MITOCHONDRIE TVORBA ATP
SEMIAUTONOMNÍ ORGANELY mitochondrie, chloroplasty • vlastní DNA (mtDNA) • vlastní proteosyntetický aparát • vlastní ribosomy (70 S) • dvě samostatné membrány • hlavní funkcí: konverze energie - syntéza ATP (oxidativní nebo fotosyntetická fosforylace) • endosymbiotická teorie
obr. 4.47; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990
MITOCHONDRIE
• válcovité struktury - tloušťka 0,5 - 1 µm délka až 7 µm • v buňce je 1 - 2 tisíce mitochondrií - tvoří nejrozsáhlejší kompartment buňky např. v játrech a ledvinách tvoří až 30 % váhy buňky
• vznikají dělením již existujících mitochondrií • průměrná délka života mitochondrie - 7 dní • mají 2 samostatné kompartmenty – vnější = intermembránový prostor – vnitřní = lumen (obsah se označuje jako matrix)
Mitochondriální membrány a matrix • vnější - 40 % lipidů (fosfoinositol, cholesterol), transportní proteiny, málo kardiolipinu - velká propustnost
• složení intermembránového prostoru se neliší od složení cytoplazmy • vnitřní - 20 % kardiolopinu – – – –
stává se téměř nepropustná pro ionty tvoří cristae mitochondriales (↑ ↑ povrch až 5x) enzymy dých. řetězce a komplex ATPsyntetáz transportní proteiny pro pyruvát a MK
•matrix - obsahuje enzymy oxidace pyruvátu,
β-oxidace MK a Krebsova cyklu; mtDNA, tRNA, ribosomy
Chemiosmotická teorie syntézy ATP • ze substrátu se odebírá vodík ve formě protonů a elektronů • elektrony s vysokou energií se předávají enzymům dých. řetězce • jejich energie je využita k transportu protonů z matrix do intermembr. prostoru (přenašeči jsou NADH, FADH2) = vzniká
protonový gradient • při návratu protonů do matrix je energie využita k syntéze ATP
S.L. Wolfe: Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publ. Comp.,1993
Konverze energie - syntéza ATP zdrojem energie oxidace cukrů a MK na vodu a oxid uhličitý
• chemiosmotická teorie (P. Mitchell, 1964) • činnost ATPázy (Boyer, Walker, Skou, 1997) • etapy buněčné respirace: – glykolýza – Krebsův cyklus – elektron-transportní řetězec a oxidativní fosforylace
Konverze energie - 1) zdroj elektronů • oxidací substrátu se odnímá vodík jako proton (H+) a 2 elektrony (e-) • odnímaný vodík při dehydrogenacích přenášejí koenzymy NAD nebo FAD do dýchacího řetězce • v cytoplazmě glykolýza (bez ohledu na přítomnost nebo nepřítomnost kyslíku) ⇒ pyruvát + NADH + ATP (zisk 2 ATP z 1 glukózy, tj. 70 kJ) • oxidační dekarboxylací pyruvátu (za přítomnosti O2 ) ⇒ vznik acetylCoA - vstupuje do matrix a zapojuje se do Krebsova cyklu reakcí s k. oxaloctovou na k. citronovou (je-li dostatek ATP, acetylCoA se využije místo v Krebsově cyklu k syntéze zásobních tuků)
• v Krebsově cyklu dekarboxylace - vznik CO2
2) Tvorba protonového gradientu většina energie se uvolňuje oxidací NADH ev. FADH2 komplexy dýchacího řetězce (NADH předá elektrony flavoproteinu a několika cytochromům prostřednictvím ubichinonu a chytochtomu c), které zprostředkují
přenos elektronů na molekulární kyslík (cytochromoxidáza) za vzniku vody elektrony z FADH2 dají asi o třetinu menší zisk ATP než elektrony z NADH
2) Tvorba protonového gradientu uvolněná energie se užije k čerpání protonů do intermembránového prostoru (při přechodu 2 e- až na kyslík = redoxpotenciál 1V - přečerpá se asi 10 protonů) ⇒ vzniká tak:
• protonový gradient - vytvoří na obou stranách vnitřní mitoch. membrány rozdíl pH • elektrický gradient - protony díky svému + náboji vytvoří membránový potenciál (pozitivní vnější a negativní vnitřní strana vnitřní mitochondriální membrány)
⇒ elektrochemický protonový gradient (tvořen z větší části membr. potenciálem, z menší části rozdílem pH)
3) Syntéza ATP • při vyrovnávání koncentrace protonů se osmotická
energie mění na chemickou energii makroergní vazby v molekule ATP • (k syntéze 1 ATP nutná energie z transportu 3 H+ zpět do matrix, tj. při transportu 2 e- se tvoří asi 3 ATP)
• celkový zisk z oxidace 1 glukózy = 36-38 ATP, (u kys. palmitové (C16) již 129 ATP) z 1 glukózy 10 NADH + 2 FADH2 + 2 ATP z glykolýzy a 2 ATP z Krebsova cyklu - teoret. výtěžek 40 %, zbytek je teplo
• vytvořená ATP neprochází přes cytoplazmatickou membránu mimo buňku (polární, malá molekula, snadno difunduje po celé b.) - pracuj. sval. b. spotřebuje 10 mil. ATP/s
3) Syntéza ATP - komplex F1 + F0 • F1 se skládá z 9 proteinů
– v hlavičce jsou 3 dimery αβ, αβ – ostatní podjednotky γδε jsou ve spojovacím stonku, – hlavička ukotvena k membráně, aby mohla rotovat pouze γ spojka
• celý komplex pracuje jako motor F0 - stator - transmembránový kanál pro vyrovnání protonového gradientu F1 - rotor - jako třídobý motor se 3 konformacemi - proudem protonů se roztočí γ podjednotka spojky, rotace dodává energii pro konformační změny podjednotek αβ
Využití elektrochemického protonového gradientu • rozdílu pH se využívá k transportu jednak pyruvátu, resp. acetylCoA, jednak fosfátového aniontu do mitochondriální matrix • membránového potenciálu se užívá k výměně ADP za ATP při transportu ATP do cytoplazmy
TRANSPORT LÁTEK PŘES MEMBRÁNU OSMÓZA
TRANSPORT LÁTEK PŘES BUNĚČNÉ MEMBRÁNY • souvisí s procesy metabolismu - jde o překonávání biomembrány = transport membránový
•biomembrána svou stavbou a chemickým složením rozhoduje o typu látek a způsobu jejich transportu •membrána je selektivně propustná (dříve semipermeabilní) •membrána má aktivní úlohu v transportu některých látek •podle spotřeby energie se dělí na pasivní a aktivní transport
Mechanismy transportu • pasivní transport - prostá difuze usnadněná difuze • aktivní transport - primární přenašečový sekundární přenašečový endocytóza a exocytóza
obr. 120; O. Nečas, Obecná biologie, H & H Jinočany, 2000
VOLNÁ DIFÚZE • přes lipidovou dvouvrstvu • proces čistě fyzikální, není selektivní • průnik – hydrofobních molekul (plyny, uhlovodníky, MK, estery, steroly, org. kys.)
– malých nenabitých hydrofilních molekul (voda, alkoholy, urea)
• rychlost závistí na koncentr. spádu, teplotě a velikosti molekuly O.Nečas, • buňka difúzi nemůže regulovat obr.121; Obecná biologie, H & H Jinočany, 2000
VOLNÁ DIFUSE - pokračování • přes preformované hydrofilní proteinové kanály (nejlépe prozkoumané Na+ a K+ kanály nervových bb.)
– selektivní (konformace proteinů kanálu určuje, které ionty projdou - Na+ Ø 0,5 nm, K+ Ø 0,3 nm)
– rychlost závisí na koncentr. spádu a hustotě kanálů – možnost regulace – napěťová záklopka (změnou membránového potenciálu)
– chemická záklopka (vazbou ligandy - ionty, nukleotidy, neurotransmitery)
USNADNĚNÁ DIFUSE (pasivní přenašečový transport) • pomocí přenašečů (AK, cukry, fosfátový aniont) • rychlost závisí na: – – – –
koncentračním spádu, afinitě přenašeče k substrátu, hustotě přenašečů v membráně rychlosti konformační změny přenašeče
• možnost regulace - např. transport glukózy do buněk ovlivňuje inzulin
AKTIVNÍ TRANSPORT • vyžaduje transportní proteiny - mohou pumpovat látky i proti koncentračnímu gradientu • transport je selektivní - přenašečem je obvykle enzym (tzv. membránové ATPázy) • vyžaduje energii (přímou hydrolýzou ATP) - k uvolnění substrátu či k regeneraci konformace přenašeče
• živá buňka aktivně udržuje určité gradienty
Uvnitř buňky (mM) Krev (mM) draslík 139 4 sodík 12 145 chloridy 4 116 uhličitan 12 29 vápník 0,0005 1,8
PRIMÁRNÍ AKTIVNÍ TRANSPORT • energie se získává přímou hydrolýzou ATP • přenašečem je enzym - membránové ATPázy • nejznámější je sodíko-draslíková pumpa (ve všech bb.) • na 1 mol. ATP pumpuje 3 Na+ ven z b. (fosforylace) a 2 K+ do b. (defosforylace přenašeče)
Na+/K+ pumpa • činnost nutná pro udržení objemu buňky a její osmotické hodnoty (uvnitř buňky negativně nabité proteiny, váží pozitivní ionty ⇒ inaktivace pumpy vede k osmotické lýze b.)
• na udržení gradientů sodíku a draslíku se spotřebuje až 1/3 ATP vytvořeného v buňce • většina aktivních transportů vytváří na membránách buněk elektrické napětí, což je způsobeno oddělením různě nabitých látek plazmatickou membránou
• Na+/K+ pumpa přispívá ke vzniku elektrického gradientu, tj. membránového potenciálu – cytoplasma je vždy vzhledem k vnějšímu povrchu buňky negativně nabitá asi o 0,1 V – membránový potenciál kolísá mezi –50 a –200 mV (mínus znamená, že vnitřek buňky je záporný) – při přenosu nervového vzruchu se v neuronu otevřou sodné kanály, jimiž Na+ ionty prudce tečou do neuronu jak po koncentračním, tak po elektrickém gradientu; Na+/K+ pumpa pak obnovuje membránový potenciál
PRIMÁRNÍ AKTIVNÍ TRANSPORT •vápníková pumpa - udržuje nízkou koncentraci Ca++ v cytosolu (vápník pumpuje ven z b. nebo ho ukládá do organel - ER, mitochondrie, sarkoplazm. retikulum)
•protonová pumpa – v parietálních bb. žaludku - koncentrování do lumen žaludku asi 1 000 000x - vytváří kyselé prostředí v žaludku
– v distálních sběrných kanálcích ledvin - koncentrování protonů do lumen tubulů asi 1000x - protony jsou vylučovány močí (pH moči je 5,5)
SEKUNDÁRNÍ AKTIVNÍ TRANSPORT •využívá energii uloženou v koncentračním gradientu, který vytvořil primární aktivní transport •jsou spřaženy dva transportní pochody jeden vyžaduje dodání energie, druhý využívá vzniklého koncentračního gradientu
• symport x antiport symport Na+ a glukózy ve střevní sliznici a renálních tubulech aktivní transport glukózy je poháněn koncentrací Na+ vně buňky, která je udržována činností sodíko-draslíkové pumpy
VESIKULÁRNÍ TRANSPORT • transport makromolekul uzavřených ve váčcích • aktivní proces - možnost regulace, závisí na vnitřní stavbě buňky: fluidita membrány, funkce cytoskeletu (mikrofilament)
• exocytóza - transportní vezikl z GA putuje k plasmatické membráně a splývá s ní - obsah veziklu se vylije do mezibuněčného prostoru molekuly extracelulární matrix, buněčné stěny, extracelulární enzymy, krevní bílkoviny, protilátky, hormony, neurotransmitery
• pučení - forma exocytózy (např. tak opouštějí b. někt. viry)
Tři typy endocytózy endocytóza - plasmatická membrána se vchlipuje dovnitř, až vytvoří vezikl uvnitř buňky • fagocytóza („cellular eating“) - buňka pomocí panožek obklopí danou látku → fagozom → po fúzi s lysozomem vzniká potravní vakuola
granulocyty, makrofágy, bb. RES, bb. v tkáňové kultuře
• pinocytóza („cellular drinking“) - buňka nespecificky pohltí část extracelulární tekutiny do malých váčků probíhá u všech eukaryontních buněk nepřetržitě
Tři typy endocytózy • endocytóza zprostředkovaná receptorem – látky z extracelulár. prostoru se specificky naváží na transmembránové proteiny, vyskytující se v membráně obvykle ve shlucích – celá struktura se zanoří dovnitř buňky až vnikne vezikl a z něj se v buňce uvolňují přenesené látky – tímto způsobem může buňka získat i látky, které v extracelulární tekutině nejsou příliš koncentrované • takto např. lidské buňky vychytávají cholesterol (složka plasmatické membrány a prekurzor steroidních hormonů • cholesterol putuje v krvi v komplexu lipidů a proteinů, tzv. LDL = Low Density Lipoproteins, na které existují v buňkách specifické receptory
OSMÓZA - pasivní transport vody • voda - silně polární látka ⇒ difuse přes membránu omezená • závislá na teplotě a dynamických změnách v uspořádání lipidové dvojvrstvy • předpoklad mikropórů (vznikají při termickém pohybu fosfolipidových řetězců dvojvrstvy) • souvisí s fluiditou membrány (při vyšším obsahu cholesterolu v membráně ↓ fluidita i pasivní transport vody) • póry v semipermeabilní membráně mohou pronikat molekuly vody, ale ne velké molekuly např. sacharózy
AKVAPORINY • některé membrány jsou pro vodu vysoce propustné (transport vody je 100 – 1000 krát rychlejší než by se očekávalo u silně polární látky), nezávisí na teplotě • voda prochází přes speciální proteinové kanálky
• vysoce selektivní (neprojdou ani malé molekuly močovina, ani ionty H+, H3O+, OH-) • průměr kanálku menší než 0,2 nm • rychlost transportu asi 2 – 4.109 mol./sec • známo asi 10 typů akvaporinů • v membránách různých bb. (erytrocyty, dist. segment nefronu, CNS, plíce, slinné a slzné žlázy) • mohou být regulovány fosforylací molekuly • propustnost řízena vasopresinem (např. ledviny)
OSMÓZA - pasivní transport vody • jsou-li dvě různě koncentrovaná prostředí oddělená semipermeabilní membránou ⇒ voda se pohybuje z hypotonického roztoku do hypertonického, i když je v hypotonickém roztoku mnoho druhů molekul; směr proudění vody závisí pouze na celkové koncentraci všech zúčastněných látek (osmóza = difuse vody přes semipermeabilní membránu poháněná koncentračním gradientem rozpuštěných látek)
v pravé části trubice je menší koncentrace volných molekul vody, neboť mnoho z nich je vázáno hydratačním obalem k molekulám sacharózy; výsledkem je, že voda bude proudit z hypotonického roztoku doprava do hypertonického
OSMÓZA - pasivní transport vody • transport vody probíhá do vyrovnání koncentrací a je provázen změnou objemu roztoků (jakoby koncentrovanější roztok vysával vodu z roztoku zředěnějšího) • tato sací síla je osmotický tlak = úměrný počtu částic v jednotce objemu - tj. úměrný molární koncentraci látky a její disociační konstantě • závisí na teplotě, ne na velikosti, hmotnosti, tvaru či náboji rozpuštěné částice
• osmotická hodnota buňky 285 mosmol/kg je dána koncentrací osmoticky aktivních částic v cytoplazmě
OSMOTICKÉ JEVY OsT krve 0,75 MPa, z toho onkotický tlak 0,003 MPa; fyziol. roztok – obsahuje 0,9 % NaCl, jeho konc. = 0,15 mol / l
hypotonický roztok živočišná
buňka voda do buňky - zvětšuje se objem až b. praskne = plasmoptýza (hemolýza)
hypertonický roztok
rostlinná buňka
živočišná buňka
rostlinná buňka
buněčná stěna nedovolí zvětšení objemu b. = zvýší se turgor
voda z buňky zmenší se objem, b. se svraští = plasmorhiza
buněčná stěna se nemůže svraštit, jen protoplast a vakuola = plasmolýza
Živočišná buňka
• v hypertonickém prostředí b. ztratí vodu, svraští se a umírá – to je zřejmě důvod, proč při zvýšení salinity vody většina živočichů umírá
• v hypotonickém prostředí se buňka nafoukne vodou a praskne Zleva doprava roste koncentrace roztoku. Uprostřed erytr. v izotonickém prostředí. Úplně vlevo jsou „ghosts“, duchové = erytr. stíny - jde o plazmatické membrány plazmoptýzou (hemolýzou) roztržených buněk, jejichž obsah se vylil do prostředí
Kontraktilní vakuola trepky
• organismy, žijící v hypotonickém či hypertonickém prostředí musí mít výkonný systém osmoregulace • sladkovodní trepka Paramecium caudatum žije v prostředí hypotonickém vzhledem k buněčnému obsahu a protože plasmalema trepky je do určité míry propustná pro molekuly vody, hrozí jí neustále plasmoptýza
• hlavním úkolem kontraktilní vakuoly je čerpat vodu z buňky zpět do okolního prostředí • tato vakuola se naplní asi za 6 vteřin; za 15 min. trepka vyloučí tolik vody, jaký je celý její objem Kontraktilní vakuola naplněná vodou Prázdná kontraktilní vakuola
Rostlinná buňka s buněčnou stěnou • v hypotonickém prostředí buněčná stěna udrží tlak vody turgor - zabrání plazmoptýze – rostlina v nedostaku vody vadne - poklesne ji turgor
• v hypertonickém prostředí je buněčná stěna proti úniku vody bezmocná ⇒ dojde k plasmolýze, končící obvykle smrtí – plazmolýza kulatá (konvexní) – plazmolýza křečová (konkávní)
• osmoregulačním orgánem - centrální vakuola (tonoplast) Elodea densa normální stav plazmolýza
CYTOSKELET MIKROTUBULY MIKROFILAMENTA STŘEDNÍ FILAMENTA
CYTOSKELETÁLNÍ PRINCIP • objeven až v 70. letech 20. století
•evolučně starý a konzervativní •u prokaryont dosud nebyl prokázán • vláknité bílkovinné struktury v buňce známy dávno, pojem cytoskelet zaveden již v r. 1928
•funkce: – konverze energie v mechanickou (všechny formy aktivního pohybu - lokomoční i intracelulární)
– určování tvaru buňky, kotví mnohé organely i některé enzymy – informační (při uchování a přenosu genetické informace)
SLOŽKY CYTOSKELETU mikrotubuly
mikrofilamenta
intermediární filamenta
© Espero Publishing, s.r.o.
FUNKCE MIKROTUBULŮ • tvoří mechanickou kostru b. (kortikální MT rostlin, marginální svazky trombocytů a erytrocytů, stresová vlákna bb.) • výběžky buněk (axopodie, axony - neurity i dendrity) • určují polaritu buněk (hlavně sekrečních buněk) • transport uvnitř buňky (vezikulární, neurotransmitery) • základem dělicího vřeténka • základem řasinek a bičíků © Espero Publishing, s.r.o.
MIKROTUBULY • průměr 25 nm • složeny ze 13 podjednotek po obvodu - protofilament • základní jednotkou - tubulin (dimer tvořený podjednotkami α, β) • autoorganizační proces regulován: Ca a Mg ionty, nukleosidfosfáty a organizačními centry - centrozom, basální tělísko • MT je polarizován (+konec směřuje do periferie b., –konec u organizač. centra)
© Espero Publishing, s.r.o.
BIČÍKY A ŘASINKY • Pohyb mnoha jednobuněčných organismů • pohyb spermií živočichů, řas a některých rostlin • výstelka části dýchací trubice • výstelka vejcovodů • společným stavebním rysem je vzorec „9+2“; jsou oba zakotveny do b. bazálním tělískem - má stejnou strukturu jako centriola (živoč. b. má 2 centrioly v centrosomu - modře jsou značeny netubulinové proteiny, které drží mikrotubulové triplety pohromadě)
Cilia a flagella - srovnání Cilia (řasinky):
Flagella (bičíky):
• na povrchu buňky obvykle ve větším počtu • průměr 0,25 µm, dlouhá 2 - 20 µm • pracují spíše jako vesla, pohyb buňky je kolmý k ose brvy
• jen jeden nebo jen několik na buňku • průměr 0,25 µm, dlouhé 10 - 200 µm • pohyb buňky je v ose bičíku
Ačkoli se cilia a flagella liší v délce, počtu na buňku a způsobem práce, mají stejnou ultrastrukturu („9+2“) – jde o starobylý princip.
ASOCIOVANÉ PROTEINY molekulové motory • dynein - lokomoce, nitrobuněčný transport (od + k -) • kinesin - nitrobuněčný transport (od - k +) • (nexin - spojuje dublety mikrotubulů v kinociliích) pohání klouzání jednoho mikrotubulu po druhém molekulové motory se mohou navázat k organele a „kráčet“ s ní podél mikrotubulu (např. vezikly s neurotransmitery se tak dostávají na konec axonů
LOKOMOČNÍ POHYB • molekulárním motorem je dynein, který spojuje jednotlivé dvojice mikrotubulů • tyto molekuly způsobují klouzání jednotlivých dvojic MT mezi sebou • jiné struktury drží celý bičík pohromadě, takže se neprodlužuje, ale ohýbá
TUBULÁRNÍ TOXINY • kolchicin, kolcemid - brání polymerizaci tubulinu (blokuje mitózu v metafázi ⇒ vznik polyploidních buněk) • vinblastin, vinkristin - vznikají agregáty z nepolymerizovaného tubulinu (cytostatika) • taxol - stabilizuje mikrotubuly, brání jejich dynamické přestavbě (cytostatikum)
MIKROFILAMENTA • globulární protein - aktin (tvoří až 15 % proteinů v eukaryotické buňce) • monomer G-aktin autoorganizací polymeruje v řetízek F-aktinu • tloušťka MF 7 nm (2 vzájemně obtočená aktinová vlákna)
• tvoří např. trojrozměrnou síť pod plazmatickou membránou bb. • rozlišuje se + a – konec (zde je polymerace rychlejší)
ASOCIOVANÉ PROTEINY • větší počet než u mikrotubulů
•fimbrin, filamin, α-aktinin - stabilizují svazky mikrofilament (např. stereocilie)
•gelsolin - fragmentuje mikrofilamenta •tropomyosiny - stabilizují aktinomyosinový komplex ve svalových buňkách
•myosin - molekulový motor - jeho aktivace aktinem se projeví posunem myosinu vůči aktinu asi o 10 nm obr. 22.3; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990
FUNKCE MIKROFILAMENT • strukturní: stavba výběžků buněk – mikroklky epitelových buněk – tyčinky sítnice, stereocilie vláskových buněk – mikrovilli vazivových buněk – součástí desmosomů
• kinetická: pohyb bb. a organel – kontraktilní prstenec (cytokineza) – svalový pohyb – améboidní pohyb (pseudopodia, lamellipodia, stresová vlákna) – cyklóza (proudění cytoplazmy a pohyb organel) – účast na endocytóze a exocytóze
MIKROFILAMENTA
© Espero Publishing, s.r.o.
A) mikroklky, B) stresová vlákna, C) améboidní pohyb a pseudopodia, D) kontraktilní prstenec
MIKROFILAMENTÁRNÍ TOXINY • cytochalasiny – zabraňují polymerizaci aktinu, – blokují cytokinezu živočišných bb. ⇒ vznik vícejaderných buněk
• phalloidin - z muchomůrky zelené stabilizuje mikrofilamenta, brání jejich přestavbě
STŘEDNÍ FILAMENTA • průměr 10 nm • fibrilární proteiny • zjištěny u všech živočišných bb., rostlinných bb. a u hub • tvoří stálou strukturu (za fyziologických podmínek je méně dynamická) – určují tvar buňky (buněčná kostra)
© Espero Publishing, s.r.o.
– určují pozici organel v buňce
– mechanicky zpevňují tkáň (výběžky nervových bb., mezibuněčná spojení typu desmosomů)
STŘEDNÍ FILAMENTA • není žádný univerzální protein, ale konkrétní pro každý typ diferencovaných bb.: – – – –
cytokeratiny (epitelové buňky) neurofilamin (nervové buňky) vimentin (ve fibroblastech) vimentin + desmin (ve svalových bb.)
• asociované proteiny - filagrin, synemin, plectin • nejsou známé žádné toxiny - střední filamenta se ruší až po částečné proteolýze
