Stanovení termodynamických dat pomocí titrační kalorimetrie Karel Řehák, Ústav fyzikální chemie VŠCHT Praha
1. Úvod Titrační kalorimetrie je technika, která je v současné době intenzivně používaná pro studium termodynamiky mezimolekulárních interakcí. Nachází uplatnění při studiu biologicky aktivních látek (protein–ligand, protein–nukleová kyselina, protein–protein interakce), v supramolekuární chemii (komlexační rekace s cyklodextriny nebo crown ethery). Obecně lze tyto interakce modelovat reakcemi makromolekuly M s menšími ligandy X podle schématu M + X → MX MX + X → MX 2 (1) M MX ( n-1) + X → MX n který je možno souhrnně zapsat ve tvaru M + n X → MX n
(2)
Pro uvedený děj, titrační kalorimetrie umožňuje vyhodnotit důležitá termodynamická data, která charakterizují kvalitu interakce mezi M a X. Konkrétně se jedná se o rovnovážnou konstantu K (tzv. binding constant) a reakční teplo ΔH0 (tzv. heat of binding) a parametr n (number of sites), kterým je dána stechiometrie studovaného procesu. Následně lze ze získaných dat vyhodnotit standardní reakční Gibbsovu energii ΔG0 ΔG 0 = − RT ln K
(3)
a standardní reakční změnu entropie ΔH 0 − ΔG 0 ΔS = (4) T Podle hodnoty ΔG0 je možno usoudit „jak ochotně“ reakce probíhá. Záporné hodnoty ΔG0 indikují, že reakce probíhá zleva doprava. Čím je hodnota zápornější, tím reakce probíhá ochotněji (tím větší je i hodnota K). Jsou-li hodnoty ΔG0 kladné, reakce samovolně neprobíhá tak, jak je zapsaná. Reakce by probíhala samovolně zprava doleva. 0
Z definiční rovnice Gibbsovy energie, kterou pro konstantní teplotu můžeme zapsat ve tvaru ΔG 0 = ΔH 0 − T ΔS 0 0
(5) 0
0
plyne, že hodnota ΔG se skládá ze dvou členů entalpického (ΔH ) a entropického (–TΔS ). Záporná hodnota reakční entalpie (tj. teplo se uvolňuje) indikuje, že v reakci převládá energie uvolněná při tvorbě vazeb v produktu. Naopak kladná hodnota ΔH0 (tj., teplo se spotřebovává) naznačuje, že v reakci převládá energie spotřebovaná na štěpení vazeb.
Reakční změna entropie souvisí s výslednou neuspořádaností děje. Záporné hodnoty ΔS0 znamenají, že neuspořádanost reakcí klesla. Kladné hodnoty naznačují, že neuspořádanost stoupla. V případě reakcí (1) je zřejmé, že dochází ke vzniku větší uspořádanosti a tudíž ΔS0 je záporné. Aby vznikaly stabilní sloučeniny MXn, musí být ΔG0 záporné. To znamená, že kladná hodnota členu (–TΔS0) musí být převážena dostatečně velkou zápornou hodnotou ΔH0, která indikuje vznik pevných vazeb.
2. Úlohy pro Odyssey simulace 2.1 Komplexace 18-crown-6-etheru s KCl 1. Pomocí strukturního editoru Odyssey vytvořte molekulu 18-crown-6-etheru (viz obr. 1) a přidejte atom draslíku a chloru. Atomy KCl umístěte blízko středu a použijte funkci „Minimize“, která nalezne energeticky nejvýhodnější uspořádání vytvořených struktur.
O O
O
O
O O Obr. 1. Strukturní vzorec 18-crown-6-etheru a jeho model
2. Použijte zobrazení „Space Filling“ a spusťte simulaci. 3. Sledujte vznik stabilního komplexu crownetheru s kationem K+. 4. Pozorujte simulaci při různých teplotách.
Obr. 2. Komplex 18-crown-6-etheru s kationem K+
2.2 Komplexace crownetherů s různými ionty 1. Pomocí strukturního editoru Odyssey vytvořte molekuly 12-crown-4-etheru, 15-crown-5etheru a 18-crown-6-etheru. (Ve značení x-crown-y-ether je x celkový počet atomů v kruhu a y je počet atomů kyslíku.) 2. Přidejte ionty Li+, Na+ a K+. 3. Použijte zobrazení „Space Filling“. 4. Vytvořte celu, ve které bude od každého etheru jedna molekula a od každého iontu 10 částic. 5. Spusťte animaci a dle potřeby měňte velikost cely a teplotu. 6. Pokuste se najít odpověď: a) Bude každá molekula crownetheru kompletovat s jiným iontem? b) Dojde zvyšováním teploty k rozpadu komplexu?
3. Vyhodnocení rovnovážné konstanty K a reakční entalpie ΔH0 z kalorimetrických dat 3.1 Popis kalorimetru a jeho funkce Hlavní součásti isotermního titračního kalorimetru jsou dvě stejné cely (měřicí a referenční), dávkovací stříkačka s míchadlem a elektronika, která udržuje konstantní teplotu, detekuje tepelný tok mezi měřicí a referenční celou a ovládá automatizovanou titraci. 8
3
1 měřicí cela 2 referenční cela 3 injekční stříkačka titračního zařízení 4 motorek umožňující rotaci stříkačky 5 tepelná izolace 6 zesilovač signálu tepelného toku 7 záznam závislosti tepelného toku na čase v průběhu titrace 8 krokový motorek titrátoru
4
5
1 7 μJ/s
2
min
6
Obr. 3. Hlavní součásti titračního kalorimetru
Měřicí cela o známém objemu V0 se naplní odplyněným roztokem makromolekuly M (např. 18-crown-6-etheru) o koncentraci (cM)cel a dávkovací stříkačka roztokem ligandu L (např. KCl) o koncentraci (cX)tit. (Referenční cela je obvykle naplněna čistou vodou.) Pomocí ovládacího softwaru kalorimetru se naprogramuje sekvence jednotlivých titračních přídavků (objemy Vtit). Spuštěním chodu celé sekvence se odstartuje kalorimetrické měření, během kterého elektronika kalorimetru zaznamenává tepelný tok (obvykle v μJ/s) mezi měřicí a referenční celou. Kalorimetrický signál monitorovaný pomocí počítače v závislosti na čase má v tomto případě tvar série píků (viz obr. 3). Softwarovou integrací jednotlivých píků se získají tepla (dQ) odpovídající jednotlivým přídavkům roztoku ligandu do cely. 3.2 Vyhodnocení experimentu Z experimentálních dat je možno vyhodnotit tzv. Wisemanovu isotermu [1], což je závislost tepla dQ normalizovaného změnou koncentrace ligandu, tj. (dQ/d(cX)cel)exp na poměru celkové koncentrace ligandu a makromolekuly Xr = (cX) cel /(cM) cel. ----Pozn.: V případě, kdy se jedná o experimentální data, teplo označované dQ a změnu koncentrace označovanou d(cX)cel lze chápat jako ΔQ a Δ(cX)cel, neboli jako uvolněné teplo a změnu celkové koncentrace ligandu X v měřicí cele způsobené titračním přídavkem. ----Experimentální křivka bude mít tvar, který určují jednak koncentrace (cX)tit a (cM)cel a dále rovnovážná konstanta K, entalpie ΔH0 a parametr n, který odpovídá stechiometrii reakce (2). Neboli ⎛ dQ ⎞ 0 ⎜ d(c ) ⎟ = f exp ( X r , K , ΔH , n) X cel ⎠ exp ⎝
(6)
Vyhodnocení rovnovážné konstanty K entalpie ΔH0 a parametru n z těchto experimentálních dat, je náročnější matematický optimalizační proces, který zavádí vypočtené hodnoty (dQ/d(cX) cel)vyp Omezíme-li se pouze komplexační reakce (1), které probíhají v poměru M:L = 1:1 (tj. n = 1), lze ⎛ dQ ⎞ 0 ⎜ d(c ) ⎟ = f vyp ( X r , K , ΔH , n = 1) X cel ⎠ vyp ⎝
(7)
explicitně vyjádřit následujícím postupem. Probíhá-li reakce M + X → MX (8) je uvolněné (či spotřebované) teplo dQ úměrné látkovému množství vzniklého komplexu dnMX a příslušné reakční entalpii ΔH0 podle vztahu
dQ = dnMX ΔH 0
(9)
Změnu látkového množství komplexu MX lze vyjádřit pomocí změny koncentrace v objemu V0, tj. dQ = dcMXV0 ΔH 0 Podělením rovnice změnou koncentrace d(cX)cel dostaneme
(10)
dcMX ⎛ dQ ⎞ 0 ⎜ d(c ) ⎟ = d(c ) V0 ΔH X cel ⎠ vyp X cel ⎝
(11)
Derivaci (dcMX/ d(cX) cel ) získáme ze vztahu pro rovnovážnou konstantu reakce (8) c K = MX cM cX
(12)
kde cX, cM a cMX jsou (neznámé) rovnovážné koncentrace příslušných látek. ----Pozn.: Takto uvedená rovnovážná konstanta bude mít rozměr (koncentrace)–1, což není z termodynamického hlediska správně. Rovnovážná konstanta je ve skutečnosti bezrozměrná veličina a správný zápis rovnice (12) by měl být c K = MX cst cM cX kde cst je standardní koncentrace 1 mol/dm3. Vzhledem k tomu, že ve většině publikací se rovnovážné konstanty uvádí dle vztahu (12), bude v následujícím textu také používán tento „klamný“ zápis a z něho vyplývající rozměr rovnovážné konstanty. ----Pomocí koncentrací cX, cM a cMX je možno vyjádřit celkové koncentrace (v měřicí cele) (cX )cel = cX + cMX (13)
(cM )cel = cM + cMX =
cMX + cMX K cX
(14)
Z rovnice (13) vyjádříme rovnovážnou koncentraci cX a dosadíme ji pravé strany rovnice (14), čímž získáme kvadratickou rovnici pro koncentraci cMX. 2 cMX + cMX [−(cM )cel − (cX )cel − 1/ K ] + (cM )cel (cX )cel = 0
(15)
Reálný kořen této rovnice udává vztah cMX =
−b − b 2 − 4c 2
(16)
kde b = [−(cM )cel − (cX )cel − 1/ K ], c = (cM )cel (cX )cel
(17)
Derivaci (dcMX/ d(cX)cel) potřebnou ve vztahu (11), získáme derivací rovnice (16) podle (cX)cel dcMX 1 − (1 + r ) / 2 + X r / 2 1 = + (18) d(cX )cel 2 X r2 − 2 X r (1 − r ) + (1 + r ) 2 kde r=
1 , K (cM )cel
Xr =
(cX )cel (cM )cel
(19)
Dosazením výsledného vztahu (18) do funkční závislosti (11) získáme konečný vztah ⎡1 ⎛ dQ ⎞ ⎜ d(c ) ⎟ = ⎢ 2 + X cel ⎠ vyp ⎝ ⎣
1 − (1 + r ) / 2 + X r / 2
⎤ 0 ⎥ V0 ΔH X − 2 X r (1 − r ) + (1 + r ) ⎦ 2 r
2
(20)
který v sobě zahrnuje K a ΔH0 jakožto parametry. Tyto veličiny se vyhodnotí vhodnou optimalizací.
Pro účely této práce použijeme cílovou funkci ve formě součtu čtverců odchylek ⎡⎛ dQ ⎞ ⎛ dQ ⎞ ⎤ F = ∑ ⎢⎜ −⎜ ⎟ ⎟ ⎥ i =1 ⎢⎝ d(cX ) cel ⎠ vyp ⎝ d(cX )cel ⎠exp ⎦⎥ ⎣ N
2
(21)
kde N je celkový počet titračních přídavků (počet experimentálních bodů). Tuto funkci budeme minimalizovat pomocí nástroje „Řešitel“ programu MS Excel.
4. Zadání úlohy
Pro stanovení rovnovážné konstanty komplexace a komplexačního tepla 18-crown-6-etheru s KCl byl připraven roztok crown etheru (M) o koncentraci 9 mmol/dm3 a roztok chloridu draselného (X) o koncentraci 100 mmol/dm3. Roztok M byl nadávkován do měřicí cely kalorimetru o objemu 1,45 cm3. Roztokem X byl naplněn injektor kalorimetru. Byl sestavena sekvence titračních přídavků roztoku X do cely. Objemy jednotlivých přídavků jsou uvedeny v tabulce 1. Proběhlo kalorimetrické měření celé sekvence při 25 °C, jehož výstupem byla závislost tepelného toku mezi měřicí a referenční celou na čase (viz obr. 3). Software kalorimetru zintegroval jednotlivé píky signálu a vypočetl příslušná tepla dQ (viz tabulka 1). Tabulka 1. Základní experimentální data Č. přídavku 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Vtit μL 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
dQ mJ -15.353 -15.383 -15.270 -15.262 -15.212 -15.175 -15.184 -15.119 -15.103 -14.983 -14.883 -14.874 -14.736 -14.530 -14.353
Č. přídavku pokračování 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Vtit μL
dQ mJ
5 5 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
-14.155 -13.971 -26.454 -24.279 -21.134 -17.135 -12.734 -9.110 -6.364 -4.418 -3.244 -2.407 -1.846 -1.441 -1.158
Z uvedených údajů 1. vyhodnoťte Wisemanovu isotermu 2. vypočtěte rovnovážnou konstantu K a reakční teplo ΔH0 za předpokladu, že reakce probíhá se stechiometrií 1:1. 3. určete standardní reakční Gibbsovu energii ΔG0 a entropii ΔS0 příslušné reakce.
5. Návod řešení úlohy
1. 2. 3. 4.
Vyhodnocení experimentu provádějte pomocí programu MS Excel Při programování vzorců dbejte na správný převod jednotek. Vytvořte tabulku se vstupními experimentálními daty, do které vyplňte údaje z tabulky 1 Do buněk nad vytvořenou tabulku uložte výchozí koncentraci roztoku M v cele (cM)cel, koncentraci roztoku ligandu v titrátoru (cX)tit, objem měřicí cely V0 a teplotu experimentu T. 5. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet d(cX)cel, který bude vypočítávat o kolik se po každém přídavku změnila celková koncentrace ligandu X v cele. 6. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet (cX)cel, který bude v každém bodě vypočítávat celkovou koncentraci ligandu v cele. 7. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet Xr = (cX) cel /(cM) cel. 8. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet (dQ/d(cX)cel)exp, což reprezentuje teplo dQ normalizované změnou celkové koncentrace ligandu v cele. 9. Vytvořte graf – Wisemanovu isotermu, neboli závislost (dQ/d(cX)cel)exp na Xr. 10. Do dvou buněk zadejte 1. aproximace (tj. odhad) hodnot K a ΔH0. Hodnotu K volte v jednotkách tisíců (dm3/mol) a hodnotu ΔH0 volte v záporných desítkách tisíc (J/mol). 11. Do další buňky či sloupce tabulky vypočtěte pomocnou veličinu r (viz rovnice 19). 12. Do tabulky naprogramujte vztah pro (dQ/d(cX) cel)vyp (viz rovnice 20). Vypočtené hodnoty přidejte do již vytvořeného grafu s Wisemanovou isotermou. Pokud jsou výpočty v pořádku, neměla by nově přidaná (vypočtená) křivka být příliš vzdálená od křivky experimentální. Pokud tomu tak není, překontrolujte výpočty - zejména převody jednotek. 13. Pokuste se 1. aproximaci hodnot K a ΔH0 zkusmo pozměnit tak, aby se vypočtená křivka přiblížila křivce experimentální. 14. Do dalšího sloupce tabulky přidejte kvadráty odchylek hodnot (dQ/d(cX)cel)vyp a (dQ/d(cX)cel)exp a do buňky sečtěte hodnoty celého sloupce. Tato buňka reprezentuje objektivní funkci F (viz rovnice 21). 15. Spusťte nástroj „Řešitel“. Nastavujte buňku s F na minimální hodnotu. Jako měněné buňky zadejte buňky s aproximací K a ΔH0. Pokud optimalizace proběhne v pořádku, měli byste v grafu zaznamenat, že experimentální i vypočtená křivka je téměř shodná. Pokud tomu tak je, hodnoty buněk s K a ΔH0 lze považovat za výsledek. 16. Nakonec z výsledných hodnot K a ΔH0 vypočtěte hodnoty ΔG0 a ΔS0 (viz vztah 3 a 4). 6. Literatura
[1]
Wiseman T, Williston S., Brandts J.F., Lin L.-N., Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Usány a New Titration Calorimeter, Analytical Biochemistry 179, 1989, 131–137.
7. Příloha
Vyhodnocení úlohy – PDF dokument určený pro asistenty (vyžaduje heslo).
Práce vznikla za podpory grantu FRVŠ č. 2028/2007.
