Microscopische beeldvorming in biofysisch en biomedisch onderzoek
23.01.2012
M. Ameloot
Interactieve websites • http://www.olympusmicro.com/index.html • http://www.microscopyu.com/index.html • http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/index.html
De microscoop oculair objectief preparaat
De microscoop
De microscoop
Vergroting microscoop
M tot M obj M oc
M tot
?
Licht is een elektromagnetische golf l l
Elektrisch veld
l golflengte c = lichtsnelheid (=lf)
Animatie: elektromagnetische golf
http://www.walter-fendt.de/ph14e/emwave.htm
Situering golflengten elektromagnetische straling
l
1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm
l Blauw licht
l
l
Rood licht
Afstand
Golfkarakter van het licht l
?
Diffractie • http://www.olympusmicro.com/primer/java/d iffraction/index.html
Diffractie
Diffractie
d sinq = l (1e min)
Diffractie ronde opening d sinq = 1,22 l (1e min) d = diameter opening q
Diffractiepatronen naburige punten
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/im ageformation/airydiskbasics/index.html
Diffractie: Rayleigh criterium
Criterium van Rayleigh
Resolutie d
0,61l d n sin
E. Abbe 1873
d
l 2
Numerieke apertuur
Resolutie en openingshoek P r e p a r a a t
?
Diffractie: conclusies 1. Geometrische optica: punt punt. 2. Golfkarakter van licht:punt vlekje. 3. Opening van het objectief , breedte vlekje. 4. Breedte vlekje , afstand tussen 2 naburige punten om afzonderlijk te worden waargenomen. 5. Resolutie mede bepaald door golflengte invallend licht
Diffractielimiet
0,61l d n sin Fundamentele beperking
d
l 2
Resolutie versus grootte-orde afmetingen
d
l
2
d 250 300 nm 1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm
Dikte hoofdhaar: 0,1 mm = 100 000 nm Diameter RBC: 0,008 mm= 8000 nm HIV virus: 90 nm Dikte biologisch membraan: 5 nm
Optische microscopie versus elektronenmicroscopie 1. Elektronenbundel golflengte. 2. Snelheid elektronen golflengte 3. Diffractielimiet evenzeer geldig. 4. Resolutie 0,5 nm. 5. Dunne preparaten vereist. 6. Omgeving niet biologisch vriendelijk.
d
l 2
Celbiologische toepassing Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, …?
Fluorescentie
FITC Fluorescein-5-isothiocyanaat
Fluorescentie-microscopie
Verschillende fluorescente labels
Celbiologische toepassing Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, …
Specifieke fluorescerende merkers
Confocale fluorescentiemicroscopie
Scanning galvanometers Point Scanning
x
y
Laser out
To Microscope
Laser in
Scanning process
X Y Sequentially illuminated sample
Sequentially generated image
Vergelijking widefield en confocale microscopie http://www.olympusconfocal.com/java/ confocalvswidefield/index.html
Optical slicing
Y Z X
3D reconstructie
Optische secties
Mitochondria gemerkt met Mitotracker Green
MDCK cellen onder metabolische inhibitie A
B
C
Mitochondriale calcium concentratie • Combinatie van twee fluorescente probes: 1
Mito Tracker Green (200 nM)
Calcium probe: Rhod2 2
Rhod2 (4 mM)
MTG masker voor selectie Rhod2mito MTG beeld
X Binair MTG masker Rhod2 beeld
= Rhod2mito
Kleinere afstanden via fluorescentie? Door gebruik te maken: - twee fluorescerende moleculen - Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
47
FRET principe Stralingsloze
Excitatie
koppeling !!! D
kT
Donor fluorescentie
FD
A
A
Acceptor fluorescentie
FDA
FDA E 1 FD
FA
Bij langere golflengte dan voor de donor 48
FDA E 1 FD
1 Å = 0.1 nm 49
Spectroscopische meetlat
50
FDA E 1 FD R06 1 E 6 6 R 6 R0 R 1 ( ) R0 Ro=30 Å
Ro=50 Å Ro=70 Å
1 Å = 0.1 nm
Toepassingen FRET
52
Cyan FP & Yellow FP R0 = 48 Å = 4,8 nm
Nature Reviews / Molecular Cell Biology
53
Cyan FP & Yellow FP R0 = 48 Å = 4,8 nm
FRET en membraanpotentiaal depolarizatie tot +60 mV Acceptor Donor
Amelie Perron, Hiroki Mutoh, Walther Akemann, Sunita Ghimire Gautam, Dimitar Dimitrov, Yuka Iwamoto and Thomas Knöpfel
55
Diffractielimiet FRET: indirecte wijze voor afstanden kleiner dan de diffractielimiet
Zijn directe waarnemingen van afstanden kleiner dan de diffractielimiet mogelijk?
Diffractielimiet
Abbe: diffractielimiet 250 - 300 nm
1-molecule detectie Dichtheid gelabelde moleculen voldoende klein!
20 nm
Beweging in membraan
Eiwitten in lipidendubbellaag
SMT = single molecule tracking
Marguet EMBO 2006
SMT = single molecule tracking
Schmidt PNAS 1996
SMT = single molecule tracking
SMT = single molecule tracking
Van microscopie naar nanoscopie: structuren met sub-micro resolutie? Hot topic! http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/s uperresolution/stochasticblinking/index.html http://www.microscopyu.com/tutorials/fla sh/superresolution/storm/index.html
Glycinereceptor HA-GlyR α3K
HA-GlyR α3L
2,5 µm
2,5 µm
Labelvrije metingen mogelijk? 1.Dikkere preparaten moeilijk aan te kleuren. 2.Beïnvloeding door fluorofoor? (stamcellen). 3.In situ? 4.Hogere penetratiediepte. 5.Optische coupes voor 3D reconstructie. 6.Gebruik in vivo (patiënten) 7.Hot topic!
SHG straling (tweede harmonische) Rayleigh scattering
Hyper-Rayleigh scattering
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
SHG straling: 2 moleculen Constructieve interferentie
Destructieve interferentie
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
SHG stralingspatroon
Niet-coherente verstrooiing Vermogen ~ N
Coherente verstrooiing Vermogen ~ N2
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
Ultrasnelle lasers – fs-gepulste lasers – Laser scanning – Beeldvorming in weefsel (“diepe” indringing) – Optische coupes
Sarcomeer
Sarcomeer
In vivo measurement of sarcomeres Z-disc mitochondria
Myosin
TPEF
SHG 10 mm
10 mm
10 mm Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
In vivo bepaling van sarcomeren 1000 um 500 um 350 um 1 cm
25 mm
Micro-endoscoop
1 cm
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
In vivo measurement of sarcomeres lateral gastrocnemius (mouse)
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
Gestreepte spier (rat)
Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)
Gestreepte spier (rat)
Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)
Labelvrije micro-endoscopie 1. Vroegtijdige detectie van veranderingen in de extracellulaire matrix bij kwaadaardig gezwel: veranderingen in collageen veranderingen in SHG. 2. Veranderingen in metabolisme veranderingen in autofluorescentie.
Beeldvorming met SHG Striated muscle
Starch
Rat Tail Tendon
Neurons
Flax
(Sanen & Paesen)
Cellulose
Cell-matrix interacties (tissue engineering) Staal van Dennis Lambrechts, Prometheus, KUL hPDC & Col I hydrogel (label vrij)
10 mm
Erkenning Universiteit Hasselt Prof. Dr. M. Ameloot Dr. N. Smisdom Drs. K. Notelaers Drs. Ir. B. De Clercq
Drs. Ir. R. Paesen Dra. K. Saenen Dra. M. Bacalum Prof. Dr. JM. Rigo Dr. Daniel Janssen
Katholieke Universiteit Leuven Prof. Dr. J. Hofkens Dra. Susana Rocha Prof. Dr. M. Roeffaers Prof. Dr. H. Van Oosterwyck Drs. D. Lambrechts
Prof. Dr. D. Devos Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin Prof. Dr. J.C. Meier
