25.2.2008
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého v Olomouci
Ivo FRÉBORT
Biotechnologie rostlin, kultivace rostlinných buněk I. část
Šlechtění kulturních plodin Zemědělské plodiny jsou výsledkem zásahů do genetické informace trvajících více než 10 000 let
1
25.2.2008
Transformace pomocí Agrobacterium tumefaciens - Půdní baktérie, vyvolává tvorbu nádorů u rostlin - Přenáší do genomu rostliny část plasmidu
Ti plasmid
Příprava transgenních rostlin
2
25.2.2008
Genové dělo Nastřelování DNA do buněk pomocí zlatého prachu
Využití genetických modifikací rostlin • Zvyšování výnosů (boj s plevelem, odolnost proti škůdcům)
• Obohacená krmiva pro dobytek (lysin) • Potraviny obsahující vitamíny • Jedlé vakcíny (rozvojové země, brambor, banán – hepatitida B, cholera)
• Fytoremediace y p půdy y ((odstraňování těžkých ý kovů)) • Molekulární farmaření (výroba léčiv – protilátky, terapeutika, bioplasty)
• Umlčování genů (oddálení dozrávání, rajče, květiny)
3
25.2.2008
Boj s hladem - vyšší výnosy - nové odrůdy • Klasické šlechtění – Pomalé – Dostává se na hranice možností
• Genetické modifikace – Rychlé – Zatím nejsou jasné jeho limity
• Hlad ohrožuje na životě 20-40 mil. lidí – Oslabení lidé náchylní k infekcím – Nejvíce ohrožení děti, matky, staří lidé
Možnosti boje s hladem t/ha 3
2
1
Nedostatek živin Plevele, choroby,škůdci Sucho Místní hnojiva N zá dná osiva Nezávadná i a sadba db HRANICE PŘEŽITÍ
HRANICE PROSPERITY
Odolné odrůdy
4
25.2.2008
Odolnost rostlin k herbicidům - Roundup
Gen pro rozklad glyfosátu
Sója odolná vůči herbicidům
Více než 50% ploch na světě oseto RR sójou
5
25.2.2008
Kukuřice - rozmach škůdců Vyvolávají druhotné napadení plísněmi - mykotoxiny
Zavíječ kukuřičný v ČR
1990 2002
6
25.2.2008
Bacillus thuringiensis - δ-endotoxin
- Specifický účinek na určitou čeleď hmyzu - Používá se jako ekologický insekticid od 1940 - Člověku neškodí ani dávka ze 2 hektarů
Bt- kukuřice - odolná vůči hmyzím škůdcům
- Široce rozšířena v USA (90%) - Je povolena k pěstování v EU
7
25.2.2008
Rizika vzniku rezistentních škůdců • Rezistence je dědičná • Založena recesivně • Musí se udržovat pole, kde škůdci nejsou vystaveni selekčnímu tlaku • Křížením vzniknou heterozygoti, kteří jsou na Bt citliví
Rezistence vzniká na všechny pesticidy, nejen na GMO!!!
Papája na Havaji Papaya ringspot virus (PRV) - Produkce na Havaji v období 1992-1996 klesla o 40% - 1996 - transgenní papája overexprimující plášťový protein pod 35S promotorem připravená biolistickou metodou - od roku 1998 nárůst produkce
8
25.2.2008
Boj s podvýživou – „zlatá rýže“
• A Avitaminóza it i ó A u konzumentů loupané rýže (JV Asie) • Ročně oslepne 200 tisíc dětí • Rýže obsahující β-karoten • Je zapotřebí obohatit stravu i o tuky
High laurate canola
1996 – Brassica nap napus s transformována transformo ána acyl-ACP-thiolesterasou pod specifickým promoterem s cílením do semen zvýšený obsah nenasycené kyseliny laurové na úkor olejové a linoleové myristová palmitová olejová l j á linolová linoleová laurová další
4% 3% 31% 11% 7% 38% 6%
0.02% % původně ů
využití: výroba mýdel a šampónů výroba čokolády výroba rostlinných sýrů light smetana
9
25.2.2008
Obohacení krmiv - změna obsahu zásobních proteinů (obiloviny a luštěniny) A) zvýšení syntézy nedostatkových AK bakteriální mutovaný gen pro DIHYDROPIKOLINÁT SYNTHASU a ASPARTÁT Á KINASU, které nemají zpětnou inhibici nadbytkem produktu (Lys) transgenní rostliny 100x vyšší obsah lysinu a methioninu ten se ale nezabudovává v tak velké míře do zásobních proteinů. B) transgenoze genu pro zásobní protein zein -28% methioninu 2S-albumin z paraořechů – 18% methioninu
GMO ve světě stále přibývá Hlavní producenti: USA (50%) Argentina B íli Brazílie Kanada Indie Čína
Hlavní plodiny: Kukuřice Sója (60% produkce) Bavlník
10
25.2.2008
Poměr tradičních a GM plodin 2007 160 140
148
Conventional Biotech
120 100
91
80 60 35
40
27
20 0 64%
Soybean
43%
24%
20%
Cotton
Maize
Canola
11
25.2.2008
Hlavní druhy GMO schválené pro komerční využívaní na území ČR/EU • Řepka olejka – tolerantní k herbicidu glufosinátu pro krmiva (Plant Genetic Systems) – tolerantní k herbicidu glufosinátu pro pěstování (AgrEvo) • Sója – tolerantní k herbicidu glyfosátu (Monsanto) • Čekanka – částečně tolerantní k herbicidu glufosinátu s pylovou sterilitou (BejoZaden) • Kukuřice v ČR 5.000 ha v roce 2007 – s rezistencí vůči hmyzu (Bt-endotoxin) a toleranci k glufosinátu (CibaGeigy a Novartis) – rezistentní vůči hmyzu (Bt-endotoxin) (Monsanto) – tolerantní vůči herbicidu glufosinátu (AgrEvo) – tolerantní k herbicidu glyfosátu (Monsanto) • Karafiáty – se změněnou barvou květu (Florigene) – karafiáty s prodlouženou trvanlivostí (Florigene)
Protesty vůči pěstování GMO rostlin
• USA a další země – velký rozvoj GMO, přijímáno jako nová pokroková technologie, technologie řešení nedostatku potravin • Evropa – konzervativní, velký vliv Greenpeace, místní nadprodukce potravin, dotované zemědělství • Greenpeace – snaha o zastavení pěstování GMO, blokují např. používání zlaté rýže • Samozákazy S ák prodeje d j GMO produktů d ktů obchodními b h d í i řetězci v Evropě – reklamní trik
12
25.2.2008
Vlivy na životní prostředí • Testy s GMO řepkou, řepou, kukuřicí • Velké snížení používání pesticidů • Nižší nebezpečí vzniku rezistentních plevelů • Vliv na biodiverzitu hmyzu, ptactva, hlodavců obdobný vlivu odrůd získaných klasickým šlechtěním
Můžeme jíst GMO? • GMO pro krmiva a potraviny - testovány a schvalovány (vývoj a velmi náročné testování ~10 let) • Obsah p pozměněné DNA v GMO rostlinách velmi nízký ý (celková DNA 0,005-0,02% sušiny) • Produkty genů – proteiny: degradovány v trávicím traktu • Přenos genů z krmiv a potravin na mikroorganismy – neprokázán, nepravděpodobný (daleko nebezpečnější je krmení a léčba antibiotiky)
• Nelze odlišit produkty zvířat krmených GMO a běžnými krmivy • GMO jako krmiva a potraviny - bezpečné • Produkty zvířat krmených GMO - bezpečné
13
25.2.2008
Výzkum GMO rostlin na Univerzitě Palackého - Snížení obsahu hormonů regulujících růst - Kratší stonek, bohatší kořenový systém - Studium možné aplikace na obiloviny
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého v Olomouci
Ivo FRÉBORT
Biotechnologie rostlin, kultivace rostlinných buněk II. část
14
25.2.2008
Transgenoze rostlin Vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace p s nimi TRANSGENOZE trvalá - změna genetické informace je přenášená na potomstvo (infekce Agrobakteriem)
TRANSGENOZE d dočasná č á - genetická informace je změněna pouze u vegetativní části rostliny a nepřenáší se na potomstvo (elektroporace, biolistické metody)
Agrobacterium tumefaciens •
• •
Patogenní bakterie přirozeně se vyskytující v kořenovém systému bobovitých rostlin Přítomnost baktérie se p projevuje j j tumory tzv. crown gall tissue Agrobacterium je schopné napadat jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin a za určitých podmínek i rostlin jednoděložných
15
25.2.2008
Ti plasmid (tumor inducing) Agrobacterium tumefaciens (200 kb) ipt,aux,nop syntéza cytokininů auxinů opinů
další geny pro biosyntézu cytokininů, permeasy, přenašeče přes membránu, enzymy metabolizující opiny a ostatní enzymy umožňující infekci
Infekce Agrobakteriem Rostlina při zranění produkuje fenolické látky (acetosyringon), ty se váží na specifické receptory na membráně Agrobacteria VirA a způsobují transkripci genu z vir regionu Ti plasmidu Agrobacteria
16
25.2.2008
Aktivace vir regulonu
• VirD2 protein se váže na 5‘ T-DNA (transferred) • Denaturace ss T-DNA z Ti plasmidu • VirE2 proteiny stabilizují ss T-DNA T DNA • VirD2 a VirE2 proteiny obsahují sekvenci potřebnou pro cílení do jádra rostlinné buňky • VirE2 se váže na proteiny VIP1 a VIP2 které zacílí T-DNA řetězec do chromatinu rostlinného chromozomu
Binární vektory pro genetickou modifikaci rostlin (odvozené od Ti plasmidu)
Ti plasmid je rozdělen na dva: pomocný plasmid (velký): nese větší část Ti plasmidu, všechny geny potřebné pro symbiózu s hostitelem a přenos T-DNA klonovací plasmid (malý): nese pouze T-DNA, do jejíž části se naklonuje požadovaná gen. informace, replikační počátky pro E. coli a Agrobacterium a potřebné selekční markery
17
25.2.2008
Klonovací plasmid pBin-Hyg-TX Resistence k hygromycinu B (selekce transgenních rostlin)
polylinker
T-DNA
replikační počátky ori
tetracyklinový supresor
resistence ke kanamycinu
• požadovaný gen se překlonuje do polylinkeru a konstrukt se namnoží v E. coli . Pro přenos je nutná jen 25 bp repetice z konce původní T-DNA. (kanamycinová selekce) • transformace do Agrobacteria nesoucí pomocný vektor (selekce Kan, Rimf, Gent) • transformace rostliny a selekce transgenního potomstva (hygromycin)
Pomocný plazmid má resistenci k rimfapicinu a gentamycinu
Začlenění T-DNA do chromosomu • Začlenění T-DNA do hostitelské-ho chromozomu je víceméně náhodné
Arabidopsis thaliana
• Nejčastěji se začlení jedna T-DNA do jedné buňky, muže však nastat i několikanásobné začlenění • Kolem centromer je začlenění méně pravděpodobné • Čím blíže telomerám tím větší pravděpodobnost
18
25.2.2008
Transgenoze Agrobakteriem • Standardní postupy pro řadu dvouděložných užitkových rostlin (rajče, hořčice, fazole). • Nevýhoda: zdlouhavá regenerace přes tkáňové kultury ý rostlin se dá p použít „g „germ-line“ transformace • Jen u některých (Arabidopsis) • Transformace T-DNA se dá využít i jako inserční mutageneze. T-DNA přeruší důležitý gen a tuto mutaci lze pak pomocí markerů na T-DNA snadno lokalizovat. Existují databanky semen takových mutantních rostlin Arabidopsis. • Od poloviny 90. let možná transformace i jednoděložných rostlin lilie, palmy, obilniny. Použití supervirulentních kmenů Agrobakteria, problém je j v regeneraci. g hlavní p
Transgenoze Arabidopsis namáčením květů (floral dipping, germ-line) A) rostliny Arabidopsis se vypěstují do fertilního stádia (3-5 v květináči) B) lodyhy s květy se namočí v kultuře Agrobacteria nesoucí binární systém vektorů s naklonovaným transgenem (5-10 min, přidává se smáčedlo). C) rostliny se nechají okapat a vrátí do skleníku, kde dozrají (vytvoří semena) D) transgení semena se vyselektují vyklíčením na živném médiu obsahující selekční marker (hygromycin)
19
25.2.2008
Transgenoze namáčením květů Agrobacterium se dostává do vyvíjejících se květů a T-DNA je včleněna do samičího gametofytu a přenesená přes vajíčko do další generace ne do samčích pohlavních generace, buněk, transgenní semena jsou proto vždy hetero-zygotní na vložený transgen).
vylepšení :
vakuová infiltrace přidávání smáčedla (Silwet L-77)
účinnost: až 6% transgenního potomstva
Tato metoda funguje i u vojtěšky a petúnie
Transgenoze pomocí listových disků: metoda používaná u většiny dvouděložných rostlin
20
25.2.2008
Regenerace transgenních tabákových rostlin z kalusů vzniklých na listových discích
Tabák
Arabidopsis
21
25.2.2008
Transgenoze topolu
Transgenoze jednoděložných rostlin např. ječmen (Tingay et al.,1997) • • • • • •
Izolace nevyvinutých embryí z obilniny Mechanické narušení – odstranění embryonální osy K k lti Kokultivace s Agrobacteriem A b t i Kultivace na kalusotvorném médiu Detekce reportérového genu v T0 i T1 generaci Efektivita do 4% (např. z 1282 embryí vyselektováno 54 transformovaných linií)
• Poprvé chřest (1988) • Problém: jednoděložné rostliny obsahují daleko méně fenolických látek Vylepšení: Ošetření acetosyringonem (aktivace vir regionu) Supervirulentní kmeny Agrobacteria: mají zmnožený gen pro virG, který je navíc pod konstitutivním promotorem
22
25.2.2008
Selekce homozygotní linie
T0 generace
T1 generace T-DNA inzerce na jednom lokusu ¼ 00 homozygotů † ½ M0+0M heterozygotůU ¼ MM homozygotů U
3:1 75% U T-DNA inzerce na dvou lokusech
Všichni Vši h i transformanti t f ti jsou j heterozygotní
9:3:3:1 93% U T-DNA inzerce na třech lokusech 1/64 oo 00 00 homozygotů † 27/64 homo-heterozygotůU 36/64 MM hetero-homozygotů U
27:9:9:3:9:3:3:1 98% U
selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum
100% U 75% U HOMOZYGOTNÍ LINE
Nutná Selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum
1/14 oo 00 homozygotů † 3/14 oo Mx homo-heterozygotů U 3/14 mx 00 homo-heterozygotů U 9/14 mx MX hetero-homozygotů U
T2 generace
Přímá transgenoze TRANSGENOZE PROTOPLASTŮ Odstranění buněčné stěny a inkubace protoplastů s roztokem DNA, DNA vniká do protoplastu endocytózou • polyetylenglycol ↑ • elektoporace p ↑ • makroinjekce ↑ Protoplasty se dají připravit ze všech rostlin lze z nich však jen velmi obtížně regenerovat celé rostliny
BIOLISTICKÉ METODY TRANSGENOZE Používají se zlaté nebo wolframové kuličky (2 μm) Smíchají se s roztokem plasmidové DNA s transgeny, odpaří se Nastřelují se do pletiva pod vakuem Transgen společně s reportérovým genem (GUS) Snadná detekce transformace
23
25.2.2008
10% DNA pronikne do pletiva
50% zůstane v epidermis (netvoří kalus)
95% cytoplasma (nedochází k transkripci) 5% jádro
99% umírá
1% přežívá a dochází k integraci do genomu
Genové dělo
Genové dělo Pokud se nepodaří z buněk zregenerovat kalus, transgenoze je pouze dočasná
24
25.2.2008
Reportérové transgeny Geny jejichž expresi lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat; slouží hlavně ke stanovování účinnosti různých rostlinných promoterů
MODRÉ ROSTLINY
REPORTÉROVÝ GEN pro β-glucuronidasu z E.coli po transformaci se rostlina namočí do barviva X-Gluc vzniká nerozpustné indigo, které jde detekovat v intaktní rostlině. Stabilní enzym bez kofaktoru.
FLUORESKUJÍCÍ ROSTLINY Malý gen pro GFP (green fluorescent protein) z medúzy Aequorea victoria Po ozáření modrým světlem (440-480nm) zeleně fluoreskuje bez jakéhokoliv substrátu a je velice stabilní. Fluorescenci si zachovává i po fúzi s jiným proteinem (chimérické geny)
Selekční markery 1. ANTIBIOTIKA (vážou se na ribosom, způsobují nesmyslný přepis mRNA) KANAMYCIN – gen nptII pro neomycinfosfotransferasu. Rostliny se buď stříkají, nebo se dává přímo do média. HYGROMYCIN B g gen aphIV p pro hygromycinfosfotransferasu p yg y –silně toxický ýip pro člověka – inhibitor proteosyntézy.
1
2. HERBICIDY nejpoužívanější GLYFOSÁT (fosfomethylglycin) inhibitor syntézy aromatických AK (je esenciální u autotrofních organismů) sp. 5-enolpyruvylšikimát-3fosfátsynthasa (EPSP) tři strategie: 1) overexprese EPSP 2) exprese mutantní ne tak citlivé formy EPSP 3) exprese glyfosátoxidoreduktasy (degradace glyfosátu) Transgenní potomstvo se stříká glyfosátem, přežívají pouze rostliny nesoucí současně s transgenem jeden ze tří způsobů rezistence.
25
25.2.2008
Selekční markery 3. ZDROJ SACHARIDŮ V ranných stádiích vývoje rostlin v in vitro podmínkách je plná závislost na zdroji uhlíku v médiu (sacharosa). Selekční marker: v médiu édi je j místo í t sacharosy h xylosa l a manosa. Hexokinasou H ki vzniká iká manosa6-fosfát, který není schopen podléhat následné glykolýze a je pro rostlinu toxický, kumuluje fosfor. Selekční transgen: fosfomanosaizomerasa přeměňuje manosa-6-fosfát na fruktosa-6-fosfát (použito u tabáku, cukrovky a kukuřice)
4. SELEKCE ROSTLINNÝMI HORMONY Transgen isopentenyltransferasa f produkuje nadbytek cytokininů ů (nemusí se přidávat do selekčního média) které podporují tvorbu prýtů z transformovaného pletiva. U tabáku a salátu bylo zjištěno že tento nadbytek nemá vliv na celkovou morfologii transgenní rostliny.
Odstranění selekčních markerů Někdy je třeba transgenní marker odstranit aby nenarušoval vývoj rostliny y ((ipt, p nptII); p ) často nutno odstranit pro komerční využití
Bakteriofágový systém Cre-lox: gen cre - rekombinasa (transposasa) lox - krátké cílové sekvence excise
26
25.2.2008
Odstranění selekčních markerů SYSTÉM MAT (multi-autotransformation): rekombinační systém z kvasinky Zygosaccharomyces rouxii R/RS: R- rekombinasa, RS – rekombinační sekvence Gen R je pod inducibilním promotorem (např. t t tetracyklin), kli ) mezii RS místa í t vložen l ž i t selekční ipt l kč í gen. Po transformaci (exprimuje se ipt gen vyrůstají tzv. teratomy (rychle rostoucí výhonky ale zakrslé - ESP fenotyp (enormous shooty phenotype) - (a); po indukci tetracyklinem, dojde k vyštěpení ipt a z teratomového pletiva začnou vyrůstat normální výhonky (b).
topol
tabák
Promotery Konstitutivní
35S - nejpoužívanější, virální původ, nebezpečí KOSUPRESE ubikvitin – rostlinný původ, exprese kolísá během ontogeneze aktin – rostlinný původ, vysoká ale kolísavá exprese
Tkáňově specifické 2A11 - z rajčete, plodově specifický Lhcb3 - listově specifický, světlem regulovaný z Arabidopsis PsMTA - z hrachu, kořenově specifický
Inducibilní
In2 2 – je indukovaný benzenIn2-2 benzen sulfonamidovým herbicidem Safener tet - indukce tetracyklinem, nejpoužívanější promoter APázy - indukovaný v kořeni, fosfátem CaMV35S:GUS PsMTA:GUS
27
25.2.2008
Terminační signál V klonovací kazetě je kromě promotorové sekvence i terminátor transkripce s polyadenylačním signálem Nejčastěji používaný terminátor z agrobakteriálního genu pro nopalin synthasu používá se jak u jedno tak dvouděložných rostlin Další používané terminátory: 3´nekódující sekvence rostlinného genu pro pšeničný histon H3
Může se použít i vlastní 3´nekódující sekvence transgenu, ale ta nemusí vždy fungovat, je jednodušší mít univerzální již v plasmidu
Další důležité složky transgenů INTRONY Inkorporace intronů do transgenu může zvyšovat sílu exprese transgenu v rostlině např. intron I z genu pro rýžový aktin nebo b iintron t I z genu pro kukuřičný k k řič ý ubikvitin bik iti 5´ NEKÓDUJÍCÍ REGION Kozákova sekvence a podobné sekvence zvyšují posttranskripční stabilitu mRNA a tím zvyšují míru exprese NUKLEOTIDOVÉ SLOŽENÍ Pokud vkládáme do rostliny gen z baktérie, hrozí nebezpečí použití žití odlišného dliš éh genetického ti kéh kódu, kód vyštěpení ště í neexistujícího i t jí íh intronu atd. Geny ze vzdálených taxonů se proto musí často upravovat (mutovat), aby bylo dosaženo dostatečné exprese v rostlinném hostiteli
28
25.2.2008
Organelové cílení transgenního proteinu
Transgen je začleněn do genomu v jádře, transkripce probíhá v jádře jádře, zralá mRNA je pak transportovaná do cytosolu kde probíhá proteosyntéza na ribosomech, buď volných nebo vázaných na ER Cílení do plastidu: genetická informace pro 23-AK signální peptid malé podjednotky Rubisco se naklonuje před vlastní N-konec transgenu Cíl í do Cílení d mikrotělísek: ik tělí k ke k kkoncii ttransgenu se připojí ři jí posledních 34 AK z isocitrátlyasy Zůstává na ER: motiv H/KDEL se zabuduje na C-konec proteinu transgenu
Přímá transformace chloroplastů: začlenění transgenu do chloroplastové DNA VÝHODY: • transgen se nepřenáší pylem • k začleňování transgenu dochází pouze na specifických místech • vysoká exprese, až několik procent celkových proteinů • výhodné pro expresi bakteriálních genů v rostlinách (stejný gen. kód) NEVÝHODY: • nutné velice silné genetické dělo hnané héliem • velice malá účinnost Specifické vektory: obsahují část genetické informace chloroplastu pro homologní rekombinaci Selekční marker antibiotikum spektinomycin
29
25.2.2008
Genové umlčování
read-through transcription
DNA-DNA pairing
methylation chromatin remodelling
RNA-DNA pairing RNA degradation
RNA-RNA pairing
methyltransferases chromatin remodelling factors
dsRNA
Oddělení molekulární biologie, Katedra biochemie Biologické centrum PřF UP – ul. Šlechtitelů 11
30
