Praktikum č. 3: Kultivace baktérií, bakteriologické půdy, podmínky inkubace, vznik a morfologie bakteriálních kolonií, růstové fáze, množení bakterií v tekutých médiích. Selektivní pomnožení a izolace. Cíle: 1. 2. 3. 4.
Seznámit se s přípravou a druhy bakteriologických půd. Naučit se základním kultivačním technikám. Seznámit se s různými nároky bakterií na podmínky inkubace. Naučit se hodnotit morfologii kolonií a rozlišovat růstové fáze bakterií.
Kultivace bakterií je umělé množení bakterií, které provádíme na bezbuněčných kultivačních (živných) půdách. Účelem kultivace je získání čisté kultury mikroba z vyšetřovaného vzorku. Čistá kultura je východiskem pro biochemickou, sérologickou, nebo i další identifikaci vypěstovaného izolátu.
Fyzikálně-chemické podmínky kultivace
1. Přítomnost vody - je nutnou podmínkou pro vstřebávání živin, splňují ji půdy tekuté, ale musí ji splňovat i půdy pevné. 2. Optimální pH - u většiny půd se pH upravuje na pH 7,2 - 7,4 louhem či kyselinou. 3. Isotonie kultivačního prostředí - zajišťuje se přidáním NaCl do většiny půd (0,5%). 4. Optimální plynná atmosféra - pro aeroby a fakultativní anaeroby je to kultivace za přístupu kyslíku a pro anaeroby bezkyslíkaté prostředí (anaerobní kultivace). Anaerobní kultivace. Podmínkou pro anaerobní kultivaci mikrobů je nízký oxidoredukční potenciál kultivačního prostředí, neboť u anaerobů neprobíhají při nevhodném redox-potenciálu fosforylační reakce, které jsou nezbytné pro získání energie. U striktních anaerobů je limitující potenciál -200 mV, u méně náročných anaerobů se pohybuje v rozmezí 0 až +150 mV, kdežto půdy pro aerobní kultivaci mají hodnotu redox-potenciálu asi +300 mV. Redukčního prostředí (záporné hodnoty redox - potenciálu) dosahujeme v tekutých a polotuhých půdách použitím čerstvě připravené a rychle ochlazené půdy, nebo jejím povařením po dobu 20 min a rychlým ochlazením až těsně před použitím - přídavkem redukujících substancí (nejčastěji kyseliny thioglykolové nebo její sodné soli, cysteinu, glukózy, redukovaného železa), přídavkem rozemleté živočišné tkáně (svalovina, játra, mozek) a převrstvením povrchu tekuté půdy parafinovým olejem. Dále i přidáním malého množství agaru (0,1-0,3%), který podstatně omezuje difúzi vzdušného kyslíku do půdy. U pevných (agarových) půd používáme média čerstvě připravená nebo regenerovaná těsně před použitím a inkubujeme v anaerobní nádobě (anaerostatu).
5. Optimální teplota - při hodnocení závislosti růstu na teplotě se udávají tři důležité teploty, minimální, maximální a optimální. Minimum je nejnižší teplota, při které se zastavuje růst příslušného mikrobního druhu, podobně maximum je nejvyšší teplota, při níž se růst zastaví, ale po ochlazení na nižší teplotu pokračuje růst dále. Optimum je pak tepelný bod, při kterém je rychlost růstu
15
maximální. Medicínsky významné bakterie a většina možných kontaminant patří do skupiny mezofilů, jejichž optimální teplota je v rozmezí 30-40o C. Proto vžitou inkubační teplotou je 37 nebo 35oC. Při této teplotě ponecháváme naočkované půdy v inkubátoru (biologickém termostatu) s automatickou regulací teploty 24-48 hodin až několik týdnů, podle růstové intenzity mikrobního druhu.
6.
Nároky bakterií na živiny Většina bakterií patří mezi mikroorganismy chemoheterotrofní - jsou závislé na zdrojích
chemické energie a využívají organické sloučeniny jako hlavní zdroj uhlíku. Požadavky na živiny splňují kultivační půdy, což jsou prostředí tekutá či tuhá, obsahující různé soli, kovové ionty, cukry, aminokyseliny, vitamíny a jiné růstové faktory. Kultivační půda má svým složením zajistit získání růstově optimální a vzhledově charakteristické kultury studovaného kmene.
MIKROBIOLOGICKÉ ŽIVNÉ PŮDY, JEJICH ROZDĚLENÍ A PŘÍPRAVA
Rozdělení půd: a) podle původu přirozené (mléko, brambor, krevní sérum aj.) umělé (uměle připravované, ale chemicky nepřesně definované - jde o většinu půd užívaných v bakteriologické diagnostice) syntetické (půdy s přesně známým chemickým složením, umožňující např. studium metabolismu) b) podle konzistence tekuté (pomnožovací) - které dobře pomnožují, ale nehodí se k získávání čisté kultury pevné (agarové) - tekuté půdy zahuštěné agarem (1,5-2%) nebo želatinou, případně koagulací bílkovin teplem (krevního séra, vaječné hmoty apod.). Jsou vhodné k izolaci čistých kultur (izolační půdy). polotuhé (semisolidní) s přídavkem 0,1 až 0,5 % agaru c) podle obsahu živin základní - slouží ke kultivaci řady běžných bakterií a jsou východiskem pro přípravu ostatních půd. Z tekutých půd sem patří peptonová voda a masopeptonový bujón (MPB), z pevných půd masopeptonový agar (MPA). obohacené - základní půdy s příměsí růstových faktorů ve formě různých extraktů, hydrolyzátů, krve, séra apod. (např. masopeptonový krevní agar, sérový bujón).
16
d) podle účelu použití univerzální - hodící se k záchytu a izolaci většiny medicínsky významných bakterií selektivní (výběrové, elektivní) - základní půda (živný základ) do níž přidáme inhibiční složku, která ve směsi bakterií potlačí bakterie nežádoucí a umožní dobrý růst hledané skupiny nebo druhu bakterií. Sem můžeme zařadit tekuté půdy k pomnožení některých patogenů z klinického materiálu (např. pomnožovací půdy pro salmonely a další). diagnostické - k základní půdě se přidává diagnostická přísada, jež se metabolismem mikroba charakteristicky mění (chemicky a barevně), nebo rozkladné produkty odhalí vhodný indikátor, přidaný již přímo do půdy, nebo přidaný po určité době inkubace k narostlé kultuře. Jde zejména o větší počet půd, používaných v tzv."pestré řadě" při určování biochemické aktivity izolovaného kmene. výběrově-diagnostické - jsou kombinací dvou předchozích. Jde většinou o pevná média s živným základem, výběrově inhibiční složkou a diagnostickou přísadou, doplněná vhodným indikátorem. Sem patří řada půd používaných k izolaci některých patogenů. transportní média – slouží k ochraně vzorku, nejčastěji ve formě vatového tamponu, po dobu od odběru do zpracování v laboratoři
Příprava mikrobiologických živných půd
Některé chemicky nedefinované suroviny k přípravě půd: Masová infuze - připravuje se z rozemletého masa (hovězí, koňské) extrahovaného přes noc dvojnásobným množstvím destilované vody. Potom směs povaříme a zfiltrujeme. Místo takto připravené suroviny, lze použít komerčně vyráběné koncentráty (např. Beef extract). Pepton - enzymatický (používá se trypsin, pepsin, papain, pankreatická šťáva) nebo kyselý hydrolyzát různých druhů bílkovin. Enzymatickou cestou získaný pepton je zdrojem peptidů, aminokyselin a růstových faktorů, kdežto kyselé hydrolyzáty vitamíny a další růstové faktory neobsahují. Kvasnicový extrakt - užíváme jako zdroje živin, hlavně vitamínů skupiny B a dalších růstových faktorů. Agar - je to sušená hydrofilní substance získaná z mořské řasy (Agar agar). Přidává se v 1,5 až 5 % koncentraci do půd k jejich zpevnění. Ve vodném prostředí připravovaného média znovu váže vodu (bobtná), získaná rosolovitá hmota se při 100o C rozváří a tuhne mezi 2560oC.
17
Příklady složení základních kultivačních médií Peptonová voda: 1 - 5 % roztok peptonu v destilované vodě s 0,5 % NaCl. Používá se hlavně k přípravě diagnostických uhlohydrátů. Masopeptonové bujony (MPB): je masová infuze s 1% peptonu a 0,5% NaCl, pH je upraveno na 7,2 - 7,4. MPB se sterilizuje při 120o C po dobu 30 minut. Existují také dehydratované speciality, které se komerčně vyrábějí. MPB je pomnožovací médium, které splňuje růstové a energetické požadavky nenáročných mikrobiálních druhů. Lze ho obohatit např. přidáním séra (sérový bujón), ascitu (ascitový bujón), jater (játrový bujón). Surovinou pro přípravu bujónů určených pro kultivaci náročných druhů nebývá infuze získaná z kosterní svaloviny. Pro náročnější bakterie se používají i další bujóny jako např. BHI bujón, jehož základem je mozko-srdcová infuze (brain-heart infusion), dále TSB - tryptózo-sójový bujón. Dále pak MP bujóny mohou být výchozí surovinou pro přípravu pevných půd. Masopeptonový agar (MPA)- živný agar: je MPB s přídavkem agarové řasy (běžně 1,5 2%). Po nasypání řasy do MPB ji necháme nabobtnat a rozvaříme v proudící páře. Upravíme pH na 7,2 - 7,4 a sterilizujeme 30 minut při 120oC. Na misky naléváme teprve po vytemperování asi na 45-50oC. MPA můžeme použít jako izolační půdu pro velký počet mikrobiálních druhů, ale hlavně slouží jako surovina k přípravě obohacených, selektivních a výběrově-diagnostických půd. Různé druhy MP agarů se opět vyrábějí jako speciality v sušeném stavu. Živné agary se liší v typech použitých peptonů a infuzních složek (BHI agar, TS agar). Masopeptonový krevní agar (MPKA) připravíme tak, že rozpustíme ve vařící se vodní lázni MPA a po ochlazení na 45o C dodáme asepticky 5-10% defibrinované ovčí krve, zahřáté na stejnou teplotu. Hned nato obsah baňky promísíme kruhovým pohybem a naléváme na misky. Jestliže krevní agar zahřejeme alespoň na 85o C, získáme tzv. čokoládový agar, který je vhodný ke kultivaci hemofilů a příbuzných bakterií. Vedle ovčí krve se též používá v indikovaných případech k přípravě krevního agaru i krve z dalších druhů zvířat (hovězí, koňské, králičí aj.) a krve lidské. Často, zejména pro studium hemolytických interakcí, se krevní agary připravují pouze přidáním propraných erytrocytů vhodného druhu. Výběrově diagnostické půdy pro Enterobakterie, v nichž je živným základem MPA a diagnostickou přísadou laktóza: Endův agar (EA) - selektivní složkou a zároveň indikátorem štěpení laktózy je v této půdě Schifovo reagens (vyvážená směs bazického fuchsinu s kyselým siřičitanem sodným)
18
MacConkeyův agar (MCA) - inhibiční složkou je v médiu speciální směs žlučových solí. Okyselení, které vzniká rozkladem laktózy, indikuje neutrální červeň. Inhibiční rozsah má téměř shodný s Endovým agarem. Obě média umožňují růst gramnegativním nenáročným bakteriím z č. Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Aeromonadaceae a někrerým dalším rodům (Pseudomonas, Alcaligenes). Desoxycholát-citrátový agar (DC agar) - inhibiční složkou jsou v médiu tvoří žlučové soli, avšak ve vyšší koncentraci než v MCA. Navíc obsahuje citronan železitý, který indikuje tvorbu sirovodíku. Indikátorem okyselení je opět neutrální červeň. DCA je zvláště vhodný pro izolaci salmonel a yersinií. Podobné složení má i Salmonella-Shigella agar (SS agar). Agar s briliantovou zelení (BGA) - inhibiční složkou je briliantová zeleň, indikátorem pH fenolová červeň. Používá se hlavně pro selektivní izolaci salmonel. Přidá-li se do půdy jako diagnostická přísada vedle laktózy ještě sacharóza, zvýší se její diferenciační hodnota.
Selektivní pomnožovací půdy jsou tekutá média, obsahující inhibiční složku(y), která inhibuje v množení nežádoucí skupiny bakterií a přitom umožňuje růst hledané skupině mikrobů nebo přímo bakteriálnímu rodu či druhu. Nejznámější z nich jsou selektivní pomnožovací půdy: a) pro salmonely: Müller-Kauffmannův tetrathionátový bujón, selenitová půd, Rappaport Vassiliadisova půda b) pro beta-hemolytické streptokoky: SBM médium c) pro grampozitivní baktérie (obecně): bujón s colistinem a kyselinou nalidixinovou (CNB)
Půdy určené ke kultivaci určitých skupin mikroorganismů 1. Významnou skupinu představují anaeroby . Běžné tekuté pomnožovací půdy pro anaeroby jsou východiskem pro přípravu pevných půd jsou např.: VL – bujón 2. Půdy pro kultivaci mykobakterií - Loewenstein - Jensenova půda: směs 10 dílů rozmíchaných vajec a 6 dílů solného roztoku s glycerinem a malachitovou zelení se nechá v šikmé poloze při teplotě 80oC koagulovat ve zkumavce. Petragnaniho půda: obsahuje vedle vaječné hmoty, solí a malachitové zeleně ještě mléko, bramborovou moučku a glycerin. 3. Půdy pro kultivaci mikroskopických hub plísní a kvasinek) Sabouraudův agar (čti Saburódův): obsahuje 1% peptonu a 3% glukózy jako živné složky a 2-3% agaru; pH se
19
upravuje na 5,6. Czapek-Doxův agar: neobsahuje pepton, ale směs anorganických solí. Sladinkový agar: je vhodný zejména ke kultivaci kvasinek. 4. Značný počet diagnostických půd je používán v rámci tradičního určování biochemické aktivity studovaného kmene v tzv. pestré řadě a budou probrány v další části.
Transportní média Jedná se o polotuhá agarová média, která se rozplňují do zkumavek. Tato média neobsahují živné složky a svým složením jsou blízké pufrům, které jsou obohaceny o další složky např. aktivní uhlí (médium dle Amiese) thioglykolát sodný aj. Tato média udržují životaschopnost náročnějších bakterií (neiserie, pasteurely, hemofily, anaeroby) ve vzorku, zabraňují během transportu vzorků jejich přerůstání doprovodnou mikroflórou a udržují tak kvantitativní poměry mezi jednotlivými mikrobními druhy, což je důležité při posuzování a interpretaci výsledků (bakteriologických nálezů). Příprava kultivačních půd je dnes podstatně zjednodušena tím, že řada základních, speciálních půd i jednotlivých složek půd (agar, kvasnicový extrakt, peptony, masový extrakt) se dnes vyrábí a expeduje, jak již bylo zmíněno, ve formě sušených půd, t.j. ve formě prášku, který se v předepsaném množství rozpustí v destilované vodě a sterilizuje. Hlavními producenty těchto půd jsou fy DIFCO, BBL, OXOID, MERCK, BIO-RAD a další. V návaznosti na otázku komerční výroby půd je nutno poznamenat, že v současném vývoji mikrobiologické diagnostiky je zřejmý trend selektivní mikrobiologie, s jednoznačným důrazem na selektivní izolaci patogenních mikroorganismů přímo z klinického materiálu a potravin. Diferenciaci hledaných patogenů usnadňují i nově zaváděná chromogení média. Pro zjednodušení přípravy médií používaných k tomuto účelu jsou komerčně vyráběny tzv. suplementy s obsahem inhibitorů, nejčastěji antibiotik.
Úspěšná kultivace bakterií je rovněž závislá i na dodržování nezbytných technických podmínek: a) Sklo a jiné pomůcky: nejčastěji používaným sklem při bakteriální kultivaci jsou Petriho misky, Erlenmayerovy baňky a tlustostěnné zkumavky. Sklo s infekčním materiálem dekontaminujeme v autoklávu, varem nebo chemicky. Potom čistíme mechanicky s pomocí detergenčních prostředků. Po opláchnutí pod proudící vodou se pak provádí neutralizace slabým roztokem kyselin a následuje důkladné opláchnutí pod proudící vodou, případně ještě v destilované vodě. Čisté a suché sklo uzavíráme zátkami z vaty,
20
kovovými uzávěry nebo hliníkovou fólií (alobalem). Petriho misky skládáme. Sterilizujeme horkým vzduchem (1 - 2 h při 160o C). b) Sterilita je základní podmínkou úspěšné kultivace. Vedle používání sterilního skla, sterilizujeme všechny zhotovené půdy a to podle jejich povahy buď v autoklávu (20-30 min při přetlaku 0,1-0,15 MPa), nebo v proudící páře (v Kochově hrnci) buď jednorázově po dobu 30 min, nebo tzv. frakcionovanou sterilizací (3 dny po sobě 20 min). U půd, kde je sterilizace teplem vyloučena, lze použít sterilizaci filtrací přes membránové filtry. Dodržujeme sterilní postupy při očkování. Půdy otvíráme jen na nejkratší dobu nutnou k naočkování vyšetřovaného materiálu. Další otevření půd může vést ke kontaminaci vzdušnými mikroby. Pečlivě vypalujeme očkovací kličky před každým použitím. Vypalování má být po celé délce kličky, nejlépe skoro ve svislé poloze. K očkování však nesmí být použito příliš teplých kliček - jejich použití vede k usmrcení mikrobů v materiálu. Proto je nutno vyžíhanou kličku nechat vychladnout, nejlépe tak, že pracujeme s několika kličkami v určitém pořádku. Při očkování půd ve zkumavce je potřeba po vyjmutí zátky, nejlépe v šikmé poloze, opálit okraje zkumavky. Stejně tak je třeba po vyjmutí zátky, nebo odstranění jiného uzávěru, opalovat hrdla Erlenmayerových láhví před vyléváním kultivační půdy do misek nebo před očkováním. Zátku není možno pokládat na laboratorní stůl, ale držíme ji malíčkem levé nebo pravé ruky tak, aby se nekontaminovala. c) Očkování (inokulace) je přenesení kultury nebo infekčního vzorku do tekuté půdy nebo na pevnou půdu. Kultivační půdy, pokud je hned nepoužíváme, jsou obvykle uloženy v chladničce. Před použitím je potom třeba pevné půdy osušit v termostatu při 37-45o C po dobu 15-30 min. Při sušení se misky skládají do sušárny otevřené, kultivační půdou dolů, aby nebezpečí kontaminace bylo co nejmenší. Půdy však nesmíme přesušit!! Půdy, které jsou připravené k používání neponecháváme na přímém slunečním světle. Před očkováním nádobky s půdami popíšeme číslem pod nímž je materiál veden v protokolu vyšetřující laboratoře a datem očkování. Očkování do tekuté půdy - vypálenou a chladnou kličkou nabereme materiál, asepticky otevřeme zkumavku, opálíme její okraje a kličku s nabraným inokulem ponoříme do média a dotyky o stěnu zkumavky s následným zatřepáním rozptýlíme nanesené mikroby. Po sterilním uzavření naočkované zkumavky vysterilizujeme použitou kličku vypálením Očkování na pevné půdy - nám umožňuje postupným ředěním inokula získat izolované bakteriální kolonie. Jsou to viditelné útvary vzniklé množením jediné baktérie. Přenesením izolované kolonie na novou půdu pak vede k získání čisté bakteriální kultury. Očkovací postup, kterým získáme izolované kolonie označujeme jako izolační očkování. Ředění ino-
21
kula při izolačním očkování na pevnou půdu v Petriho misce dosahujeme tak, že na vypálenou a vychladlou kličku nabereme inokulum, které pak naneseme hustou vlnitou čarou na výseč představující asi 1/5 povrchu půdy. Potom další vypálenou a ochlazenou kličkou přenášíme materiál na sousední výseč půdy hustou vlnitou čarou, nebo hustě vedle sebe kladenými čarami. Toto opakujeme ještě 2 - 3x, vždy po novém vypálení kličky, až celou plochu misky vyplníme očkovací čarou, jejíž konec se nesmí dotknout začátku očkování. V konečných partiích dobře vedené očkovací čáry nanášíme na půdu jednotlivé bakteriální jedince vzdálené od sebe a jejich pomnožením vzniká izolovaná bakteriální kolonie. Vlastních postupů tohoto způsobu existuje několik (viz. obrázek č. 4). Je lhostejné, který z nich si každý pracovník vyvolí. Cílem je získat jednotlivé samostatně rostoucí kolonie organismů, které je možno považovat za čistou kulturu. Obvykle rostou až na třetím nebo až ve čtvrtém stupni očkování. Obrázek č. 4 : Postupy izolačního očkování
22
Očkování na šikmý agar provedeme tak, že nabereme inokulum vypálenou a chladnou kličkou, zavedeme ji bez dotyku půdy až na dno zkumavky - do kondenzní vody, která je v malém množství v úhlu mezi agarem a zkumavkou. Potom hranou kličky vedeme co nejhustší vlnitou čáru po celé agarové ploše směrem nahoru. Inokulace do vysokého agaru se provádí vpichem.
Obrázek č. 5: Očkování šikmého agaru
RŮST B AK TERIÍ N A ŽIVNÝCH PŮD ÁCH A JEHO HODNO CENÍ V tekutých půdách se růst bakterií projevuje nejčastěji tvorbou zákalu, případně tvorbou sedimentu nebo povrchové blanky. Během inkubace naočkovaných agarových médií se za vhodných podmínek z každé buňky vytváří kolonie. Kolonie tedy představuje bakteriální masu, která je potomstvem jedné buňky (klon). Za konstantních podmínek je vzhled kolonií charakteristický pro určitou skupinu nebo dokonce rod, případně druh bakterií. Proto hodnocení morfologie kolonií představuje důležitý diagnostický krok. Při posuzování bakteriálních kolonií si všímáme následujících znaků. Velikost – kolonie mohou být tečkovité nebo se jejich velikost vyjadřuje průměrem v mm Tvar – kolonie pravidelně okrouhlá, nepravidelná … Okraje – rovné, zvlněné, výběžkaté, kořenovité Profil - plochý, mírně vypouklý, vypouklý, výrazně vypouklý, pupkovitý, vyvýšené okraje… 5. Povrch – lesklý, hladký, matný, drsný, zvrásnělý .. 6. Transparence – průhledná, průsvitná, neprůsvitná 7. Barva – bezbarvé, šedobílé, barva daná tvorbou pigmentu (Micrococcus luteus – žlutá, M.roseus, Serratia rubidea – růžová) nebo změnou barevného indikátoru v živné půdě (laktózu štěpící a neštěpící enterobakterie na selektivně diagnostických půdách s laktózou). 1. 2. 3. 4.
23
8. Změny okolí – posuzujeme změnu barvy (produkce ve vodě rozpustných pigmentů, změna pH média – změna barvy indikátoru), na MPKA si všímáme stupně hemolýzy erytrocytů (částečná hemolýza - α, úplná −β, dvojitá - α´, zelenání - viridace) 9. Konzistence – mazlavá, máslovitá, drobivá, vosková, hlenovitá 10. Zápach – značně subjektivní znak (fekální, hnilobný, kyselý, nasládlý…) Obrázek č. 6: Morfologie bakteriálních kolonií
Je třeba si uvědomit, že kolonie téhož bakteriálního druhu, ba i téhož bakteriálního kmene mohou mít na pevných půdách různý charakter tzv. růstové či disociační fáze. Zpravidla rozeznáváme tři základní růstové fáze, označované jako fáze M, S, R. Kolonie v M-fázi (mucous - hlenovitý) jsou kolonie hlenovitého vzhledu a konzistence, polokulovitě vypouklé, ostře ohraničené, mají tendenci se slévat. V preparátu z těchto kolonií jsou bakterie opouzdřené, tyčinkovité bakterie jsou kratší, streptokoky v této fázi jsou častěji po dvou nebo, jen v krátkých řetízcích. Mikroby rostoucí v této fázi jsou zpravidla nejvirulentnější, především díky přítomnosti pouzdra. V tekuté půdě rostou tyto mikroby difúzním zákalem. Kolonie v S-fázi (smooth - rovný, hladký) jsou hladké, lesklé a plošší než kolonie v M-fázi. Mikroskopicky jde o delší tyčinky, u streptokoků o delší řetízky koků. Jednotlivé bakterie nemají pouzdra. Virulence kmenů v S-fázi je nižší než kmenů v M-fázi. V tekuté půdě rostou tyto mikroby nejčastěji rovněž difúzním zákalem. Kolonie v R-fázi (rough - drsný) jsou drsného povrchu, nepravidelných okrajů, bývají často radikálně rozbrázděné, s vyvýšeným středem. Tyto mikroby rostou v tekuté kultivační půdě nejčastěji ve formě zrnitého sedimentu. Mikroskopicky jde o dlouhé tyčinky až vlákna, koky
24
bývají mnohdy protažené, uspořádané do dlouhých řetízků. Virulence těchto mikrobů je snížena, až úplně chybí. Mikroby v R-fázi se liší od mikrobů téhož kmene v M-fázi nebo Sfázi i antigenně. Mají omezenou antigenní výbavu. Fáze, v níž roste určitý bakteriální kmen, není ovšem jeho stabilní vlastností. Řada vlivů může vést ke změně disociační fáze jedním či druhým směrem. Tak i pouhé pasážování kultury na pevných půdách vede mnohdy k postupné degradaci původní M-fáze ve fázi S nebo R, podobně jako pasážování na nevnímavých jedincích. Naopak pasážování na vnímavých jedincích, např. vhodných laboratorních zvířatech, vede ke zvýšení virulence mikrobní kultury.
Poznámky:
25
