Biofyzikální chemie membrány a děje na membránách. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Biofyzikální chemie membrány a děje na membránách

Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Amfifilní molekula ve vodě

povrchové napětí

CMC/KMK (kritická micelární koncentrace)

koncentrace

Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005

Kritická micelární koncentrace

Povrchové napětí 

povrchové napětí  síla, která působí ve směru tečny k povrchu na úsečku jednotkové délky, tedy mezifázové napětí v systémech kapalina/plyn  N/m (mN/m)



mezifázové napětí  tečná síla, působící ve směru fázového rozhraní na úsečku jednotkové délky

liposom

koncentrace monomeru/micely

CMC/KMK (kritická micelární koncentrace)

micela

Kritická micelární koncentrace

celková koncentrace

Tenzid/detergent 

detergent x tenzid x látka snižující povrchové napětí



tenzid





organická látka, která je schopna se hromadit již při nízké koncentraci na fázovém rozhraní a tím snižovat mezifázovou energii soustavy



povrchově aktivní látka

detergent 

směs tenzidů a dalších látek, která má detergenční vlastnosti (tedy schopnost převádět nečistotu z pevného povrchu do objemové fáze roztoku)

SDS

Triton X-100

Tween 80

Druhy tenzidů 

dělení dle přítomnosti náboje:  detergenty nesoucí náboj 

anionické (anionaktivní)

deoxycholát

SDS





kationické (kationaktivní) amfoterní (zwitterionic)

CHAPS



neionické (neionogenní) Triton X-100

n-oktylglucosid Tween 80

Detergent a ….

http://media.wiley.com/CurrentProtocols/PS/ps0408/ps0408-fig-0001-1-full.gif


Kolik detergentu použít?

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=mcb&part=A628&rendertype=figure&id=A631

Garavito R.M., Ferguson-Miller S.: Detergents as Tools in Membrane Biochemistry, JBC 276(35), 32403-32406,2001.

Kritická micelární koncentrace II

Membránové lipidy fosfolipidy

glycerofosfolipidy

glykolipidy

steroly

sfingolipidy

cholesterol

alkohol

alkohol

3-

3-

PO4

PO4

sacharid

OH

steroidní jádro

sfingosin

alifatický řetězec

mastná kyselina

mastná kyselina

mastná kyselina

mastná kyselina

sfingosin

glycerol

Membránové lipidy fosfatidylcholin



sfingomyelin

cholesterol

kritické parametry uspořádání molekul lipidů 

objem hydrofóbní složky (v)



délka řetězce (l)



plocha, kterou zaujímá lipid na mezifázovém rozhraní (so)

Tvar molekuly lipidu

Kritický sbalovací parametr (v/l.S)

Vznikající fáze

Příklad lipidu lysofosfolipidy volné mastné kyseliny

< 1/3 (koule) 1/3 – 1/2 (tyčinka) (lamelární vrstva, liposomy) 1/2 – 1

lipidy se dvěma řetězci, velkou polární hlavicí a fluidními řetězci (fosfatidylcholin, fosfatidylserin, fosfatidylglycerol, fosfatidylinositol, kys. fosfatidová, sfingomyelin)

(lamelární vrstva, planární dvojvrstva) ~1

lipidy se dvěma řetězci, malou polární hlavicí, záporně nabité lipidy a nabité řetězce (fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin+ Ca2+)

(hexagonální útvary HII) >1

lipidy se dvěma řetězci, malou polární hlavicí, lipidy bez náboje a polynenasycené lipidy (nenasycený fosfatidylethanolamin, kys. fosfatidová + Ca2+ (pH<6), kys. fosfatidová (pH<3), fosfatidylserin (pH<4))

Několik poznámek 

membránu tvořící lipid x detergent



účinek fosfolipas



hexagonální útvary  některé buněčné organely (př. tubuly)  dělení membrán  specifické lokální podmínky

Biologická membrána I 

bariéra definující buňku a její organely



bariéra oddělující vnitřní obsah buňky (organely) a zároveň zajišťující komunikaci s okolím



základní kameny jsou membránové lipidy (25 – 70 %) a proteiny (30 – 75%) 

podíl lipidy/proteiny není konstantní a je závislý na organismu, tkáni i konkrétní části buňky

Gerrit van Meer, Dennis R. Voelker, Gerald W. Feigenson: Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 112-124 (February 2008) | doi:10.1038/nrm2330

savci kvasinky



semipermeabilní (polopropustná) – přenos hmoty a informace



dynamický útvar



model fluidní mozaiky (1972, Singer a Nicolson)

Model fluidní mozaiky I Singer SJ, Nicolson GL (February 1972). "The fluid mosaic model of the structure of cell membranes". Science 175 (4023): 720–31.

5 nm


Model fluidní mozaiky II

VNĚ

UVNITŘ

integrální

periferní

Copyright © 2002 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

Biologická membrána II

Membránové proteiny integrální x periferní proteiny



ovlivňují vlastnosti a funkci membrány



těsnější x volnější asociace s membránou  integrální – k uvolnění nutno použít účinné detergenty, při uvolnění dojde k rozbití membrány



periferní bílkoviny mohou být asociovány s integrálními bílkovinami či cytoskletem



integrální protein interaguje s membránou pomocí:  iontových interakcí mezi bazickými aminokyselinami v proteinu a negativně nabitými fosfolipidy  kovalentně připojených lipidových struktur (např. acyl, prenyl, GPI)  nepolárních transmembránových segmentů GPI = glykosylfosfatidylinositolová kotva





Lipoproteiny a lokalizace v membráně

McMahon and Gallop; Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling, Nature, Dec 2005; 438(7068):590.

Vlastnosti biologické membrány



projevuje se v lipidovém složení



i v proteinovém složení 

orientace membránových proteinů



glykosylace vždy směrem vně



nábojová asymetrie (viz dále)


Asymetrie membrány


Pohyb monomerů v membráně 

rotační pohyb lipidových molekul a uhlovodíkových řetězců



pohyb celých molekul fosfolipidů

velmi rychlý (mm/s)

možno i pro molekuly bílkovin laterální pohyb difuzní koeficient

velmi pomalý (dny)

překlopení (flip-flop)

rychlý (sekundy) „flip-flopasa“

Pohyb proteinů v membráně Garth L. Nicolson, The Fluid—Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, Volume 1838, Issue 6, June 2014, Pages 1451-1466, ISSN 00052736, http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamem.2013.10.019.

A) „transient confinement by obstacle clusters“ B) „transient confinement by the cytoskeleton“ C) „directed motion by direct attachment to the cytoskeleton“ D) „free, random difussion“

fázový přechod

gelová fáze

tekutá uspořádaná fáze

teplota

tekutá neuspořádaná fáze D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Fluidita membrány

Diferenciální skenovací kalorimetrie

R.H. Garrett, Ch. M. Grisham : Biochemistry, Saunders College Publishing, 1995.

pro některé fosfolipidy (např. fosfatidylcholin)

teplota tání (Tm)

Diferenciální skenovací kalorimetrie D. E. Vance, J. E. Vance : Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes, 4th edition, Elsevier, 2006.

dipalmitoyl fosfatidylcholin (DPPC)

tekutá krystalická fáze

gelová fáze

Di16:0 PA = dipalmitoyl fosfatidová kyselina

Diferenciální skenovací kalorimetrie D. E. Vance, J. E. Vance : Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes, 4th edition, Elsevier, 2006.

Di16:0 PA = dipalmitoyl fosfatidová kyselina

C12

C12

C18

C20

diacyl-fosfatidylethanolamin dialkyl-fosfatidylethanolamin

D. E. Vance, J. E. Vance : Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes, 4th edition, Elsevier, 2006.

Vliv délky acylu na teplotu tání

Vliv cholesterolu na teplotu tání Rate of heat flow

Ladbroke et al., Biochim. Biophys. Acta 1968, 150, 333.

dipalmitoyl fosfatidylcholin (DPPC)

gelová fáze

přechodná fáze

tekutá krystalická fáze

Fluidita membrány I 

Fluiditu membrány ovlivňuje: 

lipidové složení membrány 

Tm a fázové přechody jednotlivých fosfolipidů



přítomnost cholesterolu - nízké teploty – zvýšení fluidity - vyšší teploty – snížení fluidity



vlastnosti lipidů 

přítomnost dvojných vazeb - zvýšení fluidity - trans dvojná vazba  Tm - cis dvojná vazba   Tm



délka řetězce - delší řetězec  Tm

Fluidita membrány II 

Fluiditu membrány ovlivňuje: 

přítomnost proteinů



teplota



iontová síla a pH - vliv na fosfolipidy s nábojem



tlak - vysoký tlak zvyšuje stabilitu gelové fáze  Tm

Expert Reviews in Molecular Medicine: http://www.expertreviews.org/ Accession information: DOI: 10.1017/S1462399402005410; 20 December 2002

Interakce cholesterolu s ostatními membránovými lipidy

Lipidové rafty 

oblasti bohaté na sfingolipidy a cholesterol



obsahují specifické proteiny součásti signálních kaskád



kaveolin – tvorba kaveol („caveola“ = malá jeskyně)

lipidový raft

odolné vůči detergentům






cholesterol

GPI-kotva VNĚ

UVNITŘ

prenyl acyl kaveolin

Model fluidní mozaiky … po 43 letech

Garth L. Nicolson, The Fluid—Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes, Volume 1838, Issue 6, June 2014, Pages 1451-1466, ISSN 0005-2736, http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamem.2013.10.019.

Interakce s … a přenos přes … membránu   

Co je membrána? Co tvoří bariéru pro přechod látky přes membránu? Charakter látky x charakter membrány x charakter okolního prostředí



asymetrie membrány



celkový profil (D) ovlivněn příspěvkem:   

membránového potenciálu (A) náboje na vnější straně membrány (B) náboje na vnitřní straně membrány (C)

Bergethon P.R.:The Physical Basis of Biochemistry, 2nd edition, Springer Science and Business Media, 2010.

Elektrostatický profil membrány

Složky membránového potenciálu

Demchenko A.P., Yesylevsky S.O.:Nanoscopic description of biomembrane electrostatics: results of molecular dynamics simulations and fluorescence probing. Chemistry and Physics of Lipids 160 (2009) 63-84.

Biologická membrána jako bariéra 

interakce mezi molekulou a membránou  vlastní interakce (asociace, adheze, inkorporace) x transport



dána charakterem a vlastnostmi membrány ....  amfifilní povaha membrány  náboj na povrchu membrány  membránový potenciál  dočasné póry v membráně (ohyby)



....... a charakterem látky (velikost a polarita)  amfifilní molekuly – adheze nebo inkorporace (závislé na koncentraci)  nepolární molekula – možná inkorporace  molekula nesoucí náboj – roli hraje elektrický potenciál  ionty – možné elektrostatické interakce s nábojem na povrchu membrány  velikost je limitující faktor  látky membránou procházejí bez svého solvatačního obalu



...... a vlivem okolního prostředí (pH, teplota)

Transport hmoty přes membránu 

dle mechanismu: 







volná difuse (nespecifická permeace) 

plyny a nízkomolekulární látky nepolární povahy – 1. Fickův zákon



malé polární molekuly (voda, močovina, ethanol) – nespecificky dočasnými póry

transport trvalými i nespecifickými póry 

póry tvořeny proteiny poriny



možno přenášet širokou škálu látek od vody (aquaporiny) až po proteiny či RNA

transport mechanismem exo- a endocytosy 

účast specifických proteinů



exocytosa – např. hemaglutinin, SNARE proteiny během synapse



endocytosa – klathrin jako receptor na povrchu membrány

usnadněná difuse pomocí specifických přenašečů 

účast specifických integrálních proteinů – transportery, translokasy, permeasy, specifické kanály



vazba přenášené látky může a nemusí změnit konformaci proteinu



elektricky nevyrovnaný přenos – změna membránového potenciálu



možná spoluúčast látky přenášené na druhou stranu



saturační kinetika a možná inhibice

Transport hmoty přes membránu 



dle energetického hlediska: 

pasivní – po směru elektrochemického potenciálu



aktivní – proti směru elektrochemického potenciálu 

energie může být dodávána několika způsoby:



hydrolýza ATP (Na, K-ATPasa)



oxidačně-redukční reakcí (proton-motivní síla)



jinou chemickou reakcí nekatalyzovanou oxidoreduktasami



světelná energie (F0F1-ATPasa)



formou tzv. sekundárního aktivního transportu

dle počtu transportovaných molekul a směru přenosu 

uniport



kotransport (symport, antiport)

Prostudovat kapitoly „Přenos hmoty přes biologickou membránu“ a „Přenos informace přes biologickou membránu“ a „Příklady fysiologických dějů, v nichž hrají membrány rozhodující roli“ in Kodíček, Karpenko: Biofysikální chemie, Academia, 2000.

Difuze přes polopropustnou membránu Fickův zákon

c j  D x

D  D0e



g R.T

Transport přes polopropustnou membránu

0 ~ mi  mi  RT ln ai  zi F

elektrochemický potenciál

 … membránový potenciál

rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu

Elektrochemický potenciál

m~i , 2  mi , 2 0  RT ln ai , 2  zi F2 m~i ,1  m i ,10  RT ln ai ,1  z i F1



pasivní transport látky probíhá 

směr transportu

m~i ,1  m~i , 2

m~i ,1  m~i , 2

rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu

Gi  m~i 

Gi  m i ,1  m i , 2 Gi  m i , 2  m i ,1

pasivní transport látky neprobíhá

m~i ,1  m~i , 2

Difuse volná a usnadněná IN OUT

volná difuse


K+ kanál (Streptomyces lividans) D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

extracelulární prostor

extracelulární prostor

cytosol

cytosol

K+ ionty (poloměr 1,33 A) procházejí 10 000 x rychleji než Na + ionty (poloměr 0,95 A)

Na,K-ATPasa D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Membránový potenciál pro tento systém?

m~i  mi 0  RT ln ai  zi F in   out

c Na1 RT   M  ln z Na F c Na 2

„Elektroosmotická“ energie Jaká je změna Gibbsovy energie spojená s přenosem iontu přes mebránu?

Gi  m~i Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu – vně kompartmentu


Na,K-ATPasa

Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu – vně kompartmentu

(Klidový) membránový potenciál



Donnanova rovnováha



zachování elektroneutrality



různá propustnost membrány



činnost Na, K-ATPas a dalších transportérů

pro jednotlivé ionty Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu – vně kompartmentu

Měření (klidového) membránového potenciálu

Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu – vně kompartmentu


Proton-motivní síla

Jak může dojít k depolarizaci membrány? D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Elektricky řízený přenašeč

polární AMK D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Chemicky řízený přenašeč

leucin

Přenos informace přes membránu 

fyzikální či chemický signál .....



..... musí být dále předán přes/skrze membránu  signální látka je schopna projít membránou (např. steroidní hormony, NO)  signální látka není schopna proniknout do buňky  vazba na receptor na vnějším povrchu, jeho aktivace a vyvolání odpovědi  receptory jako součásti iontových kanálů  receptory s vlastní enzymovou aktivitou  receptory vyvolávající endocytosu signální molekuly  receptory působící pomocí G-proteinů



termodynamické a kinetické podmínky vazby receptor-agonista



regulační kaskády, amplifikace signálu


Přenos informace přes membránu

resting potential D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Přenos nervového vzruchu I

Přenos nervového vzruchu III

Voet D., Voet J.G., Pratt C.W.: Fundamentals of biochemistry, 3rd edition, Wiley, 2008.

Přenos nervového vzruchu II


Proces vidění I


tyčinka

Proces vidění II

olfaktorický neuron D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Přenos čichových vjemů

Receptor vykazuje enzymovou aktivitu V receptoru je přítomna tyrosin protein kinasa, která fosforyluje insulin receptor substrát-1. To zahájí celou kaskádu.


Hormon je schopen projít membránou D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

Děkuji za pozornost.

Dodatečný materiál

Glykosylfosfatidylinositolová kotva - GPI = glykosylfosfatidylinositol(ová) kotva

- sacharidová struktura je k proteinu připojena skrze C-koncovou aminokyselinu pomocí ethanolamin fosfátu - ukotvení proteinu do membrány (skrze lipid) vždy z vnější strany membrány

www.sigmaaldrich.com

66

Biofyzikální chemie membrány a děje na membránách. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Recommend Documents