Biofyzikální chemie interakce bílkovin s ligandy, koloidy v biochemii, rovnováha na membránách Zita Purkrtová březen – duben 2012
Interakce bílkovin s ligandy `
vratné interakce ` množství ligandu vázaného na bílkovinu závisí na jeho koncentraci v roztoku
`
ligand = látka vázající se na molekulu bílkoviny (susbtrát, efektor, přenášené látky, ion, mastná kyselina atd.)
`
otázka specifity
`
uplatňuje se celá škála nekovalentních interakcí dle povahy ligandu (ion, polární x nepolární organická látka) – kombinace různých typů nekovalentních interakcí
`
Základní otázky: ` KOLIK ? ` JAK PEVNĚ? ` KDE? ` PROČ?
Interakce bílkovin s ligandy `
Biopolymer má jedno vazebné místo
P + L ⇔ PL
K
A
=
[LP ] = [L ][P ]
1 KD
Rozsah vazby (r) = počet molů vázaných ligandů na jeden mol bílkoviny
r =
[LP ] = C
p
[LP ] = [P ] + [LP ]
K A [L ] 1 + K A [L ]
Interakce bílkovin s ligandy P + L ⇔ PL `
Biopolymer má jedno vazebné místo
r =
r
[LP ] = C
p
[LP ] = [P ] + [LP ]
K A [L ] 1 + K A [L
r
[L]
[L]
]
P + L ⇔ PL
Scatchardův výnos
r = K [L ]
A
− K Ar
r/[L]
K A [L ] r = 1 + K A [L ]
r
Interakce bílkovin s ligandy `
Biopolymer má n vazebných míst pro daný ligand
P + L ⇔ PL 1 PL 1 + L ⇔ PL 2 PL n −1 + L ⇔ PL n
Interakce bílkovin s ligandy `
Biopolymer má n vazebných míst pro daný ligand, která jsou rovnocenná a nezávislá ⇒ vnitřní asociační konstanta kA Rozsah vazby = průměrný počet ligandů vázaný na jednu molekulu bílkoviny
r=
moly vázaného ligandu moly proteinu
Stupeň asociace = frakce vazebných míst obsazených ligandem
moly vázaného L C L − [L ] r β = = = vazebná místa v systému nC P n frakce obsazených míst β = = k A [L ] frakce vol ných míst 1− β `
Rovnice vazebné isothermy
nk A [L ] r = 1 + k A [L ]
r n 1−
r n
= k A [L]
Rovnocenná a nezávislá vazebná místa nk A [L ] 1 + k A [L ]
`
r/[L]
r =
Scatchardův výnos
r = n.kA - kA.r [L]
r
Vzájemně kooperující vazebná místa Scatchardův výnos
α=1
α = 0,5
Hillova konstanta
r=
nk [L ]
α
α
1 + k [L ] α
α
1 ≤ α ≤ n α = 1,5 α < 1 ..... negativní kooperativa α > 1 .....positivní kooperativa α = n ..... dokonale kooperativní systém
Current Protocolc in Protein Science. DOI: 10.1002/0471140864.psa05as16
Current Protocolc in Protein Science. DOI: 10.1002/0471140864.psa05as16
Vzájemně kooperující vazebná místa
`
vzájemně nezávislá vazebná centra
r=
∑ i
ni k i [L] 1 + k i [L]
Scatchardův výnos
Lajtha, A:Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology. New York, USA, 2007.
Několik typů vazebných míst
Lajtha, A:Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology. New York, USA, 2007.
Nespecifická vazba
Experimentální určení
r=
nk A [L ] r = n.kA - kA.r 1 + k A [L ] [L]
jakkákoliv experimentálně dostupná změna ve struktuře proteinu po vazbě ligandu
`
metody citlivé na změnu relativní molekulové hmotnosti ` polarisace fluorescence ` elektroforetické metody ` ultracentrifugační metody ` metody využívající rozptyl světla
`
metody dialysačních rovnováh Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.
`
Metoda dialysační rovnováhy systém s polopropustnou membránou propouštějící jen nízkomolekulární látku, jejíž vazba na makromolekulu je zkoumána ` systém obsahující: A) pouze nízkomolekulární B) nízkomolekulární a vysokomolekulární látku látku `
vzájemná vazba
Metoda dialysační rovnováhy F
B
F
B
`
pro určení stechiometrie vazby (počtu vazebných míst)
`
pro systémy s vysokou afinitou vazby (nízká disociační konstanta) Current Protocolc in Protein Science. DOI: 10.1002/0471140864.psa05as16
Stechiometrická titrace
Disperzní soustavy koloidní systémy Heterogenní systémy (makroskopické fáze)
Homogenní Atomy, malé molekuly
kouř
makromolekuly
10 -10
10 -9
1 micely
10 -7
koloidy
homogenní
0,1
10 -8
10
102 viry
10 -6
10 -5
10 -4
10 -3
m
heterogenní mikroskopické
103 pyl, bakterie
104
105
6 10nm
Disperzní soustavy `
„Soustava, která obsahuje alespoň dva druhy hmoty, přičemž jeden druh je rozptýlen ve druhém ve formě více nebo méně jemných částic. Rozptýlený druh se nazývá disperzní podíl, spojitý druh disperzní prostředí. Pod pojmem druh hmoty se rozumí složka nebo fáze. Disperzní podíl může i nemusí představovat samostatnou fázi a svým chemickým složením se může, ale nemusí vždy lišit od disperzního prostředí. Podle toho mluvíme o disperzní fázi nebo disperzní složce.“ (Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005) Analytické disperze (pravé roztoky) < 1 nm homogenní systémy, tvoří jedinou fázi roztoky solí, kyselin a zásad
Koloidní disperze 1 – 500 (1000) nm
Hrubé disperze > 500 (1000) nm
Mikroheterogenní systémy (plazma, roztoky makromolekulárních látek)
Heterogenní systémy (krev, mléko)
Disperzní soustavy
Disperzní prostředí
Plyn Plyn
(všechny plyny
Disperzní podíl Kapalina kapalný aerosol (mlha, vlasový sprej)
Pevná látka pevný aerosol (kouř, prach)
zcela mísitelné)
Kapalina
pěna (pěna na holení)
Pevná látka
pevná pěna
emulze (mléko, majonéza)
gel
(aerogel, polystyrenová pěna) (agar, želatina)
sol (krev)
pevný sol
Koloidní disperze `
průměr disperzních částic 10-9 < d < 10-6 m
`
viditelné v ultramikroskopu nebo elektronovém mikroskopu
`
vykazují Tyndallův efekt a rozptyl světla
`
procházejí filtračním papírem ale ne některými mebránami
`
vykonávají tepelný pohyb
`
vykazují pomalou difuzi a sedimentaci
`
vyvolávají malý osmotický tlak (roste se stupněm disperzity)
roztok
suspenze
koloidy
Roztoky makromolekul
Heterogenní koloidy
Asociativní koloidy
disperzní částice jsou
monomolekulární
polymolekulární
polymolekulární
vznikají
samovolným rozpouštěním
z hrubých disperzí umělým dispergováním nebo z pravých roztoků srážením
vznikají asociací z pravých roztoků amfifilních molekul
homogenní
heterogenní nestálé – koagulují, sedimentují, stárnou
stabilní v určitém rozmezí podmínek
Srovnání disperzních systémů Hrubé disperze
Koloidní disperze
Analytické disperze
−
neprojdou semipermeabilními
+
oddělitelnost
papírové filtry
membránové filtry
-
Pozorovatelnost částic
oko, viditelná mikroskopie
elektronová mikroskopie
−
+
ultracentrifugace
−
malý
střední
vysoký
Koligativní vlastnosti
−
malé
velké
Difuze
−
pomalá
rychlá
často opalescence
opalescence (Tyndallův efekt)
průhledné
Průchod membránou
Sedimentace Tepelný pohyb
Optické vlastnosti
Koloidní systémy `
lyofilní x lyofobní koloidy
Optické vlastnosti koloidů `
Tyndallův efekt
`
využití rozptylu světla
Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005
Optické vlastnosti koloidů `
využití rozptylu světla – dynamic laser scattering
εk `
2 1 3 = m u = k BT 2 2
u větších částic (efektivního průměru kolem 4 μm) již tepelný pohyb není pozorovatelný
Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005
Brownův pohyb
Asociace disperzních soustav vzájemné interakce dispergace agregace koalescence koagulace
vliv gravitace sedimentace
krémování
Difuze Fickův zákon
Δc j = −D Δx
D = D0 e
−
g R .T
Koligativní vlastnosti `
vlastnosti rozpouštědla, které závisí pouze na množství částic rozpuštěné látky a ne na charakteru těchto částic
`
Raoultův zákon (snížení tenze nasycených par rozpouštědla nad roztokem ⇒ snížení teploty tuhnutí rozpouštědla a zvýšení teploty varu ve srovnání s čistým rozpouštědlem)
`
osmotický tlak čistá voda látka neprocházející membránou
píst
van´t Hoffova rovnice
π = c2 RT =
polopropustná membrána
w2 RT M2
Osmotický tlak koloidních soustav `
zředěné ideální koloidní systémy
w2 π = v2 k BT = RT M2 `
neideální roztoky
w2 π = RT ( + Bw22 + ....) M2 `
osmotický tlak klesá s rostoucí velikostí částic (⇒ vliv agregace)
`
měření osmotického tlaku se využívá ke stanovení molární hmotnosti vysokomolekulárních látek tvořících pravé roztoky
Polopropustné membrány `
polopropustnost (semipermeabilita) membrány ......
`
...... je dána vlastnostmi membrány a jejich monomerů
Rovnováha na polopropustné membráně
0 ~ μi = μi + RT ln ai + zi Fϕ
elektrochemický potenciál
Δϕ … membránový potenciál
rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu
Membrána je propustná pouze pro jeden typ iontů Na+ Cl-
1
μ~
Na
2
= μ Na + RT ln a Na + z Na Fϕ 0
μ Na 0 + RT ln a Na1 + z Na Fϕ1 = μ Na 0 + RT ln a Na 2 + z Na Fϕ 2 c Na1 RT ϕ 2 − ϕ1 = Δϕ M = ln z Na F c Na 2
Membrána je propustná pro nízkomolekulární látky ale ne pro nabité makromolekuly Na+ Cl-
Donnanova rovnováha
biopolymer
RT c Na1 ln Δϕ M = F c Na 2 RT cCl 2 ln Δϕ M = F cCl1
RT c Na1 RT cCl 2 ln ln = F c Na 2 F cCl1
c Na1cCl1 = c Na 2 cCl 2
(c
Na , protein
+ x ).x = ( x0 − x )( . x0 − x )
Membrána je propustná pouze pro molekuly rozpouštědla
glukosa
π = RT ∑ ci
`
i Osmolarita = množství osmoticky aktivních částic v 1 dm3 - 1 M glukosa je 1 Osm - 1 M NaCl je 2 Osm - 1 M AlCl3 je 4 Osm
`
isotonický roztok pro krevní buňky 310 mOsm (tj. 310 mM roztok glukosy či 155 mM NaCl)
hypotonické prostředí
hypertonické prostředí
hypotonické prostředí
hypertonické prostředí
isotonické prostředí
Osmotický tlak a buňka
Fyziologické využití osmotického tlaku
sval, šlachy
chrupavka
kost
Fyziologické využití osmotického tlaku
membrána polopropustná pouze pro NaCl
Děkuji za pozornost.
