Biosynthese. Biosynthese. Metabolic engineering. 8 Oktober 2014

6‐10‐2014

Biosynthese Metabolic engineering 8 Oktober 2014

CV

 1982 Studie Moleculaire Wetenschappen, WU  1989 Promotie productie monoklonale antilichamen ● Bioprocestechnologie&RIVM

 1994-2001 Post-docs  2001 Universitair docent bioprocestechnologie ● Farmaceutische eiwitten ● 2008 Algentechnologie

Biosynthese

 Maken van producten met behulp van enzymen. ● Losse enzymen: biokatalyse ● Beperkt aantal stappen ● Micro-organismen. ● Complexe metabole routes

1

6‐10‐2014

Penicilline G Acylase

Producten

 Bulkchemicaliën ● Halffabricaten: Melkzuur, Citroenzuur, ... ● Veevoer: Lysine,... ● Biobrandstoffen: ethanol, butanol, propanol, biodiesel

 Semi-bulk ● Medicijnen: Antibiotica ● Levensmiddelen: PUFA’s, kleur en smaakstoffen ● Enzymen (wasmiddelen)

Producten

 Specialities ● Medicijnen ● Farmaceutische eiwitten ● Complexe moleculen ● Vaccins

2

6‐10‐2014

Waarom biosynthese?

 Chemisch niet mogelijk ● Complexe moleculen (multistap synthese) ● Stereospecifiek

 Milieuvriendelijk ● Milde condities ● Minder chemisch afval

Olie gebaseerde economie

Biobased economy

3

6‐10‐2014

Catabolisme en Anabolisme glucose

Pyruvaat Citraat ......

CO2

Amino zuren

NH3

O2

Ethanol

Eiwit Vetten DNA/RNA Suikers

ATP NADH/ NADPH

Monoclonaal antilichaam

Aminozuren

melkzuur

Collageen

Glycolyse GLC

PYR

G6P

PEP

F6P

2PG

ATP ADP

ADP H 2O

ATP ADP

3PG

F16P

DHAP

ATP

ATP

P GAP

13PG NAD+

ADP

NADH

Glycolyse GLC

FRU ATP ADP

G6P

Aromatic amino acids Polysaccharides DNA/RNA

PEP

Lipids

2PG

F16P

3PG

ADP

ATP

P GAP

13PG NAD+

ATP

Alanine Lysine Valine

H 2O

F6P ATP ADP

DHAP

PYR

Serine Glycine Cysteine

ADP

NADH

4

6‐10‐2014

Glycolyse anaeroob GLC PEP

2PG

ATP ADP

ADP H2O

G6P

ATP

3PG ATP

F6P ATP ADP

PYR CO2

ADP

13PG

ACA NADH

F16P

NAD+ GAP

DHAP

LAC ETH

P

H2O

3ADP ADP+P

ATP

3ATP

NADH+0.5O2

H2O

Citroenzuur cyclus NAD+

NADH

CO2 AcCoA

PYR

CITR

CoA

ICITR

OXA NADH

NAD+

NAD+

NADH

FADH2

NAD+

MAL

CO2 FUM

CoA

FAD

AKG CoA

NADH

SUC

SUCCoA GTP

CO2

GDP+Pi

Citroenzuur cyclus AcCoA

Lipids

ICITR

OXA

ASP Pyr

Lysine

CITR

NADH

NAD+

NAD+

NADH

FADH2

NAD+

MAL

CO2 FUM

FAD

CoA

NADH

SUC

SUCCoA GTP

GLU

AKG CoA CO2

GDP+Pi

5

6‐10‐2014

Citroenzuur cyclus: Anaplerotische routes + CoA NAD

NADH CO2

PYR

PEP

C2

AcCoA

CITR

CO2

ATP

C6

C2

ADP

GLYOX

OXA CO2

ICITR

C4

MAL AKG FUM SUC

SUCCoA

C4

Pentose fosfaat route NADP+ NADPH G6P

6PGL

NADP+ NADPH

CO2

6PG

DNA/RNA

Ri5P

H2O H+ R5P

X5P PEP

S7P

GAP

E4P F6P Phenylalanine Tyrosine

CHO

Tryptophan

Biosynthese in de praktijk

 Bestaand micro-organisme ● Selecteer micro-organisme ● Maak het geschikt voor grote schaal

 Plug Bug ● Micro-organisme geschikt voor grote schaal ● Eschericia coli ● Sacharomyces cereviseae ● Zet de route er in ● Zoek de benodigde enzymen ● Genetische modificatie

6

6‐10‐2014

Elektronen balans

A (GAP)

B (1,3-PG)

M1 (NAD)

M2 (NADH)

D (LAC)

Moiety

C (PYR)

Thermodynamica

S1+S2P1+P2

 [ P1]  [ P 2]   G  G 0  RT ln  [ S1]  [ S 2]  In evenwicht ΔG=0:  1   G 0   RT lnK eq   G 0  RT ln K   eq 

   [ products]    G  RT ln K  [  Subtrates]  eq 

Thermodynamica

     G  RT ln K   eq 

 [ products]  [ Subtrates]



 ( mass action ratio) K eq

 Stappen in evenwicht: G = 0 (/Keq = 1)  Stappen uit evenwicht: G < 0 (/Keq < 1)  Stappen met grote G: ver uit evenwicht  Elke stap en hele route: G < 0

7

6‐10‐2014

Thermodynamica

Voorbeeld 1. Ethanol

 Lignocellulose ● Hernieuwbare grondstof ● Geen competitie met voedsel ● Samenstelling ● 15-25% Lignine----> Chemie ● 38-50% cellulose-----> Ethanol ● 23-32% Hemicellulose-----> Ethanol?

Behandeling

8

6‐10‐2014

Pentose fosfaat route CO2

Xylulose ATP

Xylose

ADP NADPH

NADH

X5P

Xylitol NAD+

NADP+

Ri5P

G6P R5P S7P

GAP

E4P F6P

Ethanol

Voorbeeld 2. Artemisinine

 Saccharomyces cerivisiae  Blauw: direct overexpressie  Paars: indirect overexpressie  Rood: remming  Groen: Nieuw ● Artemisia annua

 100 mg/l

Reacties vinden

atggtacgtatctatac gttgacacttgcgccct ctctcgatagcgcaac aattaccccgcaaattt atcccgaaggaaaact gcgctgtaccgcaccg gtgttcgaacccgggg gcggc........

F6P2-+ATP4- = F16P4-+ADP3-+H+

Ec 2.1.7.11 Localization

9

6‐10‐2014

Reacties vinden

Atgtcagaacgtttccc aaatgacgtggatccg atcgaaactcgcgact ggctccaggcg......

Ec 1.2.4.1 atggctatcgaaatcaa agtaccggacatcggg gctgatgaagttgaaat caccgagatc...... atgagtactgaaatcaa aactcaggtcgtggta cttggggcaggcccc gcaggttactcc......

PYR+CoA+NAD--> AcCoA+CO2+NADH

Ec 2.3.1.12

Ec 1.8.1.4

Olie productie in algen

Koolstof fixatie: Calvin cyclus 0.0000

0.0000

8.3224 5.5482

8.3224

2.7741

2.7741

16.6447 5.5482

2.7741

2.7741 2.7741

2.7741

12.5000

10

6‐10‐2014

Vragen?

11