85 BASISSTOF
UITBREIDINGSSTOF
1 Wat is biotechnologie?
86
2 Natuurlijke genoverdracht
87
2.1 Genoverdracht van bacterie naar plant 2.2 Genoverdracht tussen bacteriën 2.3 Genoverdracht via virussen 3 Kunstmatige genoverdracht 3.1 Kunstmatige genoverdracht door bacteriën 3.2 Plasmiden en de specifieke werking van restrictie-enzymen 4 Toepassingen 4.1 Toepassingen in de geneeskunde 4.2 Toepassingen in land- en tuinbouw 4.3 Toepassingen ten voordele van het milieu 5 Enkele waardevolle technieken
94 94 95
96 96 99 101
6.1 Onderzoekers versus publieke opinie 6.2 Enkele gegevens over GGO’S
110 110 110
VERRIJKINGSSTOF
7 Bioinformatica
113
8 Principe van DNA-sequencing
115
9 Stamcellen en stamceltherapie
117
9.1 Eigenschappen van stamcellen 9.2 Stamceltherapie versus celtherapie 9.3 Enkele concrete toepassingen van stamceltherapie SYNTHESE
117 117 118
119
102 102 104 105 107 107
THEMA
5.1 Klonen 5.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) 5.3 Restrictiefragment-lenght-polymorfisme (RFLP) en DNA-fingerprint 5.4 Toepassingen van PCR, RFLP en DNA-fingerprint 5.5 Technieken om transgene organismen te vormen
87 88 89
6 Biosociale problematiek
13 Biotechnologie In de biotechnologie worden nieuwe technieken ontwikkeld om het genetisch materiaal van organismen gericht te wijzigen en te gebruiken. Het gaat dikwijls over het verfijnen van technieken die we ook in de natuur aantreffen. De toepassingen van die biotechnologische ontdekkingen krijgen meer en meer een concrete weerslag op ons dagelijks leven.
86
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
1 ˘
Wat is biotechnologie?
OB
OPDRACHT 13.1
De term biotechnologie bestaat uit twee delen: bios, het Griekse woord voor ‘leven’, en technologie, wat wijst op menselijke tussenkomst. Biotechnologie wordt gedefinieerd als het gebruik van levende organismen of delen ervan om producten te maken of te wijzigen, planten of dieren aan te passen of micro-organismen voor specifieke doeleinden te ontwikkelen. De klassieke biotechnologie (afbeelding 13.1 A) omvat de traditionele selectie- of veredelingstechnieken voor het kweken van dieren en planten en het gebruik van bacteriën, gisten en schimmels voor het maken van brood, bier, wijn en kaas.
Uit de genoomwetenschap ontwikkelde zich een relatief recente wetenschapstak, transcriptomics (transcriptoomstudie). Niet zozeer de structuur van de genen is hier het onderwerp, maar wel de mate waarin die genen worden overgeschreven tot mRNA-moleculen. Een heel recente ontwikkeling in het post-genoomtijdperk is proteomics. Waar transcriptomics de transcripten onder bepaalde condities in kaart wil brengen, doet proteomics dat met de proteïnenverzameling. In dit thema gaan we dieper in op een onderdeel van de genoomstudie, de gentechnologie (afbeelding 13.1 B). Dat is het domein van de biotechnologie dat ingrijpt op het DNA. We bespreken ook enkele gevolgen op het proteïneniveau.
De moderne biotechnologie omvat drie grote domeinen: genomics, transcriptomics en proteomics (¬ V 7). De studie van de verzameling van genen van organismen wordt genomics (genoomstudie of genoomwetenschap) genoemd. Dankzij genomics beschikken onderzoekers nu over de DNA-sequenties van verscheidene eukaryoten (o.a. de mens), prokaryoten en celorganellen (o.a. mitochondriën, chloroplasten). Intussen is het besef gegroeid dat DNA-sequenties alleen niet genoeg informatie bieden om alle biologische processen te begrijpen. Afb. 13.1
A Traditionele veredeling B Biotechnologie
resultaat plant 1
X
plant 2
gewenste en ongewenste eigenschappen
A
resultaat plant 1
B
plant 2
alleen de gewenste eigenschap
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
2
Natuurlijke genoverdracht
Gentechnologie is gebaseerd op natuurlijke processen. Overdracht van genen treffen we in de natuur immers aan bij bacteriën en virussen. Die genoverdracht komt neer op een recombinatie van DNA. 2.1 Genoverdracht van bacterie naar plant 2.1.1 Genetisch materiaal bij bacteriën Het erfelijk materiaal van bacteriën bestaat uit een grote, dubbelstrengige ringvormige DNA-molecule, die als een kluwen opgerold is en soms als chromosoom wordt aangeduid. De bacterie bevat ook één of meerdere kleine ringvormige dubbelstrengige DNA-moleculen die plasmiden worden genoemd (afbeelding 13.2). Afb. 13.2
De colibacil en de agrobacterie
DNA-molecule
plasmide
reuzeplasmide
Afb. 13.3
Er zijn grote en kleine plasmiden. Bacteriën met kleine plasmiden, zoals de colibacil (Escherichia coli), repliceren vaak hun plasmiden, zodat een bacterie soms tientallen kopieën van een bepaald plasmide bevat. De bacterie kloont dat plasmide. Grote plasmiden komen maar in één of twee exemplaren per cel voor. De agrobacterie (Agrobacterium tumefaciens) bezit slechts één reuzeplasmide (afbeelding 13.2). 2.1.2 Levenscyclus van de agrobacterie
DNA-molecule
COLIBACIL
De proteïnen, zoals de verteringsenzymen die voor de vitale levensprocessen van de bacterie van belang zijn, worden door de ringvormige DNA-molecule gecodeerd. De plasmiden kunnen genen dragen, zoals de resistentiegenen (R-genen) die voor niet-essentiële eiwitten zorgen. Elk R-gen codeert dan voor een enzym dat een bepaald antibioticum of een ontsmettingsmiddel (bv. chloramfenicol) kan afbreken. Een antibioticum (letterlijk:’ tegen wat leeft’) is een stof die het metabolisme van bacteriën verstoort. Wanneer de bacterie het antibioticum kan afbreken, wordt haar metabolisme niet verstoord en is ze resistent tegen dat antibioticum.
AGROBACTERIE
De agrobacterie is een bodembacterie die tumoren kan doen ontstaan in planten (tumefaciens = tumorverwekkend). Als bijvoorbeeld een aardappelplant, een wilg, een tomatenplant of een kolensoort gekwetst is, kan de agrobacterie de wonde binnendringen (afbeelding 13.3). Ze kan dan een bepaald deel van haar plasmide, het zogenaamde T-gebied (T van ‘transferred’), overdragen aan de plantencel. Onder invloed van dat T-DNA gaat de geïnfecteerde cel ongeordend delen en vermeerderen. Zo ontstaat een plantentumor (afbeelding 13.4). We spreken van een tumorinducerend plasmide (Ti-plasmide).
Levenscyclus van Agrobacterium tumefaciens
T-DNA
T-DNA
wonde
Ti-plasmide
Agrobacterium tumefaciens
87
88
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
De plantencellen worden bovendien aangezet tot de productie van voedingsstoffen voor de agrobacteriën. De bacterie heeft dus de plantencel volledig gemanipuleerd. Dat biologische proces werd in 1974 ontdekt en wordt sinds 1983 door Prof. Van Montagu toegepast om planten genetisch te manipuleren. Afb. 13.4
Tumor op wilgenboom veroorzaakt door Agrobacterium
De lokalisatie van de resistentiegenen op de plasmiden en de waarneming dat tyfusbacteriën de resistentie van colibacillen kunnen overnemen, bewijst dat bacteriën in staat zijn om plasmiden of delen van plasmiden op elkaar over te dragen. Die genoverdracht verloopt volgens een mechanisme dat conjugatie wordt genoemd. Twee bacteriën wisselen DNA uit via een koppelbuisje of pilus (afbeelding 13.6). Door de hoge vermenigvuldigingssnelheid kunnen bacteriën op die wijze op heel korte tijd resistentiefactoren verspreiden. Afb. 13.6
Genoverdracht door conjugatie A Schematische voorstelling B EM-foto
1
RESISTENTE BACIL
3
2.2 Genoverdracht tussen bacteriën Door veel en onzorgvuldig gebruik van antibiotica kunnen bacteriënstammen reistentie ontwikkelen. Zo bleek voor bepaalde tyfuspatiënten een behandeling met antibiotica niet meer te helpen. Onderzoek wees uit dat de natuurlijke colibacillen van het darmstelsel multiresistent waren en de resistentiegenen (afbeelding 13.5) overgedragen hadden op de tyfusbacillen (Salmonella typhosa). Afb. 13.5 gen
R-gen voor tetracycline
B
R-gen voor sulfonamide R-gen voor streptomycine
4
BEIDE BACTERIËN ZIJN RESISTENT.
transfergen
R-gen voor neomycine
koppelbuisje
A
Plasmide met meerdere resistentiegenen en een transfer-
R-gen voor chloramfenicol
NIET-RESISTENTE BACIL
2
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
2.3 Genoverdracht via virussen
2.3.2 Genoverdracht van een virus naar een bacterie
2.3.1 Levenscyclus van een virus
Een virus die op een bacteriecel parasiteert, draagt de naam bacteriofaag (bacteriëneter), kortweg faag. Een lambdabacteriofaag heeft een veelvlakkige kop en een staartstuk met fibrillaire aanhangsels (afbeelding 13.8). De kop wordt gevormd door een DNA-molecule die omgeven is door een eiwitmantel. Het staartstuk is een proteïneschede die uitloopt op proteïnevezels. Het DNA codeert voor de proteïnen van de eiwitmantel en het staartstuk. De faag kan die proteïnen echter niet zelf aanmaken. Hij beschikt niet over de nodige enzymen voor transcriptie en translatie. Hij beschikt evenmin over de nodige enzymen voor DNA-replicatie. Hij is wél in staat om zijn DNA in te bouwen in het DNA van de bacterie en zo de bacterie aan te zetten tot het aanmaken van faag-DNA en faag-proteïnen.
Een virus (afbeelding 13.7) bestaat uit een nucleïnezuur (DNA of RNA) dat omgeven is door een eiwitmantel. Sommige virussen hebben rond die eiwitmantel een envelop die bestaat uit een dikke laag vetten en glycoproteïnen. Virussen vertonen zowel kenmerken van levende als van niet-levende wezens. Alle levende wezens bestaan uit één of meerdere cellen, virussen niet. Ze hebben geen cytoplasma of celorganellen en daardoor ook geen eigen metabolisme. Een virus dringt een gastheercel binnen en is er voor zijn metabolisme en voortplanting afhankelijk van. Een virus is obligaat parasiet. De levenscyclus van een virus verloopt altijd ten koste van die gastheercel. Als een virus zich buiten een cel bevindt, kristalliseert het. Afb. 13.7
A Schematische voorstelling van een DNA-virus B EM-foto van een RNA-virus: het griepvirus
Afb. 13.8
A Schematische voorstelling van een lambdabacteriofaag B EM-foto van lambdabacteriofagen die een colibacil aanvallen
glycoproteïne dubbele lipidenlaag
kop
DNA
envelop
schede proteïnehulsel eiwitmantel staartstuk lineair dubbelstrengDNA
fibrillaire aanhangsels
A A
B
B
89
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Het verloop van de levenscyclus van een bacteriofaag ziet er als volgt uit (afbeelding 13.9). • Infectie De faag hecht zich vast aan de bacterie. Een enzym zorgt ervoor dat de wand van de bacterie oplost. Het DNA dat zich in de kop van de faag bevindt, wordt geïnjecteerd. De bacterie is geïnfecteerd. • Lytische cyclus Gedurende de lytische cyclus wordt het eigen metabolisme van de bacterie lamgelegd. De bacterie wordt gedwongen om het viraal DNA in vele exemplaren te repliceren en tot expressie te brengen. Ze synthetiseert de faagproteïnen van kop en staart. Na de assemblage van DNA en proteïnen is een groot aantal nieuwe fagen ontstaan in de bacterie. De hele bacterie-inhoud wordt opgelost of gelyseerd. De bacteriewand barst open en de fagen komen vrij. Lytische en lysogene levenscyclus van de lambdabacteriofaag
lambdabacteriofaag Escherichia coli
LYSOGENE FASE ▲
LYTISCHE FASE ▲
▲
▲
profaag
▲ ▲
▲ ▲
▲ ▲ ▲ ▲
▲
▲ ▲
▲
▲ ▲
▲
▲ ▲
▲ ▲
▲
▲ ▲
▲
Afb. 13.9
• Lysogene cyclus Niet elke aanval van een faag op een bacterie verloopt op die manier. Soms wordt faag-DNA ingebouwd in het DNA van de bacterie. Dat ingebouwde, viraal DNA wordt profaag genoemd. Als de bacterie zich deelt, wordt het profaag-DNA samen met het bacterieel DNA ontdubbeld. Zo kan het overgaan op de volgende generatie bacteriën en wordt er genetisch materiaal overgedragen van een virus naar een bacterie. Bij één van die nakomelingen kan het viraal DNA zich weer afzonderen en kan de lytische cyclus opnieuw gestart worden.
▲
90
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Als het viraal DNA zich van het bacterieel DNA losmaakt, kan er een verschuiving plaatsgrijpen waarbij faag-DNA in het bacterieel genoom achterblijft en bacterieel DNA naar het viraal genoom overgaat (afbeelding 13.10). Dat komt neer op een mutatie, zowel van de faag als van de bacterie. Als de gemuteerde faag later weer profaag wordt, kan hij het DNA-fragment van de vorige bacterie inbouwen in een andere bacterie. Dat noemen we transductie: DNA-overdracht van een bacterie op een andere via een faag. Een faag kan dus gebruikt worden als overbrenger of vector van erfelijk materiaal van de ene bacterie naar de andere. Afb. 13.10
Afb. 13.11
DNA-virussen A Hepatitis B-virus B Herpesvirus C Papovavirus D Rhinovirus E Adenovirus glycoproteïne dubbele lipidenlaag
eiwitmantel lineair dubbelstrengDNA
A
Lysogene bacterie zonder (A) en met (B) transductie
A
envelop
glycoproteïne dubbele lipidenlaag
B
eiwitmantel DNA-polymerase ▲
▲
circulair gedeeltelijk dubbelstrengDNA B
▲
▲
eiwitmantel A
B
2.3.4 Genoverdracht van een virus naar een eukaryote cel C-D
• DNA-virussen Op afbeelding 13.11 zijn enkele menselijke DNA-virussen afgebeeld. Het herpesvirus doet koortsblaasjes ontstaan rondom de mond of op het mondslijmvlies. Het veroorzaakt gordelroos of zona. Het papovavirus veroorzaakt allerlei wratten bij de mens. Het adenovirus en het rhinovirus maken de mens verkouden. Het hepatitis Bvirus is de verwekker van een leverziekte. De levenscyclus van een DNA-virus verloopt in en ten koste van dierlijke cellen op nagenoeg dezelfde manier als de cyclus van de lambda-bacteriofaag in de colibacil. Zo kan er bij alle DNA-virussen ook DNA-overdracht door transductie voorkomen. Het viraal genoom kan dus een vreemd DNA-fragment bevatten dat bij een vorige infectie uit de gastcel werd meegepikt. Dat kan aan de basis liggen van het ontstaan van kanker.
circulair dubbelstrengDNA
eiwitmantel
E
lineair dubbelstrengDNA
envelop
2.3.3 Genoverdracht van een bacterie naar een andere bacterie via een virus
91
92
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
• RNA-virussen Bij andere virussen bestaat het genoom uit RNA. Bij de gewone RNA-virussen komt er geen DNA voor in de levenscyclus. De eiwitten bij die virussen worden door de gastheercel gemaakt door translatie, eventueel via een complementaire RNA-molecule. De verwekkers van polio, mazelen, griep, hondsdolheid, tabaksmozaïekziekte (afbeelding 13.12 A) en het Ebola-virus (afbeelding 13.12 B) zijn voorbeelden van dergelijke virussen. Afb. 13.12
De retrovirussen zijn RNA-virussen die wel een DNA-fase hebben en dus ook aan DNA-overdracht kunnen doen. De retrovirussen, zoals het HIV-virus, bezitten binnen de eiwitmantel en de envelop twee RNA-moleculen die elk een molecule van een DNA-polymerase dragen (afbeelding 13.12 C). Dat enzym is in staat om transcriptie te bewerken van het genoom-RNA in DNA. Dat noemen we copy-DNA (cDNA). Het is een reversetranscriptase, vandaar de naam retrovirus.
RNA-virussen A Tabaksmozaïekvirus B Ebola C HIV-virus
RNA
proteïnen
100 nm 100 nm
A
reversetranscriptase
dubbele lipidenlaag
RNA-streng
envelop
eiwitmantel
anti-sense RNA transcriptasepolymerase-complex B
glycoproteïne C
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Op afbeelding 13.13 wordt de levenscyclus van een retrovirus voorgesteld. Als een retrovirus een cel binnendringt (1), wordt zijn envelop in het plasmamembraan van de gastheercel geïntegreerd (2). In het cytoplasma valt zijn eiwitmantel uiteen. Het genoom-RNA ondergaat dan een omgekeerde transcriptie of reversetranscriptie naar DNA (3) dankzij het enzym reversetranscriptase dat het virusgenoom begeleidt. De DNA-kopie of cDNA gaat zich nu in het DNA van de geïnfecteerde cel integreren (4-5). Het ingebouwde DNA wordt provirus genoemd, naar analogie met profaag.
Afb. 13.13
Vanuit dat provirus (cDNA) verloopt de levenscyclus van het retrovirus verder zoals bij de DNA-virussen (zie lambdabacteriofaag). Het provirus blijft vanaf dan integraal deel uitmaken van het genoom van de geïnfecteerde cel. Als dat een voorloper is van een geslachtscel, wordt het provirus aan het nageslacht doorgegeven als een gewoon gen. Zo bevat elk organisme in zijn genoom een aantal provirussen. Het provirus kan omgezet worden naar RNA en translatie ondergaan (6-7). Er worden nieuwe virussen aangemaakt die de cel verlaten (8). Ook via retrovirussen is DNA-overdracht door transductie mogelijk.
Levenscyclus van een retrovirus in een T-helpercel reverse-transcriptase
RNA-streng
HIV-virus
receptor 1
2
RNA
3
4
5
DNA
6 7 8
T-helpercel
93
13
THEMA
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Kunstmatige genoverdracht
3
3.1 Kunsmatige genoverdracht tussen bacteriën Sommige bacteriën kunnen zich tegen aanvallen van bacteriofagen verdedigen. Als soortvreemd DNA een bacterie binnendringt, gaan bepaalde enzymen dat DNA in stukken knippen. Het virus wordt daardoor geïnactiveerd. De ontdekking van dergelijke knip- of restrictieenzymen was heel belangrijk. Tabel 13.1
De restrictie-enzymen blijken enkel voor te komen bij prokaryoten en zijn daardoor gemakkelijk te isoleren. Ze zijn heel specifiek (tabel 13.1). Ze verbreken bindingen binnen de dubbele DNA-streng ter hoogte van welbepaalde nucleotidensequenties die een zogenaamde palindroomstructuur bezitten (afbeelding 13.14) (¬ V 8). Het geknipte fragment bezit twee uiteinden die enkelstrengig zijn. Die uiteinden worden plakkende uiteinden of sticky-ends genoemd.
Herkenningssequenties voor enkele restrictie-enzymen
Enzym
Bron
Herkenningssequentie
EcoRI
Escherichia coli RY13
G AATTC
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens H
G GATCC
HaeIII
Haemophilus aegyptius
GG CC
HindIII
Haemophilus influenzae Rd
A AGCTT
HpaI
Haemophilus parainfluenzae
G TTAAC
HpaII
Haemophilus parainfluenzae
CC GG
MboI
Moraxella bovis
G ATC
NotI
Nocardia otitidis-caviarum
G CGGCCGC
TaqI
Thermus aquaticus
T CGA
↑
↑
↑
↑
↑
↑ ↑
↑
Afb. 13.14
↑
94
Specifieke werking van restrictie-enzym uit de colibacil KNIP
KNIP
G
A
A
T
T
C
G
A
A
T
T
C
C
T
T
A
A
G
C
T
T
A
A
G
DNA
KNIP
A
A
T
T
KNIP
C
G
A
A
T
T
C
G G C
T
T
A
A DNA-fragment met specifiek gen en plakkende uiteinden
G
C
T
T
A
A
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
3.2 Plasmiden en de specifieke werking van restrictieenzymen In 1973 maakten twee Amerikaanse biochemici, Cohen en Broyer, gebruik van restrictie-enzymen om een vreemd gen in een bacterie binnen te smokkelen (afbeelding 13.15). Via micromanipulatie isoleerden ze, uit een aantal colibacillen die resistent waren tegen het antibioticum tetracycline, het plasmide met het gen voor die resistentie. Analoog isoleerden ze uit stafylokokken (Stafylococcus aureus) die tegen penicilline resistent waren, het plasmide met het gen voor die resistentie. Ze mengden beide plasmidegroepen en voegden er een knipenzym aan toe, waardoor de plasmiden tot fragmenten verknipt werden. Na toevoeging van DNAligase, een enzym dat voor DNA herstel zorgt, vormden de fragmenten weer ringvormige plasmiden. Die ‘nieuwe’ plasmiden brachten ze in colibacillen. Een aantal ervan bleek resistent te zijn tegen beide antibiotica. In die colibacillen werd dus een soortvreemd gen na transplantatie operationeel. De ontdekking van de knipenzymen markeert eigenljjk het begin van de biotechnologie. Het experiment van Cohen en Broyer ligt aan de basis van de kunstmatige genoverdracht tussen organismen. Je kunt dat proces het best vergelijken met het montageknipwerk van een langspeelfilm: met knip- en plakwerk worden stukken film verwijderd en op een andere plaats toegevoegd. Door te knippen en te plakken kan er heel nauwkeurig een DNA-fragment of een gen aan een organisme toegevoegd worden of eruit verwijderd worden. Zo worden bestaande eigenschappen gewijzigd, fouten hersteld of een nieuw kenmerk aan een organisme gegeven. Aangezien de genetische code voor alle levende organismen universeel is, kunnen genen en de daaraan verbonden eigenschappen van de ene soort naar een andere soort worden overgebracht. De met DNA geïnfecteerde cellen bezitten meer DNA en/of genen dan de oorspronkelijke cellen. Ze bezitten een combinatie van DNA uit twee verschillende bronnen, recombinant-DNA. Het overbrengen van genetisch materiaal van een soort organismen naar een andere soort is in feite ‘genetische bouwkunde’, een letterlijke vertaling van de Engelse term genetic engineering. Er zijn heel wat verschillende namen die dezelfde lading dekken: DNA-technologie, gentechnologie, recombinant DNA-technologie, genmanipulatie, genetische manipulatie of genetische modificatie. Al die termen verwijzen naar hetzelfde: het gericht wijzigen van de genetische informatie in een organisme. We spreken van genetisch gemodificeerde (GGO’S) of transgene organismen. In de loop der jaren zijn er verschillende technieken ontwikkeld om nieuw of vreemd DNA in een cel binnen te brengen (zie 5.3). Op die manier zijn onderzoekers erin geslaagd om nieuwe eigenschappen aan een
organisme toe te voegen of bestaande kenmerken aan te passen. De genexpressie en de regulatiemechanismen voor genexpressie van prokaryoten en eukaryoten vertonen grote verschillen. Met die verschillen zal er dus rekening moeten gehouden worden wanneer genen van een eukaryoot in een prokaryoot gebracht worden. Een gen van een prokaryoot dat kunstmatig in het genoom van een eukaryoot wordt ingebracht, kan slechts tot expressie komen als het regulatiemechanisme dat gen vergezelt. Afb. 13.15 Genoverdracht tussen plasmiden: techniek van recombinant-DNA Stafyllococcus aureus
Escherichia coli resistent tegen penicilline
resistent tegen tetracycline
penicillineresistent gen
tetracyclineresistent gen
penicillineresistent gen tetracyclineresistent gen
+ restrictie-enzym uit E. coli
+ DNA-ligase
stafylokok en colibacil met resistentie tegen penicilline en tetracycline
95
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Afb. 13.16
4
Productie van insuline door recombinant-DNA-technologie 1 α- keten
Toepassingen
β- keten
4.1 Toepassingen in de geneeskunde ˘
OB
OPDRACHT 13.2 - 13.3
We bespreken hieronder de productie van insuline en EPO meer in detail.
gen voor α-keten
gen voor galactosidase
gen voor galactosidase
3
4
5
galactosidase
✂
De meeste aandoeningen zijn het gevolg van een falende productie van specifieke eiwitten waardoor een tekort aan een bepaald eiwit ontstaat of slechte eiwitten gevormd worden. Bij de traditionele productiemethode wordt er getracht om specifieke eiwitten uit de producerende organen te extraheren. Hoge productiekosten, contaminatie met andere stoffen, risico’s tot besmetting met ziekteverwekkers en heel kleine opbrengsten vormen de belangrijkste nadelen van die traditionele productiemethoden. Dankzij de toepassing van kunstmatige genoverdracht worden waardevolle eiwitten thans geproduceerd door cellen in vitro (bacteriën, gist, zoogdiercellen) of door dieren in vivo. De keuze van het systeem wordt bepaald door de aard van de te produceren eiwitten. Vele eiwitten kunnen in bacteriën worden geproduceerd, maar de meeste eiwitten die in ons lichaam werkzaam zijn, ondergaan na de translatie vaak nog wijzigingen, zoals glycosylatie, lipidatie, acetylatie ... Zonder dergelijke post-translationele wijzigingen zijn die eiwitten vaak onvoldoende of totaal niet biologisch actief. Door de productie van die eiwitten via gisten en zoogdiercellen, in plaats van de isolatie uit zoogdierbloed, wordt het risico op besmetting met ziektekiemen vermeden. Bij de aanmaak van eiwitten, hormonen (erythropoïetine (EPO), groeihormoon, insuline, interferon en bloedstollingsfactoren) en talrijke vaccins (tegen rabies, hepatitis, meningitis, encephalitis) wordt kunstmatige genoverdracht toegepast.
gen voor β-keten
2
4.1.1 Productie van waardevolle eiwitten
✂
96
α- keten β- keten
6
galactosidase
...s..s..
... ..
S .. S ...
.... ....s ..... s
• De productie van insuline door transgene bacteriën en gist Suikerzieke patiënten of diabetici zijn niet in staat om het hormoon insuline, een eiwit, aan te maken. Dat hormoon regelt de opname van glucose in de cellen. Vóór de ontdekking en zuivering van insuline in 1921 stierven vele diabetici kort na het uitbreken van de ziekte. Tot voor enkele jaren werd het hormoon geïsoleerd uit de pancreas van koeien en varkens. De pancreas van één varken levert echter slechts de dosis van één week voor één patiënt op, terwijl miljoenen mensen van het hormoon afhankelijk zijn. Ongeveer 5 op 1 000 Europeanen lijden aan suikerziekte. Tegenwoordig wordt de menselijke insuline aangemaakt in genetisch gewijzigde micro-organismen,
zoals bacteriën of gisten. Biotech-insuline is overal ter wereld te koop en vervangt meer en meer de insuline van dierlijke oorsprong. Het is nu niet alleen in onuitputtelijke hoeveelheden voorradig, het voorkomt bovendien het risico op besmetting met ziekteverwekkers die ook voor de mens schadelijk kunnen zijn. Stoffen die door genetisch gewijzigde bacteriën gevormd worden, noemen we monoklonale stoffen. Afbeelding 13.16 toont de productie van insuline door transgene bacteriën. Insuline (51 aminozuren) is opgebouwd uit een α- en een β-keten (6). Beide ketens zijn door zwavelbruggen met elkaar verbonden en vormen zo het werkzame insuline.
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Het gen voor de α-keten en het gen voor de β-keten worden met behulp van restrictie-enzymen geïsoleerd uit menselijk DNA (1). Elk gen wordt in een afzonderlijk plasmide gebracht en vastgekoppeld aan het gen voor galactosidase (2). Galactosidase is een enzym dat in bacteriën lactose afbreekt tot glucose en galactose. De plasmiden worden in de bacteriën gebracht (3). Als lactose de enige voedselbron is, gaan de bacteriën zich vermeerderen en overvloedig het galactosidase-insulinecomplex aanmaken (4). Dat complex wordt uit de bacteriën geïsoleerd en gezuiverd (5). Het galactosidasedeel wordt verwijderd en de α- en β-ketens worden aan elkaar gezet (6). • Productie van erythropoïetine (EPO) in transgene zoogdiercellen
Onze nieren produceren het complexe EPO-hormoon dat wordt vrijgegeven in het bloed. EPO stimuleert de vorming en ontwikkeling van rode bloedcellen. Mensen met slecht werkende nieren, o.a. kankerpatiënten die chemotherapie krijgen, maken vaak onvoldoende EPO Afb. 13.17
Chemische structuur van epo
aan en hebben daardoor te weinig rode bloedcellen. Ze kunnen weinig zuurstofgas opnemen en voelen zich zwak en moe. Aangezien in normale omstandigheden de EPO-concentraties in bloed en nieren uiterst laag zijn, was het tot nu toe onmogelijk EPO daaruit te isoleren. De patiënten werden behandeld met bloedtransfusies rijk aan rode bloedlichaampjes. Die transfusies hebben maar een tijdelijk effect en bevatten het risico op besmetting met virussen, zoals het HIVvirus en het hepatitis B-virus. Het 165 aminozuren tellende eiwit EPO bezit in natuurlijke omstandigheden vier ingewikkelde suikerstaarten (afbeelding 13.17). Die ingewikkelde glycosylatie kan noch in bacteriën noch in gistcellen worden uitgevoerd. De genetische gewijzigde ovariumcellen van de Chinese hamster kunnen echter wel voldoende en biologisch actief epo produceren. Het lichaamsvreemde EPO bestaat in twee vormen. De epoëtinevorm verschilt slechts van het natuurlijke EPO in de samenstelling van de vier suikerketens. De Darb-epoëtine vorm (merknaam Aranesp) heeft een suikerketen meer aan de aminozuurketen hangen. 4.1.2 Gentherapie Het niet of slecht functioneren van eiwitten in ons lichaam is het rechtstreekse gevolg van ontbrekende of defecte (gemuteerde) genen. We zouden een dergelijke aandoening kunnen bestrijden door het gen coderend voor het functionerende eiwit in de cel van de patiënt binnen te brengen. Een dergelijke behandelingswijze noemen we gentherapie. Gentherapie kan worden uitgevoerd in de lichaamscellen waarbij het foute gen en dus de ziekte alleen wordt hersteld in de patiënt zelf. We spreken van een therapeutisch effect of genotypisch geneesmiddel. Het gebruik van stamcellen zou in dat geval wel een langetermijneffect van gentherapie kunnen bewerken (¬ V 9). Door wijzigingen aan te brengen in het genetisch materiaal van de gameten kunnen de correcties ook worden doorgegeven aan het nageslacht. Het ingebrachte gen kan een juiste versie van het foute gen zijn, maar kan ook een nieuw gen zijn dat een corrigerende rol vervult (afbeelding 13.18). In andere gevallen is het mogelijk om supressorgenen en regulatiegenen in te brengen die andere genen blokkeren. Daardoor kunnen de cellulaire en virale activiteit worden geblokkeerd. Die techniek zou het mogelijk maken om de ontwikkeling van tumoren af te remmen.
Suikers die aan het eiwit EPO hangen
Voor tal van monogenetische deficiëntieziekten zou gentherapie een oplossing kunnen zijn. We bespreken enkele voorbeelden.
97
98
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
• Behandeling van mucoviscidose Een virus, in dit geval het adenovirus dat verkoudheden veroorzaakt, wordt genetisch gemanipuleerd waarbij het zijn ziekteverwekkende eigenschappen verliest en drager wordt van het gezonde mucogen. Zo’n virus noemen we een vector. Liposomen (afbeelding 13.28) en naakte plasmiden kunnen ook als vectoren gebruikt worden. Door de vectoren via een verstuiver of een aërosol in te ademen wordt de vector in de buurt van de gepaste doelcellen gebracht. Een deel van de vectoren wordt opgenomen en kan zo het goede gen binnenbrengen in de doelcellen. • Productie van ADA bij de mens
Een defect in het gen voor het enzym adenosinedeaminase (ADA) veroorzaakt het congenitaal immuniteitsdeficiëntiesyndroom (CIDS). Doordat ADA niet functioneert, vormt de patiënt geen witte bloedcellen. De immunologische afweer faalt en de patiënt valt ten prooi aan allerlei infecties waaraan hij zonder behandeling overlijdt. Beenmergtransplantatie biedt in dat geval Afb. 13.18
Transductiemogelijkheden A Genadditie B Genvervanging C Gencontrole
een oplossing, maar kan echter vaak, door het ontbreken van een geschikte donor, niet toegepast worden. Een genezing zou dus mogelijk zijn als de beenmergcellen van de patiënt zelf van een correcte versie van het ADAgen kunnen worden voorzien. Afbeelding 13.19 geeft de werkwijze voor die therapie weer. Het gen kan in beenmergcellen van een ziek kind worden gegrift door retrovirale deeltjes. In retrovirussen wordt een deel van het RNA-genoom vervangen door het RNA-transcript van het gen voor ADA. Geïsoleerde beenmergcellen van het zieke kind worden in vitro geïnfecteerd. De geïnfecteerde cellen kunnen het ADAgen als provirus in hun genoom opnemen. Als die cellen voorzien zijn van de geschikte promotor, kan het gen tot expressie komen. De beenmergcellen kunnen dan weer bij het kind geïnjecteerd worden. Tot 1991 gaf die ingreep slechts beperkte positieve resultaten. De eerste geslaagde gentherapie waarmee W. French Anderson en collega’s van het National Institute of Health (Washington) in 1990 een CIDSpatiëntje behandelden, berustte niet op het genetisch veranderen van de beenmergcellen van de patiënt, maar wel op gentherapie op witte bloedcellen. Afb. 13.19 mens
Werkplan voor integratie van een ontbrekend gen bij de
injectie van beenmergcellen met ADA-gen
punctie van beenmergcellen (stamcellen) zonder ADA-gen
defect gen correct gen cDNA A
PROVIRUS
infectie van beenmergcel met mRNA van ADA-gen
B
RETROVIRUS
regulatiegen
C
recombinant retrovirus met ADA-gen
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Aangezien witte bloedcellen de lange levensduur van beenmergcellen niet hebben, is die gentherapie geen eenmalige behandeling. Een regelmatige herhaling van de therapie is noodzakelijk. In 2002 werd de therapie in Israël met succes toegepast op een baby van zeven maanden oud. In theorie kan gentherapie alle ziekten genezen die door slecht functionerende eiwitten (genen) worden veroorzaakt. De laatste jaren zijn er veel patiënten met gentherapie behandeld. Er moeten echter nog vele hindernissen worden overwonnen vooraleer patiënten, die lijden aan een erfelijke aandoening, met gentherapie kunnen worden genezen. Het huidige onderzoek houdt zich vooral bezig met het optimaliseren van de gentransfer en de genexpressie. Slechts 1 % van de behandelde cellen blijkt het doelgen te bevatten. Bovendien komt bij amper de helft daarvan het gen ook tot expressie. Afb. 13.20
Jeff Schell en Marc Van Montagu
Afb. 13.21
Integratie van een soortvreemd gen in een plant
4.2 Toepassingen in land- en tuinbouw ˘
OPDRACHT 13.4
Onze huidige gewassen (maïs, graan, tomaten ...) zijn niet te vergelijken met hun voorgangers van pakweg honderd jaar geleden. Honderden jaren van veredeling hebben immers geleid tot uniforme landbouwgewassen met een heel grote opbrengst. In het verleden verliep het veredelen van gewassen vrij empirisch. Generaties lang kruisen heeft uiteindelijk geleid tot een aantal gewenste eigenschappen bij bepaalde plantensoorten. Vaak zijn die echter vergezeld van niet gewenste eigenschappen (afbeelding 13.1). Tegenwoordig worden nieuwe eigenschappen door genetische transformatie heel gericht in een gewas gebracht. De eerste transgene planten werden ontwikkeld in 1985 door Marc Van Montagu en Jeff Schell (afbeelding 13.20) aan de Universiteit Gent. Sinds enkele jaren worden transgene gewassen in de VS, Canada en Argentinië op commerciële schaal geteeld. Kleurverandering, insectresistentie, herbicidetolerantie, langere houdbaarheid, grotere vruchten, meerdere vruchten per plant, kleinere en stevigere planten, kant-enklare producten zijn voorbeelden van interessante planteneigenschappen die door transductie kunnen worden beïnvloed. We maken een selectie uit de vele voorbeelden.
2
gen voor Bt-insecticide
1
OB
3 4
E. coli
Agrobacterium tumefaciens
plantencel zonder celwand Ti-plasmide gen voor Btinsecticide
7
6
plant giftig voor insecten
5
99
100
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
4.2.1 Transgene planten die zelf insecticiden maken Een insecticide dat al jaren in de biologische landbouw wordt gebruikt om de vraatlust van kevers en rupsen tegen te gaan is een endotoxine uit Bacillus thuringiensis (Bt-toxine). Het endotoxine is voor de mens niet giftig en wordt bovendien snel afgebroken in de bodem. Zoals eerder al beschreven kan de agrobacterie (Agrobacterium tumefaciens) genen van zijn Ti-plasmide overdragen naar planten. Van Montagu en Schell zijn erin geslaagd om het gen dat voor het Bt-insecticide codeert naar de tabaksplant over te dragen. Afbeelding 13.21 toont hoe de integratie van een vreemd gen in een plant gebeurt. Eerst wordt het gen voor het Bt-insecticide in een colibacil (1) gekloond. Daarna wordt door recombinantDNA-technologie een Ti-plasmide samengesteld (2). Het gewijzigde Ti-plasmide wordt overgebracht in een agrobacterie (3). De gewijzigde agrobacterie infecteert vervolgens de protoplasten (naakte plantencellen zonder celwand) van tabaksplanten (4). De agrobacterie draagt het T-DNA over aan de tabaksplant die het in zijn genoom opneemt (5). De plantencellen worden opgekweekt (6) en de volwassen tabaksplant brengt het gen tot expressie (7) en blijkt insectenresistent te zijn. Rupsen die van de nakomelingen van die planten eten, sterven ook. De plant geeft het gen dus door aan de nakomelingen. De techniek wordt wereldwijd gebruikt. Zo is maïs nu resistent tegen de stengelboorder, katoen tegen bolwormen en is de aardappel bestand tegen de beruchte coloradokever. Door die ingebouwde bescherming zijn minder onkruiden insectenverdelgers nodig. Sinds 1996 wordt op testvelden en in onafhankelijke studies gemeten welke de effectieve invloeden zijn op het verbruik van chemische stoffen. Zo bleek in 1998 op de velden met insectenresistent katoen de laagste hoeveelheid chemische insectenverdelger te zijn gebruikt sinds 40 jaar. Het gebruik van de insectenresistente aardappelen reduceerde het gebruik van chemische insecticiden met meer dan 40 %. Normaal wordt een veld met katoen drie tot vier keer bespoten met insecticide. Bij het gebruik van het genetisch gewijzigde, insectenresistente katoen wordt helemaal niet of in enkele gevallen slechts eenmaal gespoten. Dat betekent voor de landbouwer minder werk en minder kosten. 4.2.2 Transgene planten die resistent zijn tegen onkruidverdelgers Genetische transformatie wordt ook gebruikt om planten resistent te maken tegen welbepaalde herbiciden. Sommige variëteiten van soja, koolzaad en maïs bezitten een herbicidentolerantiegen. Het meest gekende voorbeeld is de resistentie tegen het herbicide Roundup. Glyfosaat, de actieve component in het herbicide, blokkeert de werking van een enzym dat noodzakelijk is bij de opbouw van chloroplasten in
plantencellen. Dat betekent dat de aanmaak van bladgroen stopt, de plant bruin kleurt, de fotosynthese stilvalt en de plant afsterft. Transgene tabak, soja, tomaten, aardappelen, rapen, kolen, maïs en bieten zijn resistent tegen dat herbicide. Het herbicide kan volop gebruikt worden om het onkruid te verdelgen terwijl de groei van de gewassen niet verstoord wordt. Voor de herbicidentolerante gewassen is ook een verminderd verbruik van chemische onkruidverdelgers meetbaar, variërend tussen 9 en 30 %, afhankelijk van de locatie, het klimaat en de manier van planten. Naast die milieuvoordelen is het gebruik van herbicidentolerante gewassen voor de Amerikaanse en Canadese landbouwers ook kostenbesparend. 4.2.3 Transgene planten met specifieke kwaliteiten De genetische modificatie of gentechnologie laat toe doelgericht te werken en aan het organisme genen toe te voegen die de aanmaak van specifieke enzymen en andere eiwitten regelen. Op die manier kunnen aan planten specifieke eigenschappen toegevoegd worden. We bespreken enkele voorbeelden. • De eerste genetisch gewijzigde groenten die op de markt kwamen, waren tomaten met een vertraagd rijpingsproces. Gewone tomaten worden groen geplukt zodat er tijdens het vervoer geen kneuzingen of rotte plekken ontstaan. De toevoeging van een anti-sense-mRNA maakt dat de genetisch gewijzigde ‘Flavr Savr’(TM)tomaten’ langer aan de plant kunnen rijpen, waardoor er meer smaakstoffen door de tomaten worden aangemaakt. Doordat de transgene tomaten minder snel zacht worden, is het gevaar voor kneuzingen, zelfs bij rijpere tomaten, gering. In de toekomst wordt getracht om ook de houdbaarheid van andere planten te verhogen. • Er zijn talrijke voorbeelden waar gentechnologie aan de basis ligt van opbrengstverhoging en kwaliteitsverbetering bij planten. - Uitdroging, koude, UV-straling, schimmelinfecties ... vormen voor sommige planten stressfactoren die in belangrijke mate hun productiviteit beïnvloeden. Die omstandigheden zorgen er vaak voor dat de plant niet normaal kan ontwikkelen en vaak afsterft. Door de moderne gentechnologie zijn er nu planten die minder ziektegevoelig zijn en beter bestand zijn tegen ongunstige weersomstandigheden en virussen. Sommige planten bezitten ‘vernuftige’ genen (bv. voor de ontwikkeling van een dikkere celwand) die hen beschermen tegen extreme omgevingsfactoren. Genetische manipulatie laat toe de genen, die de stresstolerantie bepalen, te identificeren, te isoleren en over te brengen naar andere gewassen.
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
- Met behulp van DNA-technieken kunnen transgene planten ontwikkeld worden die geen mannelijke gameten meer vormen. Op die manier kan ongewenste voortplanting worden tegengegaan. - Genen voor bloemkleuren kunnen tussen verschillende soorten worden uitgewisseld en vormen een belangrijke economische troef. Blauwe anjers, paarse rozen en paarse tulpen sieren onze markten. Zo vormt de productie van blauw katoen en kant-enklare blue jeans een economische winst (geen kleurstoffen, geen energieverslindende verfprocedures) en een sterke afname van de milieuvervuiling. - Het verhogen van de houdbaarheid van snijbloemen, door de aanmaak van verwelkingsenzymen lam te leggen, komt dan weer de consument ten goede. • Andere planten bezitten dan weer specifieke eigenschappen die een invloed hebben op de gezondheid van de consument. - Het onderzoek in dat domein concentreert zich vooral op de voedingsgewassen die wijdverspreid zijn, zoals aardappelen, maïs, rijst, maniok ... De mens is altijd op zoek naar voedingsmiddelen met een grotere en betere voedingswaarde. Zo bestaan er aardappelen met meer zetmeel en minder water. Daardoor nemen ze minder vet op bij het bakken en frituren. Dat kan dan in de westerse wereld bijdragen tot het voorkomen van hart- en vaatziekten. - Aardappelen met een betere zetmeelkwaliteit en zoetere aardappelen bezitten dan weer een grotere voedingswaarde. - Rijst is in grote delen van de wereld zowat de enige voedselbron, maar in rijst ontbreekt vitamine A. Het eenzijdige rijstdieet maakt dat miljoenen kinderen een verminderde weerstand hebben en blind worden. De transgene productie van ‘Golden Rice’ biedt voor miljoenen mensen een oplossing. - Gewassen, zoals soja en koolzaad die vooral geteeld worden voor de olieopbrengst, zijn genetisch gemanipuleerd waardoor ze meer onverzadigde dan verzadigde vetten bevatten. De consumptie van die olie kan een rol spelen in het voorkomen van harten vaataandoeningen. - Transgene vruchten bevatten een extra gen voor een enzym dat de pitjes vernietigt en vruchten zonder pitjes levert. Dat biedt een belangrijk voordeel bij de verdere verwerking van de vruchten. - Uit tests blijkt dat planten een belangrijk alternatief systeem kunnen vormen voor de productie van therapeutische eiwitten, zoals vaccins. Het vaccin tegen bacteriële diarree is daar een voorbeeld van. Momenteel wordt de aanmaak onderzocht van vaccins in bananen en aardappelen die rauw kunnen worden gegeten en op vele plaatsen in de wereld worden geteeld. De ontwikkeling van orale vaccins kan het uitvoeren van universele vaccinatieprogramma’s gemakkelijker maken. Wat zal de toekomst brengen: transgene appels die ons gebit beschermen, cafeïnearme koffie met smaak, vierkante en beter stapelbare tomaten ...?
4.3 Toepassingen ten voordele van het milieu De kwaliteit van ons leven op aarde is nauw verbonden met de kwaliteit van ons milieu. Er wordt meer en meer belang gehecht aan nieuwe manieren om het milieu te beschermen en te beheren. Conferenties over de opwarming van de aarde, de vervuiling van de zeeën en de Kyoto-normen getuigen daarvan. De biotechnologie speelt zeker een rol in het ontwikkelen van alternatieven om het milieu beter te beschermen. - Biotechnologen ontdekten bacteriestammen die de biodegradatie van ruwe olie kunnen bewerken. In amper zeven dagen tijd kunnen die bacteriën giftige, onvertakte koolwaterstoffen voor 99,6 % afbreken. Die ontdekking zal zeker toepassingen kennen in de toekomst. - Andere gemodificeerde bacteriën kunnen kwik opsporen en opnemen. Het kwik kan dan vervolgens worden vrijgezet tijdens verbranding op heel hoge temperatuur. Zo kan dat zware en voor de mens gevaarlijk metaal uit de bodem worden verwijderd en worden gerecycleerd. - Onderzoek toonde aan dat de bacterie Desulfovibrio radioactief uranium uit bodemwater en uit de bodem kan opnemen. Het overbrengen van die genen naar bomen met een uitgebreid en diep wortelstelsel zou kunnen leiden tot een efficiënte en uitgebreide opruimmachine. - De meeste plastics worden via chemische processen gesynthetiseerd. Polyhydroxyalkaanzuren (PHA) zijn biodegradeerbare polyesters die geproduceerd worden door bacteriën. De plastics zijn niet toxisch en onoplosbaar in water. Sommige ervan worden al aangewend in de geneeskunde en de landbouw, voor de productie van plastic flessen en biodegradeerbaar verpakkingsmateriaal. De productie van die biodegradeerbare plastics gebeurt door bacteriën in grote fermentoren, maar is echter veel duurder dan de productie van de in bulk geproduceerde, synthetische plastics. Het is een concurrentieslag die biodegradeerbare plastics niet zullen winnen, tenzij een goedkopere productiemethode wordt ontwikkeld. De productie van PHA’s door planten vormt een goedkoper alternatief. De drie genen die coderen voor de eiwitten, betrokken in het biosyntheseproces van PHA, kunnen met succes in planten (o.a. maïs) worden ingeplant. De volgende ontwikkelingsstap, de milieuvriendelijke extractie van het plastic uit de plant, bleek geen sinecure. Onderzoekers zijn er echter in geslaagd om het plastic op een relatief eenvoudige en milieuvriendelijke manier te extraheren. Ze voorspellen dat het biodegradeerbare plastic tegen dezelfde prijs zal kunnen worden geproduceerd als de synthetische polymeren. De commerciële productie van PHA’s in planten is dus vermoedelijk een kwestie van tijd.
101
102
13
THEMA
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
Enkele waardevolle technieken
5
5.1 Klonen 5.1.1 Omschrijving Klonen is een natuurlijk fenomeen (thema 9). De individuen, ontstaan uit niet-gespecialiseerde cellen die zich enkel door mitose delen, vormen een kloon. Ze zijn identiek aan het moederorganisme. Ook bacteriën kunnen zich vermenigvuldigen via celdeling. Het DNA verdubbelt en de celinhoud van de moederbacterie wordt verdeeld over twee identieke dochtercellen. Elke bacterie die op die manier ontstaat, is een kloon van de oorspronkelijke bacterie. 5.1.2 Klonen bij mensen en dieren - Het klonen van lichaamscellen van organismen laat toe om individuen met interessante genetische kenmerken te vermenigvuldigen. Klonen bij mensen en dieren kan echter niet op dezelfde eenvoudige manier gebeuren als bij planten. Toch zijn klonen ook daar een natuurlijk fenomeen. Zo vormen eeneiige tweelingen een natuurlijke kloon. Dierlijke of menselijke klonen kunnen ontstaan door het embryo in een vroeg stadium te splitsen, waardoor er meerdere identieke embryo’s ontstaan (embryosplitsing) (afbeelding 13.22). - Het klonen uit lichaamscellen van volwassen dieren is gebaseerd op celkerntransplantatie. Vaak wordt er een onderscheid gemaakt tussen therapeutisch klonen (niet-reproductief klonen) en reproductief klonen. Bij reproductief klonen wordt de celkern van gedifferentieerde cellen gebruikt. Op afbeelding 13.23 kunnen we het verloop van dat proces volgen. Afb. 13.22
De volwassen gedifferentieerde cellen (donorcellen) worden uit een dierlijk orgaan genomen. In het geval van Dolly waren dat cellen uit de uier van een schaap. Na isolatie worden ze in cultuur gebracht. Enkele dagen voor de fusie worden ze getransfereerd naar een cultuurmedium dat arm is aan voedingsstoffen. Daardoor daalt de metabolische activiteit en worden de cellen in een rustfase gebracht. Na dat dieet worden de kernen (2n) overgebracht naar een kernloze cel. Dat is een bevruchte eicel of een heel jong embryo, in het eencellige stadium (zygote), waarvan de kern werd verwijderd. Dat wordt gerealiseerd door beide cellen dicht bij elkaar te plaatsen. Een elektrische schok zorgt dan voor de fusie van beide cellen en stimuleert de metabolische activiteit in de gefuseerde cellen. Zo kan zich een individu ontwikkelen, net als bij de fusie van een eicel en een zaadcel. Die cellen worden ingeplant bij een draagmoeder. In februari 1997 maakten onderzoekers van het Schotse Roselin Institute bekend dat ze op basis van die techniek een kloon hadden gemaakt van een volwassen schaap. Dolly werd ‘geschapen’ uit een uiercel van een zeven jaar oud schaap. - Therapeutisch klonen betekent het gebruiken van de techniek van celkerntransplantatie om cellen en weefsels te maken die therapeutisch (ter genezing van) zullen gebruikt worden. De ingeplante cellen bezitten hetzelfde erfelijk materiaal als die van de patiënt zodat er dus geen afstoting zal plaatsvinden. Door het tekort aan hersendode en hartdode patiënten is er een schrijnend tekort aan donoren voor verschillende organen. Patiënten die een orgaantransplantatie nodig hebben, komen vaak op lange wachtlijsten te staan en sterven soms vooraleer een geschikte donor wordt gevonden. Geneesheren en vorsers kijken machteloos toe en trachten alternatieve therapieën te ontwikkelen om die patiënten te helpen. Het klonen van weefsels en organen kan een oplossing bieden.
Embryosplitsing
eicel
zygote
celdelingen
versmelting
natuurlijke of kunstmatige splitsing in twee delen
De twee delen ontwikkelen zich tot een volwassen individu.
THEMA
13
BIOTECHNOLOGIE
BASISSTOF
In brandwondencentra wordt al enige tijd gebruik gemaakt van kloontechnieken om huidcellen te kweken om zwaarverbrande patiënten van een eigen nieuwe huid te voorzien. Tegenwoordig worden ook nieuwe stukken kraakbeen en been gekweekt in het laboratorium. Recente onderzoeken bieden trouwens veelbelovende resultaten voor het kweken van hele organen en ruggenmerg. Zo kreeg een Amerikaanse jongen, geboren zonder borstbeen, een normale borstkas die in het laboratorium gekweekt werd. Enkele kraakbeencellen werden geënt op een biodegradeerbare mal in de vorm van het ontbrekende been. Na enkele weken werd het geheel ingeplant en groeide het uit tot een normale borstkas. Afb. 13.23
Een recente wetenschappelijke studie toonde aan dat ook menselijke embryonale stamcellen kunnen worden gekweekt (¬ V 9). Embryonale stamcellen hebben nog geen specifieke eigenschappen. De cellen kunnen differentiëren tot verschillende celtypes. Ze kunnen dus nog een spiercel, een niercel, een levercel ... worden. Op die manier hoeft er niet meer vertrokken te worden van bestaand orgaanweefsel, maar kan het gewenste weefsel in het laboratorium gekweekt worden. Op termijn zouden mogelijk ook volledige organen in het laboratorium kunnen worden gekweekt.
Dolly
cellulaire moeder
genetische moeder
melkklierweefsel uit uier nemen
chirurgisch winnen van eicellen
kweek van melkkliercellen
celkern
vijf dagen voedselarmoede zet de celcyclus stil
celkern verwijderen
melkkliercel in rust eicel elektrisch activeren
beide cellen met elkaar in contact brengen
cellen smelten samen in elektrisch veld
draagmoeder Na vijf maanden draagtijd wordt Dolly geboren.
eicel groeit uit tot een embryo implantatie in de baarmoeder van een draagmoeder
DOLLY
103
