Agrovýzkum Rapotín s.r.o. Výzkumníků 267 787 01 Vikýřovice
Uplatněná metodika MSM 6278846201 UMM 1 (typ výsledků S – „Uplatněná metodika“)
Metoda stanovení Mycoplasma bovis v bazénovém a individuálním vzorku mléka
Zpracovala dne: 1.10.2008
RNDr. Marcela Vyletělová, Ph.D. Agrovýzkum Rapotín s.r.o.
Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od 1.12. 2008
I) Cíl uplatněné metodiky: Cílem uplatnění metodiky je zvýšení hygienické kvality syrového mléka a zajištění jejich mikrobiologické kvality, zdravotní nezávadnosti mléka jako suroviny a mléčných výrobků. Způsobem využití je zavedení nových mikrobiologických sledování do praxe jak v prvovýrobě mléka, tak u zpracovatelů mléka, dále identifikace patogenu Mycoplasma bovis v bazénových a individuálních vzorcích syrového mléka při vyšetření na podezření zánětu mléčné žlázy a zamezení jeho šíření do zdravé populace zvířat.
II) Vlastní popis metodiky Technická řešení a postupy předkládané uplatněné metodiky byly převážně podpořeny a vyvinuty z výsledků vlastního výzkumu a vývoje, které byly publikovány. 1) Úvod – Mycoplasma bovis Bakterie rodu Mycoplasma jsou nejmenší samostatně se replikující známé organismy. Jsou všudypřítomné jako saprofyti nebo paraziti lidí, savců, plazů, ryb, členovců a rostlin (Razin, 1992).
Mykoplasmy nemají buněčnou stěnu, pouze plasmatickou membránu,
jednoduchý genom a mají, ve srovnání s ostatními skupinami bakterií, limitovaný metabolismus (Razin a kol., 1998). Absence buněčné stěny a buněčných proteinů činí mykoplasmy resistentní k antibiotikům, které mají vazbu na buněčné proteiny ve stěně (Rosenbusch, 1994). Bez ohledu na jejich jednoduchý genetický potenciál a celkový obraz jsou důležitými mikroorganismy a jsou považovány za jeden z hlavních patogenů ve veterinární medicíně na celém světě (Razin, 1985; Razin a kol., 1998). Bovinní mastitida způsobená bakteriemi rodu Mycoplasma je vysoce kontagiózní onemocnění, které má za následek ztrátu mléka a brakování nakažených zvířat. Velmi často je tento typ zánětu mléčné žlázy obtížně rozeznatelný ve stádě a je rozšířen i do zdravého stáda prodejem infikovaných zvířat. První zprávy o tomto onemocnění se objevily ve Spojených státech roce 1961 ve státě Connecticut (Hale a kol., 1962). Mykoplasma byla následně odpovědná za výskyt řady mastitid v mléčném stádě ve státě New York. Kmen, který byl izolovaný v těchto případech, byl serologicky identický s kmenem z Connecticutu, a byl později pojmenován jako Mycoplasma bovis. Podobné případy se rovněž objevily v 60 letech v Kalifornii a od té doby byly mykoplasmatické mastitidy diagnostikovány v dalších státech Severní Ameriky. Zpočátku byly mykoplasmy nazývány jako pleuropneumonia (PPLO) podle jejich podobnosti s pleuropneumonií u skotu. Termín PPLO je dosud užívaný pro komerční média
2
pro izolaci mykoplasmat. Produkty metabolismu Mycoplasma spp. dráždí mléčné žlázy, což má za následek zduření tkáně a absenci tvorby mléka. Druhy jako M. bovis, M. californicum, M. canadense, M. bovigenitalium, M. alkalescens, M. argini, M. bovihirnis, M. dispar, bovinní skup. 7 a F-38 mohou způsobit mastitidní onemocnění (Alexander a kol., 1985; Kumar a Garg, 1991). Detekce onemocnění je prováděna na základě vyšetření buď bazénového vzorku mléka, nebo přímo ze struku infikovaného zvířete. Mycoplasma bovis je nejčastěji izolovaným druhem ze všech výše jmenovaných druhů rodu Mycoplasma. Je spojována i s jinými druhy bovinního onemocnění jako např. zmetání u skotu, artritida, pneumonie, zánět spojivek nebo synovitida (Hjerpe a Knight, 1972; Langsford, 1977; O´Berry, a kol., 1966; Jasper, 1982). Onemocnění způsobená bakteriemi rodu Mycoplasma jsou rezistentní vůči antimikrobiální terapii ačkoliv in vitro jsou k některým antibiotikům citlivé (Bushnell, 1984; Boughton, 1979). V naší repulice neexistuje kromě naší laboratoře pracoviště, které by se zabývalo výskytem M. bovis v mléce a mléčných výrobcích. Existuje velmi málo informací i pro výrobce syrového mléka. Jayaro (2001) vypracoval tabulku, která má široké praktické využití. Slouží zemědělcům v prvovýrobě k orientaci o hygienickém stavu chovu (tab. 1). Tabulka 1. Interpretace výsledků kontagiózní mastitidy M. bovis podle výsledků bazénových vzorků mléka (Jayarao, 2001) Pozitivní výsledek u více jak tří vzorků mléka
Navrhovaná opatření
1. Typ stáda: uzavřené stádo, náznaky chronické infekce ve stádě, které by mohla postihnout všechna zvířata jakéhokoliv věku; otevřené stádo, náznaky, že některé z
3. Zvýšena pozornost k nově přijímaným
je nejčastější příčinou onemocnění M. bovis
kusům zvířat
u stáda, které bylo nedávno rozšířené o
4. Zlepšit hygienu dojení
nové kusy zvířat 2. Počet SB je většinou >500,000 /ml, pokud je zde více než 5-10 % krav s mastitidní infekcí
5. Zamezit přenosu z jednoho zvířete na druhé během dojení, infikovaná zvířat dojit nakonec 6. Personál by měl nosit gumové rukavice
Praktické
zkušenosti:
nedostatečný
kontrolní mastitidní program s výskytem Mycoplasma spp. ve stádě včetně telat; hygrom u dospělých zvířat; léčba mastitid bez
2. Separace infikovaných a zdravých zvířat
nových zvířat je zdrojem M.bovis. Tento typ
3.
1. Provést kontrolu celého stáda
pozitivní
odezvy;
dezinfekce
a
7. Používat papírové utěrky. 8. Brakování krav s výskytem mykoplasmat 9. Měsíční monitoring bazénových vzorků na přítomnost mykoplasmat
opakované použití látkových utěrek a kanyl; nedávné rozšíření stáda
3
2) Odběr bazénových vzorků mléka Bazénový vzorek mléka je odebírán do sterilních vzorkovnic a po svozu do laboratoře ihned zpracován nebo uložen do lednice při teplotě 5°C pod dobu 48 – 72 hodin nebo při teplotách -30°C a -80°C. Způsoby a vliv teploty na uložení vzorku jsou podrobněji popsány níže v kapitole 4. Uložení vzorků mléka je důležité pro účely následného vyšetření jednotlivých zvířat na základě pozitivních bazénových vzorků. Pro stanovení M. bovis se používají následující typy bazénových vzorků: a) klasický bazénový vzorek – odebírá se mléko z tanků po ranním nebo večerním dojení. Mléko musí být vychlazené na 10°C a maximálně homogenizované. b) malý bazénový vzorek – mléko je odebráno od určitého počtu zvířat (např. 20 kusů) z celého vemene. Současně s tímto vzorkem jsou odebírány individuální vzorky (viz. kap. 3). Tento způsob vyšetření a identifikace M. bovis je pro zadavatele nejekonomičtější. 3) Odběr individuálních vzorků mléka Vzorky mléka jsou odebírány do sterilních vzorkovnic a mohou být odebrány: a) individuální vzorky směsné - ze všech čtvrtí; b) nebo individuální vzorky - z jednotlivých struků. 4) Uchování vzorků Vzorky mléka pro vyšetření je možné uchovávat při různých teplotách podle způsobu vyšetření: a) teplota 5°C – používá se teplota v případě malých bazénových vzorků mléka. Nejprve se vyšetřuje bazénový vzorek a následně v případě jeho pozitivního nálezu jsou vyšetřeny individuální vzorky, které jsou uloženy v lednici po dobu 48 – 72 hodin. b) teplota -30°C – teplota je vhodná pro uložení vzorků pro opakované vyšetření po dobu 2 týdnů; c) teplota -80°C – teplota je vhodná pro uložení vzorků pro opakovanou analýzu po dobu 5 týdnů (tab. 2). Tabulka 2. Počet kolonií (log CFU/ml) M. bovis při různých úchovných teplotách (Vyletělová, 2006) Týden/teplota
5 °C
-30 °C
-80 °C
0
7,05
7,05
7,05
1
6,95
6,98
7,04
2
6,91
6,89
7,03
3
6,80
6,75
6,97
4
6,79
6,75
6,96
5
6,59
6,75
6,9
4
5) Metoda kultivace M. bovis Vzorek mléka nebo jeho příslušné ředění je vyočkován na povrch agaru Mycoplasma Medium (Oxoid), které je obohaceno o koňské sérum, kvasniční extrakt, DNA, octan thalný a penicilin. Kultivace probíhá při 37°C a 7% CO2 po dobu 72 hodin. Kontrolní odečty se provádějí po 48 hodinách. Pro stanovení přítomnosti je použit mikroskop a zvětšení 16x. Kolonie M. bovis rostou uvnitř média v podobě smažených vajíček. V případě nejasností jsou podezřelé kolonie dále identifikovány do druhů (Razin, 1992).
III) Zdůvodnění novosti postupů Jedná se o implementaci nových dosažených výsledků, které byly získány na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektu MŠMT-ČR, MSM 2678846201 a v rámci koordinační a konzultační metodické činnosti mikrobiologické a molekulární laboratoře a Národní referenční laboratoře pro syrové mléko (NRL-SM) Rapotín, do prostředí prvovýrobců mléka. Metodiku nelze srovnat s jinými postupy, neboť se sledování M. bovis v ČR neprovádí. Cílem této uplatněné metodiky je, vzhledem k úplné absenci informací o stavu výskytu těchto mikroorganismů v mléčné žláze a syrovém mléce v České republice, její praktické využití při monitoringu výskytu Mycoplasma bovis v bazénových vzorcích syrového kravského mléka a individuálních vzorcích při mastitidním onemocnění. Metodika nabízí rychlou a ekonomickou identifikaci a eliminaci nežádoucího patogenu, který v případě rychlého rozšíření představuje velké ekonomické ztráty hlavně pro prvovýrobce mléka. Část výsledků, týkajících se výskytu M. bovis v bazénových a individuálních vzorcích byla již publikována a je uvedena v kap. VI).
IV) Popis uplatnění metodiky Způsobem využití je zavedení nových mikrobiologických ukazatelů do praxe jak v prvovýrobě mléka pro zvýšení hygienické kvality mléka jako suroviny, tak u zpracovatelů mléka pro zajištění mikrobiologické kvality a zdravotní nezávadnosti mlékárenských výrobků. Vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání v písemné formě Ing. Radkovi Musilovi, výkonnému řediteli Svazu výrobců mléka, a.s. Šumperk, dne 3.11.2008. Kontrola aplikace uplatněné metodiky je proveditelná prostřednictvím dokladů a dokumentů (úkolové listy, protokoly) o prováděných pracovních postupech v laboratoři
5
Agrovýzkum Rapotín s.r.o., dále u zadavatele prostřednictvím protokolů nebo objednávek. Uplatněná metodika, která
obsahuje podrobný metodický postup pro uživatele, byla již
v praxi využita prvovýrobci mléka. Je uložena na webové stránce poskytovatele www.vuchs.cz.
V) Seznam použité související literatury ALEXANDER, P.G., SLEE, K.J., MCORIST, S., IRELAND, L., COLOE, P.J. (1985): Mastitis in cows and polyarthritis and pneumonia in calves caused by Mycoplasma species bovine group 7. Aust. Vet. J.: 62-135. BOUGHTON, E. (1979): Mycoplasma bovis mastitis. Vet. Bull., 49:377-391. BUSHNELL, R.B. (1984): Mycoplasma mastitis. Vet. Clin. North. Am., 6: 301-312. HALE, H.H., HELMBOLDT, C.F., PLASTRIDGE, W.N., STULA, E.F. (1962): Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species. Cornell Vet, 52: 582. HJERPE, C.A., KNIGHT, H.D. (1972): Polyarthritis and synovitis associated with Mycoplasma bovis mastitis in feedlot cattle. J. Am. Vet. Met. Assoc. 160: 1414. JASPER, D.E. (1982): The role of mycoplasma in bovine mastitis. J. Am. Vet. Med. Ass. 181: 158-162. JAYARAO, M. (2001): Bovine Practitioner, 23-35. KUMAR, A., GARG, D.N. (1991): Isolation of mycoplasma F-38 from the milk of mastitis cows. Vet. Rec.: 128-429. LANGSFORD E.U. (1977): Mycoplasma agalactiae subsp. bovis in pneumonia and arthritis of bovine. Can. J. Comp. Med.: 41-89. O´BERRY, B.A., BRYNER, J.H., FRANK, A.H. (1966): Isolation of mycoplasma from an aborted bovine fetus and vaginal mucus. Am. J. Vet. Res., 27: 677-699. RAZIN, S. (1985): Molecular biology and genetics of mycoplasmas (Mollicutes). Microbiol. Rev. 49: 419-455. RAZIN, S. (1992): Mycoplasma taxonomy and ecology. In Maniloff J., McElhaney R.N., Finch L.R. a kol.: Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. Washington DC, Amer. Society for Microbiology: 3-22. RAZIN, S., YOGEV, D., NAOT, Y. (1998): Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 1094-1156.
6
ROSENBUSCH, R.F. (1994): Biology and taxonomy of the Mycoplasmas. In Whitford H.W., Rosenbusch R.F., Lauerman L.H. (ed): Mycoplasmosis in animals: Laboratory diagnosis. Ames, Iowa State University Press: 3-11. VYLETĚLOVÁ M. , GONZÁLEZ R.N. (2006): Mycoplasma bovis survival at different storage temperatures. Abstracts book. 2nd FEMS congress of european microbiologists, Integration microbial knowledge into human life. Spain, Madrid, July 4-8, 2006: 323. (MSM 267 884 6201 and MSMT INGO LA 183).
VI) Seznam publikací,které předcházely metodice 1) VYLETĚLOVÁ, M (2004): Mycoplasma bovis jako mastitidní patogen. Sborník: "Aktuální problémy řízení v chovu skotu". Rapotín, 24.11.2004. Agrární komora Olomouc, Okresní Agrární komora Šumperk, Svaz výrobců mléka, a.s. Šumperk, Českomoravská společnost chovatelů, a.s. Praha a Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Rapotín.
2) VYLETĚLOVÁ M. (2006): Výskyt Mycoplasma bovis u klinických mastitid ve státě New York. The occurrence of Mycoplasma bovis within clinical mastitis in state New York. In. „Den mléka 2006” - Sborník referátů z konference s mezinárodní účastí Katedry speciální zootechniky, Katedry kvality zemědělských produktů ČZU Praha. 22.5.2006: 82-83.
3) VYLETĚLOVÁ M. (2006): Výskyt Mycoplasma bovis a jiných původců mastitidního onemocnění dojnic u jedné farmy v ČR. Mycoplasma bovis and other mastitis pathogenes occurrence within one farm in CR. In. „Den mléka 2006” - Sborník referátů z konference s mezinárodní účastí Katedry speciální zootechniky, Katedry kvality zemědělských produktů ČZU Praha. 22.5.2006: 84-86.
4) VYLETĚLOVÁ M. , GONZÁLEZ R.N. (2006): Mycoplasma bovis survival at different storage temperatures. Abstracts book. 2nd FEMS congress of european microbiologists, Integration microbial knowledge into human life. Spain, Madrid, July 4-8, 2006: 323.
7
Ad 1) Mycoplasma bovis jako mastitidní patogen Marcela Vyletělová Agrovýzku, Rapotín s.r.o.
Abstract Mycoplasmas are known as the smallest self-replicating organisms. They have a worldwide distribution as free living saprophytes or as parasites of humans, mammals, reptiles, fish, arthropods, and plants. The absence of the cellwall and cell wall-associated proteins makes mycoplasmas resistant to the action of antibiotics that interact with these proteins. Mycoplasma bovis is the most important agent of outbreaks oc mycoplasmal mastitis in dairy cows. We have investigated 752 samples of raw milk. There ar the results of identification of the single mastitis pathogens at the table 1. The most occurrence was found out for bacteria genus Staphylococcus (187; S. aureus 40), Mycoplasma bovis (119), genus Streptococcus (93; S. agalactiae 3), and E. coli (47). Mycoplasma bovis was observed with others pathogens in 75 cases. But we aren´t able to determine if there exists some correlation because of the different frequency of the identificated pathogens.
Obecná charakteristika Bakterie rodu Mykoplasma jsou nejmenší samostatně se replikující známé organismy. Jsou všudypřítomné jako saprofyti nebo paraziti lidí, savců, plazů, ryb, členovců a rostlin. Mykoplasmy nemají buněčnou stěnu, pouze plasmatickou membránu, jednoduchý genom a mají, ve srovnání s ostatními skupinami bakterií, limitovaný metabolismus. Absence buněčné stěny a buněčných proteinů činí mykoplasmy resistentní k antibiotikům, které mají vazbu na buněčné proteiny ve stěně. Bez ohledu na jejich jednoduchý genetický potenciál a celkový obraz jsou důležitými mikroorganismy a jsou považovány za jeden z hlavních patogenů ve veterinární medicíně na celém světě.
Mechanismus patogenese Díky své jedinečnosti a vazbě na hostitelskou buňku mohou mykoplasmy způsobit chronická onemocnění u člověka i zvířat. Četné způsoby interakce s hostitelskou buňkou a důmyslný genetický mechanismus zřejmě hrají hlavní roli v patogenezi mykoplasmatických infekcí. Mykoplasmy mají typické různé povrchové lipoproteiny (Vsps) na vnější straně
8
plasmatické membrány, které jsou silnými stimuly hostitelského obranného mechanismu. Mohou hrát rozhodující roli jako prostředníci při adherenci na epiteliální buňky, jako jeden z mechanismů vyvolávající mykoplasmatickou infekci a také při úniku před imunitním systémem hostitelské buňky (Chambaud et al., 1999; Behrens et al., 1994).
Mycoplasma a mastitida Bovinní mastitida způsobená bakteriemi rodu Mycoplasma je vysoce kontagiózní onemocnění, které má za následek ztrátu mléka a brakování nakažených zvířat. Velmi často je tento typ zánětu mléčné žlázy obtížně rozeznatelný ve stádě a je rozšířen i do zdravého stáda prodejem infikovaných zvířat. První zprávy o tomto onemocnění se objevily ve Spojených státech roce 1961 ve státě Connecticut. Zpočátku byly mykoplasmy nazývány jako pleuropneumonia (PPLO) podle jejich podobnosti s pleuropneumonií u skotu. Termín PPLO je dosud užívaný pro komerční média pro izolaci mykoplasmat. Produkty metabolismu Mycoplasma spp. dráždí mléčné žlázy, což má za následek zduření tkáně a absenci tvorby mléka. Druhy jako M. bovis, M. californicum, M. canadense, M. bovigenitalium, M. alkalescens, M. argini, M. bovihirnis, M. dispar, bovinní skup. 7 a F-38 mohou způsobit mastitidní onemocnění (Alexander et al., 1985; Kumar et Garg, 1991). Detekce onemocnění je prováděna na základě vyšetření buď bazénového vzorku mléka, nebo přímo ze struku infikovaného zvířete. Mykoplasma bovis je nejčastěji izolovaným druhem ze všech výše jmenovaných druhů rodu Mycoplasma. Je spojována i s jinými druhy bovinního onemocnění jako např. zmetání u skotu, artritida, pneumonie, zánět spojivek nebo synovitida (Hjerpe et Knight, 1972; Langsford, 1977; O´Berry, et al., 1966; Jasper, 1982).
Výskyt Mycoplasma bovis u zánětů mléčné žlázy Z rozsáhlého souboru vzorků (752), které byly vyšetřeny na zánět mléčné žlázy, bylo celkem identifikováno 547 různých patogenů (tab. 1). Nejčastěji se vyskytovaly bakterie rodu Staphylococcus (187), Mycoplasma bovis (119), Streptococcus (93) a Escherichia coli (47). Dále byl specifikován výskyt M. bovis a ostatních mastitidních patogenů ve stejném vzorku mléka. Z výsledků v tabulce 1 je zřejmé, že se M. bovis vyskytovala v 75 případech spolu s ostatními patogeny. Vzhledem k tomu, že frekvence výskytu jednotlivých identifikovaných patogenů jsou rozdílné, v některých případech i velmi nízké, nelze s určitostí tvrdit, zda existuje korelace mezi M. bovis a ostatními patogeny při zánětu mléčné žlázy.
9
Tabulka 1: Identifikace a výskyt izolovaných kmenů při zánětu mléčné žlázy celkem
M. bovis + jiný druh
M. bovis + jiný druh ( %)
Streptococcus agalactiae
3
2
66,7
Streptococcus spp.
90
17
18,9
Staphylococcus aureus
40
3
7,5
Staphylococcus spp.
147
17
11,6
Escherichia coli
47
7
14,9
Klebsiella oxytoca
25
9
36,0
Pasteurella spp.
2
0
0
G- bacillus
19
5
26,3
Yest
7
3
42,9
A. pyogenes
8
3
37,5
C. bovis
7
1
14,3
G+ Bacillus
9
4
44,4
C. species
16
2
12,5
Enterobacter cloacae
2
2
100
Citrobacter
1
0
0
nespecifikované
1
0
0
kontaminace
4
0
0
Mycoplasma
119
75
-
Celkem (bez kontaminace)
543
75
13,8
Literatura ALEXANDER, P.G., SLEE, K.J., MCORIST, S., IRELAND, L., COLOE, P.J. (1985): Mastitis in cows and polyarthritis and pneumonia in calves caused by Mycoplasma species bovine group 7. Aust. Vet. J.: 62-135. BEHRENS A., KELLER M., H KIRCHHOFF H., YOGEV D., ROSENGARTEN R. (1994): A family of phaseand size-variant membrane surface lipoprotein antigens (Vsps) of Mycoplasma bovis. HJERPE, C.A., KNIGHT, H.D. (1972): Polyarthritis and synovitis associated with Mycoplasma bovis mastitis in feedlot cattle. J. Am. Vet. Met. Assoc. 160: 1414. CHAMBAUD I., HENRI WRÓBLEWSKI H., BLANCHARD A. (1999): Interactions between mycoplasma lipoproteins and the host immune system. Trends in Microbiology. Volume 7, Issue 12, 1 December 1999, Pages 493-499. JASPER, D.E. (1982): The role of mycoplasma in bovine mastitis. J. Am. Vet. Med. Ass. 181: 158-162. KUMAR, A., GARG, D.N. (1991): Isolation of mycoplasma F-38 from the milk of mastitis cows. Vet. Rec.: 128-429. LANGSFORD E.U. (1977): Mycoplasma agalactiae subsp. bovis in pneumonia and arthritis of bovine. Can. J. Comp. Med.: 41-89. O´BERRY, B.A., BRYNER, J.H., FRANK, A.H. (1966): Isolation of mycoplasma from an aborted bovine fetus and vaginal mucus. Am. J. Vet. Res., 27: 677-699.
10
Ad 2) Výskyt Mycoplasma bovis u klinických mastitid ve státě New York Marcela Vyletělová Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín Summary We have investigated the occurrence of Mycoplasma bovis and other mastitis pathogens within 752 individual milk samples of clinical mastitis from several New York State dairy farms I year 2002. There were determined 363 positive samples and identified 543 isolated microorganisms in total. The most frequently occurrence was obtained for Staphylococcus aureus and Staphylococcus spp. (187), then Mycoplasma bovis (119), Streptococcus spp. and S. agalactiae (93), Escherichia coli (47), Klebsiella oxytoca (25), Actinomyces pyogenes (8), Corynebacterium bovis (7), yeasts (7) and other microorganisms. Four milk samples were too contaminated for following identification. We have found out the occurrence of M. bovis along with other pathogens in 75 cases. There it is impossible to aver if here exists the correlation between M. bovis and other pathogens (within the mastitis disease) with regard to the different and low (in some cases) frequency of identified pathogens.
Úvod První zprávy o mykoplasmatických mastitidách se objevily ve Spojených státech v roce 1961 ve státě Connecticut. Mykoplasma byla následně odpovědná za výskyt řady mastitid v mléčném stádě ve státě New York. Druh, který byl izolovaný v těchto případech, byl později pojmenován jako Mycoplasma bovis. Podobné případy se rovněž objevily v 60. letech v Kalifornii a od té doby byly mykoplasmatické mastitidy diagnostikovány v dalších státech Severní Ameriky. Její výskyt v této oblasti je značně vysoký. V dnešní době se ve veterinárních laboratořích státu New York běžně diagnostikuje vedle jiných mastitidních patogenů i M. bovis jak v bazénových, tak individuálních vzorcích mléka. Jednou z laboratoří je Quality Milk Production Services (Servis výroby kvalitního mléka), Fakulta veterinární medicíny Cornellovy univerzity v Ithace, NY, USA, kde jsme získali první zkušeností s metodu vyšetření a identifikací M. bovis. Materiál a metody V průběhu dvou měsíců roku 2002 byl sledován výskyt bakterií rodu Mycoplasma ve 32 bazénových vzorcích mléka z různých chovů ve státě New York. Chovatelé sami odebírali mléko jednak z mléčných tanků, jednak individuální směsné vzorky od podezřelých dojnic, u kterých vykazovalo mléko abnormální složení – vločkovitý charakter, vodnatý
vzhled,
částečky krve, a nakonec od podezřelých zvířat. Tyto individuální vzorky mléka byly zamraženy při -30°C, uchovávány po dobu tří dnů a v případě pozitivního výsledku
11
bazénových vzorků byly rozmraženy při pokojové teplotě a dále analyzovány. Celkem tak bylo následně vyšetřeno 752 individuálních vzorků. Vzorek mléka nebo jeho příslušné ředění byl vyočkován na povrch Modified Hayflick’s agaru, které bylo obohaceno o koňské sérum, kvasniční extrakt, DNA, octan thalný a penicilin. Kultivace proběhla při 37°C a 7% CO2 po dobu 72 hodin. Kontrolní odečty se provedly po 48 hodinách. Pro stanovení přítomnosti byl použit mikroskop a zvětšení 16x. Výsledky a diskuse Z rozsáhlého souboru vzorků (752), které byly vyšetřeny na zánět mléčné žlázy, bylo celkem identifikováno 543 izolovaných mikroorganismů (tab. 1). Nejčastěji se vyskytovaly bakterie rodu Staphylococcus (187), Mycoplasma bovis (119), rod Streptococcus (93) a Escherichia coli (47). Dále byl specifikován výskyt M. bovis a ostatních mastitidních patogenů ve stejném vzorku mléka. M. bovis se vyskytovala v 75 případech spolu s ostatními patogeny. Vzhledem k tomu, že frekvence výskytu jednotlivých identifikovaných patogenů jsou rozdílné, v některých případech i velmi nízké, nelze s určitostí
tvrdit, zda existuje
korelace mezi M. bovis a ostatními patogeny při zánětu mléčné žlázy. Tabulka 1. Identifikace a výskyt izolovaných kmenů při zánětu mléčné žlázy
celkem
M. bovis + jiný druh
M. bovis + jiný druh ( %)
Mycoplasma
119
75
-
Str. agalactiae
3
2
66,7
Streptococcus spp.
90
17
18,9
Staphylococcus aureus
40
3
7,5
Staphylococcus spp.
147
17
11,6
Escherichia coli
47
7
14,9
Klebsiella oxytoca
25
9
36,0
Pasteurella spp.
2
0
0
G- bacillus
19
5
26,3
Kvasinky
7
3
42,9
A. pyogenes
8
3
37,5
C. bovis
7
1
14,3
G+ Bacillus
9
4
44,4
C. species
16
2
12,5
Enterobacter cloacae
2
2
100
Citrobacter
1
0
0
nespecifikované
1
0
0
kontaminace
4
x
x
Celkem (bez kontam.)
543
75
13,8
12
Ad 3) Výskyt Mycoplasma bovis a jiných původců mastitidního onemocnění dojnic u jedné farmy v ČR Vyletělová M. Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.
Summary Mycoplasma bovis and other mastitis pathogenes occurrence within one farm in CR We have found out positive occurrence of Mycoplasma bovis within one farm in ČR. In consequence, we have investigated all of dairy cows in this farm. There were investigated 464 cows in total and subsequently identified 76 isolated species. From the results is evident that the most frequently isolated strain was S. xylosus (15), then S. haemolyticus (14), S. aureus (9), S. uberis (9), S. dysgalactiae (5), S. chromogenes (2), E. faecalis (1), E. coli (1) and L. garvieae (1). Some isolates were identified only in genus Streptococcus (8) and Staphylococcus (2). There were 6 positive samples on occurrence of yeasts and 3 samples were contaminated with molds. All of isolated species of genus Staphylococcus were sensitive to kanamycin and tetracyklin. Úvod Bovinní mastitida způsobená bakteriemi rodu Mycoplasma je vysoce kontagiózní onemocnění, které má za následek ztrátu mléka a brakování nakažených zvířat. Mléko má vodnatý charakter, někdy s jemnými zrnky a může být přítomná i krev. Velmi často je tento typ zánětu mléčné žlázy obtížně rozeznatelný ve stádě a je rozšířen i do zdravého stáda. M. bovis je spojována i s jinými druhy bovinního onemocnění jako např. zmetání u skotu, artritida, pneumonie, zánět spojivek nebo synovitida. Onemocnění způsobená bakteriemi rodu Mycoplasma jsou rezistentní vůči antimikrobiální terapii ačkoliv in vitro jsou k některým antibiotikům citlivé. V ČR neexistuje (kromě naší laboratoře) pracoviště, které by se zabývalo výskytem M. bovis v syrovém mléce. Materiál a metody V rámci monitoringu zdravotního stavu dojnic byly v roce 2006 vyšetřeny všechny dojnice uvnitř jedné farmy. Tato farma byla vybrána na základě pozitivního výskytu M. bovis při běžném vyšetření na podezření mastitidního onemocnění. Celkem bylo vyšetřeno 464 dojnic. Vzorky mléka byly odebírány pracovníky farmy ze všech struků do sterilních vzorkovnic. Po svozu do mikrobiologické laboratoře byly bezprostředně analyzovány. Vyšetření na M. bovis může probíhat dvěma způsoby. Provádí se buď individuální vyšetření mléčné žlázy, nebo se z ekonomických důvodu analyzuje nejdříve vzorek z mléčného tanku a při pozitivním nálezu se zpětně provádí rozbor individuálních vzorků mléka. V současné době 13
vyšetřujeme v naší laboratoři jednotlivá zvířata. Pro kultivaci je používán Mycoplasma Agar Base (OXOID) a inkubace se provádí při 36°C/5 dnů při CO2 atmosféře. Pro kultivaci ostatních mastitidních patogenů (rodu Staphylococcus, Streptococcus apod.) byl použit Blood Agar Base (OXOID), Edwards Medium, Modified (HiMedia) a Endo Agar (HiMedia), inkubace proběhla při 36°C/24 hod. Vedle výše uvedených mikroorganismů byl u vzorků zjišťován výskyt kvasinek, které byly kultivovány na Sabouraud Dextrose Agar (HiMedia) při 36°C/2 dny. Identifikace izolovaných druhů byla provedena na STAPHYtest16, STREPTOtest 16 a ENTEROtest 16 (PLIVA-Lachema). Výsledky a diskuse Z výsledků identifikace jsme zjistili, že nejčastější izolovaným druhem byl S. xylosus (15). Tento druh nepatří mezi běžně izolované patogenní mikroorganismy během mastitidního vyšetření. S. xylosus, který je charakterizovaný jako koaguláza-negativní a novobiocin rezistentní druh, se řadí mezi podmíněně patogenní druhy (podobně jako S. chromogenes). Vyskytuje se spíše na lidské, ale mnohem častěji na zvířecí kůži, v prostředí a pouze ojediněle může způsobit nějaká infekční onemocnění. Dalším izolovaným druhem je S. haemolyticus (14) a teprve pak následují dva nejčastěji izolované druhy při vyšetření mléčné žlázy v naší laboratoři S. aureus (9) a S. uberis (9). Ostatní výsledky identifikace jsou uvedeny v tabulce 1. Během plošného vyšetření nebyl potvrzen žádný další výskyt Mycoplasma bovis. U šesti krav jsme zjistili pozitivní výskyt kvasinek a u tří vzorků byla zjištěna plíseň, která zřejmě pochází z prostředí (z krmiva) a není původcem nebo doprovodnou mikroflórou mastitidního onemocnění. V tabulce 2 jsou uvedeny výsledky některých izolovaných druhů k vybraným antibiotikům. Co se týče bakterií rodu Staphylococcus byly všechny citlivé na kanamycin, tetracyklin a většinou na cephalexin, neomycin, cefoperazone a cloxacilin. Citlivost nebo rezistence ostatních identifikovaných druhů je značně rozmanitá (tab. 2). Tabulka 1: Výsledky mastitidního vyšetření Staphylococcus xylosus
15 Escherichia coli
1
Staphylococcus haemolyticus
14 Lactococcus garvieae
1
Staphylococcus aureus
9
Streptococcus spp.
8
Streptococcus uberis
9
Staphylococcus spp.
2
Streptococcus dysgalactiae
5
kvasinky
6
Staphylococcus chromogenes
2
plíseň
3
Enterococcus faecalis
1
Celkem
76
14
Tabulka 2: Výsledky citlivosti vybraných identifikovaných druhů PEN STR NEO NOV CLE CFP AMP CLX AMC LIN KAN TET
Staphylococcus xylosus + + + Staphylococcus xylosus + + + Staphylococcus haemolyticus + + + + Staphylococcus haemolyticus + + Staphylococcus haemolyticus + v Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus + + + Staphylococcus aureus v + Staphylococcus aureus + + + + Streptococcus uberis v Streptococcus uberis + Streptococcus uberis Streptococcus uberis + Streptococcus uberis + + Streptococcus uberis v Streptococcus dysgalactiae + + + Streptococcus dysgalactiae v + Staphylococcus chromogenes + + + + Enterococcus faecalis + Escherichia coli Lactococcus garvieae v v Streptococcus spp. + (Příspěvek je podporován projektem pro MŠM 267 884 6201)
+ + + + + + + + + + + + v + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + v + + + v + + + + + v +
+ v + + + + + + + + + + + v + + + v v -
+ + + + + + + + + + + + + + v v + + + -
+ + + v + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + v +
+ + + + + + + + + + + + + + + + v -
+ + + + + + + + + + + + + + v + + + v v -
15
Ad 4) Mycoplasma bovis survival at different storage temperatures Vyletelova M1, González RN2, Hanuš O1 1
RICB and Agriresearch Ltd, Rapotín, Czech Republic. 2QMPS, CU Ithaca, New York, USA
Determination of total count of Mycoplasma bovis at three storage temperatures
Two studies were performed to investigate the survival of Mycoplasma bovis in 11 milk samples (obtained from cases of clinical mastitis from several New York State dairy farms) at three storage temperatures (5°C, -30°C and -80°C). In both studies, milk samples were cultured on Modified Hayflick’s agar and the results were expressed as the geometric mean of colony forming units per milliliter (CFU/ml) of milk for the 11 samples. Mycoplasma bovis survival in the first study (figure 1) In the first study and for temperatures 5°C, -30°C and -80°C, the total number of CFU/ml of milk was recorded at the time of culturing the milk sample for the first time in the laboratory and for storage times of one and five weeks. Results were as follows: 1) Temperature of 5°C: total number of Mycoplasma bovis CFU/ml decreased from the initial value 1,13 x 107 CFU/ml to 8,9 x 106 CFU/ml (one week) and to finally 3,9 x 106 CFU/ml (five weeks); 2) Temperature of -30°C: from the initial value 1,13 x 107 CFU/ml, colony counts for M. bovis decreased to 9,50 x 106 CFU/ml (first week) and to 5,7 x 106 CFU/ml (five weeks); 3) Temperature of -80°C: from the initial value of 1,13 x 107 CFU/ml, the number of M. bovis decreased to 1,11 x 107 CFU/ml after samples were stored for one week. At the end of the study, the M. bovis count was 9,8 x 106 CFU/ml. ; Mycoplasma bovis survival in the second study (figure 2) In the second study and for storage temperatures of -30°C and -80°C, milk samples were prepared for culture every week by repeatedly defrosting, bringing them up to room temperature and refreezing. In this case, the decreasing number of M. bovis colony counts was more apparent. Results were as follows: 1) Temperature of -30°C: the initial value of 1,13 x 107 CFU/ml decreased to 2,2 x 106 CFU/ml after 5 weeks; 2) Temperature of -80°C: the initial and final (five weeks) values were 1,13 x 107 CFU/ml and 7,9 x 106 CFU/ml, respectively. The results (figure 3) From the aforementioned results, it is evident that colony counts for M. bovis decreased in milk samples with prolonged storage time, higher storage temperatures (especially refrigeration at 5°C) and continuous defrosting and refreezing at -30°C. We have
16
find out that the temperature -80°C seams to be for M. bovis survival the best in case if the samples are prepared for each analysis. Figure 1: The growth of Mycoplasma bovis at temperatures of 5°C, -30°C and -80°C. The identical samples were analyzed weekly - for every week and temperatures -30°C and -80°C was prepared a frozen sample. The value log CFU/ml = log of the geometric mean of 11 samples 7,10 7,00
log CFU/ml
6,90 6,80 6,70
5 °C -30 °C
6,60
-80 °C 6,50 0
1
2
3
4
5
w eek
Figure 2: The growth of Mycoplasma bovis at a temperature of 5°C, - 30 °C and -80 °C. The samples for the temperature of - 30 °C and -80 °C were repeatedly frozen and defrosted. The values CFU/ml = log of the geometric mean of 11 samples 7,20
7,00
log CFU/ml
6,80
6,60
5 °C -30 °C
6,40
-80 °C
6,20 0
1
2
3
4
5
w eek
Figure 3: Mycoplasma bovis survival at the different storage conditions (samples F–D = repeated defrosting and refreezing) 7,20 7,00
log CFU/ml
6,80 6,60
5 °C -30 °C
6,40
-80 °C -30 °C D-F
6,20
-80 °C D-F 6,00 5,80 1
2
3
4
5
6
w eek
17
Předání Uplatněné metodiky Vyvinutá Uplatněná metodika byla předána uživateli výsledku v tištěné a elektronické podobě.
Za autora metodiky:
Za uživatele:
RNDr. Marcela Vyletělová, Ph.D.
Ing. Radek Musil
Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.
Svaz výrobců mléka a.s., Šumperk
Datum: 3.11.2008
18
