se o plnohodnotný opak tiskárny – světlem snímá informace na papíře a převádí je do digitální podoby nul a jedniček. Většina scannerů snímá barevně, málokteré jsou však schopny scanovat automaticky několik stránek papíru za sebou. Nejpoužívanějšími scannery jsou stolní, deskové scannery, které pracují stejně jako kopírka: Na skleněnou desku se položí předloha (která může být i plastičtější, než je papír – kupříkladu propiska, brýle, krajíc chleba), přikryje se a scanuje. Pomocí pojízdného ramena je svazkem paprsků vždy snímán celý řádek bodů, při průchodu přes celou snímací plochu je tak osvětlen celý dokument (objekt). Odražené světlo je optickou soustavou (zrcadla, čočky) usměrněno na elektronické prvky CCD citlivé na světlo, které převádí analogové informace o intenzitě světla do digitální podoby. Snímaná předloha je vyhodnocována jako matice bodů, přičemž každému bodu je přiřazen jeden z 32 až 255 odstínů šedé barvy (rozsah od bílé po černou je rozdělený na 32 až 255 různých hodnot). Stupeň šedi se získá vyhodnocením intenzity odraženého světla od ozářeného bodu. Jako světelný zdroj se používá laserový paprsek nebo skupina svítivých LED diod. Jim jsou přiřazeny fotodetektory. Takto sejmutý obraz, rozložený na body, se přes kabel, adaptér a DMA ukládá do videopaměti a následně se zobrazí na obrazovce. (pozn. DMA = Direct Memory Access, tj. přímý přístup do paměti, jedná se o schopnost sběrnice posílat data přímo z připojeného zařízení (např. skener) do paměti)
Rozlišení je základní parametr každého scanneru, který z velké části vypovídá o jeho kvalitě – čím vyšší, tím lepší. Stejně jako u tiskáren se udává v jednotce dpi (dots per inch), čímž oznamuje, kolik bodů bude naskenováno z jednoho délkového palce; například 300 dpi znamená, že skenovaná linka o délce jednoho palce (2,54 cm) bude zaznamenána 300 body v grafickém formátu obrázku. Neboli, scanner s vyšším rozlišením zaznamená více detailů (někdy i zbytečně mnoho), je to však vyváženo delším časem snímání předlohy a větší velikostí uloženého obrázku. Aby vše nebylo tak jednoduché, rozeznáváme u scannerů dva typy rozlišení: • Optické – neboli také pravé rozlišení. Udává, kolik bodů skutečně scanner „vidí“ – kolik senzorů má vměstnaných v délce jednoho palce. Často se rozlišení uvádí jako 300×600 dpi či 600 ×1 200 dpi, což znamená, že v jednom směru má scanner skutečně
•
pouze 300 či 600 snímacích senzorů, nicméně v druhém směru s nimi umí pohybovat jemněji, v 600 či 1 200 mezikrocích. Interpolované – neboli domyšlené rozlišení. Udává, kolik bodů si umí scanner dopočítat z toho, co je skutečně schopen nasnímat. Je-li optické rozlišení scanneru 300 dpi, ale my snímáme v rozlišení 600 dpi, výsledek má každý druhý bod v horizontálním i vertikálním směru dopočítán jako střední hodnota z barevných hodnot bezprostředně sousedících bodů, které byly skutečně naskenovány. Výsledek je tedy z více jak poloviny (i když rozumně) vymyšlený. Interpolované rozlišení mohou mít scannery až několikanásobně vyšší než optické rozlišení, obvykle až 4 800 dpi či 9 600 dpi. Snímáním v takovém rozlišení však nedostaneme detaily, které jsou na originálu patrné, ale pouze rozmazaný náznak originálních obrysů !!!
Snímání barevného obrazu probíhá třemi způsoby: • Předloha se snímá 3x a to vždy s jiným filtrem a dílčí obrazy se poté skládají do výsledného obrazu. Kvalita je závislá na kvalitě vlastní mechaniky. Každá sebemenší nepřesnost se projevuje neostrostí obrazu. • Předloha se snímá 1x, ale každá řádka je osvětlena postupně třemi filtry těsně po sobě. Časově je tato metoda rychlejší. • Používá se jedna lampa a rozklad světla přicházející od předlohy se převádí pomocí optického hranolu na 3 základní barvy a paprsky se vedou na 3 řádkové snímače CCD. Přestože se jedná vždy o velmi přesné umístění snímače, dochází často k barevnému zkreslení. Skenovat je možné prakticky cokoliv, ale měli bychom si uvědomit, že scanner poskytuje plošný obraz pouze té strany objektu, která je položená na sklo. Navíc jsme omezeni velikostí, většina scannerů má rozměr skla formátu A4 (tj. 210 × 297 mm), větší objekty je nutné skenovat postupně a poté složitě skládat výsledný obraz z dílčích. Limitující je také již zmíněné rozlišení scanneru, které nám povoluje kvalitně sejmout pouze detaily omezené velikosti (to je v podstatě stejné jako při fotografování). Ani hloubka ostrosti není u scanneru velká, ostře sejme skutečně pouze materiál ležící na jeho desce, detaily, které leží nad deskou jsou rozmazané případně tmavé. Z tohoto hodnocení vyplývá, že pro skenování se, kromě klasických fotografií nebo jiných předloh na papíře, hodí spíše plošné objekty větších rozměrů (detaily větší než 1 mm, celkový rozměr menší než A4).
2
Zařízení používaná v této laboratoři
Zařízeními použitými pro sejmutí obrazu sledovaného vzorku v těchto laboratorních úlohách, jsou: 1. Světelný mikroskop Nikon s kamerou SONY DFW-SX910 2. Stereomikroskop Zeiss s kamerou SONY DFW-SX910 3. Samotná kamera SONY DFW-SX910 4. Scanner multifunkčního zařízení OKI C5540 MFP 2.1
Mikroskop Nikon Eclipse LV100D
Mikroskopy Nikon řady Elipse LV jsou určeny pro celou řadu nejrůznějších oborů, jako například výroba, výzkum a vývoj polovodičů, elektroniky, léků, dále pak v obecné metalurgii, krystalografii a ve výzkumu, vývoji a výrobě keramických materiálů. Mikroskop má zabudovánu nekonečnou optiku CFI60, která koriguje chromatickou vadu v celém zorném poli. Obraz je tedy extrémně ostrý, s vysokým kontrastem a minimálním kolísáním jasu. Navíc parfokální vzdálenost 60 mm (tj. vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla) a větší průměr objektivu zajišťují jak větší pracovní vzdálenost, tak větší numerickou aperturu. Větší pracovní vzdálenost je obzvlášť výhodná při pozorování silných preparátů. Ve stojanu mikroskopu je zabudovaný světelný zdroj pro diaskopické osvětlení a páčka přepínání osvětlení dia/epi. Dostatečně velký stolek (6" x 4") usnadňuje pozorování ve všech průmyslových aplikacích. Pohodlí při pozorování preparátů zajišťuje také ergonomické uspořádání ovládacích prvků stolku a zaostření mikroskopu. Soustředné knoflíky jemného a hrubého zaostření jsou umístěny pouze několik centimetrů nad úrovní stolu a ovládací prvky posunu stolku a zaostření jsou v těsné blízkosti. Stolek i zaostření lze tedy ovládat jednou rukou a druhou rukou je možné například nastavovat osvětlení případně clony a filtry. Na následujících obrázcích je popis základních prvků tohoto mikroskopu.
Pohled zprava:
Pohled zleva (detail ovládacích prvků):
Zacházení s mikroskopem bude před začátkem laboratorní práce demonstrováno asistentem. Při práci s mikroskopem dbejte na pokyny asistenta, nezacházejte s žádným ovládacím prvkem hrubě a nezkoušejte nic, co vám asistent neukáže nebo nedovolí. Tento mikroskop je velmi nákladná součást laboratoře (cca 650 tisíc Kč) a jakákoliv oprava je nejen finančně, ale také časově náročná a výrazně by narušila chod laboratoří.
2.2
Stereomikroskop STEMI 2000, Carl Zeiss GmbH.
Používaný stereomikroskop (viz obr.3) je založen na koncepci uspořádání označované jako Greenough Concept. Je to jednodušší, avšak dostatečně výkonný mikroskopický systém. K objektivu mikroskopu je připojena přídavná čočka (předsádka), která nám dovoluje vyšší zvětšení než bychom dosáhli se samotným mikroskopem. Maximální dosažitelné zvětšení mikroskopu je tedy 100x, což nám ve spojení s kamerou umožňuje analyzovat částice, jejichž rozměr se pohybuje ve velikostech větších než jednotky mikrometrů. Výsledný obraz sledovaný mikroskopem můžeme sledovat buď pomocí dvojice okulárů nebo pomocí jednoho okuláru se současným nasměrováním druhého paprsku do objektivu připojené kamery. Ve stejný okamžik tedy můžeme sledovat analyzovanou směs jak pomocí mikroskopu, ovšem v tomto případě už ne stereoskopicky, tak také pomocí vhodného software na obrazovce počítače, ke kterému je připojena kamera.
Obr. 3: Schéma stereomikroskopu Stemi 2000 2.3
Digitální kamera SONY DFW-SX910
Tato kamera má jako snímací prvek CCD detektor, jehož rozlišení je 1392×1040 pixelů. Napájení kamery je zajišťováno pomocí standardního rozhraní IEEE 1394 (neboli FireWire). Přes toto rozhraní je také kamera ovládána buď pomocí software NIS-Elements nebo jiných programů pro ovládání FireWire kamer (mimo jiné i LabVIEW). Rychlost
snímkování kamery je maximálně 7,5 snímku za sekundu, které je ale možné dosáhnout pouze při nižším rozlišení. Kamera nemá vestavěný objektiv, a aby bylo možné získávat snímky, je tedy nutné k ní přes standardní C-závit připevnit vhodný objektiv v závislosti na velikosti sledovaného materiálu. V úloze O1 je objektiv nahrazen mikroskopem Nikon, v úloze O2 stereomikroskopem Zeiss.
Obr. 4: Kamera Sony DFW-SX 910 s objektivem 2.4
Multifunkční zařízení OKI C5540 MFP
Pomocí tohoto víceúčelového zařízení je možné tisknout nebo kopírovat barevné i černobílé obrazy vysokou rychlostí na celou řadu kancelářských tiskových médií a také snadno skenovat papírové dokumenty i jiné ploché objekty a vzniklý obraz odesílat na různá místa (e-mailové adresy, tiskárny, servery FTP nebo počítače propojené do sítě).
Toto víceúčelové zařízení nabízí následující funkce: Skenování do e-mailu, na server FTP nebo do adresáře na libovolném počítači síťově připojenému k tomuto zařízení. Skenování je možné v kvalitě až 1200 dpi, získané snímky mají tedy velmi vysokou kvalitu a jsou vhodné i pro měření v rámci obrazové analýzy Rychlý tisk až 16 plnobarevných stránek za minutu pro barevné, profesionálně vyhlížející prezentace a jiné dokumenty. Rychlé kopírování až 8 plnobarevných kopií za minutu (při rozlišení 300 dpi). Rychlý a výkonný černobílý tisk až 24 stránek za minutu pro běžné dokumenty. Rychlé a výkonné černobílé kopírování až 16 stránek za minutu (při rozlišení 300 dpi) pro běžné dokumenty. Rozlišení 1200x600 dpi umožňující tisk vysoce kvalitních obrázků s nejjemnějšími podrobnostmi. Rozlišení pro kopírování 600x600 dpi. ….a další funkce zařízení jako (síťové) tiskárny, kopírky a scanneru (oboustranný tisk díky duplexní jednotce, odeslání více stránek ke kopírování nebo skenování, …. )
Na následujícím obrázku je popis základních prvků tiskárny a scanneru OKI. Pro laboratorní práci O4 je důležitá pouze horní část, tedy samotný scanner (resp. kopírovací část tiskárny), bez jakýchkoliv ovládacích prvků.
Obr. 5: Multifunkční tiskárna OKI C5540 MFP (dole – popisky)
3
Použitý software
3.1
NIS-Elements AR 2.30
Program NIS-Elements (do srpna 2006 byl původní název tohoto programu LUCIA) je nejpoužívanější software pro obrazovou analýzu na VŠCHT Praha a jeden z nejpoužívanějších v ČR. Důvodem této obliby je to, že má českého výrobce Laboratory Imaging, s r.o. a tudíž i českou jazykovou verzi, což je velmi výhodné především pro výuku. NIS-Elements je systém obrazové analýzy určený ke sledování, snímání, archivaci a ručnímu nebo automatizovanému měření preparátů. Používaný snímací systém nejčastěji tvoří optický přístroj (mikroskop, stereomikroskop resp. makrooptika nebo skener), dále kamera nebo digitální fotoaparát, nezbytný počítač a softwarové vybavení. Vybavení programu NIS-Elements je možné rozdělit do několika stupňů podle náročnosti prováděné obrazové analýzy, v této laboratoři je používán III. stupeň nazvaný NIS-Elements Advanced Research. NIS-Elements Advanced Research - III. stupeň Jedná se o softwarové vybavení určené pro plně automatizované a náročné úlohy, často spojené s rozhodovacími procesy během měření. Advanced Research obsahuje veškeré možnosti základní verze programu nazývaného Measurement (tj. = I. a II. stupeň); většina funkcí je dále posílena o doplňky k speciálnímu použití. V základní programové výbavě NISElements Advanced Research obsahuje následující prvky, z nichž některé budou podrobněji popsány v následujících odstavcích:
Nastavení a ovládání snímací kamery Živé zobrazení na monitoru resp. výběr části obrazovky, kde je živý obraz Snímání jednotlivých snímků, sekvence (sady) snímků, snímání velkých obrázků Úprava sejmutého obrazu základními nástroji (kontrast, SW doostření, SW vyhlazení) Rozměrová kalibrace systému pro jednotlivé optické konfigurace (pro více zvětšení) Ruční proměřování délek, ploch a úhlů pomocí myši s výstupem dat Prahování - segmentace obrazu na objekty a pozadí Základní binární operace na segmentovaném obrazu (eroze, dilatace, otevření, zavření, zaplnění děr, obrysy...) Ruční editor binárního obrazu Automatizované měření planimetrických veličin (plocha, max. a min. rozměry, protažení, cirkularita, délka, šířka.) Programování - vytváření maker pro opakující se úlohy Úprava barevných obrazů obsahuje morfologické funkce (erozi, dilataci, morfologický gradient, detekci hran.) Úprava binárních obrazů obsahuje rozšířené funkce (separaci binárních objektů, skeleton, ořezání konců čar, zóny vlivu, jednobodové značení.) Srovnávací funkce pro dva barevné obrazy (vzájemné posuny, otočení, smrštění nebo roztažení, diferenční funkce) Kombinace více binárních obrazů - binární operace (průnik, sjednocení, porovnávání, odečítání)
Měření v masce - lze měřit v libovolně velké ploše různého tvaru, může být složena i s více vzájemně nepropojených oblastí; masku lze vytvořit prahováním nebo ručním editorem; lze vzájemně propojit masku a binární obrazy Měření s omezením veličin (např. jen objekty s plochou větší než 50 µm) … a řada dalších funkcí
Příklad využití funkcí měření v programu NIS-Elements (zdrojem obrazů je prospekt k programu NIS-Elements vydaný firmou Laboratory Imaging, s r.o.) Pro náročnější a speciální operace obrazové analýzy lze k základnímu programu NISElements Advanced Research (příp. NIS-Elements Image resp. Measurement) zakoupit další přídavné moduly, které nám umožní např. rozšířené ovládání zařízení mikroskopu nebo náročnější analýzu získaných snímků. Obecný postup analýzy obrazu programem NIS-Elements Advanced Research je následující: 1. Sejmutí obrazu Po spuštění programu NIS-Elements se objeví dialogové okno, ve kterém uživatel volí, zda bude snímat pomocí kamery nebo použije simulátor snímání případně nebude obrázky vůbec snímat obrázky pomocí programu NIS-Elements, ale pouze analyzovat již dříve získané snímky. Stisknutím tlačítka Živý obraz na horní liště se v hlavním okně programu zobrazí aktuální obraz, který snímá kamera. Pro korekci světelných a barevných vlastností obrazu se používá funkce Nastavení kamery v nabídce Snímání resp. v pravé části obrazovky na záložce Nastavení kamery. Pokud obrázek odpovídá představám uživatele, stiskne se tlačítko Sejmout na horní liště a tak se obrázek převede do počítače. Doporučuje se obraz ihned uložit do počítače pomocí pokynu Uložit v nabídce Soubor.
2. Otevření obrazu Obraz sejmutý jinak než přímo online kamerou se otevírá jednoduše příkazem Otevřít v nabídce Soubor. 3. Úprava barevného obrazu – nabídka Obraz
Oříznout – Pokud analyzovaný obraz obsahuje na okrajích zbytečně mnoho pozadí a rušivých objektů, které mohou rušit analýzu, je možné příkazem Oříznout upravit velikost obrazu tak, aby obsahoval všechny objekty, které mají být analyzovány a pokud možno minimum rušivých částí. Oříznout je možné pouze do tvaru obdélníku a výběr se nastaví táhnutím myši a potvrdí tlačítkem Enter. Kontrast – Pokud se sledované detaily v obraze svou světlostí málo liší od ostatních objektů, pak je možné jejich kontrast zvýšit funkcí Kontrast (pro šedý obraz) příp. Kontrast složek pro zvýraznění barevných složek obrazu. Při posouvání hodnot kontrastu na stupnici se v náhledu zobrazuje porovnání původního a upraveného obrazu. Upravit obraz – Funkce v nabídce Upravit obraz umožňují další změny barev a intenzity v obraze, jako jsou například matematické transformace jednotlivých barev, změna sytosti nebo odstínu apod. . Vyhladit/Zaostřit – Tyto funkce potlačí resp. zvýrazní detaily v obraze. Velikost/Otočit/Převrátit/Posunout – Tyto funkce manipulují s obrazem a upravují jeho rozměry. Detekce – Funkce v menu Detekce vyhledávají a zvýrazní (zvýšením světlosti) určité vlastnosti obrazu, jako jsou hrany nebo oblasti, kde hodnoty světlosti vytvářejí tzv. „údolí“ nebo „vrcholy“,tj. lokální minima nebo maxima. Morfologie – Morfologické funkce upravují objekty v obraze tak, že je zmenší nebo odstraní (Eroze), zvětší a příp. spojí (Dilatace), vyhladí kontury, odstraní malé objekty, rozpojí objekty spojené tenkou šíjí (Otevření) nebo zaplní díry, vyhladí okrajové trhliny a spojí blízké objekty (Zavření).
4. Transformace obrazu
Konverze – Tato funkce z nabídky Obraz převádí barevný obraz na šedý (Převést do šedého obrazu), obraz vyjádřený RGB (červená, zelená, modrá) stupnicí převedou na HSI (odstín, sytost, světlost) stupnici (Převést RGB na HSI) a naopak (Převést HSI na RGB). Dále je možné z obrazu vybrat jednu barevnou vrstvu příp. určitou hodnotu světlosti, odstínu a převést ji do šedé stupnice (Vytáhnout složku - výsledkem je tedy šedý obraz vytvořený na základě specifických požadavků uživatele). Prahování – Prahování je jedna z nejdůležitějších funkcí obrazové analýzy, která převádí barevný nebo šedý obraz na binární (tj. obraz, ve kterém jsou pouze dvě hodnoty barev – obvykle černá a bílá). Program NIS-Elements dovoluje prahovat (tedy stanovit práh mezi pozadím a objekty v binárním obraze) podle jednotlivých barevných složek obrazu (Prahování resp. Prahování po složkách), podle hodnot HSI (Prahovat podle HSI) a nebo podle předem stanovené reference (Prahování podle reference).
5. Editace binárního obrazu – nabídka Binární
Otevření/Uzavření/Eroze/Dilatace/Vyčištění/Vyhlazení – Tyto funkce jsou obdobou výše zmíněných funkcí pro barevný obraz, pouze pracují s binárním obrazem. Uzavřít díry/Zaplnit díry – Tyto funkce se používají v těch případech, kdy chceme např. měřit plochu objektů, ve kterých vznikly během prahování a jiných úprav kvůli odleskům nebo jiným jasovým odchylkám díry. První funkce uzavře díry, které jsou v úzkém místě otevřeny a druhá funkce pak takto uzavřené díry vyplní. Konvexní obálka – Funkce vytvoří konvexní obal kolem objektů (někdy to může pomoci, např. při pouhém počítání objektů, ale při měření plochy částic se tato funkce nedoporučuje vzhledem k tomu, že přidává objektům další pixely navíc, které by mohly rušit přesné měření). Obrysy - Tato funkce vyhledá a zvýrazní obrysy objektů. Morfologická separace objektů – Tato funkce umí rozdělit objekty, které se překrývají nebo dotýkají (oddělit objekty je možné i manuálně, nakreslením čáry do obrazu – viz Vložit čáru, kruh, elipsu). Lineární/Pokročilá morfologie – Tyto funkce provádějí jednoduché i velmi složité morfologické operace s objekty v obraze (pracují tedy s rozměry a tvarem objektů a mění je podle druhu funkce a požadavků uživatele). Zpracování po objektech – Tato funkce umožňuje provádět příkazy (funkce) pro každý objekt zvlášť (příkazy se zadávají textově nebo výběrem ze seznamu). Vložit čáru, kruh, elipsu – Pomocí této funkce je možné do obrazu vložit geometrický tvar v barvě objektů nebo pozadí binárního obrazu. Vkládání tvarů v barvě objektů se používá např. pro dokreslení objektu, pokud se jeho část prahováním odstranila a nebo pro přidání objektu, který při prahování zcela zmizel. Barva pozadí se používá pro již zmíněnou separaci nakreslením úsečky mezi dvěma dotýkajícími se objekty nebo vymazání nežádoucích objektů.
6. Výběr objektů v obraze – nabídka Měření –Editace masky Editor masky – Slouží k úpravě barevného i binárního obrazu tak, aby neobsahoval nežádoucí objekty, které by mohly rušit analýzu nebo naopak k výběru požadovaných objektů. Po spuštění editoru se změní levá i horní lišta programu. V levém rohu se volí, zda budou maskou označeny objekty, které se mají analyzovat (přepnutím čtvercového políčka na pozici FG -
), nebo
naopak objekty, které se mají přesunout do pozadí (pozice BG – ). Dále se volí nástroj, kterým se bude maska vytvářet (obdélník, kruh, linie, elipsa či libovolný jiný i nepravidelný tvar). Pravidelné tvary se vytvoří pouhým zakreslením tvaru do obrazu potažením myši, nepravidelný tvar se vytvoří vyznačením několika bodů určujících rozměry a tvar masky a nakonec potvrzením vykreslení masky pravým tlačítkem myši. Když je maska hotová (může mít i několik částí), editor se zavře a pokračují další úpravy a analýzy obrazu.
7. Měření – nabídka Měření
Interaktivní měření – Toto měření umožňuje uživateli provádět přímá měření objektů s okamžitým výstupem naměřených údajů ve zvolených jednotkách. Můžeme si vybrat z těchto parametrů: Délka, Plocha, Profil intenzity, Taxonomie, Počet, Poloměr, Poloosy, Úhel.
Měření jednotlivých objektů – Při použití této funkce program změří předem nastavené parametry všech objektů v binárním obraze. Nejprve je nutné nastavit Příznaky pro měření objektů, příp. Omezení hodnot příznaků (tedy nastavení mezí měření), poté Změřit objekty a nakonec je možné přečíst Výsledky měření objektů.
Měření polí – Obdobně jako jednotlivé objekty je možné měřit pole, kdy jsou změřeny zvolené parametry objektů (Příznaky pro měření polí) a zprůměrovány pro všechny objekty dohromady (tj. za celé pole).
Měřicí rámeček – Toto je velmi důležité nastavení rámečku, určujícího které objekty v obraze budou (uvnitř rámečku) a které nebudou (vně rámečku) měřeny. Rámeček je možné upravit i po stisknutí klávesy F popotažením jeho okrajů myší. Rámeček má strany označeny dvojím způsobem, čárkovanou a plnou čárou. Objekty, které se dotýkají plné čáry (levý a spodní okraj rámečku) nebudou do měření započítány. Objekty dotýkající se čárkované linky (pravý a horní okraj rámečku) se do měření započítávat budou.
8. Vytvoření makra – nabídka Makro Makro slouží k tomu, aby uživatel nemusel při opakovaných analýzách vždy znovu nastavovat všechny použité funkce, ale mohl celý sled funkcí spustit pouhým jedním kliknutím.
Nové…, Otevřít… - Zde se vytvoří a uloží nové makro nebo otevře makro již hotové. Vytvoření a pojmenování nového makra je nutné udělat před začátkem nahrávání makra, jinak bude sled funkcí zapisován do přednastaveného makra s názvem pracovní.mac .
Záznam…(F3) - Pokud je zvoleno požadované makro (nové, již dříve vytvořené nebo pracovní), spustí se klávesou F3 záznam funkcí a dále se provádí analýza tak, jak si to uživatel předem vyzkoušel. U dříve vytvořeného nebo pracovního makra budou dříve zaznamenané funkce přepsány příp. zachovány a k nim budou přidány funkce nové (podle toho, jak si uživatel vybere v dialogovém okně, které se objeví po stisku klávesy F3). Po provedení všech úprav a měření v obrazu se nahrávání makra ukončí opět tlačítkem F3 a nebo v nabídce Makro pokynem Zastavit záznam… .
Editovat…(F8) – Zde je možné editovat makro jako textový program, tedy textově měnit parametry funkcí, mazat nebo přidávat funkce. Tato funkce je určena především pro zkušenější uživatele programu NIS-Elements.
3.2
ScanSoft Paper Port 9.0
Program ScanSoft Paper Port 9.0 slouží ke skenování dokumentů i jiných obrazů multifunkčním zařízením OKI C5540 MFP. Tento program umožňuje nejen získání obrazu prostřednictvím scanneru, ale také následnou úpravu obrazu pomocí základních funkcí zaostření, vyhlazení, vyvážení jasu a podobně. V této práci bude program ScanSoft Paper Port 9.0 používán pouze ke skenování, ostatní úpravy obrazu již budou prováděny programem NIS-Elements. Po spuštění programu se otevře okno, které nabízí nastavení formátu a charakteru skenovaného objektu (textu nebo obrázku) a souboru, kam budou ukládány naskenované obrazy. V úloze O4 využijeme pouze skenování obrazů nikoliv dokumentů. Nastavení a přesné ovládání programu bude popsáno v návodu, který obdržíte na začátku laboratorního cvičení.
4
Základní pojmy: • • • • • • •
HSI - Barevný model, který tvoří barvy spektra pomocí hodnot Odstínu (Hue), Sytosti (Saturation) a Intenzity (Intensity) HSL - Barevný model, který tvoří barevné spektrum pomocí hodnot Odstínu (Hue), Sytosti (Saturation) a Jasu (Luminance) HSV - Barevný model, který tvoří barevné spektrum pomocí hodnot Odstínu (Hue), Sytosti (Saturation) a Hodnoty (Value) Kontrast – Rozdíl mezi nejtmavějšími a nejsvětlejšími oblastmi obrazu. Čím větší rozdíl, tím větší kontrast. Pixel - Nejmenší jednotka plochy digitálního obrazu. Každý pixel je nositelem informace o barvě, příp. jasu ve třech základních kanálech RGB. RGB – Red, Green, Blue; tj. červená, zelená, modrá. Tři barvy, které tvoří barevný model, pomocí nějž je možné složit všechny barvy spektra takzvanou aditivní metodou (složením nejvyšší intenzity všech tří barev vzniká barva bílá). Viditelné světlo – část elektromagnetického spektra o frekvenci 3.8×1014 Hz (hertz) až 7.5×1014 Hz. Vlnová délka viditelného světla ve vakuu je přibližně 380 nm až 740 nm. Hned vedle viditelného světla se nachází ultrafialové (UV) směrem do kratších vlnových délek, a infračervené záření (IR) - směrem do delších délek.
Barva
Vlnová délka
Frekvence
červená ~ 625 až 740 nm ~ 480 až 405 THz oranžová ~ 590 až 625 nm ~ 510 až 480 THz žlutá
~ 565 až 590 nm ~ 530 až 510 THz
zelená
~ 520 až 565 nm ~ 580 až 530 THz
azurová ~ 500 až 520 nm ~ 600 až 580 THz
•
• •
•
modrá
~ 430 až 500 nm ~ 700 až 600 THz
fialová
~ 380 až 430 nm ~ 790 až 700 THz
CCD – obrazový snímací prvek. Polovodičový čip obsahující stovky tisíc fotosenzorů (Shottkyho diod) převádějících intenzitu dopadajícího světla na elektronický signál. Čím vyšší je počet obrazových bodů (pixelů), tím větší má snímací prvek rozlišení. CMOS – také obrazový snímací prvek. V tomto případě převádí světlený signál na elektrický matice MOS tranzistorů. Clona – Malá přepážka s kruhovým otvorem proměnného průměru v objektivu, která řídí množství světla dopadajícího na detektor (např. CCD) při pořizování obrázku. Clona a expoziční doba společně řídí celkové množství světla dopadající na čidlo. Když je clona více otevřená (clonové číslo je nižší), dopadne na čidlo více světla. Expoziční doba – Udává, jak dlouho zůstává při pořizování snímku otevřená clona fotoaparátu nebo kamery. Nastavení expoziční doby na hodnotu 1/125 (často se uvádí jen 125) znamená, že závěrka bude otevřená přesně 1/125 sekundy.
• •
• •
• • • •
•
•
FireWire (IEEE 1394) - rozhraní pro vysokorychlostní kabelový přenos dat z digitálních zařízení (fotoaparátů, kamer i jiných) do počítače. Jediný kabel umožňuje přenos digitálních signálů v reálném čase bez jakékoli ztráty. Chromatická vada (aberace) - vzniká nestejným lomem světelných paprsků různé vlnové délky (barvy) na čočce objektivu. Projevuje se fialovou, někdy zelenou konturou na přechodech mezi vysokým jasem a stínem. Různé objektivy jsou k aberaci různě náchylné a projevuje se zejména v okrajových částech snímku. Aberace se nedá v PC kompenzovat, dá se ale potlačit. Parfokální vzdálenost – vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla. Má být pro všechny objektivy na jednom mikroskopu stejná, pak odpadá zaostřování při otáčení revolverovým nosičem. Numerická apertura (n.a.) – součin indexu lomu prostředí mezi vstupní čočkou objektivu a preparátem (krycím sklem) a sinem poloviny otvorového úhlu objektivu. Je měřítkem pro dosažitelnou rozlišovací schopnost objektivu a tím též pro jeho zvětšení a pro světelný tok, který může objektiv zachytit. Numerická apertura je vyryta do objímky na každém objektivu a dosahuje u objektivů se zvětšením 100x hodnot až 1,4. Diaskopický / Episkopický – systémy snímání obrazu, kde v prvním případě světlo prochází vzorkem a nepohlcená část dopadá na čip a v druhém případě světlo dopadá na vzorek shora a odražené paprsky jsou snímány čipem Binokulár – zdvojený okulár mikroskopu (obraz jde do dvou okulárů), který umožňuje sledovat preparát oběma očima. Dnes je to již běžná součást mikroskopů, dříve bývaly mikroskopy vybaveny pouze jedním okulárem. Polarizátor (P)– zařízení, kterým se přirozené světlo mění na polarizované Analyzátor (A)– polarizátor, který propouští polarizované světlo jen s určitou orientací kmitové roviny
Kondenzor – součást osvětlovacího zařízení světelného mikroskopu, je uložen pod stolkem mikroskopu a skládá se z několika čoček koncentrujících světlo, procházející pozorovaným preparátem a optickou částí mikroskopu.. Dá se většinou posunovat kolmo nahoru a dolů pomocí ovládacího šroubu umístěného nalevo pod stolkem. Stereomikroskop – mikroskop, ve kterém je obraz sledovaný v okulárech složený ze dvou paprsků a simuluje tedy lidský pohled dvou očí. Sledovaný preparát je díky tomu vidět prostorově (stereoskopicky).
5
Vybrané pojmy a funkce obrazové analýzy •
Prahování – transformace barevného nebo šedého obrazu na binární tak, že se intenzity barev v obraze rozdělí na dva intervaly, jednomu je přiřazena hodnota 1 a druhému hodnota 0 (resp. 0 a 255 – černá a bílá); hodnotou 1 jsou potom reprezentovány objekty a hodnotou 0 pozadí obrázku; na následujícím obrázku je znázorněno prahování barevného obrazu, všechny pixely, u kterých jsou intenzity barev ve vybraných intervalech (červená 130-200, zelená 100-150, modrá 55-115), budou v binárním obraze bílé a zbylé pixely budou černé.
•
Tabulka LUT (look-up table) – je užitečným nástrojem pro vyvažování barev v
•
obrazu. Je to převodní tabulka, která upravuje vztah mezi vstupní a výstupní hodnotou barev: hodnota vstupního obrazového bodu je použita jako index na určité místo v tabulce hodnot a výsledná hodnota je potom zaměněna hodnotou nalezenou na tomto místě tabulky LUT. Tímto způsobem lze např. vzájemně přizpůsobovat barevné profily různých zařízení. Histogram – graf, který ukazuje zastoupení jednotlivých jasů a stínů na snímku. Na vodorovné ose jsou jednotlivé odstíny jasu (od černé až po bílou, je jich obvykle 256), na svislé ose počet pixelů v dané úrovni jasu. Ukazuje např. na příliš velké jasy (vypálená místa) na snímku tím, že graf bude v pravé části dosahovat vysokých hodnot (velká četnost zastoupení světlých pixelů – viz obrázek níže). Naopak, pokud bude vlevo graf vysoko, někde na snímku budou velmi tmavá místa (velká četnost zastoupení tmavých pixelů).
• •
• • •
• •
• • •
•
Eroze – objekty se po provedení eroze zmenší, neboť se ubere jedna nebo více řad pixelů z jejich okrajů. Je-li objekt nebo úzký výběžek menší, než ubíraná šířka, zmizí z obrazu. Dilatace – po dilataci jsou objekty zvětšeny, což znamená, že k objektu je přidána slupka (jedna nebo více řad pixelů). Je-li vzdálenost mezi dvěma objekty menší, než dvojnásobná tloušťka slupky, objekty se spojí. Je-li otvor v objektu užší, než dvojnásobná tloušťka slupky, zmizí z obrazu. Otevření – je vlastně eroze následovaná dilatací, takže velikost objektů se nijak významně nemění. Otevření vyhlazuje kontury, maže malé objekty a rozpojuje částice spojené tenkou šíjí. Zavření – je dilatace následovaná erozí, takže velikost objektů není podstatně dotčena. Vyhladí obrysy tím, že zaplní malé okrajové trhliny, zaplní malé díry a také může spojit blízké objekty. Objekt / Pozadí – objekty jsou oblasti ve snímku, které ukazují pro pozorovatele důležité předměty (např. osoba na fotografii, preparát pod mikroskopem, předmět položený na scanner). Pozadí je vše co na snímku obklopuje objekty a může usnadnit nebo rušit případnou analýzu (např. podložka pod preparátem, okolí fotografované osoby, …) Planimetrické veličiny – vzdálenost, plocha, úhel, … Cirkularita (kruhovost) - V programu NIS-Elements je kruhovost rovna jedné pouze pro kruh; všechny ostatní tvary jsou charakterizovány kruhovostí menší než 1. Je to odvozená míra tvaru počítaná z plochy a obvodu. Tento příznak je užitečnou charakteristikou tvaru a počítá se podle vztahu: Kruhovost = 4·π·Plocha/Obvod2 Morfologické funkce – funkce týkající se tvaru objektů v obraze (většinou binárním) Detekce hran – funkce vyhledávající v obraze uživatelem definované skoky (rychlé změny) intenzity pixelů; oblasti, kde dochází k těmto skokům program označí jako hrany Separace binárních objektů – oddělení dotýkajících se objektů podle uživatelem definovaného algoritmu; program pomocí určitého strukturního elementu hledá v obraze úzká místa (krčky) mezi objekty a ty potom přetne křivkou a barvě pozadí Skelet – funkce vytváří kostru objektů binárního obrazu, linky kostry jsou 1 pixel široké a popisují osy a těžiště každého objektu
• • • •
Binární operace – funkce provádějící logické operace (AND, OR, NAND, NOR, negace) s dvěma binárními obrazy, jedním jako referenčním a druhým aktuálně upravovaným Maska (také ROI) – plocha, která vyznačuje část obrazu, která má být analyzována; vše co je uvnitř masky bude změřeno, co je vně nebude do měření zahrnuto; maska slouží k odstranění nežádoucích objektů v obraze Profil intenzity – tato funkce zobrazí barevnou intenzitu pixelů podél uživatelem definované úsečky Taxonomie – třídění objektů do skupin
