MITOCHONDRIE Peroxisomy a interakce kompartmentů
Mitoch
Specifický lipid vnitřní mitoch. membrány
Komplexy vnitřní membrány rostlinných mitochondrií – dva systémy přenosu e-
NADH ř dehydrogenasa
Význam této respirační dráhy je vedle výjimečných případů produkce tepla (Arum) pravděpodobně v možnosti reagovat na stres antioxidatčním působením, „upouštět“ přebytečnou energii a udržet v chodu aerobní glykolýzu, pentózový a Krebsův cyklus (tj. anabolické fce mitochondrií).
Mitochondrie se dělí „zaškrcením“ podobně jako plastidy
Vnitřní prstýnek - FtsZ1 a 2 (vzdál. prokar. příb. tubulinu GTPdep. polymerace) a spol. Vnější prstýnek – dynamin.
Organizace genomu suchozemských rostlin 208-2400 kb depending on species Relatively constant coding but highly variable organization among and even within a species Entire complexity maps as a single “master circle” All angiosperms except Brassica hirta have one or more recombination repeats. Repeats not conserved among species Direct and/or inverted orientations Recombination generated inversions (inverted repeats) Recombination generated subgenomic molecules (deletions) (direct repeats), some present at very low copy number (sublimons) Leads to complex multipartite structures
Architektura rostlinné mtDNA je velmi variabilní – př.kukuřice
Rekombinace napříč opakováními vede k delecím a fragmentacím 1
2
4’ 1
4
3’
2’
1’ 3 2’
2 3’ 4’
3
1’
4
Uspořádání genomu mitochondrií Arabidopsis. (modified from Backert et al. Trends Plant Sci 2:478)
> >
> >
> >
>
>
>
>
>
>
>
> >
>
Fyzická struktura mitochondrialní DNA rostlin (Backert et al. Trends Plant Sci 2:478)
Conclusions No discrete size classes Circles including smaller than predicted Linears including longer than predicted Potential Mechanisms Rosettes Nucleoid complexes Recombination complexes Long linear molecules and sigma molecules Rolling circle replication Recombination Branched linear molecules Recombination or replication of linear molecules Small circles Recombination across short direct repeats Questions How is the genome stably inherited from cell to cell and generation to generation?
Fyzická struktura mitochondrialní DNA rostlin (modified from Backert et al. Trends Plant Sci 2:478)
Fyzická struktura mitochondrialní DNA rostlin
via rolling circle DNA replication (from Freifelder, 1983, Molecular Biology)
Kódovací potenciál genomu rostlin In organello protein synthesis indicates 30-50 proteins encoded by most plant mitochondrial genomes Complete sequence of A. thaliana mitochondrial genome identified 57 genes respiratory complex components rRNAs, tRNAs, ribosomal proteins cytochrome c biogenesis Plant mitochondrial genomes do not encode a complete set of tRNAs mit encoded tRNAs of native (mitochondrial origin) mit encoded tRNAs from imported plastid genome missing tRNAs are nuclear encoded and imported into mitochondria to complete the set 42 orfs in A. thaliana mit genome that might be genes A. thaliana mitochondrial gene density (1 gene per 8 kb) is lower than the nuclear gene density (1 gene per 4-5 kb)!
Jak mitochondrie regulují expresi jaderných genů. Příklad alternativní oxidázové dráhy v mitochondriích a ROS.
Mitochondrial regulation of plant nuclear genes Plant mitochondrial respiratory electron transfer chain includes an alternative pathway for electron flow Single subunit alternative oxidase (AOX) – je rezistentní ke kyanidu! A je inhibována Salicylhydroxamovou kyselinou (SHAM). Encoded by a nuclear gene (aox) Bypasses two of three sites for H+ transfer coupled to ATP synthesis Transcription of nuclear aox is upregulated when electron flow through the cytochrome pathway is disrupted by the inhibitor antimycin A (AA)
Jak mitochondrie regulují jadernou genovou expresi. NtAI genes (Maxwell et al. Plant J 29:267) Nuclear genes up-regulated in response to AA, including aox Seven additional genes identified by differential mRNA display, most associated with stress responses acc oxidase glutathione S transferase Sar8.2 cysteine protease pathogen-induced lipase SA-induced glucosyl transferase Also induced by reactive oxygen species (ROS) (eg H2O2) Induction is blocked by antioxidants such as flavones Of all inducers, AA is the most rapid. This implicates mitochondria as the site coordinating ROS signaling in the plant cell
Mitochondrial regulation of plant nuclear genes NtAI genes (Maxwell et al. Plant J 29:267)
NAC - N-acetylcystein a flavon = antioxidanty; AA = antimycin A Figure 3. Antioxidants lower intracellular ROS levels and inhibit gene induction. (a) Effects of antioxidant addition on AA, H2O2, and SA-dependent accumulation of intracellular ROS in tobacco suspension cells. ROS levels were measured 4 h after AA (5 µm), H2O2 (5 mm) and SA (1 mm) addition with and without preincubation for 45 min with N-acetylcysteine (25 mm) or flavone (1 mm). Data represent means ± SD for three experiments. (b) Effect of the antioxidant treatment described above on the AA-, H2O2-and SA-dependent expression of Aox1 and the NtAI genes.
Editování mRNA v mitochondriích. 0.5 až 5% pozic bývá modifikováno. celkově jsou editovány stovky pozic – kol. 450 x pro Arabidopsis (pro připomenutí v plastidech je to jen 19x)
Editování mitochondriální RNA Evidence for the importance of cis-guiding sequences in plant mitochondrial RNA editing Editing of recombinant or rearranged mitochondrial genes Recombination breakpoint immediately 3’ to an editing site in rice atp6 did not abolish editing Recombination breakpoint seven nucleotides 5’ to an editing site in maize rps12 did abolish editing Recombination breakpoint 21 nucleotides 5’ to an editing site in maize rps12 did not abolish editing Electroporation of genes into isolated mitochondria, followed by isolation of mitochondrial cDNA Editing of mutated coxII gene demonstrated sequences from –16 to +6 required for editing
mechanismus opět DEAMINACE s C na U (viz. PLASTIDY)
Pentatricopeptidové bílkoviny (PPR) hrají roli v každém kroku genové exprese v mitochondriích včetně editování a cms.
IMPORT
GENOVÁ EXPRESE
Import bílkovin do mitochondrií
Recognition of proteins destined for mitochondria • This involves both terminal signal sequences and internal signal patches • In some cases proteins for import are packaged with chaperones, especially Hsp70, but in other cases it would appear that the fully-folded protein is imported intact. • There are two major recognition sites on the outer membrane, one recognising fully folded proteins, the other proteins associated with chaperones
N´term. Lokalizační značka pro import do mitochondrií se nazývá také presekvence. Často jsou to pozitivně nabité α-helixy. (Zvl. u membránových bílkovin je ovšem AA signál pro import často uvnitř bílkoviny.)
Entry of proteins into mitochondria, general principles
„Targetting“ do mitochondrií příklady lokalizačních „značek“
Targetting of proteins to mitochondria involves both internal and terminal signal sequences and signal patches
Import into mitochondria TOM20 příklad evoluční konvergence mezi živoč. a rostlinami.
U rostlin TOM70 schází a také recept. dom. na TOM22 – mají místo toho TOM9 a další možné receptory včetně plastidového typu „TOC64-V“=mtOM64.
• Transfer across the outer membrane does not require ATP hydrolysis directly but obviously energy is needed as the proteins are moving up a concentration gradient. The energy is probably provided by ATP hydrolysis in binding and releasing Hsp70
The Transfer - Inner membrane complex 1) It must recognise the signal on peptides projecting from the TOM complex 2) It must guide these through the inner membrane and then pull the rest of the molecule through. • The matrix targetting signal must now be removed. This is carried out by a special Matrix processing peptidase, sometimes assisted by a second enzyme, the mitochondrial intermediate peptidase
Role Vm a energie • Movement of proteins through the pore depends on the maintenance of the potential difference across the membrane. This is normally app. 200 mV which is equivalent to 400,000 V/cm • The key role in dragging the remainder of the proteins through the membrane is played by the mitochondrial form of Hsc70. Transfer requires ATP hydrolysis. Three mechanisms have been suggested. The ratchet mechanism proposes that transfer is by Brownian motion with Hsc70 binding preventing back movement. The molecular motor model proposes that the conformational change of mtHsc70 results in the protein being pulled across the membrane
Mechanics of Movement
• Importy do mitochondrií a plastidů spolu souvisejí. • Při endosymbióze sinice už v buňce byla mašinerie pro import do mitochondrií.
Import bílkovin do mitochondrií je podobný importu do plastidů i když jejich evoluční historie je různá - a obě tyto dráhy spolu souvisejí. DVOJITÉ CÍLENÍ
„Dual targeting“ – podvojné adresování. Některé bílkoviny nesou lokalizační Nterm.signál pro lokalizaci jak do mitochondrii, tak do plastidů(příp.peroxisomů). Např. jedna ze 3 NEP fág.podob. RNApol., AtZnmetalloproteáza (pro preseq./trans.pept. Odštěpování), 17x AAc-tRNA synt. . Jde bud´o nespecifický trans./pres. peptid či o dva „lokalizační“ peptidy tandemově za sebou. Také UTRs na mRNA mají zde svou roli.
TOM je dosti rostlinně specifický, zato TIM je jasně dalekosáhle homologní kvasinkovému.
Adresování do organel je ovšem silně závislé na diferenciačním/vývojovém stavu buňky – tj. (ne)přítomnosti trans-regul. bílkovin.
SAMČÍ PYLOVÁ STERILITA
• SAMČÍ PYLOVÁ STERILITA U ROSTLIN SOUVISÍ S NESTABILITOU MITOCHONDRIÁLNÍ DNA.
Cytoplasmic male sterility (CMS) • Controlled by mitochondrial genes • Maternally inherited • Used for hybrid production in many crops – Onion, carrot, cabbage – Corn, sorghum, pearl millet, sunflower, sugar beets
FERTILNÍ
cms STERILNÍ
Restorer genes „obnovovací“ geny • Nuclear genes (Rf) can restore male fertility (One locus restorer system) – – – – – –
CMS, rfrf is male sterile CMS, Rfrf is male fertile CMS, RfRf is male fertile N, rfrf is male fertile N, Rfrf is male fertile N, RfRf is male fertile
Fertility restoration in maize
Příprava hybridního osiva – využití heterose
Hybridní/chimerické ORF jako příčina CMS.
Rf potlačují jejich neblahé účinky.
PPR=pentatricopeptid repeat. U „RESTORERU“ Rf
• EVOLUČNÍ VÝZNAM CMS • SSS = „substoichiometric shifting“ • podpora cizosprašování
• Mitochondrie hrají spouštěcí roli v PCD také u rostlin.
Aktivace PCD mitochondriálními signály také u rostlin. A regulated pathway of cell death important in normal development and disease and defense responses in plants and animals ALE KLÍČOVOU ROLI HRAJE u rostlin VAKUOLA A UTOFAGICKÁ DRÁHA In animals, release of mitochondrial signaling molecules, especially the electron carrier cytochrome c, activates the cell death machinery, which is already in place. This is not regulation of gene expression! A role for mitochondria in plant PCD is becoming evident, although the nature of the signaling molecules is not yet known
VPE vacuol. proc. enz.
Figure 3. Figure 2. Many death signals converge onto mitochondria and are mediated through members of the Bcl-2 protein family called `BH3-only' proteins, such as Bid and Bad. Caspase 8 then cleaves Bid, whose C-terminal fragment (tBid) translocates to mitochondria, where it activates Bax or Bax-like proteins and results in cytochrome-c (cyt c) release. Once in the cytosol, cytochrome c activates caspase 9 by binding to Apaf-1 and dATP. from Desagher and Martinou Trends Cell Biol 10:369
Peroxisomy
Peroxisomy strukturně jednoduché, ale funkčně rozmanité organely (specializace podle pletiv) Peroxisomes are a type of microbody. Microbodies are cell organelles bounded by a single membrane and are used for a variety if different processes. For example, peroxisomes contain enzymes which produce hydrogen peroxide (and have the means for destroying it). In addition, plants have glyoxysomes which contain the enzymes of the glyoxylate cycle and yeasts have a variety of microbodies including ones involved in methanol oxidation. A) peroxisomy asociované s ER B) vizualizovaná kataláza (tmavě) v peroxisomu
Typy peroxisomů peroxisomy vždy obsahují enzym katalázu – štěpení peroxidu vodíku (marker peroxisomů) detoxifikace reactive oxygen species (ROS)
•
LISTOVÉ PEROXISOMY – fotorespirace u C3 rostlin
•
GLYOXYSOMY – β-oxidace mastných kyselin a glyoxalátový cyklus (klíčení semen)
•
GERONTOSOMY – katabolismus lipidů v odumírajících listech
•
URIKOSOMY – v hlízkách nodulujících bobovitých rostlin, specializované na dusíkatý metabolismus (při fixaci N2): oxidativní odbourávání guaninu (přes kyselinu močovou na allantoin za současné produkce H2O2) peroxisomy jsou možná pozůstatkem po prapůvodní respirační organele funkční před vznikem mitochondrií
Vlastnosti peroxisomů
Plants
Human hepatocytes
Shape
spherical, ovoid, tubular, square, irregular
ovoid
Internal Structure
amorphous, paracrystalline
amorphous
Size
0.1-2.0 µm
0.5 µm
No. per cell
1-1000
100
% vol of cell
0.1-80%
1%
Funkce peroxisomů Fotorespirace: moc světla, málo CO2 krystaly katalázy
fosfoglykolát = produkt fotorespirace až 75 % jeho produkce se takto vrátí do Calvinova cyklu
místo 2x 3-fosfoglycerátu vzniká 1x 3-fosfoglycerátu a 1x 2-fosfoglykolát
Biogeneze peroxisomů
Biogeneze peroxisomů tři modely: A) vznik ze specifických částí ER B) dělením stávajících perixosomů + import všech proteinů z cytoplasmy C) dělením stávajících perixosomů + import membr. proteinů z ER a proteinů matrix z cytoplasmy
Biogeneze peroxisomů
Only some membrane proteins (Pex3p & pex19p) travel via ER
Other membrane proteins imported like matrix proteins PEROXINY – proteiny biogeneze peroxisomů
Semiautonomní model peroxisomu u rostlin
ERPIC = ER-peroxisomal intermediate compartment
existuje i retrográdní cesta z peroxisomu do ER: tombus +RNA viry (TBSV) se replikují v peroxisomech a některé proteiny se pak transportují do ER
Review The ER-peroxisome connection in plants: Development of the “ER semi-autonomous peroxisome maturation and replication” model for plant peroxisome biogenesis Robert T. Mullena, , and Richard N. Treleaseb, , aDepartment of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, Canada N1G 2W1 bSchool of Life Sciences, Arizona State University, PO Box 874501, Tempe, AZ 85287-4501, USA Received 3 June 2006; revised 25 August 2006; accepted 6 September 2006. Available online 14 September 2006.
Abstract The perceived role of the ER in the biogenesis of plant peroxisomes has evolved significantly from the original “ER vesiculation” model, which portrayed co-translational import of proteins into peroxisomes originating from the ER, to the “ER semi-autonomous peroxisome” model wherein membrane lipids and post-translationally acquired peroxisomal membrane proteins (PMPs) were derived from the ER. Results from more recent studies of various plant PMPs including ascorbate peroxidase, PEX10 and PEX16, as well as a viral replication protein, have since led to the formulation of a more elaborate “ER semi-autonomous peroxisome maturation and replication” model. Herein we review these results in the context of this newly proposed model and its predecessor models. We discuss also key distinct features of the new model pertaining to its central premise that the ER defines the semi-autonomous maturation (maintenance/assembly/differentiation) and duplication (division) features of specialized classes of pre-existing plant peroxisomes. This model also includes a novel peroxisome-to-ER retrograde sorting pathway that may serve as a constitutive protein retrieval/regulatory system. In addition, new plant peroxisomes are envisaged to arise primarily by duplication of the pre-existing peroxisomes that receive essential membrane components from the ER.
Keywords: Biogenesis; Endoplasmic reticulum; Peroxisome; Plant; Protein trafficking; Organelle Abbreviations: APX, ascorbate peroxidase; BFA, brefeldin A; BY-2, bright yellow-2; CAT, chloramphenicol acetyltransferase; COPII, coat protein II; DiOC , 3,3′-dihexyloxacarbocyanine idodine; ESCRT, 6 endosomal sorting complex required for transport; ER, endoplasmic reticulum; ERPIC, ER-peroxisome intermediate compartment; GFP, green fluorescent protein; HA, hemagglutinin; p33, 33-kDa replication protein; 92-kDa RNA-dependent RNA polymerase; pER, peroxisomal ER; Pex, peroxin; PMP, peroxisomal membrane protein; pMVB, peroxisomal multivesicular body; PTS, peroxisome targeting signal; TBSV, tomato bushy stunt virus; TMD, transmembrane domain; YFP, yellow fluorescent protein
Semiautonomní model peroxisomu u rostlin APX = askorbát peroxidáza (perox. membr. protein) APX
DiOC4
DiOC4 = marker membrány ER
Import proteinů do peroxisomů matrixové a membranové proteiny vstupují do peroxisomů různými cestami
pex3 mutanti nemají peroxisomy
Import do matrix peroxisomů peroxisome targeting signal = PTS import do MATRIX peroxisomů Dva hlavní typy adresových sekvencí: PTS1 – Ser-Lys-Leu na C-konci, není odštěpován
PTS1 (u At 182 genů) 1) Carboxy-terminal 2) Small (3 amino acids) 3) Consensus sequence = S-K-L (malé bazické aa) 4) Not cleaved following import
PTS2 – na N-konci, je odštěpován; – u živočichů je vzácný, u rostlin docela častý
PTS2 (u At 74 genů) 1) Amino-terminal or near the amino terminus 2) Medium sized (~9 amino acids) 3) Consensus sequence = R-L-(X)5-H-I/L/F 4) Cleaved following import (in mammals)
Import do matrix peroxisomů The mechanism of PTS1 appears to involve binding of the SKL sequence to Pex5. This then interacts with a peroxisomal membrane protein called Pex14 forming a channel. It is not clear whether Pex5 and the protein move together across the channel or whether the imported protein is “pushed” through. In the peroxisome the protein is released and Pex5 is recycled with the help of Pex2, 10, and 12.
Import do matrix peroxisomů Podmínky pro import do matrix: 1) ATP hydrolysis is required for import. 2) Import into peroxisomes does not require unfolding of the protein chain (even gold particles conjugated to a peroxisomal protein can be imported). 3) Hsp70 is however needed and becomes bound to the exterior of the peroxisome.
IMPORT DO MEMBRÁNY
Komunikace kompartmentů
Fotorespirace Fotorespirace: moc světla, málo CO2 místo 2x 3-fosfoglycerátu vzniká 1x 3-fosfoglycerátu a 1x 2-fosfoglykolát
až 75 % produkce fosfoglykolátu se takto vrátí do Calvinova cyklu
Olejová tělíska – vznik a mobilizace
ACP = acyl carrier protein
Olejová tělíska – vznik a mobilizace
Olejová tělíska – vznik a mobilizace
Povrch olejových tělísek stabilizujicí oleosiny. Oleosiny uvolněné z tapeta mají důležitou roli při interakci/rozpoznání pylu a blizny.
Olejová tělíska a glyoxysomy
H2O2
glyoxalátový cyklus mobilizace zásobních tuků a glukoneogeneze rostliny dokážou převádět tuky na cukry
Export malátu (kys.jablečné) z plastidů zajišťuje nepřímo „rozvod“ redukčních ekvivalentů do cytoplasmy a dalších organel
v cytoplasmě vládne relativně redukční prostředí
Shrnutí metabolické komunikace organel
Rostliny mutanta ječmene albostrians, kompenzují nefunkční mutantní plastidy aktivací mitochondrií.
C4 rostliny Vysoká teplota zvyšuje oxygenázovou aktivitu Rubiska proti carboxylázové. Při zvýšené teplotě se nepříznivě mění rozpustnost O2 a CO2. Při zvýšené teplotě hrozí velké ztráty vody při zvýšené transpiraci.
C3 rostliny
C4 rostliny
Věnčitá anatomie C4 rostlin
„KRANZ“/věnčitá anatomie – CO2 je primárně zachycován v mezofylu karboxylací PEP na oxaloacetát prostorová separace
Věnčitá anatomie C4 rostlin
Mezofyl
Buňky pochev cévních svazků
Věnčitá anatomie C4 rostlin
1 = PEP karboxyláza
uvnitř rostliny je daleko vyšší poměr koncentrace CO2/O2 ve prospěch CO2, fotorespirace je potlačená
CAM rostliny Crassulacean Acid Metabolism časová separace