Biofyzikální chemie interakce bílkovin s ligandy, koloidy v biochemii, rovnováha na membránách. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Biofyzikální chemie interakce bílkovin s ligandy, koloidy v biochemii, rovnováha na membránách Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Hydrofobní interakce mísení dvou „jednoduchých“ málo mísitelných kapalin (panel A) 40

energie [kJ/mol]

10

G

30

G TS

20 0 -10 -20

A

-30

20

H

10 0 -10

TS

-20

B

-30

-40

Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.

40

H

30

energie [kJ/mol]

mísení oleje s vodou (panel B)

-40

250

300

350

400

teplota [K]

450

250

300

350

400

teplota [K]

450

Hydrofobní interakce přenos benzen-voda

přenos benzen-benzen

Interakce bílkovin s ligandy 

vratné interakce  množství ligandu vázaného na bílkovinu závisí na jeho koncentraci v roztoku



ligand = látka vázající se na molekulu bílkoviny (substrát, efektor, přenášené látky, ion, mastná kyselina atd.)



otázka specifity



uplatňuje se celá škála nekovalentních interakcí dle povahy ligandu (ion, polární x nepolární organická látka) – kombinace různých typů nekovalentních interakcí



Základní otázky:  KOLIK ?  JAK PEVNĚ?  KDE?  PROČ?

Interakce bílkovin s ligandy 

Biopolymer má jedno vazebné místo

P  L  PL

KA

 LP   LP

1 KD

Rozsah vazby (r) = počet molů vázaných ligandů na jeden mol bílkoviny

 LP r  Cp

LP   K A L P   LP 1  K A L

Interakce bílkovin s ligandy P  L  PL 

Biopolymer má jedno vazebné místo

r 

r

LP  Cp

LP   K A L P   LP 1  K A L

r

[L]

[L]

P  L  PL

Scatchardův výnos

r  K A  K Ar L 

r/[L]

K A L  r 1  K A L 

r

Interakce bílkovin s ligandy 

Biopolymer má n vazebných míst pro daný ligand

P  L  PL1 PL1  L  PL 2 PL n 1  L  PL n

Interakce bílkovin s ligandy 

Biopolymer má n vazebných míst pro daný ligand, která jsou rovnocenná a nezávislá  vnitřní asociační konstanta kA

Rozsah vazby = průměrný počet ligandů vázaný na jednu molekulu bílkoviny

r

moly vázaného ligandu moly proteinu

Stupeň asociace = frakce vazebných míst obsazených ligandem

moly vázaného L CL  L r    vazebná místa v systému nCP n frakce obsazených míst    k A L frakce volných míst 1  

Rovnice vazebné isothermy

nk A L r  1  k A L

r n 1

r n

 k A L

Rovnocenná a nezávislá vazebná místa nk A L 1  k A L



r/[L]

r 

Scatchardův výnos

r  n.kA - kA.r L

r

Vzájemně kooperující vazebná místa 1

Scatchardův výnos

  0,5

  1,5

Hillova konstanta

r

nk L





1  k L 



1  n  = n ..... dokonale kooperativní systém  > 1 ..... positivní kooperativa  = 1 ..... nulová kooperativa   1 ..... negativní kooperativa

Current Protocols in Protein Science. DOI: 10.1002/0471140864.psa05as16

Current Protocolc in Protein Science. DOI: 10.1002/0471140864.psa05as16

Vzájemně kooperující vazebná místa



vzájemně nezávislá vazebná centra

r

 i

ni k i L 1  k i L

celková křivka

Scatchardův výnos vazebné místo B vazebné místo A

Lajtha, A:Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology. New York, USA, 2007.

Několik typů vazebných míst

Lajtha, A:Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology. New York, USA, 2007.

Nespecifická vazba

Experimentální určení

r

nk A L r  n.kA - kA.r 1  k A L L

jakkákoliv experimentálně dostupná změna ve struktuře proteinu po vazbě ligandu



metody citlivé na změnu relativní molekulové hmotnosti  polarisace fluorescence  elektroforetické metody  ultracentrifugační metody  metody využívající rozptyl světla



metody dialysačních rovnováh Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.



Metoda dialysační rovnováhy systém s polopropustnou membránou propouštějící jen nízkomolekulární látku, jejíž vazba na makromolekulu je zkoumána  systém obsahující: A) pouze nízkomolekulární B) nízkomolekulární a vysokomolekulární látku látku 

vzájemná vazba

Metoda dialysační rovnováhy F

B

F

B



pro určení stechiometrie vazby (počtu vazebných míst)



pro systémy s vysokou afinitou vazby (nízká disociační konstanta) Current Protocolc in Protein Science. DOI: 10.1002/0471140864.psa05as16

Stechiometrická titrace

Disperzní soustavy koloidní systémy

Heterogenní systémy (makroskopické fáze)

Homogenní Atomy, malé molekuly

kouř

makromolekuly

10 -10

10 -9

1

micely

10 -7

koloidy

homogenní

0,1

10 -8

102

10

viry

10 -6

10 -5

10 -4

10 -3

m

heterogenní mikroskopické

103

pyl, bakterie

104

105

6 10nm

Disperzní soustavy 

„Soustava, která obsahuje alespoň dva druhy hmoty, přičemž jeden druh je rozptýlen ve druhém ve formě více nebo méně jemných částic. Rozptýlený druh se nazývá disperzní podíl, spojitý druh disperzní prostředí. Pod pojmem druh hmoty se rozumí složka nebo fáze. Disperzní podíl může i nemusí představovat samostatnou fázi a svým chemickým složením se může, ale nemusí vždy lišit od disperzního prostředí. Podle toho mluvíme o disperzní fázi nebo disperzní složce.“ (Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005)

Analytické disperze (pravé roztoky) < 1 nm

Koloidní disperze 1 – 500 (1000) nm

Hrubé disperze > 500 (1000) nm

Homogenní systémy, tvoří jedinou fázi roztoky solí, kyselin a zásad

Mikroheterogenní systémy (plazma, roztoky makromolekulárních látek)

Heterogenní systémy (krev, mléko)

Srovnání disperzních systémů Hrubé disperze

Koloidní disperze

Analytické disperze



neprojdou semipermeabilními

+

Oddělitelnost

papírové filtry

membránové filtry

-

Pozorovatelnost částic

oko, viditelná mikroskopie

elektronová mikroskopie



+

ultracentrifugace



malý

střední

vysoký

Koligativní vlastnosti



malé

velké

Difuze



pomalá

rychlá

často opalescence

opalescence (Tyndallův efekt)

průhledné

Průchod membránou

Sedimentace

Tepelný pohyb

Optické vlastnosti

Disperzní soustavy

Disperzní prostředí

Plyn Plyn

(všechny plyny

Disperzní podíl Kapalina kapalný aerosol (mlha, vlasový sprej)

Pevná látka pevný aerosol (kouř, prach)

zcela mísitelné)

Kapalina

pěna (pěna na holení)

Pevná látka

emulze (mléko, majonéza)

pevná pěna

gel

(aerogel, polystyrenová pěna)

(agar, želatina)

sol (krev)

pevný sol

Koloidní disperze 

průměr disperzních částic 10-9 < d < 10-6 m



viditelné v ultramikroskopu nebo elektronovém mikroskopu



vykazují Tyndallův efekt a rozptyl světla



procházejí filtračním papírem ale ne některými mebránami



vykonávají tepelný pohyb



vykazují pomalou difuzi a sedimentaci



vyvolávají malý osmotický tlak (roste se stupněm disperzity)

roztok

suspenze

koloidy

Roztoky makromolekul

Heterogenní koloidy

Asociativní koloidy

disperzní částice jsou

monomolekulární

polymolekulární

polymolekulární

vznikají

samovolným rozpouštěním

z hrubých disperzí umělým dispergováním nebo z pravých roztoků srážením

vznikají asociací z pravých roztoků amfifilních molekul

homogenní

heterogenní nestálé – koagulují, sedimentují, stárnou

stabilní v určitém rozmezí podmínek

Koloidní systémy 

lyofilní x lyofobní koloidy

Optické vlastnosti koloidů 

Tyndallův efekt



využití rozptylu světla

Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005

Optické vlastnosti koloidů 

využití rozptylu světla – dynamic/static laser scattering

2 1 3  k  mu  k BT 2 2 

u větších částic (efektivního průměru kolem 4 μm) již tepelný pohyb není pozorovatelný

Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005

Brownův pohyb

Asociace disperzních soustav vzájemné interakce

dispergace agregace koalescence koagulace

vliv gravitace

sedimentace

krémování

Difuze Fickův zákon

c j  D x

D  D0e



g R.T

Koligativní vlastnosti 

vlastnosti rozpouštědla, které závisí pouze na množství částic rozpuštěné látky a ne na charakteru těchto částic



Raoultův zákon (snížení tenze nasycených par rozpouštědla nad roztokem  snížení teploty tuhnutí rozpouštědla a zvýšení teploty varu ve srovnání s čistým rozpouštědlem)



osmotický tlak čistá voda látka neprocházející membránou

píst

van´t Hoffova rovnice

  c2 RT 

polopropustná membrána

w2 RT M2

Osmotický tlak koloidních soustav 

zředěné ideální koloidní systémy

w2   v2 k BT  RT M2 

neideální roztoky

w2   RT (  Bw22  ....) M2 

osmotický tlak klesá s rostoucí velikostí částic ( vliv agregace)



měření osmotického tlaku se využívá ke stanovení molární hmotnosti vysokomolekulárních látek tvořících pravé roztoky

Polopropustné membrány 

polopropustnost (semipermeabilita) membrány ......



...... je dána vlastnostmi membrány a jejich monomerů



…. a vede k nerovnoměrnému rozložení hmoty a náboje v okolí membrány

Co řídí transportní děje na polopropustné membráně?

0 ~ i  i  RT ln ai  zi F

elektrochemický potenciál

Elektrochemický potenciál

~i , 2  i , 2 0  RT ln ai , 2  zi F2 ~i ,1   i ,10  RT ln ai ,1  z i F1



pasivní transport látky probíhá 

směr transportu

~i ,1  ~i , 2

~i ,1  ~i , 2

rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu

Gi  ~i 

Gi   i ,1   i , 2 Gi   i , 2   i ,1

pasivní transport látky neprobíhá

~i ,1  ~i , 2

Rovnováha na polopropustné membráně ~i ,1   i ,10  RT ln ai ,1  z i F1

~i , 2  i , 2 0  RT ln ai , 2  zi F2

~i ,1  ~i , 2  i ,10  RT ln ai ,1  z i F1   i , 2 0  RT ln ai , 2  z i F 2  … membránový potenciál

  1   2    2  1

Několik poznámek na závěr …. 

bilance děje vždy pro konkrétní ion/látku, ale některé veličiny systému ovlivněny všemi látkami přítomnými v systému (ionty a makroionty v systému)



daná látka přes membránu (pasivně) neprochází, pokud dojde k vyrovnání jejich elektrochemických potenciálů 



změna Gibbsovy energie spojená s transportem přes membránu je rovna rozdílu elektrochemických potenciálů na obou stranách membrány 



ale může být přenášena aktivním transportem

pozor na směr transportu dané látky, který uvažuji!

membránový potenciál je definován určitým způsobem!

  1   2    2  1 

membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu – vně kompartmentu

   in   out

Membrána je propustná pouze pro jeden typ iontů Na+ Cl-

1

~

Na

2

  Na  RT ln aNa  z Na F 0

 Na0  RT ln aNa1  z Na F1   Na0  RT ln aNa2  z Na F2 cNa1 RT  2  1   M  ln z Na F cNa2

Membrána je propustná pro nízkomolekulární látky ale ne pro nabité makromolekuly

Na+ Cl-

Donnanova rovnováha

biopolymer

RT cNa1  M  ln F cNa2

RT cCl 2  M  ln F cCl1

RT cNa1 RT cCl 2 ln  ln F cNa2 F cCl1

cNa1cCl1  cNa2cCl 2

c

Na, protein

 x .x  x0  x  . x0  x 

Model buňky I

Model buňky II

Membrána je propustná pouze pro molekuly rozpouštědla

glukosa

  RT  ci



i Osmolarita = množství osmoticky aktivních částic v 1 dm3 - 1 M glukosa je 1 Osm - 1 M NaCl je 2 Osm - 1 M AlCl3 je 4 Osm



isotonický roztok pro krevní buňky 310 mOsm (tj. 310 mM roztok glukosy či 155 mM NaCl)

hypotonické prostředí

hypertonické prostředí

hypotonické prostředí

hypertonické prostředí

isotonické prostředí

Osmotický tlak a buňka

Fyziologické využití osmotického tlaku

sval, šlachy

chrupavka

kost

Fyziologické využití osmotického tlaku

membrána polopropustná pouze pro NaCl

Děkuji za pozornost.