Ha a vonatkozó cikkelyben nincs más előírás, az értékmérés során kapott megbízhatósági határok (P = 0,95) a becsült hatóérték 95–105%-án belül legyenek. A vizsgálatot az A vagy a B módszerrel végezzük.
0 1 / 2 0 0 9: 2 0 7 0 2
2 . 7 . 2. ANTIBIOTIKUMOK MIKROBIOLÓGIAI ÉRTÉKMÉRÉSE Az antibiotikumok hatóértékét úgy állapítjuk meg, hogy összehasonlítjuk a vizsgálandó antibiotikum és a referenciaanyag ismert koncentrációinak az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmusok szaporodására kifejtett gátló hatását. Az értékmérésekben alkalmazott referenciaanyagok olyan anyagok, amelyeknek aktivitását a megfelelő nemzetközi standardhoz vagy nemzetközi referenciakészítményhez viszonyítva pontosan meghatározták. Az értékmérést úgy kell megtervezni, hogy a hatóérték kiszámításának alapját képező matematikai modell érvényességét (validitását) ellenőrizhessük. Ha a párhuzamos egyenesek módszerét választjuk, akkor a vizsgálandó készítményre és a referenciaanyagra kapott log dózis-válasz (vagy transzformált válasz) görbéknek a számolás alapjául szolgáló koncentrációtartományban lineárisnak valamint egymással párhuzamosnak kell lenniük. Ezen feltételek teljesülését adott valószínűségi szinten (rendszerint P= 0,05) végzett validitási próbákkal igazolni kell. Más matematikai modell, pl. az iránytangens-hányados módszer is alkalmazható, ha annak érvényessége bizonyított.
A. DIFFÚZIÓS MÓDSZER A meghatározáshoz alkalmas táptalajt felolvasztjuk, és megfelelő hőmérsékleten, vegetatív alakok esetében pl. 48– 50 °C-on, beoltjuk a vizsgálandó antibiotikumra érzékeny mikroorganizmus szuszpenziójának ismert mennyiségével, úgy, hogy a meghatározáshoz használt antibiotikum-koncentrációk hatására megfelelő átmérőjű, egyértelműen mérhető gátlási zónák alakuljanak ki. A beoltott táptalajból a szükséges mennyiséget azonnal Petri-csészékbe vagy nagyméretű négyszögletes edényekbe öntjük, oly módon, hogy 2–5 mm-es, egyenletes vastagságú réteg keletkezzék. Kétrétegű táptalajjal is dolgozhatunk, ez esetben csak a felső réteget oltjuk be. A csészéket illetve edényeket ezután úgy tároljuk, hogy felhasználás előtt a mikroorganizmusok ne szaporodjanak, de ne is pusztuljanak észrevehető mértékben, és amikor a felhasználásra sor kerül, a táptalaj felülete száraz legyen. A 2.7.2.-1. táblázatban megadott oldószer és tompítóoldat felhasználásával a referenciaanyagból és a vizsgálandó
2.7.2.-1. táblázat – Diffúziós módszer A törzsoldat készítéséhez használt oldószer
Mikroorganizmus
Táptalaj és végső pH (±0,1 pH-egység)
Inkubációs hőmérséklet
pH 10,5 (0,2 M)
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 IP 1432-83
F– pH 6,1
35–37 °C
0,01 M sósav
pH 7,0 (0,05 M)
Micrococcus luteus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240
A– pH 7,0
35–39 °C
R víz
pH 6,8 (0,1 M)
Mycobacterium smegmatis ATCC 607
G– pH 7,0
35–37 °C
Antibiotikum
Referenciaanyag
Amfotericin B
CRS amfotericin B
R dimetil -szulfoxid
Bacitracin-cink
CRS bacitracin-cink
Bleomicin-szulfát
CRS bleomicinszulfát
Tompítóoldat (pH)
1
2.7.2.-1. táblázat – Diffúziós módszer (folytatás, 1) Antibiotikum
Framicetinszulfát
Gentamicinszulfát
Referenciaanyag
CRS framicetinszulfát
CRS gentamicinszulfát
A törzsoldat készítéséhez használt oldószer R víz
R víz
Tompítóoldat (pH) pH 8,0 (0,05 M)
pH 8,0 (0,05 M)
Mikroorganizmus
Táptalaj és végső pH (±0,1 pH-egység)
Inkubációs hőmérséklet
Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18
E– pH 7,9
30–37°C
E– pH 7,9
30–37°C
Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CIP 68.21 ATCC 12228 Bacillus subtilis CIP 52.62 ATCC 6633 NCTC 104000
A– pH 7,9
35–39°C
A– pH 7,9
35–39°C
A– pH 6,6
35–37°C
Jozamicin
CRS jozamicin
R metanol (l. a cikkelyt)
pH 5,6
Jozamicinpropionát
CRS jozamicinpropionát
R metanol (l. a cikkelyt)
pH 5,6
Bacillus subtilis CIP 52.62 ATCC 6633 NCTC10400
A– pH 6,6
35–37°C
Kanamicinmonoszulfát
CRS kanamicin monoszulfát
R víz
pH 8,0 (0,05 M)
Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633
A– pH 7,9
30–37°C
Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P Bordetella bronchiseptica
A– pH 7,9
35–39°C
E– pH 7,9
30–37 °C
E– pH 7,9
30–37 °C
Savanyú kanamicinszulfát
Kolisztimetátnátrium
CRS kolisztimetátnátrium
R víz pH 6,0 (0,05M)
Neomicin-szulfát CRS neomicin-szulfát
R víz
pH 8,0 (0,05 M)
NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633
Netilmicin-szulfát
CRS netilmicinszulfát
R víz
pH 8,0 ± 0,1
Staphylococcus aureus ATCC 6538P CIP 53.156
A– pH 7,9
32–35°C
Nisztatin
CRS nisztatin
R dimetilformamid
pH 6,0 (0,05 M); 5 %V/V R dimetilformamidot is tartalmaz
Candida tropicalis CIP 1433-83 NCYC 1393 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432-83 ATCC 9763
F– pH 6,0
30–37°C
F– pH 6,0
30–32°C
2.7.2.-1. táblázat – Diffúziós módszer (folytatás, 2)
Antibiotikum
Referenciaanyag
A törzsoldat készítéséhez használt oldószer
Tompítóoldat (pH)
Mikroorganizmus
Táptalaj és végső pH (±0,1 pH-egység)
Inkubációs hőmérséklet
Rifamicinnátrium
CRS rifamicinnátrium
R metanol
pH 7,0 (0,05 M)
Micrococcus luteus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341
A– pH 6,6
35–39°C
Spiramicin
CRS spiramicin
R metanol
pH 8,0 (0,05 M)
Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633
A– pH 7,9
30–32°C
Sztreptomicinszulfát
CRS sztreptomicinszulfát
R víz
pH 8,0 (0,05 M)
Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633
A– pH 7,9
30–37°C
A– pH 7,9
30–37°C
H-pH 7,8-8,0
35-37 °C
Micrococcus luteus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341
A– pH 8,0
32–35°C
Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 52.62 ATCC 6633
A– pH 8,0
37–39°C
Teikoplanin
CRS teikoplaninum
pH 6,0 (0,05M)
pH 6,0 (0,05M)
Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 5262 ATCC 9341
Tilozin állatgyógyászati célra
CRS tilozin
R metanol R 0,1 M 40 térfogatrész R foszfát– metanol és 60 tértompítóoldattal fogatrész R 0,1 M (pH7,0) készült 2,5 foszfát-tompítóol%V/V-os oldata dat (pH 8,0) elegye
Tilozin-tartarát állatgyógyászati célra Vankomicinhidroklorid
CRS vankomicinhidroklorid
R víz
pH 8,0
antibiotikumból azonos hatáserősségűnek feltételezett, ismert koncentrációjú oldatokat készítünk. Ezeket az oldatokat a táptalaj felületén elhelyezett, pl. porcelánból, rozsdamentes acélból vagy más alkalmas anyagból készült steril hengerekbe, vagy az agarban kialakított lyukakba visszük. Minden hengerbe vagy lyukba azonos térfogatú oldatot mérünk be. Úgy is eljárhatunk, hogy megfelelő minőségű, steril szűrőpapírkorongokat használunk; a korongokat átitatjuk a referenciaanyag, illetve a vizsgálandó antibiotikum oldatával és az agar felületére helyezzük. Annak érdekében, hogy az értékmérés érvényességét (validitását) ellenőrizhessük, a referenciaanyagból legalább három különböző mennyiséget kell vizsgálnunk, a vizsgálandó antibiotikumból pedig három akkora mennyiséget, melyeknek hatáserőssége feltehetőleg a referenciaanyag-mennyiségek hatáserősségével azonos. Célszerű a koncentrációsorozatokat mértani sor szerint készíteni. Rutinvizsgálatok esetében, ha a rendszer linearitása megfelelő számú, háromdózisos értékméréssel bizonyított, kétdózisos vizsgálat is elegendő lehet, feltéve, hogy az illetékes hatóság ehhez hozzájárul. Vitás esetekben azonban mindig a fent leírt, háromdózisos értékmeghatározást kell alkalmazni. A nagyobb Petri-csészékbe vagy a négyszögletes edényekbe a
3
statisztikai szempontoknak megfelelően rendezzük el az oldatokat, a kisméretű Petri-csészék esetében viszont – amelyekbe csak hat-hat oldat mérhető be – arra kell ügyelni, hogy a vizsgálandó antibiotikum és a referenciaanyag oldatai úgy váltakozzanak, hogy a töményebb oldatok egymást zavaró hatása ne érvényesülhessen. Kb. 18 órán át megfelelő hőmérsékleten inkubálunk. Annak érdekében, hogy az oldatok bemérése közötti időeltolódás kihatását a lehető legkisebbre csökkentsük, és hogy a regressziós egyenesek meredekségét növeljük, ajánlatos az inkubálást megelőzően időt hagyni a diffúzióra, ami – az adott esettől függően – szobahőmérsékleten vagy 4 °C körül rendszerint 1–4 óra. A kör alakú gátlási zónák átmérőit legalább 0,1 mm pontossággal lemérjük, vagy területüket megfelelő pontossággal megállapítjuk, és a szokásos statisztikai módszerekkel kiszámítjuk a hatóértéket. Az egyes meghatározások folyamán annyi párhuzamos mérést végzünk egy-egy mennyiséggel, amennyi a megkövetelt pontosság biztosításához elegendő. A megkövetelt pontosság elérése érdekében és annak megállapítására, hogy a vizsgált antibiotikum hatóértéke eléri-e a megkövetelt minimális értéket, a meghatározást megismételhetjük, és a mérések eredményeit statisztikai
módszerekkel egyesíthetjük.
B. TURBIDIMETRIÁS MÓDSZER A megfelelő táptalajt oly módon oltjuk be a vizsgálandó antibiotikumra érzékeny mikroorganizmus szuszpenziójával, hogy a vizsgálati körülmények között a mikroorganizmusok növekedésére kifejtett gátló hatás elegendően nagy legyen. A kiválasztott szuszpenzióból akkora ismert mennyiséget használunk, hogy a kb. 4 órás inkubálás után mutatkozó zavarosság jól mérhető legyen. A beoltott táptalajt elkészítése után azonnal felhasználjuk. A 2.7.2.-2. táblázatban megadott oldószerrel és tompító-
oldattal a referenciaanyagból és a vizsgálandó antibiotikumból olyan ismert koncentrációjú oldatokat készítünk, amelyeknek hatáserőssége feltehetőleg azonos. A meghatározás érvényességének igazolására a referenciaanyagból legalább három különböző mennyiséget mérünk be; a vizsgálandó antibiotikumból szintén három különböző mennyiséget veszünk, amelyek hatáserőssége feltehetőleg azonos a referenciaanyag-mennyiségek hatáserősségével. A mennyiségeket mértani sor szerint célszerű megválasztani. A kívánt linearitás elérése érdekében szükség esetén nagy-számú koncentráció közül
2.7.2. -2. táblázat – Turbidimetriás módszer Antibiotikum
Referenciaanyag
A törzsoldat készítéséhez használt oldószer
Tompítóoldat (pH)
Mikroorganizmus
Táptalaj és végső pH (±0,1 pH-egység)
Inkubációs hőmérséklet
Framicetinszulfát
CRS framicetinszulfát
R víz
pH 8,0
Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P
C– pH 7,0
35–37 °C
Gentamicinszulfát
CRS gentamicinszulfát
R víz
pH 7,0
Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P
C– pH 7,0
35–37 °C
Gramicidin
CRS gramicidin
R metanol
pH 7,0*
Enterococcus hirae CIP 58.55 ATCC 10541 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P
C– pH 7,0
35–37 °C
* Szükség esetén detergenst, pl. 0,1 mg/ml R poliszorbát 80-at kell a tompítóoldathoz adni, hogy a hígítások folyamán elkerüljük az adszorpciót az anyagon. Jozamicin
CRS jozamicin
R metanol (l. a cikkelyeket)
pH 5,6
Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538 P NCTC 7447
C-pH 8,0
35–37°C
2.7.2. -2. táblázat – Turbidimetriás módszer (folytatás, 2) Antibiotikum
Referenciaanyag
A törzsoldat készítéséhez használt oldószer
Tompítóoldat (pH)
Jozamicinpropionát
CRS jozamicinpropionát
R metanol (l. a cikkelyeket)
pH 5,6
Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538 P NCTC 7447
C- pH 8,0
35–37°C
Kanamicinmonoszulfát
CRS kanamicinmonoszulfát
R víz
pH 8,0
Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P
C– pH 7,0
35–37 °C
Kolisztimetátnátrium
CRS kolisztimetátnátrium
R víz
pH 7,0
Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637
C– pH 7,0
Neomicin-szulfát
CRS mikrobiológiai értékmérésre szánt neomicin-szulfát
R víz
pH 8,0
Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P
C– pH 7,0
35–37 °C
Rifamicin-nátrium
CRS rifamicinnátrium
R metanol
pH 7,0
Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536
C– pH 7,0
35–37 °C
Spiramicin
CRS spiramicin
R metanol
pH 7,0
Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P
C– pH 7,0
35–37 °C
Sztreptomicinszulfát
CRS sztreptomicinszulfát
R víz
pH 8,0
Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031
C– pH 7,0
35–37 °C
Tilozin állatgyógyászati célra
CRS tilozin
R metanol R 0,1 M foszfát– tompítóoldattal (pH 7,0) készült 2,5 %V/V-os oldata
pH 7,0
Staphylococcus aureus NCTC 6571 ATCC 9144 CIP 53.154
C– pH 7,0
37 °C
Tirotricin
CRS gramicidin
R alkohol
R alkohol
Enterococcus hirae ATCC 10541
C – pH 7,0
37 °C
Vankomicinhidroklorid
CRS vankomicinhidroklorid
R víz
pH 8,0
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P CIP 53.156
C– pH 7,0
37–39 °C
Savanyú kanamicin-szulfát
Tilozin-tartarát állatgyógyászati célra
kell három egymást követőt úgy kiválasztani, hogy a referenciaanyag és a vizsgált antibiotikum mennyiségei megfeleljenek egymásnak. Egyforma kémcsövekbe mindegyik oldatból azonos térfogatot mérünk, majd mindegyik kémcsőbe azonos térfogatú mennyiséget adagolunk a beoltott táptalajból (például 1 ml oldathoz 9 ml táptalajt). A tirotricin értékmérésénél 9,9 ml beoltott táptalajhoz 0,1 ml oldatot mérünk. Kontrollként egyidejűleg két kémcsövet készítünk elő a beoltott táptalajjal, de antibiotikum nélkül, és az egyikhez azonnal 0,5 ml R formaldehid–oldatot keverünk. Ezeket a kémcsöveket használjuk a zavarosság
Mikroorganizmus
Táptalaj és végső pH (±0,1 pH-egység)
Inkubációs hőmérséklet
35–37 °C
meghatározására szolgáló optikai eszköz beállítására. A kémcsöveket – randomizált, latin négyzetes vagy randomizált blokk elrendezés szerint – vízfürdőbe vagy más olyan készülékbe helyezzük, amely alkalmas arra, hogy az összes kémcsövet egyidejűleg és gyorsan a megfelelő inkubálási hőmérsékletre melegítse, majd 3-4 órán át ezen a hőmérsékleten tartsa. Ügyeljünk arra, hogy a hőmérséklet és az inkubálási időtartam mindegyik kémcső esetében azonos legyen. Inkubálás után mindegyik kémcső tartalmához 0,5 ml R formaldehid–oldatot elegyítünk vagy hőkezelést alkalmazunk a mikroorganizmusok növekedésének leállítása céljából, majd alkalmas optikai eszköz segítségével három értékes 5
jegy pontossággal meghatározzuk az opacitást. Olyan mérőmódszert is alkalmazhatunk, amely lehetővé teszi, hogy a zavarosságot mindegyik kémcsőben pontosan azonos inkubációs időtartam után mérjük. Megfelelő statisztikai módszerekkel kiszámítjuk a hatóértéket. A dózis–válasz összefüggés – akár transzformáljuk, akár nem – gyakran csak nagyon szűk tartományban lineáris. Ezt a tartományt kell a hatóérték kiszámításához felhasználni. A tartománynak legalább három, egymást követő koncentrációt kell tartalmaznia, hogy a vizsgálat alkalmas legyen a linearitás igazolására. Rutinvizsgálatok esetén, ha a rendszer linearitása megfelelő számú, háromdózisos értékméréssel bizonyított, kétdózisos vizsgálat is elegendő lehet, feltéve, hogy az illetékes hatóság ehhez hozzájárul. Vitás esetekben azonban mindig háromdózisos meghatározást kell alkalmazni. Az egyes meghatározások során dózisonként annyi párhuzamos mérést végzünk, amennyi a szükséges pontosság eléréséhez elegendő. Annak érdekében, hogy a kívánt pontosságot elérjük, és megállapítsuk, hogy a vizsgált antibiotikum hatóértéke eléri-e az előírt alsó határértéket, a meghatározást megismételhetjük, és a mérések eredményét statisztikai módszerekkel egyesíthetjük. A fejezet következő részei tájékoztató jellegűek. AJÁNLOTT MIKROORGANIZMUSOK A következőkben ismertetjük az ajánlott mikroorganizmusokat és azok felhasználásának körülményeit. Ezeken kívül más, a vizsgálandó antibiotikumra bizonyítottan érzékeny mikroorganizmusokat is felhasználhatunk, ha biztosítjuk a megfelelő táptalajt, valamint a megfelelő hőmérsékletet és pH-t. A felhasznált oldatok koncentrációját úgy kell megválasztani, hogy a vizsgálati körülmények között a dózis logaritmusa és a biológiai válasz közti összefüggés lineáris legyen. Inokulumok készítése. Bacillus cereus var. mycoides; Bacillus subtilis; Bacillus pumilus. Az inokulumként használandó mikroorganizmusok spóraszuszpenzióját az alábbiak szerint készítjük. A mikroorganizmust 35–37 °C-on, 7 napon át tenyésztjük alkalmas táptalaj felszínén; a táptalajhoz előzetesen literenként 0,001 g R mangán(II) -szulfátot adunk. A tenyészetet, amely főként spórákból áll, steril R vízzel lemossuk. A szuszpenziót 30 percig 70 °C-on melegítjük, majd úgy hígítjuk, hogy a spórakoncentráció megfelelő – általában milliliterenként 10 · 106 és 100 · 106 közötti érték – legyen. A spóraszuszpenziók 4 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten hosszú ideig eltarthatók. Spóraszuszpenziót úgy is készíthetünk, hogy a mikroorganizmusokat a C-táptalajon, 26 °C-on, 4–6 napon át tenyésztjük, majd aszeptikus körülmények között literenként 0,001 g R mangán(II) -szulfátot adunk a táptalajhoz, és további 48 órán át folytatjuk az inkubálást. A szuszpenziót – hogy a megfelelő mennyiségű spóra (kb. 80%) képződéséről meggyőződjünk – mikroszkóposan megvizsgáljuk, majd centrifugáljuk. Az üledéket annyi steril R vízben szuszpendáljuk, hogy a spórakoncentráció milliliterenként 10 · 106 és 100 · 106 között legyen, majd a szuszpenziót 30
percig 70 °C-on melegítjük, és 4 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten tároljuk. Bordetella bronchiseptica. A teszt-mikroorganizmust a B-táptalajon, 35–37 °C-on, 16–18 órán át tenyésztjük. A baktériumtenyészetet steril R vízzel lemossuk és olyan mértékben hígítjuk, hogy a szuszpenzió opacitása megfelelő legyen. Staphylococcus aureus; Klebsiella pneumoniae; Escherichia coli; Micrococcus flavus; Staphylococcus epidermidis. A B. bronchiseptica tenyésztésére előírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az A-táptalajt használjuk, és az opacitást úgy állítjuk be, hogy turbidimetriás meghatározás esetében kielégítő dózis–válasz összefüggést kapjunk, a diffúziós módszer esetében pedig úgy, hogy megfelelő átmérőjű, jól körülhatárolt gátlási zónákat kapjunk. Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. A tesztmikroorganizmusokat F táptalajon, 30–37 °C-on, 24 órán át tenyésztjük. A tenyészetet R nátrium-klorid 9 g/l töménységű, steril oldatával lemossuk, és a kellő opacitás elérése érdekében ugyanilyen oldattal hígítjuk. Tompítóoldatok. Az 5,8 és 8,0 közötti pH-értékű tompítóoldatokat úgy készítjük, hogy 50,0 ml R 0,2 M káliumdihidrogén-foszfát–oldatot a 2.7.2.-3. táblázatban megadott mennyiségű 0,2 M nátrium-hidroxid–oldattal elegyítünk. Az oldatokat frissen készített R desztillált vízzel 200,0 ml-re hígítjuk. 2.7.2.-3. táblázat pH
0,2 M nátrium-hidroxid–oldat (ml)
5,8
3,72
6,0
5,70
6,2
8,60
6,4
12,60
6,6
17,80
6,8
23,65
7,0
29,63
7,2
35,00
7,4
39,50
7,6
42,80
7,8
45,20
8,0
46,80
A 2.7.2.-1. táblázatban felsorolt valamennyi mikrobiológiai értékméréshez, a bleomicin-szulfát és az amfotericin B kivételével, ezeket a tompítóoldatokat használjuk. A bleomicin-szulfáthoz a tompítóoldatot (pH 6,8) úgy készítjük, hogy 6,4 g R kálium-dihidrogén-foszfátot és 18,9 g R dinátrium-hidrogén-foszfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk. Az amfotericin B-hez a következő módon készítjük a 0,2 M foszfát-tompítóoldatot (pH 10,5): 35 g R dikáliumhidrogén-foszfátot 900 ml R vízben oldunk, az oldathoz 20 ml 1 M nátrium-hidroxid–mérőoldatot elegyítünk, és az így nyert oldat térfogatát R vízzel 1000 ml-re kiegészítjük.
Táptalajok. Az alábbiakban megadott vagy velük egyenértékű táptalajok használhatók.
A dinátrium-hidrogén-foszfátot steril oldat formájában adjuk az előzetesen sterilezett táptalajhoz.
A-táptalaj
F-táptalaj
Pepton kazein-pepton (pankreász-hidrolizátum) marhahús-kivonat élesztő-kivonat glükóz-monohidrát Agar Víz
6g 4 g 1,5 g 3g 1g 15 g ad 1000 ml
B-táptalaj kazein-pepton (pankreász-hidrolizátum) szójapepton (papain-hidrolizátum) nátrium-klorid dikálium-hidrogén-foszfát glükóz-monohidrát Agar poliszorbát 80 Víz
pepton élesztő-kivonat marhahús-kivonat nátrium-klorid glükóz-monohidrát agar víz
9,4 g 4,7 g 2,4 g 10,0 g 10,0 g 23,5 g ad 1000 ml
G-táptalaj 17 g glicerin 10 g 3 g pepton 10 g 5 g hús-kivonat 10 g 2,5 g nátrium-klorid 3g 2,5 g agar 15g 15 g víz ad 1000 ml 10 g ad 1000 ml A táptalaj pH-ja sterilezés után 7,0 ± 0,1 legyen.
A poliszorbát 80-at a többi alkotórész felforralt, még forró oldatához adjuk, közvetlenül az adott térfogatra történő hígítást megelőzően. C-táptalaj Pepton marhahús-kivonat élesztő-kivonat nátrium-klorid glükóz-monohidrát dikálium-hidrogén-foszfát kálium-dihidrogén-foszfát víz
H-táptalaj 6g 1,5 g 3g 3,5 g 1g 3,68 g 1,32 g ad 1000 ml
D-táptalaj szív-kivonat élesztő-kivonat kazein-pepton glükóz-monohidrát nátrium-klorid dikálium-hidrogén-foszfát kálium-dihidrogén-foszfát kálium-nitrát víz
1,5 g 1,5 g 5g 1g 3,5 g 3,68 g 1,32 g 2g ad 1000 ml
E-táptalaj pepton hús-kivonat dinátrium-hidrogén-foszfát 12 H2O agar víz
5g 3g 26,9 g 10 g ad 1000 ml
Pepton agar marhahús-kivonatpor víz
5,0 g 15,0g 3,0 g ad 1000 ml
A táptalaj pH-ja, 0,1 M nátrium-hidroxid–oldattal beállítva, 7,0-8,0 legyen.
