Biofyzikální chemie nekovalentní interakce, prostorové uspořádání proteinů, voda Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Interakce v biochemii
Interakce v biochemii
Interakce vzájemné působení dvou nebo více činitelů
Jakých činitelů? biopolymer a jeho části biopolymer a nadmolekulární útvary (membrány) rozpouštědlo a molekuly přítomné v rozpouštědle
molekula biopolymeru je komplexní systém, o to více systém biopolymer – rozpouštědlo široká škála možných interakcí
intra- a inter- interakce
biochemické děje jsou charakteristické svou ..... ...... dynamikou ....... vratností .......specifitou
Chemická vazba
kovalentní vazba sdílení jednoho nebo více elektronových párů stabilita vazby dána termodynamicky (vysoké vazebné energie) i kineticky (vysoké aktivační energie rozpadu) dělení dle rozdílu elektronegativit prvků na: iontové polární vazby – rozdíl elektronegativit > 1,7 polární kovalentní vazbu - 1,67 > rozdíl elektronegativit > 0,4 nepolární kovalentní vazbu – rozdíl elektronegativit < 0,4
Nekovalentní interakce nekovalentní interakce (vazba, síla) nedochází ke sdílení elektronových párů vznik a rozštěpení vazby je vratný děj probíhající bez katalyzátoru (nízká aktivační a vazebná energie) kombinovatelnost nekovalentních interakcí aditivita energie vazeb zvyšující stabilitu
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Nekovalentní interakce
Elektrostatické (Coulombické) interakce Vodíkové vazby van der Waalsovy interakce Hydrofobní interakce
Elektrostatické interakce
1
q1q2 F 2 4 0 r
Ca 2+
van der Waalsovy interakce •
„všechny typy interakcí, které nespadají do kategorie elektrostatických, vodíkových a hydrofobních interakcí“
•
dělení: – Interakce permanentní dipól-permanentní dipól (van der Waalsovy-Debyeovy)
Ed d –
0 ..... permitivita vakuaa [C2.N-1. m-2] .... dipólový moment [D=C.m] k .... Boltzmanova konstanta
Interakce permanentní dipól-indukovaný dipól (van der Waalsovy-Keesomovy)
Ed id –
212 22 2 34 0 kTr6
2 12 1 22 4 0 2 r 6
.... polarizovatelnost molekuly
Londonovy disperzní síly (interakce přechodný dipól-přechodný dipól)
Edisp
3 I1 I 2 1 2 2 6 24 0 I1 I 2 r
.... polarizovatelnost molekuly I ..... ionisační energie molekuly
van der Waalsovy interakce •
dělení: – patrové interakce (- interakce) • vzájemná interakce -elektronových systémů lokalizovaných pod i nad aromatickými kruhy • stabilizace dihelixů DNA a některých úseků RNA
Vodíkové vazby (můstky)
slabě kyselý donor D-H interaguje prostřednictvím atomu vodíku s volným elektronovým párem akceptoru A
Hydrofobní interakce
interakčním partnerem je vždy voda
pojem hydrofobní je používán ve smyslu neschopné se mísit s vodou (tedy vytvářet vodíkové můstky s vodou) dávající přednost nepolárnímu prostředí před vodným přenos nepolární sloučeniny do vodného roztoku doprovázený charakteristickou teplotní závislostí termodynamických veličin způsobující vyšší uspořádanost molekul vody v okolí molekul rozpuštěné látky
kvantitativní vyjádření hydrofobity rozdělovací koeficient = termodynamická rovnovážná konstanta v systému vodanepolární rozpouštědlo
Hydrofobní interakce entropicky řízený děj
G = H - TSm -Sp D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
ΔG 0, ΔH 0, ΔS 0 ΔG 0, ΔH 0, ΔS 0
Hydrofobní interakce charakteristickým rysem je velká hodnota cp přenosu nepolární sloučeniny do vody mísení dvou „jednoduchých“ málo mísitelných kapalin (panel A) 40
mísení oleje s vodou (panel B)
energie [kJ/mol]
10
G
30
G TS
20 0 -10 -20
A
-30
20
H
10 0 -10
TS
-20
B
-30
-40
Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.
40
H
30
energie [kJ/mol]
-40
250
300
350
400
teplota [K]
450
250
300
350
400
teplota [K]
450
Hydrofobní a nepolární
?? nepolární = hydrofobní ??
Hydrofobní interakce
Hydrofobní látka
Nepolární (kovalentní) vazba
Nepolární rozpouštědlo
Nepolární látka
Typ interakce vodíkové vazby: voda (led) peptidové vazby mezi neutrální a nabitou skupinou elektrostatické interakce ion - ion interakce dvou permanentních dipólů Londonovy dispersní interakce patrové interakce hydrofobní interakce
Příklad
Vazebná energie (kJ/mol)
–O–H ...O=
17
=N–H...O=C
15
–COO-...HO–CH2–
15
–COO-...+H3N–
20-30
C+=O-... C+=O-... mezi dvěma alifatickými atomy C mezi dvěma aromatickými kruhy Phe mezi dvěma methylovými skupinami mezi dvěma postranními řetězci valinu
2 0,11 6
1,2 6
Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.
Nekovalentní interakce - souhrn
Nekovalentní interakce - rozdělení
Termodynamické hledisko dělení: interakce enthalpické povahy interakce entropické povahy
G H T .S
Hledisko síly interakce (r-x) interakce dalekého dosahu (x 3) interakce krátkého dosahu (x>3)
Hledisko struktury biopolymeru lokální interakce nelokální interakce
Nekovalentní interakce a struktura proteinů
Nekovalentní interakce a struktura proteinů
Hydrofobní interakce AMK s hydrofobním/nepolárním postranním řetězcem hydrofobní profil proteinu rozhodující síly stabilizující nativní konformaci Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000. kvantitativní vyjádření hydrofobity rozdělovací koeficient = termodynamická rovnovážná konstanta v systému vodanepolární rozpouštědlo modelující hydrofobní vnitřek molekuly proteinu (např. benzen či n-oktanol)
Elektrostatické interakce klasické (nespecifické) elektrostatické interakce destabilizující vliv v oblastech pH vzdálených od pI specifické elektrostatické interakce (iontové páry, solné můstky) malý stabilizující vliv iontových párů na povrchu (cca 4-5 iontových párů na 150 AMK)
Hydrofobní profil proteinu
zobrazení rozložení polárních a nepolárních AMK zbytků v rámci molekuly proteinu určení hydrofóbních/hydrofilních oblastí proteinu pravděpodobná lokalizace AMK zbytku v rámci molekuly proteinu (povrch x vnitřek proteinu) interakce proteinu s okolním prostředím: hydrofilní oblasti na povrchu proteinu (a tedy potažmo antigenní) hydrofóbní oblasti uvnitř proteinu případně reagující s membránou in silico předpověď x experimentální určení
in silico předpověď
různá měřítka (např. Kyte-Doolittle)
predikční programy např. ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)
experimentální určení hydrofobity AMK/proteinu: zádrž na hydrofobní koloně rozdělovací koeficient mezi vodnou a organickou fázi
Hydrofobní profil proteinu
http://lifespotlight.com/images/2008/08/amino-acids.gif
AMK
KyteDoolittle
HoppWoods
Ala
1,8
- 0,5
Arg
- 4,5
3,0
Asn
- 3,5
0,2
Asp
- 3,5
3,0
Cys
2,5
- 1,0
Gln
- 3,5
0,2
Glu
- 3,5
3,0
Gly
- 0,4
0,0
His
- 3,2
- 0,5
Ile
4,5
- 1,8
Leu
3,8
- 1,8
Lys
- 3,9
3,0
Met
1,9
- 1,3
Phe
2,8
- 2,5
Pro
- 1,6
0,0
Ser
- 0,8
0,3
Thr
- 0,7
- 0,4
Trp
- 0,9
- 3,4
Tyr
- 1,3
- 2,3
Val
4,2
-1,5
Hydrofobní profil proteinu pro membránové oblasti v centru hodnota min. 1,6
měřítko Kyte-Doolittle
Nekovalentní interakce a struktura proteinů
van der Waalsovy interakce interakce permanentní dipól-permanentní dipól četné především uvnitř molekuly (např. dvě karbonylové skupiny) interakce permanentní-indukovaný dipól např. karbonylová skupina indukující dipól v methylové skupině interakce přechodný dipól-přechodný dipól velmi časté – vpodstatě tak mohou reagovat každé dvě molekuly, které se přiblíží dostatečně blízko nezanedbatelný vliv na stabilitu struktury; důležité při interakcích mezi proteinem a komplementárními ligandy
vodíkové vazby stabilizace struktury proteinu molekula bílkoviny může tvořit: intramolekulární vazby v rámci molekuly skupiny peptidové vazby mezi neutrální a nabitou skupinou intermolekulové vazby s molekulami rozpouštědla
H2O H2O D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Nekovalentní interakce a vazba efektoru k molekule enzymu
různé typy nekovalentních interakcí
H2O
cytochrom f krystalová struktura hemoglobinu
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Vazba vody uvnitř a na povrchu molekuly proteinu
Hydratace bílkovin
0,3 g H2O na 1 g bílkoviny, teoreticky tedy tloušťka jedné molekuly H2O
výměna molekul vody v hydratačním obalu pomalejší než v čisté vodě
mezi molekulami hydratačního obalu a molekulou proteinu nekovalentní interakce různé povahy (povaha funkčních skupin na povrchu)
hydratační obal zásadní pro biologickou funkci proteinu (konformační flexibilita, difuze)
Voda
bruslařka rodu Gerris
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Molekula vody
dynamická struktura
Fyzikální vlastnosti vody Sloučenina CH4 NH3 HF Ne H2O H2S H2Se H2Te
Teplota tání (K) 89 195 181 24 273 187 207 224
Teplota varu (K) 112 240 292 27 373 213 232 271
Výparné teplo (kJ.mol-1) 9,21 23,22 30,20 1,74 40,65 18,67 19,70 19,20
isoelektronické sloučeniny
hydridy
vysoké výparné teplo zaručuje účinné ochlazení organismu odpařením již malého množství vody (vypaření 2 g vede k ochlazení zbývajících 998 g o 1 °C)
vysoká tepelná kapacita vody (4,18 kJ/kg/K) a vysoká tepelná vodivost umožňují účinnou termoregulaci a zabraňují lokálním fluktuacím teploty
vysoká relativní permitivita (78,5 při 298 K) je rozhodující pro schopnost rozpouštět i polární struktury nejen iontové sloučeniny
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Vodíkové vazby ve struktuře vody
Základní forma ledu (Ih) - šesterečná struktura; 4 vodíkové vazby - 107° (úhel H-O-H) - „ledové pravidlo“ – orientace molekul; defekty krystalové mřížky ledu
Kapalná voda - přesný model není znám - určité pravidelné struktury - klastry - strukturovaný soubor dipólů - dynamika obměny vodíkových vazeb - v řádu nanometrů nehomogenní
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Voda jako rozpouštědlo – polární látka
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Voda jako rozpouštědlo – amfifilní látka
Voda jako rozpouštědlo – nepolární látka
Klathrát = organizovaná struktura molekul vody, která se vytvoří jako důsledek hydrofobních interakcí kolem nepolární látky ve vodném prostředí
molekuly vody
nepolární látka/skupina
konfigurace x konformace biopolymeru
hierarchie uspořádání
struktura s nízkou hodnotou Gibbsovy energie
uplatňují se inter- i intra- interakce zcela zásadní vliv rozpouštědla
kooperativita
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Nativní struktura biopolymeru
Nativní struktura biopolymeru
kooperativita lineární allosterický efekt průměrná kooperativita molekuly = pravděpodobnost s jakou změní (n+1)-tý zbytek svou konformaci jako důsledek změny konformace zbytku n-tého
vznik mikroprostředí v rámci molekuly biopolymeru povrch molekuly x její střed např. rozdílná permitivita
konformačně-dynamické struktura
Vznik nativní struktury biopolymeru
nejedná se o náhodný proces Levinthalův paradox řetězec 100 AMK se sbalí za cca 5s pokud by byly náhodně zkoušeny všechny možné konformace rychlostí 1013 trvalo by nalezení správné konformace 10 87 s, stáří vesmíru přitom je jen 6. 10 17 s
nicméně přesný model sbalování není znám ....
energetická bilance procesu
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Vznik nativní struktury biopolymeru
model roztavené globule (molten globule) počáteční spontánní kolaps (hnaný hydrofobními interakcemi) dá vzniknout nestabilnímu mezistupni (molten globule), který již má určitý stupeň nativních struktur, ale postranní řetězce ještě nejsou zcela fixovány
hierarchický model
sbalování pomocí „gardedám“ nutná přítomnost chaperonových proteinů či intramolekulárních chaperonových sekvencí
možná účast dvou enzymů v konečné fázi: protein disulfid isomerasa peptid prolyl cis-trans isomerasa
Vznik nativní struktury biopolymeru
energetická bilance procesu
Je vždy dosaženo „absolutního minima Gibbsovy energie“? vliv energetického příspěvku vazby specifických nízkomolekulárních partnerů (např. prosthetická skupina) vznik nadmolekulárních komplexů
otázka renaturace
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
„Vnitřně neuspořádané oblasti“ v proteinové struktuře pojem, který se objevuje posledních zhruba deset let
oblasti, které jsou funkční, ale přesto (v určité fázi či okamžiku) neuspořádané He, B. et al. (2009): Predicting intrinsic disorder in proteins: an overview. Cell Research 19,929-949.
calcineurin
„Vnitřně neuspořádané oblasti“ v proteinové struktuře a jejich funkce
Chouard, T. (2011): Breaking the protein rules. Nature 471, 151-152.
tumour-supressor protein p53 Uversky, V. N. (2011): Intrinsically disordered proteins from A to Z. Int J Biochem Cell Biol 43, 1090-1103.
„Vnitřně neuspořádané oblasti“ v proteinové struktuře a jejich funkce vztah uspořádanosti struktury enzymu a vazby substrátu model zámku a klíče
„fold as you bind“
„shape shifting“
Chouard, T. (2011): Breaking the protein rules. Nature 471, 151-152.
Denaturace nativní struktury
„Každá podstatná změna prostorového uspořádání biopolymeru, která vede ke ztrátě jeho biologické aktivity.“
neuspořádané (statistické) klubko (random coil) x neúplně denaturované stavy (stabilní meziprodukty denaturace)
v procesu denaturace dochází k zániku původních a vzniku nových nekovalentních interakcí role rozpouštědla
vratná x nevratná denaturace
fyzikální a chemické vlivy x chemická činidla
pro experimentální stanovení možno využít jakoukoliv metodu, která sleduje změnu v konformaci biopolymeru
ND
D KD N
Denaturace nativní struktury dvoustavový model (pro vratnou denaturaci)
ND co = D + N
KD =
F = fN N + fD D
FN-F F-FD
-3500
[] [deg.cm2.dmol-1 ]
FD
fD = FD / co
-4500 -5500 -6500 -7500
fN = FN / co
FN
-8500
20
30
40
50
60
70
teplota [°C] Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.
80
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Denaturace nativní struktury
Tm (teplota tání) = hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace
Denaturace nativní struktury
Tm (teplota tání)
= hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Jsou tyto stavy stejné?
Diferenciální mikrokalorimetrie bílkovin H cp T p 10
cp [J/K/g]
8 6
cp cp,D N
4 2
Td
0 50
60
70
80
90
t [°C] Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia , 2000.
100
Děkuji za pozornost.
D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005
Kódované aminokyseliny