Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro Břetislav Křižan, Eva Ondrušiková, Martina Kudělková, Jana Krajíčková, Lenka Wasserbauerová, Kateřina Smékalová, Karel Dušek
CERTIFIKOVANÁ METODIKA Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2010
Autorský kolektiv: Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. Ing. Eva Ondrušiková, CSc. Ing. Martina Kudělková Ing. Lenka Wasserbauerová Mgr. Jana Krajíčková Ing. Kateřina Smékalová, Ph.D. Ing. Karel Dušek, CSc. © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2010 ISBN:
2
Název: Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro Autoři: Vypracoval kolektiv autorů pod vedením Ing. Břetislava Křižana, Ph.D. Ing. Břetislav Křižan, Ph.D., Ing. Eva Ondrušíková, CSc., Ing. Martina Kudělková - Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta Ing. Lenka Wasserbauerová, Mgr. Jana Krajíčková - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Ing. Kateřina Smékalová, Ph.D., Ing. Karel Dušek, CSc. -Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Oddělení zelenin a speciálních plodin Olomouc Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Tisk: MediaDIDA s.r.o., Olomouc Vyšlo v roce: 2010 Vydáno bez jazykové úpravy. Kontakt na vedoucího autorského kolektivu:
[email protected] Oponenti: Ing. Jaroslav Rod, CSc., Česká společnost rostlinolékařská Ing. Ivan Branžovský, CSc., MZe Praha Autoři fotografií: Břetislav Křižan, Martina Kudělková Fotografie na úvodní straně: Multiplikace rostliny česneku kultivované z meristémů, autorka Martina Kudělková Dedikace: Metodika vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství a je výstupem řešení projektu NAZV QH 71228 s názvem „Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace“. Doba řešení 1.5.2007 – 31.12.2011 © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2010 ISBN:
3
4
Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro
Břetislav Křižan, Eva Ondrušiková, Martina Kudělková, Jana Krajíčková, Lenka Wasserbauerová, Kateřina Smékalová, Karel Dušek
CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2010
5
Obsah
6
Úvod
7
1
CÍL METODIKY
10
2
METODICKÝ POSTUP KULTIVACE A MULTIPLIKACE ČESNEKU V PODMÍNKÁCH IN VITRO
10
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
Vybavení a chemikálie potřebné k in vitro množení Příprava zásobních roztoků Příprava kultivačního média Založení kultur a kultivační podmínky Převod rostlin do nesterilních podmínek
10 11 12 15 16
2.6
Závěr
17
3
SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ
18
4
POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY
19
5
EKONOMICKÉ ASPEKTY
19
6
SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY
20
7
SEZNAM PUBLIKACÍ, KTRÉ PŘEDCHÁZELY METODICE
22
PŘÍLOHY
24
8
6
Seznam zkratek BA (BAP) - 6-benzylaminopurin BDS - kultivační médium (Dunstan a Short, 1978) EDTA - kyselina etylendiamintetraoctová GA3 - kyselina giberelová IAA - kyselina indolyl-3-octová IBA - kyselina indolyl-3-máselná JA - kyselina jasmonová KIN - kinetin MENDELU - Mendelova univerzita v Brně MS - kultivační médium (Murashige a Skoog, 1962) MZe - Ministerstvo zemědělstvi NAA - kyselina 1naftyloctová NAZV - Národní agentura pro zemědělský výzkum TDZ - thidiazuron
Úvod Česnek kuchyňský (Allium sativum) patří k nejstarším kulturním plodinám, které provázejí lidstvo již od dávných dob. Je ceněn jako zelenina, koření, ale také jako léčivá rostlina pro své antibiotické účinky. V podmínkách České republiky se rostliny česneku množí pouze vegetativně. Při tomto způsobu množení však snadno dochází k přenosu virových chorob, a proto bývají rostliny česneku ozdravovány od virů v laboratorních podmínkách. Výsledkem ozdravování je rostlinka pěstovaná v in vitro podmínkách, kterou je následně potřeba namnožit. Předkládaná metodika se nezabývá procesem ozdravování, ale klade si za cíl zvýšení multiplikačního koeficientu ozdravených rostlin česneku. Množení rostlin v in vitro podmínkách (mikropropagace) znamená velké možnosti pro celou řadu druhů rostlin. Množení není závislé na počasí, rostliny jsou uniformní a touto metodou lze bez rizik množit i ozdravený materiál, protože při dodržení správného postupu nemůže během množení dojít k opětovnému nakažení patogeny. Dosud byla popsána in vitro kultivace u zhruba 500 druhů rostlin. Některé rostlinné druhy, mezi něž patří i česnek, se však při tomto způsobu pěstování a množení chovají značně specificky a jejich mikropropagace je obtížná. Tyto problémy jsou zpravidla způsobeny slabými reakcemi rostlin na dodané regulátory růstu. Rostliny domácích genotypů česneku byly ozdraveny v rámci projektu NAZV QH 71228 s názvem „Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace“. Jak název projektu napovídá, pro
7
uchování tohoto cenného, pracně ozdraveného materiálu, byla vybrána a je experimentálně ověřována metoda kryokonzervace. Protože výsledkem ozdravení bývá zpravidla jen několik zdravých rostlin (z důvodu pracnosti odběru meristémů, úhynu rostlin a finanční nákladnosti testů), je potřeba tento materiál nejprve namnožit (např. pro kryokonzervaci je potřeba minimálně 160 rostlin od genotypu). Je samozřejmě možné převézt do půdy rostliny ihned po jejich ozdravení a dále je pak množit konvenčním způsobem v technické izolaci, ale z důvodu ztrát během převodu a možnostem reinfekce není tento postup používán. Třetím rokem utvoří rostliny dělené cibule. Další možnou cestou namnožení ozdraveného materiálu je mikropropagace. Ačkoliv velmi záleží na množeném genotypu, lze obecně říci, že při použití zde publikovaného metodického postupu lze dosáhnout rychlejšího namnožení rostlin za období jednoho roku. Metoda mikropropagace rostlin česneku už byla popsána pro některé (zvláště asijské) genotypy v pracích např.: (Abo El-Nil, 1977; Bhojwani, 1980; Nagasawa, Finer, 1988, Moriconi et at., 1990; Nagakubo et al., 1993; Seabrook, 1994; Mohamed-Yassen et al., 1995; Haque et al., 1997; Ayabe, Sumi, 1998; Myers, Simon, 1998, 1999.) Vždy však záleží na použitém genotypu. Informace o množení českých genotypů česneku udržovaných v Genové bance v Olomouci obsahuje tato metodika. Metodika se na základě provedeného výzkumu jednotlivých postupů množení detailně zabývá složením živných médií a jejich přípravou, úpravou hormonální složky médií, kultivačními podmínkami a konečně převodem namnožených rostlin do nesterilních podmínek. Princip známých metod množení česneku v laboratorních podmínkách: Mechanické zásahy Mechanickými zásahy označujeme pro účel množení většinou půlení a čtvrcení rostlin kultivovaných v podmínkách in vitro. Úspěšnost této metody závisí na použitém genotypu. Prakticky je kultivovaná rostlina zakrácena na 2 cm a jsou odstraněny kořeny. Ze spodní strany podpučí jsou rostliny nařezávány cca 2 mm hlubokým řezem na dvě poloviny, popř. na čtvrtiny. Všechny části rostliny drží v celku, nejedná se o odříznutí žádné části, a rostlina je dále kultivována ve zkumavce s médiem. Reakce genotypů je velmi rozílná. Výsledkem bývají jak 4 výchozí rostliny (u čtvrcení) tak velmi často úhyn materiálu. Praktický význam má tato metoda pouze u velmi problematicky množitelných genotypů. Multiplikace v průměru dosahuje poměru 1:1,5.
8
„Stem-disc dome culture“ - metoda stonkových disků Podle Ayabe a Sumiho (1998) je možno množit česnek ze struktury „Stem - disc dome“ což je prakticky 2 mm tenký plátek obsahující meristém a svrchní část podpučí. Z jednoho „Stem-Disc“ segmentu vyrůstalo na médiu LS (Linsmaier, Skoog, 1965) dvacet až třicet nových výhonků. Stonkové disky se jeví jako explantáty s vysokým multiplikačním potenciálem. Více jak 90 % výhonků takto vzniklých, formovalo cibulky. Metoda byla vyvinuta na japonském genotypu Fukuchi-Howaito. Kultivace kořenů Haque et al., (2000) použili jako primární explantát při multiplikaci kořeny. Povrchově desinfikované stroužky byly nejprve kultivovány 15 dní ve zkumavkách na směsi destilované vody a 0,7 % agaru. Poté byly odebrány kořenové špčky velkosti 2 mm a dále kultivovány na MS médiu s růstovými regulátory 2,2 mg.l-1 BA a 0,2 mg.l-1 NAA. Procento explantátů, které vytvořily výhonky, bylo v závislosti na odrůdě v rozmezí 7,9 - 95, 2 %. Formování cibulek bylo zjevné u všech odrůd, ale značně se lišily velikostí. Kultivovány byly odrůdy „Bangladesh local“ a „White roppen“. Odrůda ´White roppen´, u které se multiplikace dařila nejvíce, byla následně převedena do podmínek ex vitro. Somatická embryogeneze Jedná se o metodu, při které vzniká jedinec nepřímo (je spojena s předchozí tvorbou kalusu), z diploidní somatické buňky - vznik embrya z jiných buněk než zygot (Procházka et al., 2003). Explantátem (izolovaná část z celistvého organismu) pro kultivaci in vitro mohou vegetativní a generativní orgány, protoplasty, buňky a pletiva (Procházka et al., 2003; Šebánek, Sladký, 1988). Obecně platí, že mladá pletiva, u kterých probíhá aktivní dělení, jsou pro embryogenezi vhodnější (Novák, 1990). U česneku bývají používány kořenové a listové explantáty (Havránek, 2005). Fereol et al., (2002) použil jako explantáty mladé vnitřní listy v bazální části rosliny z desinfikovaných stroužků. Byly vybrány česneky vzniklé izolací meristému. Byly uloženy po dobu 4-5 měsíců od sklizně při 15 °C, a převedeny na 3 týdny do 5 °C, aby překonaly dormanci. Listové explantáty vytvářely kalusové kultury a ty poté sloužily pro somatickou embryogenezi. Somatická embryogeneze ja také popsána v pracích Fereol et al., (2005 a, b) a Mukhopadhyay et al., (2004).
9
Fereol et al., (2002) použili jako explantáty pro somatickou embryogenezi kořeny i mladé listy. Produkce kalusu byla pozorována na kořenech i na mladých listech, ale u listů se projevil vyšší potenciál pro embryogenezi. Až 75 % vzniklých kalusů diferencovalo somatická embrya. 30 % z těchto embryí bylo převedeno do nesterilních podmínek. Rostliny tvořily výhony i kořeny. Somatická embryogeneze, jako velmi účinná metoda množení, která je některými autory doporučována, není vhodná pro množení ozdravených genotypů k uchování v genových bankách, neboť je zde vysoké riziko somaklonální variability.
1 Cíl metodiky Cílem předkládané „Metodiky kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro“ je zveřejnit metodický postup, podle kterého je možno genotypy česneku namnožit v laboratorních podmínkách. Zpřehlednit dostupné informace týkající se množení česneku a označit postupy, které jsou při multiplikaci českých genotypů účinné. K in vitro množení bývají použity zpravidla ozdravené genotypy česneku, které je potřeba rychle rozmnožit k dalším činnostem, ať jde již o uchovávání, či další množení.
2 Metodický postup kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro 2.1 Vybavení a chemikálie potřebné k in vitro množení Přístrojové zabezpečení Chemická laboratoř a přípravna roztoků Laboratoř vybavená pro práci s in vitro kulturami Chladnička (+ 4 °C) Mraznička (-20 °C) Autokláv pH-metr Laboratorní váhy Termostat Destilační (popř. demineralizační) přístroj Studený skleník Technický izolát
10
Materiál Laboratorní sklo Pěstební kontejnery Pěstební rašelinové substráty Hnojiva (makro a mikroprvky) Skalpely, pinzety, očkovací jehly Chemikálie Chemikálie pro in vitro množení: NH4NO3, KNO3, MgSO4 · 7H2O, KH2PO4, CaCl2 · 2H2O, FeSO4 · 7H2O, Na2EDTA · 2H2O, MnSO4 · H2O, ZnSO4 · 7H2O, Na2MoO4 · 2H2O, CuSO4 · 5 H2O, H3BO3, KI, CoCl2 · 6H2O, AlCl3 · 6H2O, sacharóza, agar (B & V commercial agar S 1000, Itálie), BAP, GA3, NAA, thiamin, kyselina nikotinová, glycin, myo-inositol, HgCl2, etanol, NaOH, KOH. Přípravky ochrany rostlin a pomocné látky: Ridomil Gold Plus 42,5 WP (metalaxyl M + oxichlorid mědi) Rovral Flo (iprodione) Karben Flo Stefes (carbendazim) Silwet 77 (heptamethyltrisiloxan) Savo (5 % chlornan sodný) 2.2 Příprava zásobních roztoků Zásobní roztoky Zásobní roztoky usnadňují celkový postup přípravy médií. Rozdělením na jednotlivé roztoky je zabráněno vzájemnému vysrážení některých solí, což značně komplikuje příjem živin rostlinou. Každou chemikálii rozpustíme zvlášť a teprve po úplném rozpuštění jednotlivých chemikálií v destilované vodě smícháme vzniklé dílčí roztoky dle níže uvedeného pořadí a doplníme destilovanou vodou na požadovaný objem. K přípravě kultivačního média MS použijeme následující zásobní roztoky: Makroelementy Roztok připravíme 20krát koncentrovaný (tj. na 20 l média). K přípravě použijeme 1000 ml odměrnou baňku. Navážíme: 33,00 g NH4NO3; 38,00 g KNO3; 7,40 g MgSO4 · 7H2O a 3,40 g KH2PO4. Roztoku dávkujeme 50 ml do 1 l připravovaného média.
11
Roztok chloridu vápenatého Roztok připravíme 50krát koncentrovaný (tj. na 50 l média). K přípravě použijeme 500 ml odměrnou baňku. Navážíme: 22,00 g CaCl2 · 2H2O. Roztoku dávkujeme 10 ml do 1 l připravovaného média.
Mikroelementy Roztok připravíme 50krát koncentrovaný (tj. na 50 l média). K přípravě použijeme 250 ml odměrnou baňku. Navážíme: 845,00 mg MnSO4 · H2O; 430,00 mg ZnSO4 · 7H2O; 310,00 mg H3BO3; 41,50 mg KI; 12,50 mg Na2MoO4 · 2H2O; 1,25 mg CuSO4 · 5H2O; 1,25 mg CoCl2 · 6H2O a 1,25 mg AlCl2 · 6H2O. Roztoku dávkujeme 5 ml do 1 l připravovaného média. Vitamíny Roztok připravíme 25krát koncentrovaný (tj. na 25 l média). K přípravě použijeme 250 ml odměrnou baňku. Navážíme: 10,00 mg thiaminu, 50,00 mg pyridoxinu; 50,00 mg kyseliny nikotinové a 200,00 mg glycinu. Roztoku dávkujeme 10 ml do 1 l připravovaného média. Roztoky růstových regulátorů Roztoky připravíme do 50 ml odměrných baněk. Koncentrace roztoku BAP je 1 mg.ml-1. V případě kyselin NAA a GA3 připravíme roztoky roztoky o koncentraci 0,1 mg . ml-1. BAP a NAA rozpustíme napřed v malém množství 5 % NaOH a doplníme destilovanou vodou na požadovaný objem. GA3 je nutno napřed rozpustit v malém množství etanolu a pak doplnit destilovanou vodou na požadovaný objem. Všechny zásobní roztoky skladujeme v temnu v ledničce při teplotě 4 °C. Roztoky makroelementů, mikroelementů a roztok chloridu vápenatého lze takto skladovat až 1 rok, roztok vitamínů a roztoky regulátorů růstu maximálně 2 měsíce. Potom je nutno připravit roztoky čerstvé.
2.3 Příprava kultivačního média Prvním krokem při přípravě média je dokonalé rozvaření agaru (v jedné čtvrtině celkového objemu média). Do rozvařeného agaru postupně přidáváme zásobní roztoky v pořadí: makroelementy, roztok dihydrátu chloridu vápenatého, mikroelementy, vitamíny, fytohormony. Vždy pečlivě zamícháme. Dále přidáme navážený FeSO4 · 7H2O, Na2EDTA · 2H2O, myo-inositol a sacharózu. Tyto složky médií včetně všech regulátorů růstu přidáváme před sterilizací autoklávováním. Pouze v případě médií pro chemoterapii přidáváme ribavirin do již sterilního 12
média filtrací. pH upravíme 5 % vodným roztokem NaOH na hodnoty stanovené v tabulce 1. Médium sterilizujeme párou v autoklávu 25 minut při teplotě 120 oC a přetlaku 100 kPa. Tabulka 1.: Složení kultivačních médií C1, C2 a C3 (Modifikované MS) -1
Složka (mg · l ) NH4NO3 KNO3 MgSO4 · 7H2O KH2PO4 CaCl2 · 2H2O FeSO4 · 7H2O Na2EDTA · 2H2O MnSO4 · H2O ZnSO4 · 7H2O Na2MoO4 · 2H2O CuSO4 · 5 H2O H3BO3 KI CoCl2 · 6H2O Sacharósa Agar BA GA3 NAA Thiamin Pyridoxin Kys. nikotinová Glycin Myo-inositol pH
Založení kultur C1 1 650 1 900 370 170 440 27 37 16,9 8,6 0,25 0,025 6,2 0,83 0,025 20 000 7 000 0,5 0,5 0,1 0,1 0,5 0,5 2 100 5,8
13
Multiplikace kultur C2 1 650 1 900 370 170 440 27 37 16,9 8,6 0,25 0,025 6,2 0,83 0,025 20 000 7 000 0,5 0,5 0 0,1 0,5 0,5 2 100 5,8
Zmnožování cibulek C3 1 650 1 900 370 170 440 27 37 16,9 8,6 0,25 0,025 6,2 0,83 0,025 110 000 7 000 1 0 0,1 2 0,5 1 2 100 6,00
Tabulka 2.: Složení kultivačních médií C4 a C5 (Modifikované MS) -1
Složka (mg · l ) NH4NO3 KNO3 MgSO4 · 7H2O KH2PO4 CaCl2 · 2H2O FeSO4 · 7H2O Na2EDTA · 2H2O MnSO4 · H2O ZnSO4 · 7H2O Na2MoO4 · 2H2O CuSO4 · 5 H2O H3BO3 KI CoCl2 · 6H2O Sacharósa Agar TDZ GA3 NAA Thiamin Pyridoxin Kys. nikotinová Glycin Myo-inositol pH
Multiplikace kultur C4 1 650 1 900 370 170 440 27 37 16,9 8,6 0,25 0,025 6,2 0,83 0,025 20 000 7 000 0,5 0 0 2 0,5 1 2 100 6,00
14
Tvorba cibulek C5 1 650 1 900 370 170 440 27 37 16,9 8,6 0,25 0,025 6,2 0,83 0,025 120 000 7 000 0 0 0 2 0,5 1 2 100 5,8
2.4 Založení kultur a kultivační podmínky Pokud materiál pro množení prošel procesem ozdravování, a je udržován v laboratoři již sterilní, bude použit pro množení v in vitro podmínkách bez další desinfekce. Jedná-li se o zakládání ozdravených kultur česneku ze stroužků či pacibulek, odstraníme zaschlé listy, a stroužky povrchově desinfikujeme pomocí 0,2 % chloridu rtuťnatého (vysoce toxická látka, označení T+). Doba desinfekce je 17 minut. Potom stroužky umístíme do sterilní destilované vody na 10 minut a toto opláchnutí 3x opakujeme, vždy po deseti minutách. Ať už pochází primární explantát ze stroužku, pacibulky či je to rostlinka kultivovaná z meristému je středem zájmu pro další množení meristém s podpučím. Rostliny pěstujeme v mikrobiologických zkumavkách s hliníkovými uzávěry. Zkumavky s rostlinami jednotlivě označíme popisky na sklo zkumavky. Větší stroužky při použití zkumavek seřízneme z bočních stran a z vrchní strany, podpučí necháme vcelku. Segmenty uložíme na médium C1 s přídavkem hormonů 0,1 mg.l-1 NAA, 0,5 mg.l-1 BA a 0,5 mg.l-1 GA3 (složení média viz tabulka 1). Za 4 týdny rostlinky přeneseme na multiplikační médium. Při pasážování (přenos rostlin na čerstvá média) zakracujeme rostliny na 3 cm. U rostlin, které multiplikují, nerozdělujeme trsy skalpelem, ale kultivujeme rostliny tak dlouho, dokud nedojde k samovolnému oddělení jednotlivých rostlin. V případě rozkrojení trsu skalpelem hrozí uhynutí namnoženého materiálu. V kultivační místnosti udržujeme teplotu 23 oC a fotoperiodu 16 hod. světlo/8 hod. tma. K osvětlení používáme zářivkové trubice Philips TL-D 80 Super 58W / 865. V průběhu kultivace se u některých rostlin začne projevovat vodnatění. Je to děj, při kterém ve zkumavce dochází k hyperhydrataci (převodnění pletiv). Vodnatění může být způsobeno vysokou vzdušnou vlhkostí, mají na něj vliv osmotické látky (tedy sacharóza) v médiu, koncentrace agaru a cytokininy. U rostlin se projevuje špatným vývojem pletiv, sklovitým a celkově nezdravým vzhledem světle zelené, někdy až hnědé barvy. Průduchy vodnatěním napadených rostlin ztrácejí svoji funkci (Novák, 1990; Wu et al., 2009). U rostlin, které jsou jen lehce postiženy, odstraníme zvodnatělé vnější části, rostliny zakrátíme a dále kultivujeme. Tyto rostliny je potřeba častěji přenášet na čerstvé médium. Většina těchto rostlin poté projevuje normální vývoj. Silně vodnaté jedince zlikvidujeme. Jak stroužky, tak i izolované meristémy, mohou být v kultuře napadány infekcemi. Bakteriální infekce řešíme přenesením rostlin na médium s přípravkem Proclin 400 (Supelco). Pokud se bakterie vyskytují i nadále, použijeme médium s antibiotikem dvakrát po sobě. Když rostliny spontánně multiplikují na médiu C1, jako další postup použijeme kultivaci na médiu C2 (viz tabulka 1). Postup sledu 15
multiplikačních médií C1 a následně C2 pro genotypy vnímavé k BA, nezatěžuje rostliny vysokými dávkami regulátorů růstu. Multiplikace je dána použitím 0,5 mg.l-1 BA (médium C1) a následnou absencí NAA (médium C2). V případě, že rostlinky českých genotypů na médiu C1 nemultiplikují ani po dvou pasážích (rostlinky 2x přeneseny na čerstvé médium), tyto přeneseme na další médium C4 (médium založené na účinku cytokininu TDZ, s absencí jiných regulátorů růstu) viz tabulka 1. Na tomto médiu však kromě množení dochází i k většímu výskytu vodnatění rostlin, proto stav kultur musíme kontrolovat častěji a rostliny častěji pasážovat. Pokud nelze rostliny donutit k množení pomocí TDZ, použijeme další médium C3 (MS s 110 g.l-1 sacharózy, 0,1 mg.l-1 NAA s přídavkem 1 mg. l-1 BA) k multiplikaci formou zmnožování cibulek. V tomto případě spolupůsobí na množení vysoká koncentrace sacharózy společně s BA.
2. 5 Převod rostlin do nesterilních podmínek Rostlinky určené k převodu do nesterilních podmínek kultivujeme 3 měsíce na médiu C5 (MS bez regulátorů růstu s 120 g.l-1 sacharózy). Toto médium bylo převzato z komerční laboratoře Vivai piante Battistini s.s. z Itálie a je zajímavé právě vysokým obsahem sacharózy. Rostlinky na tomto médiu vytvoří cibulku a následně zatáhnou. Cibulky vyjímáme z kultivačních nádob a uchováváme v ledničce do doby výsadby, nebo vysazujeme bezprostředně. Termín výsadby naplánujeme na jarní období, rostliny pak využijí celé vegetační období k růstu. Při výsadbě cibulky namáčíme do vody za účelem odstranění zbytků agaru a uchránění před zavadnutím. Cibulky vysazujeme do multiplat s velikostí jamek 3,5 x 4,0 cm (TEKU JP 3040/54). Použijeme již hotový substrát Steckmedium (Klasmann) který je už namíchán dohromady s agroperlitem. Plná multiplata umístíme na množárnu s vysokou vzdušnou vlhkostí a se spodním vytápěním na 25 oC. Vysazené cibulky na množárně kryjeme fólií, aby byla udržena vysoká vzdušná vlhkost a aby byly napodobeny předchozí podmínky v kultivační nádobě. Teplota vzduchu na množárně nesmí překročit 38 oC. Při převodu dochází k minimálnímu úhynu rostlin (cca 8 %). Tato fáze je charakterizována snižováním vzdušné vlhkosti. Sedmý den po převodu sejmeme fólii z rostlin na množárně 3 krát denně na cca 5 minut aby byla umožněna výměna vzduchu. Intervaly větrání každý den prodlužujeme v závislosti na počasí. Cibulky začnou velice rychle prorůstat. Ve slunečných, horkých dnech interval větrání zkrátíme, protože rostliny rychleji vadnou (vadnutí se projevuje kroucením vrcholku nejvyššího listu). Po čtyřech týdnech rostliny na množárně ponecháme zcela bez nadkrytí. 16
Substrátové topení používáme pouze pro první týden převodu. Rostliny v multiplatech po měsíci převezeme z množárny do skleníku. Zde rostliny dále pěstujeme až do výšky cca 12-15 cm a potom je umístíme do venkovních prostor do síťovníku, kde je nahrnkujeme do kontejnerů P 9, do kterých použijeme substrát KTS 2 zásobený živinami na půl roku. K biologickému hubení smutnic (Sciara sp.), použijeme parazitické hlístice Steinernema feltiae Filipjev. Třetí týden od převodu zakořeněné rostliny v multiplatech přihnojíme formou hnojivé závlahy na list hnojivem Kristalon Start v dávce 1 g · l-1. Pak pravidelně přihnojujeme stejnou dávkou 1x týdně. Ošetření fungicidy provádíme třetí den po převodu, a to přípravky: Ridomil Gold Plus 42,5 WP (oxichlorid mědi, metalaxyl-M) v koncentraci 0,1 % a Carben Flo Stefes (carbendazim) v koncentraci 0,1 %. Pokud je potřeba další ošetření, kombinujeme přípravek Ridomil Gold Plus 42,5 WP s přípravkem Rovral FLO (iprodione) v koncentraci 0,05 %. Všechny přípravky aplikujeme spolu se smáčedlem Silwet 77. 2. 6 Závěr Řada postupů, které byly experimentálně aplikovány české genotypy česneku v průběhu let 2007-2010 byla hodnocena z hlediska multiplikace rostlin. Shrneme-li získané poznatky, docházíme ke stejnému závěru jako Senula et al., (2000), kteří zkoušeli pro množení česneku celou řadu regulátorů růstu (IAA, NAA, KIN, BA, 2-iP). Při množení 87 genotypů zjistili, že vliv složení média je zanedbatelný při srovnání s vlivem genotypu na multiplikaci. Rovněž Bertaccini et al., (2004) došli při množení 97 genotypů ke stejným závěrům. U námi zkoušených českých genotypů z genové banky se potvrdila obecně známá větší závislost úspěchu množení na genotypu, než na složení médií. Při vyzkoušení regulátorů růstu (IAA, NAA, BA, TDZ, JA, GA3) se reakce jednotlivých genotypů značně liší. Z toho důvodu je publikovaná metoda tvořena postupnou obměnou regulátorů růstu v médiích, což je dáno postupným pořadím jednotlivých kultivačních médií, aby bylo zajištěno namnožení rozdílně reagujících genotypů. I zde je však vliv genotypu větší než např. vliv použitého regulátoru růstu. Na rozdíl od autorů, kteří uvádějí NAA jako složku multiplikačního média (Fereol et al., 2002, Bertaccini et al., 2004, Kim et al., 2003) se neosvědčila přítomnost tohoto hormonu pro množení. NAA pozitivně ovlivňuje adaptaci česneku v in vitro kultuře na začátku kultivace. Později je však jeho vliv na množení bezvýznamný. Rovněž se potvrdila vhodnost média MS, jak ostatně uvádějí Bertaccini et al., (2004) a Kim et al., (2003) na rozdíl od média BDS doporučovaného autory Fereol et al., (2002) a Luciini et al., (2001). Všechna doporučovaná média v této metodice jsou založena na receptuře MS. 17
3 Srovnání novosti postupů Z důvodu odlišného chování jednotlivých genotypů česneku v podmínkách in vitro, nebyla dosud snaha o univerzální postup vhodný pro všechny genotypy úspěšná. Ozdravování rostlin česneku v rámci projektu NAZV QH 71228 s názvem „Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace“ s dobou řešení od 1.5.2007 do 31.12.2011, jehož náplní je ozdravení 50-ti genotypů česneku pro potřeby uchování metodou kryoprezervace, umožnilo ověřit již existující postupy množení a na základě výsledků vyvinout postupy nové. Vývoj poznatků v oblasti in vitro kultur česneku, o němž svědčí publikované vědecké práce v posledních letech a množsví ozdravovaných genotypů udržovaných v in vitro podmínkách v rámci řešení projektu, umožnilo experimentálně ověřit postupy množení. Metodika, která vznikala za spolupráce odborníků 3 pracovišť (Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. a Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.) přináší originální informace o množení českých genotypů česneku metodou in vitro, které nebyly dosud na rostliny českých genotypů aplikovány. Množení pomocí moderních biotechnologických metod v laboratorních podmínkách použitím in vitro kultur rostoucích na umělých živných médiích, představuje velkou perspektivu pro množení. Ve sterilním prostředí kultivačních nádob je minimalizováno riziko infekce houbovými nebo bakteriálními chorobami a je vyloučeno napadení živočišnými škůdci. Ve fázi množení je téměř vyloučeno riziko reinfekce již ozdraveného materiálu. In vitro kultury je možno pěstovat a množit v průběhu celého roku. Experimentálně bylo ověřováno použití různých médií, za účelem dosažení vyššího koeficientu multiplikace, zvláště pak použití regulátorů růstu a jejich kombinací. Bylo ověřováno použití médií o různém složení. Bylo použito univerzální médium MS (Murashige, Skoog 1962), dále médium používané pro kultivaci kořenových špiček česneku publikované v práci Haque et al., (2003), médiun s přídavkem kyseliny jasmonové, publikované pro ozdravování česneku v práci Ucman et al., (1998) a médium WPM (Lloyd, McCown, 1981).
18
4 Popis uplatnění certifikované metodiky Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro, je určena zejména pracovištím genových bank, kde probíhá udržování genových zdrojů česneku, MZe, ÚKZÚZ, dále pro potřeby SRS, pěstitelům česneku a dalším zájemcům. Metodika bude využívána k rychlému namnožení ozdraveného materiálu zejména českých genotypů česneku, a to jak pro jejich uchování metodou kryokonzervace, pro další bezpečné uchovávání, tak pro rychlé namnožení množitelského materiálu, či materiálu ve fázi šlechtění. Postupy popsané v metodice mohou být rovněž při dalším výzkumu experimentálně aplikovány na další genotypy česneku, popř. ostatní cibuloviny.
5 Ekonomické aspekty Jednoznačným přínosem zveřejněného postupu množení je vyšší multiplikace, tedy efektivnější množení v rámci časového úseku. Znamená to, že za stejnou dobu množení jako v polních podmínkách, je možno v laboratoři dosáhnout většího počtu jedinců. Bohužel, provedené experimenty týkající se českých genotypů česneku poukazují na vysoký vliv genotypu na množení. Postupy v metodice tedy nemohou být vztaženy na všechny české genotypy, avšak je zde publikován postup, který byl po provedení pokusů s vybranými genotypy nejefektivnější. V průběhu experimentů bylo namnoženo 1207 rostlin. Ve sterilním prostředí kultivačních nádob je minimalizováno riziko infekce houbovými nebo bakteriálními chorobami a je vyloučeno napadení živočišnými škůdci. Ve fázi množení je téměř vyloučeno riziko reinfekce již ozdraveného materiálu. In vitro kultury je možno pěstovat a množit v průběhu celého roku. V podmínkách technické izolace při pěstování na poli je riziko reinfekce až mnohonásobně vyšší. V průběhu množení in vitro tedy prakticky nemůže docházet k znehodnocení pracně ozdraveného cenného materiálu. Pro účely dlouhodobého uchovávání metodou kryokonzervace je bezesporu nutné použít množení rostlin v podmínkách in vitro, aby vyprodukovaný rostlinný materiál nebyl v průběhu množení znovu napaden, jak k tomu docházelo u ozdravených rostlin v minulosti. Ekonomický přínos je spatřován v důležitosti množení ozdraveného materiálu bez rizika reinfekce. Pokud by nebyl ozdravený materiál takto množen, budou nemalé náklady na ozdravování pohybující se od 21 000 Kč do 36 000 Kč za jeden genotyp investovány zcela zbytečně.
19
6 Seznam použité související literatury AYABE, M., SUMI, S.: Establishment of a novel tissue culture method, stem-disc culture, and its practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Reports (1998) 17: 773–779 s. AYABE, M., SUMI, S.: A novel efficient tissue culture method - “stem disc dome culture“ - for producing virus - free garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep (2001) 20:503 - 507 s. BERTACCINI, A., BOTTI, S., TABANELLI, D., DRADI, G., FOGHER, C., PREVIATI, A., DA RE, F. : Micropropagation and Establishment of Mite - Borne Virus - Free Garlic (Allium sativum), Acta horticulturae 631: 201-206 s., ISHS 2004. BRUNA, A.: Effect of thermotherapy and meristem-tip culture on production of virus-free garlic in Chille, Acta Horticulturae. 1997, 433: 631-634 s. FEREOL, L., CHOVELON, V., CAUSSE, S., KALUMVUEZIKO , M. L., KAHANE, R. : Embryogenic Cell Suspension Cultures of Garlic (Allium sativum L.) as Method for Mass Propagation and Potential Material for Genetic Improvement, Acta Horticulturae, 2005, 688: 65-74 s. FEREOL, L., CHOVELON, V., CAUSSE, S., MICHAUX-FERRIERE, N., KAHANE, R.: Evidence of a somatic embryogenesis process for plant regeneration in garlic (Allium sativum L.), 2002, Plant Cell Rep 21: 197– 203 s. FEREOL, L., CHOVELON, V., CAUSSE, S., TRIAIRE, D. : Establishment of embryogenic cell suspension cultures of garlic (Allium sativum L.), plant regeneration and biochemical analyses, Plant Cell Rep (2005) 24: 319-325 s. HAQUE, M. S., WADA, T., HATTORI, K.: Garlic root for micropropagation through in vitro bulbet formation, 2000, Acta Horticulturae 520: 45-52 s. HAQUE M, S., WADA, T., HATTORI, K. : Shoot regeneration and bulbet formativ from shoot and root meristem of garlic cv. Bangladesh local, 2003, Asian journal of plant science 2 (1) 23-27
20
HAVRÁNEK, P.: Redakčně upravená závěrečné správa grantového projektu Ministerstva zemědělství ČR QE 1108. 2005. Systém produkce certifikované sadby česneku. HAVRÁNEK, P.: Viruprosté klony česneku kuchyňského získané z meristematických kultur. Sborník ÚVTI – Ochrana rostlin. 1972. vol. 8, p. 291 – 298. HAVRÁNEK, P.: Vliv virového onemocnění na výnosy česneku kuchyňského. Sborník ÚVTI – Ochrana rostlin. 1975. vol. 10, p. 251 – 256. KIM, E. K., HAHN, E. J., MURTHY, H, N., PAEK, K. Y. High frequency of shoot multiplication and bulbet formativ of garlic in liquid cultures. KUDĚLKOVÁ, M.: Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro. Diplomová práce. Lednice: MENDELU v Brně, 2010. p. 92. LINSMAIER, E. F., SKOOG, F.: Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. 1965. Physiol Plant 18:1, p. 127. LLOYD, G., MCCOWN, B., Commercially-feasible micro-propagation of Mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. International Plant Propagation. 1981, vol. 30, p. 421 – 427. LUCIANI, G. F., MARINANGELI, P. A., CURVETTO, N. R. Increasing nitrate/amonium ratio for improvement of garlic micropropagation. 2001, Scientia Horticulture 87, 11-20 MUKHOPADHYAY, M. J., SENGUPTA, P., MUKHOPADHYAY, S., SEN, S. : In vitro stable regeneration of onion and garlic from suspension culture and chromosomal instability in solid callus culture, 2004, Scienta Horticulturae 104: 1-9 s. MURASHIGE, T. and SKOOG, F.: A revised medium for rapid growth and boi-assays with tobaco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, vol. 15, p. 473 – 497. NOVÁK, F. J.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin, Academia Praha, 1990, ISBN 80-200-0344-4. SENULA, A., KELLER, E. R. J., LESEMAN, D. E. : Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment 21
of an in vitro collection of garlic (Allium sativum), 2000, Acta Horticulturae 530: 121-128 s. UCMAN, R., ŽEL, J., RAVNIKAR, M.: Thermotherapy in virus elimination from garlic: influences on shoot multiplication from meristems and bulb formation in vitro. Scientia Horticulturae. 1998. vol. 73, p.193– 202 WU, M., CHEN, L. J., LONG, Y. J.: Analysis of ultrastructure and reactive oxygen species of hyperhydric garlic (Allium sativum L.) shoots. In vitro Cell. Dev. Bol. Plant, 2009, vol. 45, p. 483-490.
7 Seznam publikací, které předcházely metodice KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Virové choroby u kolekce genetických zdrojů česneku v České republice. In: Hauptvogel, P. (ed.) Hodnotenie genetických zdrojov rastlín pre výživu a pol´nohospodárstvo. Zborník abstraktov z 5. vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou, 6. – 7. května 2008, Piešťany, Slovenská republika. str. 14, ISBN 978-80-88872-74-0 KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Occurrence of virus diseases in collection of genetic resources of garlic in the Czech Republic. In: Meglič, V.; Bastar, M.T. (eds.): Book of abstracts of 19th Eucarpia Conference, Genetic Resources Section, Ljubljana, Slovenia, May 26 th – 29th, 2009. p. 40, ISBN 978-961-6505-40-6. KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Virus diseases in collection of genetic resources of garlic in the Czech Republic. Agriculture (Poĺnohospodárstvo). 2009. 55(1): 58-60. KUDĚLKOVÁ, M.: Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro. Diplomová práce. Lednice: MENDELU v Brně, 2010. p. 92. NAUŠOVÁ, O., KUČEROVÁ, Z., ONDRUŠIKOVÁ, E., KŘIŽAN, B., WASSERBAUEROVÁ, L., SOUKUPOVÁ, J., KARLOVÁ, K., STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Zhodnocení účinnosti metody izolace meristému při ozdravování 20 odrůd česneku. In ŘEHOUT, V. Biotechnology 2008. 1. vyd. České Budějovice: Scientific Pedagogical Publishing, 2008, s. 193--195. ISBN 80-85645-58-0.
22
ONDRUŠIKOVÁ, E., SASKOVÁ, H., ČECHOVÁ, J., KŘIŽAN, B.: The effect of genotype on sanitation of garlic plants (Allium sativum L.) In New developments in green gene technology. 1. vyd. Szeged, Hungary: Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, 2009. SMÉKALOVÁ, K., STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journal of Plant Pathology, 2010, 96 (1): 273-274.
23
8 Přílohy: Obr. 1. Rostliny česneku kultivované v mikrobiologických zkumavkách, pohled do kultivační místnosti.
Obr. 2: Pracovní prostředí laminárního boxu pro sterilní práci s rostlinným materiálem
24
Obr. 3: Kultivace česneků pocházejících z meristémů
Obr. 4: Multiplikace rostlin na médiu C1
25
Obr. 5: Multiplikace rostlin na médiu C2
Obr. 6: Rostliny česneku po aplikaci čtvrcení
26
Obr. 7: Cibulky vytvořené v podmínkách in vitro
Obr. 8: Rostliny česneku postižené hyperhydratací pletiv (tyto rostliny jsou nevhodné pro další multiplikaci)
Obr. 9: Segment rostliny po aplikaci čtvrcení (na bazální části patrný řez)
27
Obr. 10: Zmnožující se kultivovaná rostlina, v tomto případě je nutno počkat až dojde k samovolnému oddělení rostlin
28
