Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Asimilace oxidu uhličitého a tvorba ATP v acidofilních bakteriích Diplomová práce
Brno 2009
Eva Pakostová
Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně s použitím literatury, kterou uvádím v seznamu.
V Brně dne 20. dubna 2009
………………….. Eva Pakostová
2
Chtěla bych poděkovat doc. Ing. Martinu Mandlovi, CSc., mému vedoucímu diplomové práce, za odborné vedení práce, za cenné informace, rady a připomínky, které jsem uplatnila při zpracovávání své diplomové práce.
Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Jiřímu Kučerovi a Mgr. Pavlu Bouchalovi, Ph.D. za pomoc s proteomickými metodami a zpracováním výsledků. Ráda bych také poděkovala Bc. Petře Linhartové za pomoc s genomickými metodami.
Za rady a pomoc v laboratoři děkuji paní Hedvice Říčánkové a Mrg. Evě Divíškové.
Děkuji také své rodině a příteli za podporu během mého studia.
3
Obsah 1. Úvod .......................................................................................................................................5 2. Teoretická část ........................................................................................................................6 2.1. Acidofilní bakterie...........................................................................................................6 2.1.1. Adaptace na kyselé prostředí ....................................................................................6 2.2. Acidithiobacillus ferrooxidans ........................................................................................8 2.2.1. Síra jako zdroj energie..............................................................................................9 2.2.2. Oxidace železa........................................................................................................14 2.2.3. Složky elektrontransportního řetězce .....................................................................15 2.2.4. Fixace CO2 ..............................................................................................................19 2.2.5. Tvorba ATP u A. ferrooxidans ...............................................................................20 2.2.6. Chemiluminiscence ................................................................................................21 2.2.7. Proteom, proteomika ..............................................................................................23 2.3. Cíle práce.......................................................................................................................25 3. Materiál a metody.................................................................................................................26 3.1. Mikroorganismus a jeho kultivace ................................................................................26 3.2. Analytické metody.........................................................................................................28 4. Výsledky...............................................................................................................................34 4.1. Fixace CO2 .....................................................................................................................34 4.2. Růst bakterií na Fe2+ ......................................................................................................37 4.2.1. Stanovení počtu bakterií rostoucích na Fe2+ ...........................................................37 4.2.2. Inhibice luciferasy Fe2+ a Fe3+ ................................................................................40 4.2.3. Růst bakterií na Fe2+ a změny ATP .......................................................................41 4.2.4. Tvorba ATP po obnovení Fe2+-oxidačního cyklu...................................................44 4.2.5. Tvorba ATP za nerůstových podmínek ..................................................................47 4.3. Růst bakterií na tetrathionanu........................................................................................51 4.4. Růst bakterií na pyritu ...................................................................................................54 4.5. Bakteriální oxidace síry při různých teplotách ..............................................................57 5. Diskuse .................................................................................................................................70 5.1. Fixace CO2 .....................................................................................................................70 5.2. Růst bakterií na Fe2+ ......................................................................................................71 5.3. Růst bakterií na tetrathionanu........................................................................................72 5.4. Růst bakterií na pyritu ...................................................................................................72 5.5. Bakteriální oxidace síry při různých teplotách ..............................................................73 6. Souhrn...................................................................................................................................75 7. Summary...............................................................................................................................76 8. Seznam zkratek.....................................................................................................................77 9. Literatura ..............................................................................................................................79
4
1. Úvod Metody studia krátkodobé asimilace CO2 v autotrofních acidofilních bakteriích se v minulosti většinou realizovaly izotopovými metodami za použití značeného CO2. Před několika lety byly publikovány výsledky změn CO2 v plynné fázi v bioreaktoru za použití infračerveného analyzátoru, což však vyžadovalo dlouhodobé experimenty ve větším měřítku. Jeden z cílů diplomové práce byl ověřit možnost plynové chromatografie při krátkodobém studiu asimilace CO2, což bylo později rozšířeno použitím CO2 elektrody. Další náplň práce souvisí s dřívějšími experimenty studujícími korelaci mezi aktivitou buněk na Fe2+ a obsahem ATP v buňkách. Nově byly testovány další substráty – tetrathionan a pyrit s cílem podchytit širokou škálu substrátů vyskytujících se v přírodě. Poslední částí práce je studium teplotních změn při biooxidaci síry se snahou podchytit změny v proteomu buňky. Výsledky tak souvisejí s širokou problematikou biochemie, fyziologie a biotechnologie sirných acidofilních bakterií. Práce je součástí řešení projektu GAČR 525/08/0697 a výzkumného záměru MŠMT 0021622413.
5
2. Teoretická část 2.1. Acidofilní bakterie Většina acidofilních mikroorganismů žije v prostředí, kde jsou vhodné podmínky pro tvorbu kyseliny sírové. Tato prostředí mají původ v důlním průmyslu a s ním spojeným odpadem. V těchto prostředích je pH kolem 1. Vnitřní pH acidofilů se pohybuje v hodnotách 5 až 7. Jednou ze studovaných acidofilních bakterií je Acidithiobacillus ferrooxidans, který nám slouží jako modelový organismus oxidace Fe2+ a sirných látek [1]. V průmyslu je A. ferrooxidans využíván v biohydrometalurgii k loužení kovů (Cu, Au, Co, U) ze sulfidických rud [2]. Bakterie se také hojně vyskytuje v kyselých důlních vodách, kde svým působením zvyšuje kyselost prostředí a migraci těžkých kovů [3].
2.1.1. Adaptace na kyselé prostředí Stejně jako neutrofilové vyžadují acidofilní bakterie intracelulární pH kolem neutrálních hodnot. Nicméně acidofilové tolerují větší pH gradient (∆pH = pHin – pHout) než neutrofilové. ∆pH je u acidofilů hlavní přispívající faktor k protonmotivní síle. Průtok elektronů přes F0F1 ATPasu zvyšuje protonaci buňky, nekontrolovaný průtok by způsobil vybití ∆pH. Volné intracelulární protony také zhoršují funkci proteinů a nukleových kyselin. Acidofilní bakterie udržují homeostasu několika mechanismy (obr. 1) [4].
6
Obr. 1. Procesy spojené s pH homeostasou u acidofilů. (i) reverzní ∆ψ. (ii) aktivní protonový transport. (iii) sekundární přenašeče. (iv) enzymy / látky schopny vázat protony. (v) zvýšené množství reparačních systémů proti neutrofilům. (vi) degradační systémy organických kyselin působících jako rozpojovače [4].
Důležitým mechanismem k udržení pH homeostasy je velikost a permeabilita membránových kanálů. U porinu buněčné stěny A. ferrooxidans Omp40 byla identifikována rozsáhlá vnější smyčka, která může regulovat velikost a iontovou selektivitu vstupu porinu. Při pH 2,5 má smyčka náboj +2 a kontroluje vtok protonů přes buněčnou stěnu. Dalším mechanismem snižujícím vtok protonů je generace vnitřního pozitivního membránového potenciálu (∆ψ). U neutrofilů je ∆ψ naopak negativní. ∆ψ je generován s největší pravděpodobností K+ ionty a brání vtoku elektronů použitím chemiosmotické bariéry proti protonovému gradientu. K udržené pH homeostasy musí být acidofilní bakterie schopny odstranit přebytečné protony z cytoplasmy. Nadbytečné protony jsou pumpovány protonovými pumpami ven z buňky. U A. ferrooxidans bylo identifikováno několik kandidátů na proteiny zajišťující odtok protonů. Početné protony řízené sekundární přenašeče pravděpodobně zajišťují adaptaci organismu k přežití v extrémně kyselém pH. Díky sekundárním přenašečům může být protonmotivní síla využita k metabolickým účelům, tedy acidofilové jsou schopni využít ∆pH na membráně k tvorbě většího množství ATP.
7
Pufrační kapacita cytoplasmy je také využívána k udržení vnitřního pH. Pufrační molekuly obsahují bazické aminokyseliny, které odjímají protony. Na pufrování se například podílí dekarboxylace glutamátu nebo kyselina fosforečná. Pokusy naznačují, že ačkoliv jsou acidofilové schopni udržovat pH pufrací, jejich pufrační kapacita nemusí být nutně větší než u neutrofilů. Protože organické kyseliny (jako kyselina octová nebo mléčná) fungují za nízkého pH jako rozpojovače respiračního řetězce, je u heterotrofních acidofilů vyvinut mechanismus jejich degradace. Byly izolovány geny kódující enzymy přeměny laktátu na pyruvát. Nezbytná je přítomnost heat shock proteinů k reparaci biomolekul poškozených nízkým pH. U A. ferrooxidans změna pH z hodnoty 3,5 na 1,5 vyústilo v podobnou odpověď v regulaci proteinů jako teplotní šok [4]. Principy adaptace proteinů z acidofilních bakterií nejsou zatím jasně popsány. Enzym α-amylasa vykazuje 30%ní snížení počtu nabitých aminokyselinových zbytků (kyselých i bazických) ve srovnání s α-amylasou pH-neutrálně adaptovaných druhů. Protein rusticyanin bakterie A. ferrooxidans má redukovaný obsah nabitých reziduí v okolí aktivního místa kovu (Cu). U jiných acidofilních proteinů je vyšší počet bazických povrchových skupin poskytující vysoce pozitivně nabitý povrch [5].
2.2. Acidithiobacillus ferrooxidans
Obr. 2. Acidofilní bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans [6]
Acidithiobacillus ferrooxidans (obr. 2) je obligátně autotrofní (jako zdroj uhlíku slouží vzdušný CO2) acidofilní (roste při pH 1,0 – 6,0, optimum při 2,0 – 2,5) mesofilní (teplotní optimum při 28 - 35°C) bakterie [7] účastnící se vzniku kyselých důlních vod a využívaná v hydrometalurgii [8], protože oxiduje nerozpustné sulfidy kovů [9,10].
8
A. ferrooxidans je považován za obligátně aerobní organismus, ačkoliv za anaerobních podmínek může trojmocné železo nahradit kyslík coby akceptor elektronů [7]. Autotrofní růst je podporován oxidací redukovaných anorganických sirných sloučenin (sulfidů, síry, thiosíranu, tetrathionanu a jiných) a dvojmocného železa. Bakterie je schopna oxidovat také molekulární vodík nebo kyselinu mravenčí. A. ferrooxidans může využívat čtyři různé formy respirace, H2/O2 pro aerobní růst a H2/Fe3+, H2/S0 a S0/Fe3+ pro anaerobní růst. Na všech formách respirace bakterie může růst autotrofně [9,11].
2.2.1. Síra jako zdroj energie Zodpovědnost ze velmi nízké pH prostředí, ve kterých byly acidofilní bakterie nalezeny, má nejčastěji H2SO4, která je produkovaná oxidací redukovaných anorganických sloučenin síry (RICSs). Pro biologické oxidace slouží RICSs jako donory elektronů, kyslík je energeticky nejvýhodnější akceptor elektronů. Přirozeně se vyskytující RICSs jsou přítomny všude tam, kde jsou sulfidy obsahující minerály vystaveny na povrch. 2.2.1.1. Oxidace elementární síry Elementární síra se vyskytuje hlavně ve formě S8 kruhů a její rozpustnost ve vodě je velmi nízká (5 µg.l-1) [12]. Oxidace elementární síry probíhá dle následující reakce (rovnice 1) [2]: 1/8 S8 + 3/2 O2 + H2O → SO42- + 2 H+
(1)
O oxidaci síry u A. ferrooxidans je toho známo méně než o oxidaci Fe2+. Redoxní potenciál pro pár S0/HS- je –270 mV při pH = 7, pro pár S2O32-/HS- je –400 mV a pro pár SO42-/HSO3- je -520 mV [13]. Extracelulární elementární síra je transportována do cytoplasmy jako polysulfidglutathion, jehož hydrolýzou a oxidací vzniká siřičitan (působením sulfurdioxygenasy SDO). Siřičitan je sulfit:akceptor-oxidoreduktasou
(SOR)
oxidován
na
síran,
jeho
elektrony
jsou
pravděpodobně přeneseny na cytochromy [2]. Výsledky experimentů podporují myšlenku, že během oxidace síry může být také využita alternativní cesta. Větvení nastává u chinolu, kde některé elektrony jdou přes bc1 komplex a cytochrom c4 na cytochrom c oxidasu typu ba3, zatímco zbývající elektrony jdou na bd chinoloxidasu (obr. 3).
9
Volný sulfid je v periplasmě oxidován na elementární síru sulfid:chinon-oxidoreduktasou (SQR). U A. ferrooxidans byla dále prokázána přítomnost thiosíran:chinon-oxidoreduktasy (TQR), ani u jednoho enzymu zatím není jasné, jestli se jedná o jediný enzym nebo sérii enzymatických reakcí. SQR a TQR jsou asi 20x více exprimovány v buňkách rostoucích na síře než v buňkách rostoucích na železe, to naznačuje, že jejich exprese je závislá na růstovém substrátu. Pokusy s inhibitory ukázaly, že asi polovina elektronů z oxidace thiosíranu využívá cestu přes cytochrom c oxidasu ba3, zbývající část elektronů jde přes chinoloxidasu bo3 nebo bd [13].
Obr. 3. Model elektrontransportní cesty oxidace síry u A. ferrooxidans. S8 = molekula síry; GSH = redukovaný glutathion; GS8-SH = polysulfid glutathionu; SDO = sulfurdioxygenasa; SOR = sulfit:akceptor-oxidoreduktasa; Q = ubichinon; QH2= ubichinol; cyt c4 = cytochrom c4; cyt ba3 = cytochrom ba3; NDH1 = NADH dehydrogenasa; cyt bd = cytochrom bd; cyt bo3 = cytochrom bo3. Dochází k transportu síry do periplasmy, kde je oxidována periplasmatickou sulfurdioxygenasou na siřičitan a dále sulfit:akceptor-oxidoreduktasou na síran. Hlavní roli během oxidace hrají ba3 cytochromoxidasa, bc1 II komplex a bd ubichinoloxidasa, jsou však přítomny i jiné cytochromoxidasy [2,13]. 2.2.1.2. Oxidace redukovaných sirných sloučenin A. ferrooxidans může oxidovat kromě elementární síry i siřičitan, thiosíran, tetrathionan a sulfid. Není schopen oxidovat thiokyanát. Ačkoliv může A. ferrooxidans využívat síru vzniklou rozkladem dithioničitanu, některý z produktů rozkladu má na oxidaci inhibiční účinky [14].
10
Množství biomasy produkované na mol elektronů je mnohem větší během růstu na redukovaných sirných sloučeninách než během růstu na Fe2+ (tab. I). Také růstový výtěžek na mol elektronů na pyritu je výrazně větší než molární růstový výtěžek na Fe2+ [12]. Tab. I. Růstové výtěžky A. ferrooxidans rostoucího na Fe2+, tetrathionanu a pyritu [12] Růstový výtěžek
Substrát
(g suché váhy / mol elektronů)
Fe2+
0,23
tetrathionan
0,92
pyrit
0,35 – 0,5
Mezi jednotlivými druhy rodu Thiobacillus neexistuje uniformita drah oxidací sirných sloučenin. Z bioenergetických úvah vyplývá, že alespoň některé z reakcí účastnících se oxidací redukovaných sirných sloučenin se odehrávají v periplasmě, což naznačuje, že zúčastněné enzymy by měly být funkční za nízkých hodnot pH [12]. 2.2.1.2.1. Oxidace sulfidů Reakce oxidací nejsou pro všechny sulfidy stejné a probíhají i přes různé meziprodukty [2,9]. Sulfidy jsou z anorganických sirných sloučenin nejvíc redukovány. A. ferrooxidans vykazuje k sulfidům vysokou afinitu, KS je zhruba 5 µM. Oxidace sulfidu na síran probíhá u A. ferrooxidans přes některou formu konjugované síry, která je lokalizovaná hlavně mezi buněčnou stěnou a cytoplasmatickou membránou. Z tohoto pozorování vyplývá, že tvorba sirného meziproduktu je periplasmatický proces. Sirný meziprodukt se pravděpodobně skládá z elementární síry (S8) a vyšších polythionanů jako u oxidace tetrathionanu [12]. Thiosíranový mechanismus byl navržen pro oxidaci sulfidů kovů jako pyrit (FeS2) a molybdenit (MoS2), které jsou nerozpustné v kyselém prostředí, a polysulfidový mechanismus pro v kyselém prostředí rozpustné sulfidy kovů jako sfalerit (ZnS), chalkopyrit (CuFeS2) nebo galena (PbS). U polysulfidového mechanismu probíhá rozpouštění sulfidu díky kombinaci Fe3+ a protonů a hlavním meziproduktem je elementární síra.
11
U thiosíranového mechanismu dochází k ataku Fe3+ na nerozpustný sulfid kovu, hlavním meziproduktem je thiosíran a hlavním konečným produktem síran (rovnice 2 a 3) [2,9]. FeS2 + 6 Fe3+ + 3 H2O → S2O32- + 7 Fe2+ + 6 H+
(2)
S2O32- + 8 Fe3+ + 5 H2O → 2 SO42- + 8 Fe2+ + 10 H+
(3)
Vzniklé Fe2+ může být neoxidováno na Fe3+ působením A. ferrooxidans nebo bakteriemi z rodů Leptospirillum a Sulfobacillus. Role mikroorganismů v rozpuštění kovů tedy spočívá v produkci H2SO4 a udržování železa v oxidovaném stavu Fe3+. A. ferrooxidans oxiduje pyrit na síran železitý a kyselinu sírovou. Během této oxidace pochází pouze jeden elektron z Fe2+, zatímco 14 elektronů je z jedné molekuly síry (rovnice 4) [12].
(4)
2.2.1.2.2. Oxidace thiosíranu Thiosíran je za nízkého pH relativně nestabilní, v prostředí s pH nižším než 3 se může rozkládat na síru a siřičitan. Rychlost tohoto chemického rozkladu silně závisí na koncentraci thiosíranu.
Počáteční
krok
v metabolismu
thiosíranu
je
oxidace
na
tetrathionan,
u A. ferrooxidans probíhá v periplasmě [12]. Doba zdvojení při růstu na thiosíranu je dlouhá (36 hodin) a proměnlivá [14]. 2.2.1.2.3. Oxidace tetrathionanu Tetrathionan tvořený jako meziprodukt během oxidace thiosíranu je A. ferrooxidans snadno oxidován, stejně tak je A. ferrooxidans schopen autotrofního růstu na tetrathionanu jako jediném zdroji energie. Na rozdíl od thiosíranu je tetrathionan v kyselém prostředí stabilní. Nicméně v přítomnosti jiných redukovaných sirných sloučenin se může objevit tvorba pentathionanu. KS A. ferrooxidans k tetrathionanu je 4 µM. Během oxidace vznikají mezi buněčnou stěnou a cytoplasmatickou membránou sirné globule jako meziprodukt (obr. 5). Sirný meziprodukt se skládá z polythionanů s dlouhým řetězcem (S13 a více) a elementární síry hlavně ve formě S80 [12].
12
Obr. 5. Navrhovaná struktura sirné globule, která se tvoří jako meziprodukt během oxidace tetrathionanu u A. ferrooxidans. Globule je složena z polythionanů s dlouhým řetězcem a elementární síry [12].
Reakce 5 až 10 vysvětlují vznik sirného meziproduktu během oxidace tetrathionanu A. ferrooxidans [12].
Hydrolýza tetrathionanu: S4O62- + H2O → HS2SO3- + HSO3-
(5)
Elongace sulfan-monosulfonové kyseliny: 2 HS2SO3- ↔ HS4SO3- + HSO3-
(6)
2 HS4SO3- ↔ HS8SO3- + HSO3-
(7)
Tvorba elementární síry: HS8SO3- ↔ S8 + HSO3-
(8)
Tvorba polythionanů: 2 HS2SO3- + ½ O2 → S6O62- + H2O
(9)
2 HS2SO3- ↔ S5O62- + H2S
(10)
2.2.1.2.4. Oxidace siřičitanu Siřičitan je esenciální meziprodukt navržených drah oxidací redukovaných sirných sloučenin u thiobacillů. KS pro siřičitan je zhruba 50 µM. Při pH 3 oxiduje A. ferrooxidans
13
siřičitan nízkou rychlostí, výrazné rychlosti oxidace jsou pozorovány , pokud je pH zvýšeno na hodnotu 6. Pro oxidaci siřičitanu byly navrženy dva mechanismy. V prvním kondenzuje siřičitan s adenosin 5´-monofosfátem (AMP) za vzniku APS (adenosin 5´-fosfosulfát). Uvolnění síranu z APS je spojeno s tvorbou ADP. AMP může být následovně regenerováno adenylátkinasou. Tento mechanismus substrátové fosforylace vynáší půl molekuly ATP na každou molekulu oxidovaného siřičitanu. Elektrony z této dráhy mohou přispívat k tvorbě protonmotivní síly [12]. V druhém navrženém mechanismu není AMP vyžadováno a oxidace siřičitanu je katalyzována siřičitanoxidasou [15].
2.2.2. Oxidace železa Oxidace Fe2+ na Fe3+ bakterií A. ferrooxidans probíhá podle rovnice 11 [2]. 2 Fe2+ + ½ O2 + 2 H+ → 2 Fe3+ + H2O
(11)
Rychlost této oxidace se snižuje při pH vyšším než 2,5. Někteří autoři tvrdí, že i vznik sraženin trojmocného železa může mít inhibiční účinek, stejně tak vyčerpání koncentrace protonů [16]. Obr. 6 ukazuje možný model elektrontransportní dráhy u A. ferrooxidans pro oxidaci Fe2+. Oxidace Fe2+ je spojena s redukcí NAD(P)+, která je nezbytná pro fixaci CO2 a pro anabolické procesy. Protože je redoxní potenciál páru Fe3+/Fe2+ (+ 650 mV při pH 2,0) mnohem pozitivnější než redoxní potenciál páru NAD(P)+/NAD(P)H (- 305 mV při cytoplasmatickém pH 6,5), redukce NAD(P)+ vyžaduje energii [13]. Protože je uvolněn pouze jeden mol elektronů na jeden mol oxidovaného železa, je třeba oxidovat obrovské množství Fe2+ k produkci relativně malého množství biomasy. Železo není transportováno přes buněčnou stěnu, ale zůstává vně buňky a každý Fe2+ doručí svůj elektron přenašeči situovaném na buněčném povrchu [2]. Cesta z Fe2+ na O2 není ještě plně popsána, bylo vytvořeno několik různých modelů elektrontransportního
řetězce.
Nejnovější
navržený
model
předkládá
možnou
elektrontransportní dráhu z Fe2+ na O2 následovně: Fe2+ poskytuje elektrony cytochromu c2 lokalizovanému na buněčné stěně a rusticyaninu [13]. Rusticyanin je nízkomolekulární protein obsahující Cu lokalizovaný v periplasmě. Funguje jako rezervoár elektronů tím způsobem, že „nasaje“ elektrony dostupné na buněčné stěně a soustředí je do respirační
14
dráhy [2]. Většina elektronů jde přímým tokem přes cytochrom c na cytochromoxidasu a pak na O2, tvoří se ∆p, který může být využit k tvorbě ATP. Některé elektrony vstupují do zpětného toku na komplex bc1I, dále dochází k redukci chinonu a vzniku NADH na komplexu NDH1 za spotřeby ∆p [18]. Výzkumy naznačují, že zpětný tok elektronů je řízen protonmotivní silou, která pochází z hydrolýzy ATP [19]. Bylo zjištěno, že zpětný a přímý tok obsahují různé cytochromy c, pro přímý tok označen cyt c552 a pro zpětný c4 [13]. Pokusy s acidofilními bakteriemi A. ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans a archaei Sulfobacillus a Metallosphaera ukázaly, že v každém organismu jsou obsaženy rozdílné složky elektrontransportního řetězce. Z toho je patrné, že schopnosti využívat Fe2+ jako donor elektronů se pravděpodobně vyvinuly nezávisle na sobě [2].
Obr. 6. Model elektrontransportní cesty pro oxidaci Fe2+ u A. ferrooxidans. Cyt c2 = cytochrom c2; cyt c4 = cytochrom c4; cytochrom c552 = cytochrom c552; cyt ba3 = cytochrom ba3; cyt aa3 = cytochrom aa3; Q = ubichinon; QH2 = ubichinol; NDH1 = NADH dehydrogenasa; cyt bd = cytochrom bd; cyt bo3 = cytochrom bo3. Tloušťka šipek vyjadřuje rychlost toku elektronů [13,19].
2.2.3. Složky elektrontransportního řetězce 2.2.3.1. Cytochromy c A. ferrooxidans Cytochromy c jsou široce distribuovány mezi eukaryoty, archei a eubakteriemi. U bakterií je apocytochrom c přemístěn do periplasmy, kde je kovalentně připojen hem c.
15
Holocytochromy c jsou často spojeny s membránou nebo buněčnou stěnou, ale mohou být nalezeny také v periplasmě, kde mohou působit jako mobilní elektronový přenašeč. A. ferrooxidans vykazuje nezvykle vysoký obsah cytochromů c, které mohou tvořit až 10% proteinů syntetizovaných v buňkách při růstu na Fe2+. A. ferrooxidans je jediný organismus, u kterého zatím byly detegovány dva cytochromy c1 a první organismus, u kterého byly nalezeny geny kódující vícenásobné (4) cytochromy typu c4. Dalším identifikovaným cytochromem je cytochrom c2. Nižší
množství
(0,30-0,57 µmol.g
-1
cytochromů
c
bylo
pozorováno
proteinu ) než na Fe2+ (1,2 µmol.g
-1
v buňkách
rostlých
na
síře
proteinu ). Jeden cytochrom c byl
specifický pro růst na síře, zatímco tři pro růst na železe, což naznačuje, že syntéza cytochromů c je modulována v závislosti na donoru elektronů. Exprese genů kódujících elektronové přenašeče závisí na růstových podmínkách, což umožňuje efektivní adaptaci na environmentální změny [20]. Vysokomolekulární cytochrom c2 (46 kDa) je lokalizován na buněčné stěně a je primárním akceptorem elektronů v respirační dráze mezi Fe2+ a O2. Protein je monohemový a skládá se pouze z β-listů, jak je běžné pro proteiny buněčné stěny [21]. Cytochrom c552 o molekulové hmotnosti 14 kDa je rozpustný cytochrom a nachází se v periplasmě. Přítomnost síranů stimuluje oxidaci cytochromu c552 cytochromoxidasou, což naznačuje potřebu síranů i při oxidaci Fe2+ [22]. Cytochrom c4 má molekulovou hmotnost 21 kDa, nachází se v periplasmě a má vysokou afinitu k cytoplasmatické membráně, byla pozorována také interakce s rusticyaninem, kterým je cytochrom redukován [21, 22]. 2.2.3.2. Rusticyanin Rusticyanin (obr. 7) je počáteční akceptor elektronů z Fe2+ v respiračním řetězci A. ferrooxidans. Patří do rodiny proteinů obsahujících měď (BCP), která je široce distribuovaná mezi četnými organismy. Rusticyanin je nicméně jediný z BCP s tak vysokým redoxním potenciálem (+ 680 mV) a stálostí v kyselém pH [23]. Vysoký potenciál rusticyaninu je dán sítí vodíkových vazeb a hydrofobními vazbami obklopujícími vazebné místo pro měď. Rusticyanin s velikostí 16,5 kDa je jedním z největších BCP [24]. Protein je lokalizovaný v periplasmě [25] a je nejrozšířenější rozpustný protein u A. ferrooxidans. V genomu A. ferrooxidans jsou přítomny dvě formy genu pro rusticyanin (rus). Dva isoenzymy se liší povrchovým nábojem díky rozdílnému aminokyselinovému složení,
16
ale koordinační místa mědi jsou plně zachovány. Přesnou roli těchto dvou isoforem je třeba podrobit dalšímu zkoumání [23]. Skládání kostry proteinu stabilizuje redoxní stav, zvyšuje afinitu apoproteinu ke kovovému iontu v oxidovaném stavu [26], v rozbaleném stavu je afinita snížena [24]. Skládání také brání drastickým změnám redoxních potenciálů při změnách pH [25].
Obr. 7. Rentgenokrystalová struktura oxidované formy rusticyaninu A. ferrooxidans [27]
2.2.3.3. Dva bc1 komplexy A. ferrooxidans Cytochromový bc1 komplex je jediný energii konzervující enzym, který je běžný pro fotosyntetický (b6f) i respirační (bc1) elektrontransportní systém [28]. Ačkoliv komplex A. ferrooxidans vykazuje většinu charakteristických vlastností bc1 komplexu, má i unikátní vlastnosti, které jsou pravděpodobně spojeny s chemolitotrofií a/nebo acidofilitou [29]. Funkční jádro enzymu se skládá ze tří podjednotek: cytochromu b, cytochromu c1 a [2Fe-2S] klastru zvaného Rieskeho protein [28]. Cytochrom c je tvořen hemem c, cytochrom b se skládá ze dvou hemů b. Redoxní potenciál bL, který je umístěn na cytosolové straně membrány, je –169 mV a redoxní potenciál bH, který je lokalizován na periplasmatické straně membrány, je +20 mV. Rieskeho centrum je klíčové redoxní centrum bc1 komplexu. Má o 150 mV vyšší redoxní potenciál (+ 490 mV [30]) než u jiných bc1 komplexů, což souhlasí s faktem, že skoro všechny komponenty elektrontransportního řetězce A. ferrooxidans mají vyšší redoxní potenciál ve srovnání s jinými druhy. Hodnota pK Rieskeho centra je posunuta asi o dvě jednotky směrem do kyselé oblasti (pK ~ 8) [29]. A. ferrooxidans byl první známý organismus, jehož genom kóduje dva bc1 komplexy [18]. V posledních letech bylo osekvenováno mnoho genomů a zjištěno mnoho genů
17
pro vícenásobné Rieskeho proteiny [30]. U oxidace dvojmocného železa je bc komplex označen bc1 I komplex, funguje reverzně mechanismem závislým na protonmotivní síle přenášejíc elektrony z cytochromu na ubichinon. Pro oxidaci síry je označen bc1 II komplex a funguje v přímém směru. Důvod jejich přítomnosti je fakt, že pro jeden bc1 komplex není termodynamicky možné pracovat s oběma směry elektronových toků [13]. 2.2.3.5. Terminální oxidasy A. ferrooxidans A. ferrooxidans obsahuje 4 terminální oxidasy – aa3 cytochrom c oxidasa, bd chinoloxidasa, bo3 chinoloxidasa a ba3 cytochrom c oxidasa. V buňkách rostoucích na Fe2+ je dominantní cytochrom aa3, dvě další oxidasy, cytochrom bd a cytochrom ba3, jsou exprimovány 8-14x méně než cytochrom aa3. Na sirném substrátu exprimuje A. ferrooxidans tři terminální oxidasy, bd a bo3 chinoloxidasy a ba3 cytochrom c oxidasu. Dominantní oxidasou je cytochrom bd, ve velkém množství je také exprimována ba3 oxidasa (1,5x méně než cytochrom bd), zatímco cytochrom aa3 je v podstatě nedetegovatelný. Exprese bd chinoloxidasy je 1,7x vyšší u buněk rostoucích na síře než u buněk rostoucích na Fe2+. Cytochrom bd nepatří do rodiny oxidas s binukleárním jádrem hem-měď, kam patří aa3 a ba3 cytochrom c oxidasy. Je široce rozšířen mezi bakteriemi, především mezi gramnegativními heterotrofy. A. ferrooxidans je aerobní bakterie aerobně redukující N2, obsahuje tudíž nitrogenasu. Rychlá spotřeba kyslíku aktivní oxidasou je nezbytná k udržení nízké intracelulární koncentrace kyslíku slučitelnou s nitrogenasovou funkcí. Cytochrom bd hraje úlohu této oxidasy u A. ferrooxidans a jelikož slouží jako ochrana nitrogenasy před kyslíkem, je možné, že převládá za aerobních podmínek, zatímco za podmínek limitace kyslíkem převládá cytochrom bo3. K objasnění rolí dvou chinoloxidas by mohly přispět budoucí experimenty. A. ferrooxidans je první a dosud jediná známá acidofilní gramnegativní eubakterie obsahující cytochrom c oxidasu typu ba3, která byla objevena v organismech obývajících extrémní podmínky jako vysoké teploty nebo haloalkalifilní prostředí. Exprese ba3 oxidasy v buňkách rostlých na síře místo aa3 oxidasy, která je dominantní u buněk rostoucích na Fe2+, má pravděpodobné vysvětlení v tom, že pokud jsou v přírodě využívány oba substráty, je strukturně a kineticky snazší, aby elektrony pocházející ze síry jdoucí přes bc1 komplex redukovaly jinou oxidasu než aa3, která je již využívána elektrony pocházejícími z Fe2+ [13].
18
2.2.4. Fixace CO2 Oxid uhličitý slouží jako zdroj uhlíku pro buňku, spolu se zdroji N a P a minerálními ionty K+, Mg2+, Ca2+, Na+ je využíván pro buněčný růst a syntézy [31]. 3-fosfoglyceraldehyd vznikající fixací CO2 v Calvinově cyklu vstupuje do Embden-Meyerhof-Parnassovy dráhy, kde může být fixovaný uhlík směrován dvěma cestami: pro biosyntézu glykogenu a pro skladování, nebo k poskytnutí uhlíku pro anabolické děje [19]. Snížení doby zdvojení více než o polovinu byl u A. ferrooxidans pozorován při zvýšeném obsahu CO2 oproti běžnému obsahu ve vzduchu (0,03%) na 0,07 – 0,1% (v/v) [32,33]. Podobný pozitivní efekt vzduchu obohaceného o CO2 byl pozorován i při biotěžbě. Nicméně maximální rychlost oxidace může mít jiné optimum koncentrace CO2 než růst [31]. CO2 je u chemolitotrofních sirných bakterií fixován Calvinovým cyklem. Proces probíhá dle následující rovnice (rovnice 12) [34]: 6 CO2 + 18 ATP + 12 NADH + 12 H+ + 12 H2O → C6H12O6 + 18 ADP + 12 NAD+ + 18 Pi
(12)
Calvinův cyklus se skládá ze 3 kroků: (i) fixace CO2 na ribulosa-1,5-bisfosfát (ii) redukce 3-fosfoglycerové kyseliny a (iii) regenerace akceptoru CO2 – ribulosa-1,5-bisfosfátu [35]. Klíčovým enzymem cyklu je ribulosabisfosfátkarboxylasa/oxygenasa (obr. 8) [32]. RuBisCO katalyzuje první krok Calvinova cyklu, karboxylaci ribulosa-1,5-bisfosfátu. U autotrofů jsou přítomny dvě strukturně rozdílné formy RuBisCO (I a II) s rozdílnými katalytickými vlastnostmi. Forma I se skládá z 8 velkých (katalytických) a 8 malých podjednotek tvořících hexadekamer a A. ferrooxidans obsahuje dvě kopie formy I [36]. Forma II se skládá z různého počtu velkých podjednotek [35]. Velká podjednotka má molekulovou hmotnost 54 000 Da a malá 15 500 Da [33]. V genomu byl dále identifikován gen kódující nový protein podobný RuBisCO známý jako forma IV. Předpokládá se, že se účastní odpovědi na stres [19]. Hodnota Km pro ribulosa-1,5-bisfosfát je 80 µM a pro CO2 je 28 µM. Hodnota 28 µM je stejná jako u rostlin a zelených řas, ale 4 – 5x nižší než u většiny bakterií, a dokonce 30x nižší než u jiných thiobacilů. Tato nízká hodnota Km je pravděpodobně adaptivní mechanismus A. ferrooxidans na nízký parciální tlak CO2 v prostředí [33].
19
Obr. 8. Struktura enzymu RuBisCO [37]
Druhým jedinečným enzymem Calvinova cyklu je fosforibulokinasa (PRK), která katalyzuje poslední krok cyklu, regeneraci akceptoru CO2
ribulosa-1,5-bisfosfátu
zprostředkovanou fosforylací ribulosa-5-fosfátu pomocí ATP. Ostatní kroky Calvinova cyklu jsou katalyzovány enzymy běžnými pro jiné dráhy metabolismu [35]. Oxidace substrátů slouží k vytváření NAD(P)H a ATP potřebných pro karboxylaci ribulosa-1,5-bisfosfátu a redukci hexos. Dle provedených energetických výpočtů je třeba 470,6 kJ na fixaci 1 molu CO2 [34]. Účinnosti fixace CO2 (µmoly asimilovaného CO2 / µmoly využitého O2) v přítomnosti elementární síry, sulfidu, siřičitanu a dithioničitanu se pohybují v hodnotách 0,01 – 0,02. V přítomnosti thiosíranu nebo tetrathionanu, ačkoliv byly účinnosti fixace nízké, absolutní rychlost fixace CO2 byla rychlejší než v přítomnosti elementární síry [14].
2.2.5. Tvorba ATP u A. ferrooxidans ATPasa A. ferrooxidans vykazuje typické podjednotkové složení F-ATPasy (obr. 9). Skládá se ze dvou hlavních částí: cytoplasmatické F1 části (α3β3γδε) obsahující katalytické místo pro syntézu ATP a membránovou F0 část (ab2c10-14) tvořící protonový kanál. Tyto dvě složky jsou spojeny dvěma stopkami, centrální stopka je tvořena γ a ε podjednotkou a vnější stopka δ a b2 [38].
20
Obr. 9. Části bakteriální F-ATPasy [39]
Hodnota Km pro ATP je 1,8 mM. Aktivita ATPasy je optimální při pH 8,5 a 45°C. pH optimum naznačuje, že ATPasa slouží výhradně k syntéze ATP, využívajíc protonový gradient tvořený během oxidace síry nebo Fe2+, ne k hydrolýze, protože cytoplasmatické pH je 6-7 a aktivita ATPasy je při tomto pH velmi nízká. Bakterie využívá protonového gradientu, který existuje na cytoplasmatické membráně, k tvorbě ATP chemiosmotickým mechanismem. Transmembránový pH gradient je udržován spotřebou protonů k redukci kyslíku na vodu a ATP je syntetizováno díky protonům vstupujícím do buňky skrz ATPasu. Tok protonů přes membránu způsobuje rotaci rotoru (c10-14). Rotace asymetricky ohnuté γ podjednotky uvnitř α3β3 cylindru vyvolá periodické strukturní změny katalytické β podjednotky, což vede k syntéze ATP [38].
2.2.6. Chemiluminiscence U některých reakcí je produkovaná energie uvolněna jako světlo. Luminiscence byla poprvé popsána roku 1888 německým fyzikem Eilhardtem Wiedemannem. Moderní definice říká, že chemiluminiscence je emise fotonů vyvolaná exergonickou chemickou
reakcí.
Vzniká excitací atomu a následným návratem do základního stavu. Bioluminiscence je luminiscence vyvolaná živými organismy [40]. 2.2.6.1. Reakční systém luciferin - luciferasa V živých buňkách slouží ATP jako univerzální donor energie pro metabolické reakce. ATP bioluminiscence se používá od roku 1960 jako technika k zjištění mikrobiální aktivity. Jedním z nástrojů k měření ATP bioluminiscence je systém luciferin-luciferasa [41].
21
Luciferasa ze světlušky (obr. 10) katalyzuje reakci znázorněnou rovnicí 13 [42].
ATP + D-luciferin + O2
AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + světlo
(13)
Reakce probíhá v několika krocích (rovnice 14 až 17) [43].
E + ATP + D-luciferin → E(luciferyl-adenylát) + PPi
(14)
E(luciferyl-adenylát) + O2 → E(oxyluciferin*; AMP) + CO2
(15)
E(oxyluciferin*; AMP) → E(oxyluciferin; AMP) + foton
(16)
E(oxyluciferin; AMP) → E + oxyluciferin + AMP
(17)
Množství emitovaného světla je úměrné koncentraci přítomného ATP [41].
Obr. 10. Krystalová struktura luciferasy (62 kDa) ze světlušky [44]
2.2.6.2. Využití chemiluminiscence Chemiluminiscence byla a je člověkem využívána různými způsoby – jako návnada pro rybáře, jako zdroj světla japonských vojáků během války, nebo k detekci jaderných ponorek. Ale chemiluminiscence může hlavně sloužit jako analytický nástroj, pokud je sloučenina našeho zájmu spřažena s některým reaktantem chemiluminiscenční reakce. Koncentrace analytu je pak úměrná množství světla. Jednou z hlavních oblastí, kde je chemiluminiscence využívána je analýza enzymů a metabolitů. Byly vytvořeny tři systémy, které umožňují stanovení široké škály analytů:
22
systém luciferin – luciferasa ze světlušky pro ATP, bakteriální luciferasa – oxidoreduktasa pro NAD(P)H a ftalazindiony pro H2O2. Mohou být tedy měřeny všechny enzymy a metabolity spřažené s ATP, NAD(P)H nebo H2O2. Systém ze světlušky může detegovat až 0,1 fmol ATP, je tedy možné měřit ATP v jednotlivé savčí buňce (hepatocyt obsahuje 10 fmol), ale systém není dost citlivý pro bakteriální buňku, která obsahuje asi 10 amol. Jediným fyziologickým kationtem, který je schopný vyvolat chemiluminiscenční reakci je Ca2+. Pomocí chemiluminiscence je tedy možné měřit koncentraci Ca2+ v živých buňkách. Reaktivní formy kyslíku tvoří emisi s luminolem nebo lucigeninem, což umožňuje monitorovat typy buněk schopné tvořit reaktivní formy kyslíku za fyziologických a patologických podmínek. Chemiluminiscenční sloučeniny navázané na antigeny nebo protilátky je možné používat místo radioaktivních značek. Nevýhodou chemiluminiscence je nestálost signálu [40].
2.2.7. Proteom, proteomika Jedním z hlavních cílů proteomického výzkumu je získání proteinové mapy, dvourozměrného obrazu znázorňujícího buněčné proteiny jako skvrny (spoty), jejichž integrální absorbance je mírou jejich koncentrace za daných podmínek [45]. Dnešní analýzy umožňují detegovat mnoho fyziologicky významných proteinů, například proteiny účastnící se asimilace síranů, metabolismu sulfidů a elektronového transportu A. ferrooxidans. Fyziologický podtext míry exprese některých proteinů zatím zůstává nejasný [46]. Proteiny na povrchu buněk pravděpodobně mají ochrannou funkci proti stresu [47]. 2.2.7.1. Vliv substrátu na proteiny A. ferrooxidans Výzkumy ukázaly, že proteom A. ferrooxidans je silně ovlivňován oxidovaným substrátem. Během sirného metabolismu i metabolismu Fe2+ jsou exprimovány specifické proteiny a proteomické analýzy mohou poskytnout kvantitativní a kvalitativní markery sirné nebo Fe2+ oxidace. Byl nalezen jasný vztah mezi oxidací Fe2+ a expresí rusticyaninu, který tedy může sloužit jako marker oxidace Fe2+ u A. ferrooxidans. Rusticyanin je přítomen v mnohem menším množství v buňkách rostlých na síře. Další dva identifikované proteiny, cytochrom c552 a Rieskeho protein, jsou také hojnější v železité kultuře. Podjednotka 2 sulfát:adenylyl-transferasy nebyla zaznamenána při růstu na síře, na rozdíl od železa, což může být vysvětleno sníženou potřebou asimilace síranu během růstu
23
podporovaného sirnou oxidací. Ve velkém množství byly v proteomu během růstu na síře přítomny fyziologicky důležité proteiny - sulfát/molybdenan vázající protein a
protein
náležející k systému transportu fosfátu. Dalšími enzymy indukovanými během sirného růstu jsou serin:hydroxymethyl-transferasa, fosfoserin:aminotransferasa a seryl:tRNA-ligasa [46]. Mezi proteiny, jejichž exprese byla během růstu na síře oproti růstu na Fe2+ snížena, patří malá a velká podjednotka RuBisCO, protein P30 odpovědný za udržování konformačního stavu a aktivity RuBisCO a protein homologní k bakteriálnímu DNA vázajícímu proteinu [48]. Fyziologicky důležitou skupinou jsou proteiny zprostředkovávající vazbu bakteriálních buněk na různé substráty. Růst A. ferrooxidans na různých substrátech má za následek modifikace ve složení bakteriálního povrchu. Zatímco sirné buňky se vážou pouze na hydrofobní povrchy, buňky rostlé na Fe2+ adherují pouze k záporně nabitým sloučeninám. Při růstu na různých substrátech jsou exprimovány různé proteiny ovlivňující složení buněčného povrchu bakterie. Exprese porinu Omp40 se měnila se změnami v mediu, jako pH nebo fosfátové hladovění. Protein je indukován nízkým pH typickým pro sirnou oxidaci [46]. Růstem na síře byla silně zvýšena exprese proteinu buněčné stěny Omp44, který je příbuzný proteinům zajišťujícím translokaci mastných kyselin s dlouhým řetězcem přes buněčnou stěnu [48]. 2.2.7.2. Vliv fosfátového hladovění na proteiny A. ferrooxidans [49] Fosfátové hladovění vyvolalo změnu exprese alespoň 25 proteinů. Určení tohoto fyziologického stavu je obzvláště důležité, pokud organismus roste v přítomnosti arseničnanu, který je analogem fosfátu a vstupuje do buňky skrz systémy inkorporující fosfát. 2.2.7.3. Vliv teploty a pH na proteiny A. ferrooxidans [47] Zvýšením teploty ze 30°C na 35°C nebo 41°C dochází k inhibici syntézy většiny proteinů a nárůstu syntézy několika heat shock proteinů s molekulovou hmotností mezi 14 a 92 kDa. V mnohem větším množství byly syntetizovány proteiny o 66 – 72 kDa. Minimálně 10 proteinů může být považováno za heat shock proteiny, jeden z nich, jak naznačuje studie, může být povrchový protein. Odpověď na teplotní šok je reverzibilní, jakmile jsou vystavené buňky navráceny k normální růstové teplotě. Pokusy ukázaly podobnou odpověď na posun pH z hodnoty 3,5 na 1,5, ačkoliv se neobjevil obecný pokles proteosyntézy, a nadto mělo zvýšenou syntézu několik proteinů o vysoké molekulové hmotnosti.
24
2.3. Cíle práce 1. Možnosti plynové chromatografie pro sledování asimilace CO2 ve vzorku kultury A. ferrooxidans v uzavřeném systému.
2. Studium změn obsahu ATP v kulturách A. ferrooxidans s různými substráty.
25
3. Materiál a metody 3.1. Mikroorganismus a jeho kultivace Používaný organismus Acidithiobacillus ferrooxidans (CCM 4253) pochází z rudných ložisek ve Zlatých Horách. Kultivace bakterie rostoucí na Fe2+ probíhala v mediu 9K, bakterie rostoucí na síře v sirném médiu a kultivace bakterie rostoucí na tetrathionanu byla prováděna na tetrathionanovém médiu.
Složení media 9K [50] Složení je uvedeno na 1 l deionizované vody. •
Složka A1: 600 ml H2O 3,0 g (NH4)2SO4 0,1 g KCl 0,5 g MgSO4 . 7H2O
•
Složka A2: 100 ml H2O 0,5 g K2HPO4
•
Složka B: 300 ml H2O (pH upraveno H2SO4 na 1,7) 44,2 g FeSO4 . 7H2O (výsledné pH upraveno H2SO4 na 1,3)
•
Složka C: 100 ml H2O 0,71 g Ca(NO3)2 . 4H2O
Každá složka byla sterilizována varem, po vychladnutí na laboratorní teplotu byly smíchány složka A1 a A2, vzniklá složka A byla přilita ke složce B, za stálého míchání byly k mediu přidány 2 ml složky C. Medium bylo skladováno v chladové místnosti při 5°C.
Složení sirného media [51] Složení je uvedeno na 1 l deionizované vody. •
0,2 g (NH4)2SO4
•
3,0 g KH2PO4
•
0,5 g MgSO4 . 7H2O
•
0,13 g CaCl2
26
Soli byly postupně rozpouštěny v 1 l deionizované vody. Medium bylo sterilizováno varem, po vychladnutí na laboratorní teplotu skladováno v chladové místnosti při 5°C.
Složení tetrathionanového media Složení je uvedeno na 1 l deionizované vody. •
Složka A: 980 ml H2O 3,0 g (NH4)2SO4 0,1 g KCl 0,5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 . 7H2O 0,01 g Ca(NO3)2
•
Složka B: 20 ml H2O 2,0 g K2S4O6
Složky byly sterilizovány varem, složka B byla přefiltrována přes Millipore filtr a přidána ke složce A. Medium bylo skladováno v chladové místnosti při 5°C.
Kultivace bakterií Kultivace na třepačce Aplikovala se 10% inokulace kultury A. ferrooxidans v 500ml sterilních baňkách s kultivačním objemem 100 ml. Pro růst na síře bylo před inokulací do sirného media přidáno 1,5 g síry a vysterilizováno varem. Výsledné pH přeočkované kultury bylo upraveno na hodnotu 3 – 4. Výsledné pH kultury buněk rostoucích na Fe2+ bylo po inokulaci upraveno na 1,6 – 1,8. Během kultivace bylo pH kultury udržováno (H2SO4) pod hodnotou 1,8, aby se zabránilo masivní tvorbě sraženin Fe3+. Pro růst na pyritu bylo použito medium 9K, kde bylo Fe2+ nahrazeno 3,0 g pyritu (promytého zř. H2SO4 o pH 1,5) na 100 ml media. Pro růst na tetrathionanu bylo použito tetrathionanové medium. Kultivace probíhala na rotační třepačce při teplotě 28°C. Kultivace v bioreaktoru 400 ml sirné kultury vyrostlé v baňkách sloužilo jako 10% inokulum do 4 l sirného media pro kultivaci ve fermentoru (Biostat B-DCU, B. Braun Biotech International, Německo)
27
s 5l nádobou (PEEK-sklo, FairMenTec, Německo). Hladina kyslíku byla sledována kyslíkovou elektrodoou, pH pH elektrodou (oboje Mettler Toledo, Švýcarsko).
Obr. 11. Bioreaktor Biostat B-DCU, B. Braun Biotech International
Nádoba fermentoru se 4 l sirného media byla po kalibraci pH elektrody (příp. kyslíkové elektrody na 0% v nasyceném roztoku Na2SO3) vysterilizována v autoklávu. Po vychladnutí byl fermentor uveden do chodu a nastaveny podmínky kultivace: aerace 1,5 l.min-1, míchání 300 min-1, teplota 28 °C. Po polarizaci kyslíkové elektrody a jejím nakalibrování na 100% bylo do reaktoru přidáno 60 g varem sterilizované síry a 400 ml inokula (pH upraveno na 3 - 4).
3.2. Analytické metody Měření fixace CO2. Fixace CO2 byla měřena plynovou chromatografií. První používaný plynový chromatograf byl chromatograf s tepelně vodivostním detektorem (TCD) a lineárním zapisovačem. Jako mobilní fáze byl použit H2, jako chromatografická kolona byla použita hadička Novoplast typ 1118 Ø 5/8 mm, délka 115 mm, náplň Porapack Q. Kvůli nedostatečné citlivosti přístroje (při dávkování 1 ml vzorku 0,01 obj. % CO2) byla atmosféra nad bakteriální kulturou obohacena o směs Ar + 1,1% CO2. Druhý použitý chromatograf byl Agilent GC 6850 (Kalifornie) s TCD detektorem, nastavený na stanovení CO2. Nosným plynem bylo He. Byla použita kapilární kolona (délka 30 m, film 0,25 µm) a software Clarity.
28
Bakteriální kultura byla míchána za laboratorní teploty ve 150ml inkubační nádobce uzavřené gumovým septem. Z atmosféry nad suspenzí buněk byl odebrán injekční stříkačkou 1 ml plynné fáze a dávkován do plynového chromatografu. Fixace CO2 byla také měřena elektrochemicky pomocí CO2 elektrody s převodníkem 5100e (Mettler Toledo, Švýcarsko). CO2 elektroda obsahuje pH elektrodu ponořenou do roztoku elektrolytu, který je separován z měřeného roztoku membránou propouštějící CO2. Stanovovaný plyn difunduje přes membránu a mění hodnotu pH elektrolytu. Bakteriální kultura byla míchána v termoboxu při 28 °C v 200ml Erlenmayerově baňce uzavřené silikonovou zátkou, přes kterou byla přivedena do kultury CO2 elektroda. Měření pH. Hodnoty pH byly měřeny pomocí kombinované skleněné pH elektrody a pH metru PHM 93 (Radiometer, Copenhagen).
Stanovení
počtu
bakterií.
Počet
bakterií
byl
stanovován
turbidimetricky
(spektrofotometr Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) po kalibraci na mikroskopické počty (mikroskop BX50, Olympus, Japonsko a Cyrusova komůrka II). U kultury rostoucí na síře byla používána vlnová délka 570 nm, měření byla prováděna proti destilované vodě. Koncentrace bakterií v 1 ml se vypočítala z kalibrační křivky (rovnice 18 [52]). (počet buněk . 108) . ml-1 = A570 / 0,034
(18)
U kultury rostoucí na Fe2+ byla koncentrace buněk měřena při vlnové délce 450 nm. Vzorek 2,4 ml kultury byl smíchán s 0,1 ml H3PO4 pro odbarvení Fe3+ rušícího stanovení. Koncentrace bakterií se vypočítala z kalibrační křivky (rovnice 19). (počet buněk . 108) . ml-1 = A450 / 0,086
(19)
Stanovení iontů železa. Fe2+ bylo stanovováno manganometricky, Fe3+ UV absorční spektrofotometrií při 300 nm [53].
Stanovení koncentrace síranů. Koncentrace síranů coby produktu oxidace síry byla stanovována isotachoforeticky [10].
29
Stanovení ATP. Množství ATP v kultuře bylo stanoveno chemiluminiscenční metodou na luminometru Junior LB 9509 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) za použití komerčního kitu ATP Biomass Kit HS (BioThema, Švédsko). Jedna sada kitu obsahuje [54]: •
ATP Reagent HS – lyofilizovaný reagent obsahující luciferasu a luciferin
•
Diluent B – pufr k rozpouštění ATP reagentu
•
Extraktant B/S – extraktant uvolňující ATP z buněk
•
Standard ATP (100 nmol . L-1)
Složení reakční směsi pro buňky rostoucí na Fe2+ [55]: •
50 µl vzorku 300 x ředěného zř. H2SO4 (pH 2 – 2,6)
•
50 µl extraktantu B/S
•
400 µl ATP reagentu HS
•
1 µl 10 x ředěného standardu ATP (destilovanou vodou), tak aby velikost signálu RLU po přídavku standardu byla o 200 - 500 jednotek vyšší
Složení reakční směsi pro sirnou kulturu [52]: •
20 µl vzorku 50 x ředěného sirným mediem
•
20 µl extraktantu B/S
•
160 µl ATP reagentu HS
•
0,1 – 5 µl přídavek standardu ATP, tak aby velikost signálu RLU po přídavku standardu ATP byla o 1000 - 2000 jednotek vyšší
Měření probíhalo za laboratorní teploty. Reakční směs byla před vlastním měřením řádně promíchána. Nejprve je ATP uvolněn z buněk extraktantem B/S a poté analyzován reagentem HS. Průběh luminiscence vystihuje rovnice 13. Intenzita světla je přímo úměrná množství ATP a je měřena luminometrem. Emise světla je měřena před a po přídavku známého množství standardu ATP, to umožňuje spočítat množství ATP ve vzorku v pmol podle následujícího vztahu (rovnice 20), který platí pro přídavek 10 µl ATP [54].
ATPsmp = Ismp / (Ismp+std – Ismp)
(20)
30
Obecně lze zavést koeficient k, pro který platí k = 0,1ε, pokud ε je standardní přídavek ATP v µl (rovnice 21).
ATPsmp = Ismp . k /(Ismp+std – Ismp)
(21)
Izolace genomové DNA A. ferrooxidans. Byla provedena izolace DNA pomocí oscilačních mlýnků. Buňky byly 3x promyty H2SO4 ředěnou destilovanou vodou o pH 1,4 a rozpuštěny v 500 µl TRIS/HCl pufru (pH = 7,0). K buněčnému extraktu bylo přidáno 100 µl lyzačního pufru (1% SDS, 0,2 M NaOH, dH2O), 50 µl 5 M chloristanu sodného, 0,1 g balotinových perel (Ø = 0,17 – 0,18 mm). Reakční směs se nechala 15 minut inkubovat při 95° C. Po promíchání byla směs krátce zamražena při -70°C a 20 minut rozbíjena při frekvenci 30 s-1 (Mixer Mill Type MM301, Retsch, Německo). Následně byla směs zcentrifugována (13 000g / 10 min). Fenol-chloroformová extrakce: K supernatantu
byla
přidána
v objemovém
poměru
1:1
směs
fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Po promíchání a 20minutové inkubaci při laboratorní teplotě za mírného míchání byly vysráženy bílkoviny. Následovala centrifugace (13 000 g / 10 min). Alkoholové srážení: K horní fázi byla přidána 1/10 objemu 3 M octanu sodného, po promíchání bylo přidáno 500 µl ethanolu a po opatrném promíchání se nechala DNA 30 minut vysrážet při -20°C. Byla
provedena
centrifugace
(13
000
g
/
15
min),
sediment
byl
vysušen
(SPD 111V SpeedVac, ThermoSavant) a DNA rozpuštěna v TE pufru (50 – 100 µl).
RAPD-PCR. Byla provedena amplifikace náhodných úseků DNA pomocí primeru RAPD-1 (5´- GTGAGGCGTC -3´). PCR reakce (25 µl) obsahovaly: •
19 µl dH2O
•
2,5 µl Thermopol Reaction Buffer
•
0,5 µl 12mM dNTP
•
1 µl primeru RAPD-1 (100 pmol.µl-1)
•
1,0 µl Taq DNA polymerasy (5 000 U.ml-1)
•
1,0 µl DNA
31
Amplifikace byly provedeny na T3 Thermocycleru (Biometra, Schoeller Instruments) a obsahovaly iniciační denaturaci při 94°C po dobu 3 minut, následovanou 44 cykly 94°C / 1 min., 35°C / 1 min., 72°C / 2 min a finálním prodlužováním při 72°C po dobu 7 min. PCR produkty (10 µl) byly podrobeny elektroforéze v 1% agarózovém gelu po barvení ethidium bromidem (5 µl). Gely byly fotografovány pod UV světlem (MiniBisPro, Bio-Imaging Systems). [56]
2-DE analýza. Sirná kultura byla po sklizení 3x promyta H2SO4 ředěnou na pH 1,4, po konečné centrifugaci (13 000 g / 10 min) bylo přeneseno 50 mg (mokrá hmotnost) peletu do eppendorfky , přidáno 300 µl lyzačního pufru LBz5 a PMSF (zásobní roztok 100 mM v isopropanolu) do výsledné koncentrace 1mM. Byla provedena sonikace (3x1 s) a směs byla ponechána 1,25 h při laboratorní teplotě lyzovat. Po přidání 150 U benzonasy následovalo 15minutové stání při laboratorní teplotě, přidání Pharmalytu 3/10 do výsledné 2% (v/v) koncentrace a centrifugace (16 000 / 20 min / 15°C). V supernatantu byla stanovena bílkovina (viz.dále), vypočtené množství odpovídající 150 µg proteinu bylo smícháno se 7,5 násobkem objemu acetonu + 0,2% DTT a ponecháno stát přes noc při –20°C. Následovala centrifugace (16 000 g / 20 min / 4°C), přídavek stejného objemu vychlazeného acetonu + 0,2% DTT, 20minutové stání při -20°C, centrifugace (16 000 g / 20 min / 4°C) a vysušení peletu (SpeedVac). K peletu bylo přidáno 343 µl rehydratačního pufru Bzt-D, 7 µl Pharmalyte 3/10 (2% v/v), vše ponecháno 1,5 hodiny resolubilizovat při 20°C a poté zcentrifugováno (16 000 g / 20 min / 15°C). Supernatant byl nanesen na 18 cm, pH 3-10 NL IPG strip (Bio-Rad), přes noc probíhala in-gel rehydratace. Byla provedena isoelektrická fokusace (100 kVh; Protean IEF Cell, Bio-Rad). Stripy byly použity na polyakrylamidovou gelovou elektroforézu (SDS-PAGE) (viz. dále). Spoty byly barveny stříbrem (viz. dále) [57].
RC DC stanovení bílkovin. DC Reagent S a DC Reagent A byly smíchány v poměru 5 µl : 250 µl, tímto vznikl Reagent A´. 10 µl vzorku bylo smícháno se 125 µl RC Reagentu I, po promíchání a 1 minutě inkubace při laboratorní teplotě bylo přidáno 125 µl RC Reagentu II. Směs byla zcentrifugována (15 000 g / 3-5 minut), supernatant vylit a sediment znovu promyt 125 µl Reagentu I a 40 µl
Reagentu II. Následovala opět centrifugace
(15 000 g / 3-5 minut). K sedimentu bylo přidáno 127 µl Reagentu A´, vše promícháno a inkubováno 5 minut při laboratorní teplotě (příp. tak dlouho, než je usazenina úplně rozpuštěna) a opět promícháno. Byl přidán 1 ml DC Reagentu B, vzorek byl promíchán 32
a inkubován 15 minut při laboratorní teplotě, poté byla změřena absorbance při vlnové délce 750 nm. Množství bílkoviny (v µg) bylo spočítáno z rovnice kalibrační křivky (rovnice 22) [58].
bílkovina (µg) = (A750 – 0,0093) / 0,0053
(22)
Polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE). Byla připravena monomerní směs na 4 polyakrylamidové gely o složení: •
65,25 ml ddH2O
•
37,50 ml 1,5 M TRIS/HCl pH 8,8
•
1,50 ml 10% SDS
•
45,00 ml akrylamidu/Bis (40%)
K monomerní směsi bylo přidáno 750 µl 10% APS a 75 µl TEMED, směs byla promíchána a gely byly nality. IEF stripy byly 12 minut ekvilibrovány za stálého míchání s ekvilibračním roztokem I (6 x 4 ml základního ekvilibračního roztoku + 0,060 x 4 g
dithiothreitolu) a poté
s ekvilibračním roztokem II (6 x 4 ml základního ekvilibračního roztoku + 0,150 x 4 g jodacetamidu). Po skončení ekvilibrace byly IEF stripy přeneseny do agarosy (750 µl) nanesené nad polyakrylamidový gel a byla provedena elektroforéza (Protean II XL, pufrový systém LAEMMLI) při napětí 50 V 2 hodiny a pak při 100 V 18 – 22 hodin [46].
Barvení stříbrem. Po skončení elektroforézy byly gely fixovány 1 hodinu ve fixačním roztoku I, dále ve fixačním roztoku II, promývány deionizovanou vodou a impregnovány 30 minut roztokem AgNO3. Poté byly gely krátce promyty deionizovanou vodou a ponechány vyvíjet ve vyvíjecím roztoku. Nakonec byly umístěny do stop roztoku a uchovávány v roztoku glycerolu [59].
33
4. Výsledky 4.1. Fixace CO2 Následující výsledky představují snahu o nahrazení sledování růstu biomasy v čase krátkodobými měření fixace CO2. 0,9
0,8
% CO2
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3 0
20
40
60
m in
Obr. 12. Změny CO2 (objemová %) v plynné fázi inkubační nádobky. Stanoveno plynovou chromatografií při 23°C. (♦) 100 ml kultury A. ferrooxidans (pH 1,75) rostoucí na síře přeneseno do 150ml inkubační nádobky. Atmosféra nad suspenzí buněk tvořena 1,1% CO2 v argonu. (♦) kontrola bez bakterií: identické podmínky s 100 ml zředěné H2SO4 (pH 1,75).
34
0,45
% CO2
0,4
0,35
0,3
0,25 0
20
40
60
80
m in
Obr. 13. Změny CO2 (objemová %) v plynné fázi inkubační nádobky s polovičním objemem kultury. Stanoveno plynovou chromatografií při 23°C. (♦) 50 ml kultury A. ferrooxidans (pH 1,60) rostoucí na síře přeneseno do 150ml inkubační nádobky. Atmosféra nad suspenzí buněk obohacena 1,1% CO2 v argonu. (♦) kontrola bez bakterií: identické podmínky s 50 ml zředěné H2SO4 (pH 1,65). Na základě obr. 12 a 13 lze uzavřít, že citlivost daného chromatografu neumožnila zachytit měřitelnou spotřebu CO2. Bylo možné pozorovat změny CO2 v souvislosti s jeho rozpuštěním v kapalné fázi. Plynová chromatografie tak nenaplnila cíle o nahrazení měření změny biomasy v čase, proto se zkusila elektrochemická metoda pomocí CO2 elektrody, ač daná elektroda má sloužit jiným podmínkám s vyšším obsahem CO2 v kapalné fázi (optimální kalibrace při 100% CO2 v plynné fázi).
35
0,01
CO2 (mM)
0,009
0,008
0,007 0
20
40
60
80
m in
Obr. 14. Změny CO2 v 200ml uzavřené nádobce se sirnou kulturou A. ferrooxidans o pH 1,7 a při 28°C, stanoveno CO2 elektrodou. Rychlost spotřeby CO2 je 18 ± 3 nmol.l-1.min-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,983). 0,01
CO2 (mM)
0,009
0,008
0,007 0
50
100
150
m in
Obr. 15. Změny CO2 podmínek uvedených v obr. 14, při pH 1,75 a 29°C. (♦) Bakteriální suspenze, rychlost spotřeby CO2 je 19 ± 3 nmol.l-1.min-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,989). (♦) Bakteriální suspenze po varu, rychlost spotřeby CO2 snížena na 2,4 ± 1,2 nmol.l-1.min-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,987). (♦) kontrola bez bakterií: identické podmínky s 200 ml zředěné H2SO4 (pH 1,75).
36
Z obr. 14 a 15 vyplývá, že v daném okamžiku byla spotřeba CO2 byla měřitelná, ačkoliv je elektroda určena na vyšší koncentrace CO2. Největším problémem bylo dlouhodobější udržení kalibrace při přirozeném obsahu CO2 ve vzduchu. To bylo příčinou značné nestability.
4.2. Růst bakterií na Fe2+ 4.2.1. Stanovení počtu bakterií rostoucích na Fe2+ Následující grafy popisují zavedení metody turbidimetrického stanovení koncentrace bakterií rostoucích na Fe2+, která nahradila přímé počítání buněk pod mikroskopem. 0,5
0,4
A
0,3
0,2
0,1
0 400
450
500
550
600
λ (nm )
Obr. 16. Závislost absorpce bakteriální suspenzí na vlnové délce. (♦) 2,4 ml kultury A. ferrooxidans vyrostlé na Fe2+ + 0,1 ml H3PO4. (♦) kontrola – tentýž vzorek bez bakterií (po filtraci). Kultura inkubována na třepačce při 28°C.
37
0,4
A
0,3
0,2
0,1
0 400
450
500
550
600
λ (nm)
Obr. 17. Závislost absorpce bakteriální suspenze na vlnové délce. (♦) 2,4 ml kultury A. ferrooxidans vyrostlé na Fe2+ + 0,1 ml H3PO4. (♦) 2,4 ml kultury vyrostlé na Fe2+ + 0,1 ml H3PO4 + 0,1 ml H2SO4. Kultura inkubována na třepačce při 28°C.
0,3
A450
0,2
0,1
0 0
1
2 8
10 buněk.m l
3
4
-1
Obr. 18. Kalibrační závislost pro určení počtu buněk A. ferrooxidans rostoucích na Fe2+. Směrnice je 0,086 ± 0,005 (95% interval spolehlivosti, r = 0,997). Rozdíl mezi nulou a průsečíkem s osou y je nevýznamný (P > 0,05).
38
0,28
A450
0,24
0,2
0,16 0
20
40
60
80
m in
Obr. 19. Časová závislost absorpce při 450 nm. Měřený vzorek 2,4 ml vyrostlé kultury A. ferrooxidans + 0,1 ml H3PO4. Pro měření byla zvolena vlnová délka 450 nm (obr. 16) a postup odbarvování Fe3+ pomocí H3PO4, okyselení s H2SO4 již hodnoty neovlivnilo (obr. 17). Následně byla vytvořena kalibrační křivka (obr. 18), která zjednodušila stanovení koncentrace buněk A. ferrooxidans rostoucích na Fe2+.
39
4.2.2. Inhibice luciferasy Fe2+ a Fe3+ Byly provedeny pokusy k ověření způsobu ředění bakteriální kultury rostoucí na Fe2+ kvůli omezení inhibičního účinku iontů železa. 4000
RLU
3000
2000
1000
0 0
10
20
30
Fe 2+, Fe 3+ (m M)
Obr. 20. Inhibice luciferasové reakce bez přítomnosti bakterií (♦) Fe2+, IC50 = 0,62 mM. (♦) Fe3+ , IC50 = 0,10 mM. 100000
RLU . ředění
75000
50000
25000
0 0
500
1000
1500
Stupeň ředění
Obr. 21. Intenzita luminiscence a ředění bakteriální kultury A. ferrooxidans. Rostoucí kultura byla ředěna vodou o pH 2,3.
40
Ředění bakteriální kultury 300x pro měření obsahu ATP je dostatečné. Důvodem ředění je vyřazení inhibice luciferasové reakce ionty železa, jak ukazuje obr. 20. Používaný postup byl ověřen na rostoucí kultuře s vyšším obsahem Fe2+ (obr. 21).
4.2.3. Růst bakterií na Fe2+ a změny ATP Sledování růstu buněk, oxidace Fe2+ a intenzity luminiscence bylo provedeno, aby se ověřily a doplnily chybějící fáze dřívějších výsledků [55] a potvrdily se sledované parametry vzhledem k tvorbě ATP a hodnoty obsahu ATP v buňce.
108 buněk.ml -1
3
2
1
0 0
50
100
150
h
Obr. 22. Růst bakterií A. ferrooxidans na Fe2+. Kultura inkubována na třepačce při 28°C. Směrnice lineární části grafu (7,81 ± 1,68) . 106 buněk.ml-1.h-1(95% interval spolehlivosti, r = 0,978) udává rychlost růstu kultury. (♦) pH sníženo na 1,61.
41
200
Fe 3+ (mM)
150
100
50
0 0
50
100
150
h
Obr. 23. Průběh koncentrace Fe3+ v čase. Směrnice lineární části grafu 7,74 ± 2,07 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,974) udává rychlost oxidace Fe2+ bakteriální kulturou. (♦) pH sníženo na 1,61. 800
RLU
600
400
200
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 24. Průběh intenzity luminiscence v čase viz. obr. 22. (♦) pH sníženo na 1,61.
42
2
ATP (amol.buňka -1)
1,5
1
0,5
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 25. Průběh obsahu ATP v buňce během růstu a oxidace Fe2+ viz. obr. 22. (♦) pH sníženo na 1,61. 250
10-10 ATP (mol)
200
150
100
50
0 0
1
2
3
1010 buněk
Obr. 26. Závislost celkového obsahu ATP v lineární fázi růstu na celkovém počtu buněk (objem 100 ml). Směrnice 0,66 ± 0,28 amol ATP.buňka-1(95% interval spolehlivost, r = 0,905) odpovídá střední hodnotě obsahu ATP v buňce.
43
3
108 buněk.ml -1
2,5
2
1,5
1
0,5
0 0
50
100 Fe
2+
150
200
(m M)
Obr. 27. Výtěžek biomasy na mol Fe2+ během lineárního růstu. Směrnice (1,71 ± 0,43) . 1012 buněk.(mol Fe2+)-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,962) odpovídá výtěžku biomasy na Fe2+. Byly potvrzeny primární výsledky [55], že lineární fázi růstu kultury a oxidace Fe2+ odpovídá lineární průběh intenzity luminiscence. Po úplné oxidaci Fe2+ dochází k zastavení růstu buněk a poklesu intenzity luminiscence v důsledku limitace Fe2+ (obr. 22 – 24). Ve fázi lineárního růstu je pravděpodobně obsah ATP na buňku konstantní (obr. 26 a 25 po zanedbání velkého rozptylu). Hodnotu konstantního obsahu ATP na buňku udává směrnice lineární závislosti na obr. 26, která má hodnotu asi 0,7 amol ATP.buňka-1. Obr. 27 uvádí hodnotu výtěžku biomasy na Fe2+.
4.2.4. Tvorba ATP po obnovení Fe2+-oxidačního cyklu Po úplné oxidaci Fe2+ byla kultura vyhladověna a poté byl přidán další substrát. Byl sledován růst kultury, oxidace Fe2+ a intenzita luminiscence. Cílem bylo zjistit obnovení sledovaných parametrů po přídavku Fe2+ a jejich srovnání s dřívějšími výsledky.
44
5
108 buněk.ml-1
4
3
2
1
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 28. Růst bakterií A. ferrooxidans. Kultura inkubována na třepačce při 28°C. (♦) pH sníženo na 1,7. (♦) přídavek 90 mM Fe2+ (celková koncentrace Fe2+ 250 mM). Směrnice lineární části před přídavkem Fe2+ je (7,40 ± 1,81) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,991). Směrnice lineární části po přídavku Fe2+ je (12,84 ± 3,09) .106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,992). Rozdíl mezi rychlostmi růstu je nevýznamný (P > 0,01).
300
250
Fe3+ (mM)
200
150
100
50
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 29. Průběh koncentrace Fe3+ v čase. (♦) pH sníženo na 1,7. (♦) přídavek 90 mM Fe2+. Směrnice lineární části před přídavkem Fe2+ je 6,84 ± 1,53 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,993), po přídavku Fe2+ 9,78 ± 6,10 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,980). Rozdíl mezi rychlostmi oxidace je nevýznamný (P > 0,05).
45
1000
800
RLU
600
400
200
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 30. Průběh intenzity luminiscence v čase viz. obr. 28. (♦) pH sníženo na 1,7. (♦) přídavek 90 mM Fe2+.
1
ATP (amol.buňka -1)
0,75
0,5
0,25
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 31. Průběh obsahu ATP v 1 buňce během růstu a oxidace Fe2+. Podmínky viz. obr. 28. (♦) pH sníženo na 1,7. (♦) přídavek 90 mM Fe2+.
46
4
108 buněk.ml -1
3
2
1
0 0
50
100 Fe
2+
150
(m M)
Obr. 32. Výtěžek biomasy na Fe2+ během lineárního růstu (♦) před přídavkem Fe2+. Směrnice je (1,37 ± 0,30) . 1012 buněk.(mol Fe2+)-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,983). (♦) po přídavku 90 mM Fe2+. Směrnice je (1,15 ± 1,24). 1012 buněk.(mol Fe2+)-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,942). Rozdíl mezi výtěžky je nevýznamný (P > 0,05). Po přídavku substrátu došlo k obnovení rychlosti růstu buněk (obr. 28), oxidace Fe2+ (obr. 29), intenzity luminiscence (obr. 30) i množství ATP v buňce (obr. 31) téměř na původní hodnotu, je ovšem možnost chybějícího bodu maximální hodnoty. Také výtěžek biomasy na Fe2+ v lineární fázi růstu a oxidace je před přídavkem i po přídavku substrátu stejný (obr. 32).
4.2.5. Tvorba ATP za nerůstových podmínek Následující pokus (obr. 33 – 37) popisuje procesy za předpokládaných nerůstových podmínek, kdy prostředí oxidace Fe2+ se bude odehrávat ve zř. H2SO4 namísto živného media 9K. Byly sledovány počty buněk, oxidace Fe2+ a průběh intenzity luminiscence suspenze buněk ve zředěné H2SO4 (pH 1,7). Buňky vyrostlé v mediu 9K byly proto centrifugovány, rozsuspendovány ve zř. H2SO4 (pH 1,7) a nainokulovány (standardní 10% inokulace) do zř. H2SO4 (pH 1,7) obsahující 160 mM Fe2+. Otázkou byl obsah ATP v takových podmínkách.
47
108 buněk.ml -1
3
2
1
0 0
50
100
150
h
Obr. 33. Růst bakterií A. ferrooxidans. Kultura inkubována na třepačce při 28°C. (♦) růst v 9K mediu, směrnice lineární části (7,81 ± 1,68) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,978) udává rychlost růstu. (♦) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Směrnice počáteční lineární části (1,68 ± 0,49) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,988) udává počáteční omezenou rychlost růstu. 200
Fe3+ (mM)
150
100
50
0 0
50
100
150
h
Obr. 34. Průběh koncentrace Fe3+, viz. ob. 33. (♦) růst v 9K mediu, směrnice lineární části 7,74 ± 2,0 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,974) udává rychlost oxidace Fe2+. (♦) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Směrnice lineární části 1,44 ± 0,21 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,990) udává rychlost růstu. Rozdíl mezi rychlostmi oxidace je významný (P < 0,01).
48
800
RLU
600
400
200
0 0
50
100
150
h
Obr. 35. Průběh intenzity luminiscence, viz. obr. 33. (♦) růst na 9K mediu. (♦) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. 2
ATP (amol.buňka -1)
1,5
1
0,5
0 0
50
100
150
h
Obr. 36. Průběh obsahu ATP v 1 buňce, viz. obr. 33. (♦) růst na 9K mediu.(♦) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Růst buněk se nepodařilo přenesením do zředěné H2SO4 eliminovat úplně, růst byl však výrazně snížen oproti růstu na 9K mediu, ve kterém došlo ke zvýšení počtu buněk 8,6x, zatímco ve zř. H2SO4 pouze 2,7x (obr. 33). Pomalý růst během asi 25 h může být způsoben vazbou živných solí na buňkách inokula a k eliminaci růstu dochází až po jejich vyčerpání nebo v důsledku autolýzy a uvolnění živin. Oxidace Fe2+ po 25. h je už realizována nerostoucí biomasou. Hodnoty intenzity luminiscence byly nižší (obr. 35) než za růstových podmínek,
49
pouze v počátku je náznak shody s růstovou kulturou v důsledku růstu. Překvapivě by se mohly zdát hodnoty obsahu ATP v buňce stejné jako za růstových podmínek (obr. 36). V obou případech dochází k snižování ATP po limitaci růstu, pouze v druhém případě nejde o limitaci Fe2+.
Provedli jsme další experiment s cílem eliminovat růst z předcházejícího pokusu. Podmínky experimentu jsou shodné s předcházejícími (obr. 33 až 36), ale buňky byly před inokulací do zř. H2SO4 více promyty (obr. 37 a 38).
108 buněk.ml -1
3
2
1
0 0
50
100
150
200
h
Obr. 37. Růst bakterií A. ferrooxidans. Kultura inkubována na třepačce při 28°C. (♦) růst na 9K mediu, směrnice lineárního úseku je (5,72 ± 1,11) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,990). (♦)1x promytá (H2SO4 o pH 1,7) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Směrnice lineárního úseku je (2,23 ± 0,46) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,994). (♦) 2x promytá (H2SO4 o pH 1,7) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Směrnice lineárního úseku je (0,60 ± 0,35) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,922). Rozdíl mezi rychlostmi růstu je významný (P < 0,01).
50
200
Fe3+ (mM)
160
120
80
40
0 0
100
200
300
h
Obr. 38. Průběh koncentrace Fe3+ v čase, viz. obr. 37. (♦) růst na 9K mediu, směrnice lineárního úseku je 12,34 ± 6,03 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,987). (♦) 1x promytá (H2SO4 o pH 1,7) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Směrnice lineárního úseku je 1,39 ± 0,36 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,960).(♦) 2x promytá (H2SO4 o pH 1,7) kultura přenesena z 9K do ředěné H2SO4 (pH 1,7) + Fe2+. Směrnice lineárního úseku je 0,65 ± 0,03 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,998). Rozdíl mezi rychlostmi oxidace je významný (P < 0,05).
Ani dvojnásobné promytí úplně neodstranilo růst, ale snížilo ho oproti navýšení počtu buněk v 9K (8,4x) a 1x promyté kultuře (3,7x) na hodnotu 2,5x (obr. 37).
4.3. Růst bakterií na tetrathionanu Tetrathionan jako další substrát byl testován pro jeho rozpustnou povahu a spolu s Fe2+ tvoří protiklad k síře a pyritu. Cílem bylo získat údaje o průběhu ATP v kultuře. Následující grafy (obr. 39 až 42) popisují experiment sledující růst a intenzitu luminiscence kultury rostoucí na tetrathionanu.
51
108 buněk.ml -1
1,5
1
0,5
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 39. Růst bakterií A. ferrooxidans na tetrathionanu (sledováno přímým počítáním buněk pod mikroskopem). Kultura inkubována na třepačce při 28°C. Směrnice lineární části grafu (5,80 ± 3,87) .106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,998) udává rychlost růstu kultury. pH se pohybovalo od 3,60 do 1,80. 800
RLU
600
400
200
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 40. Průběh intenzity luminiscence, viz. obr. 39. Podmínky měření shodné jako u sirné kultury.
52
0,8
ATP (amol.buňka -1)
0,6
0,4
0,2
0 0
50
100
150
200
250
h
Obr. 41. Průběh obsahu ATP v buňce během růstu na tetrathionanu, viz. obr. 39.
80
10-10 ATP (mol)
60
40
20
0 0,5
0,75
1
1,25
1,5
10
10 buněk
Obr. 42. Závislost celkového obsahu ATP v lineární fázi růstu na tetrathionanu na celkovém počtu buněk v kultivačním objemu (100 ml). Směrnice je 0,66 ± 0,81 amol ATP.buňka-1 (95 % interval spolehlivost, r = 0,686).
Jedná se o předběžné výsledky. Počet buněk se zvýšil pouze 3x (obr. 39). Hodnota obsahu ATP v buňce je 0,66 ± 0,81 amol ATP.buňka-1 (obr. 41 a 42). V časové tísni nedošlo k opakování pokusů, výsledky jsou zatíženy vysokým rozptylem hodnot. Dojít k přesnějším výsledkům jen námět do budoucna.
53
4.4. Růst bakterií na pyritu Následující grafy (obr. 43 – 47) popisují experiment sledující růst, oxidaci a intenzitu luminiscence kultury využívající pyrit jako substrát. Pokus byl proveden s cílem rozšířit škálu substrátů o jejich souvislost s ATP. Pyrit je sice nerozpustný substrát, ale vlastně biochemickým substrátem je Fe2+ z pyritu uvolňované chemickou reakcí pyritu s Fe3+. 12
108 buněk.ml -1
9
6
3
0 0
200
400
600
800
1000
h
Obr. 43. Růst bakterií A. ferrooxidans na pyritu. (sledováno přímým počítáním buněk pod mikroskopem). Kultura inkubována na třepačce při 28°C. Směrnice lineární části grafu (3,07 ± 1,14) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,937) udává rychlost růstu kultury. 50
Fe3+(mM)
40
30
20
10
0 0
200
400
600
800
1000
h
Obr. 44. Průběh koncentrace Fe3+, viz. obr. 43. Směrnice lineární části grafu 0,08 ± 0,01 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,989) udává rychlost oxidace Fe2+ bakteriální kulturou. 54
Koncentrace Fe2+ byla po celou dobu nižší než 1 mM. 4000
RLU
3000
2000
1000
0 0
200
400
600
800
1000
h
Obr. 45. Průběh intenzity luminiscence, viz. obr. 43. 4
ATP (amol.buňka -1)
3
2
1
0 0
200
400
600
800
1000
h
Obr. 46. Průběh obsahu ATP v buňce během růstu na pyritu, viz. obr. 43.
55
800
10-10 ATP (mol)
600
400
200
0 0
2
4
6
8
10
10 buněk
Obr. 47. Závislost celkového obsahu ATP v lineární fázi růstu na pyritu na celkovém počtu buněk v kultivačním objemu (100 ml). Směrnice je 0,81 ± 0,31 amol ATP.buňka-1 (95 % interval spolehlivost, r = 0,948).
Kultura využívající pyrit jako substrát rostla lineárně necelých 20 dní rychlostí (3,07 ± 1,14) . 106 buněk.ml-1.h-1 (obr. 43). Lineárnímu růstu odpovídala lineární oxidace Fe2+ (obr. 44). Získaná hodnota obsahu ATP na buňku je 0,81 ± 0,31 amol ATP.buňka-1 (obr. 46 a 47). Jde o hodnotu podobnou té získané na Fe2+. Na obr. 46 se však zdá, že již dříve dochází k limitaci Fe2+. Citlivějším stanovením Fe2+ by bylo možné posoudit, zda se koncentrace Fe2+ nacházejí v limitujícíc oblasti (KS = 7 mM). Na rozdíl od růstu na Fe2+, ionty Fe2+ se z pyritu kontinuálně uvolňují, takže limitace Fe2+ zde má podobný průběh jako limitace kyslíkem (kontinuální dodávka substrátu i jeho spotřeba). Námět na další studii tedy spočívá v přesném určení koncentrace Fe2+.
56
4.5. Bakteriální oxidace síry při různých teplotách Cílem bylo sledování vlivu různých teplot na kinetiku bioprocesů a také předběžné výsledky analýzy proteomu, zda změny vyvolané vyšší teplotou souvisejí s tvorbou specifických proteinů anebo jde pouze o vliv teploty na aktivitu enzymů.
Následující, úvodní experiment se týkal kultivace A. ferrooxidans ve fermentoru při různých teplotách. Byla sledována kinetika bioprocesů při teplotách od 28°C do 42°C. V průběhu kultivace byly provedeny úpravy uvedené v tabulce II. Tab. II. Úpravy provedené v průběhu experimentu kultivace při různých teplotách ve fermentoru
Úprava číslo
Čas (h)
Přídavek síry (g)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
120 167 220 236 380 499 553 620 695 763 770 833
20 20 80 60 20 20 30 30
57
Alkalizace NH3 (výsledné pH) 3,00 3,75 3,69 3,14 3,46 4,11 3,43 3,66 -
Obr. 48a. Růst bakterií A. ferrooxidans za různých teplot. Podmínky kultivace ve fermentoru: 28 - 42°C, míchání 300 min-1, aerace 1,5 l.min-1, procentuální nasycení O2 nekleslo pod 55 %, počáteční pH 3,64. Šipkami zaznačené úpravy viz tab. II. (♦) 28°C. Rychlost růstu byla (8,64 ± 0,60) . 106 buněk.ml-1.h-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,998). (♦) 37°C. Po přídavku substrátu ve 167. hodině byla rychlost růstu (8,49 ± 3,18) . 106 buněk.ml-1.h-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,994). (♦) 42°C. Rozdíl mezi rychlostmi růstu při 28 a 37°C je nevýznamný (P > 0,01).
Obr. 48b. Růst bakterií A. ferrooxidans po úpravě z 42°C (konec záznamu v obr. 48a) na 28°C. Podmínky experimentu viz. obr. 48a. (♦) 28°C. Po jeho obnovení byla rychlost růstu (6,39 ± 1,42) . 106 buněk.ml-1.h-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,989). (♦) 39°C. Rychlost růstu byla (9,19 ± 2,51) . 106 buněk.ml-1.h-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,974). Rozdíl mezi rychlostmi růstu je nevýznamný (P > 0,01).
58
Obr. 48c. Růst bakterií A. ferrooxidans po úpravě z 39°C (konec záznamu v obr. 48b) na 28°C. Podmínky experimentu viz. obr. 48a. (♦) 28°C. Rychlost růstu byla (4,65 ± 0,39) . 106 buněk.ml-1.h-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,997). (♦) 40°C. Rychlost růstu byla (5,42 ± 1,12) . 106 buněk.ml-1.h-1 (99% interval spolehlivosti, r = 0,982). Rozdíl mezi rychlostmi růstu je nevýznamný (P > 0,01).
Obr. 49a. Průběh koncentrace SO42-, viz. obr. 48a. (♦) 28°C, směrnice je 0,40 ± 0,06 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,987). (♦) 37°C, směrnice je 0,39 ± 0,21 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,985). (♦) 42°C. Rozdíl mezi rychlostmi oxidace při 28 a 37°C je nevýznamný (P > 0,05).
59
Obr. 49b. Průběh koncentrace SO42-, viz. obr. 48b. (♦) 28°C, směrnice je 0,42 ± 0,14 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,994). (♦) 39°C, směrnice je 0,71 ± 0,23 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,994). Rozdíl mezi rychlostmi oxidace je nevýznamný (P > 0,05).
Obr. 49c. Průběh koncentrace SO42-, viz. obr. 48c. (♦) 28°C, směrnice je 0,57 ± 0,34 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,951). (♦) 40°C, směrnice je 0,18 ± 0,24 mmol.l-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,718). Rozdíl mezi rychlostmi oxidace je nevýznamný (P > 0,05).
60
Kultura rostla téměř stejnou rychlostí při teplotách 28°C, 37°C, 39°C a 40°C (obr. 48a - 48c). Růst se zastavil při 42°C (obr. 48a). Při opětném snížení teploty na 28°C se rychlost růstu obnovila (obr. 48b). Oxidace síry následovala růst (obr. 49a – 49c), při 42°C tedy neprobíhala.
Předcházející pokus byl zopakován ve snaze odebrat vzorky pro proteomickou analýzu při vysoké teplotě, kdy kultura ještě roste (40°C), a teplotě, kdy už kultura neroste (41°C nebo 42°C). Během experimentu nebyly prováděny žádné úpravy.
Obr. 50. Růst bakterií A. ferrooxidans za různých teplot. Podmínky kultivace ve fermentoru: 28 - 42°C, míchání 300 min-1, aerace 1,5 l.min-1, procentuální nasycení O2 nekleslo pod 75 %, počáteční pH 3,41, konečné pH kolem 1,6. (♦) 28°C. Rychlost růstu byla (3,34 ± 0,35) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,981). (○) odebrán vzorek 1 na proteomickou analýzu při 28°C. (♦) 41°C. (○) odebrán vzorek 2 na proteomickou analýzu při 41°C. (♦) 28°C. Rychlost růstu byla (2,33 ± 0,22) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,997). (♦) 40°C.
61
Obr. 51. Průběh koncentrace H+, viz. obr. 50.
Během experimentu (obr. 50 a 51) se potvrdily výsledky předešlého pokusu. Kultura byla kultivována při 28°C, následně při 41°C došlo k zastavení růstu. Po návratu teploty na 28°C se růst obnovil. Rozdílem oproti předešlému experimentu je zastavení růstu při 40°C (obr. 50), tedy ne úplná reprodukovatelnost vlivu teplot, což poněkud komplikuje formulaci obecného závěru. Průběh oxidace kopíroval průběh růstu (obr. 51).
Během experimentu se nepodařilo získat vzorek při vysoké teplotě, kdy kultura roste, proto byl pokus opakován. V dalším experimentu (obr. 52 - 56) byl získán vzorek 3 (při 28°C) a vzorek 4 při růstových 40°C, ale až po přídavku substrátu s úpravě pH.
62
Obr. 52. Růst bakterií A. ferrooxidans při různých teplotách. Podmínky kultivace ve fermentoru: 28 - 42°C, míchání 300 min-1, aerace 1,5 l.min-1, procentuální nasycení O2 nekleslo pod 62 %, počáteční pH 3,21. Ve 140. hodině přídavek 40g S a zvýšení pH na 3,09 (označeno šipkou). (♦) 28°C. Rychlost růstu byla (5,06 ± 3,47) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,999). (○) odebrán vzorek 3 na proteomickou analýzu při 28°C. (♦) 37°C. Rychlost růstu byla (3,92 ± 14,38) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,961). (♦) 40°C. (♦) 28°C. Rychlost růstu byla (3,61 ± 0,12) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,999). (♦) 40°C. Směrnice byla (3,84 ± 0,40) . 106 buněk.ml-1.h-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,997). (○) odebrán vzorek 4 na proteomickou analýzu při 40°C.
Obr. 53. Průběh koncentrace H+, viz. obr. 52.
63
Obr. 54. Průběh intenzity luminiscence, viz. obr. 52.
Obr. 55. Průběh obsahu ATP v buňce, viz. obr. 52.
64
100
10-12 ATP (mol)
80
60
40
20
0 0
1
2
3
4
5
108 buněk
Obr. 56. Závislost celkového obsahu ATP v lineární fázi růstu na celkovém počtu buněk v 1 ml, viz. obr. 52. (♦) 28°C. Směrnice udávající obsah ATP v buňce je 0,45 ± 0,06 amol ATP.buňka-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,991) odpovídá střední hodnotě obsahu ATP v buňce. (♦) 37°C. Směrnice je 0,49 ± 16,57 amol ATP.buňka-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,353). (♦) 40°C. (♦) 28°C po obnovení růstu. Směrnice je 0,29 ± 0,16 amol ATP.buňka-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,983). (♦) 40°C. Kultura rostla až při druhém navození 40°C, tudíž nelze učinit jednoznačný závěr, že zlom růstu kultury nastává mezi 40 a 41°C. Průběh oxidace opět sleduje průběh růstu (obr. 53). Z obr. 54 až 56 je patrné, že teplota 37°C nemá vliv na ATP, ale 40°C způsobuje pokles. Výsledky jsou zatíženy vysokým rozptylem hodnot, takže ne vždy je možné hovořit o trendu. Rozhodující zde je, že fáze, kdy bakterie oxidovaly síru při 40°C, mohla být použita pro analýzu proteomu. Důvod proměnlivého účinku teplot na růst a tvorbu ATP zde není uspokojivě doložen.
Při dlouhodobých experimentech s přídavky substrátu může dojít ke kontaminaci kultury A. ferrooxidans bakterií A. thiooxidans. Proto jsme provedli analýzu na potvrzení původní bakterie, aby se pozorované změny daly přisoudit právě A. ferrooxidans. Poněvadž se analýza RAPD-PCR nezdařila, pravděpodobně kvůli nečistotám ve vzorku, rutinně ji po dalším přečištění provedla Bc. Petra Linhartová, kteréžto děkuji. Na základě velikosti fragmentů, které se vytvořily při PCR reakci s primerem RAPD-1 a srovnáním výsledků analýz v databázi kmenů A. ferrooxidans a A. thiooxidans z lokality Zlaté Hory v Jeseníkách byl vzorek určen jako jeden z kmenů A. ferrooxidans.
65
Byla provedena proteomická analýza buněk A. ferrooxidans rostoucích na síře metodou dvourozměrné elektroforézy. Účelem analýzy bylo srovnání proteomu buněk rostoucích při klasické růstové teplotě 28°C , teplotě 40°C, kdy buňky ještě rostou, a teplotě 41°C, kdy už kultura neroste. Byly získány 4 vzorky kultury ze dvou kultivací ve fermentoru (viz. výše). Pro srovnání byly vybrány 2 gely, u kterých byla možná reprodukovatelnost - vzorek 1 a vzorek 4.
Obr. 57. Proteinová mapa kultury A. ferrooxidans rostoucí na síře při 28°C. Červeně jsou vyznačeny spoty s výrazně sníženou expresí při 40°C oproti 28°C a zeleně s expresí výrazně zvýšenou.
66
Obr. 58. Proteinová mapa kultury A. ferrooxidans rostoucí na síře při 40°C. Červeně jsou vyznačeny spoty s výrazně sníženou expresí při 40°C oproti 28°C a zeleně s expresí výrazně zvýšenou.
Byly vybrány spoty s prokazatelnými změnami exprese (obr. 57 a 58). Pokles exprese (více než 2x) při 40°C oproti 28°C byl pozorován u 59 spotů a nárůst (více než 5x) u 14 spotů. Protože se jednalo pouze o předběžný experiment, nebyla provedena identifikace pomocí MS.
67
Příklady spotů se zvýšenou expresí při 40°C:
Obr. 59. Spoty 1817 a 2715, vlevo při 28°C, vpravo při 40°C. Ze srovnání s literaturou se dá předpokládat, že se jedná o chaperon proteinu dnaK (heat shock protein 70) a 60 kDa chaperonin [46].
Obr. 60. Spot 1115, vlevo při 28°C, vpravo při 40°C.
68
Příklady spotů se sníženou expresí při 40°C:
Obr. 61. Spoty 8111 a 9105, vlevo při 28°C, vpravo při 40°C.
V souladu s literaturou [47] při teplotě kolem 40°C dochází ke snížení syntézy velkého množství proteinů a ke zvýšení pouze několika, pravděpodobně heat shock proteinů.
69
5. Diskuse 5.1. Fixace CO2 Snažili jsme se nahradit dlouhodobá sledování změn biomasy měřením fixace CO2. Pokusy byly prováděny na aktivně respirující sirné kultuře pomocí plynové chromatografie a CO2 elektrody. Kvůli nedostatečné citlivosti použitého plynového chromatografu byla atmosféra nad suspenzí buněk obohacována o směs plynů Ar + 1,1 % CO2. Výsledky měření pomocí plynové chromatografie se dají považovat za neprůkazné (obr.12 a 13). Detegovat šlo pouze vyrovnávání obsahu CO2 mezi plynnou a kapalnou fází. Tyto změny probíhaly po dobu asi 30 min, což je zrovna zhruba perioda, kdy dojde k vyčerpání kyslíku respirací a v dalším čase již biochemická spotřeba CO2 není možná. Tím je dáno časové omezení použití výše zmíněných postupů. Podobné výsledky byly získány s chromatografem Agilent GC 6850, kde se plynná fáze neobohacovala o CO2, neboť na základě vyšší citlivosti přístroje jsme očekávali detegovatelné změny i při výchozí nízké koncentraci CO2 v plynné fázi. Veškeré experimenty nevedly k rychle měřitelné asimilaci CO2 a použité uspořádání pokusů bylo zamítnuto. Další způsob se nabídl až v průběhu práce, kdy byl úbytek CO2 měřen pomocí CO2 elektrody. Elektrochemická metoda se ukázala nadějnější než plynová chromatografie. Nejvyšší naměřená rychlost fixace CO2 byla 1 µmol.l.-1h-1 (obr. 14 a 15), což je v porovnání s jediným srovnatelným údajem v literatuře 100 x nižší hodnota [60]. Boon a kol. ovšem měřili spotřebu CO2 infračerveným detektorem v kultuře rostoucí v 2l fermentoru na Fe2+. Vyšších hodnot poklesu CO2 by pravděpodobně bylo dosaženo ve fermentoru, nebo po úpravě podmínek experimentu, např. obohacením kapalné fáze o takové množství CO2, které by ještě nemělo inhibiční účinky. Avšak z časových důvodů, nebylo možné provést více experimentů. Ačkoliv původně byla elektroda vyvinuta na řádově vyšší koncentrace CO2 v plynné fázi a pro naše podmínky tedy není určena, hlavní problém je spojen s nestabilitou kalibrace při 0,04% CO2 v plynu. To znemožňovalo reprodukovatelné výsledky.
70
5.2. Růst bakterií na Fe2+ Nový způsob určení počtu buněk spočíval v měření zákalu po eliminaci barvy Fe3+ kyselinou fosforečnou (obr. 16 – 19). To urychlilo celkové analýzy.
Pro stanovení ATP bylo nutné ředění bakteriální kultury A. ferrooxidans, aby se snížily až odstranily inhibiční účinky iontů železa na luciferasu (obr. 20). Ředění vzorku 300x, používané již dříve [55], je tak dostatečné. To bylo ověřeno i na rostoucí kultuře A. ferrooxidans (obr. 21), kde je vyšší koncentrace Fe2+ než ve vyrostlé kultuře.
Růst bakterií na Fe2+ a změny ATP Byly ověřeny informace z minulých pokusů [55], že lineárnímu růstu odpovídá lineární oxidace substrátu a lineární nárůst intenzity luminiscence (obr. 22 – 24). Dále že snížení pH, které zabránilo vzniku sraženin Fe3+, neovlivnilo žádný ze sledovaných parametrů (obr. 24 - 26). Oproti předešlým měřením byly doplněny údaje těsně před oblastí limitace Fe2+, kdy dochází k zastavení růstu buněk a prudkému poklesu intenzity luminiscence, tudíž i poklesu obsahu ATP na buňku. Z časových důvodů nebylo změřeno více bodů prvních 20 hodin kultivace, což by mohlo říct více o rozptylu bodů v obr. 25 a zpřesnit závislost celkového obsahu ATP v lineární fázi růstu na celkovém počtu buněk v kultivačním objemu (obr. 26), jehož hodnotu jsme stanovili na 0,66 ± 0,28 amol ATP.buňka-1, což je v porovnání s dřívějším výzkumem 0,9 amol ATP.buňka-1 [55] mírně, nicméně nevýznamně, nižší hodnota. Po zoxidování veškerého přítomného Fe2+ došlo k očekávanému zastavení růstu a oxidace. Následně jsme nechali kulturu hladovět asi 3 dny, během nichž docházelo k postupnému poklesu RLU (na hodnotu RLU ~ 200) a ATP na buňku. Poté byl přidán další substrát. Veškeré sledované parametry se obnovily na původní hodnotu (obr. 28 – 32). Již dřívější výsledky [55] popsaly obnovu oxidace a nárůstu ATP po přídavku Fe2+, ale nikoliv růst biomasy, který byl sledován v našem experimentu. Skutečnost, že limitace Fe2+ okamžitě ovlivní tvorbu ATP je obecně očekávaná. Je to však v rozporu s údaji pro kulturu oxidující síru, kde přídavky síry vyvolávají odlišné efekty [52], rychlosti růstu a oxidace síry se obnoví, obsah ATP v buňce však nikoliv.
71
Tvorba ATP za nerůstových podmínek O nerůstové podmínky, kdy bylo medium 9K nahrazeno zř. H2SO4 obsahující odpovídající množství Fe2+, byla snaha již v dřívějších pokusech [55], ale nebyla pozorována žádná změna v kterémkoli ze sledovaných parametrů. Bylo tedy usouzeno, že 9K medium obsahuje nadbytek základních solí. Proto narozdíl od dříve provedených pokusů, nebyla kultura přeočkována z 9K media do zředěné H2SO4, jak je obvyklý postup inokulace, ale buňky byly zcentrifugovány a naočkovány do zř. H2SO4. Poté byl zaznamenán nárůst v kultuře 2,7x (obr. 33). V této krátké růstové fázi se shoduje s růstem za standardních podmínek i obsah ATP v buňce (obr. 36). U kultivace na 9K mediu dochází kolem 30. hodiny k limitaci Fe2+ (obr. 34 a 36) a dochází tedy k poklesu obsahu ATP v buňce. Kolem 30. hodiny dochází k poklesu obsahu ATP v buňce i ve zř. H2SO4 (obr. 36), zde ale nenastává limitace Fe2+ (obr. 34), ale pravděpodobně jinou živinou a tedy zastavení růstu (obr. 33). Oxidace Fe2+ pokračuje a odpovídající obsah ATP v jediné bakterii představují hodnotu asi 0,36 amol, což je až 3x méně oproti růstové kultuře. To naznačuje rozdíly v energetických poměrech obou metabolických stavů. Růst zcela neeliminovalo ani dvojnásobné promytí buněčné suspenze (obr. 37 - 38).
5.3. Růst bakterií na tetrathionanu Jedná se o předběžné výsledky, které je třeba ověřit opakováním experimentu, aby se snížil rozptyl výsledků. Hodnotu obsahu ATP v buňce 0,66 ± 0,81 amol ATP.buňka-1 (obr. 41 a 42) je potřeba ověřit. Jde ale o podobný výsledek jako u prvního rozpustného substrátu, Fe2+. Na rozdíl od hodnot blízkých 1 pro rozpustné substráty, u oxidace síry bylo dosaženo hodnot kolem 0,4 amol ATP.buňka-1. Toto snížení by mohlo být způsobeno limitací sírou postulovanou dříve [51].
5.4. Růst bakterií na pyritu Aktivní fáze růstu trvala asi 20 dní, proces byl možná částečně limitovaný Fe2+ (což použitá koncentrace manganistanu nemohla odhalit). Na konci pokusu (pH 1,2) pravděpodobně dochází k inhibici růstu H2SO4 (obr. 43). Nově byla získána hodnota obsahu ATP v buňce během lineárního růstu 0,81 ± 0,31 amol ATP.buňka-1 (obr. 46 a 47). Rozdíl mezi hodnotami ATP na buňku při růstu na pyritu a na Fe2+(obr. 26) je nevýznamný (P > 0,05). Tato shoda nasvědčuje ne hluboké limitaci Fe2+, proto jde o podobný výsledek
72
jako u oxidace Fe2+. Fe2+ je z pyritu kontinuálně uvolňováno a průkaz skutečné koncentrace prokáže, zda se potvrdí idea o nelimitaci či nepatrné limitaci (kolem KS).
5.5. Bakteriální oxidace síry při různých teplotách Ač je A. ferrooxidans mesofilní bakterie, teploty do 40°C neměly vliv na rychlost růstu ani na rychlost oxidace síry. Až při teplotě 42°C došlo k náhlému zastavení růstu a oxidace (obr. 48 a 49). Bylo usouzeno, že teplota 42°C pravděpodobně inhibuje některé z enzymů bakterie, ale nezpůsobuje smrt buňky. V průběhu pokusu byla přidávána síra a upravováno pH (tab. II), aby se zabránilo limitaci substrátem a inhibici kyselinou sírovou. Ke zjištění proteomických změn v buňce při vystavení teplotám kolem 40°C byl předcházející pokus opakován, ale bez zásahů bránících limitaci substrátem a inhibici H2SO4 (obr. 50 a 51). Tudíž všechny chtěné změny teplot bylo nutné vykonat v mnohem kratším časovém úseku. Avšak kultura reagovala na teploty kultivace odlišně, při 40°C, narozdíl od předchozího experimentu, nerostla a neoxidovala. I během tohoto pokusu se potvrdilo, že buňky při vysoké nerůstové teplotě (41 a 40°C) nejsou inaktivovány, ale při návratu k původní teplotě 28°C se růst obnovuje. Byl získán vzorek 1 na proteomickou analýzu při 28°C a vzorek 2 při nerůstové teplotě 41°C. Během posledního experimentu (obr. 52 - 56) týkajícího se vlivu teplot na A. ferrooxidans byl získán 3. vzorek při 28°C a 4. vzorek při vysoké růstové teplotě 40°C, ale po přídavku síry a alkalizaci. Je tedy těžké z předešlých pokusů určit přesnou teplotu, kdy dochází k zastavení růstu a oxidace. Jednotlivé teploty se ve 3 provedených experimentech lišily. Hodnoty obsahu ATP v buňce rostoucí na síře odpovídají dřívějším výsledkům [52]. Teplota 40°C však způsobuje pokles ATP v buňce. (obr. 55 a 56)
Veškerá opakovatelná i neopakovatelná pozorování odpovídají přítomnosti pouze A. ferrooxidans, jak dokládá analýza RAPD-PCR.
Studium proteomu během teplotních změn Pro srovnání výsledků nebylo možné použít všechny 4 gely, 2 musely být kvůli nekvalitnímu rozlišení, způsobenému pravděpodobně vysokou koncentrací kontaminujících nízkomolekulárních látek, vyřazeny. Bylo nalezeno 30 spotů, které mají při 40°C více než 5x zvýšenou expresi, na obr. 59 a 60 je zaznačeno 14 nejvýznamnějších změn. Označen je i spot 2715 (obr. 59 - 61). Ačkoliv
73
nebyla provedena identifikace pomocí MS, srovnáním s literaturou se dá předpokládat, že se jedná o 60 kDa chaperonin [46]. Jeho exprese byla při teplotě 40°C zvýšena 1,6x. Spot 1817 (obr. 59 - 61) by mohl odpovídat v literatuře identifikovanému chaperon proteinu dnaK (heat shock protein 70) [46]. Exprese tohoto proteinu byla zvýšena při vysoké teplotě 1,8x. Dá se předpokládat, že se tyto dva proteiny s velkou pravděpodobností podílí na ochraně buňky při vysokých teplotách. V blízké oblasti spotu 60 kDa chaperoninu a heat shock proteinu 70 jsou spoty se stejnou molekulovou hmotností lišící se izoelektrickým bodem, což nasvědčuje tomu, že se jedná pravděpodobně o isoformy téhož proteinu lišící se nábojem, což mohou mít za následek některé z posttranslačních modifikací. Srovnání spotů s literaturou je velice orientační, jelikož základ je identifikace daného spotu, která tady nebyla provedena. Větší množství změn v nárůstu exprese při 40°C bylo pozorováno v oblasti gelu s pH mezi 4,5-5,0 a molekulové hmotnosti okolo 20 kDa. Tato oblast není zatím příliš prozkoumána, tudíž nelze srovnáním s literaturou říct, jaký typ proteinů se zde nachází. Více než dvojnásobné snížení exprese při 40°C bylo pozorováno u 254 spotů, na obr. 59 a 60 je zaznačeno 59 prokazatelných, výrazných změn. Příklady spotů se sníženou expresí při 40°C jsou uvedeny na obr. 63.
74
6. Souhrn Diplomová práce přináší neúspěšný pokus využití plynové chromatografie pro studium asimilace CO2 bakteriemi A. ferrooxidans. Všechny způsoby vykazovaly nedostatečnou citlivost měření. Lepších výsledků dosáhla metoda s CO2 elektrodou, ani ta však původně není konstruovaná na naše podmínky a nelze ji doporučit pro nízkou reprodukovatelnost. Při oxidaci Fe2+ kulturou A. ferrooxidans byly studovány fáze změn obsahu ATP v kultuře, které se nepostihly dříve. Rozhodující je potvrzení souvislostí mezi aktivní a substrát-limitující fází a obsahem ATP v buňkách. U Fe2+ se systém chová standardně, avšak v rozporu s kulturou oxidující síru. Vedle Fe2+ byl testován další rozpustný substrát – tetrathionan, v obou případech obsah ATP výrazně převyšuje stav u buněk na síře, což podporuje dříve postulovanou limitaci sírou. Úvodní experimenty s oxidací pyritu a obsahem ATP v kultuře vedly k hodnotám ATP blízkým při oxidaci Fe2+. Nestandardní chování sirné kultury při vyšších teplotách bylo doplněno proteomickou analýzou za účelem detekce specifických proteinů. Pro dlouhodobost experimentů bylo metodou RAPD-PCR potvrzeno, že v kultuře byla stále přítomna bakterie A. ferrooxidans. .
75
7. Summary The thesis contains results of an unsuccessful experiments based on the use of gas chromatography for study of CO2 assimilation by A ferrooxidans. All the used methods showed insufficient sensitivity of measurement. Better results were obtained with a CO2 electrode, although it originally does not serve for our experimental conditions. Nevertheless the CO2 electrode can not be recommended for its low reproducibility. Phases of changes in cellular ATP content which had not been described in previous studies were investigated during Fe2+ oxidation. Relationships between active and substrate-limiting phases and cellular ATP content was confirmed. In addition to Fe2+, another soluble substrate, tetrathionate, was tested. In case of both substrates, cellular ATP content exceeds the value of ATP content in cells growing on elemental sulfur, which supports elemental sulfur limitation postulated earlier. Preliminary results of pyrite biooxidation and cellular ATP content were obtained. It resulted in ATP values close to those of Fe2+ oxidation. Proteomic analysis was added to studies on elemental sulfur oxidation under higher temperatures in order to detect formation of specific proteins. Due to long-term experiments, a presence of A. ferrooxidans in bacterial culture was monitored by a RAPD-PCR method.
76
8. Seznam zkratek 2-DE
dvourozměrná elektroforéze
∆p
elektrochemický protonový gradient
∆pH
transmembránový pH gradient
∆ψ
transmembránový elektrický potenciál
APS
adenosin 5´- fosfosulfát
BCP
proteiny obsahující měď
DMSO
dimethylsulfoxid
DTT
dithiothreitol
IC50
koncentrace způsobující 50% inhibici
IEF
isoelektrická fokusace
Ismp
intenzita chemiluminiscence vzorku
Ismp+std
intenzita chemiluminiscence vzorku s přídavkem standardu ATP
IPG
imobilizovaný pH gradient
Km
Michaelisova konstanta
KS
saturační konstanta
NDH1
NADH dehydrogenasa
OMP
specifické proteiny buněčné stěny
PCR
polymerasová řetězová reakce
PMSF
fenylmethylsulfonylfluorid
PPi
pyrrofosfát
PRK
fosforibulokinasa
Qp
oxidovaný ubichinol umístěný na pozitivní straně membrány
Qn
redukovaný ubichinon umístěný na negativní straně membrány
RICSs
redukované anorganické sloučeniny síry
RLU
relativní luminiscenční jednotka
RuBisCO
ribulosabisfosfátkarboxylasa/oxygenasa
SDS
dodecyl-sulfát sodný
SDS-PAGE
polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti dodecyl-sulfátu sodného
SDO
sulfurdioxygenasa
SOR
sulfit:akceptor-oxidoreduktasa
SQR
sulfid:chinon-oxidoreduktasa
77
TCD
tepelně vodivostní detektor
TE pufr
Thermopol Reaction pufr
TQR
thiosíran:chinon-oxidoreduktasa
TRIS
tris(hydroxymethyl)aminomethan
78
9. Literatura 1. Horikoshi K., Grant W. D. (1998). Extremophiles: microbial life in extreme environments. Wilex-Liss, Inc. New York. 2. Rawlings D. E. (2005). Characteristics and adaptability of iron- and sulfur-oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates. Microbial Cell Factories 4: 13. 3. Hallberg K. B., Johnson D. B. (2005). Mine water mikrobiology. Mine Water and the Environment 24, 28 – 32. 4. Baker-Austin C., Dopson M. (2007). Life in acid: pH homeostasis in acidophiles. Trends in Microbiology 15, 165 - 171. 5. Pakchung A. A. H., Simpson P. J. L., Codd R. (2006). Life on Earth. Extremophiles continue to move the goal posts. Environmental Chemistry 3, 77 – 93. 6. http://www.lamolina.edu.pe/simbiosis/fotos/Micr517b.jpg. (2009). 7. Ohmura N., Sasaki K., Matsumoto N., Saiki H. (2002). Anaerobic respiration using Fe3+, S0, and H2 in the chemolithoautotrophic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. Journal of Bacteriology 184, 2081 – 2087. 8. Pokorná B., Mandl M., Bořilová Š., Češková P., Marková R., Janiczek O. (2007). Kinetic constant variability in bacterial oxidation of elemental sulfur. Applied and Environmental Microbiology 73, 3752 – 3754. 9. Rawlings D.E. (2002). Heavy metal mining using microbes. Annual Review of Microbiology 56, 65 - 91. 10. Janiczek O., Mandl M., Češková P. (1998). Metabolic activity of Thiobacillus ferrooxidans on reduced sulfur compounds detected by capillary isotachophoresis. Journal of Biotechnology 61, 225 – 229. 11. Pronk J. T., Bruyn J. C., Bos P., Kuenen J. G. (1992). Anaerobic growth of Thiobacillus ferrooxidans. Applied and Environmental Microbiology 58, 2227 – 2230. 12. Pronk J. T., Meulenberg R., Hazeu W., Bos P., Kuenen J. G. (1990). Oxidation of reduced inorganic sulphur compounds by acidophilic thiobacili. FEMS Microbiology Reviews 75, 293 – 306. 13. Brasseur G., Levican G., Bonnefoy V., Holmes D., Jedlicki E., Lemesle-Meunier D. (2004). Apparant redundancy of electron transfer pathways via bc1 complexes and
79
terminal
oxidases
in
the
extremophilic
chemolithoautotrophic
Acidithiobacillus
ferrooxidans. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics 1656, 114 - 126. 14. Silver M. (1970). Oxidation of elemental sulfur and sulfur compounds and CO2 fixation by
Ferrobacillus
ferrooxidans
(Thiobacillus
ferrooxidans).
Canadian
Journal
of Microbiology 16, 845 – 849. 15. Sugio T., Hisazumi T., Kanao T., Kamimura K., Takeuchi F., Negishi A. (). Existence of
aa3-type
ubiquinol
oxidase
as
a
terminal
oxidase
in
sulfite
oxidation
of Acidithiobacillus ferrooxidans. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 70, 1584 – 1591. 16. Meruane G., Vargas T. (2003). Bacterial oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5–7.0. Hydrometallurgy 71, 149 - 158. 17. Chen Y., Suzuki I. (2005). Effects of electron transport inhibitors and uncouplers on the oxidation of ferrous iron and compounds interacting with ferric iron in Acidithiobacillus ferrooxidans. Canadian Journal of Microbiology 51, 695 – 703. 18. Brasseur G., Bruscella P., Bonnefoy V., Lemesle-Meunier D. (2002). The bc1 complex of the iron-grown acidophilic chemolithotrophic becterium Acidithiobacillus ferrooxidans functions in the reverse but not in the forward direction: Is there a second bc1 complex? Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics 1555, 37 – 43. 19. Valdés J., Pedroso I., Quatrini R., Dodson R. J., Tettelin H., Blake R., Eisen J. A., Holmes D. S. (2008). Acidithiobacillus ferrooxidans metabolism: from genome sequence to industrial applications. BMC Genomics 9. 20. Yarzábal A., Brasseur G., Bonnefoy V. (2002). Cytochromes c of Acidithiobacillus ferrooxidans. FEMS Microbiology Letters 209, 189 – 195. 21. Yarzábal A., Brasseur G., Ratouchniak J., Lund K., Lemesle-Meunier D., Demise J. A.,
Bonnefoy
V.
(2001).
The
high-molecular-weight
cytochrome
c
Cyc2
of Acidithiobacillus ferrooxidans is an outer membrane protein. Journal of Bacteriology 184, 313 – 317. 22. Cavazza Ch., Giudici-Orticoni M. T., Nitschke W., Appia C., Bonnefoy V., Bruschi M. (1996). Characterisation of a soluble cytochrome c4 isolated from Thiobacillus ferrooxidans. European Journal of Biochemistry 242, 308 – 314. 23. Sasaki K., Ida Ch., Ando A., Matsumoto N., Saiki H., Ohmura N. (2003). Respiratory isozyme, two types of rusticyanin of Acïdithiobacillus ferrooxidans. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67, 1039 – 1047.
80
24. Alcaraz L. A., Donaire A. (2004). Unfolding process of rusticyanin (Evidence of protein aggregation). European Journal of Biochemistry 271, 4284 – 4292. 25. Zeng J., Geng M., Liu Y., Xia L., Liu J., Qiu G. (2007). The sulfhydryl group of Cys138 of rusticyanin from Acidithiobacillus ferrooxidans is a crucial for copper binding. Biochimica et Biophysica Acta 1774, 519 – 525. 26. Alcaraz L. A., Gómez J., Ramírez P., Calvente J. J., Andreu R., Donaire A. (2007). Folding and unfolding in the blue copper protein rusticyanin: role of the oxidation state. Bioinorganic Chemistry and Applications 2007. 27. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=57242. (2009). 28. Brugna M., Nitschke W., Asso M., Guigliarelli B., Lemesle-Meunier D., Schmidt Ch. (1999). Redox components of cytochrome bc-type enzymes in acidophilic prokaryotes (II. The Rieske protein of phylogenetically distant acidophilic organisms). The Journal of Biological Chemistry 274, 16766 – 16772. 29. Elbehti A., Nitschke W., Tron P., Michel C., Lemesle-Meunier D. (1999). Redox components
of
cytochrome
bc-type
enzymes
in
acidophilic
prokaryotes
(I. Characterization of the cytochrome bc1-type complex of the acidophilic ferrous ion-oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans). The Journal of Biological Chemistry 274, 16760 – 16765. 30. Schneider D., Schmidt Ch. (2004). Multiple rieske proteins in prokaryotes: Where and why? Biochimica et Biophysica Acta–Bioenergetics 1710, 1 – 12. 31. Jensen A. B., Webb C. (1994). Ferrous sulphate oxidation using Thiobacillus ferrooxidans: a review. Process Biochemistry 30, 225 – 236. 32. Haddadin J., Morin D., Ollivier P., Fick M. (1993). Effect of different carbon dioxide concentrations on ferrous iron and pyrite oxidation by a mixed culture of iron and/or sulfur-oxidizing bacteria. Enzyme and Microbial Technology 15, 832 – 841. 33. Holuigue L., Herrera L., Philips O. M., Young M., Allende J. E. (1987). CO2 fixation by
mineral-leaching
bacteria:
characteristics
of
the
ribulose
bisphosphate
carboxylase-oxygenase of Thiobacillus ferrooxidans. Biotechnology and Applied Biochemistry 9, 497 – 505. 34. Kelly
D.
P.
(1999).
Thermodynamics
aspects
of
energy
conservation
by
chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation pathways. Archives of Microbiology 171, 219 – 229. 35. Appia-Ayme C., Quatrini R., Denis Y., Denizot F., Silver S., Roberto F., Veloso F., Valdés J., Cárdenas J. P., Esparza M., Orellana O., Jedlicki E., Bonnefoy V., Holmes 81
D. S. (2006). Microarray and bioinformatic analyses suggest models for carbon metabolism in the autotroph Acidithiobacillus ferrooxidans. Hydrometallurgy 83, 273 - 280. 36. Heinhorst S., Baker S. H., Johnson D. R., Davies P. S., Canon G. C., Shively J. M. (2002). Two copies of form I RuBisCO genes in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270. Current Microbiology 45, 115 – 117. 37. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=32727. (2009). 38. Wakai S., Ohmori A., Kanao T., Sutko T., Kamimura K. (2005). Purification and biochemical characterization of the F1-ATPase from Acidithiobacillus ferrooxidans NASF-1 and analysis of the atp operon. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 69, 1884 - 1891. 39. http://journals.prous.com/journals/dnp/20061903/html/dn190139/images/fig1.gif. (2009). 40. Campbell A. K. (1986). Living light: chemiluminiscence in the research and clinical laboratory. Trends in Biochemical Science 11, 104 - 108. 41. Chu C. P., Lee D. J., Bea-Ven Chang, Liao C. S. (2001). Using ATP bioluminiscence technique for monitoring microbial activity in sludge. Biotechnology and Bioengineering 75, 469 - 474. 42. Squirrell D.J., Price R.L., Murény M. J. (2001). Rapid and specific detection of bacteria using bioluminiscence. Analytica Chimica Acta 457, 109 - 114. 43. Lundin A. (2000). Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Methods in Enzymology 305, 346 – 370. 44. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=56705. (2009). 45. Bouchal P., Kučera I. (2003). Dvourozměrná elektroforéza v proteomice: principy a aplikace. Chemické Listy 97, 29 – 36. 46. Bouchal P., Zdráhal Z., Helánová Š., Janiczek O., Hallberg K. B., Mandl M. (2006). Proteomic and bioinformatic analysis of iron- and sulfur-oxidizing Acidithiobacillus ferrooxidans using immobilized pH gradients and mass spectrometry. Proteomics 6, 4278 – 4285. 47. Jerez C. A., Chamorro D., Peirano I., Toledo H., Arredondo R. (1988). Studies of the stress response in chemolithotrophic acidophilic bacteria. Biochemistry International 17, 989 – 999. 48. Ramírez P., Guiliani N., Valenzuela L., Beard S., Jerez C. A. (2004). Differential protein expression during growth of Acidithiobacillus ferrooxidans on ferrous iron, sulfur compounds, or metal sulfides. Applied and Environmental Microbiology, 4491 – 4498. 82
49. Vera M., Guiliani N., Jerez C. A. (2003). Proteomic and genomic analysis of the phosphate starvation response of Acidithiobacillus ferrooxidans. Hydrometallurgy 71, 125 – 132. 50. Silverman M., Lundgren D. G. (1959). Studies on the chemoauthotropic iron bakterium Ferrobacillus ferrooxidans: 1. An improved medium and a harvesting procedur efor securing high cell yields. Journal of Bacteriology 77, 642 – 647. 51. Češková P., Mandl M., Helánová Š., Kašparovská J. (2002). Kinetic studies on elemental sulfur oxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans: sulfur limitation and activity of free and adsorbed bakteria. Biotechnology and Bioengineering 78, 24 - 30. 52. Divíšková E. (2008). Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU, Brno. 53. Mandl M., Nováková O. (1993). An ultraviolet method for the determination of oxidation of iron sulphide mineral by bacteria. Biotechnology Techniques 7, 573 – 574. 54. ATP Biomass Kit HS, Instructions for Use. BioThema AB, Handen, Sweden. 55. Marková R. (2008). Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU, Brno. 56. Waltenbury D.R., Leduc L.G., Ferroni G.D. (2005). The use of RAPD genomic fingerprinting to study relatedness in strains of Acidithiobacillus ferrooxidans. Journal of Microbiological Methods 62, 103-112. 57. Bouchal P. (2004). Optimalizovaný protokol pro 2-DE analýzu celobuněčného lyzátu Acidithiobacillus ferrooxidans. 58. Instruction Manual, RD DC Protein Assay, Bio-Rad Laboratories. 59. Rabilloud T., Brodard V., Peltre G., Righetti P. G., Ettori C. (1992): A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains. Electrophoresis 13, 429 - 439. 60. Boon M., Luyben K. C. A. M., Heijnen J. J. (1997): The use of on-line off-gas analyses and stoichiometry in the bio-oxidation kinetice of sulphide minerale. Hydrometallurgy 48, 1-26.
83
