METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Nutrisi dan Laboratorium Nutisi Ternak Perah Fakultas Peternakan IPB Bogor dan di Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor. Waktu pelaksanaan mulai bulan Februari 1997 sampai dengan September 1998. Penelitian I Pengujian Potensi Mikroba Rumen Kambing Peranakan Etawa asal Kaligesing (PEK) terhadap Kecernaan Kaliandra in Vitro Penelititan ini bertujuan untuk menguji potensi mikroba rumen kambing PEK (K) dalam mencerna pakan kaliandra (Calliandra calothyrsus). Sebagai pembandingnya (kontrol), maka digunakan kambing yang diberi pakan 100% kaliandra salama labih dari 6 bulan (A), kambing yang diberi pakan 100% rumput gajah (R). Persiapan Empat ekor ternak kambing dipersiapkan dan dipelihara di kandang individual di lokasi Kandang Penellitian ternak domba BPT Ciawi. Dua ekor diberi pakan 100% kaliandra dan dua ekor diberi pakan 100% rumput gajah. Pemberian jumlah pakan dan air minum tidak dibatasi, pemberian dilakukan dua kali pada pagi dan sore. Sisa pakan dibuang keesokan harinya dan diganti dengan yang baru. Kaliandra diberikan dalam bentuk potongan bagian daun dan batang terkecilnya, sedangkan rumput gajah diberikan dalam bentuk potongan ukuran 2-5 cm. empat ternak tersebut dipelihara dengan perlakuan tersebut salama 6 bulan, dan kemudian setelah melewati waktu tersebut ternak siap diambil cairan rumennya untuk bahan inokulum percobaan in vitro. Dua ekor kambing PEAK yang berumur 6 dan 8 bulan didatangkan dari Desa Pandanrejo Kecamatan Kaligesing Kabupaten Purworejo Jawa Tengah. Kedua ekor kambing tersebut dikarantina selama dua minggu di Balai Penelitian
Ternak Ciawi. Setelah dikarantina kemudian ditempatkan di kandang individual bersama empat ekor kambing lainnya. Dua ternak ini diberi pakan 100% kaliandara, dua hari kemudian siap diambil cairan rumennya untuk bahan inokulum percobaan in vitro. Perlakuan Pemberian senyawa poly ethylene glicol (PEG) dalam pakan bertanin terbukti terbaik dalam meredam efek negatif tanin, namun karena bahan ini masih mahal maka tidak ekonomis untuk dilakukan di lapangan. PEG mampu mengikat tanin sehingga tanin tidak sempat bereaksi dengan zat makanan. Kemampuan mikroba dalam rumen kambing yang diuji dalam mengatasi tanin, perlu diketahui kemampuannya bila ditanbahkan PEG, sehingga diketahui potensi maksimumnya. Dalam penelitian ini cairan rumen yang berasal dari kambing PEK (K) kambing berpakan 100% kaliandra (A), dan kambing berpakan 100% rumput gajah (R) merupakn perlakuan utama, sedangkan penambahan PEG pada cairan rumen merupakan perlakuan yang menyisipi perlakuan utama. Perancangan penelitian untuk tahap ini adalah Acak Kolompok berpola faktorial 3×2, yaitu: 1.
Faktor pertama K = Cairan rumen kambing PEK A = Cairan rumen kambing berpakan 100% kaliandra R = Cairan rumen kambing berpakan 100% rumput gajah
2.
Faktor kedua P = Penambahan PEG 0 = Tanpa Penambahan PEG
Percobaan in Vitro Cairan rumen untuk percobaan ini diambil dengan metode oral, yaitu pengambilan melalui mulut menggunakan selang. Pengambilan cairan rumen dilakukan pada pagi hari sebelum diberi pakan. Cairan rumen ditampung dalam thermos kapasitas 400 ml. Thermos didisi penuh cairan rumen dengan tujuan untuk mengondisikan agar cairan rumen tetap dalam keadaan anaerob. Cairan
rumen dalam thermos socepatnnya di bawa ke laboratorium untuk digunakan dalam percobaan in vitro. Percobaan in vitro menggunakan metode Tilley and Terri (1963) yang dimodifikasi oleh Close and Menke (1985). Tabung polypropilene 50 ml digunakan sebagai tabung fermentor. Tabung tersebut telah sebelumnya diisi tepung daun kaliandra sebanyak 0.5 g.
Takaran penggunaan PEG adalah
sebanyak 2 kali kandungan tanin tepung daun kaliandra. Kandungan tanin daun kaliandra 8%, sehingga pemberian PEG adalah 16%. Setiap tabung yang telah disiapkan sesuai perlakuan, ditambahkan 30 ml campuran larutan MC Dougall dan cairan rumen dengan rasio 4:1. Tabung tanpa sampel tepung kaliandra disiapkan (tabung yang ini disebut blangko), kemudian di perlakukan sama dengan lainnya. Residu dari blangko selanjutnya dalam penghitungan kecernaan kaliandra,
menjadi pengurang (koreksi) residu kecernaan pakan. Dengan
demikian terdapat 6 tabung perlakuan dan 3 blangko. Percobaan ini dilakukan dalam dua stage, maka tabung yang dipergunakan menjadi 12 tabung dengan 6 blangko. Tabung sebanyak itu untuk mendapatkan satu peubah. Larutan campuran Mc Dougall dan cairan rumen terus menerus dialiri gas CO2 untuk menjamin kodisi anaerob. Selanjutnya campuran tersebut diisikan dalam tabung fermentor, kemudian segera ditutup dengan sumbat karet berkatup (katup berfungsi sebagai pelepas gas hasil fermentasi). Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 39 0C selama 48 jam dalam shaker bath (stage 1). Stage 1 merupakan tiruan (artificial) proses pencernaan fermetatif di rumen. Akhir Stage 1, tutup tabung dibuka. Tabung-tabung yang diperuntukkan mendapatkan kecernaan pada stage 1, selanjutnya isi tabung disaring dengan kertas saring merk Whatman no 41 menggunakan pompa vakum. Residu yang diperoleh dianalisis lebih lanjut untuk memperoleh peubah kecernaannya. Sedangkan tabung-tabung yang diperuntukkan untuk uji kecernaan pada stage 2, maka setiap tabung ditambahkan berturut-turut 2 ml HCl 4 N dan 0.06 g pepsin (merk Sigma). kemudian diinkubasi kembali pada suhu 39 0C selama 48 jam dalam shaker bath. Akhir stage 2, isi tabung disaring dengan kertas saring Whatman no 41, residunya
dianalisis lebih lanjut untuk mendapatkan peubah kecernaan. Stage 2 merupakan tiruan (artificial) proses pencernaan hidrolisis enzimatias di pasca rumen. Jumlah tabung dan kapasitas tampung tabung dalam shaker bath yang terbatas menyebabkan percobaan ini menggunakan perancangan Acak Kelompok. Waktu pengambilan cairan rumen sebagai kelompok, maka prosedur di atas diulang tiga kali dalam waktu yang berurutan. Peubah yang Diamati Peubah kecernaan diamati dalam dua Stage. Pada Stage 1 (fase fermentatif) diamati peubah kecernaan bahan kering (BK), bahan organik (BO), protein (P), serat deterjen netral (neutral detergent fiber/NDF), dan Serat Deterjen Asam (acids detergent fiber/ADF). Peubah yang diamati pada Stage 2 (fase fermentatif dan enziamtis) adalah BK, BO, dan P. Analisis statistik Penelitian ini didesain dengan rancangan acak kelompok (RAK) dengan waktu pengambilan cairan rumen merupakan kelompok. Perlakuan diulang tiga kali. Data yang diperoleh dianalisis statistik menggunakan analisis ragam. Perbedaan antar perlakuan diuji dengan uji jarak berganda Duncan (Steel &Torrie, 1993).
Penelitian II Isolasi Bakteri Cairan Rumen Kambing PEK Penelitian tahap ini merupakan upaya isolasi bakteri rumen kambing PEK yang mempunyai potensi toleran terhadap kehadiran tanin dan diharapkan mempunyai kemampuan menguraikan senyawa tersebut. Prosedur ini terdiri dari isolasi koloni, pemurnian, identifikasi, dan penyimpanan.
Isolasi Koloni 1.
Pembiakkan Bakteri pada Media Cair Disiapkan empat tabung berisi 10 ml media biakan cair (broth) brain heart infusion (BHI) yang masing-masing mengandung asam tanat 1%, 1,5%, 2%, dan 3% . Ke dalam masing-masing tabung dimasukkan 0.5 ml cairan rumen kambing PEK. Mikroba yang terdapat dalam cairan dibiakkan dalam empat tabung tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 39 0C selama 24 jam. Asam tanin membentuk kompleks dengan zat makanan dalam media BHI dalam bentuk gumpalan, oleh karena itu agar terjadi kontak antara mikroba dengan tanin maka dilakukan pengocokan secara periodik dengan vorteks selama satu menit. Pengocokan dilakukan selama masa inkubasi yaitu setiap 10 menit pada 3 jam pertama, setiap 30 menit pada 3 jam kedua, dan setiap 3 jam pada inkubasi selanjutnya.
2.
Pembiakkan Bakteri pada Media Agar Pada akhir inkubasi masing-masing biakan diencerkan 100 kali secara serial hingga lima kali dengan cara mengencerkan 0.05 ml biakan kedalam 5 ml media cair BHI, selanjutnya dari campuran tersebut diencerkan kembali sebanyak 0.05 ml ke media cair BHI, demikian seterusnya hingga lima kali pengenceran (serial). Pada pengenceran ke-3 (106 kali), ke-4 (108 kali), dan ke5 (109 kali) msing-masing diambil 0.1 ml untuk dimasukkan dalam 7 ml media biakan beragar BHI dalam keadaan cair dengan suhu 47 0C (dengan demikian pengenceran ke-3 menjadi 107 kali, ke-4 menjadi 109 kali, dan ke-5 1011 kali), kemudian dengan cepat tabung tersebut diputar horizontal dalam alat pemutar (roller) sambil dialiri air dingin, sehingga media beragar dalam bentuk cair itu segera membeku membentuk lapisan agar tipis merata dinding tabung. Dengan cara tersebut bakteri menempel dam menyebar merata dalam agar. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator pada suhu 39 0C selama 2-3 hari. Bakteri yang menempel pada agar akan tumbuh membentuk koloni. Koloni dapat dilihat langsung dengan mata (visual), oleh karena itu koloni ini dapat diamati bentuk, warna, dan ukurannya. Pembentukan koloni akan terlihat rapat dan padat pada pengenceran rendah dan akan jarang atau bahkan tidak ada pada
pengenceran tertinggi.
Pada pengenceran padat kita akan mendapatkan
sejumlah jenis kelompok koloni, sedangkan untuk mempermudah pengambilan koloni sebagai isolat serta mempermudah pemurniannya dapat dilakukan pada pengenceran tinggi (kerapatan koloni yang jarang). Kelompok koloni yang tidak terdapat pada pengenceran tinggi diambil pada pengenceran yang lebih rendah. Penentuan Isolat Penggunaan level asam tanin dimaksudkan untuk memperoleh isolat bakteri yang mampu hidup pada beberapa level konsentrasi tanin. Bakteri yang dapat tumbuh pada level tanin tertinggi merupakan harapan sebagai isolat terbaik. Koloni-koloni bakteri yang terbentuk pada setiap level konsentrasi tanin dipilah-pilah sehingga didapatkan beberapa kelompok koloni. Kolompok koloni yang tumbuh pada level tertinggi ditetapkan sebagai kelompok koloni terpilih. Dari setiap kelompok koloni terpilih diambil satu koloni sebagai isolat. Setiap koloni isolat diambil dengan ose untuk dibiakkan ke dalam 10 ml media cair BHI (diinkubasi pada suhu 39 0C selama 24 jam). Dengan demikian diperoleh beberapa biakan isolat, dan biakan itu selanjutnya dilakukan pemurnian. Pemurnian isolat Koloni isolat-isolat yang telah dibiakkan pada 10 ml media cair BHI, kemudian dibiakan lagi pada 7 ml media agar BHI setelah dilakukan pengenceran (teknik pembiakan pada media agar ini sama seperti pada tahap isolasi). Koloni yang terbentuk diamati keseragamannya. Bila koloni-koloni bakteri yang tumbuh pada media agar BHI masih ada koloni Bakteri yang tidak sama dengan ciri fisik koloni bakteri isolatnya, maka dilakukan pengambilan (menggunakan ose) satu koloni bakteri yang sama dengan ciri fisik koloni bakteri isolatnya kedalam 10 ml media cair BHI untuk dibiakkan kembali (diinkubasi 39 0C selama 24 jam). Biakan dalam media cair ini kembali dibiakkan pada media agar untuk dilihat keseragaman koloninya. Bilamana pengamatan belum terlihat seragam maka kembali salah satu koloni dibiakan dalam media 10 ml media cair BHI dan diamati keseragaman koloninya pada media agar, demikian prosedur ini dilakukan
berulang-ulang hingga koloni-koloni bakteri yang tumbuh pada media agar dinyatakan seragam. Setelah dinyatakan seragam maka satu koloni bakteri isolat diambil dengan ose dan dibiakkan pada 10 ml media cair BHI yang mengandung 1% asam tanin (inkubasi 39 0C selama 24 jam) untuk disimpan. Penyimpanan Biakan isolat bekteri yang murni dalam 10 ml media cair BHI mengandung 1% asam tanat, diambil sebanyak 6 ml dicampur 2 ml larutan gliserol 80% (3:1), dan selanjutnya campuran ini disimpan dalam freezer (suhu beku). Karakterisasi Isolat Karakterisasi isolat meliputi: 1.
Morfologi Isolat Pengamatan morfologi dilakukan dengan metode pewarnaan gram.
2. Aktivitas Isolat terhadap Pembeningan Tanin Disediakan 10 ml media agar BHI mengandung 1% asam tanat dan 1% tanin terkondensasi dalam botol kaca kapasitas 100 ml, media membeku dibagian dasar setebar 2-3 mm. Biakan dari penyimpanan (stock) ditumbuhkan sebanyak 0.1 ml pada 10 ml media cair BHI mengandung 1% asam tanat (diinkubasi 39 0
C 24 jam). Biakan tersebut di teteskan pada bagian tengah media agar,
kemudian posisi botol segera dibalikan sehingga media agar menggantung atau terlerak di bagian atas selanjutnya diinkubasi 39 0C sema 3-5 hari. Koloni bakteri akan tumbuh dan bilamana terjadi aktivitas pembeningan tanin maka di sekitar koloni bakteri terjadi area yang berwarna bening (clearing zone) yang menunjukkan bahwa isolat mempunyai aktivitas yang bereaksi atas kehadiran tanin. 3.
Aktivitas Pemanfaatan Sumber Karbon Sumber karbon yang digunakan adalah glukosa, fruktosa, galaktosa, xylosa, sukrosa, maltosa, selulosa, selobiosa, dan pati. Sebanyak satu takar spatula (±0.001 gram) dimasukkan dalam 10 ml media cair non karbon. Sebanyak 0.1 ml biakan isolat dibiakkan pada media yang mengandung sumber-sumber karbon tadi, kemudian diinkubasi 39 0C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan
pada tingkat kekeruhan yang terjadi pada biakan media sumber-sumber karbon itu dengan membandingkan dengan blangkonya (media cair non karbon tanpa penambahan sumber karbon).
Penelitian III Pengujian Kemampuan Isolat terhadap Pengurangan Kadar Tanin Terkondensasi dalam Media Khusus (Defined Media) Penelitian ini bertujuan untuk menguji kemampuan isolat dalam menurunkan kadar tanin terkondensasi dalam media biakannya, atau dengan kata lain isolat diuji kemampuannya mendegradasi tanin terkondensasi. Media biakan untuk pengujian ini digunakan media khusus. Media ini tidak mengandung zat-zat yang dapat bereaksi dengan tanin -seperti protein dan karbohidrat- membentuk senyawa kompleks. Pasokan makanan untuk mikroba berupa vitamin-vitamin, mineral-mineral, dan tanin terkondensasi. Media khusus dikemas dalam 10 ml dengan kandungan tanin tekondensasi 1% dalam tabung Hungate. Isolat-isolat dari penyimpanan (freezer) dibiakan sebanyak 0.1 ml dalam 10 ml media cair BHI kemudian diinkubasi 39 0C 24 jam. Selanjutnya biakan dihitung jumlah bakteri yang hidup melalui metoda penghitungan koloni. Setelah diketahui jumlah bakteri hasil pembiakan, maka kembali isolat dibiakan kembali dengan cara yang sama. Isolat-isolat hasil biakan ditransfer ke media khusus denga jumlah satuan bakteri sebanyak 107. Dengan demikian volume media biakan berbeda untuk setiap isolat akan tetapi mempunyai jumlah satuan bakteri yang sama, untuk tujuan tersebut maka media biakan yang jumlah bakterinya padat diencerkan dengan media khusus. Isolat-isolat dalam media khusus dibiakkan dalam inkubator bersuhu 39 0C. Satu jenis isolat akan ditumbuhkan dalam 7 tabung media khusus. Tujuh tabung tersebut digunakan untuk mengamati peubah yang diukur dalam seri waktu (time series) 0, 4, 8, 12, 18, 24, dan 48 jam masa inkubasi. Isolat dalam media khusus diinkubasi dengan suhu 39 0C. Peubah yang diukur adalah:
1.
Kadar tanin tekondensasi Analisis tanin ini dilakukan dengan metoda Presipitasi-protein (Hagerman & Butler, 1978).
2.
Pengamatan fraksi-fraksi senyawa fenolik (komponen senyawa tanin) Analisis menggunakan HPLC merk Waters, recorder Sic Cromatocorder, dan Kolom menggunakan Novapak
TM
C18. Panjang gelombang 280, flow rate 0,9
ml/menit, eluen menggunakan 40% Methanol.
Penelitian IV Inokulasi Isolat ke dalam Ekosistem Rumen Kambing yang tidak pernah Mengkonsumsi Kaliandra terhadap Kecernaan Kaliandra in Vitro Penelitian ini bertujuan menguji pengaruh inokulasi isolat bakteri terhadap ternak yang tidak terbiasa mengkonsumsi pakan kaliandra –dalam hal ini ternaknya adalah kambing berpakan 100% rumput gajah- terhadap kecernaan kaliandra. Penelitian ini dilakukan secara in vitro. Isolat diinokulasikan pada tabung fermentor yang berisi 30 ml larutan McDougall-Cairan rumen kambing berpakan tumput gajah (4:1), dan 0.5 g tepung kaliandra sebagai sumber karbon. Dosis isolat yang diinokulasikan adalah 108 cfu/ml media fermentor. Isolat dari penyimpanan (stock) dibiakkan sebanyak 0.1 ml dalam 10 ml media cair BHI, diinkubasikan 39 0C 24 jam. Kemudian pertumbuhan jumlah bakteri diamati dengan metode pencacahan koloni dalam media agar BHI. Jumlah koloni yang tumbuh mencerminkan jumlah bekteri yang dapat tumbuh selama 24 jam pada biakan media cair BHI, sehingga dapat ditentukan berapa ml harus diambil dari media biakan tersebut untuk setiap satu tabung fermentor. Dari isolasi diperoleh empat isolat dengan notasi isolat IK1, IK2, IK3, dan IK4. Isolat IK1 tidak dapat hidup kembali setelah dilakukan penyimpanan dengan suhu beku dalam media penyimpanan gliserol (gliserol stock), sehingga hanya ada tiga isolat saja yaitu isolat IK2, IK3, dan IK4. Penelitian ini terdiri dari dua bagian, yaitu:
1. Pengaruh inokulasi masing-masing bakteri terhadap kecernaan kaliandra, dengan notasi perlakuan sebagi berikut. IIK2
= Inokulasi isolat bakteri rumen II asal kambing Kaligesing
IIK3
= Inokulasi isolat bakteri rumen III asal kambing Kaligesing
IIK4
= Inokulasi isolat bakteri rumen IV asal kambing Kaligesing
Peubah yang diamati adalah kecernaan bahan kering dan organik pada Stage 1. Percobaan ini bertujuan memilih isolat terbaik dari ketiga isolat, dengan demikian diperoleh satu isolat unggulan. 2. Berdasarkan pertimbangan atas hasil perlakuan inokulasi di atas, serta didukung kinerjanya berdasarkan pengujian sebelumnya, maka isolat IK4 ditetapkan sebagai isolat terbaik. Isolat IK4 ini kemudian diperbandingkan lagi dengan beberapa perlakuan lain untuk melihat gambaran potensi atau kemampuannya secara lebih jauh dan mendalam. Semua perlakuan menggunakan inokulum cairan rumen yang berasal dari kambing berpakan rumput gajah, kecuali perlakuan K. Perlakuan K menggunakan cairan rumen kambing Kaligesing. Perlakuan K dimaksudkan untuk melihat sejauh mana tingkat keberhasilan inokulasi dibanding keadaan asalnya sebagai kontrol positif. Peubah kecernaan bahan kering dan bahan organik diamati pada stage 1 dan 2. Peubah pH dan NH3 diamati pada stage 1 dengan waktu inkubasi 0, 3, dan 6 jam. Analisis Statistik Penelitian ini ddidesain dengan rancangan acak kelompok (RAK) dengan waktu pengambilan cairan rumen merupakan kelompok. Perlakuan diulang tiga kali. Data yang diperoleh dianalisis statistik menggunakan analisis ragam. Perbedaan antar perlakuan diuji dengan Uji Jarak Berganda Duncan (Steel & Torrie, 1993)
Prosedur Analisis Sampel Penelitian 1.
Analisis Total Tanin dengan Metode Presipitasi Protein a. Pembuatan Pereaksi -
Larutan Buffer Asetat pH 5 Menimbang 27.2 g CH3COONa·3H2O, dicampurkan dengan 9.945 g NaCl, lalu dilarutkan dengan air suling sampai volumenya 700 ml. Selanjutnya diukur sampai pH 5 dengan ditambahkan asam asetat 0.2 M (11.4 ml asam asetat galcial/liter air) sedikit demi sedikit sampai akhirnya menjadi 1 liter larutan.
-
Larutan SDS-TEA Larutan natriumdodedihidrogen sulfat 1% dan trietanolamin 5% dibuat dalam air suling. Kemudian masing-masing dicampurkan dengan perbandingan 1:1
-
Larutan FeCl3 0.01 M dalam asam korida 0.01 N Ferriklorida ditimbang sebanyak 0.4055 g lalu dilarutkan HCl 0.01 N sampai volumenya menjadi 250 ml.
-
Larutan Standar Bovine Serum Albumin (BSA) Ditimbang sebanyak 100 mg BSA lalu dilarutkan dengan larutan buffer asetat pH 5, sampai volumenya menjadi 50 ml di dalam labu ukur. Larutan standar BSA ini berkonsentrasi 2 mg/ml.
b. Prosedur Analisis Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 9.l methanol 50% dan diaduk dengan vorteks. Larutannya lalu dipipiet sebanyak 1 ml kedalam tabung reaksi yang lain dan ditambahkam 1 ml BSA. Setelah itu dibiarkan selama 20 menit di ruang pendingin (bertemperatur 5 0C), kemudian dipusingkan selama 15 menit dengan
3000
rpm.
Cairannya
dibuang
dan
endapannya
dicuci
menggunakan larutan buffer asetat pH 5 sebanyak 3 kali dengan meneteskan secara perlahan melalui dinding tabung reaksi. Endapan dilarutkan dengan 4 ml SDS-TEA dan ditambah 1 ml larutan FeCl3 dalam HCl. Campuran dikocok dengan vorteks lalu didiamkan selama 20 menit
pada temperatur kamar. Serapannya diukur pada panjang gelombang 510 m. Larutan standar dibuat dengan melarutkan 50 mg asam tanat dengan Metanol absolut (konsentrasi 1 mg/ml). dibuat deret standar dengan cara memipet larutan induk di atas sebanyak 0, 1, 2, 3, 4, dan, 5 kemudian dijadikan 10 ml. larutan standar tersebut mempunyai konsentrasi 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; dan0,5 mg/ml. kemudian dipipet sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml larutan standar BSA berkonsentrasi 2 mg/ml, selanjutnya dilakukan cara kerja seperti pada sampel. Warna larutan yang diperoleh adalah ungu kehitaman. c.
Perhitungan % Tanin = Faktor pengenceran X mg/ml sampel X 100%
2. Analisis Konsentrasi N-Amonia Sampel yang berupa cairan rumen atau cairan yang diambil dari tabung fermentor pasca inkubasi dipusingkan dengan 5000 rpm pada suhu 5 0C selama 15 menit. Supernatan diambil untuk dianalisis. Konsentrasi N-Amonia dalam cairan rumen ditentukan dengan metode mikridifusi Conway. Sebanyak 1 ml supernatan cairan rumen diletakan dalam salah satu sisi sekat cawan Conway dan pada sisi lainnya diletakan 1 ml larutan NaOH jenuh. Posisi cawan Conway diletakkan sedemikian rupa sehingga keduanya tidak tercampur sebelum cawan ditutup rapat. Pada bagian tengah diletakan 1 ml larutan asam borat berindikator methylene blue (indikasi warna biru). Cawan lalu ditutup rapat dengan bantuan vaselin. Supernatan dan larutan NaOH jenuh dicampur rata dengan menggoyang cawan. Amonia yang dibebaskan dari reaksi akan ditangkap oleh asam borat, menjadi amonium borat. Perubahan dari asam borat menjadi amonium borat, terindikasi dengan terjadinya perubahan warna dari biru menjadi merah. Setelah 24 jam, amonium borat dititrasi dengan H2SO4 0.005 N sampai terjadi perubahan warna ke warna asalnya (biru). Kadar amonia dihitung dengan rumus berikut:
N-Amonia (mM) = jumlah ml H2SO4 X Nilai N H2SO4 X 1000 3.
Prosedur Pencacahan Populasi Bakteri Populasi bakteri rumen dihitung dengan menggunakan metode pencacahan koloni dimana yang diperhitungkan hanya bakteri hidup. Prinsip penghitungannya adalah cairan rumen diencerkan secara serial lalu dibiakan dalam media agar BHI dalam tabung Hungate. Untuk keperluan pembiakan, diperlukan media tumbuh yang spesifik untuk semua jenis bakteri yang akan dibiakkan. Media tersebut terlebih dahulu disiapkan dengan prosedur sebagai berikut. Bahan-bahan media dicampur dan dimasukkan ke dalam botol yang telah disterilkan dengan autoclave. Campuran tersebut dipanaskan perlahanlahan sambil dialiri gas CO2 sampai terjadi perubahan warna coklat menjadi merah pada suhu 121 0C selama 15 menit dengan tekanan 1.2 kgf/cm2. Setelah siap digunakan untuk pembiakkan bakteri, media agar dimasukkan kedalam penangas air pada suhu 47 0C, yaitu suhu dimana agar belum memadat dan untuk waktu yang singkat tidak mematikan bakteri. Untuk setiap sampel cairan rumen dibutuhkan tiga tabung Hungate yang berisi media di atas. Sampel yang berupa media kultur atau cairan rumen diencerkan terlebih dahulu dengan media pengenceran (Ogimoto & Imai, 1981). Pengenceran dilakukan sebagai berikut: 0.1 ml sampel dimasukkan kedalam 9.9 ml media pengenceran, selanjutnya dari tabung tersebut diambil 0.1 ml lagi dan dimasukkan kedalam 9.9 ml media pengenceran yang lain. Demikian seterusnya dilakukan hingga lima kali (lima seri tabung). Salanjutnya dari masing masing seri tabung pengenceran diambil sibanyak 0.1 ml untuk dimasukkan ke dalam media agar yang disimpan pada bak pemanas bersuhu 47 0C. Segera setelah dimasukkan tabung segera di putar dengan alat pemutar (roller) pada posisi horizontal dengan dialiri air dingin supaya media agar cepat memadat dan membentuk lapisan tipis merata di dinding tabung bagian dalam. Selanjutnya tabung diinkubasi selama 3-7 hari pada suhu 39 0C. Pada
selang waktu itu di lapisan tipis agar itu terbentuk koloni-koloni bakteri yang tumbuh. Apabila tabung seri yang kelima terdapat n koloni, maka jumlah bakteri sampel yang diamati adalah = n/0.1 × 1010 bakteri/ml.
Komposisi dan Prosedur Pembuatan Media 1.
Media Khusus(Defined Media) Larutan mineral I a)
6.0 ml
Larutan mineral II b)
6.0 ml
Henin + 1,4 napthaquinone c)
1.0 m
Trace elemen d)
l0.5 ml
Sodium karbonat 5%
1.5 ml
Resazurine 0,1%
0.05 ml
Amonium klorida
0.375 g
Asam kasamino
0.15 g
larutan VFA
e)
Larutan Vitamin f)
0.31 ml 4.00 ml
Semua bahan (kecuali sodium karbonat dan larutan vitamin) dicampur dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan air destilata sampai menjadi 91 ml. pH ditepatkan pada nilai 7.75 dengan menambahkan KOH 10 nM, lalu ditambahkan 5% sodium karbonat, dan terakhir ditambahkan larutan vitamin. a) Larutan mineral I: K2HPO4
592 g
Aquades
500 ml
b) Larutan mineral II: KH2PO4
3.54 g
NaCl
0.89 g
MgSO4·7H2O
1.875 g
MnCl2·4H2O
0.1 g
CoCl2·6H2O
0.001 g
Na2SO4
4.15 g
CoCl2·2H2O
1.596 g
Aqudes
500 ml
c) Hemin + 1,4-naphthaquinone: 50 g hemin ditambah 10 mg 1,4-napthaquinone dilarutkan dalam 1 ml NaOH 1 N, lalu ditambahkan air desilata sampai mencapai volume 100 ml. d) Trace elemen: ZnSOP4·7H2O
10 g
H3BO3
10 g
Na2MoO4·2H2O
10 g
NiCl2·6H2O
5g
CuSO4·5H2O
5g
Al2(SO4)3
2g
FeSO4
10 g
Aqudes
100 ml
e) VFA: Asam asetat
17 ml
Asam propionat
6 ml
Asam n-butirat
4 ml
Asam n-butirat
1 ml
Asam n-valerat
1 ml
Asam i-valerat
1 ml
f) Larutan vitamin Biotin
2.5 mg
Asam folat
2.5 mg
Asam para aminobensoat
2.5 mg
Sianokobalamin
2.5 mg
Ca-panthotenat
20 mg
Nikotinamid
20 mg
Riboflavin
20 mg
Thiamin-HCL
20 mg
2.
3.
Pyrydoxamine
20 mg
Asam lipoik
2 mg
Aquades
300 ml
Media Brain Heart Infusion (BHI) BHI powder
3.7 g
Glukosa
0.005 g
Selobiosa
0.005 g
Pati
0.005 g
Cystein
0.005 g
Hemin (0.05%)
2.5 ml
Larutan Mc Dougall a.
b.
c.
Larutan mineral mikro CaCl2·2H2O
13.2 g
MnCl2·4H2O
10 g
CoCl2·6H2O
1g
FeCl3·6H2O
8g
Aquades
100 ml
Buffer rumen NH4HCO3
4g
NaHCO3
35 g
Aquadest
1000 ml
Larutan mineral makro Na2HPO4
5.7 g
KH2PO4
6.2 g
MgSO4·7H2O
0.6 g
Aquades
1000 ml
d. Resazurin 0.1% e.
Larutan pereduksi NaOH 1N
4 ml
Na2S·9H2O
635 ml
Aquadest
95 ml
f.
Pembuatan: 400 ml aquades, 200 ml buffer rumen, 200 ml larutan makro, 0.1 ml larutan mikro, 1 ml resazurin, dan 40 ml larutan pereduksi dicampurkan. Jumlah komposisi ini untuk mendapatkan larutan Mc Dougall sebanyak 841.1 ml. Campuran ini kemudian dialiri gas CO2 secara terus menerus hingga warna asal campuran yang berwarna merah akan berubah menhadi tidak berwarna (bening).
4.
Media Pengenceran Larutan mineral I a)
7.5 ml
Larutan mineral II b)
7.5 ml
Cystein-HCl·H2O
0.05 g
Na2CO3
0.3 g
Resazurin 0.1%
0.1 ml
Aquades
100 ml
a) Larutan mineral I K2HPO4
0.6 ml
Aquades
100 ml
b) Larutan mineral II NaCl
1.2 g
(NH4)2SO4
1.2 g
KH2PO4
0.6 g
CaCl2
0.12 g
MgSO4·7H2O
0.25 g
Aquades
100 ml
