Módszerfejlesztés antibiotikumok meghatározására tejmintákból on-line szilárd fázisú extrakciós UHPLC-MS/MS módszerrel Élelmiszer Toxikológiai Nemzeti Referencia Laboratórium Susán Judit 2015. Április 23.
NÉBIH
Domány Gábor Pálffi Éva Lukonics Dóra Nagy Dániel Marosi Dóra
Szent István Egyetem ÁOTK
Dr. Lányi Katalin Dr. Könyves László Dr. Briedl Endre Szabó Piroska
Simkon Kft.
Dr. Kmellár Béla Vincze Lajos †Szakai Miklós
Bevezetés 5. témacsoport Állatorvosi gyógyszermaradékok vizsgálatok témacsoport Az Európai Unió szigorúan szabályozza az állati eredetű élelmiszerekben előforduló antibiotikumok mennyiségét, MRL értékeket határoz meg, ami mátrixonként és vegyületenként is eltérő lehet Low lipophilicity Strong acids
Penicillins Cephalosporins
Strong bases
Aminoglycosides
Moderate lipophilicity
High lipophilicity Költséghatékonyság szempontjából fontos cél a minél több vegyület egy méréssel történő meghatározása, amit azonban a komponensek sokszor igen eltérő fizikai-kémiai tulajdonsága korlátoz
Weak acids
Sulfonamides
Weak bases
Macrolides
Amphoteric
Tetracyclines (OTC, TC and CTC)
Fluoroquinolones
Fluoroquinolones (2d and 3d generation)
Bevezetés
Vizsgálataink célcsoportja a β-laktám antibiotikumok:
1. Penicillineket: Penicillin V, Penicillin G, Oxacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Nafcillin, Amoxicillin, Ampicillin és Penicillin G D7 (ISTD) 2. Cefalosporinokat: Cefalexin, Cefazolin, Cefoperazon, Cefapirin, Cefquinome, Ceftiofur és Cefalonium
Minta előkészítés A minta-előkészítés a mérés egy igen kritikus pontja: ki kell vonni a célvegyületeket a mintából valamilyen extrakciós eljárással, de ezzel együtt a lehető legjobban kell csökkenteni a mátrix jelenlétét. A mintatisztításra gyakran alkalmazott eljárás a szilárd fázisú extrakció (SPE), melynek során egy szorbens rétegen engedik át az adott térfogatú extraktumot. A szorbens megköti a számunkra értékes komponenseket, a zavaró mátrixot viszont nem, ezért az oldószeres lemosáskor már nem lesz az oszlopon és nem kerül bele az eluátumba. Az SPE technika laboratóriumi időigénye jelentős, manuálisan lehet végezni (több párhuzamos mintával is akár). Az SPE automatizálására volt már próbálkozás, de az a lépések automatizálását és nem a csapdázást alkalmazta, és HPLC-hez csatolt külön eszköz kellett hozzá.
• • • • •
Extrakció Rázatás Centrifugálás SPE dúsítás, tisztítás Eluálás Bepárlás Oldás Szűrés Injektálás
• • • • • • •
Extrakció Rázatás Centrifugálás Bepárlás Oldás Szűrés Injektálás
On-line SPE
• • • •
Minta előkészítés SPE nélkül
off-line SPE
Minta előkészítés módszerek
• • • • •
Extrakció Rázatás Centrifugálás Szűrés Injektálás on-line SPE
A szilárd fázisú extrakció lépései 1. Aktiválás Az oszlop aktiválása. Általában a kolonna közepes polaritású szerves oldószerrel való mosását, nedvesítését jelenti. Cél a szorbens szemcséi közötti térbõl a levegő eltávolítása, az aktív ligandumok szolvatációja és aktiválása. 2. Kondicionálás Az aktiválás után egy egyensúlyt beállító lépés következik, amit általában egy olyan oldószer 3. Mintafelvitel A meghatározandó anyag 4. Mosás Az oszlopon gyengébben kötődő szennyezők és a mintamátrix nem kötődő komponenseinek eltávolítása. A mosó oldószer szükségképpen a mintafelvitelinél erősebb, de az elúciós oldószernél gyengébb eluenserősségű, valamint lehetőleg azokkal elegyedő, hogy a kolonna teljes kiszárítását el lehessen kerülni, ami az elválasztás szempontjából kedvezőtlen. 5. Elúció A vizsgálandó komponensek szelektív leoldása az oszlopról. Törekedni kell arra, hogy az elúciót a lehető legkevesebb oldószerrel végezzük, hogy elkerüljük a minta hígulását.
SPE minta tisztítás és koncentrálás
Minta bemérés
On-line SPE HPLC
HPLC on-line SPE
Mérési paraméterek . Paraméter Áramlási sebesség (mL/perc) Gradiens: 0% B (3.5 percig), 90% B 13 percnél (tartja 2 percig), 0% B 15.5 percnél
0.3
HPLC
ESI
MS
Érték
Futtatási idő (perc)
20
Oszlop termosztát hőmérséklete
40
Nebulizing gas flow (porlasztógáz; mL/perc)
3
Heating gas flow (fűtött gáz; mL/perc)
10
Drying gas flow (szárítógáz; mL/perc)
10
Interface hőmérséklete (°C)
400
DL hőmérséklete (°C)
250
Heat block hőmérséklete (°C)
400
ESI tű távolsága a forrástól (mm; skála:[-2 ;10])
1.5
Q1 felbontás
Egység
Q3 felbontás
Eghység
üzemmód
+/- MRM
dwell time (msec)
20
pause time (msec)
1
On-line SPE
Nagy nyomású váltószelep: kezdetben 1-es pozíció, 3 percnél 0-s pozíció, 15.5 percnél 1-es pozíció
Minta előkészítés A cél az volt, hogy a lehető legegyszerűbb minta-előkésítést alkalmazzuk. A tejminták fehérjéket, tejcukrot és zsírokat tartalmaznak, amik injektálási mintába kerülését lehetőség szerint meg kell akadályozni. A fehérjéket kicsapással és centrifugálással, a zsírokat centrifugálással, a cukrokat részben centrifugálással lehet leválasztani. Ezért, kétféle kicsapási-előkészítési módszert próbáltunk ki: az acetonitriles és az ecetsavas kicsapást. A tejfehérjék a tej mennyiségével ekvivalens mennyiségű acetonitril hozzáadásával csapódnak ki, kevesebb acetonitril (kisebb hígítás) hozzáadásával nem centrifugálhatóak. 1 mL felülúszó, ami acetonitril-víz elegy, ezért 0.5 g tejet reprezentál. Ez azért fontos, mert az on-line SPE oszlopot 100% vizes eluenssel mossuk az injektálást követően, és a kis mennyiségű szerves oldószer is befolyással lehet a csúcsalakra és a visszatartásra. 100 µL mintamennyiség mellett megvizsgáltuk a csúcsalakokat a két extrakció esetén. Arra is kíváncsiak voltunk, hogy változik-e a csúcsalak, ha a 100 µL mintát kétféle módon viszem a rendszerbe: 5×20 vagy 2×50 µL formájában.
változik-e a csúcsalak, ha a 100 µL mintát kétféle módon viszem a rendszerbe: 5×20 vagy 2×50 µL formájában
változik-e a csúcsalak, ha a 100 µL mintát kétféle módon viszem a rendszerbe: 5×20 vagy 2×50 µL formájában
LOD:0.03 µg/kg MRL: 30 µg/kg
7-pontos kalibráció komponensre szabottan: 0.01 MRL – 5 MRL LOD-k: 0.001 – 0.1 µg/kg LOQ-k: 0.005 – 0.3 µg/kg
Összegzés Minta előkészítési eljárás Hatékonyabb Gyorsabb Olcsóbb
