Biofyzikální chemie nekovalentní interakce, prostorové uspořádání proteinů, voda. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Biofyzikální chemie nekovalentní interakce, prostorové uspořádání proteinů, voda Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Interakce v biochemii

Interakce v biochemii 

Interakce  vzájemné působení dvou nebo více činitelů



Jakých činitelů?  biopolymer a jeho části  biopolymer a nadmolekulární útvary (membrány)  rozpouštědlo a molekuly přítomné v rozpouštědle



molekula biopolymeru je komplexní systém, o to více systém biopolymer – rozpouštědlo  široká škála možných interakcí



intra- a inter- interakce



biochemické děje jsou charakteristické svou .....  ...... dynamikou  ....... vratností  .......specifitou

Chemická vazba 

kovalentní vazba  sdílení jednoho nebo více elektronových párů  stabilita vazby dána termodynamicky (vysoké vazebné energie) i kineticky (vysoké aktivační energie rozpadu)  dělení dle rozdílu elektronegativit prvků na:  iontové polární vazby – rozdíl elektronegativit > 1,7  polární kovalentní vazbu - 1,67 > rozdíl elektronegativit > 0,4  nepolární kovalentní vazbu – rozdíl elektronegativit < 0,4

Nekovalentní interakce nekovalentní interakce (vazba, síla)  nedochází ke sdílení elektronových párů  vznik a rozštěpení vazby je vratný děj probíhající bez katalyzátoru (nízká aktivační a vazebná energie)  kombinovatelnost nekovalentních interakcí  aditivita energie vazeb zvyšující stabilitu




Nekovalentní interakce    

Elektrostatické (Coulombické) interakce Vodíkové vazby van der Waalsovy interakce Hydrofobní interakce

Elektrostatické interakce

1

q1q2 F 2 4 0 r

Ca 2+

van der Waalsovy interakce •

„všechny typy interakcí, které nespadají do kategorie elektrostatických, vodíkových a hydrofobních interakcí“

•

dělení: – Interakce permanentní dipól-permanentní dipól (van der Waalsovy-Debyeovy)

Ed  d –

0 ..... permitivita vakuaa [C2.N-1. m-2]  .... dipólový moment [D=C.m] k .... Boltzmanova konstanta

Interakce permanentní dipól-indukovaný dipól (van der Waalsovy-Keesomovy)

Ed id –

212  22  2 34 0  kTr6

 2 12  1 22  4 0 2 r 6

.... polarizovatelnost molekuly

Londonovy disperzní síly (interakce přechodný dipól-přechodný dipól)

Edisp  

3 I1 I 2 1 2 2 6 24 0  I1  I 2  r

.... polarizovatelnost molekuly I ..... ionisační energie molekuly

van der Waalsovy interakce •

dělení: – patrové interakce (- interakce) • vzájemná interakce -elektronových systémů lokalizovaných pod i nad aromatickými kruhy • stabilizace dihelixů DNA a některých úseků RNA

Vodíkové vazby (můstky) 

slabě kyselý donor D-H interaguje prostřednictvím atomu vodíku s volným elektronovým párem akceptoru A

Hydrofobní interakce 

interakčním partnerem je vždy voda



pojem hydrofobní je používán ve smyslu  neschopné se mísit s vodou (tedy vytvářet vodíkové můstky s vodou)  dávající přednost nepolárnímu prostředí před vodným  přenos nepolární sloučeniny do vodného roztoku doprovázený charakteristickou teplotní závislostí termodynamických veličin  způsobující vyšší uspořádanost molekul vody v okolí molekul rozpuštěné látky



kvantitativní vyjádření hydrofobity  rozdělovací koeficient = termodynamická rovnovážná konstanta v systému vodanepolární rozpouštědlo

Hydrofobní interakce entropicky řízený děj

G = H - TSm -Sp D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005



ΔG  0, ΔH  0, ΔS  0 ΔG  0, ΔH  0, ΔS  0

Hydrofobní interakce charakteristickým rysem je velká hodnota cp přenosu nepolární sloučeniny do vody mísení dvou „jednoduchých“ málo mísitelných kapalin (panel A) 40

mísení oleje s vodou (panel B)

energie [kJ/mol]

10

G

30

G TS

20 0 -10 -20

A

-30

20

H

10 0 -10

TS

-20

B

-30

-40

Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.

40

H

30

energie [kJ/mol]



-40

250

300

350

400

teplota [K]

450

250

300

350

400

teplota [K]

450

Hydrofobní a nepolární 

?? nepolární = hydrofobní ??



Hydrofobní interakce



Hydrofobní látka



Nepolární (kovalentní) vazba



Nepolární rozpouštědlo



Nepolární látka

Typ interakce vodíkové vazby: voda (led) peptidové vazby mezi neutrální a nabitou skupinou elektrostatické interakce ion - ion interakce dvou permanentních dipólů Londonovy dispersní interakce patrové interakce hydrofobní interakce

Příklad

Vazebná energie (kJ/mol)

–O–H ...O=

17

=N–H...O=C

15

–COO-...HO–CH2–

15

–COO-...+H3N–

20-30

C+=O-... C+=O-... mezi dvěma alifatickými atomy C mezi dvěma aromatickými kruhy Phe mezi dvěma methylovými skupinami mezi dvěma postranními řetězci valinu

2 0,11 6

1,2 6

Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.

Nekovalentní interakce - souhrn

Nekovalentní interakce - rozdělení 

Termodynamické hledisko dělení:  interakce enthalpické povahy  interakce entropické povahy

G  H  T .S



Hledisko síly interakce (r-x)  interakce dalekého dosahu (x 3)  interakce krátkého dosahu (x>3)



Hledisko struktury biopolymeru  lokální interakce  nelokální interakce

Nekovalentní interakce a struktura proteinů

Nekovalentní interakce a struktura proteinů 

Hydrofobní interakce  AMK s hydrofobním/nepolárním postranním řetězcem  hydrofobní profil proteinu  rozhodující síly stabilizující nativní konformaci Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.  kvantitativní vyjádření hydrofobity  rozdělovací koeficient = termodynamická rovnovážná konstanta v systému vodanepolární rozpouštědlo modelující hydrofobní vnitřek molekuly proteinu (např. benzen či n-oktanol)



Elektrostatické interakce  klasické (nespecifické) elektrostatické interakce  destabilizující vliv v oblastech pH vzdálených od pI  specifické elektrostatické interakce (iontové páry, solné můstky)  malý stabilizující vliv iontových párů na povrchu (cca 4-5 iontových párů na 150 AMK)

Hydrofobní profil proteinu



zobrazení rozložení polárních a nepolárních AMK zbytků v rámci molekuly proteinu určení hydrofóbních/hydrofilních oblastí proteinu  pravděpodobná lokalizace AMK zbytku v rámci molekuly proteinu (povrch x vnitřek proteinu)  interakce proteinu s okolním prostředím:  hydrofilní oblasti na povrchu proteinu (a tedy potažmo antigenní)  hydrofóbní oblasti uvnitř proteinu případně reagující s membránou in silico předpověď x experimentální určení



in silico předpověď

 





různá měřítka (např. Kyte-Doolittle)



predikční programy např. ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)

experimentální určení hydrofobity AMK/proteinu:  zádrž na hydrofobní koloně  rozdělovací koeficient mezi vodnou a organickou fázi

Hydrofobní profil proteinu

http://lifespotlight.com/images/2008/08/amino-acids.gif

AMK

KyteDoolittle

HoppWoods

Ala

1,8

- 0,5

Arg

- 4,5

3,0

Asn

- 3,5

0,2

Asp

- 3,5

3,0

Cys

2,5

- 1,0

Gln

- 3,5

0,2

Glu

- 3,5

3,0

Gly

- 0,4

0,0

His

- 3,2

- 0,5

Ile

4,5

- 1,8

Leu

3,8

- 1,8

Lys

- 3,9

3,0

Met

1,9

- 1,3

Phe

2,8

- 2,5

Pro

- 1,6

0,0

Ser

- 0,8

0,3

Thr

- 0,7

- 0,4

Trp

- 0,9

- 3,4

Tyr

- 1,3

- 2,3

Val

4,2

-1,5

Hydrofobní profil proteinu pro membránové oblasti v centru hodnota min. 1,6

měřítko Kyte-Doolittle

Nekovalentní interakce a struktura proteinů 

van der Waalsovy interakce  interakce permanentní dipól-permanentní dipól četné především uvnitř molekuly (např. dvě karbonylové skupiny)  interakce permanentní-indukovaný dipól např. karbonylová skupina indukující dipól v methylové skupině  interakce přechodný dipól-přechodný dipól velmi časté – vpodstatě tak mohou reagovat každé dvě molekuly, které se přiblíží dostatečně blízko  nezanedbatelný vliv na stabilitu struktury; důležité při interakcích mezi proteinem a komplementárními ligandy



vodíkové vazby  stabilizace struktury proteinu  molekula bílkoviny může tvořit:  intramolekulární vazby v rámci molekuly  skupiny peptidové vazby  mezi neutrální a nabitou skupinou  intermolekulové vazby s molekulami rozpouštědla

H2O H2O D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Nekovalentní interakce a vazba efektoru k molekule enzymu

různé typy nekovalentních interakcí

H2O

cytochrom f krystalová struktura hemoglobinu


Vazba vody uvnitř a na povrchu molekuly proteinu

Hydratace bílkovin 

0,3 g H2O na 1 g bílkoviny, teoreticky tedy tloušťka jedné molekuly H2O



výměna molekul vody v hydratačním obalu pomalejší než v čisté vodě



mezi molekulami hydratačního obalu a molekulou proteinu nekovalentní interakce různé povahy (povaha funkčních skupin na povrchu)



hydratační obal zásadní pro biologickou funkci proteinu (konformační flexibilita, difuze)

Voda

bruslařka rodu Gerris


Molekula vody



dynamická struktura

Fyzikální vlastnosti vody Sloučenina CH4 NH3 HF Ne H2O H2S H2Se H2Te

Teplota tání (K) 89 195 181 24 273 187 207 224

Teplota varu (K) 112 240 292 27 373 213 232 271

Výparné teplo (kJ.mol-1) 9,21 23,22 30,20 1,74 40,65 18,67 19,70 19,20

isoelektronické sloučeniny

hydridy



vysoké výparné teplo zaručuje účinné ochlazení organismu odpařením již malého množství vody (vypaření 2 g vede k ochlazení zbývajících 998 g o 1 °C)



vysoká tepelná kapacita vody (4,18 kJ/kg/K) a vysoká tepelná vodivost umožňují účinnou termoregulaci a zabraňují lokálním fluktuacím teploty



vysoká relativní permitivita (78,5 při 298 K) je rozhodující pro schopnost rozpouštět i polární struktury nejen iontové sloučeniny


Vodíkové vazby ve struktuře vody

Základní forma ledu (Ih) - šesterečná struktura; 4 vodíkové vazby - 107° (úhel H-O-H) - „ledové pravidlo“ – orientace molekul; defekty krystalové mřížky ledu

Kapalná voda - přesný model není znám - určité pravidelné struktury - klastry - strukturovaný soubor dipólů - dynamika obměny vodíkových vazeb - v řádu nanometrů nehomogenní


Voda jako rozpouštědlo – polární látka


Voda jako rozpouštědlo – amfifilní látka

Voda jako rozpouštědlo – nepolární látka 

Klathrát = organizovaná struktura molekul vody, která se vytvoří jako důsledek hydrofobních interakcí kolem nepolární látky ve vodném prostředí

molekuly vody

nepolární látka/skupina



konfigurace x konformace biopolymeru



hierarchie uspořádání



struktura s nízkou hodnotou Gibbsovy energie



uplatňují se inter- i intra- interakce  zcela zásadní vliv rozpouštědla



kooperativita


Nativní struktura biopolymeru

Nativní struktura biopolymeru 

kooperativita  lineární allosterický efekt  průměrná kooperativita molekuly = pravděpodobnost s jakou změní (n+1)-tý zbytek svou konformaci jako důsledek změny konformace zbytku n-tého



vznik mikroprostředí v rámci molekuly biopolymeru  povrch molekuly x její střed  např. rozdílná permitivita



konformačně-dynamické struktura

Vznik nativní struktury biopolymeru 

nejedná se o náhodný proces  Levinthalův paradox  řetězec 100 AMK se sbalí za cca 5s  pokud by byly náhodně zkoušeny všechny možné konformace rychlostí 1013 trvalo by nalezení správné konformace 10 87 s, stáří vesmíru přitom je jen 6. 10 17 s



nicméně přesný model sbalování není znám ....



energetická bilance procesu


Vznik nativní struktury biopolymeru 

model roztavené globule (molten globule)  počáteční spontánní kolaps (hnaný hydrofobními interakcemi) dá vzniknout nestabilnímu mezistupni (molten globule), který již má určitý stupeň nativních struktur, ale postranní řetězce ještě nejsou zcela fixovány



hierarchický model



sbalování pomocí „gardedám“  nutná přítomnost chaperonových proteinů či intramolekulárních chaperonových sekvencí



možná účast dvou enzymů v konečné fázi:  protein disulfid isomerasa  peptid prolyl cis-trans isomerasa

Vznik nativní struktury biopolymeru



energetická bilance procesu



Je vždy dosaženo „absolutního minima Gibbsovy energie“?  vliv energetického příspěvku vazby specifických nízkomolekulárních partnerů (např. prosthetická skupina)  vznik nadmolekulárních komplexů



otázka renaturace


„Vnitřně neuspořádané oblasti“ v proteinové struktuře pojem, který se objevuje posledních zhruba deset let



oblasti, které jsou funkční, ale přesto (v určité fázi či okamžiku) neuspořádané He, B. et al. (2009): Predicting intrinsic disorder in proteins: an overview. Cell Research 19,929-949.



calcineurin

„Vnitřně neuspořádané oblasti“ v proteinové struktuře a jejich funkce

Chouard, T. (2011): Breaking the protein rules. Nature 471, 151-152.

tumour-supressor protein p53 Uversky, V. N. (2011): Intrinsically disordered proteins from A to Z. Int J Biochem Cell Biol 43, 1090-1103.

„Vnitřně neuspořádané oblasti“ v proteinové struktuře a jejich funkce vztah uspořádanosti struktury enzymu a vazby substrátu model zámku a klíče

„fold as you bind“

„shape shifting“

Chouard, T. (2011): Breaking the protein rules. Nature 471, 151-152.



Denaturace nativní struktury 

„Každá podstatná změna prostorového uspořádání biopolymeru, která vede ke ztrátě jeho biologické aktivity.“



neuspořádané (statistické) klubko (random coil) x neúplně denaturované stavy (stabilní meziprodukty denaturace)



v procesu denaturace dochází k zániku původních a vzniku nových nekovalentních interakcí  role rozpouštědla



vratná x nevratná denaturace



fyzikální a chemické vlivy x chemická činidla



pro experimentální stanovení možno využít jakoukoliv metodu, která sleduje změnu v konformaci biopolymeru

ND

 D KD  N 

Denaturace nativní struktury dvoustavový model (pro vratnou denaturaci)

ND co = D + N

KD =

F = fN N + fD D

FN-F F-FD

-3500

[] [deg.cm2.dmol-1 ]



FD

fD = FD / co

-4500 -5500 -6500 -7500

fN = FN / co

FN

-8500

20

30

40

50

60

70

teplota [°C] Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.

80


Denaturace nativní struktury



Tm (teplota tání) = hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace

Denaturace nativní struktury

Tm (teplota tání)

= hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace


Jsou tyto stavy stejné?

Diferenciální mikrokalorimetrie bílkovin  H  cp     T  p 10

cp [J/K/g]

8 6

cp cp,D N

4 2

Td

0 50

60

70

80

90

t [°C] Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.

100

Děkuji za pozornost.


Kódované aminokyseliny

Biofyzikální chemie nekovalentní interakce, prostorové uspořádání proteinů, voda. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Recommend Documents