6‐10‐2014
Biosynthese Metabolic engineering 8 Oktober 2014
CV
1982 Studie Moleculaire Wetenschappen, WU 1989 Promotie productie monoklonale antilichamen ● Bioprocestechnologie&RIVM
1994-2001 Post-docs 2001 Universitair docent bioprocestechnologie ● Farmaceutische eiwitten ● 2008 Algentechnologie
Biosynthese
Maken van producten met behulp van enzymen. ● Losse enzymen: biokatalyse ● Beperkt aantal stappen ● Micro-organismen. ● Complexe metabole routes
1
6‐10‐2014
Penicilline G Acylase
Producten
Bulkchemicaliën ● Halffabricaten: Melkzuur, Citroenzuur, ... ● Veevoer: Lysine,... ● Biobrandstoffen: ethanol, butanol, propanol, biodiesel
Semi-bulk ● Medicijnen: Antibiotica ● Levensmiddelen: PUFA’s, kleur en smaakstoffen ● Enzymen (wasmiddelen)
Producten
Specialities ● Medicijnen ● Farmaceutische eiwitten ● Complexe moleculen ● Vaccins
2
6‐10‐2014
Waarom biosynthese?
Chemisch niet mogelijk ● Complexe moleculen (multistap synthese) ● Stereospecifiek
Milieuvriendelijk ● Milde condities ● Minder chemisch afval
Olie gebaseerde economie
Biobased economy
3
6‐10‐2014
Catabolisme en Anabolisme glucose
Pyruvaat Citraat ......
CO2
Amino zuren
NH3
O2
Ethanol
Eiwit Vetten DNA/RNA Suikers
ATP NADH/ NADPH
Monoclonaal antilichaam
Aminozuren
melkzuur
Collageen
Glycolyse GLC
PYR
G6P
PEP
F6P
2PG
ATP ADP
ADP H 2O
ATP ADP
3PG
F16P
DHAP
ATP
ATP
P GAP
13PG NAD+
ADP
NADH
Glycolyse GLC
FRU ATP ADP
G6P
Aromatic amino acids Polysaccharides DNA/RNA
PEP
Lipids
2PG
F16P
3PG
ADP
ATP
P GAP
13PG NAD+
ATP
Alanine Lysine Valine
H 2O
F6P ATP ADP
DHAP
PYR
Serine Glycine Cysteine
ADP
NADH
4
6‐10‐2014
Glycolyse anaeroob GLC PEP
2PG
ATP ADP
ADP H2O
G6P
ATP
3PG ATP
F6P ATP ADP
PYR CO2
ADP
13PG
ACA NADH
F16P
NAD+ GAP
DHAP
LAC ETH
P
H2O
3ADP ADP+P
ATP
3ATP
NADH+0.5O2
H2O
Citroenzuur cyclus NAD+
NADH
CO2 AcCoA
PYR
CITR
CoA
ICITR
OXA NADH
NAD+
NAD+
NADH
FADH2
NAD+
MAL
CO2 FUM
CoA
FAD
AKG CoA
NADH
SUC
SUCCoA GTP
CO2
GDP+Pi
Citroenzuur cyclus AcCoA
Lipids
ICITR
OXA
ASP Pyr
Lysine
CITR
NADH
NAD+
NAD+
NADH
FADH2
NAD+
MAL
CO2 FUM
FAD
CoA
NADH
SUC
SUCCoA GTP
GLU
AKG CoA CO2
GDP+Pi
5
6‐10‐2014
Citroenzuur cyclus: Anaplerotische routes + CoA NAD
NADH CO2
PYR
PEP
C2
AcCoA
CITR
CO2
ATP
C6
C2
ADP
GLYOX
OXA CO2
ICITR
C4
MAL AKG FUM SUC
SUCCoA
C4
Pentose fosfaat route NADP+ NADPH G6P
6PGL
NADP+ NADPH
CO2
6PG
DNA/RNA
Ri5P
H2O H+ R5P
X5P PEP
S7P
GAP
E4P F6P Phenylalanine Tyrosine
CHO
Tryptophan
Biosynthese in de praktijk
Bestaand micro-organisme ● Selecteer micro-organisme ● Maak het geschikt voor grote schaal
Plug Bug ● Micro-organisme geschikt voor grote schaal ● Eschericia coli ● Sacharomyces cereviseae ● Zet de route er in ● Zoek de benodigde enzymen ● Genetische modificatie
6
6‐10‐2014
Elektronen balans
A (GAP)
B (1,3-PG)
M1 (NAD)
M2 (NADH)
D (LAC)
Moiety
C (PYR)
Thermodynamica
S1+S2P1+P2
[ P1] [ P 2] G G 0 RT ln [ S1] [ S 2] In evenwicht ΔG=0: 1 G 0 RT lnK eq G 0 RT ln K eq
[ products] G RT ln K [ Subtrates] eq
Thermodynamica
G RT ln K eq
[ products] [ Subtrates]
( mass action ratio) K eq
Stappen in evenwicht: G = 0 (/Keq = 1) Stappen uit evenwicht: G < 0 (/Keq < 1) Stappen met grote G: ver uit evenwicht Elke stap en hele route: G < 0
7
6‐10‐2014
Thermodynamica
Voorbeeld 1. Ethanol
Lignocellulose ● Hernieuwbare grondstof ● Geen competitie met voedsel ● Samenstelling ● 15-25% Lignine----> Chemie ● 38-50% cellulose-----> Ethanol ● 23-32% Hemicellulose-----> Ethanol?
Behandeling
8
6‐10‐2014
Pentose fosfaat route CO2
Xylulose ATP
Xylose
ADP NADPH
NADH
X5P
Xylitol NAD+
NADP+
Ri5P
G6P R5P S7P
GAP
E4P F6P
Ethanol
Voorbeeld 2. Artemisinine
Saccharomyces cerivisiae Blauw: direct overexpressie Paars: indirect overexpressie Rood: remming Groen: Nieuw ● Artemisia annua
100 mg/l
Reacties vinden
atggtacgtatctatac gttgacacttgcgccct ctctcgatagcgcaac aattaccccgcaaattt atcccgaaggaaaact gcgctgtaccgcaccg gtgttcgaacccgggg gcggc........
F6P2-+ATP4- = F16P4-+ADP3-+H+
Ec 2.1.7.11 Localization
9
6‐10‐2014
Reacties vinden
Atgtcagaacgtttccc aaatgacgtggatccg atcgaaactcgcgact ggctccaggcg......
Ec 1.2.4.1 atggctatcgaaatcaa agtaccggacatcggg gctgatgaagttgaaat caccgagatc...... atgagtactgaaatcaa aactcaggtcgtggta cttggggcaggcccc gcaggttactcc......
PYR+CoA+NAD--> AcCoA+CO2+NADH
Ec 2.3.1.12
Ec 1.8.1.4
Olie productie in algen
Koolstof fixatie: Calvin cyclus 0.0000
0.0000
8.3224 5.5482
8.3224
2.7741
2.7741
16.6447 5.5482
2.7741
2.7741 2.7741
2.7741
12.5000
10
6‐10‐2014
Vragen?
11
