MENDLOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDLOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

DIPLOMOVÁ PRÁCE

BRNO 2011

Soňa Beržinská

Mendlova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

MONITORING IZOFLAVONŮ V PRODUKTECH SÓJI Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

prof. RNDr. Bořivoj Klejdus, Ph.D.

Bc. Soňa Beržinská

Brno 2011

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Monitoring izoflavonů v produktech sóji vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendlovy univerzity v Brně. Dne .......................................................... Podpis diplomanta ...................................

PODĚKOVÁNÍ

Na tomto místě bych velmi ráda srdečně poděkovala vedoucímu diplomové práce prof. RNDr. Bořivoji Klejdusovi, Ph.D. za cenné rady a materiál pro vyhotovení diplomové práce, dále za informace a odborné vedení během analytického stanovení a zpracování dat.

ABSTRAKT Cílem této diplomové práce je analyzovat obsah izoflavonů v sójových produktech běžně dostupných v obchodní síti v České republice. V teoretické části byla popsána historie a biologie sóje. Dále byly popsány izoflavony z hlediska struktury a funkce. Na teoretickou část navazuje praktická část, ve které byli diskutovány metody používány v analýze izoflavonů. Hlavní části optimalizace metody pro měření izoflavonů v produktech sóji a měření provedené na vzorcích ze sójových potravin běžně používaných v České republice. Získané výsledky byly vyhodnoceny a diskutovány s výsledky dosaženými v jiných studiích. Na závěr je zhodnocena vhodnost použití optimalizované analytické metody pro studium izoflavonů a zformulováno doporučení ohledně konzumace sójových produktů. Klíčová slova: sója, sójové potraviny, izoflavony, fytoestrogeny, kapalinová chromatografie

ABSTRACT The aim of this diploma thesis is to analyze the content of isoflavones in soy products commonly available in the Czech Republic. The theoretical part describes the history and biology of soy. In addition, isoflavones have been described in terms of structure and function. The theoretical part is followed by a practical part in which methods used in the analysis of isoflavones are discussed. The main part is a description of the actual measurements performed on samples of foods commonly used in the Czech Republic. The discussion was an evaluation of the measurement results, which were compared with results obtained in other studies. Finally, it is assessed the suitability of optimalized analytical method for the study of isoflavones. Also recommendations on the consumption of soy products are formulated. Key words: soy, soy foods, isoflavones, phytoestrogens, liquid chromatography

OBSAH 1 ÚVOD...........................................................................................................................10 2 CÍL PRÁCE..................................................................................................................11 3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY (LITERÁRÁNÍ PŘEHLED)....12 3.1 Sója.......................................................................................................................12 3.1.1 Historie pěstování sóje..................................................................................12 3.1.2 Sója v České republice..................................................................................14 3.1.3 Biologie sóje..................................................................................................14 3.1.4 Využití sóje...................................................................................................15 3.1.5 Složení a nutriční hodnota sóje.....................................................................16 3.1.6 Zdravotní účinky sóje....................................................................................18 3.2 Potravinářské výrobky ze sóji...............................................................................18 3.2.1 Výrobky z bobů.............................................................................................19 3.2.2 Nefermentované výrobky ze sóji...................................................................22 3.2.3 Fermentované výrobky ze sóji......................................................................24 3.2.4 Doplňky výživy.............................................................................................26 3.3 Sekundární metabolity..........................................................................................27 3.3.1 Flavonoidy.....................................................................................................28 3.3.2 Fytoestrogeny................................................................................................31 3.3.3 Izoflavony.....................................................................................................34 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ.................................................................43 4.1 Přehled metod studia izoflavonů...........................................................................43 4.1.1 Předběžná příprava vzorků............................................................................44 4.1.2 Extrakce.........................................................................................................45 4.1.3 Detekce a identifikace...................................................................................48 4.2 Experimentální část...............................................................................................53 4.2.1 Výběr vzorků.................................................................................................53 4.2.2 Předběžné zpracování....................................................................................54 4.2.3 Extrakce.........................................................................................................54 4.2.4 Chromatografická analýza.............................................................................56 4.2.5 Detekce..........................................................................................................58 4.2.6 Vyhodnocení chromatografu.........................................................................58 4.2.7 Statistická analýza.........................................................................................59 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE.............................................................................60 5.1 Výsledky měření izoflavonů ve vzorcích sójových produktů...............................60 5.1.1 Porovnání extrakčních technik......................................................................60 5.1.2 Hodnocení přesnosti systému HPLC-DAD..................................................61 5.1.3 Vyhodnocení výsledků HPLC-DAD analýzy izoflavonů.............................62 5.2 Obsah izoflavonů v sójových bobech...................................................................63 5.3 Obsah izoflavonů v sójové mouce........................................................................66 5.4 Obsah izoflavonů v granulátu a v sójových kostkách...........................................68 5.5 Obsah izoflavonů v sójovém nápoji......................................................................70 5.6 Obsah izoflavonů v doplňku výživy.....................................................................72 6 ZÁVĚR.........................................................................................................................75 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.............................................................................76 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK.............................................................................81

SEZNAM OBRÁZKŮ....................................................................................................82 SEZNAM GRAFŮ..........................................................................................................82 SEZNAM TABULEK.....................................................................................................82 SEZNAM PŘÍLOH.........................................................................................................83 PŘÍLOHY........................................................................................................................84

1 ÚVOD Během posledních dvaceti let se pozoruhodné množství studií zaobíralo účinky konzumace sójových produktů na lidské zdraví. Velká část těchto výzkumů byla věnována přítomnosti izoflavonů v sóji a jejich podílu na zdravotních účincích. Od první izolace přirozeně se vyskytujících derivátů izoflavonů již uplynula značná doba a díky rozsáhlému vědeckému bádání se stali tyto heterocyklické sloučeniny dobře známými produkty rostlinné říše. Tato diplomová práce zkoumá obsah izoflavonů v nejčastěji konzumovaných sójových výrobcích na Českém trhu. V teoretické části bude popsáná historie, biologie a složení sóje. Dále pak bude nabídnut přehled sójových potravin. Navazovat bude popis fytoestrogenů, speciálně izoflavonů včetně jejich fyziologických účinků a metabolismu. V praktické části bude provedena optimalizace metody pro studium izoflavonů . Následně budou analyzovány izoflavony ve vybraných sójových potravinách pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s detektorem diodového pole. Výsledky měření budou zhodnoceny a porovnány s výsledku jiných studií a s daty USDA Database on the Isoflavone Content of Selected Foods.

10

2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je laboratorní analýza vybraných sójových produktů, které jsou nejběžnější na Českém trhu a nejpopulárnější u Českých spotřebitelů. Předmětem laboratorní analýzy jsou fytoestrogenní komponenty sóje – izoflavony. Cílem práce je také na základě výsledků analýzy a studia vlivu izoflavonů na lidské zdraví zhodnotit význam těchto látek vzhledem ke stravovacím zvyklostem v České republice.

11

3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY (LITERÁRÁNÍ PŘEHLED) 3.1 Sója Slovo „sója“ pochází z japonského slova „shoyu“, které se poprvé objevilo v Japonském slovníku publikovaném v roce 1597 (Hymowitz, 2008). Tato jednoletá keříčkovitá rostlina je nazývána zázračnou rostlinou, rostlinným masem či rostlinou budoucnosti. V Číně je známá pod názvy jako Žlutý klenot, Nebeské ptáče nebo Veliký poklad. Z oblasti svého původu se rozšířila do celého světa a stala se nepostradatelnou plodinou. Velké množství odrůd plodí semena různých tvarů, velikostí a barev. Neoblíbenější a pro přípravu jídel nejvhodnější je sója žlutá. (Strosserová 2009) Sója je po kukuřici, pšenici a rýži čtvrtá nejrozšířenější plodina na světě. Mezi luskovinami o olejninami je nejpěstovanější. Je výbornou předplodinou, přispívá k udržení úrodnosti půdy (díky své vysoké schopnosti vázat atmosférický dusík symbiózou s baktériemi), je neocenitelná nejen ve výživě lidí a zvířat, ale také v průmyslu. 3.1.1 Historie pěstování sóje Sója pochází ze severovýchodní Asie, kde se pěstovala už tři tisíce let před naším letopočtem. O datování první zmínky o sóji se dodnes vedou diskuse. Nejčastěji uváděným prvním pramenem pojednávajícím o sóji je kniha známá jako „Pen-Ts'aoKong-Mu“ datovaná do roku 2838 př. n. l. Tento dokument popisuje rostliny v Číně za vlády císaře Shennonga. (Morse 1950 cit. podle Zemánková 1991a Hymowitz 2008) Podle Hymowitze (2008) je tento údaj pouhou legendou a ve své práci uvádí, že začátek pěstování sóje se pravděpodobně nikdy nepodaří určit blíže, než na oblast východní poloviny severní Číny o něco dříve než jedenácté století př. n. l. Lingvistické, geografické a historické důkazy již spolehlivě ukazují, že jako domestikovaná rostlina se sója uplatňovala během vlády dynastie Zhou (1125 – 256 př. n. l.). Tradiční způsoby pěstování a zpracování sóje se v Číně udržely po několik tisíciletí. V prvním století našeho letopočtu se sója rozšířila ze severní Číny do Koreje a jižní Číny. Další rozšíření bylo zaznamenáno do do Indonésie, Japonska, Malajsie, Myanmaru, Nepálu a Severní Indie, Filipín, Thajska a Vietnamu. Tyto oblasti se označují jako sekundární genová 12

centra. Rozšiřování sóje po oblastech Asie studovali Hymowitz a Kaizuma a vytvořili podrobnou migrační mapu znázorněnou v publikaci Soybeans: Chemistry, Production, Processing, and Utilization ( Hymowitz, 2008) Prvním Evropanem konzumujícím sóju byl podle Hymowitze (2008) Marco Polo kolem roku 1300 n. l., i když sóju nezmiňuje. Během následujícího půl století se ojediněle vyskytli nenápadné zmínky od různých mořeplavců a botaniků. Pro Evropu představil sóju švédský botanik Carl von Linné v Holandsku v roce 1737. V té době se ale pořád ještě neprosadila jako kulturní plodina. Do Ameriky ji pak přivezl Samuel Bowen v polovině osmnáctého století. (Zemánková, 1991) V Evropě se postupně začala pěstovat v severní Itálii, Francii, Německu a v Maďarsku. Největším stoupencem sóje v Evropě byl profesor Haberland z Královské Univerzity ve Vídni. V roce 1854 byli v Japonsku vypěstované dvě odrůdy: odrůda s bílými semeny a odrůda s červenými semeny. Tyto se začali s úspěchem vyvážet. Ještě do druhé světové války byla hlavním dodavatelem sóji pro celý svět Čína. Po druhé světové válce se ale největším pěstitelem staly Spojené státy americké. Od šedesátých let rostla produkce sóji také v Jižní Americe, kde byla největší expanze zaznamenána v posledním desetiletí. Dnes s USA o vedoucí pozici na globálním trhu soupeří Brazílie i Argentina. (Orsillo, 2009) Poptávka po rostlinách bohatých na olej a bílkoviny výrazně vzrostla na začátku sedmdesátých let. Hlavním důvodem byla špatná úroda podzemnice olejné v zemích afrického Sahelu, klesající úroda ve Spojených státech a rostoucí poptávka v tehdejším Sovětském svazu. Cena sóji stoupla v roce 1973 během šesti měsíců o 150%. K dalšímu prudkému zvýšení poptávky po sóji došlo v Evropě po roce 1996 a to v důsledku krize vyvolané bovinní spongiformní encefalopatií (BSE). Evropská unie tehdy zavedla zákaz zkrmování zpracovaných živočišných bílkovin, který výrazně ovlivnil poptávku po rostlinných bílkovinách. Posledním ekonomicky významným faktorem, který měl vliv na rozšíření sóje v Evropě byla snížená dostupnost rybí moučky, ke které došlo v důsledku stoupající poptávce chovatelů ryb. (Orsillo, 2009) Mezi lety 1950 a 2000 se v důsledku populační exploze a světového hospodářského vzestupu produkce masa zvýšila na pětinásobek. Důsledek zvýšené spotřeby masa byl výrazný hlavně v Číně, která se v průběhu deseti let z hlavního světového vývozce stala největším dovozcem. Sója se velice dobře prosadila také v 13

Jižní Americe a v krátké době se stala nejdůležitějším vývozním artiklem pro čtyři jihoamerické státy: Brazílii, Argentinu, Paraguay a Bolívii. V Evropě se sója pěstuje ve všech jižních státech, ale také v Polsku a Švédsku. Nejúspěšnější je Itálie, kde výnosy sóji dosahují nejlepší světové hodnoty (až 3,5 tun na hektar). (Flohrová 2001) V roce 1994 byla ke komerčnímu užití v USA schválena první geneticky modifikovaná odrůda sóji (GMO sója), odolná vůči působení herbicidu Roundup. 3.1.2 Sója v České republice První pokusy pěstovat sóju v Čechách se uskutečnili asi půl století po jejím úspěchu v Americe. V roce 1934 se sója pěstovala na ploše 1500 hektarů. Výnosy v té době kolísali od 1,2 do 3 tun na hektar. Snaha o zvýšení zastoupení sóje v rostlinné výrobě se projevila i po druhé světové válce, většímu rozvoji ale bránil nedostatek odrůd vhodných do našich klimatických podmínek. V posledním desetiletí byli v Kanadě vyšlechtěny nové odrůdy, které jsou přizpůsobeny klimatickým podmínkám, podobným jako u nás. (Flohrová 2001) V současnosti se sója v ČR pěstuje na 1,8% orné půdy. Areál pěstování sóje se v České republice nachází především na jižní Moravě (Dolnomoravský a Dyjskosvratecký úval) a v Polabské nížině. Přestože je rozlohou pěstování sója plodinou malou, zaujímá na trhu významné postavení. Důvodem je její využití jak pro lidskou výživu tak pro krmné účely. Význam sóje nejvíce narostl po jejím zavedení jako náhrady masokostní moučky. Od roku 2000 se zaznamenává neustálý trend zvyšování produkce sóji v ČR. Státní podpora produkce spočívá v podpoře nákupu osiva pro pěstitele sóji. Nemalý význam má také podpora Evropské unie. (Potměšilová 2005) Sklizňová plocha sóji v ČR v letech 1999 až 2006 pravidelně meziročně rostla, v letech 2007 a 2008 došlo k poklesu sklizňové plochy a v roce 2009 k opětovnému nárůstu na úroveň cca 6000 ha. (Zehnálek et al. 2010) 3.1.3 Biologie sóje Sója patří z hlediska biologického i agrotechnického mezi luštěniny, v hospodářském členění produkce rostlinné výroby je ale řazena mezi olejniny. (Peterová, 2005) Přísluší do rodu Glycine, který je členem rodiny Fabaceae/Leguminosae (leguminózy), 14

podrodiny Papilionoideae a kmene Phaseoleae. Kmen Phaseoleae obsahuje členy s prokazatelnou důležitostí jako zdroje potravy a krmiva. V tomto kmenu se nachází šestnáct rodů z podkmenu Glycininae, které jsou dále rozděleny podle morfologických vazeb do dvou skupin – Glycine a Shutaria. (Hymowitz, 2008). Sója je jednoletá rostlina. Běžně dorůstá do jednoho metru, ale za vhodných podmínek může dosáhnout až 1,5 metru. Roste 90 až 120 dnů. Sója má jednoduché primární listy, sekundární listy jsou většinou trojčetné. Kořenový systém je hlíznatý a sestává z hlavního kořenu, z kterého vyrůstají postranní kořeny. Většina kultivarů je na povrchu pokryta jemnými trichomy. Kvete drobnými, do hroznu uspořádanými bílými až fialovými květy. Plodem je lusk. Lusky jsou rovné nebo lehce zakřivené a dosahují délky od 2 do 7 cm. Semena jsou většinou oválná, ale existují kultivary s plochými či protáhlými semeny. Sója je dvouděložná samosprašná rostlina a komerčně se pěstuje ze semene. (Flohrová, 2001 a Rychlík, 2004) Svými výnosy patří k stabilním plodinám. Lusky kulturní sóji dosahují běžně délky 2-7 cm a v nich obsahují převážně oválná semena. Lusky obsahují jedlé boby s obsahem bílkovin a olejů. Schematický nákres rostliny sóje a kořenového systému znázorňuje obrázek 1.

Obr.1: Sója luštinatá (Glycine max (L.) Merrill.) a kořenový systém s asociovanými rhizobiemi. (převzato od Sobek, 2011 a Livingstone, 1996) 3.1.4 Využití sóje Sója nabízí veliké množství způsobů využití. Slouží nejen jako potravina ale také jako krmivo i surovina pro zpracovatelský průmysl (chemie, farmacie, potravinářství).

15

Průmyslové využití zahrnuje širokou škálu výrobků od izolačních a plastických látek, přes oleje až po barvy, laky a fermeže. Zároveň pěstování, studium, zušlechťování a zpracování sóje dává celosvětově zaměstnání milionům lidí. Vzhledem k tomu, že Evropa není v produkci sóji soběstačná, je tato plodina strategickou surovinou ve vzájemném obchodu Evropy s Amerikou. (Rychlík, 2004) Zpracování sóje pro potravinářské účely a přehled potravinářských výrobků ze sóje jsou popsány v kapitole 3.3.1. Význam sóje jako krmiva pro hospodářská zvířata je obrovský a s rostoucí spotřebou masa pořád stoupá. Důvodem je zejména velice příznivý aminokyselinový profil. Podmínkou pro zkrmení sóje je její zahřátí, aby byli zničeny inhibitory růstu. 3.1.5 Složení a nutriční hodnota sóje Sója je ze všech luštěnin nejlepším zdrojem bílkovin. Sójové boby jich obsahují přibližně 33 % , geneticky modifikovaná sója jich ale může obsahovat až 45 %. Proteiny sójových bobů jsou tvořeny třemi hlavními frakcemi: albuminy, globuliny a gluteliny, z nichž 80% tvoří globuliny. (Hrabě et al. 2007) Globulinová frakce je separovatelná pomocí centrifugace nebo chromatografie na dva základní komponenty vicilin a legumin. Sójový legumin se nazývá glycinin a je nejdůležitějším sójovým globulinem. (Belitz et al. 2009) Bílkoviny sóje jsou sami o sobě neplnohodnotné kvůli nedostatku methioninu a cysteinu. Plnohodnotnou bílkovinu lze získat kombinací s bílkovinami obilovin. Nejvíc zastoupenými aminokyselinami jsou kyselina asparagová a kyselina glutamová a jejich amidy asparagin a glutamin. Sójová bílkovina je v lidském trávícím traktu optimálně zužitkovatelná, má vysokou biologickou hodnotu a může sloužit jako náhrada živočišných proteinů. (Hrabě et al. 2007) Nevýhodou sójové bílkoviny je vysoká alergenita, v důsledku které patří sója mezi nejvýznamnější zdroje potravinových alergenů. Alergeny sójové bílkoviny jsou glykoproteiny glycinin, β-conglycinin, 2S globulin a Kunitz trypsin inhibitor. (Belitz et al. 2009) Snížení alergenity lze dosáhnout tepelnou denaturací nebo enzymovou hydrolýzou bílkovin. Sója téměř neobsahuje lepek. (Hrabě et al. 2007) Až 80% proteinů ze sójových bobů je extrahovatelných při pH 6.8. Většina těchto proteinů je pak schopná precipitovat acidifikací při pH 4.5. Tato pH dependentní solubilita je důležitou technologickou vlastností využívanou při extrakci sojových proteinů. (Belitz et al. 2009) 16

Sója je významným zdrojem inhibitorů proteináz (s obsahem až 20 g/kg). Tyto inhibitory lze podle struktury rozdělit na Kunitzovy inhibitory ( inhibující trypsin a chymotrypsin a obsahující jenom jednu trypsin-specifickou proteinovou vazbu v aktivním centru) a Bowman-Birkovy inhibitory (obsahující dvě aktivní místa, které obě směřují k trypsinu nebo k trypsinu a chymotrypsinu). Biologický význam inhibitorů pro rostlinu je zatím neznámý. Nicméně se předpokládá, že inhibitory působí jako protektanty proti poškození rostliny vyššími živočichy, hmyzem a mikroorganismy. V lidském těle mají sójové inhibitory prokázaný účinek ve smyslu inhibice trypsinu a chymotrypsinu. Bowman-Birkovy inhibitory jsou na rozdíl od Kunitzových inhibitorů dobře odolné proti působení žaludečních šťáv, čeho se využívá ve farmakologii. (Belitz et al. 2009) Sója obsahuje v semenech až 18 % tuků. Tím se výrazně odlišuje od ostatních luštěnin ve kterých je průměrný obsah lipidů 3 % (viď porovnání v příloze 1). Hlavními mastnými kyselinami sójových bobů jsou kyselina palmitová, stearová, olejová, linolová a α-linolenová. Z celkového obsahu mastných kyselin jsou v sójových bobech zastoupeny převážně nenasycené mastné kyseliny s vícečetnými dvojnými vazbami (z tohoto důvodu je sója doporučenou potravinou v rámci prevence proti trombotickým onemocněním a ateroskleróze). Z fosfolipidů je v sóji nejvíce zastoupen fosfatidylcholin (lecitin), který tvoří 24 – 46 % fosfolipidů. (Hrabě et al. 2007) Sacharidy tvoří 30 hmotnostních procent sóji a jsou zastoupeny monosacharidy, oligosacharidy , škrobem a celulosou. Z monosacharidů jsou v sóji přítomny v malém množství glukosa (0,04 – 0,2 %) a fruktosa. Sója obsahuje jen nízké procento škrobu, oproti čočce, fazoli a hrachu (viď porovnání v příloze 1). Díky nízkému procentu škrobu je sója vhodná pro diabetickou dietu. Ve formě celých semen obsahuje sója velké množství vlákniny, která se ale v řadě zpracovaných sójových produktů již nevyskytuje. Ze slupek sójových bobů se získávají sójové otruby, které obsahují asi 63,9 g / 100 g vlákniny. (Velíšek a Hajšlová , a 2009) Sója obsahuje významné množství vitamínů, především ze skupiny B a vitamin E a K. Minerální látky tvoří v sóji téměř tři procenta. Pro lidskou výživu má největší význam vápník, fosfor, hořčík a železo, využitelnost je ale relativně nízká. Sója obsahuje některé přírodní toxické a antinutriční látky mezi které patří kromě výše popsaných inhibitorů enzymů fytoestrogeny, saponiny, lektiny, purinové látky a 17

fytosteroly. Podrobný přehled obsahových látek sóje je v příloze 2 této práce. 3.1.6 Zdravotní účinky sóje V průměru snižují sójové proteiny hladinu LDL cholesterolu o 13%. Tento přímý efekt proteinů je nespojitý se změnami ve složení dietetického tuku nebo cholesterolu. Čím vyšší je individuální hladina krevního cholesterolu, a čím větší množství sojových proteinů je použito, tím více se projevuje efekt snižování hladiny LDL cholesterolu. Další složkou sóji, která prokazatelně pozitivně působí na snižování rizik srdečních onemocnění jsou fytoestrogeny. (Wardlaw, 1998) Podobnost sójových izoflavonů s estrogeny je také příčinou pozitivních účinků sóje při prevenci osteoporózy. Některé studie dokonce ukazují, že izoflavony kromě schopnosti inhibovat odbourávání kostní hmoty také stimulují formování kostí. (Wardlaw, 1998) Genistein inhibuje růst široké škály hormonálně závislých a hormonálně nezávislých rakovinných buněk včetně buněk prsní žlázy, buněk prostaty, buněk tlustého střeva a kožních buněk. Závislost mezi konzumací sóje a výskytem nádorových onemocnění (zvláště nádorů prsů) zkoumali mnohé studie. Stále probíhají studie, zjišťující možnost využití sójových izoflavonů v přímé léčbě nádorových onemocnění. (Wardlaw, 1998) Sója má velmi kladný vliv na průběh diabetu. Sójové výrobky se pomalu absorbují a pomáhají zpomalit přístup glukózy do krevního oběhu. Rovněž pomáhají řídit stav cukru v krvi a jsou prevencí před aterosklerózou a nemocemi ledvin. Sója je zásadotvorná potravina. Pro vysoký obsah draslíku a hořčíku je vhodná pro regulaci vysokého krevního tlaku. Obsahem fosforu se rovná sušenému mléku, organicky vázaného železa má 2 krát víc a vitaminu B 3 krát víc. (Rychlík, 2004)

3.2 Potravinářské výrobky ze sóji Jen malá část produkce sójových bobů se spotřebuje bez předchozího průmyslového zpracování. Sójové boby jsou používány pro výrobu široké škály potravinářských výrobků. Technologie používané ve výrobě jsou stejně rozmanité jako výsledné produkty. Schematické znázornění zpracování sójových bobů na různé potravinářské výrobky je v příloze č. 3. 18

3.2.1 Výrobky z bobů Boby Boby se většinou používají jako hodnotné krmivo. Jen asi třetina bobů se spotřebuje pro lidskou výživu. Celé sojové boby mohou být připravovány podobně jako ostatní druhy luštěnin a mohou být používány v omáčkách, při dušení zeleniny a v polévkách. Edamame (sladké boby) Edamame pochází z rozsáhlých sojových sklizní, kdy je sója ještě nezralá. Takto sklizené lusky mají sladkou chuť a konzumují se jako zelenina. Edamame je oblíbené hlavně v Asii a USA. Sójové výhonky Výhonky sójových bobů, až 10 cm dlouhé, se připravují klíčením ve vlhkém prostředí při teplotě 22-30°C po dobu 4-7 dnů. Slouží jako ingredience pro teplou a studenou kuchyni a také při výrobě řady pokrmů. Díky rozkladu nestravitelných oligosacharidů během klíčení jsou dobře stravitelné a mají vysoký obsah vitaminů B1, B2 a C. (Dostálová, 2010) Sójové mouky, krupice a vločky Sójové mouky jsou plnotučné, polotučné a odtučněné. Obsah bílkovin je 40-55%. Sójové mouky se vyrábí mletím bobů. Boby se třídí, myjí a máčejí. Cílem máčení je popraskání slupky, která se v dalších krocích odstraní. Během výroby je nutné použití ohřevu kvůli inaktivaci antinutričních látek a enzymů. Ohřevem se také zlepší senzorické vlastnosti mouky. Využití sójových mouk spočívá hlavně v obohacování různých potravinářských výrobků bílkovinami. Postupně jsou ale nahrazovány koncentráty (70% sójových bílkovin) a izoláty sójových bílkovin (90-95% bílkovin), hlavně kvůli lepším senzorickým vlastnostem. (Dostálová, 2010) Sójová mouka se vyznačuje žlutou barvou, typickou vůní a nahořklou chutí. Nositeli hořké a trpké chuti sójové mouky bývají hlavně izoflavony a jejich glykosidy. (Velíšek a Hajšlová b, 2009) Sójové mouky se používají také k výrobě sójových těstovin. Protože neobsahují lepek jsou vhodné pro lidi trpící celiakií. Pekařské vlastnosti sójové mouky jsou horší než vlastnosti mouky pšeničné. Méně zahušťuje, má odlišné chuťové vlastnosti a vysoký obsah tuku. 19

Koncentráty sójových bílkovin Vyrábějí se z odtučněných sójových šrotů a mouk odstraněním ve vodě rozpustných sacharidů a minerálních látek. Toho se dosahuje promýváním směsí vody a nižšího alifatického alkoholu (methanol, ethanol, isopropylalkohol) o koncentraci okolo 60 %, promýváním roztokem kyselin o pH 4,2 – 4,5 (hodnota izoelektrického bodu sójových bílkovin), nebo tepelnou denaturací a extrakcí vodou. (Belitz, 2009) Koncentráty obsahují kolem 70% proteinů a vysoký podíl vlákniny. Využívají se k výrobě technologicky složitějších sójových výrobků nebo jako přídavky do jiných potravinářských výrobků (hlavně masných, mléčných a pekařských). (Dostálová 2010, Kadlec 2009) Izolované sojové proteiny Sojové izoláty vznikají po odebraní bílkoviny ze sójových šrotů. Nejčastější technologií je extrakce bílkovin vodou s přídavkem alkálií (NaOH, NH3) o pH 7,5 – 9,0 při teplotě 80 °C. Následuje precipitace z vodního roztoku poklesem pH na 4-5. Pevné podíly se z extraktu odstraní filtrací, rozpuštěné sloučeniny se získají vazbou na ionexy, aktivním uhlím a ultrafiltrací. Z vyčištěného extraktu se bílkoviny vysráží v izoelektrickém bodě, následuje promytí a sprejové sušení. Izoláty obsahují cca 92% bílkovin, čím mají největší množství proteinů ze všech sojových výrobků. Patří k dobře stravitelným zdrojům aminokyselin a používají se ve speciální výživě. Přidávají se v rámci receptur do pekárenských a masných výrobků a produktů kojenecké a dětské výživy. (Belitz, 2009, Kadlec 2009) Sójový olej Sójový olej se vyrábí postupy, které jsou běžné pro výrobu ostatních rostlinných olejů. Využívá se přitom extrakce rozpouštědly, zejména hexanem. Extrahovaný surový sójový olej nemá vhodné organoleptické vlastnosti, které se zlepšují rafinací. Proces rafinace je tří krokový a sestává z odslizování, odkyselení, bělení a deodorace. Sójový olej se využívá jako surovina pro výrobu rostlinných tuků, majonéz a dalších výrobků a také jako stolní olej. Na území Spojených států Amerických se odhaduje až 79% zastoupení sójového oleje mezi všemi potravinářskými oleji. (Dostálová, 2010) Sójový olej je zdrojem ω-3 nenasycených mastných kyselin a z běžných rostlinných olejů obsahuje nejvíce vitamínu E (530 – 2000 mg/kg). Vitamín E se z 11 % 20

vyskytuje ve formě α-tokoferolu, přes 60 % ve formě γ-tokoferolu a více než 20 % jako δ-tokoferol. Sójový olej je také dobrým zdrojem vitamínu K (1,39 – 2,90 mg/kg). Celkový obsah fytosterolů je 1837 – 4089 mg / kg. (Hrabě et al. 2007) V domácnosti se využívá se jako olej do salátů nebo na vaření, průmyslově pro výrobu rostlinných tuků, majonéz a dalších výrobků. Vedlejšími produkty výroby je lecitin, tokoferoly a fytosteroly. (Velíšek a Hajšlová b, 2009) Sójový šrot, vzniklý při lisování oleje, je nejen výborným krmivem ale také surovinou pro výrobu odtučněné sójové mouky, sójových koncentrátů, sójových izolátů a sójových hydrolyzátů. Obsahuje 35 – 45 % bílkovin a 1 – 2 % tuku. (Hrabě et al. 2007) Sójový lecitin Název sójový lecitin se používá pro směs fosfolipidů separovaných ze sójového oleje při rafinaci (odslizování) a usušení za vakua, případně bělených. Sójový lecitin se používá v potravinářství jako emulgátor ve výrobcích s vysokým obsahem tuků a olejů (pekařství, výroba cukrovinek a doplňků stravy). Mezi další technologické vlastnosti patří podpora stabilizace a krystalizace. (Kadlec 2009) Lecitin se skládá z mastné kyseliny, glycerolu, kyseliny fosforečné a cholinu (složka acetylcholinu, který hraje významnou roli v řízení paměti a svalové činnosti). Díky své emulgační schopnosti má lecitin vliv na zmenšování velikosti tukových částí v krevním oběhu. Pomáhá navodit rovnováhu mezi hladinami HDL a LDL cholesterolu. Příznivě ovlivňuje hladinu cholesterolu v krvi a tím zpomaluje proces arteriosklerózy. Je také antioxidačním činidlem. Texturované sójové bílkoviny Principem výroby texturovaných sójových bílkovin je přeměna struktury sójové bílkoviny z globulární formy na fibrilární formu, která poté připomíná strukturu bílkoviny masa. Texturované sójové výrobky se dělí na výrobky extrudované a spřádané. Oba druhy lze barvit a aromatizovat. Při výrobě spřádaných sójových výrobků se vlákna sójových bílkovin spřádají podobným postupem jako syntetická vlákna v textilním průmyslu. U texturovaných sójových výrobků se provádí extruze na principu shodném s extruzí při výrobě cereálních výrobků. (Kadlec 2009) Texturované sójové výrobky se prodávají ve formě kostek, plátků nebo granulátu, 21

mražené, konzervované nebo sušené. Pro takové výrobky nesmí být podle současné legislativy používán termín sójové maso, protože se výživovou hodnotou výrazně odlišují od masa zvířat. Texturované sójové bílkoviny jsou často používány jako přídavek do masných výrobků (zejména karbanátky a hamburgery), protože mají obdobné složení. (Dostálová, 2010) Sójová vláknina Termín sójová vláknina se používá pro vlákninový koncentrát vyrobený ze sójových bobů (slupek). Používá se k obohacování pekárenských i jiných výrobků. Sójová vláknina má podobu bílého prášku a vysokou schopnost vázat vodu (až v poměru 7:1). Používá se také jako doplněk výživy. (Kadlec 2009) Okara Okara je drť vlákniny získaná při výrobě sojového mléka. Obsahuje méně proteinů než samotné sojové boby, ale ve vysoké kvalitě. Je přidávána jako vláknina do koláčů a čajového pečiva. Při domácím použití se může péct. Používá se také při výrobě masných výrobků (hlavně párků a klobás).(Kadlec 2009) 3.2.2 Nefermentované výrobky ze sóji Sójové oříšky Sójové oříšky jsou křehký výrobek podobný praženým ořechům. Vyrábí se loupáním, vařením a sušením sójových bobů a jejich následným pražením v oleji. Často se obalují v soli. Sójové máslo Připravuje se ze sójové mouky upravené pražením, do které se následně vmíchá sójový olej. Výrobek se různě ochucuje. Používá se jako náhražka arašídového másla. Má méně tuku a je výrazně méně aromatické. (Zemánková, 1991, Alden, 2005) Sójové nápoje Sójový nápoj je nutričně vyvážený nápoj vyráběný z vybraných sójových bobů. V Číně je tento produkt známý víc než 2000 let, kde se získává tradičně dodnes rozemletím namočených sójových bobů , a jejich povařením po dobu 15 – 20 min. Většina postupů výroby sójových nápojů se zakládá na tomto tradičním postupu s následným 22

odstředěním, pasterací a homogenizací. Jinou možností je extruze sójových bobů na plnotučnou sójovou mouku, její disperze ve vodě, homogenizace a sprejové usušení. Moderních postupů výroby je patentována celá řada, vyrábějí se sójové nápoje různých příchutí, ve směsích s kravským mlékem a obohacované vápníkem. Nápoj má podobu řídké emulze, specifické chuti, do jisté míry připomínající mléko. Z důvodu odlišného složení od mléka savců je ve většině krajin (včetně České republiky) označení sójové mléku zakázáno. Složení sójového nápoje závisí na použitém technologickém postupu. (Belitz, 2009, Dostálová, 2010) Kromě běžné konzumace dospělou populací se vyrábí i sójové nápoje sloužící pro výživu kojenců - soy infant formula (SIF). SIF jsou výrobky určeny pro děti, u kterých se projevila alergie nebo nesnášenlivost proteinů pasterizovaného kravského mléka. SIF se prodávají ve formě prášků, koncentrovaných tekutých substancí nebo ve formě k okamžitému krmení (ready-to-feed). (Vandenplas, 2011) Tofu Tofu je hlavním sójovým potravinářským výrobkem pro lidskou výživu na světě. Technologie výroby tofu spočívá ve srážení sójového nápoje přídavkem kyselin, MgCl2, CaCl2 nebo CaSO4 (v množství asi 3g soli na 1kg roztoku) při teplotě 65°C. Tvorba sraženiny je výsledkem denaturace sójové bílkoviny a následným shromážděním denaturovaných bílkovin do sraženiny. Sraženina se po odstranění přebytečné tekutiny formuje do požadovaného tvaru. Tofu se vyrábí ve velkém množství variant a příchutí, chuť čistého tofu je málo výrazná. Tofu je jemný výrobek a dovede absorbovat jakoukoliv chuť a vůni, které převezme z přidaných ingrediencí. Vyrábí se v různých konzistencích podle cílového použití. Tuhé tofu se používá do polévek, na smažení a grilování. Obsahuje více bílkovin, tuku a vápníku než ostatní formy tofu. Měkké tofu je určeno pro přípravu pokrmů, při kterých je vyžadováno tofu na míchání. Jemné tofu je krémový výrobek na výrobu omáček a majonéz. Složení tofu se různí v závislosti na technologii výroby, průměrně je ve 100 gramech obsaženo 17 g bílkovin, 8 g tuku, 1,5 g sacharidů. Vodní podíl tvoří až 88% produktu. (Belitz, 2009, Dostálová, 2010) Kávoviny Kávoviny ze sójových bobů se vyrábějí stejnými způsoby jako ostatní kávoviny. 23

Sójové boby se zpracují čištěním, krájením, sušením, pražením a rozemíláním. Často používaným nesprávným označením je sójová káva. Sójové cukrovinky Sójové cukrovinky patří mezi nečokoládové cukrovinky. K výrobě je používána sójová krupice, která se zpracovává s různými přísadami do forem tabulek, tyčinek a řezů. Vyrábí se také sójová zmrzlina, která patří ve Spojených státech k nejoblíbenějším nemléčným cukrovinkám. Další nefermentované sójové výrobky Oblíbeným produktem v Evropě a Spojených Státech je sójanéza, sójová náhražka majonézy. V jihovýchodní Asii se vyrábí kinako – prášek z pražených a jemně namletých sójových bobů, který se používá k posypávání jídel a yuba – během vaření sójového nápoje vzniklá povrchová sraženina sesbírána a usušená na žlutavé pláty. (Kinako in Wikipedia 2007, Tofu skin in Wikipedia 2005) 3.2.3 Fermentované výrobky ze sóji Sójová omáčka (tamari, shoyu, teriyaki) Sójová omáčka je slaná hnědá omáčka vyrobená fermentací sójových bobů nebo sójové mouky (krupice). Pro fermentaci se využívá Aspergillus oryzeae, Aspergillus soyae, Lactobacillus delbruckii a některé kmeny kvasinek. Fermentační kultury se nechají růst na syrovém materiálu ze směsi vařené odtučněné sójové mouky a pražené pšeničné mouky. Směs získána mícháním této směsi se solným roztokem se nechává zrát. Doba zrání určuje kvalitu i cenu výsledného produktu. Během fermentace sójové omáčky jsou bílkoviny hydrolyzovány na peptidy, aminokyseliny a amoniak. Stupeň hydrolýzy závisí na použitých proteázách. Sójová omáčka obsahuje 1.5% dusíku, 4.4% redukujících cukrů a vedlejší produkty mikrobiálního metabolismu(ethanol – 1.2%, kyselinu mléčnou, jantarovou a octovou). Sójové omáčky nižší kvality jsou připravovány kyselou hydrolýzou a ochucovány kořením. Sójová omáčka slouží k ochucování pokrmů jak při výrobě, tak přímo před konzumací. Zdravotní účinek tkví v podpoře trávení. (Belitz, 2009, Dostálová, 2010)

24

Miso Miso je výživné, slané koření, charakteristické pro základ japonské kuchyně. V Japonsku se z něho připravují miso polévky a používá se k ochucení stravy. Konzistencí je to hustá hladká pasta. K výrobě se kromě sojových bobů používají také obiloviny (např. rýže). Obiloviny smíchané s Aspergillus oryzae se inkubují 40-50 hodin při teplotě 28-35°C. Po inkubaci se přidají sójové boby a sůl (4-13%). Směs fermentuje a dozrává v tradičních cedrových kádích. Výroba trvá obvykle od jednoho do tří let. Použité suroviny a různá délka fermentace umožňují produkci misa o různé chuti, textury, barvy a aroma. Miso se využívá se k přípravě polévek, omáček, dresingů a marinád. (Belitz, 2009, U.S. Soyfoods Directory, a 2006) Zakysané sójové výrobky Výrobky vyráběné ze sójových nápojů kysáním svým charakterem připomínají jogurty. Často se používá směsi sójových nápojů s kravským mlékem. Pro kysání se používají klasické jogurtové kultury. Výrobky se obvykle nazývají kyška, dezert nebo sojagurt. Tempeh Tempeh je indonéský náhrada masa. Vyrábí se z oloupaných vařených sójových bobů a dalších obilovin fermentovaných kulturou Rhizopus oligosporus. Je bohatý na vlákninu a bílkoviny, má podobu kompaktního koláče, žvýkačkovou texturu a pikantně slanou, ořechovou chuť. Obzvláště je oblíbený na ostrově Jáva, kde jde o hlavní zdroj proteinů. Díky fermentaci získává tempeh nejen vysoký podíl proteinů, vlákniny a vitaminů, ale také intenzivnější aroma. Nutriční vlastnosti jsou stejné jako u tofu. (Alden, 2005) Natto Natto jsou vařené sójové boby fermentované kulturou Bacillus nato (varianta Bacillus subtilis) po dobu 16-20 hodin při teplotě 40-45°C. Díky fermentačnímu procesu se rozkládají sojové bílkoviny a tudíž je natto mnohem snadněji stravitelné než samotné sojové boby. Jeho povrch je slizký a viskózní se sýrovitou strukturou. Vyznačuje se štiplavou chutí a vysokou nutriční hodnotou. Je velice oblíbené na Asijském trhu, kde se prodává čerstvé, mražené nebo mrazem sušené. (Alden, 2005, Belitz et al. 2009) Sufu Sufu je tofu fermentované plísní Actinomucor elegans. Tofu se nakrájí na kostky o 25

hraně asi 3cm a naloží do solného roztoku. Produkt se ohřeje na teplotu 100°C a tato teplota se udržuje po dobu 15minut. Následuje inokulace Actinomucor elegans. Po inkubaci při 12-25°C po dobu 2-7 dní se sufu uloží do 5-10 % solného roztoku obsahujícího pastu z fermentovaných sójových bobů a ethanol. Výrobek se označuje jako čínský sýr. (Belitz, 2009) Další fermentované výrobky ze sóji V jihovýchodní Asii se připravuje řada dalších výrobků a pokrmů fermentací sójových bobů, které jsou pro Evropský trh neznámé. Jako příklady lze uvést sójovou pastu zvanou konamiso, tekuté sladko slané koření koisin nebo sladkou pastu z fermentovaných červených bobů – sweetened. 3.2.4 Doplňky výživy Sója slouží jako surovina pro výrobu stále většího počtu různých druhů doplňků výživy. Doporučené použití doplňků kopíruje předpokládané pozitivní zdravotní účinky sóje. Podle účelu použití lze doplňky rozdělit následovně: Doplňky výživy na zmírnění projevů menopauzy Doplňky výživy pro podporu snižování váhy Doplňky výživy na doplnění energie a podporu v tréninku Doplňky výživy na redukci rizika srdečních onemocnění Doplňky výživy na redukce rizika osteoporózy Doplňky výživy pro zlepšení kvality pokožky, vlasů a nehtů (U.S. Soyfoods Directory, b 2006) Pro zmírnění nežádoucích projevů v období menopauzy se používají doplňky výživy s vysokým obsahem izoflavonů. Kromě sóje se pro tento účel používá i jetel luční (Trifolium pratense). Doplňky výživy na báze sóje určené pro redukci hmotnosti vycházejí z následujících vlastností sóje: sója působí díky vysokému obsahu vlákniny rychlý pocit nasycení, má nízký glykemický index a lze ji použít jako plnou náhradu živočišné bílkoviny. Pro podporu v tréninku u sportovců výrobci doplňků výživy definují sójový protein v různých modifikacích. Ten je často vyhledáván pro nízkou cenu, vysokou koncentraci esenciálních aminokyselin a příjemnou chuť. Zvláštní oblibě se těší u 26

silových sportovců pro vysokou vaznost vody (1:5) a nízkou energetickou hodnotu. Pro snižování rizika srdečně cévních onemocnění a snižování rizika trombóz bývá nabízen doplněk výživy vyráběný z tradiční japonské potraviny, tzv. natto (viď kapitola 3.3.3). Ze suroviny jsou odstraněny kromě zbytků bakteriálních buněk také vitamin K a senzorické látky dávající nattu typickou vůni a chuť. Přípravky s deklarovanými pozitivními účinky v prevenci proti osteoporóze obsahují sójové izoflavony nebo je jejich technologickým základem sójový protein obohacený vápníkem. Doplňky výživy deklarující zlepšení kvality kožního krytu a kožních adnex jsou vyráběny na bázi sójového oleje. Zvláštní postavení na trhu s doplňky výživy má sójový lecithin, který má poskytovat výživu pro buňky nervového systému, zlepšovat paměť a celkově pozitivně působit na metabolismus. Společně se sójovým proteinem patří tento druh doplňku k nejoblíbenějším a nejprodávanějším.

3.3 Sekundární metabolity Pojmem metabolismus se rozumí soubor regulovaných biochemických reakcí, které organismům zajišťují stavební látky a nezbytnou energii pro plnění funkcí. Od primárního metabolismu se odvíjí biosyntéza a degradace látek zahrnovaných do tzv. sekundárního metabolismu. Rozdělení metabolitů na primární a sekundární pochází z rostlinné fyziologie a původně sloužilo k oddělení látek běžně vznikajících u všech rostlin od látek identifikovaných u několika čeledí nebo druhů. Obecně mezi primární metabolity řadíme bílkoviny, sacharidy, lipidy, chlorofyl a příbuzné látky. Mezi sekundární metabolity patří látky, které nemají obecnější metabolický význam: terpeny, glykosidy, alkaloidy atd. U živočichů se sekundární metabolity vyskytují sporadicky, v rostlinné říši jsou naproti tomu celkem běžné. Většina názvů jednotlivých látek pochází z názvů biologických taxonů, ze kterých byli izolovány. (Macholán, 2003) Sekundární metabolity vznikají během různých metabolických procesů v organismu. Tyto látky nejsou přímo účastné na procesu růstu, vývoje a rozmnožování, tudíž jejich nedostatek nezpůsobuje okamžitou smrt organismu, jak tomu je při nedostatku metabolitů primárních. Jejich funkce se různí v závislosti na druhu 27

organismu a většinou se uplatňují při mezidruhové kompetenci. Sekundární metabolity plní v rostlině některé ze čtyř základních funkcí. Fungují jako vedlejší cesta primárního metabolismu, vztahují se k abiotickému prostředí (adaptace vůči mrazu nebo zaplavení), regulují vztahy se živočichy a patogenními mikroorganismy nebo regulují vztahy k jiným vyšším rostlinám. Mnohé z jejich funkcí mohou být složené, některé jsou však stále neprozkoumané. (Míka, 2001) Metabolismus sekundárních metabolitů přímo navazuje na metabolismus primárních metabolitů. Hranice mezi primárními a sekundárními metabolity nejsou zcela jednoznačně definovány a mohou se překrývat. Přírodní rostlinné metabolity lze rozdělit do tří hlavních skupin: terpeny, alkaloidy, fenylpropanoidy a jim příbuzné fenolické sloučeniny. Terpeny se skládají z dvou nebo více isoprenových jednotek. Jsou odvozeny od prekurzoru isopentenyl-difosfátu (IPP) s pěti atomy uhlíku a zahrnují kromě primárních metabolitů také více než 25 000 sekundárních metabolitů. Alkaloidy, kterých je známo okolo 12 000, obsahují jeden nebo více atomů dusíku a jejich biosyntéza vychází z přeměny aminokyselin. Jsou to zásadité organické sloučeniny (odtud také pochází jejich název) obsahující dusík a to především v heterocyklické formě. (Klejdus et al., 2003) Fenylpropanoidy jsou látky rozmanité struktury. Jejich základní skelet tvoří benzenové jádro a jsou odvozeny od fenylpropanu, resp. kyseliny fenylpropanové. O fenolických sloučeninách pojednává podrobněji následující kapitola. Schematické znázornění vztahů mezi primárními a sekundárními metabolity je v příloze 4 této práce. 3.3.1 Flavonoidy Pod pojmem flavonoidy je označována skupina látek odvozených od flavonových barviv. Název dostali od zbarvení, které je provází ( flavus = žlutý). Nacházejí se v květech, listech a plodech převážně dvouděložných rostlin. Flavonoidy jsou univerzální rostlinné pigmenty. Jsou všudypřítomné v kutikule a v epidermálních buňkách listů, kde chrání pletiva před poškozením UV zářením. Největší množství se jich nachází ve vakuolách. (Stratil b,1993) V současné době je známých více než 20 000 flavonoidů. Většina patří do skupiny flavonoidů, ale mají značné strukturní, biochemické a farmakologické odlišnosti. Považují se za semiesenciální látky, protože nejsou nezbytné pro udržení života, ale 28

přispívají k podpoře zdraví. (Stratil b,1993) Flavonoidy zahrnují různorodou skupinu, kde je společným znakem polyfenolická struktura. Základní strukturní element je flavanový skelet. Flavanový skelet se skládá z uhlíkového skeletu C6-C3-C6. Skelet je složen ze dvou benzenových jader uprostřed umístěného pyranového kruhu. Jádra se značí zleva doprava velkými písmeny A, C a B. Prostřední pyranový cyklus obsahuje kyslík a je zodpovědný za typické reakce flavonoidů. Fenyl B může být napojen na obou stranách dvojné vazby (tzv. normální flavonoidy, mezi něž patří většina flavonoidních barviv) či na druhé straně dvojné vazby (izoflavonoidy) anebo na "dolním" uhlíku pyranosového cyklu C (neoflavonoidy). (Míka, 2001) Chemicky se flavonoidy odvozují od benzopyranu (chromanu) s postranním fenylem v polohách C-2 nebo C-3. Biogeneticky vznikají přes stadium chalkonů. Migrací fenylového zbytku u chalkonů na sousední uhlík C-3 vznikají izoflavony. (Macholán, 2003) Základní strukturní skupiny flavonoidů jsou podle Opletala (2010): flavan-3-oly (katechiny) flavan-3,4-dioly (leukoantokyanidiny) antocyanidiny flavonoly dihydroflavonoly (flavanonoly) flavony, flavanony (dihydroflavony) chalkony aurony Struktury těchto skupin spolu s typickými zástupci jsou znázorněny v příloze 5 této práce. Flavonoidy se objevují jak ve formě volné, tak ve formě glykosidicky vázaných sloučenin. Všechny flavonoidy mají společnou základní strukturu odvozenou od chromanu s fenylem vázaným v poloze 2, izoflavonoidy mají fenyl v poloze 3, neoflavonoidy v poloze 4 a dále se liší v míře hydroxylace, methylace a glykosylace. (Klejdus et al., 2003) Flavonoidy tvoří komplexy s ionty přechodných prvků. Dva sousední uhlíkové atomy aromatického jádra nesou hydroxylové skupiny nebo hydroxylovu a 29

karboxylovou skupinu. Reakce s kovovými ionty souvisí s antioxidační aktivitou fenolů. Komplexy tvoří hlavně s mědí, která je nezbytná pro aktivitu mnoha enzymů. (Velíšek a Hajšlová a, 2009) Flavonoidy jsou antioxidanty a reagují jak s hydrofilními tak i s lipofilními systémy. Antioxidační aktivita flavonoidů je dána tím, že při nízkém pH zachytávají volné radikály. V neutrálním a zásaditém prostředí vytvářejí komplexy s mědí (čím inhibují oxidázu kyseliny askorbové a peroxidázu). Některé flavonoidy redukují kyselinu dehydroaskorbovou na aktivní kyselinu askorbovou a tím ji vrací k opětovnému využití v organismu. (Stratil b,1993) Ochranný účinek flavonoidů se částečně shoduje s účinky fenolických kyselin. Spočívá v útlumu prooxidačně působících jaterních enzymů a povzbuzení činnosti detoxikačně působících enzymů. (Komprda, 2009) Flavonoidy jsou také označovány jako vitamin P podle jejich vlivu na permeabilitu krevních cév. Mezi nejdůležitější skupiny flavonoidů z hlediska potravinových zdrojů patří katechiny, epigallokatechingaláty, antokyany a izoflavonoidy. Katechiny se vyskytují v červeném vínu a jablkách, epigallokatechingaláty jsou typickou složkou zeleného čaje, antokyany se vyskytují v červených hroznech a nejdůležitějším zdrojem izoflavonoidů jsou sójové boby. (Komprda, 2009) Databáze potravinových flavonoidů v současnosti obsahuje 35 druhů ovoce, 31 druhů zeleniny, 26 nápojů, 8 různých džemů, tři typy čokolády a 12 květin. Obsah flavonoidů v potravinách je přitom ovlivněn mnoha faktory. Kromě lokality pěstování jsou to mezidruhové rozdíly a charakteristiky, způsob pěstování, skladování a v neposlední řadě analytické variace při detekci. (Andersen, 2006) Původní odhad denního příjmu flavonoidů byl stanoven v sedmdesátých letech dvacátého století ve Spojených státech a byl stanoven na 1000 mg/den. Tato hodnota nebyla zpochybněna až do devadesátých let, kdy v Dánsku proběhla rozsáhlá studie s diametrálně odlišným výsledkem. Příjem flavonoidů se podle ní pohybuje od 3 mg/den ve Finsku po 65 mg/den v Japonsku. Ve středoevropské oblasti je příjem odhadován na 26 mg/den. (Andersen, 2006) Vzhledem ke stravovacím zvyklostem v České republice je příjem poloviny všech flavonoidů hrazen z černého čaje, čtvrtina z česneku a desetina z jablek. (Komprda, 2009) 30

3.3.2 Fytoestrogeny Fytoestrogeny (FE) jsou látky rostlinného původu strukturálně i funkčně připomínající pohlavní steroidní hormony - estrogeny. Receptory cílových buněk pro pohlavní hormony jsou situovány převážně v cytoplazmě. Z toho vyplývá nevyhnutná schopnost estrogenů prostupovat volně cytoplazmatickou membránou. Jejich účinek na buňku pak spočívá v tom, že po navázání na receptor se mohou ovlivňovat transkripci jaderné DNA. Estrogeny jsou zodpovědné za vývoj pohlavních orgánů, sekundárních pohlavních znaků a sexuální chování jedince. Látek s estrogenními účinky je známo několik desítek a vyskytují se v přibližně 300 druzích rostlin. Účinky fytoestrogenů jsou hormonální, orgánové a metabolické. Fytoestrogeny patří částečně i mezi endokrinní disruptory (mohou negativně ovlivnit fyziologickou funkci endogenních hormonů). V takovém případě se často označují jako xenoestrogeny. (Velíšek, 2009) Podle Velíška byl prvním fytoestrogenem prokázaným v rostlinách estron. Byl nalezen v palmovém a palmo-olejovém oleji a v semenech marhaníku granátového (Punica granatum, Puniaceae). Podle Vrzáňové a Heresové byla existence fytoestrogenů poprvé zaznamenána a prokázána Bennetsem v roce 1946 v souvislosti s neplodností ovcí pasených dlouhodobě na pastvinách s velkým výskytem jetele podzemního (Trifolium subterraneum, Fabaceae). V roce 1954 z jetele lučního Bradbury a White izolovali genistein a formononetin, izoflavonoidy s estrogenním účinkem. Neplodnost byla zjištěna nejprve u ovcí, jelikož hovězí dobytek je vůči fytoestrogenům o mnoho méně citlivý. (Vrzáňová a Heresová, 2003) Obrázek 2 znázorňuje struktury endogenního hormonu estradiolu, fytoestrogenu daidzeinu a syntetického estrogenu diethylstilbestrolu.

estradiol

daidzein

diethylstilbestrol

Obr. 2: Porovnání struktur endogenního hormonu estradiolu, fytoestrogenu daidzeinu a syntetického estrogenu diethylstilbestrolu.

31

Chemická struktura a biogeneze fytoestrogenů je odlišná od endogenních estrogenů. Společným strukturním znakem je fenolové jádro, které umožňuje vazbu FE na estrogenní receptor (ER). Stejně jako přirozené estrogeny se FE vstřebávají ve střevě, vstupují do enterohepatálního oběhu. Dále konjugují s kyselinou glukuronovou a sírovou. Konjugáty jsou vylučovány do moči a žluči. Funkce fytoestrogenů u rostlin je odlišná od úlohy estrogenů u živočichů. U živočichů je hlavní funkce rozmnožovací, u rostlin je to funkce ochranná a obranná. Posilují imunitu rostliny, mají antioxidační vlastnosti i vlastnosti antiparazitární, antivirové, antibakteriální a fungistatické. Zabraňují angiogenezi (brání tvorbě nových cév), čím u rostlin zabraňují zhoubnému bujení.(Vrzáňová a Heresová, 2003) V rostlinách se FE nacházejí převážně jako konjungované glykosidy a v gastrointestinálním traktu savců podléhají metabolickým procesům. Intestinální hydrolázy střevních bakterií mají schopnost štěpit glykosidické konjungáty. Tím vznikají aglykony, které jsou převedeny do enterohepatálního oběhu. Fytoestrogeny přecházejí v organismu savců řadou složitých reakcí jako je demetylace, methylace, hydroxylace, hydrogenace, chlorace, iodace a nitrace. Vzniklé sloučeniny mohou potom konjungovat v játrech a jiných tkáních na formu β-glukuronidů, glukuronátů a sulfátů. Další možností je přestup přes střevní stěnu pasivní difuzí. (Kornwell, 2004) Rozdělení fytoestrogenů Fenolové fytoestrogeny rozdělují různí autoři podle různých hledisek. Pro potřeby této diplomové práce bylo zvoleno rozdělení podle Kornwellové (2004), které definuje čtyři skupiny fytoestrogenů: Kumestany Z široké škály kumestanů pouze zlomek prokazuje estrogenní vlastnosti. Nacházejí se převážně v jeteli a vojtěšce a okrajově v sóji, špenátu a slunečnicových semenech. Hlavními zástupci jsou pro tuto skupinu kumestrol a 4 ́metoxy- kumestrol. I když vzhledem k charakteru rostlin, ve kterých se kumestany převážně vyskytují nejsou z hlediska lidské výživy příliš významné, jsou potencionální složkou funkčních potravin s velkou perspektivou. (Kornwell, 2004, Kalač, 2003) Stilbeny Stilbeny vznikají fenylpropanoid-acetátovou cestou. Stejným mechanismem vznikají i 32

isoflavonoidy. Zdrojem stilbenů jsou hrozny a hroznová šťáva, nejvýznamnějším zástupcem je resveratrol. Z jeho dvou izomerů (cis a trans) má estrogenní účinky trans izomer. (Kornwell, 2004) Lignany Lignany jsou sloučeniny polyfenolického charakteru, spojené přes 4 uhlíkatý most. Nejvýznamějším rostlinným zdrojem lignanů jsou lněná semena, v menším množství se ale nacházejí v obilovinách, ovoci a zelenině. Zástupci této skupiny jsou matairesinol (MAT) a secoisolariciresinol (SECO), které nemají estrogenní účinky. V gastrointestinálním traktu savců se působením střevních bakterií přeměňují na enterolakton a enterodiol. Ty potom již estrogenní aktivitu vykazují. (Kornwell, 2004) Vzhledem ke skladbě jídelníčku, jsou lignany u Evropské populace přijímány ve větším množství než izoflavony a z tohoto důvodu můžou být také důležitějším zdrojem potravinových fytoestrogenů. (Andersen, 2006) Izoflavonoidy Nejznámější skupinou fytoestrogenů jsou izoflavonoidy. V rostlině se vyskytují ve formě volných aglykonů, méně často ve formě glykosidů (konjugáty s glukosou, rhamnosou či apiosou). 7-O-glykosidy jsou zásobní formou izoflavonoidů. Působí jako stresové látky v ochraně proti útoku bakterií, plísní, parazitů a reagují na případné klimatické trauma. (Vrzáňová a Heresová, 2003) Izoflavonoidy se vyskytují v různých oxidačních stupních, také ve formě dimerů a heterodimerů. V tělních tekutinách konzumentů jsou přítomny jako volné aglykony, sulfáty, glukosiduronáty nebo sulfoglukosiduronáty. Základní skelet molekul izoflavonoidů (3-fenylchromen-4-on) podléhá substitucím ( hydroxylace, methylace, chlorace, prenylace a pod.) a cyklizacím. Na základě strukturní rozmanitosti jsou izoflavonoidy klasifikovány podle Veitcha (2007) do podskupin: izoflavony, izoflavany, izoflavanchinony, izoflavanony, izoflav-3-eny, rotenoidy, dehydrorotenoidy, 12ahydroxyrotenoidy, pterokarpany, pterokarpeny, 6a-hydroxypterokarpany, kumestany, kumaronochromony, 3-arylkumariny, 2- arylbenzofurany a izoflavanoly. Struktury všech podskupin izoflavonoidů jsou znázorněny v příloze 6. Nejpočetnějšími skupinami izoflavonoidů jsou izoflavony a pterokarpany.

33

3.3.3 Izoflavony Izoflavony, stejně jako mnoho jiných fytochemikálií, jsou formovány rostlinným pletivem jako odpověď na fyziologický stimul, infekční agens nebo jeho produkt, které se akumulují v množství, které inhibuje růst mikroorganismů. Z tohoto důvodu množství izoflavonů výrazně narůstá v období vystavení rostlin stresu, jak jsou nedostatek vláhy, enviromentální podmínky. (Messina, 2010) První přirozený izoflavon, glukosid irigeninu byl izolován Lairem a Tiemannem v roce 1893 z rostliny kosatec florentský (Iris florentina). Později, v roce 1910, byl pronetin definován jako sloučenina izoflavonového typu. V první polovině devatenáctého století Reinsch a Hlasiwetz izolovali z kořenů jehlice trnité (Ononis spinosa L.) ononin. Pojmenování „izoflavon“ (isoflavon) bylo vytvořeno Bakerem a Robinsonem, kteří také poprvé izoflavony syntetizovali. (Lévai, 2004) Izoflavony upoutali pozornost vědecké komunity ve čtyřicátých letech devatenáctého století a to kvůli problémům s plodností ovcí chovaných na určitém typu jetele bohatém na izoflavony. O tři dekády později Setchell zjistil, že sójové izoflavony, které byly standardní součástí diety kočkovitých šelem chovaných v zajetí, jsou faktorem podílejícím se na poklesu plodnosti těchto zvířat. Toto zjištění do značné míry ovlivnilo vnímání izoflavonů odbornou veřejností jako antinutrientů. V šedesátých letech pak objev afinity izoflavonů k estrogenním receptorům motivovalo jejich označení jako fytoestrogeny. V osmdesátých letech bylo izoflavonům věnováno málo pozornosti s výjimkou výzkumu dr. Setchela, který se intenzivně věnoval jejich metabolismu. (Messina, 2010) Teorie, že fytoestrogenita je jedinou fyziologicky významnou vlastností izoflavonů byla vyvrácena v roce 1987 Akiyamou, který zjistil, že genistein je také inhibitorem tyrozinkinázy. Od tohoto objevu je genistein intenzivně zkoumán pro svoji schopnost ovlivňovat intracelulární metabolismus a kontrolovat buněčný růst. Od roku 1990 je široce zkoumán potencionální antikarcinogenní efekt izoflavonů. V roce 1992 Adlercreutz vyslovil myšlenku, že izoflavony mohou být důvodem, proč Asijské a Japonské ženy ve všeobecnosti trpí mnohem méně vedlejšími účinky menopauzy. První studie na toto téma byla publikována v roce 1995. Ve stejném roce Anderson et al. vyslovil teorii, že konzumace sójových produktů se se podílí na snížení hladiny cholesterolu. Později specifikoval, že za tento efekt z 60-70% odpovídají izoflavony. 34

(Messina, 2010) Zkoumání dalších zdravotních efektů následovalo velice záhy a patřilo k nim například zkoumání možností prevence rakoviny prsní žlázy, osteoporózy a kardiovaskulárních onemocnění. V roce 2001 byla publikována první studie zkoumající vliv sóje na kognitivní funkce. V roce 2005 Americká Office of Dietary Supplements (ODS) sponzorovala přehledovou správu o klinické literatuře věnované sóji a v roce 2009 ta samá organizace pořádala workshop věnovaný budoucímu klinickému výzkumu sóje. (Messina, 2010) Izoflavony se podílejí na růstu a rozvoji rostliny a obraně vůči patogenům. Dalším významem je ve vytváření symbiotického vztahu mezi rostlinou a rhizobiálními bakteriemi jako chemoatraktans pro tyto bakterie. Nezanedbatelnou je také insekticidní funkce, která souvisí s ochranou rostliny. Podle Benešové (2008) je taxonomické omezení izoflavonů na leguminózy spojeno pravděpodobně se závislostí na enzymu 2hydroxyisoflavanonsynthasa (2HIS), který je potřebný k přeskupení 2-fenylchromanu na 3-fenylchroman (přeskupení z flavanonu na izoflavon). Tento enzym se často označuje jako izoflavonsynthasa (IFS) a patří mezi cytochrom P450 monooxygenasy. Nejbohatším zdrojem izoflavonů je sója luštinatá (Glycine max, Fabaceae). Vyskytují se také v přibližně 60 neleguminózních rostlinách, například v jeteli lučním (Trifolium pratense, Fabaceae), jeteli plazivém (Trifolium repens, Fabaceae) a tolici vojtěšce (Medicago sativa, Fabaceae). Tyto zdroje ale nemají z hlediska lidské výživy větší význam, i když v současnosti se z jetele připravují doplňky výživy. Izoflavony a některé jejich deriváty se kvůli svým estrogenním účinkům řadí mezi toxické látky. Některé izoflavony vykazují také antimikrobiální a další biologické účinky. Sója je jednou z mála rostlin vykazujících vysoké koncentrace izoflavonů.(Velíšek a Cejpek, 2008) Molekula izoflavonů obsahuje C15-skelet typu C6-C3-C6, ale na rozdíl od ostatních flavonoidů všechny molekuly obsahují stavební jednotky 3-fenylchromanu. Izoflavony mohou tvořit dimery a oligomery (například bis-izoflavony nebo izoflavanflavanony) a také adukty s deriváty skořicové kyseliny (izoflavano-lignany). Od izoflavonů jsou odvozené isoflavanony a pterokarpany. (Míka, 2001) Struktury jednotlivých izoflavonů se liší ve stupni hydroxylace, methylace a 35

glykosylace a jsou znázorněny v příloze 7. V sójových bobech se vyskytují izoflavony daidzein (7,4´-dihydroxyisoflavon), genistein (5,7,4´-trihydroxyisoflavon) a glycitein (7,4´-dihydroxy-6-methoxyisoflavon). Prekurzorem daidzeinu, formononetinu a glyciteinu je flavanon liquiritigenin (7,4´dihydroxyflavanon), prekurzorem genisteinu a biochaninu je naringenin (5,7,4´trihydroxyflavanon). Izoflavony se v rostlinách vyskytují převážně v konjugované zásobné formě jako 7-β-D-glukosidy. Glukosidem daidzeinu je daidzin, genisteinu genistin, a glyciteinu glycitin. Nejvyšší podíl v sójových bobech mají glykosidy genistin (s výskytem asi 326 – 777 mg/kg sóje), daidzin (s výskytem asi 234 – 637 mg/kg sóje) a glycitin (s výskytem asi 60 – 66 mg/kg sóje) a jejich estery s malonovou kyselinou (malonylgenistein, malonyldaidzin, malonylglycithin). Naklíčené boby obsahují formononetin (v množství asi 1-30 g/kg). (Velíšek, 2009, Wang, 2008) Metabolismus izoflavonů Mechanismus metabolismu izoflavonů v lidském těle je stále předmětem studií. Důvodem k tomu jsou hlavně rozdílné možnosti metabolismů derivátů izoflavonů a jejich rodičovských sloučenin. (Andersen, 2006) Po požití jsou izoflavony hydrolyzovány savčí laktáza-florizin hydrolázou (lactase phlorizin hydrolasa), která rozloží výchozí sloučeniny na aglykony (daidzein, genistein a glycitein). To se děje v malé části v tenkém a převážně v hrubém střevě. Daidzein, genistein a glycitein pak mohou být buď absorbovány nebo metabolizovány působením enzymů bakterií přítomných v hrubém střevě. Studie přitom ukazují, že na metabolismu glykosidů izoflavonů se podílejí specifické skupiny mikroorganismů. Obecné schéma mechanismu střevní absorpce izoflavonů, tak jak mu v současnosti rozumíme, znázorňuje obrázek 3. Ačkoli prostředí střeva se střevními bakteriemi hraje klíčovou roli v konjugaci sójových izoflavonů, enterocyty také disponují účinným a specifickým transportním systémem. Glukuronidaci v prostředí enterocytu katalyzují isoenzymy UDP-glukuronyltransferázy (UDPGT) s tkáňovou a substrátovou specificitou. (Andersen, 2006, Badger, 2003, Setchell, 2002)

36

Obr. 3: Obecný mechanismu intestinální absorpce a metabolismu glykosidů izoflavonů. (podle Setchell, 2002) BLM – bazolaterální membrána MKL – membrána kartáčového lemu UDPGT - UDP-glucuronyltransferása

Fyziologické účinky izoflavonů Izolované a purifikované izoflavony byli rozsáhle studovány in vitro a byli u nich zjištěny významné vlivy na několik intracelulárních systémů. Mnoho z pozitivních zdravotních účinků spojených s konzumací sóje jsou atributy izoflavonů. Kromě estrogenních účinků považovaných za prospěšné pro ženy v menopauzálním období izoflavony snižují také riziko koronárních srdečních onemocnění. snižováním stupně oxidace cholesterolu, redukcí hladiny LDL cholesterolu a navozováním arteriální relaxace. Izoflavony hrají roli také v prevenci některých konkrétních nádorových onemocnění, jako je karcinom prsu. Předpokládá se také jejich podíl na možném snížení mortality karcinomu prostaty díky zabraňování latentní formě onemocnění v progresi do větších zhoubných forem tumorů. Příjem izoflavonů se také doporučuje v rámci prevence osteoporózy, zvláště v období menopauzy. Výhodou přírodních izoflavonů proti synteticky připravených estrogenům je jejich nízká kumulativnost v organismu. (Wang, 2008)

37

Estrogenní a antiestrogenní aktivita Nejaktivnější ženský pohlavní hormon steroidní povahy je estradiol. Patří do skupiny estrogenů vytvářených ve folikulech vaječníků. Řídí menstruační cyklus a do klimakteria snižuje riziko vzniku osteoporózy a kardiovaskulárních chorob. Před obdobím nástupu klimakteria tvorba tohoto hormonu slábne a v klimakteriu se zastavuje. (Kalač, 2003) V porovnání s fyziologickými estrogeny vykazují izoflavony nízkou aktivitu – přibližně 1000krát nižší než estrogen estradiol. Navzdory této relativně nízké potenci, jsou izoflavony schopny přivodit fyziologický efekt. Důvodem k tomu je, že koncentrace izoflavonů v krvi člověka konzumujícího sóju je mnohem vyšší než fyziologická hladina estrogenů. (Wardlaw, 1998) Antiestrogenní aktivita izoflavonů se projevuje při normální hladině estradiolu v krvi (období dospělosti do nástupu menopauzy). Za těchto podmínek izoflavony vstupují do kompetice s estradiolem, čím působí antiestrogenně. Estrogenní aktivita je pak typická pro období snížené sekrece pohlavních hormonů. V této situaci izoflavony nahrazují chybějící molekuly estrogenů. Z populačních studií vyplývá, že návaly horka se u Evropských žen během menopauzy vyskytují až v 70-80 % případů.. U východoasijských žen je to pouze v necelých 20 % případů. Možnost zmírnit četnost a intenzitu návalů konzumací sójových produktů byla již prokázána. Klinické studie se zabývali jak použitím běžných potravin tak i doplňků stravy s obsahem izoflavonů. Další potencionálně pozitivní efekty příjmu izoflavonů v období menopauzy (pokles LDL cholesterolu, zpevnění cévní stěny, snížení rizika odvápnění kosti a osteoporózy) zatím nebyli spolehlivě prokázány. Pro dosažení pozitivních účinů se pro tuto skupinu žen doporučená dávka pohybuje mezi 60 a 100 mg izoflavonů denně. Typická japonská dieta přitom obsahuje 20-50 mg/den. V typické Evropské stravě je to méně než 1 mg.(Kalač, 2003) Vliv na nádorové bujení Genistein ovlivňuje proces, při kterém jsou signály z buněčného povrchu transportovány do vnitra buňky a inhibuje aktivitu několika enzymů, které se podílejí na kontrole buněčného růstu a diferenciace (zahrnující rakovinné bujení). (Wardlaw, 1998) V několika studiích byl vysloven závěr, že zvýšená konzumace izoflavonů v období adolescence má preventivní účinek na vznik rakoviny prsní žlázy v pozdějším 38

věku. Také se předpokládá pozitivní efekt v prevenci rakoviny děložního čípku a rakoviny prostaty. Preventivní účinky sójových izoflavonů vůči některým typům rakoviny bývají hlavní motivací snah o zvýšený příjem. Tyto předpoklady ale zatím nebyli dostatečně prokázány. (Kalač, 2003) Prevence osteoporózy Stejně jako u předešlých pozitivních zdravotních efektů, také předpoklad, že konzumace sójových produktů má pozitivní vliv v prevenci osteoporózy potřebuje dlouhodobé populační studie k potvrzení. Někteří autoři přitom předpokládají, že efekt sójových izoflavonů na zdraví kostí je závislé také na individuální schopnosti produkovat metabolit izoflavonů – equol. (Higdon, 2009) Vliv na kognitivní funkce Vědeckých výzkumů věnujících se vlivu konzumace izoflavonů na kognitivní funkce je zatím velice málo. Většina těchto studií také pracovala se ženami v období menopauzy. Přesvědčivé důkazy zatím pořád chybí, ale dosavadní studie ukazují, že sójové izoflavony můžou mírně zlepšit kognitivní schopnosti lidí vyššího věku. (Higdon, 2009) Vliv na hladinu cholesterolu Ačkoli kontrolní studie na zvířatech naznačovali, že konzumace sóje může výrazně snížit hladinu LDL cholesterolu v krvi, nedávné klinické studie na lidech ukázali, že reálný efekt je mnohem menší. Dále bylo prokázáno, že výsledný efekt užívání izoflavonů závisí do značné míry na výchozí hladině sérového cholesterolu. Čím je hladina LDL cholesterolu vyšší, tím je také výraznější regulační efekt. U lidí s normální hladinou LDL cholesterolu byl zaznamenán pouze minimální pokles. (Higdon, 2009) Vliv na kardiovaskulární systém Současné studie zaměřených na efekt sójových izoflavonů na kardiovaskulární systém přinášejí smíšené výsledky. Ve studiích se převážně hodnotil vliv na vývoj aterosklerózy. Ačkoli studie zatím přesvědčivě nedokázali pozitivní vliv izoflavonů na vasodilataci, předběžné studie naznačují možný pozitivní efekt při prevenci vzniku aterosklerózy. (Higdon, 2009) Vliv na růst a vývoj Velkou pozornost poutá také problematika možných zdravotních účinků sójových izoflavonů na rané období života. Ačkoli studií věnovaných metabolismu izoflavonů v dospělém organismů je velký počet, jenom velice málo informací je dostupných o stejné 39

problematice u dětí a mládeže. (Andersen, 2006) Vzhledem k odlišnému složení střevní mikroflóry dětí a dospělých lze předpokládat i zásadní rozdíly v metabolismu izoflavonů. Studie zaměřené na dětskou populaci převážně studují vliv podávání SIF na další vývoj dítěte. V těchto studiích zatím nebyly prokázány žádné nežádoucí účinky nebo následky užívání těchto produktů. Potencionální zdravotní rizika izoflavonů Fytoestrogeny ve všeobecnosti mohou za určitých podmínek způsobit neplodnost u některých živočišných druhů, proto se velice důkladně zkoumají možnosti ohrožení lidského zdraví v této oblasti. Izoflavony některých druhů jetele v Západní Austrálii byly prokázány jako agens odpovědné za syndrom neplodnosti u ovcí. Na druhou stanu většina komerčně chovaných zvířat ve vyspělých zemích je krmena potravou obsahujících až 20% sóje bez zaznamenání jakéhokoli vlivu na fertilitu. Stejně tak nebyli nalezeny poruchy plodnosti u lidí žijících v oblastech s dlouhodobě vysokým příjmem sóje. Vzhledem k prokázané exkreci izoflavonů do mateřského mléka u matek konzumujících sóju, jsou také kojenci těchto matek vystaveni izoflavonům bez prokázaných vedlejších účinků. (Andersen, 2006) Klinické studie prokázali, že vysoké dávky estrogenů zvyšují náchylnost k onemocnění rakovinou prsu. Z tohoto faktu vychází i předpoklad, že stejné negativní důsledky může mít nadměrná konzumace sójových produktů. Tyto rizika ale zatím nebyli dokázány. (Livestrong, 2009) Prokazatelný negativní účinek mají izoflavony (genistein a daidzein) na funkci štítné žlázy. Působí jako tyroidální inhibitory – inhibují využití jódu štítnou žlázou. Z těchto důvody se lidem trpícím hypotyroidismem doporučuje omezení až vynechání potravin obsahujících sóju. (Livestrong, 2009) Posledním negativním účinkem izoflavonů je interakce s některými léky. Bylo prokázáno, že izoflavony ve velkých dávkách snižují účinnost antikoagulantů (například warfarin). Dalším podezřením z negativní interakce s izoflavony je zatíženo užívání tamoxifenu (lék předepisovaný při léčbě rakoviny prsu). (Livestrong, 2009) Vliv technologického zpracování na strukturu izoflavonů Většina izoflavonů je v rostlinách i ve zpracovaných potravinách vázána na sacharidy a tvoří s nimi glykosidy izoflavonoidy. Nefermentované sójové produkty obsahují 40

izoflavony většinou ve formě β-glukosidů, přičemž některé jsou esterifikované malonovou nebo octovou kyselinou. Fermentované sójové produkty obsahují převážně konjugované izoflavony ve formě aglykonů. (Andersen, 2006) Fenolická struktura a redoxní potenciál izoflavonů poskytují excelentní antioxidační aktivitu. Hydroxylové skupiny vázané na fenolickou strukturu k antioxidační aktivitě izoflavonů také přispívají. Nakolik jsou izoflavony nerozpustné v tucích, množství izoflavonů v sójovém oleji mnohem nižší než v sójových bobech. V odtučněné sójové mouce ale může být množství izoflavonů až 100 krát vyšší než v sójovém oleji. Taktéž bylo zjištěno, že celková antioxidační aktivita sójového oleje je nižší než antioxidační aktivita odtučněné sójové mouky, i když sójový olej obsahuje vyšší hladinu vitaminu E. Chemická struktura sójových izoflavonů v průběhu technologického zpracování sóje není stabilní. Izoflavony s β-glukosidy, daidzin, glycitin a genistin, které jsou hlavními zástupci izoflavonů v nezpracované sójové mouce se můžou z β-glukosidické formy přeměnit na formu aglykonů během termického procesu. Současně mohou být v sójové mouce produkovány deesterifikované formy malonylů a acetyl β-glukosidů. Faktory podílející se při produkci sójových potravin, jako enzymy v syrové mouce, zahřívání a přídatné látky mohou také ovlivnit stabilitu sójových izoflavonů. (Xu, 2009) Termickou stabilitu většiny sojových izoflavonů při různých teplotách sledoval Yue (2010). Monitorována byla degradace izoflavonů, a to jejich glukosidické formy a formy aglukonů. Yue na základě své studie zformuloval závěr, že rychlost degradace izoflavonů roste s teplotou. Pořadí jednotlivých izoflavonů podle stability od nejnižší po nejvyšší je glycitin < genistin < daidzin < glycitein < genistein < daidzein. (Yue, 2010) Studie provedená skupinou Kanadských vědců a publikována v Journal of Functional Foods v roce 2009 sledovala změny izoflavonů v průběhu technologické úpravy při výrobě funkčního chleba a to ze třech druhů sójových bobů rozdělených podle obsahu izoflavonů. Ve všeobecnosti v průběhu výroby sójové mouky došlo k obohacení izoflavony v důsledku odebrání oleje ze semen. Během výroby SPI došlo k poklesu množství izoflavonů a samotný proces výroby chleba již hladinu izoflavonů neovlivnil. Došlo ale k částečné konverzi glukosidů a acetylglukosidů na aglykony již před pečením. Během pečení byla pak zaznamenána degradace malonylglukosidů na acetylglukosidy (dekarboxylace) a dále na glukosidy (de-esterifikace). (Shao, 2009) 41

Změny obsahu a složení izoflavonů v potravinách hodnotila ve své přehledové studii Villares et al. (2011). Výsledky zaznamenává tabulka 1. Tab. 1: Změny izoflavonů během některých technologických procesů používaných při výrobě sójových potravin (Villares et al., 2011) Technologický proces

Podmínky

Změny izoflavonů

Namáčení

Pokojová teplota

ztráty

Vysoká teplota (100°C)

Degradace malonylů

Pokojová teplota

beze změn

Vysoká teplota (100°C)

Tvorba aglykonů

Vaření

Vysoká teplota (100°C)

Degratace malonylů, formace aglykonů

Koagulace

0.3% koagulant

ztráty

Odtučnění

Hexan

beze změn

Extrakce

Vysoká teplota

Formace aglykonů

Výchozí pH

Degradace malonylů

Precipitace

PH 4.5

Vysoká návratnost izoflavonů

Promývání

Kyselé pH

ztráty

Fermentace

Aspergillus

Formace aglykonů, degradace glukosidů

Bacillus subtilis

Formace aglykonů, degradace glukosidů

Rhizopus oligosporus

Formace aglykonů, degradace glukosidů

Mletí, drcení

Množství izoflavonů obsažených v doplňcích výživy sledovala Boniglia (2009) Bylo zjištěno, že množstevní údaje bývají často vyjadřovány nepřehledným a zavádějícím způsobem. Není specifikováno, zda údaj na obalu vyjadřuje množství izoflavonů v aglykonech nebo v konjugované formě. Boniglia doporučila deklarovat na obalu celkové množství izoflavonů ve výrobku, aby pak bylo možné provést porovnání s jinými produkty. Množství izoflavonů v doplňcích je extrémně variabilní (od 34 do 150 mg), Boniglia proto zdůrazňuje potřebu standardizovat doporučené dávky.

42

4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ

4.1 Přehled metod studia izoflavonů Hlavní roli ve studiu izoflavonů hraje detekce a identifikace. Mezi orientační rychlé techniky patří papírová chromatografie (PC), tenkovrstvá chromatografie (TLC) a méně často sloupcová chromatografie (CC). Pro stanovení jednotlivých izoflavonů v rostlinných extraktech a biologických materiálech jsou používány v první řadě chromatografické metody (vysokoúčinná kapalinová chromatografie – HPLC a plynová chromatografie – GC) a elektromigrační metody (kapilární elektroforéza -CE a micelární elektrokinetická chromatografie – MEKC). Informace o chemické struktuře izoflavonů lze získat spektrálními technikami. Mezi off-line metody patří spektrofotometrické metody v ultrafialové a viditelné (UV/VIS) nebo infračervené (IR) oblasti, hmotnostní spektrometrie (MR) a nukleární magnetická rezonance (NMR). Mezi on-line techniky patří GC, HPLC a CE ve spojení s detektorem s diodovým polem (UV/VIS/DAD), nebo detekcí pomocí hmotnostní spektrometrie HPLC/MS, HPLC-MS/MS, GC/MS, CE/MS. S úspěchem lze použít i kombinaci kapalinové chromatografie s nukleární magnetickou resonancí (HPLC/NMR). (Klejdus et al., 2003, Benešová, 2008, Vacek, 2008) Všechny výše uvedené techniky nezbytně vyžadují dokonalou přípravu vzorku. Protože klasické izolační postupy jsou značně neselektivní, musí být na předběžnou separaci jednotlivých skupin metabolitů kladen zvláštní důraz. (Klejdus et al., 2003, Benešová, 2008) Obrázek 4 schematicky znázorňuje průřez celým analytickým postupem ve studiu flavonoidů.

43

Obr. 4.: Schematické znázornění úpravy vzorků před analýzou a možnosti instrumentální analýzy (podle Rijke, 2006) Použité zkratky: LLE = extrakce kapalina -kapalina (liquid–liquid extraction); SE = extrakce rozpouštědlem (solvent extraction); MSPD = disperze matrice na pevné fázi (matrix solid-phase extraction); SPME = mikroextrakce na pevnou fázi (solid-phase micro-extraction); SPE = extrakce na pevnou fázi (solid-phase extraction); GC = plynová chromatografie (gas chromatography); LC = kapalinová chromatografie (liquid chromatography); MS = hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry); CE = kapilární elektroforéza (capillary electrophoresis); TLC = chromatografie na tenké vrstvě (thin layer chromatography)

4.1.1 Předběžná příprava vzorků Při přípravě vzorů se používají metody závislé na charakteru zkoušené potraviny. Při potravinách ve větších kompaktních formách se používá dělení, například zmenšování vzorku na děliči, řezání, krájení nebo kvartace. Kvartací se rozumí vyřazení dvou protilehlých čtvrtí, smíchání a znovu čtvrcení zůstatku, dokud není dosaženo požadované velikosti. U potravin složených z menších částí se pak používají techniky

44

pro snížení zrnění jako je drcení a mletí. U vzorků o odpovídající velikosti částic se pak použije homogenizace, například mísení, míchání. (Vyhláška č. 211/2004 Sb.) Flavonoidy obecně podléhají v rostlinném materiálu enzymové degradaci. Proto se doporučuje pro experimentální účely použití suchých, lyofilizovaných nebo mražených vzorků. Suché vzorky se ve všeobecnosti převedou do práškové formy. (Andersen, 2006) Při přípravě vzorku se provedou taková předběžná opatření, aby se zabránilo všem změnám, které by mohli ovlivnit výsledek zkoušky. 4.1.2 Extrakce Extrakční metody přípravy vzorku by měli odstranit možné interferenty ze vzorku a to jak pro separační, tak i pro detekční fázi. Tím se zvýší selektivita analytické metody. Dalším úkolem je zvýšit koncentraci analytu a zároveň pokud možno zvýšit senzitivitu systému. Cílem je upravit analyt do co nejvhodnější formy pro detekci nebo separaci a v neposlední řadě poskytnout robustní a reprodukovatelnou metodu, která je nezávislá na variacích v matrixu vzorku. (Badger, 2003) Nejdůležitější chemickou vlastností ovlivňující extrakci fytochemických látek je jejich polarita. Postupy pro extrakci izoflavonoidů lze podle Klejduse et al. (2003) rozdělit do pěti skupin: Extrakce polární kapalinou Kyselá hydrolýza Enzymatická hydrolýza Extrakce na tuhé fázi (SPE) Extrakce kapalinou v nadkritickém stavu (SFE) Extrakce polární kapalinou Pro extrakci polární kapalinou je potřeba dokonale homogenizovat vzorek. Používá se methanol, ethanol, acetonitril, jejich vodné roztoky o různé koncentraci nebo dichlormethan. (Klejdus et al, 2003) Podle Andersena (2006) lze použít také chloroform, diethyl ether a etyl acetát. Doba extrakce je závislá na použité extrakční kapalině a charakteru vzorku. Pohybuje se v řadech hodin až dní. Doba a účinnost extrakce závisí na zvoleném postupu, teplotě a způsobu a intenzitě třepání/míchání. (Klejdus et al, 2003) 45

Pohodlnou a často využívanou metodou je sekvenační kapalinová extrakce. V prvním kroku jsou při ní extrahovány aglykony flavonoidů a méně polární materiál použitím například dichlormethanu. V dalším kroku se použitím alkoholu extrahují glykosidy a polární látky. (Andersen, 2006) Kyselá hydrolýza Pro kyselou hydrolýzu se využívá vodních roztoků organických rozpouštědel (methanol, acetonitril, ethanol) s přídavkem kyseliny chlorovodíkové. Účinnost kyselé hydrolýzy je závislá na koncentraci kyseliny chlorovodíkové, koncentraci rozpouštědla a době extrakce. (Klejdus et al, 2003) V průběhu kyselé hydrolýzy jsou glykosidy převedeny na jednotlivé aglykony, čím se zjednoduší následná identifikace. Při výběru SPE sorbentů je pak potřeba přihlížet ke kyselému charakteru extraktu. Enzymatická hydrolýza Enzymatická hydrolýza je jemnější a šetrnější metoda než hydrolýza kyselá. Předpokladem pro úspěšnou enzymatickou hydrolýzu je dokonalá homogenizace vzorku a jeho extrakce 96% roztokem ethanolu. Následuje odpaření rozpouštědla pod vakuem a digesce acetátovým pufrem obsahujícím β-glukuronidasu/sulfatasu. Dalšími kroky jsou inkubace a centrifugace. Výhodou enzymatické hydrolýzy je šetrnost s výrazně lepší selektivitou v porovnání s předešlými metodami. Nevýhodou je relativní pracnost provedení.(Klejdus et al, 2003, Vacek et al., 2008) Enzymatická hydrolýza nabízí také on-line provedení v případě ukotvení enzymu ke koloně, kterou protéká vzorek. Extrakce na tuhé fázi Při SPE extrakci je vodný roztok vzorku protlačován přes malou kolonku naplněnou porézními částicemi pevné fáze. Jinou možností je použití membránového disku, který obsahuje částice sorbentu. K extrakci organických analytů dochází již na začátku extrakční kolonky. Použití SPE musí rovněž předcházet digesce vhodným rozpouštědlem. Klíčovým momentem je výběr vhodného sorbentu. K nejpoužívanějším patří modifikovaný silikagel C18, polymerní sorbenty na bázi kopolymeru N-vinylpyrrolidonu a 46

divinylbenzenu a kopolymeru styren-divinylbenzen (PS-DVB). Sorbenty PS-DVB eliminují řadu limitujících faktorů, kterými je zatíženo použití sorbentů na bázi alkylovaného silikagelu. Je to především nedostatečná retence polárních analytů, což může být příčinou nízké návratnosti. PS-DVB sorbenty jsou stabilní v širokém rozsahu pH a vykazují lepší retenci polárních analytů. Nevýhodou je horší smáčivost. Tento nedostatek na druhou stranu nemají polymery na bázi N-vinylpyrrolidonu. Vykazují dobrou smáčivost stejně jako retenci analytů. (Klejdus et al, 2003, Vacek et al., 2008) SPE může být rovněž použita jako vícestupňová separační metoda, dvoudimenzionální extrakce na tuhé fázi ( 2D SPE). Použití této metody vyžaduje především vhodné nastavení složení extrakčních rozpouštědel a to hlavně hodnoty pH a optimalizaci koncentrace použitého organického rozpouštědla. Pomocí 2D SPE lze dosáhnout maximální selektivity separace analytů a vyloučení většiny interferujících složek ze vzorku. Metoda umožňuje minimalizovat spotřebu materiálu, protože probíhá na jedné kolonce. (Benešová, 2008) Extrakce kapalinou v nadkritickém stavu Jak napovídá název metody, superkritická fluidní extrakce využívá solubilizačních vlastností kapalin v nadkritickém stavu. Pro tento druh extrakce se nejvíce používá oxid uhličitý. Výhodou metody je nižší spotřeba rozpouštědla, kontrolovatelná selektivita a nižší termická a chemická degradace proti například Soxhletově extrakci. (Andersen, 2006) Tato metoda vykázala dobré výsledky pro stanovení aglykonů izoflavonů, pro stanovovaní glykosidů nebyla příliš úspěšná. Pro zvýšení účinnosti a selektivity lze použít modifikátor (například methanol nebo acetonitril). (Klejdus et al, 2003) Další extrakční metody Kromě uvedených metod lze podle Andersena (2006) použít také další extrakční metody: Prvním příkladem je kapalinová extrakce za zvýšeného tlaku (PLE – pressurized liquid extraction).Při této metodě je extrakce akcelerována použitím vysoké teploty a vysokého tlaku. Zlepší se tím difuzibilita solventu a zároveň vzniká možnost pracovat v inertní atmosféře a za nepřítomnosti světla. Ultrazvuková extrakce je technika umožňující práci s nemísitelnými kapalinami, 47

nejčastěji hexanem a ředěným ethanolem. Mikrovlnná extrakce (MAE – microwave assisted extraction) byla popsána pro extrakci mnoha různých matric. Jde o jednoduchou techniku, která využívá energii mikrovln. Extrakce disperzní tuhou fází (MSDP - Matrix Solid Phase Dispersion) umožňuje extrakci analytu ze vzorků homogenně dispergovaných v tuhém nosiči. Tímto nosičem bývá zpravidla modifikovaný silikagel C18 nebo C8. Aplikace na extrakci flavonoidů je spíše výjimečná. (Vacek et al., 2008) Mikroextrakce tuhou fází (SPME – Solid Phase Micro Extraction) využívá jako stacionární fáze vlákna silikagelu potažená vhodným polymerem (polyakrylem, nebo polydimethylsiloxanem). Vlákno je ponořeno do vzorku za definovaných podmínek. K extrakci analytu dochází na polymerní vrstvě. Analyty jsou pak tepelně desorbovány plynnou mobilní fází v plynové chromatografii (GC), která na SPME navazuje. Výhodou je jednoduchost, extrakce velice malého množství analytu a kompletní přenesení analytu do GC. (Benešová, 2008) 4.1.3 Detekce a identifikace Pro detekci a identifikaci izoflavonů jsou nejčastěji používány chromatografické a elektromigrační metody. K orientačním technikám patří kromě papírové chromatografie (PC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC) také sloupcová chromatografie (CC). Kromě použití v detekci jsou tyto techniky využitelné také ve fázích přípravy vzorku. Nejúspěšnějšími detekčními technikami pro stanovení izoflavonů v biologických materiálech jsou z chromatografických metod HPLC – vysokoúčinná kapalinová chromatografie a GC – plynová chromatografie. Z elektromigtačních metod to jsou CZE - kapilární zónová elektroforéza a MEKC - micelární elektrokinetická chromatografie. Z nechromatografických metod se dále využívá hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) a specifická radioimunologická stanovení. Papírová chromatografie Papírová chromatografie (PC – Paper Chromatography) je starší a jednodušší metoda, která byla postupně nahrazena chromatografií na tenké vrstvě. Principem metody je uložení stacionární fáze v ploše (papíru) a ponoření okraje tohoto papíru do 48

rozpouštědla, které pak vzlíná a unáší analyty. Analyty jsou různou dobu zadržovány stacionární fází. (Štulík et al. 2004) Chromatografie na tenké vrstvě Chromatografie na tenké vrstvě (TLC – Thin Layer Chromatography) je známá už více než 100 let, ale využívat se začala až před třiceti lety. Od té doby se stala jednou z nejužívanějších chromatografických technik a nahradila PC. Klasická TLC je jednoduchá a finančně nenáročná metoda vyžadující minimální instrumentalizaci. Moderní varianta – vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC – High Performance Thin Layer Chromatography) využívá účinné stacionární fáze a její přesnost a správnost je srovnatelná s GC nebo HPLC. (Štulík et al. 2004) Uložení stacionární fáze je v TLC obdobné jako v PC. Tuhá stacionární fáze je nanesena v tenké vrstvě na vhodném podkladu. Mobilní fáze je zpravidla směsí rozpouštědel. TLC pro preparativní účely má tlustší vrstvu stacionární fáze. Pro separaci izoflavonů pomocí TLC se používá směs rozpouštědel CHCl3-MeOH v poměru 92/8 nebo 3/1. (Andersen, 2006) Sloupcová chromatografie Základem sloupcové chromatografie (CG – Column Chromatography) je svislá trubice přednostně z průhledného materiálu naplněná stacionární fází. Stacionární fáze je pak promývána fází mobilní, která unáší analyty. Ty jsou pak ve stacionární fázi zadržovány a na základě jejich retenčního času je prováděno vyhodnocení. Plynová chromatografie Plynová chromatografie (GC – Gas Chromatography) používá jako mobilní fázi plyn. Mechanismem účinku je rozdělení koncentrace analytu mezi stacionární a mobilní fázi na základě adsorpce a rozpustnosti. Předpokladem je rovnovážnost rozdělení. Na aparaturu GC navazuje sledovací zařízení, jehož signál je funkcí množství analytu a citlivosti. (Štulík et al. 2004) Všechny fytoestrogenní látky obsahují hydroxylové nebo karboxylové skupiny, kvůli kterým je z důvodu jejich polarity nutná derivatizace. Cílem derivatizace je snížení těkavosti a zlepšení chromatografických vlastností fytoestrogenních látek. V tandemu s GC se obvykle používá hmotnostní detekce. GC-MS analýzy obecně zahrnují 49

vícefázovou přípravu včetně extrakce na pevné fázi, přečistění a derivatizace. Ztráty během komplikované úpravy vzorku můžou být značné a musí být známé. Nutností při použití GC je použití vnitřních standardů. (Benešová, 2008) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High-Performance Liquid Chromatography) se vyvinula na počátku 70tých let z klasické kapalinové chromatografie. Vysoké účinnosti je HPLC dosaženo použitím stacionárních fází, které obsahují malé částice jednotné velikosti a pravidelného tvaru. Účinnost kolony je vyjádřena počtem teoretických pater, kterých může být až několik desítek tisíc na metr kolony. Průtok mobilní fáze je zajištěn vysokým tlakem a na rozdíl od plynové chromatografie se mobilní fáze také podílí na separaci. K detekci jsou je pak potřeba citlivého detekčního systému, který umožní kontinuální sledování látek na výstupu z kolony. (Štulík et al. 2004) Rozhodující vliv na separaci má velikost a uspořádání částic stacionární fáze. Čím menší jsou částice, tím je účinnost separace vyšší. Běžně se proto používají kolony s velikostí částic do 10 μm. Při HPLC izoflavonů se nejčastěji používá reverzní fáze na alkylovaných silikagelech C18 nebo C8. Separace je možná izokratickou i gradientovou elucí. Mobilní fázi tvoří směs methanolu, acetonitrilu, propan-1-olu, tetrahydrofuranu nebo ethanolu s vhodnými tlumiči (kyselina octová, mravenčí nebo trifluoroctová, octan amonný nebo fosfátový pufr. (Klejdus et al., 2003) Hlavním problémem separace flavonoidů je jejich slabá rozpustnost v solventech používaných pro chromatografii. Navíc se jejich rozpustnost snižuje s rostoucí čistotou vzorku. Slabá rozpustnost v mobilní fázi používané v chromatografii může vést k precipitaci na začátku kolony, co způsobí špatné výsledky, pokles průtoku až zablokování kolony. Není popsána jednotná izolační strategie pro flavonoidy a v některých případech je nutno udělat více kroků izolace. Výběr metody závisí na polaritě komponentů a kvantity vzorku. (Andersen, 2006) Analyty lze identifikovat na základě jejich retenčních časů nebo přídavkem inertního standardu. Tyto identifikace jsou vyjadřovány s určitou pravděpodobností. Pro zvýšení informační hodnoty výsledků se využívá kombinace porovnání retenčních 50

časů a porovnání UV-Vis-DAD absorpčních spekter měřených látek se spektry uloženými v knihovně spekter standardních látek s použitím srovnávacích faktorů. (Klejdus et al. a, 2005) Na detektory v HPLC jsou kladeny určité požadavky. Detektor musí mít malý vnitřní objem, aby bylo rozmytí elučních křivek co nejmenší. Signál detektoru by měl být stabilní a dobře reprodukovatelný, ideálně lineárně závislý na koncentraci v co nejširším rozsahu. Také je kladen důraz na vysokou citlivost a nízkou mez detekce. V současnosti jsou v podstatě všechny typy detektorů používaných v HPLC koncentrační a lze je rozdělit na selektivní (signál je úměrný pouze koncentraci detekovaného analytu v eluentu) a univerzální (signál je úměrný celkovým vlastnostem analytu a rozpouštědla). (Douša, 2010) V kombinaci s HPLC lze zvolit celou řadu detektorů. Nejpoužívanější jsou detektor refraktometrický – RI, detektor spektrofotometrický – UV/VIS, detektor infračervený – IR, detektor fluorimetrický – FLD, detektor elektrochemický – ECD, detektor diodového pole – DAD a hmotnostní detektor – MS. Podle Andersena (2006) jsou nejpoužívanější tandemy v analýze flavonoidů HPLC-UVS, DAD, HPLC-MS a HPLC-NMR. Centrifugační rozdělovací chromatografie Centrifugační rozdělovací chromatografie (CPC - Centrifugal Partition Chromatography, také označována jako CDCCC - Centrifugal Droplet Countercurrent Chromatography) má několik významných výhod. Je to žádná nevratná adsorpce vzorků, jednoduché kvantitativní vyhodnocení záznamu, nízké riziko denaturace vzorku, nízká spotřeba solventu a příznivé ekonomické podmínky. Touto technikou se povedlo podle Andersena (2006) izolovat čtyři izoflavony ze sójového extraktu: glycitein, daidzein, acetylgenistin a acetyldaidzin. Použit byl přitom systém rozpouštědel CHCl3-MeOH-H2O v poměru 4:3:2. (Andersen, 2006) Kapilární zónová elektroforéza Při kapilární zónové elektroforéze (CZE - Capillary Zone Electrophoresis) jsou nabité molekuly analytu unášeny elektroosmotickým tokem separačního pufru k detektoru. Celý proces probíhá v kapiláře. Protože se ionty analytu pohybují v pufru rozdílnými elektroforetickými rychlostmi, dochází k separaci. Během jednoho experimentu lze dělit 51

a detekovat kladně i záporně nabité molekuly (ionty). Micelární elektrokinetická chromatografie Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC - Micellar Electrokinetic Chromatography) je označována jako hybridní metoda mezi chromatografií a elektroforézou. Pomocí MEKC lze dělit i neutrální látky. Principem metody je přídavek surfaktantu do základního elektrolytu a to v takové koncentraci, kdy se právě vytvoří micely. Jednotlivé analyty interagují nevazebnou hydrofobní interakcí s jádrem micel při postupu aparaturou k detektoru a tím jsou různou mírou zpomalovány. Tenzidy mohou mít náboj a pak se též pohybují buď směrem k detektoru, nebo proti němu. Základní tenzidy užívané v MEKC jsou SDS (sodná sůl dodecylsulfonové kyseliny), CTAB (cetyltrimethylamonium bromid) a TRITON X-100. Výhodou metody je relativní jednoduchost. (Štulík et al. 2004) MALDI-TOF Ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) v kombinaci s detektorem doby letu (TOF – Time-Of-Flight) se používá pro určení vyšších molekulových hmotností. Principem metody je změření dobu průletu částice detektorem. Z této doby lze pak vypočítat rychlost částice. Hmotnostní spektroskopie MALDI byla původně vyvinuta pro kvalitativní analýzu peptidů a bílkovin, ale byla již u úspěchem použita také při analýze flavonoidů. Výhodou MALDI-TOF je vysoká citlivost a rychlost měření. Nevýhodou je náročná instrumentalizace. Radioimunologická stanovení Radioimunologická stanovení jsou hojně využívána pro analýzu všech fytoestrogenů. Imunologická stanovení využívají protilátky, které tvoří vazbu s cílovým antigenem. Reakce probíhá in vitro za přítomnosti radioaktivně značené sloučeniny jako indikátoru. Vazebná místa protilátek se nekovalentně vážou na cílový analyt (antigen). Protože je vznik vazby závislý na tvaru molekuly antigenu, nikoli na chemických vlastnostech, protilátky netvoří vazbu s látkami s odlišnou strukturou. (Benešová, 2008) Mezi výhody radioimulogických analýz patří vysoký screeningový potenciál, vysoká sensitivita a specificita a relativně nízká cena. Nevýhodou je poměrně obtížná 52

izolace a příprava protilátek. Nejvíce využívané imunologické metody specificita pro analýzu fytoestrogenů jsou metody s radioaktivním značením (RIA - Radio Immuno Assay), enzymatická imuno-analýza (ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) a časově rozlišitelné fluoro-imunologické stanovení (TR-FIA - (Time Resolved Fluorescence Immuno Assay). (Benešová, 2008, Vítková, 2004)

4.2 Experimentální část Pro stanovení množství izoflavonů ve vybraných vzorcích sójových produktů byla zvolena metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie v tandemu s detektorem diodového pole. Kombinace vysoce efektivní chromatografické techniky s efektivními izolačními a purifikačními technikami je nanejvýš vhodná pro kvantitativní analýzu izoflavonů. (Klejdus et al., b, 2005) 4.2.1 Výběr vzorků Výběr vzorků proběhl v rámci lokálního trhu v sítích prodejen s potravinami a lékárnách. Cílem výběru bylo získání různorodých vzorků, které by kopírovali nabídku sójových produktů v České republice. K výběru nebyli použity internetové obchody. Upřednostněny byli výrobky běžně dostupné před výrobky netradičními. Pro chemickou analýzu byly vybrány výrobky suchého charakteru. Tabulka 2 zaznamenává výrobky vybrané pro chemickou analýzu s údaji uvedenými na obalech.

53

Tab. 2: Výrobky vybrané pro chemickou analýzu Číslo Název výrobku vzorku

Výrobce/distri Velikost Složení butor balení [g]

1

Sója

Druid, původ Kanada

2

500

Sójové boby

Bio Sója, sója z PRO-BIO ekologického zemědělství

500

Sójové boby

3

Sójové kostky, texturovaný sójový výrobek

Bonavita

100

Sójová mouka odtučněná, voda

4

Sója natur, sójový granulát

Haas

100

Sójová mouka odtučněná

5

Sójová mouka hladká, plnotučná

Extrudo

350

Sójové boby

6

Sójový nápoj Zajíc plus

Mogador

350

Sušený kukuřičný sirup, čístečně dehydrogenovaný sójový olej, tepelně upravená sója, sójový lecithin

7

Isoflavone, doplněk stravy Sanamed s obsahem sojových GesmbH izoflavonů

30 kapslí

1kapsle: 100mg sójového extaktu s následujícím složením: izoflavony celkem 40mg, genistein 10mg, daidzein 10mg, přísady: inulin, extrakt ze sójových bobů, hydroxypropylmethylcelulóz a, strearát hořečnatý

4.2.2 Předběžné zpracování Z každého výrobku byl odebrán vzorek o hmotnosti cca 10g. Tento pak byl předběžně upraven. Vzorky 1,2 a 3 (sójové boby, sójové kostky) byly pomlety na laboratorním mlýnku. Vzorek 4 (sójový granulát) byl rozdrcen v hmoždíři. K mletí byl použit mlýnek Ika Grinder Mill Model A10 A-10 2 prong. Sójová mouka a sójový nápoj byly přesety přes síto. Vzorek izoflavonů (doplňku stravy Isoflavone) byl zvážen v kapsli a následně byl obsah kapsle důkladně vyprázdněn a použit pro analýzu. Pro výpočet absolutní hmotnosti vzorku byla od hmotnosti celé kapsle odpočítána hmotnost prázdného obalu. 4.2.3 Extrakce Z každého vzorku bylo naváženo po 0,2g s přesností na 4 desetinná místa. Navážky vzorků zaznamenává tabulka 3. 54

Tab 3: Přesné navážky vzorků použitých pro analýzu Číslo Název výrobku vzorku

Navážka E1 [g]

Navážka E2 [g]

1

Sója

0,2008

0.2001

2

Bio Sója, sója z ekologického zemědělství

0,2002

0.2004

3

Sójové kostky, texturovaný sójový výrobek

0,2008

0.2003

4

Sója natur, sójový granulát

0,2007

0.2005

5

Sójová mouka hladká, plnotučná

0,2008

0.2004

6

Sójový nápoj Zajíc plus

0,2002

0.2008

7

Isoflavone, doplněk stravy s obsahem sojových 0,2682 izoflavonů

0.2682

E1 – extrakce 1 (na laboratorní třepačce) E2 – extrakce 2 (na zkumavkovém homogenizátoru)

Pro extrakci byly vybrány dvě metody: extrakce pomocí laboratorní třepačky a extrakce pomocí homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX. Pro obě extrakce bylo použito jako rozpouštědlo 80% methanol. Methanol pro analýzu byl získán naředěním 99.9% methanolu. Vzorky pro extrakce na laboratorní třepačce byly naváženy do zkumavek a doplněny 10 ml 80% methanolu. Zkumavky byly třepány po dobu 60mi při 30°C v horizontální poloze. Pro extrakci použitím IKA ULTRA-TURRAX® Tube Drive Workstation byly vzorky naváženy do zkumavek. Přidáno bylo 10 ml 80 % methanolu ke každému vzorku. Do každé ze zkumavek byly přidány tři skleněné kuličky a vzorky byli homogenizovány na homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX® Tube Drive Workstation po dobu 2x 29 min při laboratorní teplotě. Po celou dobu homogenizace bylo důsledně dbáno na to, aby nedošlo ke ztrátám vzorků v důsledku netěsností homogenizačních zkumavek. Po skončení homogenizace byli vzorky z obou extrakcí přefiltrovány přes filtrační papír do odměrných baněk na 10ml. Baňky pak byly doplněny 80% methanolem na objem 10ml. Vzorky byli až do provedení chromatografické analýzy skladovány ve tmě při teplotě 4°C. Před použitím vzorků pro chromatografickou analýzu byly všechny vzorky přefiltrovány přes LUT Syringe Filter Nylon (Labicom) s parametry 13mm, 0,45 μm, 55

pk/100. 4.2.4 Chromatografická analýza Pro instrumentální analýzu vzorků byla zvolena metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie v tandemu s detektorem diodového pole. Schematické znázornění aparatury HPLC je na obrázku 5.

Obr. 5: Schematické znázornění HPLC (upraveno podle Kos, 1998) Využito bylo přístroje HP 1100 (Hewlett- Packard, USA). Přístroj je vybaven vakuovým odplynovačem, binární pumpou, autosamplerem, a kolonovým termostatem a DAD detektorem pracujícím v rozsahu 190 nm až 270nm. Pro separaci byla použita chromatografická kolona Zorbax SB-C18 (výrobce Agilent, USA) s následujícími parametry: průměr kolony4,6mm, délka 75mm, velikost částic 3,5μ. Průtoková rychlost byla nastavena na 1ml/min a teplota 45 °C. Pro mobilní fázi byla zvolena gradientová eluce dvou mobilních fází: A – acetonitrilu (ACN) a B – 0.2 % kyseliny octové. Gradientovou eluci mobilních fází zaznamenává graf 2. Procento ACN stoupalo v čase ze 14% (v čase 0 min) až na 60% (v čase 9 min) a opětovně klesalo na původních 14% (dosaženo v čase 15 min). Grafické znázornění gradientové eluce je v grafu 2 a vlastnosti použitých rozpouštědel jsou v tabulce 4.

56

Gradientová eluce 90 80

mobilní fáze [%]

70 60 mobilní fáze A mobilní fáze B

50 40 30 20 10 0 0

9

15

20

čas [min]

Graf 1: Gradientová eluce mobilních fázi použita při analýze izoflavonů. Mobilní fáze A = ACN, mobilní fáze B = 0,2 % kyselina octová

Tab 4: Vlastnosti rozpouštědel použitých v analýze izoflavonů Absorpční hrana = vlnová délka, při které rozpouštědlo způsobuje absorbanci rovnou jedné v optické dráze 1cm.

rozpouštědlo

Acetonitril

Absorpční hrana [nm]

Kyselina octová

190

230

1.341

1.370

82

118

Viskozita při 25°C [mPa.s]

0.34

1.06

Parametr polarity

5.8

6.0

Index lomu Teplota varu [°C]

Jako standard byl použit standardní roztok izoflavonů od firmy Sigma Aldrich. Jednotlivé složky byli v standardu v koncentraci 1mg/100ml. V nástřiku 1 μl pak byl obsah jednotlivých složek 10ng na kolonu. Standard byl skladován stejně jako vzorky bez přístupu světla při teplotě 4°C. Pro vyhodnocení byla zvolena metoda vnějšího standardu. Pro vytvoření kalibrační křivky byly použity tři nástřiky standardu a to v objemu 1 μl, 2 μl a 3 μl. Vzorky byli nastřikovány v objemu 5 μl s výjimkou vzorku doplňku stravy Isoflavone, který byl po extrakci pomocí homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX nastříknut v objemu 0.5 μl. 57

4.2.5 Detekce V analýze izoflavonů v sójových potravinách byl použit detektor diodového pole (DAD), který je součástí systému HP 1100 (Hewlett-Packard, USA). DAD je vícekanálový systém, který snímá celé spektrum v reálném čase bez přerušení chromatografické separace. Schematické znázornění detektoru s diodovým polem je na obrázku 6. UV spektrum izoflavonů je charakteristické dvěma hlavními absorpčními maximy. První je v rozmezí 245-270 nm a druhé v rozmezí 300-360 nm. (Badger, 2003)

Obr. 6: Schéma detektoru s diodovým polem (Douša, 2010) 1 – zdroj záření, 2 – štěrbina, 3 – čočka, 4 – clona, 5 – měrná cela detektoru, 6 – holografická mřížka, 7 – diodové pole

Parametry detektoru diodového pole použité pro HPLC-DAD analýzu izoflavonů zaznamenává tabulka 5. Tab. 5: Parametry DAD detektoru pro analýzu izoflavonů Kanál

Vlnová délka [nm] Šířka pásma [nm]

Referenční hodnota

Kanál 1

254

16

360 nm při 100 nm

Kanál 2

270

16

400 nm při 100 nm

4.2.6 Vyhodnocení chromatografu Kvalitativní vyhodnocení chromatografu bylo provedeno na základě porovnání retenčních časů analyzovaných vzorků s retenčními časy standardů. Retenční časy byli určeny podle polohy vrcholů píků. Pro určení přesnosti systému HLPC – DAD bylo využito statistických metod. 58

Kvantitativní vyhodnocení chromatografu bylo provedeno vyhodnocením píků pomocí softwaru ChemStation – Instrument1 pro vyhodnocování chromatografických dat. 4.2.7 Statistická analýza Všechny vzorky byly extrahovány a analyzovány v trojím provedení. Data byla analyzována použitím základních statistických funkcí: průměr, směrodatná odchylka a procento směrodatné odchylky. Pro stanovení přesnosti systému HPLC – DAD bylo použito standardní analýzy rozptylu (ANOVA – analysis of variance), konkrétně single factor ANOVA. Pro potřeby diskuse výsledků s odbornou literaturou bylo využito sloupcových grafů s funkcí chybových čar.

59

5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE Tato kapitola hodnotí výsledky získané analýzou vzorků sójových produktů metodou HPLC-DAD. Kromě vyhodnocení výsledků běžnými statistickými metodami jsou výsledky získané analýzou porovnány s hodnotami z jiných studií a z dat dostupných v USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods. USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods je databáze vytvořena společným úsilím United states Department of Agriculture, Iowa State University, Food Composition Laboratory a Nutrient Data Laboratory. Hodnoty pro obsah izoflavonů v potravinách byly pro potřeby této databáze sesbírány z vědeckých článků publikovaných v renomovaných časopisech. Dalším zdrojem dat pro databázi byly studie sójových produktů prováděné na Iowa State University. Databáze uvádí souhrnná data, data pro daidzein, genistein a glycitein, přičemž nerozlišuje glukosidy a aglykony.

5.1 Výsledky měření izoflavonů ve vzorcích sójových produktů 5.1.1 Porovnání extrakčních technik Při optimalizaci metody extrakce vzorků bylo zjištěno významného rozdílu mezi zvolenými extrakčními technikami. Grafické znázornění porovnání účinnosti extrakce pomocí laboratorní třepačky a extrakce pomocí IKA ULTRA-TURRAX homogenizátoru je v grafu 2 a grafu 3.

Porovnání účinností extrakcí 0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

sója Bio sója

E1 E2

Sójová mouka Sójový granulát Sójové kostky Sójový nápoj

celkové množství izoflavonů [mg/100g]

Graf 2: Porovnání účinnosti extrakce použitím laboratorní třepačky a homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX E1 – extrakce 1 (na laboratorní třepačce) E2 – extrakce 2 (na homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX)

60

Porovnání účinnosti extrakcí u doplňku výživy 2 1 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Celkové množství izoflavonů v doplňku výživy [mg/100g]

Graf 3: Porovnání účinnosti extrakcí u doplňku výživy Isoflavone 1 – extrakce 1 (na laboratorní třepačce) 2 – extrakce 2 (na homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX)

Již z grafů je patrný rozdíl v účinnosti extrakce. Tabulka 6 zaznamenává procentuální podíl získaného množství izoflavonů metodou třepání na laboratorní třepačce vůči metodě extrakce použitím IKA ULTRA-TURRAX homogenizátoru. Nejnižších hodnot bylo dosaženo u obou vzorků sójových bobů a u vzorku sójového granulátu. Na základě tohoto porovnání byla pro další hodnocení zvolena extrakce použitím IKA ULTRATURRAX homogenizátoru. Tab 6: Porovnání výsledků extrakcí s procentuálním vyjádřením účinnosti sója Bio sója Sójová mouka Sójový granulát Sójové kostky Sójový nápoj Doplněk výživy

E1 [mg/100g] [%] E2 [mg/100g] 4,13644 3,5900648061 115,21909 7,43589 6,6409912407 111,96958 75,83272 57,038251189 132,95064 45,15754 9,9651212789 453,15595 89,62289 67,501114312 132,77246 2,70416 79,551665809 3,39925 5996,89464 81,535784606 7354,92357

5.1.2 Hodnocení přesnosti systému HPLC-DAD Přesnost systému HPLC-DAD byla zhodnocena na základě ANOVA analýzy shodnosti retenčních časů. Hodnoty retenčních časů jsou zaznamenány v příloze 8. V tabulce 7 jsou pro názornost vyjmuty průměrné hodnoty a směrodatné odchylky. Tab 8 zaznamenává výsledek analýzy ANOVA. Nakolik vypočtená hodnota koeficientu F (0,0004377) je menší, než tabelovaná hodnota koeficientu Fkrit na 95% hladině spolehlivosti, lze přijmout nulovou hypotézu a konstatovat, že mezi naměřenými retenčními časy není statisticky významný rozdíl.

61

Tab 7: Rozdíly v retenčních časech jednotlivých izoflavonů izoflavon daidzin glycitin genistin daidzein glycitein genistein

průměr SD 2,6064285714 2,7371428571 3,6281428571 5,0594285714 5,2032857143 6,2585714286

% RSD 0,0171868483 0,6594022375 0,0244915646 0,8947857617 0,0261229432 0,7200086729 0,0163694589 0,3235436302 0,0528386068 1,0154854008 0,0115864101 0,1851286701

Tab.8: Výsledky analýzy ANOVA pro retenční časy izoflavonů ANOVA Zdroj variability SS Mezi výběry 0,0057663 Všechny výběry 76,852982 Celkem

76,858748

Rozdíl

MS F Hodnota P F krit 6 0,0009611 0,0004377 1 2,3717812 35 2,1957995 41

SS = součet čtverců, MS = průměrný čtverec, F = vypočtený koeficient, F krit = tabelovaná kritická hodnota koeficientu F

5.1.3 Vyhodnocení výsledků HPLC-DAD analýzy izoflavonů Vzorky izoflavonů extrahovány použitím IKA ULTRA-TURRAX homogenizátoru byly podrobeny kvalitativní a kvantitativní analýze na HPLC-DAD systému. Měření byli provedeny ve třech opakováních. Výsledky s provedenými statistickými operacemi jsou v příloze 9. Výpočty byly provedeny při vlnové délce 270 nm a šířce pásma 16 nm pro nástřik 5 μl u vzorků 1 – 6 a pro nástřik 0,5 μl u vzorku 7 (doplněk výživy). Graf 4 a graf 5 graficky znázorňují obsah jednotlivých izoflavonů ve vzorcích. Z grafů je patrné, že daidzin byl detekován pouze ve vzorku sóje Druid (vzorek 1) a ve vzorku doplňku výživy Isoflavone (vzorek 7). Nejvyšší podíl izoflavonů u většiny vzorků měl genistin. Daidzein a genistein byli detekovány ve velice malých množstvích. Větší množství izoflavonů bylo ve formě glukosidů s výjimkou doplňku výživy Isoflavone (vzorek 7), ve kterém byl poměr glukosidů a aglykonů vyrovnaný

62

Obsah izoflavonů v sójových produktech 80 70

množství [mg/100g]

60 50

Sója Bio sója sójová mouka sójový granulát sójové kostky sójový nápoj

40 30 20 10 0 daidzin

glycitin

genistin

daidzein

glycitein

genistein

izoflavony

Graf 4: Obsah izoflavonů v sójových produktech

Obsah izoflavonů v doplňku výživy 3000

množství [mg/100g]

2500 2000 1500 průměr 1000 500 0 glycitin daidzein genistein daidzin genistin glycitein

izoflavony

Graf 5: Obsah izoflavonů v doplňku stravy

5.2 Obsah izoflavonů v sójových bobech V této práci byly analyzovány dva vzorky sójových bobů. Prvním byly sójové boby Druid, původem z Kanady, druhým boby PRO-BIO, původem z České republiky. Celkové naměřené množství izoflavonů bylo ve vzorku 1 (sójové boby Druid) 114,98 mg / 100 g a ve vzorku 2 (sójové boby PRO-BIO) 113,1 mg / 100 g . Přehledová 63

tabulka hodnot je v příloze 9. Porovnání obsahu izoflavonů naměřeného v sójových bobech Druid (vzorek 1) a v sójových bobech PRO-BIO (vzorek 2) je znázorněno v grafu i s vyznačenými směrodatnými odchylkami. Z grafu 6 je patrné, že nejen celkové množství izoflavonů, ale také profil je podobný. Největší zastoupení u obou vzorků mají glukosidy glycitin a genistin, aglykony byli naměřeny pouze v malém množství.

Obsah izoflavonů ve vzorcích sóje 120 110 100

množství [mg/100g]

90 80 70 60

Sója Druid Bio Sója

50 40 30 20 10 0 daidzin

glycitin

genistin

daidzein

glycitein

genistein

celkem

izoflavony

Graf 6: Obsah izoflavonů ve vzorcích sójových bobů sója Druid = vzorek 1 Bio sója PRO-BIO = vzorek 2

Naměřené hodnoty vzorků sójových bobů Druid (vzorek 1) a sójových bobů PRO-BIO (vzorek 2) byly porovnány s hodnotami v databáze USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods pro některé země pěstující sóju. Tabulka 9 zaznamenává obsah izoflavonů v sójových bobech tak, jak je prezentuje USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods.

64

Tab. 9: Obsah izoflavonů v sójových bobech (podle USDA Database on the Isoflavone Content of Selected Foods, verze 2.0, citováno 25.4.2010) Původ bobů

Celkem [mg/100 g ]

Rozsah [mg/100 g ]

Daidzein [mg/100 g ]

Rozsah [mg/100 g ]

Genistein [mg/100 g ]

Rozsah [mg/100 g ]

Glycitein[ Rozsah mg/100 g [mg/100 g ] ]

Všechny zdroje

154.53

10.04 – 440.72

62.07

2.64 – 191.43

80.99

5.56 – 276.21

14.99

0.0 – 121.69

Austrálie

120.84

50.8 – 305.8

39.88

7.3 – 112 65.64

26.4 – 175

17.12

7.29 – 42.4

Brazílie

99.82

42.54 188.00

29.09

9.89 – 87.42

67,57

25.88 110.98

13.10

4.56 – 20.49

Čína

118.28

77.67 – 182.8

53.38

24.40 – 96

57.98

43.35 – 72.3

11.71

5.56 – 15.08

Evropa

103.56

45.38 – 161.22

45.44

2.64 – 69.69

39.78

9,7 – 109.25

22.37

45.38 – 50.58

Japonsko

130.65

34.22 – 253.09

45.95

7.45 – 113.8

74.33

13.00 – 156.7

9.01

2.7 – 20.4

Korea

178.81

20.02 – 380.9

78.86

7.51 – 144.92

89.32

10.13 – 221.85

18.76

1.25 – 47.82

Taiwan

85.68

10.04 – 196.6

27.77

3.31 – 94.75

45.88

5.56 – 83.55

13.24

1.17 – 24.75

USA

159.98

18.08 – 388.08

61.33

9.88 – 191.43

86.33

19.79 – 180.19

13.33

1.16 – 121.69

Graf 7 porovnává průměrné hodnoty izoflavonů naměřené ve vzorcích sójových bobů Druid (vzorek 1) a sójových bobů PRO-BIO (vzorek 2) s průměrnými hodnotami pro některé světové producenty sóje. Na grafu X lze vidět, že oba vzorky se přibližují průměrným hodnotám izoflavonů v sóji pěstované v Číně a v Evropě. Lze říct, že oba vzorky sójových bobů patří mezi sójové boby se středním obsahem izoflavonů ( v rozmezí 100 – 120 mg / 100g)

65

Porovnání obsahu izoflavonů vzorků 1 a 2 s databází 200

množství izoflavonů [mg/100g]

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Brazílie

Evropa sója (vz.1) Austrálie USA Bio sója (vz. 2) Čína Japonsko

Korea

průměrné hodnoty krajin

Graf 7: Porovnání obsahu izoflavonů vzorků 1 a 2 s databází

5.3 Obsah izoflavonů v sójové mouce Sójová mouka hladká plnotučná od výrobce Extrudo, Bečice byla analyzována jako jediný vzorek mouky (vzorek 5). Graf 8 znázorňuje složení izoflavonů v mouce. Celkové naměřené množství izoflavonů dosáhlo 132,05 mg / 100 g . Největší podíl tvořili glycitin a genistin. Daidzein a genistein byly naměřeny v malých množstvích, daidzin nebyl detekován.

Obsah izoflavonů ve vzorku mouky 140

množství [mg/100g]

120 100 80 60 40 20 0 glycitin

genistin

daidzein

glycitein

genistein

izoflavony

Graf 8: Obsah izoflavonů ve vzorku sójové mouky hladké, plnotučné 66

celkem

Tabulka 9 zaznamenává obsah izoflavonů v sójových moukách tak, jak je prezentuje USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods. Z tabulky vyplývá, že všechny sójové mouky, včetně texturované a pražené si zachovávají vysoký obsah izoflavonů. Tab. 9: Obsah izoflavonů v sójových moukách (podle USDA Database on the Isoflavone Content of Selected Foods, verze 2.0, citováno 25.4.2010) Sójová mouka

Celkem

Rozsah

Daidzein Rozsah

[mg/100 g ]

[mg/100 g ]

[mg/100 g ]

[mg/100 g [mg/100 g ] ]

Genistein Rozsah [mg/100 g ]

Glycitein Rozsah [mg/100 g [mg/100 g ] ]

Texturova 148.61 ná

4.40 295.55

59.62

1.65 123.25

78.9

2.75 144.02

20.19

15.60 28.28

odtučněná 131.19

73.72 168.09

57.47

22.60 93.90

71.21

46.51 100.54

7.55

3.95 9.89

Plnotučná 177.89 syrová

59.80 264.84

71.19

18.20 130.92

96.83

6.39 145.23

16.8

4.80 24.83

Plnotučná 195.97 pražená

131.70 260.50

99.27

87.65 119.20

98.75

70.74 126.90

16.4

14.40 18.40

Grafické porovnání naměřeného celkového množství izoflavonů ve vzorku sójové mouky (vzorek 5) a průměrných hodnot různých druhů sójových mouk je v grafu 9.

Porovnání obsahu izoflavonů vzorku 5 s databází obsah izoflavonů [mg/100g]

250 200 150 100 50 0 odtučněná

plnotučná (vz.5) plnotučná syrová Texturovaná plnotučná pražená

sójová mouka

Graf 9: Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorku plnotučné sójové mouky s databází. 67

Z grafického porovnání vyplývá, že všechny druhy tržných sójových mouk obsahují významné množství izoflavonů. Mouka analyzovaná metodou HPLC-DAD vykazovala střední množství izoflavonů v porovnání s databází. Většina izoflavonů přitom byla ve formě aglykonů, což odpovídá předpokladům studie Villares et al.(2011).

5.4 Obsah izoflavonů v granulátu a v sójových kostkách Texturované sójové výrobky patří u nás k nejpoužívanějším a nejoblíbenějším sójovým produktům. Pro HPLC-DAD analýzu byli vybrány dva výrobky: sójový granulát Natur (vzorek 4) a sójové kostky Bonavita (vzorek 3). Z grafu 10, který porovnává množství izoflavonů naměřené v těchto dvou produktech , je zřetelný podobný profil obsažených izoflavonů. Celkové množství naměřené v sójovém granulátu bylo 132,46 mg/100g a v sójových kostkách 147,41 mg/100g. Daidzin nebyl ani u jednoho vzorku detekován, daidzein a genistein byli naměřeny v malém množství.

Obsah izoflavonů v sójovém granulátu a sójových kostkách 160 140

množství [mg/100g]

120 100 80

Sójový granulát Sójové kostky

60 40 20 0 daidzin

glycitin

genistin

daidzein

glycitein

genistein

celkem

izoflavony

Graf 10: Obsah izoflavonů v sójovém granulátu a sójových kostkách

Tabulka zaznamenává obsah izoflavonů v sójových potravinách tak, jak prezentuje USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods. Potraviny v tabulce byly pro porovnání s analyzovanými vzorky vybrány z důvodu podobných technologických postupů při výrobě. 68

Tab. 10: Obsah izoflavonů ve vybraných sójových potravinách (podle USDA Database on the Isoflavone Content of Selected Foods, verze 2.0, citováno 25.4.2010) Celkem

Rozsah

Daidzein

Rozsah

Genistein Rozsah

Glycitein Rozsah

[mg/100 g] [mg/100 g] [mg/100 g] [mg/100 g] [mg/100 g] [mg/100 g] [mg/100 g] [mg/100 g]

Sójová 209.58 potravina, odtučněná, syrová

125.82 – 225.15

80.77

57.4787.45

114.71

68.35 – 127.38

16.12

13.69 – 16.61

Sójové 131.53 vločky odtučněné

61..34 – 244.1

37.47

13.92 – 88.04

91.22

44.41 – 156.06

14.23

1.71 – 26.76

Sójové vločky, plnotučné

21.12 – 207.89

21.75

7.01 – 74.35

39.57

13.19 – 131.96

1.12

0.92 – 1.90

62.31

Graf porovnává celkové množství izoflavonů naměřené ve vzorcích sójového granulátu Natur (vzorek 4) a sójových kostek Bonavita (vzorek 3) s průměrnými hodnotami u výrobků vyráběných podobným technologickým postupem. Z dostupných dat nelze soudit, jestli bylo množství izoflavonů ve výrobcích ovlivněno technologickou úpravou.

Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorcích 3 a 4 s databází 250

množství [mg/100g]

200

150

100

50

0 sójové vločky, odtučněné sójové kostky (vz.3) sójové vločky,plnotučné sójový granulát (vz.4) sójová potravina odtučněná

Graf 11: Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorcích sójového granulátu a sójových kostek

69

5.5 Obsah izoflavonů v sójovém nápoji Sójový nápoj Zajíc je jediný potravinářský výrobek zařazených do HPLC-DAD analýzy, který obsahuje kromě sóje a vody i jiné složky. Jsou to sušený kukuřičný sirup, částečně hydrogenovaný sójový olej a sójový lecithin. Naměřené hodnoty izoflavonů pomocí HPLC-DAD dosahovali velice malých hodnot a z toho důvodu i vysoké směrodatné odchylky (viz graf ). Ve vzorku sójového nápoje zajíc nebyl vůbec detekován daidzin a glycitein. Ostatní izoflavony byli detekovány ve velice malém množství. Celkové množství izoflavonů bylo naměřeno pouze 3,85 mg/100g.

Obsah izoflavonů v sójovém nápoji 5 4,5

množství [mg/100g]

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 glycitin

genistin

daidzein

glycitein

genistein

celkem

izoflavony

Graf 12: Obsah izoflavonů v sójovém nápoji (vzorek 6)

Sójových nápojů je na trhu celá řada. U nás je nejpopulárnější sójový nápoj Zajíc v sušené podobě, ve Spojených státech se zas těší velké oblibě sójové nápoje tekuté, připravené k okamžité spotřebě. V tabulce 11 jsou data z USDA Database on the Isoflavone Content of Selected Foods, vztahující se k výrobkům s podobnými charakteristikami, tj. výrobky sloužící jako náhrada mléka bez obsahu laktózy s komplikovanějším složením. Vzhledem k tomu, že sójový nápoj Zajíc je určen pro děti od tří let, nebyl tento vzorek porovnáván s obsahem izoflavonů v produktech pro kojeneckou výživu (SIF – soy instant formula).

70

Tab. 11: Obsah izoflavonů v sójových nápojích (podle USDA Database on the Isoflavone Content of Selected Foods, verze 2.0, citováno 25.4.2010) Celkem [mg/100 g

Rozsah [mg/100 g

Daidzein [mg/100 g

Rozsah [mg/100 g

Genistein Rozsah [mg/100 g [mg/100 g

Glycitein Rozsah [mg/100 g [mg/100 g

7.01

2.80 11.22

2.41

0.70 4.12

4.6

2.10 7.10

Žádná data

Žádná data

Instantní 109.51 sójový nápoj

100.10 125.00

40.07

29.50 70.00

62.18

55.00 73.15

10.9

10.50 11.10

Tekutý 9.65 sójový nápoj

1.26 21.13

4.45

1.14 9.84

6.06

1.12 11.28

0.56

0.36 - 0.86

Sójový nápoj mražený

2.12 7.31

1.9

0.34 3.45

2.81

1.78 3.85

Žádná data

Žádná data

Sójový nápoj

4.71

Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorku 6 s databází obsah izoflavonů [mg/100g]

120 100 80 60 40 20 0 tekutý sójový nápoj mražený sójový nápoj instant. Nápoj sójový nápoj sójový nápoj (vz. 6)

sójové nápoje

Graf 13: Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorku sójového nápoje s databází. Z porovnání výsledku HPLC-DAD analýzy z grafu 13 je vidět, že překvapivě nízký obsah izoflavonů je typický pro výrobky podobného složení a to i v tekuté a mražené formě. Zajímavé je, že tak jako u sójového nápoje Zajíc, také u dvou sérií dat z databáze nebyl detekován glycitein. Nelze posoudit, jestli je malé množství obsažených izoflavonů způsobeno technologickou úpravou výrobků, nebo nízkým podílem sójové složky ve výrobku (výrobce uvádí pouze seznam složek výrobku).

71

5.6 Obsah izoflavonů v doplňku výživy Do souboru produktů testovaných HPLC-DAD analýzou byl zařazen i vzorek doplňku stravy Isoflavone. Pro tento účel byl vybrán doplněk výživy obsahující výhradně extrakt ze sójových bobů. Doplněk výživy Isoflavone je výrobcem určen pro ženy v období klimakteria a pro ženy po onkologických operacích. Naměřené celkové množství izoflavonů v doplňku výživy Isoflavone dosáhlo 7,35 g/ 100g. Jak lze vidět z grafu 14 , který zaznamenává obsah izoflavonů v doplňku stravy Isoflavone (vzorek 7), zastoupeny byly všechny izoflavony. Nejmenší bylo množství daidzinu a glyciteinu, největší množství bylo naměřeno daidzeinu a glycitinu. Glukosidy a aglykony byly zastoupeny v podobných množstvích.

Obsah izoflavonů v doplňku výživy 8 7

množství [g/100g]

6 5 4 3 2 1 0 daidzin

glycitin

genistin

daidzein

glycitein

genistein

celkem

izoflavonu

Graf 14: Obsah izoflavonů v doplňku výživy Isoflavone Tabulka 12 porovnává množství izoflavonů naměřené metodou HPLC-DAD a množství izoflavonů deklarované výrobcem. Při porovnání byl zjištěn rozdíl mezi oběma hodnotami. Naměřené množství izoflavonů bylo o více než 50% nižší než hodnota deklarovaná výrobcem. Obsah daidzeinu byl nižší o 26.5% a obsah genisteinu o 59.5% .

72

Tab 12: Porovnání naměřených množství izoflavonů a množství deklarovaných výrobcem izoflavon daidzin glycitin genistin daidzein glycitein genistein celkem

průměr [mg/100g]průměr průměr[g/100g] [g/100g] mg/100mg extraktu Dekl Rozdíl [%] 33,32498 0,03332498 0,0893775964 2178,4498933333 2,1784498933 5,8426026139 754,56182 0,75456182 2,0237348012 2739,46766 2,73946766 7,3472522641 10 -26,53 133,0863666667 0,1330863667 0,3569376354 1510,0286333333 1,5100286333 4,0498967946 10 -59,5 7348,9193533333 7,3489193533 19,7098017056 40 -50,73

Dekl = množství deklarované výrobcem [mg/100mg sójového extraktu]

Jak již bylo zmíněno v kapitole 3.4.4, množství izoflavonů obsažených v doplňcích výživy sledovala skupina vědců v Římě pod vedením Boniglie (2009). Studie zahrnovala 14 vzorků doplňků výživy určených k potlačení perimenopauzálních a menopauzálních obtíží. Pro analýzu byla použita metoda HPLC a UV detekce. Výsledky této studie jsou v tabulce 13. Tab 13: Obsah izoflavonů v doplňcích výživy (Boniglia, 2009) Genistein Daidzein [g/100g] [g/100g]

Glycitein [g/100g]

Celkem [g/100g]

Údaj výrobce [g/100g]

Rozdíl [%]

1

2

1.79

0.14

3.93

4.82

-18

2

1.72

2.10

0.16

3.98

7

-43

3

2.3

2.27

0.72

5.29

7

-24

4

1.49

1.16

0.14

2.79

11.03

-75

5

0.21

0.92

0.46

1.59

14.7

-91

6

2.41

1.41

0.12

3.93

10.67

-63

7

8.53

0.42

nd

8.95

6.67

+34

8

12.15

1.02

0.96

14.13

11.94

+18

9

0.26

0.69

0.30

1.25

1.25

0

10

0.48

0.67

nd

1.15

13.3

-91

11

9.46

6.14

0.66

16.26

17.78

-9

12

0.73

4.07

1.32

6.11

8.2

-25

13

3.72

4.77

0.95

9.43

8.0

+18

Graf porovnává naměřený obsah izoflavonů v doplňku stravy Isoflavone s množstvím izoflavonů v doplňcích naměřeným Boniglii (2009). Z grafu vyplývá, že doplněk stravy Isoflavone patří mezi doplňky se středním obsahem izoflavonů (5 -10 73

g/100g). Při porovnání obsahu jednotlivých složek s tabulkou je vidět, že z hlediska obsahu genisteinu patří doplněk Isoflavone k průměrným doplňkům, z hlediska obsahu daidzeinu k nadprůměrným a z hlediska obsahu glyciteinu k podprůměrným doplňkům. Rozdíl proti deklarovanému množství izoflavonů je průměrný. Nelze určit důvod rozdílu naměřených hodnot proti hodnotám deklarovaným, ale je možné snížení obsahu izoflavonů vlivem stáří produktu.

Porovnání obsahu izoflavonů v doplňcích výživy 18

obsah izoflavonů [g/100g]

16 14 12 10 Sloupec B

8 6 4 2 0 10

9

5

4

1

6

2

3

12

vz.7

doplňky výživy

Graf 15: Porovnání obsahu izoflavonů v doplňcích výživy

74

7

13

8

11

6 ZÁVĚR V této diplomové práci byla optimalizována metoda extrakce izoflavonů ze sójových produktů použitím IKA ULTRA-TURRAX homogenizátoru. Metoda byla účinná při extrakci izoflavonů ze sedmi různých vzorků sójových produktů. Přesnost systému HPLC – DAD byla analyzována pomocí metody single factor ANOVA, kterou na hladině významnosti 95% nebyl dokázán statisticky významný rozdíl v retenčních časech. Výsledky analýzy HPLC-DAD vzorků sójových produktů byly vyhodnoceny a porovnány s výsledky jiných studií. U sójové bobů Druid i sójových bobů PRO-BIO byl naměřen střední obsah izoflavonů ( v rozmezí 100 – 120 mg / 100g). Oba vzorky také obsahovali podobné množství jednotlivých izoflavonů. Vzorek sójové mouky obsahoval množství izoflavonů odpovídající tomuto typu produktu s větším množstvím aglykonů než glukosidů. Obsah izoflavonů v sójových kostkách a granulátu také odpovídal hodnotám z jiných studií. U sójového nápoje Zajíc byly naměřeny velice nízké hodnoty izoflavonů. Při porovnání s jinými studiemi ale byly zjištěny podobné výsledky. Množství izoflavonů v doplňku stravy Isoflavone byl výrazně nižší než bylo množství deklarováno na obalu. Při porovnávání výsledku s jinými studiemi bylo zjištěno, že mezi doplňky stravy nejde o ojedinělý jev. K výsledkům analýzy izoflavonů metodou HPLC-DAD lze souhrnně říct, že u šesti ze sedmi analyzovaných vzorků byly naměřeny významné množství izoflavonů. Vzhledem k fyziologickým účinkům sójových izoflavonů na lidské zdraví a výsledkům měření v této diplomové práci lze formulovat následující výživové doporučení: Skupinou obyvatel, která by měla ke konzumaci sójových výrobků přistupovat s určitou opatrností jsou těhotné a kojící ženy. Příjmu izoflavonů by se měli vyhnout lidé trpící hypotyroidismem a užívající antikoagulanty. Jiné skupiny lidí, například lidi trpící vysokým cholesterolem, můžou ale z konzumace sójových produktů těžit významné zdravotní benefity zahrnující zlepšení stavu opěrného a kardiovaskulárního systému a snížení rizika karcinogenézy. Umírněnost v konzumaci je pravděpodobně nejlepším klíčem a v kombinaci s upřednostněním přirozených potravin před doplňky výživy a vysoko technologicky zpracovanými potravinami je základem pro vytěžení maxima z možných zdravotních efektů. 75

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY •

ALDEN, L. The Cook's Thesaurus [online]. 1996-2005 [cit. 2010-11-10]. Soy Products. Dostupné z WWW: .

•

ANDERSEN, Ø.; MARKHAM, K. Flavonoids : Chemistry, Biochemistry and Applications. New York : Taylor&Francis, 2006. 1237 s. ISBN 0-8493-2021-6.

•

BADGER, T; RONIS, M.; FANG, N. Molecular nutrition. Wallingford : CABI, 2003. The Health Effects of Dietary Isoflavones, s. 201-216. ISBN 0-85199654-X.

•

BELITZ, H.D.; GROSCH, W.; SCHIEBERLE, P. Food Chemistry. 4. vyd. Berlin : Springer, 2009. 1070 s. ISBN 978-3-540-69935-4.

•

BENEŠOVÁ, L. Screening isoflavonů v biologickém materiálu. Brno, 2008. 104 s. Dizertační práce. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita.

•

BONIGLIA, C., et al. Content of phytoestrogens in soy-based dietary supplements. Food Chemistry. 2009, 115, s. 1389–1392.

•

BROUNS, F. Soya isoflavones: a new and promising ingredient for the health food sector. Food Research International. 2002, 35, s. 187-193.

•

Centrum pro databázi složení potravin (2010): On-line databáze složení potravin ČR, verze 1.10. Centrum pro databázi složení potravin. Ústav zemědělské ekonomiky a informací a Výzkumný ústav potravinářský Praha. [cit. 2011-0318]. Dostupné z WWW: http://www.czfcdb.cz.

•

CORNWELL, T.; COHICK, W.; RASKIN, I. Dietary phytoestrogens and health. Phytochemistry. 2004, 65, s. 995–1016.

•

Česká republika. Vyhláška č. 211/2004 Sb., o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků. In Sbírka zákonů. 2004, Částka 71, s. 3327-3438.

•

DOSTÁLOVÁ, J. Sója a výrobky ze sóji. Výživa a potraviny. 2010, 4, s. 59-61.

•

DOUŠA, M. HPLC.cz [online]. 3.6. 2010 [cit. 2011-04-23]. Typy detektorů v HPLC. Dostupné z WWW: .

•

FLOHROVÁ, A. Zkušenosti s pěstováním sóji v zahraničí a v ČR. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 2001. 32 s. ISBN 80-7271-088-5

•

HIGDON, J. Soy Isoflavones. Micronutrient Information Center : Linus Pauling Institute [online]. 2006, updated 2009 [cit. 2011-04-18]. Dostupný z WWW: .

•

HOUBA, M., et al. Luskoviny : pěstování a užití. První vydání. České Budějovice : Kurent, 2009. 133 s. ISBN 978-80-87111-19-2.

•

HRABĚ, J.; BUŇKA, F.; HOZA, I. Technologie výroby a potravin rostlinného původu. Vyd. 1. Zlín : Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 2007. 189 s. ISBN 97880-7318-520-6. 76

•

HYMOWITZ, T. The History of the Soybean. 1-22 s. In: Johnson, L. (ed.), Soybeans: Chemistry, Production, Processing, and Utilization, vyd. Urbana, AOCS Press, 2008, 800s. ISBN 978-1-893997-64-6

•

CHEN, Y.W., et al. Bowman-Birk inhibitor abates proteasome function and suppresses the proliferation of MCF7 breast cancer cells through accumulation of MAP kinase phosphatase-1. Carcinogenesis. 2005, 26, s. 1296-306.

•

Isoflavones.info [online]. 2010 [cit. 2011-04-25]. Isoflavones contents of food. Dostupné z WWW: .

•

KADLEC, P.; MELZOCH, K.; VOLDŘICH, M. Co byste měli vědět o výrobě potravin? : Technologie potravin. Vyd. 1. . Ostrava : Key Publishing, 2009. 536 s. ISBN 978-80-7418-051-4.

•

KALAČ, P. Funkční potraviny : kroky ke zdraví . 1. vyd. České Budějovice: Dona, 2003. 130 s. ISBN 80-7322-029-6.

•

Kinako. In Wikipedia : the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida) : Wikipedia Foundation, 9.4.2007, last modified on 19.1.2011 [cit. 2011-03-20]. Dostupné z WWW: .

•

KLEJDUS, B., et al. Identifikace a charakterizace isoflavonů v rostlinných extraktech za použití kombinace HPLC s hmotnostním detektorem a detektorem s diodovým polem (HPLC-DAD-MS). Chemické listy. 2003, 97, 7, s. 530-539. Dostupný také z WWW: <www.chemicke-listy.cz>.

•

KLEJDUS, B. et al. Determination of Isoflavones in Soy Bits by Fast Column High-Performance Liquid Chromatography Coupled with Diode-Array Detector. Journal of Chromatography A. 2005. sv. 1084, č. 1, s. 71--79. ISSN 0021-9673.

•

KLEJDUS, B. et al. Evaluation of Isoflavones Distribution in Soy Plants and Soybeans by Fast Column High-Performance Liquid Chromatography Coupled with Diode-Array Detector. Journal of agricultural and food chemistry. 2005. sv. 53, č. 13, s. 5848--5852. ISSN 0021-8561.

•

KOMPRDA, T. Výživou ke zdraví. 1. vyd. Velké Bílovice: TeMi CZ, 2009. 110 s. ISBN 978-80-87156-41-4.

•

KONDROVÁ, E.; OZGOVÁ, Š.; GUT, I. Natural polyphenolic substances as antioxidants and prooxidants and mechanisms of their action. České pracovní lékařství. 2006, 4, s. 195-200.

•

KOS, G.; KRSKA, R. Separation and Detection Techniques for the Determination of Mycotoxins. Leatherhead Food Research [online]. 1998, [cit. 2011-04-24]. Dostupný z WWW:
•

LÉVAI, A. Synthesis of Isoflavones. Journal of Heterocyclic Chemistry. 2004, 41, s. 449-460.

•

LIVINGSTONE, I. Biodidac [online]. 1996, 2011-03-16 [cit. 2011-03-16]. Glycine max Rhizobium association with pea roots. . Dostupné z WWW: .

77

•

Livestrong.com [online]. 2001-04-07 [cit. 2011-04-09]. The Safety of Soy Isoflavones. Dostupné z WWW: .

•

MACHOLÁN, L. Sekundární metabolity. druhé vydání. Brno : Masarykova Univerzita, 2003. 150 s. ISBN 80-210-3068-2.

•

MÍKA, V., et al. Fenolické látky v lučních rostlinách. Praha : Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2001. 116 + 56 s. ISBN 80-86555-07-0.

•

MESINA, M. A Brief Historical Overview of the Past Two Decades of Soy and Isoflavone Research. The Journal of Nutrition. 2010, 140, s. 1350-1354.

•

OPLETAL, L.; KOULA, V. Daidalea [online]. 2010 [cit. 2010-11-11]. Obsahové látky taxonů. Dostupné z WWW: .

•

OPLETAL, L.; SKŘIVÁNKOVÁ, V. Přírodní látky a jejich biologická aktivita : Svazek 2, Využití látek pro ovlivnění fyziologických procesů hospodářských zvířat. první vydání. Praha : Karolinum, 2010. 653 s. ISBN 97880-246-1801-2.

•

ORSILLO, N.. Co mají společného vlk hřivnatý, děti v brazilském slumu a kuře ze supermarketu? : české velkochovy a expanze sóji v Latinské Americe, Brno :Hnutí Duha, 2009. 24 s. ISBN 978-80-86834-31-3

•

PETEROVÁ, J.. Pěstování sóji v ČR a srovnání se světem : Soya Growing in the CR and a Comparison with the World. In Perspektivy sóji v ČR. Praha : Česká zemědělská univerzita v Praze, 2005. s. 24-27.

•

PIČMANOVÁ, M. Isoflavonoidy v nebobovitých rostlinách: fytochemie, biologické funkce a molekulární biologie. Praha, 2008. 40 s. Bakalářská práce. Univerzita Karlova v Praze.

•

POTMĚŠILOVÁ, J. Sója v České republice : Soybean in the Czech Republic. In Perspektivy sóji v ČR. Praha : Česká zemědělská univerzita v Praze, 2005. s. 1112.

•

PUME, N. et al. V. Soja: Pěstování, použití a národohospodářský význam. 2. vyd. Praha: Nákladem ministerstva zemědělství, 1941. 304 s. Časové spisky ministerstva zemědělství.

•

RIJKE, E. de, et al. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A. 2006, 1112, s. 31-63.

•

RYCHLÍK, A.. Strava jako lék: jáhly, kroupy, kukuřice, ovesné vločky, pohanka a sója v naší kuchyni. Vizovice: Lípa, 2004. 223s. ISBN 80-86093-78-6

•

SANFUL, R.; DARKO, S. Utilization of Soybean Flour in the Production of Bread. Pakistan Journal of Nutrition. 2010, 9, s. 815-818.

•

SHAO, S., et al. Tracking isoflavones: From soybean to soy flour, soy protein isolates to functional soy bread. Journal of Functional Foods. 2009, 1, s. 119127. 78

•

SETCHELL, K., et al. Evidence for lack of absorption of soy isoflavone glycosides in humans, supporting the crucial role of intestinal metabolism for bioavailability . The American Journal of Clinical Nutrition. 2002, 76, s. 447–53 . Dostupný také z WWW: .

•

SOBEK, J. SYSTEMATICKÁ BOTANIKA[online]. 15.02.2011 [cit. 2011-03-16]. Čeleď bobovité. Dostupné z WWW: .

•

STRATIL, P.: A B C zdravé výživy - Díl 1. 1. vyd. Brno: Stratil, 1993. 345 s. ISBN 80-900029-8-6.

•

STRATIL, P.: A B C zdravé výživy - Díl 2. 1. vyd. Brno: Stratil, 1993. 580 s. ISBN 80-900029-8-6.

•

STROSSEROVÁ, A; DOSTÁLOVÁ, J. Luštěniny. Výživa a potraviny. 2009, 4, s. 66-68.

•

ŠTULÍK, K., et al. Analytické separační metody. Vyd. 1. Praha : Karolinum, 2004. 264 s. ISBN 80-246-0852-9.

•

Tofu skin. In Wikipedia : the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida) : Wikipedia Foundation, 12.4.2005, last modified on 24.10.2010 [cit. 2011-03-20]. Dostupné z WWW: .

•

U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. 2002. USDAIowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods, Release 2.0 - 2008. Nutrient Data Laboratory Web site: http://www.ars.usda.gov/services/docs.htm?docid=6382

•

U.S. Soyfoods Directory a[online].Physicians Laboratories, 2006, 14.3.2011 [cit. 2011-03-20]. Miso. Dostupné z WWW: .

•

U.S. Soyfoods Directory b[online].Physicians Laboratories, 2006 [cit. 2011-0320]. Soy nutrition information. Dostupné z WWW: .

•

VACEK, J., et al. Current trends in isolation, separation, determination and identification of isoflavones : A review. Journal of Separation Science. 2008, 31, 11, s. 2054 – 2067 .

•

VANDENPLAS, Y., et al. Soy infant formula: is it that bad?. Acta Pædiatrica. 2011, 100, s. 162–166.

•

VEITCH, N. Isoflavonoids of the Leguminosae. Natural Product Reports. 2007, 2, s. 417-464.

•

VELÍŠEK, J.; CEJPEK, K. Biosyntesis of Food Components. first edition. Tábor : Ossis, 2008. 497 s. ISBN 978-80-86659-12-1.

•

VELÍŠEK, J.; HAJŠLOVÁ, J. Chemie potravin : první díl. třetí vydání. Tábor : Ossis, 2009. 580 s. ISBN 978-80-86659-15-2.

•

VELÍŠEK, J.; HAJŠLOVÁ, J. Chemie potravin : druhý díl. třetí vydání. Tábor : 79

Ossis, 2009. 580 s. ISBN 978-80-86659-16-9. •

VILLARES, A., et al. Content and Profile of Isoflavones in Soy-Based Foods as a Function of the Production Process. Food Bioprocessing Technology : Review paper. 2011, 4, s. 27-38.

•

VÍTKOVÁ, M., et al. Enzymová imunoanalýza pro stanovení isoflavonoidů. Chemické listy. 2004, 12, s. 1135-1139.

•

VRZÁŇOVÁ, M; HERESOVÁ, J. Fytoestrogeny. Interní medicína pro praxi. 2003, 9, s. 448-451. Dostupný také z WWW: <www.internimedicina.cz>.

•

WANG, T. Minor Constituents and Phytochemicals of Soybeans. 297-323 s. In: Johnson, L. (ed.), Soybeans: Chemistry, Production, Processing, and Utilization, vyd. Urbana, AOCS Press, 2008, 800s. ISBN 978-1-893997-64-6

•

WARDLAW, G. Perspectives in nutrition. fourth edition. United States of America : WCB/McGraw-Hil, 1998. .900 s. ISBN 0-07-092078-8.

•

XU, Z. Antioxidants in grains, vegetables and fruits. In Food Science and Technology Bulletin - Functional Foods. Baton Rouge : Louisiana State University Agricultural Center, 2009. s. 61-67.

•

YUE, X.; ABDALLAH, A.; XU, Z. Thermal dynamic properties of isoflavones during dry heating. International Journal of Food Science and Technology. 2010, 45, s. 1878–1882.

•

ZEHNÁLEK, P; HOLUBÁŘ, J; MEZLÍK, T. Odrůdy 2010 : Seznam doporučených odrůd řepka olejka a sója[online]. Brno : Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Brno, Národní odrůdový úřad, 2010 [cit. 2010-1103]. Dostupné z WWW: <www.ukzuz.cz/Articles/.../139308-7Olejniny_2010pdf.aspx>. ISBN 978-80-7401-023-1.

•

ZEMÁNKOVÁ, M. Sója v naší kuchyni. 2. vyd. Praha: Avicenum, 1991. 126 s. ISBN 80-201-0192-6

•

ŽÁČEK, Z.; ŽÁČEK, A. Potravinářské tabulky. První vydání. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1994. 484 s. ISBN 80-04-24457-2.

80

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK IPP = isopentenyl-difosfát FL = fenolické látky LP = lipoperoxidace COX = cyklooxygenáza LO = lipooxygenáza SIF = soy infant formula PC = papírová chromatografie (Paper Chromatography) CC = sloupcová chromatografie (Column Chromatography) HPLC = vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-performance Liquid Chromatography) GC = plynová chromatografie (Gas Chromatography) MEKC = micelární elektrokinetická chromatografie DAD = detektorem s diodovým polem (Diode Array Detector) PLE = extrakce za zvýšeného tlaku (pressurized liquid extraction) MAE = mikrovlnná extrakce (microwave assisted extraction) MSDP = Extrakce disperzní tuhou fází (Matrix Solid Phase Dispersion) MALDI-TOF = Ionizace laserem za přítomnosti matrice s detektorem doby letu (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) ODS = Office of Dietary Supplements LLE = extrakce kapalina -kapalina (Liquid–Liquid Extraction) SE = extrakce rozpouštědlem (Solvent Extraction) SPME = mikroextrakce na pevnou fázi (Solid-Phase Micro-Extraction) SPE = extrakce na pevnou fázi (Solid-Phase Extraction) LC = kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography) MS = hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry) CE = kapilární elektroforéza (Capillary Electrophoresis) TLC = chromatografie na tenké vrstvě (Thin Layer Chromatography) NMR = nukleární magnetická rezonance (Nuclear Magnetic Resonance) ED = elektrochemická detekce (Electrochemical Detection)

81

SEZNAM OBRÁZKŮ Obr.1: Sója luštinatá a kořenový systém s asociovanými rhizobiemi. Obr. 2: Porovnání struktur endogenního hormonu estradiolu, fytoestrogenu daidzeinu a syntetického estrogenu diethylstilbestrolu. Obr. 3: Obecný mechanismu intestinální absorpce a metabolismu glykosidů isoflavonů. Obr. 4.: Schematické znázornění úpravy vzorků před analýzou a možnosti instrumentální analýzy Obr. 5: Schematické znázornění HPLC Obr. 6: Schéma detektoru s diodovým polem

15 31 37 44 56 58

SEZNAM GRAFŮ Graf 1: Gradientová eluce mobilních fázi použita při analýze isoflavonů. 57 Graf 2: Porovnání účinnosti extrakce použitím laboratorní třepačky a homogenizátoru IKA ULTRA-TURRAX 60 Graf 3: Porovnání účinnosti extrakcí u doplňku výživy Isoflavone 61 Graf 4: Obsah izoflavonů v sójových produktech 63 Graf 5: Obsah izoflavonů v doplňku stravy 63 Graf 6: Obsah izoflavonů ve vzorcích sójových bobů 64 Graf 7: Porovnání obsahu izoflavonů vzorků 1 a 2 s databází 66 Graf 8: Obsah izoflavonů ve vzorku sójové mouky hladké, plnotučné 66 Graf 9: Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorku plnotučné sójové mouky s databází. 67 Graf 10: Obsah izoflavonů v sójovém granulátu a sójových kostkách 68 Graf 11: Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorcích sójového granulátu a sójových kostek 69 Graf 12: Obsah izoflavonů v sójovém nápoji (vzorek 6) 70 Graf 13: Porovnání obsahu izoflavonů ve vzorku sójového nápoje s databází 71 Graf 14: Obsah izoflavonů v doplňku výživy Isoflavone 72 Graf 15: Porovnání obsahu izoflavonů v doplňcích výživy 7 74

SEZNAM TABULEK Tab. 1: Změny izoflavonů během některých technologických procesů používaných při výrobě sójových potravin 42 Tab. 2: Výrobky vybrané pro chemickou analýzu 54 Tab 3: Přesné navážky vzorků použitých pro analýzu 55 Tab 4: Vlastnosti rozpouštědel použitých v analýze izoflavonů 57 Tab. 5: Parametry DAD detektoru pro analýzu izoflavonů 58 Tab 6: Porovnání výsledků extrakcí s procentuálním vyjádřením účinnosti 61 Tab 7: Rozdíly v retenčních časech jednotlivých izoflavonů 62 Tab.8: Výsledky analýzy ANOVA pro retenční časy izoflavonů 62 Tab. 9: Obsah izoflavonů v sójových bobech 65 Tab. 10: Obsah izoflavonů ve vybraných sójových potravinách 69 Tab. 11: Obsah izoflavonů v sójových nápojích 71 Tab 12: Porovnání naměřených množství izoflavonů a množství deklarovaných výrobcem 73 Tab 13: Obsah izoflavonů v doplňcích výživy 73

82

SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1: Kvalitativní složení běžných druhů luštěnin Příloha 2: Obsahové složení sóje Příloha 3: Zpracování sójových bobů Příloha 4: Biosyntetické vztahy mezi primárními a sekundárními metabolity Příloha 5: Základní strukturní skupiny flavonoidů Příloha 6: Chemické struktury izoflavonoidů Příloha 7: Struktury izoflavonů a Struktury aglykonů a glukosidů izoflavonů Příloha 8: Tabulka retenčních časů pro jednotlivé izoflavony ve zkoumaných vzorcích Příloha 9: Naměřené hodnoty izoflavonů ve zkoumaných vzorcích vyjádřeny v mg/100g

83

PŘÍLOHY