UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie Academiejaar 2013-2014
NONMEVALONAAT PATHWAY VOOR ISOPRENOID BIOSYNTHESE ALS POTENTIEEL DOELWIT VOOR ANTIBACTERIELE THERAPIE
Lisa MAES Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. T. Coenye Commissarissen Prof. Dr. Apr. H. J. Nelis Dr. A. Sass
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie Academiejaar 2013-2014
NONMEVALONAAT PATHWAY VOOR ISOPRENOID BIOSYNTHESE ALS POTENTIEEL DOELWIT VOOR ANTIBACTERIELE THERAPIE
Lisa MAES Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. T. Coenye Commissarissen Prof. Dr. Apr. H. J. Nelis Dr. A. Sass
AUTEURSRECHT “ De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 3 juni 2014
Promotor
Auteur
Prof. Dr. T. Coenye
Lisa Maes
SAMENVATTING De resistentie van bacteriën tegen vele van de huidige AB bemoeilijkt de behandeling van verschillende infectieziekten. [2] Ook de capaciteit van bacteriën om te gaan samenleven in biofilms draagt bij tot deze problematiek. [26] Het is noodzakelijk om hierop te reageren en te investeren in onderzoek naar AB met een nieuw werkingsmechanisme. [3] Recent werd de DOXP-pathway ontdekt, die zowel bij de malariaparasiet P. falciparum als bij heel wat pathogene bacteriën essentieel is voor de biosynthese van isoprenoïden. Bovendien beschikt de mens hiertoe over een alternatieve pathway, waardoor inhibitoren van de DOXP-pathway bij de mens toepasbaar zijn. [7] Fosmidomycine, een inhibitor van het Dxr (tweede enzym van de DOXP-pathway) zit zo momenteel in klinische fase II voor de behandeling van malaria. [8] Fosmidomycine en zijn geacetyleerd analoog FR900098 hebben ook reeds een goede activiteit aangetoond tegen het opgezuiverde Dxr van verschillende bacteriën (o.a. dit van E. coli), maar hun effect werd nog maar bestudeerd in een beperkt aantal intacte bacteriële cellen (waaronder cellen van E. coli, M. tuberculosis en Bcc). [19], [30], [8] In dit onderzoek wordt het potentieel van fosmidomycine, FR900098 en ook andere DOXP-inhibitoren als antibacterieel therapeuticum getest in vijf relevante micro-organismen. Het opmerkelijkste resultaat werd bekomen met het thiazolopyrimidine ritanserine, een inhibitor van het vijfde enzym van de DOXP-pathway (het MECP synthase). De MIC van ritanserine voor E. coli, P. acnes en M. smegmatis bedraagt 125 µM. Hierdoor lijkt ritanserine een goed alternatief voor fosmidomycine-resistente kiemen (zoals P. acnes en M. smegmatis). Ook bij de fosmidomycine-gevoelige bacterie E. coli (MIC voor fosmidomycine is 62,5 µM) is de MIC voor ritanserine van 125 µM klinisch relevant. Daarnaast blijkt ritanserine ook een goede antibiofilm activiteit te hebben. Bij E. coli biofilms wordt met 125 µM ritanserine een reductie in biofilm biomassa van 20 % bekomen, hetgeen ook gevonden wordt voor 125 µM FR900098 en 250 µM fosmidomycine. Voor P. acnes en M. tuberculosis biofilms behandeld met 250 µM ritanserine wordt een reductie van respectievelijk 40 % en 50 % geoberserveerd. Dit onderzoek toont aan dat DOXP-inhibitoren en met name de thiazolopyrpimidines, interessant zijn om te evalueren als AB in pathogene, (multi-)resistente bacteriën.
DANKWOORD Gedurende een volledig semester kreeg ik de kans om mijn thesisonderzoek uit te voeren in het Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie. Dit was voor mij een zeer boeiende tijd, waarin ik voor de eerste keer in mijn opleiding zelfstandig onderzoek kon verrichten. Mijn promotor, Prof. Dr. T. Coenye, wens ik hiervoor graag te bedanken. Bovendien waren zijn lessen gevorderde microbiologie voor mij een meerwaarde en hulp om bepaalde aspecten van mijn onderzoek beter of sneller te begrijpen. Graag wil ik ook een woord van dank en appreciatie richten aan Prof. Dr. Apr. H. J. Nelis. Hij heeft mijn interesse voor microbiologie weten te prikkelen gedurende zijn lessen en mij daarnaast laten kennismaken met microbiologische vaardigheden, twee zaken die ertoe geleid hebben dat een thesis in dit onderzoeksveld voor mij een vanzelfsprekende keuze was. Dit dankwoord biedt mij tevens de gelegenheid om mijn begeleidster Annelien oprecht te bedanken. Zij heeft mij vele praktische zaken geleerd, maar ook op vlak van zelfstandigheid, probleemoplossend denken en vlot schrijven heb ik veel van haar opgestoken. Bedankt, Annelien, om altijd klaar te staan voor antwoorden op mijn vragen, je enthousiasme in het labo en het herhaaldelijk nalezen en verbeteren. Dit eindwerk is ook jouw verdienste! Ook aan de andere doctoraatstudenten, post-docs en laboranten: een welgemeende dank u. Zij hadden steeds handige tips voor mij en met hun vrolijke’ goedemorgen’ was meteen de toon gezet voor een aangename nieuwe dag in het labo. Aan mijn medethesisstudenten wil ik merci zeggen voor de gezellige middagpauzes, die ideaal waren om even mijn gedachten te verzetten, en voor de motiverende sfeer in het labo. Ik wil graag mijn ouders bedanken om mij te steunen in mijn studie. Ook al ben ik door de week niet thuis, ik weet dat jullie altijd achter mij staan! Dank aan mijn vrienden, voor de nodige ontspanningen tijdens dit thesissemester en jullie interesse in mijn thesis! In het bijzonder wens ik mijn vriend, Gijs, te bedanken. Ik keek er altijd naar uit om op het einde van een dag in het labo thuis te komen en samen te genieten van een rustige avond met z’n twee. Je hebt extra goed voor mij gezorgd, zodat ik dit eindwerk met vooral ups en weinig downs tot stand kon brengen.
INHOUDSTAFEL 1. INLEIDING ..................................................................................................................... 1 1.1. RESISTENTIEPROBLEMATIEK............................................................................................ 1 1.2. DOXP-PATHWAY .............................................................................................................. 2 1.3. MICRO-ORGANISMEN...................................................................................................... 5 1.3.1. Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 5 1.3.2. Burkholderia cepacia complex .......................................................................... 5 1.3.3. Mycobacterium tuberculosis en Mycobacterium smegmatis .............................. 7 1.3.4. Propionibacterium acnes .................................................................................. 9 1.3.5. Escherichia coli ................................................................................................. 9 1.4. BIOFILM ......................................................................................................................... 10 1.4.1. Structuur en vorming ...................................................................................... 10 1.4.2. Impact ............................................................................................................ 10 1.4.3. Resistentie ..................................................................................................... 11 1.5. DOXP-INHIBITOREN ....................................................................................................... 11 1.5.1. Algemeen ....................................................................................................... 11 1.5.2. Fosmidomycine en analogen ........................................................................... 12 1.5.2.1. Historiek ........................................................................................................... 12 1.5.2.2. Moleculaire basis van de werking van fosmidomycine ................................... 13 1.5.2.3. Resistentie ........................................................................................................ 14 1.5.1.4. Analogen........................................................................................................... 14 1.5.3. Thiazolopyrimidines ....................................................................................... 15 1.5.4. Dxs-inhibitoren ............................................................................................... 16 2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 18 3. MATERIALEN EN METHODEN....................................................................................... 20 3.1. ALGEMEEN ..................................................................................................................... 20
3.1.1. Overzicht van de bestudeerde stammen ......................................................... 20 3.1.2. Maken van een reincultuur (figuur 3.1.) .......................................................... 20 3.1.3. Maken van een over-nacht (O/N) cultuur ........................................................ 21 3.1.4. Autoclaveren en filtreren ................................................................................ 22 3.1.5. Spectrofotometer ........................................................................................... 22 3.1.6. Envision (figuur 3.3.) ....................................................................................... 23 3.1.7. MilliQ en fysiologisch water (FW).................................................................... 23 3.1.8. Voedingsmedia ............................................................................................... 23 3.1.8.1. Algemeen ......................................................................................................... 23 3.1.8.2. Mueller Hinton agar en bouillon ...................................................................... 24 3.1.8.3. Luria Bertani agar ............................................................................................. 24 3.1.8.4. Brain Heart Infusion agar en bouillon .............................................................. 24 3.1.8.5. DifcoTM Middlebrook 7h10 agar en DifcoTM 7h9 bouillon ................................ 25 3.1.9. AB-oplossingen ............................................................................................... 26 3.2. BEPALING VAN DE MINIMAAL INHIBERENDE CONCENTRATIE (MIC)............................ 28 3.2.1. Antibioticum-microtiterplaat .......................................................................... 28 3.2.2. Microtiterplaat inzetten met kiemsuspensie en absorptiebepaling .................. 29 3.3. BEPALING VAN DE MINIMALE BIOFILM INHIBERENDE CONCENTRATIE (MBIC) ........... 30 3.3.1. Inzetten van de biofilm, spoeling en behandeling ............................................ 30 3.3.2. Kwantificatie .................................................................................................. 32 3.3.2.1. Resazurinekleuring ........................................................................................... 32 3.3.2.2. Uitplating .......................................................................................................... 33 3.4. CHECKERBOARD ASSAY ................................................................................................. 34 4. RESULTATEN ............................................................................................................... 36 4.1. MIC-BEPALING VAN DOXP-INHIBITOREN ...................................................................... 36 4.2. MBIC-BEPALING VAN DOXP-INHIBITOREN .................................................................... 37
4.2.1. Resultaten van MBIC-experimenten met E. coli ............................................... 38 4.2.2. Resultaten van MBIC-experimenten met P. acnes ........................................... 38 4.2.3. Resultaten van MBIC-experimenten met M. smegmatis .................................. 40 4.2.4. Resultaten van MBIC-experimenten met P. aeruginosa ................................... 40 4.2.5. Resultaten van MBIC-experimenten met B. cenocepacia ................................. 41 4.3. CHECKERBOARD ASSAYS................................................................................................ 42 4.3.1. Resultaten van checkerboard assays met E. coli .............................................. 42 4.3.2. Resultaten van checkerboard assay met B. cenocepacia .................................. 42 4.3.3. Resultaten van checkerboard assay met M. smegmatis ................................... 42 5. DISCUSSIE ................................................................................................................... 44 5.1. ACTIVITEIT VAN FOSMIDOMYCINE EN FR900098 ......................................................... 44 5.2. ACTIVITEIT VAN THIAZOLOPYRIMIDINES....................................................................... 45 5.3. ACTIVITEIT VAN DXS-INHIBITOREN................................................................................ 46 5.4. BIOFILMEXPERIMENTEN ................................................................................................ 46 6. CONCLUSIE.................................................................................................................. 48
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN AB: antibiotica AIDS: acquired immune deficiency syndrome Bcc: Burkholderia cepacia complex BL: blanco CF: cystic fibrosis (= mucoviscidose) CGD: chronische granulomateuze ziekte DMAPP: dimethylallyl difosfaat DMSO: dimethylsulfoxide DNA: deoxyribonucleïnezuur DOXP/DXP: 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfaat Dxr: 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfaat reductoisomerase Dxs: 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfaat synthase EP: European Pharmacopeia FIC: fractional inhibitory concentration fsr: fosmidomycine-resistentie gen FW: fysiologisch water GC: groeicontrole GlpT: glycerol-3-fosfaat transporter 5-HT2: 5-hydroxytryptamine, subfamilie 2 HTS: high throughput screening IPP: isopentenyl difosfaat KVE: kolonie vormende eenheden LPS: lipopolysaccharide MBIC: minimale biofilm inhiberende concentratie MDR: multiple drug resistant MECP: methyl-d-erythritol-2,4-cyclodifosfaat MEP: 2-C-methyl-D-erythritol-4-fosfaat MG: moleculair gewicht Mg2+: magnesium (II+) ion MIC: minimaal inhiberende concentratie Mn2: mangaan (II+) ion MSDS: material safety data sheet MTP: 96-well microtiterplaat NADPH: gereduceerd nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat OD: optische densiteit O/N: over-nacht cultuur PBP: penicilline-bindend proteïne PfDxr: Dxr van Plasmodium falciparum QS: quorum sensing RNA: ribonucleïnezuur ROS: reactive oxygen species TBC: tuberculose USP: United States Pharmacopeia WHO: World Health Organisation WWB: warmwaterbad
1. INLEIDING 1.1. RESISTENTIEPROBLEMATIEK De resistentie van bacteriën tegen de bestaande antibiotica (AB) neemt toe en bemoeilijkt steeds vaker de behandeling van infecties. De mechanismen die aan de basis hiervan liggen, worden ofwel gecodeerd in het chromosomaal DNA (intrinsieke resistentie), ofwel zijn ze het gevolg van mutaties, conjugatie, transpositie of transformatie (verworven resistentie). [1] Deze laatste processen dragen ertoe bij dat resistente pathogenen deze ongevoeligheid kunnen transfereren naar andere (gevoelige) bacteriën, waardoor na verloop van tijd multiresistente (“multiple drug-resistant”, MDR) kiemen ontstaan. Voorbeelden van MDR organismen die ernstige infecties veroorzaken zijn: methicilline-resistente Staphylococcus aureus
(MRSA),
vancomycine-resistente
enterococci
(VRE),
penicilline-resistente
pneumococci en multiresistente Gram-negatieve bacteriën zoals Escherichia coli en Pseudomonas aeruginosa. [2] Hoewel de farmaceutische industrie aanvankelijk wel in staat was om op deze problematiek te reageren met de productie van nieuwe, effectieve antibiotica wordt het steeds moeilijker de ontwikkeling van AB met nieuwe werkingsmechanismen mogelijk te maken. Hierdoor blijkt de initieel ingestelde therapie vaak niet werkzaam of komt het zelfs voor dat er geen effectieve therapie voorhanden is, wat belangrijke klinische en financiële gevolgen met zich mee brengt. Zo is het bijvoorbeeld in hospitalen, waar men vaak te kampen heeft met MDR kiemen, in principe noodzakelijk om in vitro de susceptibiliteit van het pathogeen voor specifieke AB te onderzoeken. Hierdoor krijgen patiënten pas laattijdig een effectieve behandeling toegediend of overlijden ze soms aan een onbehandelde infectie. Dit alles leidt tot toegenomen morbiditeit, verlengd hospitaalverblijf en een tekort aan zorgverleners en onderzoek voor andere patiënten in nood. Bovendien moet men soms beroep doen op behandelingen met tweede of derde lijns- antibiotica, die doorgaans duurder zijn dan eerstelijns-AB. De resistentieproblematiek brengt dus een toegenomen gezondheidskost met zich mee, die o.a. in ontwikkelingslanden niet haalbaar is. Aangezien het onnodig voorschrijven van derde lijns-AB en het profylactisch gebruik van AB verder bijdragen tot de ontwikkeling van antibioticaresistentie, is controle op AB-misbruik één van de hoekstenen in de aanpak van deze problematiek. [2]
1
Bovendien is de resistentieproblematiek schrijnend voor de volksgezondheid. Zo wordt geschat dat in 2010 ongeveer 7,5 procent van de mensen die stierven aan tuberculose, geïnfecteerd waren met één of meerdere multiresistente stammen van M. tuberculosis. Naast de controle op AB-gebruik, moet de farmaceutische industrie dus blijvend inspanningen leveren in het onderzoek naar AB met nieuwe werkingsmechanismen. Het is namelijk zo dat de huidige klinisch bruikbare AB slechts een kleine fractie van de mogelijke doelwitten benutten en er momenteel niet veel AB met nieuwe werkingsmechanismen meer in de pipeline zitten. [3] In het algemeen zijn er vier belangrijke resistentiemechanismen te onderscheiden [1]: 1) modificatie van het antibioticum, zoals bijvoorbeeld bij bacteriën die β-lactamasen produceren en zo β-lactam antibiotica kunnen afbreken vooraleer deze hun doelwit bereiken 2) modificatie van het doelwit, zoals bijvoorbeeld het geval is bij resistentie tegen aminoglycosiden (inhibitoren van de proteïnesynthese, met als doelwit de 30Sribosomale subeenheid) waarbij mutaties kunnen zorgen voor de expressie van een ander ribosomaal proteïne, waaraan het aminoglycoside niet meer kan binden 3) alternatief doelwit (bypass), zoals het voorkomen van een nieuw penicilline-bindend proteïne (PBP) dat de functie van het oorspronkelijk PBP overneemt, maar waarop βlactam AB niet meer kunnen inwerken 4) permeabiliteitsproblemen waardoor AB niet tot bij hun doelwit geraken, zoals effluxpompen en impermeabiliteit van de celmembraan. 1.2. DOXP-PATHWAY Isoprenoïden en moleculen gebaseerd op isoprenoïden zijn essentieel voor verschillende organismen: bij bacteriën zijn ze o.a. verantwoordelijk voor elektronentransport (de quinones), bij archaea en eukaryoten maken ze deel uit van de celmembraan (respectievelijk prenyllipiden en sterolen) en in planten komen ze voor als pigmenten (carotenoïden. [4] Bovendien zijn het precursoren van hormonen. [5] Isoprenoïden worden gevormd uit isopentenyl difosfaat (IPP) of zijn isomeer dimethylallyl difosfaat (DMAPP), die op hun beurt aangemaakt worden via de mevalonaat of de recentelijk ontdekte 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfaat (DOXP) pathway (non-mevalonaat 2
pathway). [5] De mevalonaat pathway komt voor bij eukaryoten (inclusief de mens), archaea en sommige bacteriën en start met condensatie van drie moleculen acetylCoA tot HMG-CoA, dat vervolgens door het HMG-CoA reductase wordt omgezet tot mevalonaat. Dit mevalonaat zal 2 keer gefosforyleerd en gedecarboxyleerd worden tot IPP (zie figuur 1.1.). [6] Naast de mevalonaat pathway, bestaat echter ook de DXP/DOXP/MEP pathway, die voorkomt in de meeste bacteriën, algen, plantenplastiden en de malariaparasiet Plasmodium falciparum. Deze pathway start met de condensatie van pyruvaat en glyceraldehyde-3-fosfaat met vorming van 1-deoxyxylulose-5-fosfaat (DXP of DOXP). DOXP wordt dan omgezet tot 2-C-methyl-D-erythritol-4-fosfaat (MEP). Deze pathway zal zo via een alternatieve weg eindigen in IPP (zie figuur 1.1.). [7] Ten slotte dient nog opgemerkt te worden dat sommige bacteriën, zoals bepaalde Streptomyces species, beide pathways kunnen gebruiken om IPP te produceren. [4] Aangezien de functie van de enzymen in de DOXP-pathway niet kan overgenomen worden door andere enzymen, blijkt deze pathway van essentieel belang te zijn voor o.a. P. falciparum en bacteriën. Dit samen met het gegeven dat deze pathway afwezig is bij de mens, maakt van deze pathway een potentieel doelwit voor antibacteriële, antimalaria therapie en als herbicide. [7] Reeds in 1999 werd aangetoond dat de malariaparasiet Plasmodium falciparum over de DOXP-pathway beschikt en er werden twee inhibitoren naar voor geschoven, fosmidomycine en zijn geacetyleerd analoog FR900098. Zoals aangeduid op figuur 1.1. zijn dit inhibitoren van het tweede enzym in de pathway, het 1-deoxy-D-xylulose5-fosfaat reductoisomerase (Dxr). De effectiviteit van fosmidomycine voor de behandeling van ongecompliceerde malaria kon reeds gestaafd worden in Fase I klinische studies. [8] Ook voor de mevalonaat pathway, die bij de mens aanwezig is, zijn al inhibitoren gekend. Een belangrijk voorbeeld zijn de statines die cholesterolverlagend werken door specifieke inhibitie van HMG-CoA reductase, zoals geïllustreerd in figuur 1.1. [6]
3
FR900098
Figuur 1.1.: De mevalonaat pathway (zoogdieren) en de MEP/DOXP/DXP pathway (bacteriën) met als gemeenschappelijke eindproducten isopentenyl difosfaat (IPP) of zijn isomeer dimethylallyl difosfaat (DMAPP). [12]
4
1.3. MICRO-ORGANISMEN In dit onderzoek worden vijf groepen bacteriën bestudeerd waarvoor werd aangetoond dat de DOXP-pathway de enige pathway is voor isoprenoïd biosynthese. 1.3.1. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve bacterie en een opportunisch pathogeen. Het is de meest voorkomende bacterie die de longen van mucoviscidose (Engelse term: cystic fibrosis, CF) patiënten infecteert, met een prevalentie van 80 % bij volwassen van 25 tot 34 jaar en 25 % bij kinderen van 5 jaar en jonger. Alhoewel de infectie initieel intermittent kan verlopen en veroorzaakt wordt door verschillende stammen die gevoelig zijn aan antipseudomonale AB, zal uiteindelijk één enkele stam de longen chronisch infecteren, waarna definitieve uitroeiing vaak geen optie meer is. [9] Hoewel men aanvankelijk vermoedde dat de transmissie van P. aeruginosa enkel via de omgeving gebeurde, toonden epidemiologische studies aan dat soms meerdere patiënten binnen één medisch centrum geïnfecteerd waren met dezelfde stam, wat de mogelijkheid van overdracht van patiënt tot patiënt suggereert. [9] P. aeruginosa is in staat zich aan te passen aan zijn gastheer door in de longen van mucoviscidosepatiënten te zorgen voor overproductie van alginaat, biofilmvorming en downregulatie van virulentiefactoren, wat zijn overleving ten goede komt. [11] Daarnaast is P. aeruginosa ook betrokken bij systemische infecties. Zo kan deze bacterie de oorzaak zijn van een bacteremie die in de dagelijkse praktijk is opgedaan ('community acquired') met bijvoorbeeld een endocarditis tot gevolg. Ook is P. aeruginosa een belangrijke verwekker van nosocomiale infecties. Het kan gaan om medische materialen zoals katheters, een hartklep of kunstmatige heup, die gecontamineerd zijn met P. aeruginosa en zo de oorzaak vormen van systemische infecties. Hierin speelt biofilmvorming op medische materialen een grote rol. Een andere mogelijke ziekenhuisinfectie met P. aeruginosa ontstaat ten gevolge van onderdrukte afweer, zoals het geval is bij (brand)wonden, neutropenie, lymfocytopenie, AIDS of een orgaantransplantatie. [1] 1.3.2. Burkholderia cepacia complex Pseudomonas cepacia, een Gram-negatieve bacterie behorend tot de groep van de proteobacteriën, was oorspronkelijk gekend als een pathogeen dat ajuinen infecteerde. [9] 5
In 1980 werd echter bij een aantal CF-patiënten, geïnfecteerd met Pseudomonas cepacia, een snelle achteruitgang met vroegtijdige sterfte gezien te wijten aan een necrotiserende pneumonie en sepsis, een ziektebeeld dat beschreven werd als het “cepacia syndroom”. [14] Zeven species hieruit werden in 1992 op basis van taxonomische studies ondergebracht in het nieuwe genus Burkholderia. Vandaag de dag telt dit genus meer dan 60 soorten en hoewel de meeste voornamelijk in de natuur voorkomen, zijn enkele de oorzaak van humane infecties. [9] Midden de jaren 1990 ontdekten Vandamme et al. dat er binnen Burkholderia cepacia stammen zijn die zeer sterk op elkaar gelijken en ze benoemden deze als “genomovars” totdat verdere karakterisatie een binominale nomenclatuur kon aangeven. [9] Zo ontstond het Burkholderia cepacia complex (Bcc) (tabel 1.1.), een groep van 18 soorten die fenotypisch sterk gelijkend zijn, maar genotypisch wel kunnen onderscheiden worden. [14] Bcc veroorzaakt ernstige en moeilijk te behandelen respiratoire infecties bij gevoelige patiënten, waaronder diegenen die lijden aan chronische granulomateuze ziekte (CGD) en mucoviscidose. Hoewel bij CF-patiënten Bcc-infecties minder voorkomen dan infecties met Pseudomonas aeruginosa (zie 1.3.1.), zijn deze Bcc-infecties wel verantwoordelijk voor een snelle daling in longfunctie en een verhoogde mortaliteit. [8] Het gegeven dat zowel P. aeruginosa als B. cenocepacia al dan niet gecombineerde biofilms kunnen vormen in de longen van CF-patiënten, maakt dat zij meer resistent worden tegen de huidige antibiotica en vormt zo de primaire oorzaak van de hoge morbiditeit en mortaliteit. [13] Virulentiefactoren van Bcc zijn: “de resistentie tegen antibiotica, biofilmvorming (op zowel abiotische oppervlakken als biotische, zoals epitheliale cellen), de mogelijkheid om epitheliale cellen en macrofagen binnen te dringen, het benutten van quorum sensing (QS) moleculen in het regelen van de genexpressie betrokken bij virulentie en de productie van catalasen, reactieve zuurstof moleculen (ROS), lipasen, proteasen en haemolysinen”. Bovendien blijken deze bacteriën resistent te zijn tegen vele antibiotica ten gevolge van o.a. “de verminderde permeabiliteit van de buitenste membraan, veranderingen in de lipopolysaccharide (LPS) van de buitenste membraan, de aanwezigheid van effluxpompen, induceerbare chromosomale βlactamasen en veranderde penicilline-binding proteïnen (PBP’s)”. [15]
6
Tabel 1.1.: De 18 species van het Burkholderia cepacia complex (Bcc) [9], [10] Species
Vroegere
Jaar van identificatie
genomovar
en/of naamgeving
aanduiding B. cepacia
I
1950, 1997
B. multivorans
II
1997
B. cenocepacia
III
1997, 2003
B. stabilis
IV
1997, 2000
B. vietnamiensis
V
1995, 1997
B. dolosa
VI
2001, 2004
B. ambifaria
VII
2001
B. anthina
VIII
2002
B. pyrrocinia
IX
2002
B. ubonensis
2000, 2008
B. latens
2008
B. diffusa
2008
B. arboris
2008
B. seminalis
2008
B. metallica
2008
B. contaminans
2009
B. lata
2009
B. pseudomultivorans [10]
2013
1.3.3. Mycobacterium tuberculosis en Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis is een saprofytische bodembacterie, die gebruikt wordt als mycobacterieel model voor Mycobacterium tuberculosis, aangezien deze laatste behoort tot Categorie 3 humane pathogenen en bovendien traag groeit . [16] Er wordt geschat dat ongeveer 1-2 miljard mensen wereldwijd (1/3
van de
wereldbevolking!) (latent) geïnfecteerd zijn met M. tuberculosis, de verwekker van tuberculose (TBC). M. tuberculosis wordt respiratoir overgedragen en in het binnenste van de long (t.h.v. de alveolen) zorgt deze bacterie voor de aantrekking van macrofagen (chemotaxis). Niet-geactiveerde macrofagen (waarbij de fusie van lysosoom en fagosoom niet plaatsvindt)
maken
het
mogelijk dat de 7
bacterie
zich
intracellulair
kan
vermenigvuldigen. Dit stimuleert de aanvoer van additionele macrofagen en zo wordt uiteindelijk een tuberkel gevormd. Indien onze afweer het toch mogelijk maakt het aandeel geactiveerde macrofagen t.o.v. niet-geactiveerde hoog te houden (terwijl deze laatste nog steeds de longen koloniseren), ontstaat een zogenaamde latente infectie. Deze kan terug acuut worden in geval van immunodeficiëntie zoals het geval is bij ondervoeding, longaandoeningen, immunosuppressieve therapie of alcoholisme. Bij een acute infectie barsten de niet-geactiveerde macrofagen open en komen de bacteriën vrij in de cellen van de longen en in het bloed. [1] Om zo’n actieve infectie te behandelen is een langdurige antibioticumtherapie nodig, wat ertoe geleid heeft dat multiresistente tuberculose in stijgende lijn voorkomt. [16] Het huidige behandelingsplan voor nieuwe TBC-patiënten bestaat uit een kuur van 4 verschillende antibiotica gedurende 6 maanden. Tijdens de eerste 2 maanden is dit een combinatie van isoniazide, rifampicine, pyrazinamide en ethambutol, gevolgd door 4 maanden behandeling met isoniazide en rifampicine. De precieze werkingsmechanismen van tuberculostatica zijn nog gedeeltelijk onopgehelderd, maar o.a. inhibitie van de biosynthese van mycolzuren zou hiertoe bijdragen. Het incorrect gebruik van deze tuberculostatica, het gebruik van ineffectieve formulaties en vroegtijdige onderbreking van de behandeling, hebben ook bijgedragen tot het ontstaan van MDR tuberculose. [17] Om de stijgende trend van MDR-TBC te stoppen heeft de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) een plan opgesteld, “The Global Plan to Stop TB 2006–2015”, waarin bepaald wordt dat voor alle reeds behandelde patiënten een “drug susceptibility testing” beschikbaar moet zijn. Dit heeft als doel MDR tuberculose in een vroeg stadium op te sporen en het behandelingsschema hieraan aan te passen. [18] Mycobacteriële resistentie tegen de huidige AB is hoofdzakelijk te wijten aan de fysicochemische eigenschappen van de celwand. Deze is opgebouwd uit mycolzuren (vertakte hydroxy-vetzuren met een zeer lange alkylketen) en vormt zo een impermeabele barrière voor verschillende AB zoals penicillines. [19] Hoewel het doelwit waarop penicillines inwerken, het PBP, wel aanwezig is bij mycobacteriën, geraken deze AB niet doorheen hun lipofiel omhulsel. Daarnaast is aangetoond dat dit genus ook verschillende effluxsystemen voor AB bezit. Deze karakteristieken maken mycobacteria, zowel pathogene (M. tuberculosis) als saprofytische (M. smegmatis) intrinsiek resistent tegen een brede waaier 8
van AB. Bovendien blijken ze ook specifieke stressresponsen te bezitten tegen vormen van oxidatieve en genotoxische stress en tegen tekorten aan zuurstof en nutriënten. [20] 1.3.4. Propionibacterium acnes Propionibacterium acnes is de enige Gram-positieve bacterie die hier onderzocht wordt. Deze bacterie koloniseert de haarfollikels in de huid. Acné vulgaris is een veel voorkomende huidaandoening die gekenmerkt wordt door een overmatige talgproductie en afzetting van keratine in de haarfollikel. Dit proces wordt gestimuleerd door hormonen en leidt tot verstopping van de haarfollikels. [21], [1] Zo ontstaan micromedomen en puistjes. P. acnes kan onder deze omstandigheden een inflammatoire respons teweeg brengen, waardoor een infectie ontstaat. [1] Infecties met P. acnes leiden tot irritatie van de huid door metabolisatie van triglyceriden (aanwezig in de talg) tot vrije vetzuren. De lipasen, die P. acnes hiertoe produceert, kunnen bovendien zelf dienst doen als neutrofiele attractant en op die manier bijdragen tot de infectie. [22] De rol van P. acnes in de pathogenese van acné is nog onduidelijk, maar mogelijks draagt biofilmvorming door P. acnes hiertoe bij. [21] De voorkeur voor de behandeling van milde inflammatoire acné gaat uit naar benzoyl peroxide, een krachtig antibacterieel middel. Een andere mogelijkheid is behandelen met een lokaal retinoïde, zoals tretinoïne. [24] Topicale antibiotica zoals clindamycine en erythromycine hebben een bacteriostatisch effect op P. acnes, maar worden niet meer aangeraden. [23], [24] Hoewel de behandeling met topicale AB voor deze relatief banale ziekte in het verleden effectief was, neemt de resistentie toe en bovendien houdt dit overmatig AB-gebruik de ontwikkeling van MDR kiemen wereldwijd in stand. Ook blijkt een behandeling bestaande uit een combinatie van benzoyl peroxide met topicale AB effectiever te zijn dan monotherapie met topicale AB op zich. [22], [23] Indien geen van deze behandelingsmogelijkheden effectief blijkt, kan een kuur met systemische AB opgestart worden (bijvoorbeeld met tetracyclines of erythromycine). [1] 1.3.5. Escherichia coli Escherichia coli is een Gram-negatieve bacterie en een gekend commensaal in het gastrointestinale systeem van de mens. E. coli kan tevens verschillende ziekten vooroorzaken, zowel intestinaal (bv. gastroenteritis) als extra-intestinaal (bv. urineweginfecties). [1] 9
E. coli zal in dit onderzoek dienst doen als referentiebacterie. Fosmidomycine bleek reeds een potente inhibitor van het gezuiverde Dxr enzym van E. coli, maar er is nog maar weinig activiteit gezien tegen intacte bacteriële cellen. [30], [19], [8] 1.4. BIOFILM 1.4.1. Structuur en vorming Bacteriën die als individuele kolonies voorkomen duiden we aan met de term ‘planktonische cellen’. Wanneer zij echter gaan samenleven in gemeenschappen vastgehecht aan een oppervlak spreken we van biofilms. De bacteriële cellen in een biofilm noemen we sessiele cellen. Bij de omschakeling van planktonische naar sessiele cellen veranderen bacteriën hun gen- en eiwitexpressie en zullen op die manier een matrix of slijmlaag produceren om zich in te bedden en te beschermen. Deze matrix bestaat voornamelijk uit exopolysacchariden, proteïnen en nucleïnezuren. [13] Samengevat verloopt de biofilmvorming in verschillende stadia (figuur 1.2.): van vasthechting en celproliferatie tot matrixproductie met de finale vorming van een complexe 3-dimensionale structuur. Nadien kunnen enkele bacteriële cellen loskomen uit deze structuur en elders opnieuw starten met de vorming van een nieuwe biofilm. [25],[26] Bovendien kunnen bacteriën in biofilms interacties met elkaar aangaan, wat het gevolg is van duizenden jaren coëvolutie. Een voorbeeld van zo’n interactie is de mogelijkheid om te communiceren via zogenaamde quorum-sensing moleculen. De productie van deze moleculen is afhankelijk van de populatiedensiteit. [13]
Figuur 1.2.: De verschillende stadia in biofilmvorming [27] 1.4.2. Impact De capaciteit van bacteriën om biofilms te vormen draagt bij tot hun overlevingsstrategie en 10
heeft een enorme impact op onze maatschappij. Biofilms kunnen niet alleen leiden tot problemen in diverse industriële processen zoals corrosie van scheepsrompen, dichtslibben van leidingen en aantasting van warmteuitwisselaars, maar ze hebben ook een enorme impact op onze gezondheid. [28] Ten eerste kunnen biofilms zich vasthechten op medische materialen, zoals katheters en prothesen, waardoor deze hun fuctionaliteit verliezen en vervanging noodzakelijk is. Ten tweede maken biofilm-gerelateerde infecties 60 % uit van alle humane infecties. [25] Ten derde zijn sessiele cellen meer resistent tegen antibioticumtherapie dan planktonische cellen en vergemakkelijken ze resistentieontwikkeling via horizontale gentransfer. [26] 1.4.3. Resistentie Er zijn reeds verschillende resistentiemechanismen in biofilms bekend. Zo zorgt de biofilm voor een vertraagde penetratie van sommige antibiotica, zoals het geval is voor positief geladen aminoglycosiden die kunnen gebonden worden door het negatief geladen alginaat in de P. aeruginosa biofilmmatrix. Daarnaast wordt de opregulatie van effluxpompen gedurende antibioticumbehandeling beschreven. Bovendien kunnen bacteriën in biofilms stressresponsen ontwikkelen, zoals het induceren van de expressie van beta-lactamasen (als reactie op beta-lactam antibiotica) en van specifieke stress-responsgenen. Deze laatste kunnen de effecten van antibiotica en ons immuunsysteem tegenwerken. [26] Ook is er heterogeniteit binnen een biofilm, waarbij we verschillende microklimaten kunnen onderscheiden, waarin cellen aanwezig zijn die traag of zelfs helemaal niet groeien en minder antibioticumgevoelig zijn. [25] Tot slot bestaan er zogenaamde persisters, een subpopulatie van cellen die tolerant zijn voor de antibioticatherapie en zo verantwoordelijk zijn voor overleving en verdere verspreiding van de biofilm. [25], [26] 1.5. DOXP-INHIBITOREN 1.5.1. Algemeen Hoewel verschillende enzymen van de DOXP-pathway bestudeerd zijn voor antibacteriële drugtargetting, is het 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfaat reductoisomerase (Dxr of IspC) het best gekend. [29] Dit enzym katalyseert de reductie en isomerisatie van 1-deoxy-D-xylulose 5fosfaat (DXP of DOXP) naar 2-C-methyl-D-erythritol 3-fosfaat (MEP), een reactie die afhankelijk is van NADPH en divalente kationen zoals Mg2+ of Mn2+. De kristalstructuur van 11
dit Dxr is reeds voor verschillende bacteriën opgehelderd, waaronder E. coli, Zymomonas mobilis, M. tuberculosis en Thermotoga maritima en wordt gebruikt in het rationeel design van effectieve inhibitoren. Het meeste onderzoek is echter gegaan naar mogelijke inhibitoren van Dxr van P. falciparum, de meest lethale malariaparasiet bij de mens. [30] 1.5.2. Fosmidomycine en analogen 1.5.2.1. Historiek Malaria is verantwoordelijk voor meer dan 1 miljoen doden per jaar en wordt veroorzaakt door een infectie met parasieten van het genus Plasmodium, die overgedragen worden door de
Anopheles
mug.
Aangezien
P.
falciparum
resistent
is
tegen
verschillende
antimalariageneesmiddelen, zoals chloroquine, is de DOXP-pathway die aanwezig is in de apicoplast een zinvol nieuw doelwit gebleken. [30] Potente
inhibitoren
van
Dxr
zijn
fosmidomycine
(3-(N-formyl-N-
hydroxyamino)propylfosfonaat), een natuurproduct afkomstig van Streptomyces lavendulae, en zijn geacetyleerd analoog FR900098, waarvan de structuurformule en werking weergeven zijn in figuur 1.3. [29], [30]
Figuur 1.3.: Structuurformule en werkingsmechanisme van fosmidomycine en FR900098 [30] In 1999 toonden Jomaa et al. aan dat fosmidomycine en FR900098 in staat waren recombinant Dxr van P. falciparum (PfDxr) te inhiberen. Bovendien kon met deze 2 inhibitoren zelfs de groei van P. falciparum geremd worden en konden muizen, die geïnfecteerd waren met P. vinckei, genezen van malaria. Momenteel zit fosmidomycine in 12
klinische fase II in de ontwikkeling voor de behandeling van ongecompliceerde malaria. [30] Fosmidomycine en FR900098 blijken ook redelijk potente inhibitoren van het Dxr van bacteriën, hoewel hun activiteit minder uitgesproken is tegenover het Dxr van Grampositieve bacteriën in vergelijking met dit van Gram-negatieve. [29] 1.5.2.2. Moleculaire basis van de werking van fosmidomycine Dxr is een homodimeer, wat betekent dat dit enzym bestaat uit 2 identieke subunits. Elke subunit bevat een NADPH-molecule en een divalent metaalion. Fosmidomycine en FR900098 bootsen DXP, het substraat van Dxr, na en binden in het actieve centrum van Dxr met vorming van een quaternair complex (Dxr-NADPH-metaal-inhibitor). De structuur van één subunit van zo’n fosmidomycine-gebonden quaternair complex is weergegeven in figuur 1.4. Hierin wordt de structuur van PfDxr getoond, maar deze blijkt in essentie overeen te stemmen met de Dxr’s van andere soorten, o.a. deze van bacteriën. Fosmidomycine (in het zwart) en NADPH (in het grijs) zijn weergeven in een ball-and-stick model en zijn gebonden ter hoogte van de twee belangrijkste en grootste domeinen van de subunit, respectievelijk het katalytische (groen) en het NADPH-binding domein (blauw). Ter hoogte van het katalytische domein (groen) wordt, naast de inhibitor, ook het metaalion gebonden. [30]
Figuur 1.4.: De subunit van het fosmidomycine-gebonden quaternair complex van Plasmodium falciparum Dxr (PfDxr). De NADPH- en katalytische zone zijn respectievelijk blauw en groen gekleurd en vormen de twee belangrijkste domeinen in elke subunit van het homodimeer Dxr. Fosmidomycine (zwart) en NADPH (grijs) zijn weergegeven in een ball-and-stick model. [30] 13
Fosmidomycine bestaat uit 3 grote delen, die specieke interacties kunnen aangaan met het Dxr: [33] (1) het fosfonaat gedeelte reageert met specieke aminozuren, op een analoge manier als DOXP (2) de 3 koolstof-spacer (3) de hydroxamaat groep bindt met het metaalion in het actieve centrum 1.5.2.3. Resistentie Naast de goede veiligheid en effectiviteit die fosmidomycine heeft bewezen (onder meer voor de behandeling van malaria) is er nog altijd de mogelijkheid van resistentieontwikkeling
die
in
acht
moet
genomen
worden.
Eén
van
de
bestudeerde
resistentiemechanismen is een gereduceerde opname. De glycerol-3-fosfaat transporter (GlpT) is de belangrijkste transporter voor de opname van fosmidomycine in E. coli. Studies met B. cenocepacia tonen aan dat deze bacterie niet over GlpT beschikt en suggeren dat er een alternatief glycerol-3-fosfaat systeem verantwoordelijk is voor fosmidomycine-import, dat geïnduceerd wordt in de aanwezigheid van glucose-6-fosfaat. De afwezigheid van GlpT of een alternatief opnamesysteem en mutaties in de genen die hiervoor coderen leiden tot resistentie tegen fosmidomycine. [8] Zo blijkt fosmidomycine inactief tegen M. tuberculosis, een bacterie die geen GlpT (of alternatief suiker-fosfaat transportsysteem) bezit en bovendien een lipofiel omhulsel heeft die het polaire fosmidomycine niet doorlaat. [29] Daarnaast kan er ook een opregulatie voorkomen van een fosmidomycine-resistentie gen (fsr) dat codeert voor een efflux pomp. Zo kunnen Bcc bacteriën fosmidomycine mogelijks wel opnemen, maar brengen ze ook een fosmidomycine efflux pomp tot expressie, wat uiteindelijk resulteert in resistentie tegen fosmidomycine en FR900098. [8] 1.5.1.4. Analogen Eén van de manieren om de opname van fosmidomycine te verhogen is de productie van lipofiele analogen. Zo blijken verschillende lipofiele esters van fosmidomycine, waarvan de algemene structuur te zien is in figuur 1.5. (1), een verhoogde opname en antibacteriële activiteit te vertonen. Ze doen dienst als prodrugs, die in de cel moeten worden gehydrolyseerd door esterasen met de vorming van de fosfonaatverbinding, die op zijn beurt Dxr kan inhiberen. [29] 14
De beste resultaten werden tot nu toe echter bekomen met α-arylgesubstitueerde analogen, waarvan een mogelijke structuur wordt weergegeven in figuur 1.5. (2). Deze inhibitor toonde in een in vitro studie een sterk verhoogde (12x) antimalaria-activiteit in vergelijking met fosmidomycine. [33] Dxr-inhibitoren die geoptimaliseerd zijn naar celpenetratie toe en bovendien perfect passen in het actieve centrum van Dxr, kunnen een belangrijke stap vormen in de ontwikkeling van nieuwe antibiotica. [29]
(1)
(2)
Figuur 1.5.: (1) Algemene structuur van lipofiele esters als prodrugs van fosmidomycine en FR900098 [29] (2) fosmidomycine analoog met een 3,4-dichlorofenyl substituent op de αplaats [33] 1.5.3. Thiazolopyrimidines Pyrimidines zijn heterocyclische verbindingen en de fundamentele bouwstenen van nucleïnezuren (DNA en RNA), maar hebben ook belangrijke farmacologische eigenschappen. De laatste jaren is er veel onderzoek gedaan naar pyrimidinederivaten en hun medische toepassingen. De samenvoeging van pyrimidine met thiazool bijvoorbeeld is onderzocht op vlak
van
verschillende
farmacologische
activiteiten, waaronder
anti-inflammatoir,
psychofarmaceutisch, bactericied en antiviraal. [31] Zo is ritanserine, een thiazolopyrimidine, een 5HT2-antagonist met anxiolytische activiteit. [32] Figuur 1.6. (1) geeft de structuurformule van ritanserine weer.
15
(2)
(1)
Figuur 1.6.: Structuurformule van (1) ritanserine en (2) ketanserine [38] Het 2C-methyl-d-erythritol-2,4-cyclodifosfaat (MECP) synthase of IspF proteïne is het vijfde enzym in de DOXP-pathway en katalyseert de vorming van MECP, een cyclisch difosfaat. [33], [34] De structuren van IspF-proteïnen van verschillende organismen zijn reeds opgehelderd d.m.v. X-straal kristallografie, waaronder die van E. coli, M. smegmatis, Plasmodium vivax en Arabidopsis thaliana. Deze laatste IspF is een planten-enzym en werd gebruikt als vervangend doelwit voor het IspF van P. falciparum en M. tuberculosis in een high-troughput screening (HTS) met 40.000 verbindingen. [35] De thiazolopyrimidines inhibeerden in deze HTS de IspF’s van P. falciparum en M. tuberculosis met IC50-waarden in de lage micromolaire range. [33], [34], [35] In een andere studie werden verschillende thiazolopyrimidines gesynthetiseerd met enonen styryl-functionaliteiten. Een aantal componenten vertoonden een significante antimalaria en anti-HIV activiteit. [36] Er werd ook reeds gezien dat bepaalde derivaten van thiazolopyrimidines een inhiberend effect hebben op E. coli. [37] Zowel ritanserine als ketanserine (zie figuur 1.6., (2)) worden bestudeerd in dit onderzoek. 1.5.4. Dxs-inhibitoren Clomazone (zie figuur 1.7.) is op de markt als een herbicide sinds 1986 en wordt in planten gemetaboliseerd tot 5-keto-clomazone (zie figuur 1.7.), dat dezelfde herbicideeigenschappen heeft. [34] Clomazone zou dus waarschijnlijk zijn functie als herbicide uitoefenen via bio-activatie tot 5-ketoclomazone. Beide componenten zijn in staat het eerste
16
enzym in de DOXP-pathway, het DOXP synthase (Dxs), te inhiberen en bijgevolg de biosynthese van o.a. carotenoïden te blokkeren. [39], [40] Indien de activiteit van deze moleculen ook kan doorgetrokken worden naar het Dxs van Plasmodium falciparum en pathogene bacteriën, kunnen ze fungeren als mogelijk anti-malaria en anti-bacterieel therapeuticum. [40] Clomazone, 5-ketoclomazone en 4(3H)-pyrimidinone (zie figuur 1.7.) worden bestudeerd in dit onderzoek.
clomazone [38]
5-ketoclomazone [41]
4(3H)-pyrimidinone [38]
Figuur 1.7.: Overzicht van de onderzochte Dxs-inhibitoren
17
2. OBJECTIEVEN Infecties met antibioticum-resistente bacteriën en biofilm-gerelateerde infecties zorgen ervoor dat er steeds minder effectieve behandelingen voorhanden zijn en vormen zo een bedreiging voor onze gezondheid. [2] Bovendien is het onwaarschijnlijk dat in de nabije toekomst beloftevolle, nieuwe AB op de markt zullen komen. Momenteel zitten er immers geen antibacteriële producten in de pipeline met een nieuw werkingsmechanisme of die tot een nieuwe chemische klasse behoren. [3] Verschillende pathogene bacteriën synthetiseren isoprenoïden via de 1-deoxy-D-xylulose-5fosfaat (DOXP) pathway. Aangezien de DOXP pathway essentieel is voor deze bacteriën en bovendien afwezig is bij de mens, is het een potentieel doelwit voor antibacteriële therapie. [7] Inhibitoren van de DOXP-pathway waren reeds een nieuwe insteek in het onderzoek naar de behandeling van malaria. Zo bleken inhibitoren van het tweede enzym van de DOXPpathway, meer bepaald fosmidomycine en FR900098, effectief te zijn voor de afdoding van de malariaparasiet Plasmodium falciparum. [30] Daarnaast kennen deze verbindingen een goede activiteit tegen het opgezuiverde Dxr van verschillende bacteriën (o.a. dit van E. coli). [19], [30] Tot nu toe werd de mogelijke werking van DOXP-inhibitoren als antibacterieel chemotherapeuticum enkel nog maar getest op een beperkt aantal intacte bacteriële cellen (waaronder cellen van E. coli, M. tuberculosis en Bcc). [19], [8] Ook spitste onderzoek zich voornamelijk toe op inhibitie van het tweede enzym van de DOXP-pathway, het DOXPreductoisomerase (Dxr), d.m.v. fosmidomycine of zijn geacetyleerd analoog FR900098. [29] Het doel van deze studie bestaat erin de activiteit van de Dxr-inhibitoren fosmidomycine en FR900098 te bestuderen in een aantal andere relevante micro-organismen. Tegelijk willen we andere aangrijpingspunten die de DOXP-pathway biedt zo goed mogelijk benutten. Naast de reeds bestudeerde Dxr-inhibitoren wordt tevens gebruik gemaakt van nieuwe componenten die andere enzymen van de DOXP-pathway inhiberen. Hiertoe worden inhibitoren van het Dxs (1e enzym) en MECP synthase (5e enzym) ingesloten. Zo zal dit onderzoek de effectiviteit van fosmidomycine, FR900098 en een aantal nieuwe componenten in vitro evalueren op intacte bacteriële cellen van E. coli, P. aeruginosa, B. 18
cenocepacia, P. acnes en M. smegmatis. Het antimicrobieel effect van alle componenten zal worden nagegaan op planktonische cellen d.m.v. bepaling van de MIC. Nadien zullen de componenten die hierin effectief bleken, verder getest worden op hun antibiofilm activiteit in MBIC-experimenten. Hiertoe worden biofilms opgekweekt in een eenvoudig biofilm modelsysteem, namelijk een MTP met Uvormige kuipjes. Het afdodend effect zal uiteindelijk onderzocht worden door kwantificatie van de biofilm biomassa via uitplating en via resazurinekleuring. In het kader van de toenemende resistentie van bacteriën, wordt combinatietherapie met lagere dosissen van ieder AB meer en meer toegepast. Daarom wordt in deze studie via de checkerboard-assay nagegaan of er een synergistisch effect waarneembaar is indien twee componenten gecombineerd worden.
19
3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. ALGEMEEN 3.1.1. Overzicht van de bestudeerde stammen De gebruikte stammen van de vijf kiemen die worden bestudeerd in dit onderzoek worden weergegeven in tabel 3.1. Tabel 3.1.: Overzicht van de bestudeerde stammen Kiem
Stamnummer
Isolatiebron
Escherichia coli
K12
Patiënt herstellend van difterie, faeces, VS [42]
Pseudomonas aeruginosa
PAO1
Wonde, Australië [43]
Burkholderia cenocepacia
LMG 16656
Mucoviscidose-patiënt (epidemische stam), sputum, VK [44]
Propionibacterium acnes
LMG 16711
Mens, faciale acné, VK [44]
Mycobacterium smegmatis
ATCC 700084/mc(2)155
Humaan sebum [45]
3.1.2. Maken van een reincultuur (figuur 3.1.) We wensen van elke bacterie (E. coli, P. aeruginosa, B. cenocepacia, P. acnes en M. smegmatis) een zuivere cultuur te maken, dit wil zeggen dat deze enkel bestaat uit het te bestuderen micro-organisme en dus niet gecontamineerd is. De handelingen die ertoe bijdragen een reincultuur te bekomen en te behouden worden “aseptische techniek” genoemd. Alle kiemen worden bewaard bij -80°C. Om de eerste maal een reincultuur te maken wordt de vial met de gewenste kiem ontdooid. Vervolgens wordt met een steriel plastieken entoog (BiolabInc., Budapest, Hongarije) één parel uit de vial op een steriele voedingsbodem gebracht en worden een reeks parallelle lijnen op het oppervlak van de agar uitgestreken. Door de petriplaat iedere keer een kwartslag te draaien kan men gemakkelijk opnieuw parallelle lijnen trekken, kruisgewijs op de vorige. Zo bekomt men na 24u of 48u incubatie bij 37°C een reincultuur waarbij duidelijk geïsoleerde kolonies zichtbaar zijn. Hierbij dient opgemerkt te worden dat de reincultuur van P. acnes onder anaërobe condities moet 20
geïncubeerd worden door gebruik te maken van een anaëroob zakje (AnaeroGen compact, OXOID, Hants, UK). Algemeen geldt dat telkens wanneer een deksel afgenomen wordt dit zo kort mogelijk moet gebeuren en in een straal van ± 15 cm rond de Bunsenvlam (steriele zone), om aseptische techniek toe te passen.
Figuur 3.1.: Eigen reincultuur van Escherichia coli 3.1.3. Maken van een over-nacht (O/N) cultuur Voor een O/N cultuur brengen we eerst 10 ml van het juiste vloeibaar medium (zie 3.1.8) in een steriel leeg flesje. Met een steriel entoog worden enkele kolonies vanaf een vast medium opgepikt en vervolgens uitgesmeerd tegen de wand van het flesje, zodat eventuele aggregaten opgebroken worden. Na grondig mengen met de Vortexmixer kan deze homogene suspensie overnacht groeien tijdens incubatie in het schuddend WWB bij 37°C. Bij E. coli en P. aeruginosa enerzijds volstaat in principe 1 enkele kolonie om te komen tot een bruikbare O/N cultuur, terwijl bij B. cenocepacia, P. acnes en M. smegmatis anderzijds best meerdere kolonies geënt worden aangezien zij minder snel groeien. De O/N cultuur van P. acnes wordt anaëroob geïncubeerd in het WWB gedurende 48u. Aangezien M. smegmatis een kiem is die een sterke neiging vertoont tot aggregraatvorming, dient de oorspronkelijke O/N cultuur gefiltreerd en opnieuw geïncubeerd te worden vooraleer een bruikbare homogene kiemsuspensie bekomen wordt. Deze filtratie gebeurt door een geautoclaveerde erlenmeyer, aangesloten op een vacuümpomp, te voorzien van 21
een filter met poriegrootte 5,0 µm (Millipore, Molsheim, Frankrijk) en vervolgens de O/N cultuur over deze filter te brengen. De gefilterde kiemsuspensie wordt ten slotte nog 48u geïncubeerd in een schuddend WWB bij 37 °C. 3.1.4. Autoclaveren en filtreren Thermostabiele producten kunnen gesteriliseerd worden via hittebehandeling, waarvan de autoclaafmethode een voorbeeld is. Hierbij wordt het te steriliseren materiaal samen met een kleine hoeveelheid water in de autoclaaf gedurende 20 minuten verwarmd bij 121 °C en bij een overdruk van 1 atmosfeer. De hete stoom die gevormd wordt zorgt ervoor dat microorganismen afsterven. Thermolabiele producten kunnen niet kiemvrij gemaakt worden via hittebehandeling. Tijdens de bereiding worden ze kiemvrij gemaakt door filtratie met behulp van een membraanfilter. Hierbij worden, zoals bij een zeefproces, micro-organismen weerhouden op de filter. In het labo wordt gebruikt gemaakt van celluloseacetaat membraanfilters met een poriëngrootte van 0,22 µm (CORNING B.V., Schiphol-Rijk, Nederland). 3.1.5. Spectrofotometer Een spectrofotometer (figuur 3.2.) (Milton Roy Spectronic 20+, Ivyland, PA, USA) is een toestel dat de mate van troebeling in een staal (turbiditeit, τ), ook wel “opalescentie” genoemd, kan meten. Hierbij wordt iets meer dan 3 ml van een staal, bv. een kiemsuspensie, in een cuvet in de spectrofotometer geplaatst. Deze zal licht met een bepaalde golflengte (595 nm) en intensiteit (I0) uitzenden, dat vervolgens door de bacteriën in de suspensie verstrooid wordt, waardoor slechts een deel van het invallende licht (I) recht door zal gaan en de detector zal bereiken (zie vergelijking 3.1.). Dit betekent dat hoe meer bacteriën aanwezig zijn, des te meer het licht verstrooid wordt en des te lager het signaal zal zijn. τ=-ln(I/I0)
(3.1)
waarin: τ: turbiditeit I: intensiteit van het invallende licht I0: intensiteit van het verstrooide licht Figuur 3.2.: Spectrofotometer [46] 22
De gemeten optische densiteit (OD) is dus een maat voor de hoeveelheid kiemen in een bepaald staal. Deze waarde wordt via de regel van drie omgerekend naar de gewenste OD. 3.1.6. Envision (figuur 3.3.) De EnVisionTM® (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) is een multilabel microtiter plaat lezer, een toestel dat in staat is de fluorescentie en absorbantie in microtiterplaten te meten.
Figuur 3.3.: EnvisionTM multilabel microtiter plaat lezer [47] 3.1.7. MilliQ en fysiologisch water (FW) In microbiologisch onderzoek is de kwaliteit van het gebruikte water zeer belangrijk. Dit moet immers vrij zijn van voedingscomponenten, die enkel mogen worden aangeleverd via een groeimedium (zie 3.1.8) en bovendien mag het geen toxische stoffen, zware metalen of chloor bevatten, die de groei van micro-organismen kunnen inhiberen. Daarom wordt in het labo gebruikt gemaakt van milliQ water, aangemaakt via het Milli-Q Reference systeem (Millipore, Billerica, MA, VS). Door de combinatie van actieve kool, reversed osmose, electrodeionisatie en een 0,2µm filter wordt zuiver water geproduceerd dat voldoet aan de kwaliteitseisen van de Amerikaanse farmacopee (USP) en de Europese farmacopee (EP). [48] Fysiologisch water is milliQ water dat isotoon gemaakt is door 9 g NaCl (Roth, Karlsruhe, Duitsland) op te lossen in 1000 ml milliQ water, wat overeenstemt met een concentratie van 0,9 % (m/v) NaCl. In FW wordt de verdere groei van bacteriën geremd door de afwezigheid van nutriënten, maar bacteriën zullen wel overleven in dit isotoon milieu. 3.1.8. Voedingsmedia 3.1.8.1. Algemeen Bacteriën kunnen zowel gekweekt worden op vaste als in vloeibare voedingsbodems. Het verschil tussen beide is dat vaste voedingsbodems bestaan uit een extra component, agar, die ervoor zorgt dat de voedingsbodem gelachtig wordt. Beide soorten zijn commercieel verkrijgbaar als gedehydrateerde poeders waarin alle nutriënten reeds aanwezig zijn. Het volstaat dan om de voorgeschreven hoeveelheid poeder (vermeld op de verpakking) af te 23
wegen en te mengen met de vermelde hoeveelheid milliQ water (bij dubbelgeconcentreerde media moet de dubbele hoeveelheid voor het vermelde volume worden afgewogen). Om de agar te laten vervloeien tot een ‘sol’ dient het mengsel voor agarbodems verwarmd te worden tot 100°C. Ten slotte worden groeimedia altijd geautoclaveerd (zie 3.1.4.). 3.1.8.2. Mueller Hinton agar en bouillon Mueller Hinton agar en bouillon (LabM, Lancashire, UK) zijn algemene media, respectievelijk vast en vloeibaar, en worden in dit onderzoek gebruikt voor de kweek van E. coli en P. aeruginosa. De bouillon wordt tevens gebruikt voor de experimenten met B. cenocepacia. Samenstelling per liter MH-bouillon (en MHA): [49]
vleesinfuus:
2,0 g
zuurgehydrolyseerde caseïne:
17,5 g
zetmeel:
1,5 g
(agar nr. 1:
17,0 g)
3.1.8.3. Luria Bertani agar Luria Bertani agar (LabM, Lancashire, UK) is een algemene vaste voedingsbodem en wordt hier gebruikt voor de kweek van B. cenocepacia. Samenstelling per liter LBA: [49]
trypton:
10,0 g
gist extract:
5,0 g
natriumchloride:
10,0 g
agar:
15,0 g
3.1.8.4. Brain Heart Infusion agar en bouillon Brain Heart Infusion agar en bouillon (LabM, Lancashire, UK) zijn algemene media, respectievelijk vast en vloeibaar en worden hier gebruikt voor de kweek van P. acnes. Samenstelling per liter BHI-bouillon (en BHIA): [49]
hersen-hart infusie/porcine:
17,5 g
tryptose:
10,0 g 24
Samenstelling per liter BHI-bouillon (en BHIA) (vervolg): [49]
glucose:
2,0 g
natriumchloride:
5,0 g
dinatriumfosfaat:
2,5 g
(agar nr.2:
12,0 g)
3.1.8.5. DifcoTM Middlebrook 7h10 agar en DifcoTM 7h9 bouillon Difco™ Middlebrook 7H10 Agar en Difco™ Middlebrook 7H9 Bouillon (Becton Dickinson and company, Sparks, USA) zijn respectievelijk vaste en vloeibare media en bevatten samen met het respectievelijke OADC enrichment en ADC enrichment (Becton Dickinson and company, Sparks, USA) alle nodige componenten voor de groei van Mycobacteria. Voor de bereiding van 1 l agar en 1 l bouillon wordt respectievelijk 5 ml en 2 ml glycerol afgemeten en gemengd met respectievelijk 885 ml en 888 ml milliQ, dat de gewenste hoeveelheid gehydrateerd poeder bevat. Aan deze 900 ml wordt 100 ml OADC/ADC enrichment toegevoegd bij 55°C (agar) en 45°C (bouillon), nadat de media geautoclaveerd zijn. Samenstelling per 900 ml 7h10-agar: [50]
Samenstelling per 900 ml 7h9-bouillon: [51]
ammoniumsulfaat:
0,5 g
ammoniumsulfaat:
0,5 g
monokaliumfosfaat:
1,5 g
monokaliumfosfaat:
1,0 g
dinatriumfosfaat:
1,5 g
dinatriumfosfaat:
2,5 g
natriumcitraat:
0,4 g
natriumcitraat
0,1 g
magnesiumsulfaat:
25,0 mg
magnesiumsulfaat:
0,5 g
calciumchloride:
0,5 mg
calciumchloride:
0,5 mg
zinksulfaat:
1,0 mg
zinksulfaat:
1,0 mg
kopersulfaat:
1,0 mg
kopersulfaat:
1,0 mg
L-glutaminezuur :
0,5 g
L-glutaminezuur:
0,5 g
Ijzer ammoniumcitraat:
0,04 mg
Ijzer ammoniumcitraat:
0,04 g
Pyridoxine
pyridoxine
1,0 mg
biotine
0,5 mg
hydrochloride:
1,0 mg
biotine:
0,5 mg
malachiet groen :
250,0 µg
agar:
15,0 g
25
Samenstelling per liter OADC enrichment:[50] Samenstelling per liter ADC enrichment: [51]
natriumchloride:
8,5 g
natriumchloride:
8,5 g
dextrose:
20,0 g
dextrose:
20,0 g
runder albumine (fractie V):
50,0 g
runder albumine (fractie V):
50,0 g
katalase:
0,03 g
katalase:
0,03 g
oliezuur:
0,6 ml
3.1.9. AB-oplossingen De componenten, weergegeven in tabel 3.2., worden geëvalueerd op basis van hun effect op de groei van planktonische en sessiele bacteriële cellen in respectievelijk MIC- (minimale inhiberende concentratie) en MBIC (minimale biofilm inhiberende concentratie)experimenten. Tabel 3.2.: AB gebruikt in de MIC- en MBIC(*)-experimenten, met moleculair gewicht (MG) Component
MG DOXP-inhibitoren
FosmidomycineNa(a) * (b)
FR900098Na *
205,08 g/mol 219,11 g/mol
(c)
5-ketoclomazone
253,69 g/mol
(b)
239,70 g/mol
(b)
477,57 g/mol
Clomazone
Ritanserine * Ketanserine
(b)
4(3H)-pyrimidinone
545,51 g/mol (b)
96,09 g/mol Referentie-AB
Kanamycine sulfaat(b) *
582,58 g/mol
Rifampicine(b) *
822,24 g/mol
Isoniazide(d) *
137,14 g/mol
(a) Invitrogen Life Technologies, Eugene, Oregon, USA (b) Sigma aldrich, St.Louis, USA; Sigma aldrich chemie GmbH, Steinheim (c) Echelon Biosciences, Inc. (d) Janssen Pharmaceutica, Beerse, België
Voor de MIC-experimenten (zie 3.2.) wordt van elke component een oplossing van 500 µM bereid, die in de microtiterplaat ½ verdund zal worden zodat de hoogste concentratie die getest wordt gelijk is aan 250 µM. Aangezien de hoeveelheid stof die moet afgewogen 26
worden om 10 ml oplossing van 500 µM te bekomen (te berekenen via het MG) te laag is om nauwkeurig af te wegen op de balans, dient steeds een hoog geconcentreerde stockoplossing aangemaakt te worden. In het geval van kanamycine, FR900098, fosmidomycine, isoniazide, ritanserine, ketanserine en 4(3H)-pyrimidinone kan hiertoe bijvoorbeeld een stockoplossing van 5 mM gemaakt worden. Voor rifampicine wordt geopteerd voor een stockoplossing van 2,5 mM vermits de oplosbaarheid hiervan in water slechts 2,5 mg/ml bedraagt. De stockoplossing voor 5ketoclomazone en clomazone wordt best bereid in het potje waarin de stof bewaard wordt, omdat deze stoffen te viskeus zijn om nauwkeurig af te wegen. Alle stockoplossingen kunnen gemaakt worden in milliQ water, behalve deze voor 5ketoclomazone, clomazone, ritanserine en ketanserine waarvan de MSDS-fiche vermeldt dat deze onoplosbaar zijn in water. De oplosbaarheid van deze stoffen in dimethylsulfoxide (DMSO) bedraagt > 10 mg/ml, waardoor DMSO als solvent in aanmerking komt. Er dient echter rekening gehouden te worden met het feit dat DMSO toxisch is voor bacteriën en daarom mag de uiteindelijke DMSO-concentratie in de MIC- en MBIC-platen de grens van 2 % niet overschrijden. De bereiding van de stockoplossingen van 5-ketoclomazone, clomazone en ritanserine gebeurt dus door oplossen van de componenten in DMSO, gevolgd door aanlengen met milliQ water tot het gewenste volume. Vervolgens wordt uit de stockoplossing het gewenste volume (Vgeconcentreerd in vergelijking 3.2.) genomen en aangelengd tot 10 ml om te komen tot de werkoplossing van 500 µM. Mgeconcentreerd*Vgeconcentreerd = Mverdund*Vverdund
(3.2)
waarin: Mgeconcentreerd: molariteit van de stockoplossing (µM) Vgeconcentreerd: volume stockoplossing (ml) Mverdund: molariteit van de werkoplossing (µM) Vverdund: volume werkoplossing (ml) Alle oplossingen dienen gefiltreerd te worden (zie 3.1.4) vóór gebruik, met uitzondering van van de DMSO-oplossingen aangezien DMSO in staat is de filters aan te tasten. In dit laatste geval zal de steriliteit moeten verzekerd worden door zo aseptisch mogelijk te werken. 27
De componenten die afdoding vertonen in de MIC-experimenten, worden verder onderzocht naar hun effect op biofilms in MBIC-experimenten (zie 3.3.). Dit zijn: kanamycine (voor E. coli, P. aeruginosa, P. acnes), FR900098 (voor E. coli), fosmidomycine (voor E. coli, P. aeruginosa), ritanserine (voor E. coli, M. smegmatis, P. acnes, B. cenocepacia), rifampicine (voor M. smegmatis) en isoniazide (voor M. smegmatis). In tegenstelling tot de MICexperimenten waarbij de verdunningen aangemaakt worden in de microtiterplaat zelf met behulp van een multipipettor, zullen we voor de MBIC-experimenten alle nodige oplossingen op voorhand klaar maken in steriele plastieken potjes. Zo worden 8 oplossingen gemaakt, te beginnen bij de hoogste concentratie van 250 µM en deze vervolgens telkens ½ te verdunnen om ten slotte een oplossing van 1,95 µM te bekomen als laagste concentratie (in geval van E. coli + kanamycine zijn de te testen concentraties 62,5 µM t.e.m. 0,49 µM). De bereiding van de 250 µM oplossing gebeurt uitgaande van een stockoplossing. Ook hier worden de oplossingen best vóór de aanvang van de experimenten gefiltreerd (zie 3.1.4.), met uitzondering van de DMSO-oplossingen. 3.2. BEPALING VAN DE MINIMAAL INHIBERENDE CONCENTRATIE (MIC) De minimaal inhiberende concentratie (MIC) is de laagste concentratie AB waarbij geen zichtbare groei meer waar te nemen is in de microtiterplaat. De MIC-experimenten worden uitgevoerd in drievoud om een reproduceerbaar resultaat te bekomen. 3.2.1. Antibioticum-microtiterplaat Voor de MIC-experimenten zijn 96-well microtiterplaten (MTP) met platte bodem (TPP, Trasadingen, Zwitserland) ter beschikking. De MTP wordt gevuld met 100 µl milliQ, met
uitzondering van de rijen B t.e.m. G van kolom 1 (6 kuipjes in totaal). Deze worden gevuld met 200 µl van 6 verschillende AB met een concentratie van 500 µM (zie 3.1.9). Voor de MIC-experimenten met E. coli, P. aeruginosa, B. cenocepacia en P. acnes enerzijds zijn dat fosmidomycine, kanamycine, FR900098, 5-ketoclomazone, clomazone en ritanserine, voor de MIC-experimenten met M. smegmatis anderzijds gaat het om fosmidomycine, rifampicine, isoniazide, 5-ketoclomazone, clomazone en ritanserine. Vervolgens wordt uit elk van deze 6 kuipjes 100 µl genomen met behulp van een multipipettor en gemengd met de 100 µl milliQ in kolom 2 (rijen B t.e.m. G) door 3 keer op 28
en neer te pipetteren. Zo wordt de 500 µM AB-oplossing uit kolom 1 ½ verdund in kolom 2, dit betekent dat de concentratie hier 250 µM bedraagt. Deze bewerking wordt herhaald t.e.m. kolom 10, zodat van kolom tot kolom telkens een 2-voudige verdunning tot stand komt. De rijen A en H en kolom 11 worden niet gevuld met AB-oplossing en zullen fungeren als blanco. Ook kolom 12 bevat geen AB en zal dienst doen als groeicontrole (GC). Deze AB-platen kunnen eventueel op voorhand aangemaakt worden en ingevroren worden in de diepvries bij -20°C gedurende enkele weken. 3.2.2. Microtiterplaat inzetten met kiemsuspensie en absorptiebepaling Bij de MIC-experimenten wordt uitgegaan van een O/N cultuur (zie 3.1.3.) in vloeibaar steriel medium (zie 3.1.8.) op basis van een reincultuur die maximaal 24 uur oud is (zie 3.1.2). De OD van de O/N cultuur wordt gemeten met een spectrofotometer (zie 3.1.5) en wordt via de regel van 3 herleid tot een OD van 0,05 (in geval van M. smegmatis tot een OD van 0,6). Hiervan wordt een 1/50 verdunning van 10 ml (ongeveer 100 µl x 96 kuipjes nodig) in steriel dubbel geconcentreerd medium gemaakt. Ter controle van de steriliteit van het medium en correctie van de gemeten absorpties, worden rij A en H en kolom 11 gevuld met 100 µl steriel dubbel geconcentreerd medium. De 1/50 verdunde kiemsuspensie wordt toegevoegd aan de kuipjes gevuld met AB (kolom 1 t.e.m. 10, rij B t.e.m. G) volgens stijgende AB-concentratie (d.w.z. van rechts naar links in de MTP) en aan de kuipjes die dienst doen als GC (B12 t.e.m. G12). Aangezien de MTP hier reeds met 100 µl AB gevuld is, wordt hierdoor de AB-concentratie in elk kuipje ½ verdund. Een volledig overzicht van de MIC-plaat, zoals beschreven in sectie 3.2.1. en 3.2.2., wordt weergegeven in figuur 3.4.
29
Figuur 3.4.: Overzicht van de MIC-plaat. (BL= blanco, GC= groeicontrole, AB-concentraties : 250 µM t.e.m. 0,49 µM) Ten slotte worden zowel de blanco (dubbel geconcentreerd medium) als de gebruikte kiemsuspensie uitgeplaat op een voedingsbodem om de mogelijkheid op contaminatie uit te sluiten. Dit gebeurt via de plaatstrijkmethode met behulp van een steriele drigalsky spatel. Ten slotte wordt na 24u incubatie (48u in geval van M. smegmatis) de absorptie in elk kuipje gemeten bij 590 nm, gebruik makend van de Envision multilabel microtiter plaat lezer (zie 3.1.6). Er worden ook nog MIC-experimenten uitgevoerd met ketanserine en 4(3H)-pyrimidinone. De uitvoering kan analoog gebeuren aan bovenstaande beschrijving, waarbij nu telkens 1 microtiterplaat wordt aangemaakt per AB en deze wordt behandeld met 2 (M. smegmatis en P. acnes) of 3 (E. coli, P. aeruginosa en B. cenocepacia) verschillende kiemen. 3.3. BEPALING VAN DE MINIMALE BIOFILM INHIBERENDE CONCENTRATIE (MBIC) De minimale biofilm inhiberende concentratie is de laagste AB-concentratie die de groei van sessiele cellen inhibeert. De MBIC-experimenten worden in drievoud uitgevoerd. 3.3.1. Inzetten van de biofilm, spoeling en behandeling Analoog aan de MIC-experimenten, wordt voor de bepaling van de MBIC gestart van een O/N cultuur waarvan een kiemsuspensie met gewenste OD (zie tabel 3.3.) gemaakt wordt. 30
Deze OD is zo gekozen dat een goede biofilmvorming verzekerd is. Tabel 3.3.: Elke kiem met de respectievelijke OD en AB gebruikt in de MBIC-experimenten Kiem
OD
Te testen AB
E. coli
0,05
kanamycine, FR900098, fosmidomycine, ritanserine
P. aeruginosa
0,2
kanamycine
B. cenocepacia
0,05
ritanserine
P. acnes
0,5
kanamycine, ritanserine
M. smegmatis
0,2
rifampicine, isoniazide, ritanserine
Een steriele MTP met U-vormige kuipjes (TPP, Trasadingen, Zwitserland) doet dienst als statisch in vitro biofilm-modelsysteem voor de studie van microbiële biofilms. De MTP wordt geïnoculeerd met 100 µl kiemsuspensie, met uitzondering van de buitenste kuipjes. Deze worden gevuld met steriel medium en fungeren als blanco. Ook hier worden kiemsuspensie en blanco uitgeplaat als controle. De MTP wordt geïncubeerd bij 37°C voor een periode van 4 uur, waarin adhesie aan de bodem van de kuipjes kan plaatsvinden. Hierna wordt het supernatans, dat nog planktonische cellen bevat, verwijderd en de biofilm wordt gewassen met 100 µl fysiologisch water (FW). Nadien wordt 100 µl vers steriel medium toegevoegd, gevolgd door een incubatieperiode van 20 uur waarin de biofilm zich kan ontwikkelen. Na de incubatie wordt het supernatans opnieuw weggehaald en wordt de biofilm ook opnieuw gespoeld met FW. Vervolgens wordt de biofilm behandeld met AB met een maximum van 2 AB per plaat (3 kuipjes per AB-concentratie). Tabel 3.3. illustreert per kiem welke AB getest worden, namelijk deze waarvan in de MIC-experimenten het effect op planktonische cellen aangetoond werd. Hiertoe worden, in oplopende AB-concentratie van kolom 3 t.e.m. kolom 10, de rijen B t.e.m D gevuld met één AB en de rijen E t.e.m. G met een tweede AB. De AB-oplossingen die hiervoor nodig zijn, worden reeds op voorhand aangemaakt zoals beschreven in sectie 3.1.9. De niet-geïnoculeerde kuipjes of blanco’s (rij A, rij H, kolom 1 en kolom 12) en de kuipjes met GC (kolom 2 en 11) worden in deze stap gevuld met FW en vormen respectievelijk de negatieve en positieve controle. Een schematisch overzicht van de biofilmexperimenten is weergegeven in figuur 3.5. 31
Figuur 3.5.: Overzicht van de MBIC-plaat (BL= blanco, GC= groeicontrole, AB-concentraties: 250 µM t.e.m. 1,95 µM (voor E.coli+kanamycine: 62,5 µM t.e.m. 0,49 µM)) 3.3.2. Kwantificatie Om het effect van AB op biofilms te evalueren wordt de fractie sessiele cellen die de behandeling overleven gekwantificeerd. In dit onderzoek worden 2 methoden gebruikt voor de kwantificatie van de biofilm biomassa: de resazurinekleuring enerzijds (indirecte kwantificatie) en de uitplating anderzijds (directe kwantificatie). 3.3.2.1. Resazurinekleuring Om de fractie levende cellen in de biofilm te detecteren, wordt gebruik gemaakt van resazurine. Resazurinekleuring is dus een leefbaarheidskleuring, die afhankelijk is van de aanwezigheid van metabool actieve cellen. Het is namelijk zo dat enkel deze cellen in staat zullen zijn het niet-fluorecente resazurine te reduceren tot het fluorescente resorufine (figuur 3.6.). Hiertoe worden eerst de AB en FW verwijderd en wordt de biofilm opnieuw gespoeld met FW. Nadat het FW van de MTP verwijderd is, wordt 120 µl CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI, USA) toevoegd. De incubatie gebeurt bij 37°C gedurende 1 uur (voor E. coli is dit een half uur). De fluorescentie wordt gemeten met de Envision multilabel microtiter plaat lezer (zie 3.1.6.). Hoe meer metabool actieve cellen aanwezig zijn, des te meer de reductie van resazurine tot resorufine zal optreden en des te meer fluorescentie zal gemeten worden.
32
Figuur 3.6.: Omzetting van het niet-fluorescente resazurine tot het fluorescente resorufine door metabool actieve cellen. [25] Het voordeel van deze kwantificatiemethode is dat ze snel uit te voeren is, maar daartegenover staat wel dat ze de nodige apparatuur vereist. Bovendien is optimalisatie vereist, is er slechts 1 signaal per (gemengde) biofilm, kunnen enkel relatieve waarden bepaald worden en is het gemeten signaal geen directe aanwijzing tot het aantal cellen. Daarom voeren we ook een directe kwantificatie uit, die toelaat het absolute aantal cellen te tellen. Deze methode heeft wel als nadeel dat ze tijdrovend en arbeidsintensief is en dat bacteriën die wel groeien maar geen kolonies vormen (VBNC, viable but not culturable) niet in rekening gebracht kunnen worden. Het resultaat van uitplatingen is dus een maat voor het aantal kweekbare bacteriën. 3.3.2.2. Uitplating Uitplating is een directe kwantificatiemethode, die toelaat de micro-organismen te kweken en te tellen. Hiervoor wordt al het biofilmmateriaal losgemaakt in de kuipjes door 5 min. schudden op de titramax (Heidolph instruments, Duitsland) en 5 min. soniceren (BransonIC 3510 ultrasonic cleaner, Danbury, USA). De inhoud van de kuipjes (dezelfde als die gebruikt werden voor de resazurinekleuring) worden vervolgens per AB-concentratie gecollecteerd in steriele flacons en na toevoeging van FW wordt het schudden en soniceren nog eens herhaald. Figuur 3.7.: plaatgietmethode [25] De bekomen celsuspensies worden toegevoegd aan de flacons en dit wordt aangelengd met FW tot een volume van 10 ml (= onverdunde kiemsuspensie). 33
Voor de plaatgietmethode (zie figuur 3.7.) wordt van elke AB-concentratie plus de GC en blanco een verdunningsreeks bereid van 100 t.e.m. 10-6. Van iedere verdunning wordt vervolgens 1 ml op een steriele petriplaat gebracht en deze wordt homogeen gemengd met gesmolten en tot ± 48 °C afgekoelde steriele agar. Na stollen kunnen de petriplaten geïncubeerd worden bij 37°C. 24 uur later (48 uur in geval van M. smegmatis) zijn de kolonies voldoende gegroeid om op één of meerdere platen een telbaar (bv. 30-300) aantal kolonies te bekomen. 3.4. CHECKERBOARD ASSAY Deze experimenten zijn vergelijkbaar met de MIC-experimenten met het verschil dat bij een checkerboard assay het effect van een combinatie van 2 AB op de groei van planktonische cellen wordt nagegaan. De experimenten worden driemaal herhaald. De uitvoering is analoog aan de MIC-experimenten. Er wordt ook gestart van een O/N cultuur (zie 3.1.3.), waarvan een kiemsuspensie met OD 0,05 (OD 0,6 in geval van M. smegmatis) gemaakt wordt, die op zijn beurt 1/50 verdund wordt in steriel dubbelgeconcentreerd medium. De AB-oplossingen worden aangemaakt in concentraties van 250 µM t.e.m. 3,9 µM (in geval van E. coli 62,5 µM t.e.m. 0,98 µM) in steriele plastieken potjes. De kolommen 3 t.e.m. 10 van een MTP met platte bodem worden gevuld met een combinatie van 2 AB. Een overzicht van de combinaties die per kiem bestudeerd worden, wordt weergegeven in tabel 3.4. Tabel 3.4: De te testen combinaties AB, weergeven per kiem E. coli
B. cenocepacia
M. smegmatis
Kanamycine+fosmidomycine
Ritanserine+fosmidomycine
Ritanserine+rifampicine
Ritanserine+fosmidomycine
Ritanserine+FR900098
Ritanserine+isoniazide
Kanamycine+FR900098
Rifampicine+isoniazide
Ritanserine+FR900098
Ritanserine+fosmidomycine
Kanamycine+ritanserine
Rifampicine+fosmidomycine
Eerst wordt de MTP van onder naar boven toe gevuld met 25 µl oplopende concentraties 34
van een eerste AB, waarbij rij H gevuld wordt met 25 µl milliQ. Vervolgens wordt van links naar rechts 25 µl van een tweede AB in oplopende concentratie toegevoegd, waarbij kolom 3 gevuld wordt met 25 µl milliQ. De blanco (kolom 1 en 12) en de GC (kolom 2 en 11) worden gevuld met respectievelijk 100 µl en 50 µl dubbelgeconcentreerd steriel medium. Vervolgens wordt in alle kuipjes met GC en AB (d.w.z. kolom 2-11) 50 µl van de 1/50 verdunde kiemsuspensie gebracht. De plaat wordt geïncubeerd bij 37°C gedurende 24u (48u in geval van M. smegmatis). Uiteindelijk wordt de absorptie bij 590 nm gemeten met de Envision (zie 3.1.6). Een volledig overzicht van de MTP is weergegeven in figuur 3.8.
Figuur 3.8.: Overzicht van de MTP voor de checkerboard assay Om GM-interacties te beschrijven, wordt meestal gebruikt gemaakt van de Fractional Inhibitory Concentration (FIC) index. Deze wordt als volgt berekend: FIC index = (A/MICA) + (B/MICB) = FICA + FICB
(vgl. 3.3.)
Waarin: A: MIC van AB1 in combinatie met AB2 MICA: MIC van AB1 alleen B: MIC van AB2 in combinatie met AB1 MICB: MIC van AB2 alleen Indien de FIC kleiner is dan 0,5 dan duidt dit op een synergistisch effect, een FIC groter dan 4 wijst op antagonisme. 35
4. RESULTATEN 4.1. MIC-BEPALING VAN DOXP-INHIBITOREN De gevoeligheid van 5 kiemen (zie tabel 3.1.), die uitsluitend de DOXP-pathway gebruiken voor isoprenoïdsynthese, wordt bepaald t.o.v. verschillende DOXP-inhibitoren (zie tabel 3.2.). Na 24u incubatie (48u bij M. smegmatis) wordt de absorptie gemeten bij 590 nm. De resultaten van de MIC-experimenten zijn per kiem samengevat in onderstaande tabel. Voor de componenten die bij een kiem geen afdoding geven, bedraagt de MIC meer dan de hoogst geteste concentratie, namelijk meer dan 250 µM. Voor E. coli wordt de MIC voor fosmidomycine en FR900098 vastgelegd op 62,5 µM, voor ritanserine op 125 µM en voor kanamycine op 3,9 µM. Bij P. aeruginosa behandeld met kanamycine bedraagt de MIC 62,5 µM. Voor P. acnes worden MIC’s gevonden van 125 µM voor ritanserine en 31,25 µM voor kanamycine. Ten slotte tonen de MIC-experimenten met M. smegmatis MIC’s aan van 125 µM voor ritanserine, 62,5 µM voor isoniazide en 31,25 µM voor rifampicine. Tabel 4.1.: Overzicht van de MIC’s voor de DOXP-inhibitoren en AB, weergegeven per kiem Component
MIC (µM) E. coli
P. aeruginosa
P. acnes
M. smegmatis
K12
PAO1
LMG 16711
ATCC 700084
Fosmidomycine
62,5 (*)
>250
>250
>250
FR900098
62,5 (*)
>250
>250
>250
5-ketoclomazone
>250
>250
>250
>250
Clomazone
>250
>250
>250
>250
Ritanserine
125 (*)
>250
125 (*)
125 (*)
Ketanserine
>250
>250
>250
>250
4(3H)pyrimidinone
>250
>250
>250
>250
Kanamycine
3,9 (*)
62,5 (*)
31,25 (*)
Isoniazide
62,5 (*)
Rifampicine
31,25 (*)
(*)
Hiervan wordt het inhiberend effect op sessiele cellen later geëvalueerd.
Bij B. cenocepacia wordt met geen enkele component een volledige afdoding bereikt. 36
Wanneer behandeld wordt met ritanserine is er wel een lichte daling van de absorbantie waarneembaar (zie figuur 4.1.). Voor ketanserine, eveneens een thiazolopyrimidine, wordt echter geen inhiberend effect waargenomen.
Absorbantie bij 590 nm
0,7 0,6 fosmidomycine
0,5
FR900098
0,4
5-ketoclomazone
0,3
clomazone
0,2
ritanserine
0,1
ketanserine pyrimidinone
0 0
100
200
300
AB concentratie (µM)
Figuur 4.1.: MIC-experiment van B. cenocepacia behandeld met verschillende DOXP-inhibitoren 4.2. MBIC-BEPALING VAN DOXP-INHIBITOREN Alle componenten die in tabel 4.1. aangeduid worden met een (*) hebben het vermogen om de proliferatie van planktonische cellen te inhiberen. We wensen te bepalen of de aangehaalde DOXP-inhibitoren bij de respectievelijke kiemen ook de groei van biofilms, gevormd door deze kiemen, kunnen verstoren. De componenten worden toegevoegd aan de kuipjes van een microtiterplaat waarin gedurende 24u (48u in geval van M. smegmatis) biofilms zich hebben ontwikkeld. De fractie levende cellen na 24u behandeling wordt bepaald m.b.v. de resazurinekleuring. Het gemeten fluorescentiesignaal is immers recht evenredig met het aantal metabool actieve cellen. Het aantal KVE aanwezig in de biofilm wordt bepaald door uitplating. De resultaten van beide kwantificatiemethoden worden uitgedrukt relatief t.o.v. de GC, dit is de positieve controle waaraan geen AB is toegevoegd. Enkel
voor
B.
cenocepacia
worden
interpreteerbare
resultaten
bekomen
na
resazurinekleuring (figuur 4.7.). Bij de andere kiemen geeft de resazurinekleuring steeds in de behandelde kuipjes hogere fluorescentiewaarden dan in kuipjes met GC. Daarom worden voor deze kiemen uitsluitend de resultaten weergegeven die bekomen werden via uitplating. 37
4.2.1. Resultaten van MBIC-experimenten met E. coli De MIC-experimenten tonen aan dat vanaf 3,9 µM kanamycine de groei van planktonische cellen van E. coli volledig geïnhibeerd wordt. De cellen in de E. coli biofilm blijken echter resistenter te zijn tegen kanamycine. Hoewel er bij 3,9 µM al een reductie van 35 % in het aantal KVE t.o.v. de GC gezien wordt, zal volledige groei-inhibitie pas tot stand komen vanaf 62,5 µM (p < 0,05). Met andere woorden: de MBIC voor E. coli behandeld met kanamycine bedraagt 62,5 µM, zoals geïllustreerd in figuur 4.2. Bij behandeling met fosmidomycine, ritanserine en FR900098 wordt in geen van de geteste concentraties een volledige afdoding van sessiele E. coli cellen geobserveerd en er kan dus geen MBIC bepaald worden. De resultaten van deze uitplatingen worden weergegeven in figuur 4.2. Hierin wordt de laagste AB-concentratie getoond waarbij een bepaalde reductie in aantal KVE t.o.v. GC gezien wordt.
aantal KVE per biofilm t.o.v. GC (%)
140 120 100 80 60 40 20
*
0 GC
62,5 µM kana.
250 µM fosm.
125 µM rit.
125 µM FR900098
Figuur 4.2.: Afdodend effect van kanamycine, fosmidomycine, ritanserine en FR900098 (in de aangeduide concentraties) op E. coli biofilms Bij E. coli biofilms worden bij 250 µM fosmidomycine en 125 µM ritanserine nog ongeveer 80 % van het aantal KVE t.o.v. GC gezien. Voor 125 µM FR900098 is dit iets minder, zo’n 70 %. Deze reducties zijn niet statistisch significant (p > 0,05). 4.2.2. Resultaten van MBIC-experimenten met P. acnes Bij behandeling met kanamycine en ritanserine wordt in geen van de geteste concentraties 38
een volledige afdoding van sessiele P. acnes cellen geobserveerd en er kan dus geen MBIC bepaald worden. De resultaten van deze uitplatingen worden weergegeven in figuur 4.3. Hierin wordt de laagste AB-concentratie getoond waarbij een bepaalde reductie in aantal KVE t.o.v. GC gezien wordt.
aantal KVE per biofilm t.o.v. GC (%)
140 120 100 80 60 40 20 0 GC
7,8 µM kana.
250 µM rit.
Figuur 4.3: Afdodend effect van kanamycine en ritanserine (in de aangeduide concentraties) op P. acnes biofilms Zoals figuur 4.3. aanduidt, wordt voor P. acnes biofilms reeds bij 7,8 µM kanamycine een reductie van 25 % gezien. Bij 250 µM ritanserine bedraagt deze reductie 40 %. Beide reducties zijn niet statistisch significant (p > 0,05). Figuur 4.4. toont aan dat wanneer de kanamycineconcentratie verhoogd wordt, een dosisafhankelijke respons/reductie gezien wordt, die eindigt in een statistisch significante reductie van 85 % bij 125 µM en van 90 % bij 250 µM (p < 0,05).
aantal KVE per biofilm t.o.v. GC (%)
140 120 100 80 60 40
*
20
*
0 -20
GC
1,95
3,9
7,8
15,6
31,25
conc. kanamycine (µM)
62,5
125
250
Figuur 4.4.: Dosisafhankelijke inhibitie van kanamycine op P. acnes biofilms 39
4.2.3. Resultaten van MBIC-experimenten met M. smegmatis Hoewel bij behandeling van planktonische M. smegmatis cellen met isoniazide een MICwaarde van 62,5 µM geobserveerd wordt, kan uit de MBIC-experimenten besloten worden dat isoniazide geen invloed heeft op M. smegmatis biofilms. Bij behandeling met ritanserine en rifampicine wordt wel een afdodend effect gezien op M. smegmatis sessiele cellen. Echter, in geen van de geteste concentraties wordt een volledige afdoding van sessiele M. smegmatis cellen geobserveerd en bijgevolg kan er geen MBIC bepaald worden. De resultaten van deze uitplatingen worden weergegeven in figuur 4.5. Hierin wordt de laagste AB-concentratie getoond waarbij een bepaalde reductie in aantal
aantal KVE per biofilm t.o.v. GC (%)
KVE t.o.v. GC gezien wordt.
140 120 100 80
*
60 40 20 0 GC
250 µM iso
250 µM rit.
250 µM rif.
Figuur 4.5.: Afdodend effect van isoniazide, ritanserine en rifampicine (in de aangeduide concentraties) op M. smegmatis biofilms Voor M. smegmatis biofilms behandeld met 250 µM ritanserine wordt het aantal KVE t.o.v. de GC vastgelegd op ongeveer 50 %. Dit is een statistisch significante reductie in biofilm biomassa vergeleken met de GC (p < 0,05). Voor de behandeling met 250 µM rifampicine wordt 40 % reductie geobserveerd. Deze waarde is niet statistisch significant (p > 0,05). 4.2.4. Resultaten van MBIC-experimenten met P. aeruginosa Hoewel kanamycine effectiviteit aantoont op planktonische cellen van P. aeruginosa, heeft het in geen van de geteste concentraties een effect op sessiele P. aeruginosa cellen (zie figuur 4.6.). 40
aantal KVE per biofilm t.o.v. GC (%)
140 120 100 80 60 40 20 0 GC
250 µM kana
Figuur 4.6: Resultaten behandeling P. aeruginosa biofilms met 250 µM kanamycine 4.2.5. Resultaten van MBIC-experimenten met B. cenocepacia Bij behandeling met ritanserine wordt in geen van de geteste concentraties een volledige afdoding van sessiele B. cenocepacia cellen geobserveerd en er kan dus geen MBIC bepaald worden. De resultaten van de uitplating en resazurinekleuring worden weergegeven in figuur 4.7. Hierin wordt de laagste AB-concentratie getoond waarbij een bepaalde reductie gezien wordt in respectievelijk aantal KVE t.o.v. GC (resultaat uitplating) en fluorescentiesignaal t.o.v. GC (resultaat resazurinekleuring). 140 120 100 80
*
60
Uitplating CTB
40 20 0 GC
250 µM rit.
Figuur 4.7: Afdodend effect van 250 µM ritanserine op B. cenocepacia biofilms, weergegeven als aantal KVE per biofilm t.o.v. GC (resultaat uitplating) en als gemeten fluorescentiesignaal t.o.v. GC (resultaat resazurinekleuring) 41
Bij B. cenocepacia wordt bij behandeling met 250 µM ritanserine het aantal KVE t.o.v. GC vastgelegd op 66 %, wat niet statistisch significant is (p > 0,05). Deze waarde sluit nauw aan bij het resultaat van de resazurinekleuring, die een fluorescentiewaarde van 68 % aangeeft t.o.v. de GC en statistisch significant verschillend is t.o.v. de GC (p > 0,05). 4.3. CHECKERBOARD ASSAYS In de checkerboard assays is, bij elke geteste kiem, voor geen enkele combinatie van antibiotica (zie tabel 3.4.) een synergistisch (FIC < 0,5) of antagonistisch effect (FIC > 4) waarneembaar. 4.3.1. Resultaten van checkerboard assays met E. coli Tabel 4.2. toont de FIC-waarden voor E. coli behandeld met de combinatie kanamycine met FR900098 en kanamycine met fosmidomycine. Tabel 4.2.: Overzicht FIC’s van combinaties van DOXP-inhibitoren voor E. coli FR900098
kanamycine
1,95 µM
31,25 µM
62,5 µM
FIC = 0,5
0,5 < FIC < 4
3,9 µM
fosmidomycine 62,5 µM
125 µM
FIC = 0,5
0,5 < FIC < 4
Voor de overige geteste combinaties (ritanserine+fosmidomycine, ritanserine+FR900098, kanamycine+ritanserine) kunnen geen FIC-waarden berekend worden, aangezien de MICwaarden voor één of beide AB groter is dan 250 µM (hoogst geteste AB-concentratie). 4.3.2. Resultaten van checkerboard assay met B. cenocepacia Voor geen van de geteste combinaties (ritanserine+fosmidomycine, ritanserine+FR900098) kunnen FIC-waarden berekend worden, aangezien de MIC-waarden voor één of beide AB groter is dan 250 µM (hoogst geteste AB-concentratie). 4.3.3. Resultaten van checkerboard assay met M. smegmatis Tabel 4.3. toont de FIC-waarden voor M. smegmatis behandeld met de combinatie rifampicine met isoniazide.
42
Tabel 4.3.: Overzicht FIC’s van de combinatie van tuberculostatica voor M. smegmatis isoniazide 62,5 µM rifampicine
7,8 µM 125 µM
125 µM
250 µM
0,5 < FIC < 4
0,5 < FIC < 4
0,5 < FIC < 4
Voor de overige geteste combinaties (ritanserine+rifampicine, ritanserine+isoniazide, ritanserine+fosmidomycine,
rifampicine+fosmidomycine)
kunnen
geen
FIC-waarden
berekend worden, aangezien de MIC-waarden voor één of beide AB groter is dan 250 µM (hoogst geteste AB-concentratie).
43
5. DISCUSSIE 5.1. ACTIVITEIT VAN FOSMIDOMYCINE EN FR900098 Bij E. coli worden voor fosmidomycine en FR900098 MIC’s gevonden van 62,5 µM. Voor P. aeruginosa, B. cenocepacia en M. smegmatis liggen de MIC’s voor deze componenten boven de hoogst geteste concentratie, namelijk boven 250 µM. Deze resultaten zijn niet geheel onverwacht. Fosmidomycine en FR900098 behoren immers tot de best bestudeerde DOXP-inhibitoren en in de literatuur zijn hierover al verschillende zaken beschreven. Zo werd bij E. coli een MIC gevonden van 69 µM voor fosmidomycine. [29] Fosmidomycine en FR900098 zijn potente inhibitoren van het geïsoleerde Dxr van E. coli. [30] Ook is aangetoond dat fosmidomycine, een hydrofiele molecule, kan opgenomen worden door E. coli via actief transport gebruik makend van de glycerol-3-fosfaat transporter (GlpT). [8] Dit gegeven is van belang, aangezien een gereduceerde opname in vele gevallen resistentie tegen fosmidomycine kan verklaren. Zo is bijvoorbeeld het recombinant Dxr van M. tuberculosis gevoelig aan fosmidomycine, maar zijn intacte cellen van M. tuberculosis en M. smegmatis intrinsiek resistent tegen fosmidomycine. De afwezigheid van glpT homologen in het genoom van deze bacteriën en het hydrofobe mycobacterieel omhulsel zijn wellicht verantwoordelijk voor deze resistentie. [19] Een ander mogelijk resistentiemechanisme dat in de literatuur beschreven wordt, is de aanwezigheid van een fosmidomycine-resistentie gen (fsr) dat codeert voor een efflux pomp. B. cenocepacia bevat zo’n fsr gen (BCAL1451) en bovendien is gebleken dat dit gen bij behandeling met fosmidomycine of FR900098 opgereguleerd wordt. Dit kan de resistentie van B. cenocepacia tegenover deze componenten verklaren. [8] Verschillende onderzoeken rapporteren over de synthese van andere fosmidomycineanalogen.
Zo werden er reeds goede resultaten bekomen met α-arylgesubstitueerde
fosmidomycine-analogen bij in vitro studies met het gezuiverde Dxr van E. coli. [30] Beloftevolle resultaten blijven echter uit wanneer fosmidomycine (en analogen) getest worden
op
intacte
bacteriële
cellen.
Bijkomend
resistentiemechanismen is dan ook noodzakelijk.
44
onderzoek
naar
mogelijke
Eens mogelijke resistentiemechanismen opgehelderd zijn, dient onderzoek verricht te worden naar oplossingen om deze mechanismen te omzeilen. Voor de hierboven vermelde resistentiemechanismen worden in verscheidene artikels dan ook mogelijke oplossingen naar voor geschoven. Indien de opname problematisch is maar de molecule het gezuiverde Dxr wel inhibeert, zoals bij M. tuberculosis, kan fosmidomycine wel effectief worden op celniveau indien de molecule geoptimaliseerd wordt naar celpenetratie toe. [19] Dit kan bijvoorbeeld door de synthese van lipofiele prodrugs. [19], [29] Indien deze componenten toch geen activiteit vertonen, dient de vrijgave van de actieve component in de cel (bv. door hydrolyse van een esterprodrug) nader bestudeerd te worden. Indien de resistentie te wijten is aan de aanwezigheid van effluxpompen, kan onderzoek met effluxpomp-inhibitoren mogelijks verbetering geven. [19] 5.2. ACTIVITEIT VAN THIAZOLOPYRIMIDINES De meeste studies die terug te vinden zijn in de literatuur leggen zich toe op de studie van fosmidomycine en analogen. Over thiazolopyrimidines is nog maar weinig beschreven. De resultaten die in deze studie met ritanserine bekomen werden, waren dus interessant. Ritanserine inhibeert volledig de groei van planktonische cellen van E. coli en P. acnes met een MIC van 125 µM. Ook bij M. smegmatis veroorzaakt ritanserine een volledige groeiinhibitie vanaf 125 µM. Deze MIC-waarde is respectievelijk het tweevoud en viervoud van de bekomen MIC’s voor de tuberculostatica isoniazide (MIC= 62,5 µM) en rifampicine (MIC= 31,25 µM). Bij B. cenocepacia behandeld met ritanserine wordt geen volledige afdoding gezien. Er wordt echter wel een zeker inhiberend effect geobserveerd, dat nader onderzocht dient te worden, aangezien deze resultaten meer beloftevol lijken dan deze met fosmidomycine (waarvoor resistentie aangetoond is). Een HTS naar het mogelijk inhiberend effect van deze thiazolopyrimidines op het IspF van planten (als alternatief voor het IspF van P. falciparum en M. tuberculosis), werd reeds in de literatuur beschreven. [33], [34], [35] Op basis van de resultaten die dit onderzoek naar voor brengt, blijken deze verbindingen bovendien effectief op intacte bacteriële cellen. Ook Hawas et al. bespreken een inhiberend effect van thiazolopyrimidine-derivaten op E. coli, maar de resultaten kunnen moeilijk vergeleken worden met bovenstaande, aangezien een 45
verschillende assay gebruikt werd. [37] Omwille van de succesvolle resultaten die bekomen werden met ritanserine, werd later ook het effect van ketanserine op de verschillende kiemen onderzocht. Deze verbinding vertoonde echter geen groei-inhibitie op de geteste kiemen. In de toekomst zou onderzoek naar het effect van nog andere thiazolopyrimidines op deze en andere pathogene bacteriën interessant kunnen zijn. 5.3. ACTIVITEIT VAN DXS-INHIBITOREN Clomazone en ketoclomazone staan reeds bekend voor hun herbicide-eigenschappen. Echter, in dit onderzoek hebben deze componenten geen invloed op de groei van planktonische cellen van de geteste kiemen. Dit geldt ook voor de later geteste component 4(3H)-pyrimidinone. 5.4. BIOFILMEXPERIMENTEN In het algemeen geldt dat sessiele cellen minder gevoelig zijn aan antibacteriële therapie in vergelijking met planktonische cellen. Er zijn reeds verschillende resistentiemechanismen opgehelderd. [25], [26] Dit onderzoek blijkt de verhoogde resistentie in biofilms te bevestigen. Immers: concentraties waarbij in de MIC-experimenten een volledige afdoding verwezenlijkt wordt, vertonen in de MBIC-experimenten geen volledige afdoding meer. Hierbij dient opgemerkt te worden dat, voor het merendeel van de geteste componenten, wel een bepaalde afdoding gezien wordt t.o.v. de GC, zij het bij hogere concentraties dan de MIC. Bij E. coli wordt met ritanserine een vergelijkbaar effect verkregen als met fosmidomycine en dit bij een dosis die 2 keer zo laag is (80 % KVE t.o.v. GC, respectievelijk bij 125 µM en 250 µM). Ook bij B. cenocepacia blijkt ritanserine een goede activiteit te vertonen: 250 µM ritanserine reduceert de biofilmgroei tot ongeveer 70 % t.o.v. de GC. Dit resultaat is interessant gezien B. cenocepacia biofilms in staat zijn ernstige, moeilijk te behandelen longinfecties te veroorzaken bij mucoviscidosepatiënten. [52] Hoewel de rol van P. acnes biofilmvorming bij acné nog onduidelijk is [21], kunnen de componenten die in deze (en de MIC-) experimenten succesvolle resultaten bieden, 46
mogelijks een plaats krijgen in de aanpak van multi-resistente acné. Het nieuwe werkingsmechanisme van bijvoorbeeld ritanserine t.o.v. reeds bestaande AB zoals clindamycine, heeft in deze studie immers effectiviteit bewezen. Zo wordt bij 250 µM ritanserine het aantal KVE t.o.v. GC gereduceerd tot 60 %, de MBIC is groter dan de hoogst geteste concentratie van 250 µM (MIC voor ritanserine = 125 µM). De literatuur vermeldt een MBIC voor clindamycine van ≥ 301 µM (en MIC voor clindamycine = 0,29 µM). [53] Dezelfde gedachte over de mogelijke toekomst van DOXP-inhibitoren in de behandeling van MDR infecties kan doorgetrokken worden naar de aanpak van MDR tuberculose. Bij M. smegmatis veroorzaakt ritanserine een statistisch significante reductie in KVE t.o.v. GC van 50 % (p < 0,05) en een klinisch relevante MIC van 125 µM. Vergeleken met de resultaten van de tuberculostatica isoniazide en rifampicine, zijn deze resultaten interessant.
47
6. CONCLUSIE Uit de resultaten van dit onderzoek kan besloten worden dat de DOXP-pathway mogelijks een
beloftevol
doelwit
vormt
in
de
ontwikkeling
van
AB
met
een
nieuw
werkingsmechanisme. Er werden namelijk succesvolle resultaten bereikt met moleculen die de DOXP-pathway inhiberen. Het opmerkelijkste resultaat werd bekomen met ritanserine, een molecule die in staat is het vijfde enzym van de DOXP-pathway (het MECP synthase) te inhiberen. Deze component is een voorbeeld van een thiazolopyrimidine. Hoewel er nog maar weinig onderzoek werd gedaan naar het antibacterieel effect van deze thiazolopyrimidines, blijken deze componenten in dit onderzoek zeker potentieel te hebben. Op planktonische cellen van E. coli, P. acnes en M. smegmatis vertoont ritanserine een volledig inhiberend effect bij een concentratie van 125 µM. Wanneer we dit vergelijken met de resultaten die bekomen werden voor het reeds bestudeerde fosmidomycine, kan besloten worden dat ritanserine mogelijks een goed alternatief vormt voor kiemen die resistentie vertonen tegenover fosmidomycine (zoals P. acnes en M. smegmatis). Bij E. coli bedraagt de MIC van ritanserine het dubbel van de MIC van fosmidomycine en FR900098, respectievelijk 125 µM en 62,5 µM, maar ook deze hogere concentratie kan als klinisch relevant beschouwd worden. Ook blijkt de werking van ritanserine op biofilms redelijk uitgesproken te zijn. Bij E. coli biofilms worden met 125 µM ritanserine zo goed als gelijke reducties bekomen als met 125 µM FR900098 of 250 µM fosmidomycine. Voor P. acnes biofilms wordt een statistisch significante reductie van 85 % (p < 0,05) gezien bij behandeling met 125 µM kanamycine t.o.v. 40 % (p > 0,05) bij 250 µM ritanserine. Bij M. smegmatis biofilms wordt een statistisch significante reductie van 50 % (p < 0,05) waargenomen met 250 µM ritanserine. Bij P. aeruginosa wordt echter geen invloed gezien van ritanserine, noch op planktonische, noch op sessiele cellen. De goede activiteit van ritanserine kan mogelijks verklaard worden door zijn lipofiele structuur (log P = 5,2 [54]) (o.a. te wijten aan de verschillende aromatische ringen), waardoor een verhoogde opname in de cel verwacht wordt in vergelijking met het meer
48
hydrofiele fosmidomycine (log P = -2,47 [55]). Om een beter inzicht te krijgen in een mogelijke toepassing van bijvoorbeeld ritanserine naar de klinische praktijk toe, kan deze component getest worden in meer geavanceerde modellen zoals invertebraten (bv. Caenorhabditis elegans en Galleria mellonella). Bovendien kan met deze in vivo modellen de toxiteit van de componenten geëvalueerd worden. Ritanserine werd reeds onderzocht als 5HT2-antagonist en werd in de studie van Wiesel et al. bij 10 schizofreniepatiënten goed verdragen. [56] Ook Barone et al. toonden de veiligheid van 10 mg en 20 mg ritanserine aan bij 12 gezonde vrijwilligers. [57]
49
LITERATUURLIJST [1] cursus Microbiologie, H.Nelis, 2012 [2] French, G.L., 2005, Clinical impact and relevance of antibiotic resistance, Advanced Drug Delivery
Reviews 57, 1514-1527
[3] Uh, E., Jackson, E.R., San Jose, G., Maddox, M., Lee, R.E., Lee, R.E., Boshoff, H.I., Dowd, C.S., 2011. Antibacterial and antitubercular activity of fosmidomycin, FR900098, and their lipophilic analogs. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6973–6976. [4] Lange, B.M., Rujan, T., Martin, W., Croteau, R., 2000. Isoprenoid biosynthesis: the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 13172–13177. [5] Heuston, S., Begley, M., Gahan, C.G.M., Hill, C., 2012. Isoprenoid biosynthesis in bacterial pathogens. Microbiology 158, 1389–1401. [6] cursus Medische Biochemie, J. Van Bocxlaer, 2011 [7] Richard, S.B., Bowman, M.E., Kwiatkowski, W., Kang, I., Chow, C., Lillo, A.M., Cane, D.E., Noel, J.P., 2001. Structure of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol synthetase involved in mevalonate-independent isoprenoid biosynthesis. Nat. Struct. Mol. Biol. 8, 641–648. [8] Messiaen, A.-S., Verbrugghen, T., Declerck, C., Ortmann, R., Schlitzer, M., Nelis, H., Van Calenbergh, S., Coenye, T., 2011. Resistance of the Burkholderia cepacia complex to fosmidomycin and fosmidomycin derivatives. Int. J. Antimicrob. Agents. [9] LiPuma, J.J., 2010. The Changing Microbial Epidemiology in Cystic Fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 23, 299–323. [10] Peeters, C., Zlosnik, J.E.A., Spilker, T., Hird, T.J., LiPuma, J.J., Vandamme, P., 2013. Burkholderia pseudomultivorans sp. nov., a novel Burkholderia cepacia complex species from human respiratory samples and the rhizosphere. Syst. Appl. Microbiol. 36, 483–489. doi:10.1016/j.syapm.2013.06.003 [11] The ACFBAL study group, Manos, J., Hu, H., Rose, B.R., Wainwright, C.E., Zablotska, I.B., Cheney, J., Turnbull, L., Whitchurch, C.B., Grimwood, K., Harmer, C., Anuj, S.N., Harbour, C., 50
2013. Virulence factor expression patterns in Pseudomonas aeruginosa strains from infants with cystic fibrosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32, 1583–1592. doi:10.1007/s10096013-1916-7 [12]http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/articles/biofiles/dietaryterpenes/dietary-figure-1-v3a9.gif (10/05/2014) [13] Peters, B.M., Jabra-Rizk, M.A., O’May, G.A., Costerton, J.W., Shirtliff, M.E., 2012. Polymicrobial Interactions: Impact on Pathogenesis and Human Disease. Clin. Microbiol. Rev. 25, 193–213 [14] Holden, M.T.G., Seth-Smith, H.M.B., Crossman, L.C., Sebaihia, M., Bentley, S.D., Cerdeno-Tarraga, A.M., Thomson, N.R., Bason, N., Quail, M.A., Sharp, S., Cherevach, I., Churcher, C., Goodhead, I., Hauser, H., Holroyd, N., Mungall, K., Scott, P., Walker, D., White, B., Rose, H., Iversen, P., Mil-Homens, D., Rocha, E.P.C., Fialho, A.M., Baldwin, A., Dowson, C., Barrell, B.G., Govan, J.R., Vandamme, P., Hart, C.A., Mahenthiralingam, E., Parkhill, J., 2008. The Genome of Burkholderia cenocepacia J2315, an Epidemic Pathogen of Cystic Fibrosis Patients. J. Bacteriol. 191, 261–277. [15] Coenye, T. (2010). Social interactions in the Burkholderia cepacia complex: biofilm formation and quorum sensing. Future Microbiol 5: 1087-1099 [16] Shiloh, M.U., DiGiuseppe Champion, P.A., 2010. To catch a killer. What can mycobacterial models teach us about Mycobacterium tuberculosis pathogenesis? Curr. Opin. Microbiol. 13, 86–92. [17]http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547833_eng.pdf?ua=1 (23/03/2014) [18] http://www.who.int/features/qa/79/en/ (23/03/2014) [19] Brown, A.C., Parish, T., 2008. Dxr is essential in Mycobacterium tuberculosis and fosmidomycin resistance is due to a lack of uptake. BMC Microbiol. 8, 78. [20] Bowman, J., Ghosh, P., 2014. A complex regulatory network controlling intrinsic multidrug resistance in Mycobacterium smegmatis: Regulation of M. smegmatis drug resistance. Mol. Microbiol. 91, 121–134. doi:10.1111/mmi.12448 51
[21] Coenye, T., Peeters, E., Nelis, H.J., 2007. Biofilm formation by Propionibacterium acnes is associated with increased resistance to antimicrobial agents and increased production of putative virulence factors. Res. Microbiol. 158, 386–392. [22] Hoover, W.D., Davis, S.A., Fleischer, A.B., Feldman, S.R., 2014. Topical antibiotic monotherapy prescribing practices in acne vulgaris. J. Dermatol. Treat. 25, 97–99. doi:10.3109/09546634.2013.852297 [23] H.H. Tan, Topical antibacterial treatment for acne vulgaris, Am. J. Clin. Dermatol. 5 (2004) 79-84 [24]https://www.nhg.org/standaarden/volledig/nhg-standaard-acne#idm233136 (5/5/2014) [25] cursus Gevorderde Microbiologie, T.Coenye, 2013 [26] Fux, C.A., Costerton, J.W., Stewart, P.S., Stoodley, P., 2005. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13, 34–40. doi:10.1016/j.tim.2004.11.010 [27]
https://www.biofilm.montana.edu/files/CBE/images/CBE-03_BFin3steps.preview.jpg
(12/04/2014) [28] Forier, K., Messiaen, A., Coenye, T., Nelis, H., Celen, S., Van Caelenbergh, S., De Smedt, S., Demeester, J., Braeckmans K., 2010. Transport and delivery of antimicrobial agents in Burkholderia biofilms, Abstracts/Journal of Controlled Release 148, e21-e56 [29] Uh, E., Jackson, E.R., San Jose, G., Maddox, M., Lee, R.E., Lee, R.E., Boshoff, H.I., Dowd, C.S., 2011. Antibacterial and antitubercular activity of fosmidomycin, FR900098, and their lipophilic analogs. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6973–6976. [30] Umeda, T., Tanaka, N., Kusakabe, Y., Nakanishi, M., Kitade, Y., Nakamura, K.T., 2011. Molecular basis of fosmidomycin’s action on the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Sci. Rep. 1. [31] Kashyap S.J., Sharma P.K., Garg V.K., Dudhe R., Kumar N., 2011, Review on the synthesis
and the biological potential Thiazolopyrimidine derivative. J Adv Sci Res, 2(3): 18-24 [32] Jain, K.S., Chitre, T.S., Miniyar, P.B., Kathiravan, M.K., Bendre, V.S., Veer, V.S., Shahane, S.R., Shishoo, C.J., 2006. Biological and medicinal significance of pyrimidines. Curr. Sci.52
BANGALORE- 90, 793. [33] Hale I., O’Neill P.M., Berry N.G., Odom A., Sharma R., 2012. The MEP pathway and the development of inhibitors as potential anti-infective agents. Med. Chem. Commun., 3, 418433 [34] Witschel M., Röhl F., Niggeweg R., Newton T., 2013. In search of new herbicidal inhibitors of the non-mevalonate pathway. Pest Manag Sci, 69, 559-563 [35] Geist J.G., Lauw S., Illarionova V., Illarionov B., Fischer M., Gräwert T., Rohdich F., Eisenreich W., Kaiser J., Groll M., Scheurer C., Wittlin S., Alonso-Gómez J.L., Schweizer W.B., Bacher A., Diederich F., 2010. Thiazolopyrimidine inhibitors of 2-Methylerythritol 2,4cyclodiphosphate Synthase (IspF) from Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium falciparum. ChemMedchem, 5, 1092-1101 [36] Fatima, S., Sharma, A., Saxena, R., Tripathi, R., Shukla, S.K., Pandey, S.K., Tripathi, R., Tripathi, R.P., 2012. One pot efficient diversity oriented synthesis of polyfunctional styryl thiazolopyrimidines and their bio-evaluation as antimalarial and anti-HIV agents. Eur. J. Med. Chem. 55, 195–204. doi:10.1016/j.ejmech.2012.07.018 [37] Hawas, U.W., Al-Omar, M.A., Amr, A.G.E., Hammam, A.E.-F.G., 2012. Synthesis of some thiopyrimidine
and
thiazolopyrimidines
starting
from
2,6-dibenzylidene-3-
methylcyclohexanone and its antimicrobial activities. Arab. J. Chem. 5, 509–515. doi:10.1016/j.arabjc.2010.09.019 [38] http://www.sigmaaldrich.com/belgium-nederlands.html (12/04/2014) [39] Mueller et al., 2010, properties and inhibition of the first two enzymes of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis [40] Zeidler et al., 2010, the non-mevalonate isoprenoid biosynthesis of plants as a test system for drugs against malaria and pathogenic bacteria [41] http://www.echelon-inc.com/ (12/04/2014) [42] http://www.genome.wisc.edu/resources/strains.htm (12/04/2014) [43] http://www.pseudomonas.com/genomeMenu.do?strain_id=107 (12/04/2014) 53
[44] http://www.straininfo.net (12/04/2014) [45] http://hamap.expasy.org/proteomes/MYCS2.html (12/04/2014) [46]http://www.ebay.com/sch/sis.html?_kw=Milton+Roy+Spectronic+20D+Spectrophotome ter+Scientific+Lab+Equipment (12/04/2014) [47] http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/2104-0010 (12/04/2014) [48] http://www.millipore.com/lab_water/clw4/microbiological_media (12/04/2014) [49] http://www.labm.com/ (12/04/2014) [50]http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/221174.pdf (12/04/2014) [51]http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/271310.pdf (12/04/2014) [52] Høiby, N., 2011. Recent advances in the treatment of Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis. BMC Med. 9, 32. [53] Furustrand Tafin, U., Corvec, S., Betrisey, B., Zimmerli, W., Trampuz, A., 2012. Role of Rifampin against Propionibacterium acnes Biofilm In Vitro and in an Experimental ForeignBody
Infection
Model.
Antimicrob.
Agents
Chemother.
56,
1885–1891.
doi:10.1128/AAC.05552-11 [54] http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/87051-43-2 (27/05/2014) [55] http://www.lookchem.com/Fosmidomycin/ (27/05/2014) [56]
Frits-Axel Wiesel, A.-L. Nordström, L. Farde, Bo Eriksson, An open clinical and
biochemical study of ritanserin in acute patients with schizophrenia. Psychopharmacology, february 1994, volume 114, issue 1, pp 31-38 [57] Barone JA, Bierman RH, Cornisch JW, Hsuan A, Drake ND, Colaizzi JL, Safety evaluation of ritanserine, an investigational serotonin antagonist. Drug Intell Clin Pharm, 1986, 20(10): 77
54
BIJLAGE: INTERNATIONALIZATION AT HOME – PROF. CROMMELIN Het overkoepelend thema van de lezingen is een kijk op het verleden, de huidige situatie en de toekomst van de farmaceutische wetenschappen, met een focus op de toekomst. 1. Openingslezing: Impact van farmaceutische wetenschappen gedurende de voorbije 50 jaar en ... Quo vadis? Deze lezing begint met de vraag wat de farmaceutische wetenschap de voorbije 50 jaar bereikt heeft. Als we teruggaan naar 1964, zien we toch verschillen met de huidige situatie. Zo waren er toen geen veilige en effectieve behandelingen voor essentiële hypertensie, wat een verhoogd risico op vroegtijdige sterfte met zich mee bracht. Gelukkig zijn er sinds de jaren 1970-1980 wel geneesmiddelen (GM) als Captopril (ACE-inhibitor) en Lovastatine op de markt, die het risico op hart- en vaatziekten doen dalen. Hoewel er vóór 1960 onduidelijkheid was over wat GM precies deden in het lichaam (als ze al geabsorbeerd werden), kon men nadien wel bloedconcentraties meten en de biologische beschikbaarheid bepalen. Ook werd geïnvesteerd in nieuwe formulaties (bv. MDI, DPI, OROS). Bovendien werd steeds meer interesse getoond in het doelgericht afleveren van GM en het verzekeren van de kwaliteit. Nochtans wordt het steeds moeilijker om GM te ontwikkelen. Dit komt voornamelijk door de strenge regelgeving, die de huidige farma-industrie tot een conservatieve industrie maakt. De toekomst zou zich kunnen toeleggen op het integreren van verschillende –omics (zoals genomic, transcriptomic, proteomic, metabolomic) om hiermee een persoonlijke profiel op te maken. Dit profiel zou voor een individuele patiënt het risico op de ontwikkeling van bepaalde ziektes, maar ook de effectiviteit van een GM kunnen voorspellen (waarbij de apotheker een rol kan spelen). 2. Biotech neemt het over en we kunnen er ons maar beter op voorbereiden (deel 1), Het generisch paradigma herzien: biosimilars en non-biological complex drugs (NBCD) (deel 2) Biologicals zijn proteïnen die therapeutisch gebruikt worden. Een lijst met de 10 meest verkochte geneesmiddelen wereldwijd bevat 7 biologicals. Toch is het niet vanzelfsprekend dat zij de huidige markt van laag MG geneesmidellen zullen overnemen. Een eerste reden hiervoor is dat ze enorm duur zijn. Ook is de karakterisatie van deze proteïnen met hun secundaire en tertiaire vouwing niet zo eenvoudig en zijn ze over het algemeen onstabiel. 55
Bovendien bestaat er het risico op het ontwikkelen van een immuunrespons. Ten slotte dienen ze geïnjecteerd te worden, hoewel op dit vlak al vele inspanningen geleverd zijn om het gemak van de patiënt te verhogen (orale nanocapsulen, pulmonaire route, transdermaal, needle-free injections), echter zonder veel succes. Voor laag MG geneesmiddelen is het zo dat voor generieken farmaceutische en bioequivalentie moet aangetoond worden t.o.v. het origineel product. Voor biologicals is dit iets gecompliceerder, aangezien ze niet voor 100% chemisch en fysisch gekarakteriseerd kunnen worden. De EMEA heeft protocols opgesteld die aangeven hoe een biosimilar dient gemaakt te worden. Klinische studies spelen hier een belangrijke rol in. Verschillende voorbeelden tonen echter aan dat innovaties mogelijk zijn. Veranderingen in bv. formulatie kunnen nochtans leiden tot serieuze bijwerkingen, zoals PRCA door een wijziging in EPO-formulatie. 3. GM targeting: no fantastisch voyages so far (verontschuldigingen aan Asimov) (deel 1), Dierexperimenten: wat proberen dieren ons te vertellen? (deel 2) Hier wordt ingegaan op drug targeting stategieën, met de focus op nanomedicines (10-100 nm). Aangezien in de tumor het endotheel meer doorlatend is, kunnen deze deeltjes hier passeren (en niet inwerken op ander weefsel). De effectiviteit van nanomedicines is afhankelijk van het EPR (‘enhanced permeability and retention’) effect. Wanneer we dit EPR effect in beeld brengen en zo kunnen kijken of een bepaalde patiënt lekkende vaten heeft, kunnen we beslissen om nanopartikels toe te dienen. Deze combinatie van drug targeting en beeldvorming kent mogelijks een toepassing in ‘personalized medicine’. Het nut van dierproeven wordt steeds vaker in vraag gesteld. Niet alleen bestaat er speciesspecificiteit, ook blijken de meeste serieuze bijwerkingen voorspeld te kunnen worden o.b.v. farmacologie. Bovendien zijn de dieren die we gebruiken gestandaardiseerd, terwijl de mens verschilt in grootte, leeftijd, gezondheid,... Daarom groeit de interesse voor big data (bv. verzameling van verschillende –omics) en personalized medicine. 4. Eigen mening Het positieve aan deze lezingen vind ik dat ze aanzetten tot kritisch denken over de toekomst van de farmaceutische wetenschappen. Hoewel de onderwerpen mij aanspreken, ben ik over de inhoud enigszins teleurgesteld. 56
57
