Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Variabilita lokusu CSN3 (kappa kasein) a mléčná užitkovost krav Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracoval:

doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D.

Bc. Ondřej Martinec

Brno 2008

Zadání diplomové práce

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Variabilita lokusu CSN3 (kappa kasein) a mléčná užitkovost krav“ vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně, dne………………………………………. Podpis diplomanta………….………………….

Poděkování Rád bych poděkoval panu doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za pomoc při řešení této práce. Dále bych rád poděkoval moji mamince paní Ing. Stanislavě Martincové a bratrovi za podporu při studiu.

Abstrakt Genotypy genu CSN3 byly stanoveny u 388 krav, z toho 147 krav bylo plemene holštýn a 241 krav plemene české strakaté. Ke stanovení genotypů byly použity metody PCR, RFLP a elektroforéza na agarózovém gelu. Pro statistické analýzy byl použit smíšený lineární model (MLM), proc mixed metoda REML (Restricted Maximum Likelihood) programem SAS for Windows 9.1.3. Byl sledován efekt genotypů CSN3 na dojivost (kg/den), procento tuku, procento proteinu, procento laktózy a počet somatických buněk (ml). Ve sledované populaci byla stanovena frekvence žádoucí alely genu CSN3 B 0,36 a genotyp BB 12,11 %. Populace obou plemen byly v H-W rovnováze. V této práci nebyl nalezen žádný statisticky významný vliv genotypu CSN3 na znaky mléčné produkce. Klíčová slova: CSN3, κ-kasein, znaky mléčné produkce, genotypy mléčných proteinů, odhad genetických asociací

Abstract The Genotypes of CSN3 were detected at 388 cows, from those 147 cows were of the Holstein breed and 241 cows the Czech Fleckviehs. For the determination of the genotypes were used the methods PCR, RFLP and the electrophoresis on agarose gel. For the statistical analysis waere used the mixed linear model (MLM), method REML (Restricted Maximum Likelihood) in program SAS for Windows 9.1.3. The efects of the genotypes CSN3 were estimated for the milk yield (kg/day), fat content, protein content, lactose content and the number of somatic cell (ml). The allele frequencies CSN3 B 0,36 and the frequencies genotype BB 12,11 % were established in the observed population. The populations of both breeds were in H-W equilibrium. There was found no statistically significant influence of the genotypes CSN3 on the milk production parameters. Key words: CSN3, κ-casein, milk production traits, milk protein genotypes, genetic association estimates

OBSAH 1 ÚVOD.................................................................................................... 9 2 CÍL PRÁCE .......................................................................................... 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ....................................................................... 12 3.1 MLÉKO A JEHO SLOŽKY ......................................................................... 12 3.1.1 MLÉČNÉ PROTEINY ...................................................................................................13 3.1.1.1 Kaseiny ................................................................................................................14 3.1.1.1.1 αS1-kasein..........................................................................................................15 3.1.1.1.2 αS2-kasein .........................................................................................................15 3.1.1.1.3 β-kasein ............................................................................................................16 3.1.1.1.4 κ-kasein ............................................................................................................17 3.1.1.2 Syrovátkové proteiny..........................................................................................17 3.1.2 SACHARIDY ............................................................................................................. 18 3.1.3 MLÉČNÝ TUK .......................................................................................................... 18 3.1.4 ENZYMY ................................................................................................................. 18 3.1.5 MINERÁLNÍ LÁTKY ...................................................................................................19 3.1.6 VITAMÍNY ................................................................................................................19 3.2 KVANTITATIVNĚ GENETICKÉ PARAMETRY MLÉKA ...................................... 19 3.3 GENETIKA Κ-KASEINU .......................................................................... 21 3.3.1 OZNAČOVÁNÍ GENU CSN3 VE VĚDECKÝCH ČLÁNCÍCH .................................................21 3.3.2 VÝZNAM KAPPA KASEINU PRO MLÉKÁRENSKÝ PRŮMYSL ............................................ 22 3.3.3 LOKALIZACE GENU CSN3........................................................................................ 23 3.3.4 VARIABILITA GENU CSN3 ....................................................................................... 24 3.3.5 FREKVENCE ALEL A GENOTYPŮ GENU CSN3 V POPULACI........................................... 26 3.3.6 VLIV GENU CSN3 NA MLÉČNOU PRODUKCI KRAV ...................................................... 29 4 MATERIÁL A METODIKA................................................................... 32 4.1 ÚDAJE O ZVÍŘATECH ............................................................................ 32 4.2 STANOVENÍ PARAMETRŮ MLÉČNÉ UŽITKOVOSTI ........................................ 33 4.3 STANOVENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 ....................................................... 33 4.3.1 IZOLACE DNA Z MLÉKA ........................................................................................... 33 4.3.2 AMPLIFIKACE SEKVENCE DNA METODOU POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE (PCR) 34

4.3.3 IDENTIFIKACE ALEL GENU CSN3 METODOU RFLP ................................................... 36 4.3.4 PŘÍPRAVA GELU PRO GELOVOU ELEKTROFORÉZU ...................................................... 37 4.4 MATEMATICKO-STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ ............................................ 38 5 VÝSLEDKY A DISKUZE ...................................................................... 39 5.1 ANALÝZA GENU CSN3 DLE RŮZNÝCH KRITÉRIÍ ......................................... 39 5.1.1 TESTOVÁNÍ HARDY-WEINBERGOVY

ROVNOVÁHY POMOCÍ TESTU DOBRÉ SHODY

– (Χ2

TEST) .............................................................................................................................. 39

5.1.1.1 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) u testované populace bez rozlišení plemen .................................................................. 39 5.1.1.2 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) u plemene holštýn......................................................................................................... 40 5.1.1.3 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) u českého strakatého plemene.......................................................................................41 5.1.2 FREKVENCE GENOTYPŮ A ALEL GENU CSN3 VE VŠECH CHOVECH ................................41 5.1.3 ZASTOUPENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 V JEDNOTLIVÝCH CHOVECH ............................. 42 5.1.4 ZASTOUPENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 V JEDNOTLIVÝCH ODDÍLECH PLEMENNÉ KNIHY . 43 5.1.5 ZASTOUPENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 V JEDNOTLIVÝCH LAKTACÍCH ........................... 45 5.2 ANALÝZA ASOCIACE GENOTYPŮ GENU CSN3 SE ZNAKY MLÉČNÉ PRODUKCE ... 47 5.2.1 ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A DOJIVOSTI ............................................................. 47 5.2.2 ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A PROCENTA TUČNOSTI V MLÉCE ............................... 48 5.2.3 ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A PROCENTA PROTEINU V MLÉCE ............................... 49 5.2.4 ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A PROCENTA LAKTÓZY V MLÉCE ................................. 50 5.2.5 ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A POČTU SOMATICKÝCH BUNĚK V MLÉCE .................... 52 6 ZÁVĚR................................................................................................ 54 7 POUŽITÁ LITERATURA...................................................................... 55 8 SEZNAM TABULEK ............................................................................ 59 9 SEZNAM ZKRATEK ............................................................................ 62

1 Úvod Zemědělství jako odvětví má řadu specifik, které jsou dány hlavně jeho vazbou

s přírodou.

Jeho

klíčovým

posláním

je

produkce

kvalitních

zemědělských produktů k zabezpečení výživy obyvatelstva. Podle statistických údajů se snížily počty skotu k 31.12.2007 meziročně o 1,6 % na 1367 tis. kusů. Počty krav celkem klesly o 1,5 % na 559 tis. kusů, z toho počty dojných krav se snížily o 2,4 % na 407 tis. kusů. V roce 2007 se zvýšila průměrná roční dojivost na dojnici meziročně o 2,8 % na 6548,3 litrů. Trend růstu cen zemědělských výrobců mléka, který nastal v druhé polovině roku 2007, pokračoval i v 1. čtvrtletí roku 2008. Průměrná cena zemědělských výrobců nejvyšší třídy jakosti Q se meziročně zvýšila o 28,9 %. Mléko se nakupovalo v 1. čtvrtletí roku 2008 za průměrnou cenu 10,06 Kč/l. oproti cenám od 2. čtvrtletí 2006 do 3. čtvrtletí 2007, kdy nepřesáhly hranici 8,0 Kč/l. V tomto roce však opět dochází ke snižování cen v měsíci únor na 9,98 Kč/l a v březnu již 9,70 Kč/l. Pokud tento trend bude pokračovat, stane se opět výroba mléka díky vysokým nákladům na výrobu nerentabilní. Vysoké výkupní ceny mléka, ale také zvýšení cen mléčných výrobků bylo způsobeno vyšší poptávkou po mléce z Číny a Indie, a také sucha v zemích s největší světovou produkcí mléka – v Austrálii a na Novém Zélandu. Mléčné kvóty, které byly zaváděny v době nadprodukce, mají nyní na produkci mléka a mléčných výrobků negativní dopad. Došlo totiž v Evropě k razantní redukci zásob másla a sušeného odstředěného mléka. Poptávka hlavně po sýru a čerstvých mléčných výrobcích na vnitřním trhu přitom významně vzrostla. V současné době již v Evropské unii neexistují téměř žádné zásoby mléčných výrobků. Poptávka po nich narostla natolik, že jí produkce není schopna uspokojit. Podle prognóz by měla produkce mléka v EU mírně stoupat až do roku 2014. Výroba a spotřeba sýrů by také měla stoupat na rozdíl od másla a sušeného odstředěného mléka. Výroba mléka celkově by měla od roku 2011 dosáhnout hladiny 147,3 až 147,4 miliony tun. Počty dojnic by měly dále poklesnout, především díky poklesu stavů dojnic v zemích EU-12. Myslím si, že zemědělec v EU bude muset produkovat mléko s vyšším množstvím kvalitního mléčného proteinu - kaseinu. Podle predikcí by totiž měla

9

stoupat výroba a spotřeba sýrů a pokud by mléko obsahovalo vyšší množství mléčného proteinu kappa kaseinu, mlékárny by mohly takovéto mléko lépe zpeněžovat. I přes stanovené kvóty EU minimálně do roku 2013, musí být zemědělci připraveni na volný trh a být konkurence schopnými takovým výrobcům jako státy Latinské Ameriky (Argentina, Chille, Brazílie), USA, Nového Zélandu a v poslední době v tomto odvětví rozvíjející se Ruska. Zde by mohla najít mnohem větší uplatnění znalost genetických markerů (kappa kaseinu) a jejich asociací s mléčnou užitkovostí a jejich aplikace v konkurenčním prostředí trhu.

10

2 CÍL PRÁCE

1. Osvojení metodik izolace DNA, PCR, RFLP a elektroforézy na agarózovém gelu. 2. Stanovení polymorfismu v genu CSN3. 3. Analýza frekvencí jednotlivých genotypů a alel v daných populacích zvířat. 4. Na základě molekulárních dat analyzovat asociace genetického markeru CSN3 s mléčnou užitkovostí krav v několika chovech.

11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mléko a jeho složky Mléko je jediným a nezbytným zdrojem výživy novorozených mláďat savců a velice hodnotnou potravinou pro člověka, obsahující téměř kompletní soubor látek, nezbytných pro normální vývoj organismu. Biologická hodnota mléka je vysoká. Mléko obsahuje kolem 200 různých látek, z toho 60 mastných kyselin, 40 minerálních prvků, 20 aminokyselin, 17 vitamínů, řadu enzymů, hormonů a pigmentů. K základním složkám mléka patří bílkoviny, tuk, laktóza, minerální látky a voda. Jeden litr kravského mléka uhradí u člověka denní potřebu tuku, esenciálních aminokyselin, vápníku, fosforu, mikroelementů (s výjimkou železa a manganu), polovinu bílkovin, více než jednu třetinu vitamínu A, C, D a jednu čtvrtinu energie (Jelínek, Koudela, 2003). Zralé mléko můžeme rozdělit na albuminová a kaseinová. V tabulce 1 jsou uvedeny rozdíly ve složení mléka některých savců, kteří produkují kaseinové mléko. V tabulce 2 je uvedeno průměrné složení a variabilita kravského mléka (http://www.vscht.cz). Tab. 1 Složení mléka (http://www.vscht.cz).

některých

savců

–

kaseinová

mléka

Složení (% hm) Mléko Voda/sušina Tuk Kasein Bílk. Laktosa Popeloviny syrovátky Kravské 87,3 / 12,7 3,9 2,6 0,6 – 0,7 4,8 0,7 Kozí 87,0 / 13,0 4,1 2,7 0,7 4,7 0,8 Ovčí 80,9 / 19,1 7,9 4,9 0,9 4,5 0,9 Buvolí 82,8 / 17,2 7,5 3,6 0,6 4,8 0,7 Zebu 86,7 / 13,3 4,7 2,6 0,6 4,7 0,7 Yaka 82,2 / 17,8 6,5 5,8 4,6 0,9 Velbloudí 87,9 / 12,1 3,3 2,9 0,4 4,8 0,7 Sobí 67,5 / 32,5 18,0 8,5 1,9 2,6 1,5

12

Tab. 2 Průměrné složení a variabilita kravského mléka (http://www.vscht.cz). Složka Průměrný obsah (%) Rozsah (%) Voda 87,3 85,5 – 88,7 Sušina 12,7 14,5 – 11,3 Tukuprostá sušina 8,8 7,9 – 10,0 Tuk 3,9 2,4 – 6,5 Bílkoviny 3,2 2,3 – 4,4 Kasein 2,6 1,7 – 3,5 Laktosa 4,8 3,8 – 5,3 Popeloviny 0,7 0,5 – 0,8 Org. kyseliny 0,18 0,13 – 0,22

3.1.1 Mléčné proteiny S rozvojem sofistikovaných analytických technik bylo během posledních let charakterizováno v mléce skotu více než 200 typů proteinů. Mléčný protein je velmi heterogenní skupina molekul a pro popis mohou být klasifikovány do pěti hlavních kategorií: kaseiny, syrovátkové proteiny, proteiny globulí mléčného tuku, enzymy a jiné miceliární minoritní proteiny. Heterogenita mléčných proteinů je také komplikována přítomností genetických variant, které byly identifikovány u hlavních druhů, zvláště u skotu. S vývojem molekulární biologie a zdokonalení technik pro klonování je možné také zvýšit heterogenitu mléčných proteinů řízenou mutagenezí kontrolující úroveň exprese proteinů původem mléčných, ale nové proteiny jsou mléčné žláze cizí (NG-KWAI-HANG, 2003) . Základní charakteristiky hlavních proteinů kravského mléka je uvedeny v tabulce 3.

13

Tab. 3 Charakteristiky hlavních proteinů kravského mléka (NG-KWAI-HANG, 2003) Mol. Počet AK zbytků Počet Konc. Detek. genet. Protein hmot. (g/l) varianty Celkem Pro Cys PO4 A,B,C,D,E,F, αS1-kasein 23164 199 17 0 8 10 G,H αS2-kasein 25388 207 10 2 10–13 2,6 A,B,C,D A1,A2,A3,B, β-kasein 23983 209 35 0 5 9,3 C,D,E,F,G A,B,C,E,F1,F κ-kasein 19038 169 20 2 1 3,3 2,G1,G2,H,I, J A,B,C,D,E,F, β-LG 18277 162 8 5 0 3,2 H,I,J α-LA 14175 123 2 8 0 1,2 A,B,C Sér. albumin 66267 582 28 35 0 0,4 1430000 8,4% 2,3% 0,8 Imunoglob. 1030000 Pozn. molekulová hmotnost je určena pro genetickou variantu zvýrazněnou tučně

Chemické složení mléka ovlivňují genetické, fyziologické a technologické faktory i podmínky vnějšího prostředí (Jelínek, Koudela, 2003). 3.1.1.1 Kaseiny Kaseiny v mléce krav byly původně definovány hlavně po sýru a čerstvých mléčných výrobcích Výborem americké mléčné asociace na nomenklaturu, klasifikaci a metodologii mléčných proteinů (American Dairy Association Committee on the Nomenclature, Classification, and Metodology of Milk Proteins) v roce 1956 Jennessem. Ten je definoval jako fosfoproteiny, které se srazí ze syrového mléka okyselením na pH 4,6 při 20 °C. Kaseiny byly identifikovány

podle

homologie

jejich

primárních

struktur

(sekvence

aminokyselin) (Farrell et al., 2004). Mléko skotu obsahuje čtyři typy kaseinů označovaných jako αS1-kasein, αS2-kasein, β-kasein a κ-kasein, všechny jsou produkovány speciálními geny (NG-KWAI-HANG, 2003). αS-, β-, κ- kaseiny jsou geneticky polymorfní a jsou

14

kontrolovány autosomálními geny, které jsou děděny v souladu s Mendelovou dědičností (NG-Kwai-Hang et al., 1984). Identifikace hlavních kaseinů a syrovátkových proteinů bude stále založeno na jejich primární struktuře (Farrell et al., 2004). Kaseiny kravského mléka zahrnují 82 % všech proteinů. V kyselém prostředí se kaseiny, na rozdíl od syrovátkových proteinů, sráží. V mléce se kasein nachází ve formě micel o velikosti kolem 100 nm, spolu s vápníkem a fosforem (Jelínek, Koudela, 2003). 3.1.1.1.1 αS1-kasein Primární struktura αS1-kaseinu obsahuje 199 aminokyselinových zbytků. Neobsahuje žádný cysteinový zbytek, obsahuje osm fosfátů připojených na serin. Menšinový αS1-kasein byl dříve označovaný jako αS0-kasein (NG-KWAIHANG, 2003). αs1-kasein představuje přes 40 % kaseinových frakcí v kravském mléce. Referenční protein pro tuto skupinu je αs1-CN B-8P. Skládá se ze 199 aminokyselinových zbytků: Asp7, Asn8, Thr5, Ser8, Ser P8, Glu25, Gln14, Pro17, Gly9, Ala9, Val11, Met5, Ile11, Leu17,Tyr10, Phe8, Lys14, His5, Trp2 a Arg6. Vypočtená molekulová hmotnost je 23,615 Da (Farrell et al., 2004). Aktuálně je známo 8 genetických variant. Varianta A byla nalezena u Holštýnského, Red Holštýnského a Německého červeného skotu. B varianta je predominantní varianta u druhu Bos taurus, varianta C u Bos indicus a Bos grunniens, varianta D u různých plemen ve Francii a Itálii a také u plemene Jersey v Nizozemí, a varianta E u Bos grunniens. Varianta F byla objevena u Německého černobílého skotu, G varianta u Italského hnědého skotu a poslední objevená varianta je αs1-kasein H (Farrell et al., 2004). 3.1.1.1.2 αS2-kasein αS2-kasein obsahuje 207 aminokyselin. Obsahuje 10 prolinů, více fosfoserinů a více lyzinů než jiné kaseiny a má dva cysteiny na pozici 36 a 40. Hlavní formy αS2-kaseinu jsou zjistitelné pomocí PAGE způsobené různým stupněm fosforylace která má rozmezí od 10 do 13 fosfátových skupin. Tyto

15

formy byly identifikovány jako αS2-, αS3-, αS4-, αS5- a αS6-kasein (αS5- je dimer αS3- a αS4-) (NG-KWAI-HANG, 2003). Referenční protein je αs2-CN A-11P. Obsahuje 207 aminokyselinových zbytků: Asp4, Asn14, Thr15, Ser6, Ser P11, Glu24, Gln16, Pro10, Gly2, Ala8, Cys2, Val14, Met4, Ile11, Leu13,Tyr12, Phe6, Lys24, His3, Trp2 a Arg6. Vypočtená molekulová hmotnost je 25,226 Da ( Farrell et al., 2004). αS2-kaseinová rodina představuje až 10% z kaseinové frakce v mléce skotu. Genetické varianty jsou αS2-kasein A, B, C, a D. Varianta A je nejčastěji pozorovaná u západních plemen, αS2-kasein D s pozorovanými četnostmi od 0.01 až 0.09 u plemene Vosgienne a Montbeliarde a u třech španělských plemen. B varianta byla pozorovaná s nízkými četnostmi u zebu v Jižní Africe a varianta C byla pozorovaná u yaka v údolí Nepálu a Mongolska ( Farrell et al., 2004). 3.1.1.1.3 β-kasein β-kasein obsahuje sekvenci 209 aminokyselin. Je to nejhydrofobičtější kasein. Neobsahuje žádný cystein, ale má vysoký podíl prolinu (35 reziduí). Přirozená amfipatická molekula β-kaseinu je příčinou, proč tyto formy micel agregují v roztoku. γ-kaseiny,

které byly dlouhou dobu známy, jsou

hydrolytickými produkty β-kaseinu produkované činností plasminů. γ-kaseiny odpovídají reziduím 29-209, 106-209 a 108-209 β-kaseinu (Farrell et al., (2004) označoval tato frakce jako γ1-, γ2-, γ3-CN) a jsou přítomny ve sraženině během isoelektrického srážení celého kaseinu při pH 4,6. Jiné fragmenty βkaseinu (zbytky 1-28, 1-105 a 1-107) byly nalezeny v syrovátce a tvoří část frakcí dříve známé jako „proteosový pepton“ (NG-KWAI-HANG, 2003). β-kaseinová rodina představuje až 45% z kaseinu bovinního mléka. Referenční protein pro tuto skupinu je β-CN A2-5P, obsahující 209 zbytků. Skládá se z: Asp4, Asn5, Thr9, Ser11, Ser P5, Glu19, Gln20, Pro35, Gly5, Ala5, Val19, Met6, Ile10, Leu22,Tyr4, Phe9, Lys11, His5, Trp1 a Arg4. Vypočtená molekulová hmotnost je 23,983 Da ( Farrell et al., 2004). Bylo popsáno 13 genetických variant β-kaseinu. Patří sem A1, A2, A3, B, C, D, E, F (dříve označován β-CN-X), G, H1, H2, I, J ( Farrell et al., 2004).

16

3.1.1.1.4 κ-kasein κ-kasein je nejvíce studovaný mléčný protein. Stabilizuje kaseinové micely proti srážení vápníkem. Chymozin odštěpuje od κ-kaseinu glykopeptid a zbylý parakasein vytváří s vápníkem nerozpustnou sraženinu parakaseinát vápenatý, který se zadrží ve slezu a je tráven pepsinem (Jelínek, Koudela, 2003). Ke štěpení κ-kaseinu dochází v místě Phe105-Met106. Para-κ-kasein je reziduum 1-105, kaseinomakropeptid je reziduum 106-169, které zůstává v roztoku (NG-KWAI-HANG, 2003). Problematika κ-kaseinu je rozvedena v samostatné kapitole 3.2 Genetika κ-kaseinu. 3.1.1.2 Syrovátkové proteiny Syrovátkové proteiny zahrnující 18 % všech proteinů. Mezi syrovátkové bílkoviny řadíme β-laktoglobulin (10 %), α-laktalbumin (3 %), imunoglobuliny (2 %), krevní (plazmatický) albumin (1 %) a albumózopeptonová frakce (2 %) (Jelínek, Koudela, 2003). Jsou také známy aminokyselinové sekvence βlaktoglobulinu,

α-laktalbuminu

a

sérového

albuminu

s molekulovými

hmotnostmi 18277, 14175 a 66267 Da v tomto pořadí. Na rozdíl od βlaktoglobulinu nejsou α-laktalbumin, sérový albumin a některé imunoglobuliny syntetizovány v mléčné žláze. Imunoglobuliny jsou extrémně heterogenní, jejich rozdělení je dáno dle jejich imunochemických vlastností. V mléce skotu bylo identifikováno pět tříd imunoglobulinů (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) (NG-KWAIHANG, 2003). Imunoglobuliny (IgG, IgM, IgA) se ve zvýšeném množství nacházejí v mlezivu a mají význam pro pasivní imunitu mláďat. Hladina imunoglobulinů ve zralém mléce je nízká. β-laktoglobulin se nachází pouze v mléce přežvýkavců. α-laktalbumin

se

účastní

při

syntéze

laktózosyntetázy (Jelínek, Koudela, 2003).

17

laktózy

jako

součást

enzymu

3.1.2 Sacharidy Hlavním sacharidem mléka je laktóza. Kravské mléko obsahuje kolem 5 % laktózy. V mléce některých mořských savců (tuleň, mrož) laktóza chybí. Laktóza je zdrojem energie (30 % energetické hodnoty mléka), dodává mléku nasládlou chuť a při zkvašování mléka je substrátem pro tvorbu kyseliny mléčné. V tenkém střevě napomáhá resorpci vápníku, fosforu, hořčíku a využití vitamínu D (Jelínek, Koudela, 2003). 3.1.3 Mléčný tuk Mléčný

tuk

obsahuje

triacylglyceroly

(85 %),

diacylglyceroly

a

monoacylglyceroly, neesterifikované mastné kyseliny, fosfolipidy a cholesterol. Stabilitu tukových kuliček zajišťuje vrstvička fosfolipidů na jejich povrchu. Mléčný tuk obsahuje 60 mastných kyselin, jejich vzájemný poměr je druhově specifický. Kravské mléko obsahuje všechny základní nasycené mastné kyseliny se sudým počtem atomů uhlíku. Na rozdíl od ostatních tuků obsahuje mléčný tuk asi 9 % mastných kyselin s krátkým řetězcem (C4 až C10) – kyselinu máselnou, kapronovou, kaprylovou, kaprinovou a laurovou. Nejvyšší zastoupení má kyselina olejová (30 %), palmitová (24 %), stearová (13 %) a myristová (9 %). Nízký obsah esenciálních mastných kyselin (4 %) spolu s vysokým obsahem cholesterolu snižuje biologickou hodnotu mléčného tuku, naproti tomu fosfolipidy a vitamíny rozpustné v tucích jeho biologickou hodnotu zvyšují (Jelínek, Koudela, 2003). 3.1.4 Enzymy V kravském mléce bylo identifikováno více než 60 skupin enzymů. Uvádí se, že je jich méně než 1 % z celkového množství mléčných proteinů (NG-KWAIHANG, 2003). Mléko

obsahuje

řadu

enzymů

–

lipázy,

proteázy,

oxidázy,

laktoperocidázy, alkalickou fosfatázu, katalázu, alfa-amylázu, aldolázu a další. Stabilní součástí mléka jsou i bílkovinné a steroidní hormony (Jelínek, Koudela, 2003).

18

3.1.5 Minerální látky Minerální látky ovlivňují výživnou hodnotu a chuť mléka, fyzikální vlastnosti a stabilitu mléčných bílkovin. Mléko obsahuje Ca, P, K, Na, S, Mg, Fe, Cu, Zn a další minerální látky, buď ve formě anorganických solí nebo organických sloučenin (Jelínek, Koudela, 2003). 3.1.6 Vitamíny Mléko je bohaté na vitamíny, zejména riboflavin, biotin, cholin, ale i ostatní vitamíny skupiny B. Obsah vitamínů rozpustných v tucích závisí na obsahu karotenu, tokoferolu a ergosterolu v krmivu a koreluje s obsahem mléčného tuku. Obsah vitamínů skupiny B je v úzkém vztahu především s aktivitou bachorové mikroflóry (Jelínek, Koudela, 2003).

3.2 Kvantitativně genetické parametry mléka Koeficient

heritability

(h2)

je

jedna

z nejdůležitějších

vlastností

kvantitativní genetiky. Důležitou funkcí heritability je její role predikce, vyjadřující spolehlivost fenotypové hodnoty jako vodítka k plemenné hodnotě. Pouze fenotypové hodnoty mohou být přímo změřeny, ale je to plemenná hodnota, která určuje jejich vliv na příští generaci. Heritabilita je definována jako poměr mezi aditivní genetickou variancí a fenotypovou variancí: h 2 =

VA VP

(Falconer, Mackay, 1996). V tabulce 4 jsou uvedeny koeficienty heritability u znaků mléčné produkce dle Hřebena a Bucka (2005), v tabulce 5 jsou uvedeny koeficienty heritability a směrodatné odchylky dle Hayese et al., (1984). Znaky, které mají vztah mezi množstvím mléka, tuku a proteinu na jednu stranu

a

procenta

proteinu

a

tuku

na

druhou

stranu

je

částečně

charakterizována negativními genetickými korelačními koeficienty (Freyer et al., 1999). Existuje vysoká korelace mezi produkcí kaseinu a produkcí bílkovin

19

v kilogramech a o něco nižší korelace mezi obsahem bílkovin a obsahem kaseinu (tabulka 7) (Hřeben, Bucek, 2005). V tabulce 6 jsou popsány sledování genetických a fenotypových korelací mezi některými znaky mléčné produkce dle Hayese et al., (1984). V tabulce 7 uvádí Hřeben a Bucek (2005) hodnoty genetických korelací mezi kilogramy kaseinu a kilogramy mléka, kilogramy proteinu a procentem kaseinu, dále genetické korelace mezi procentem kaseinu a kilogramy mléka, kilogramy proteinu a procento proteinu. Tab. 4 Koeficienty heritability pro studované vlastnosti (Hřeben, Bucek, 2005). Sledovaný ukazatel mléko (kg) produkce kaseinu (kg) produkce bílkovin (kg) obsah kaseinu (%) obsah bílkovin (%)

Koeficient heritability 0,31 0,27 0,30 0,22 0,23

Tab. 5 Koeficienty heritability a směrodatné odchylky pro množství kaseinu, procento kaseinu, kaseinové číslo a znaky produkce (Hayes et al., 1984). Vlastnost mléčné užitkovosti množství kaseinu obsah kaseinu kaseinové číslo množství mléka množství tuku množství proteinu obsah tuku obsah proteinu

koeficient heritability 0,11 0,26 0,08 0,22 0,23 0,12 0,70 0,53

20

směrodatná odchylka 0,40 0,07 0,03 0,06 0,06 0,04 0,11 0,10

Tab. 6 Genetické a fenotypové korelace mezi každým z množství kaseinu, procenta kaseinu a kaseinovým číslem a množstvím mléka, množstvím tuku, množstvím proteinu, procento tuku a procento proteinu (Hayes et al., 1984). množství mléka r SE množství 0,80 0,08 kaseinu 0,87 procento -0,76 0,08 kaseinu -0,46 kaseinové -0,09 0,22 číslo -0,33

množství množství tuku proteinu r SE r SE 0,61 0,13 0,95 0,02 0,82 0,91 -0,21 0,12 -0,28 0,19 -0,25 -0,30 -0,22 0,21 -0,45 0,20 -0,31 -0,39

% tuku % proteinu r SE r SE 0,34 0,15 0,17 0,12 0,03 0,00 0,51 0,11 0,96 0,01 0,34 0,52 0,00 0,17 0,12 0,18 0,01 -0,12

Pozn. horní číslo z každého páru je genetická korelace

Tab. 7 Odhad genetických korelací mezi sledovanými vlastnostmi (Hřeben, Bucek, 2005). Genetická korelace kg kaseinu – kg mléka kg kaseinu – kg proteinu kg kaseinu - % kaseinu % kaseinu – kg mléka % kaseinu - kg proteinu % kaseinu - % proteinu

Hodnota 0,956 0,992 -0,115 -0,391 -0,123 0,925

3.3 Genetika κ-kaseinu 3.3.1 Označování genu CSN3 ve vědeckých článcích Ve vědeckých pracích je gen CSN3 často označován různými zkratkami. Kučerová et al., (2004) používá označení CSN3. Gazdová et al., (2007) používá označení C-CSN, Freyer et al., (1999), Bobe et al., (1999) a Farrell et al., (2004) používají označení κ-CN a NG-Kwai-Hang et al., (1984) a Bovenhuis et al., (1992) používají označení κ-kasein. Soria et al., (2003) uvádí ještě dvě možné označení, κCN a CASK.

21

3.3.2 Význam kappa kaseinu pro mlékárenský průmysl Kasein je v poslední době velice sledovaná složka mléka v souvislosti s výtěžností při výrobě sýrů. Výtěžností rozumíme množství čerstvých nebo zralých sýrů vyrobených ze 100 litrů nebo ze 100 kg mléka. Výši spotřeby litrů mléka na 1 kg sýrů ovlivňuje řada faktorů, např. složení a jakost zpracovaného mléka, především jeho tučnost a obsah bílkovin v mléce o 0,1 % představuje zvýšení spotřeby mléka na výrobu 1 kg sýra v průměru o 0,3 – 0,5 litru. Čím vyšší je obsah bílkovin v mléce, speciálně obsah kaseinu, tím nižší je spotřeba litrů mléka na 1 kg sýra za jinak stejných výrobních podmínek (Mášová, Šustová, 2007). Jednou z nejdůležitějších technologických vlastností mléka je jeho sýřitelnost. Jedná se o schopnost mléka srážet se syřidlem a vytvořit sýřeninu požadovaných vlastností. Mléko s příznivými sýrařskými vlastnostmi dává předpoklad vyšší výtěžnosti sýrů s jejich požadovaným složením, než mléko s nevhodnými sýrařskými vlastnostmi. Sýřitelnost mléka je kombinací iniciační enzymatické hydrolýzy a následné enzymově nezávislé agregační reakce proteinů. Dobrá sýřitelnost mléka závisí na jeho neporušeném složení, na obsahu kaseinových bílkovin, jejich složení a genetickém typu, na obsahu minerálních látek a jejich rovnováze s bílkovinami atd. Sýřitelnost negativně ovlivňuje přítomnost mastitidního mléka (Čejna, Chládek, 2005). Kaseiny kravského mléka jsou velmi důležité pro svoje nutriční a funkční vlastnosti. S rostoucí produkcí sýrů se také zvyšuje tlak mlékárenských podniků k pravidelnému monitoringu obsahu kaseinu. To je též podpořeno zaváděním nových analytických metod pro jeho zjišťování. Vedle bazénových vzorků má stanovení kaseinu význam i v rámci kontroly užitkovosti, a to z hlediska šlechtění a monitoringu krmení. Nízký obsah kaseinu má negativní vliv na výtěžnost sýrů (Čejna, Chládek, 2007). V posledním období se naskytla možnost rutinního stanovení obsahu kaseinu v rámci kontroly užitkovosti a při zpeněžování a tím získat údaje o složce mléka. V současné době je tento ukazatel mlékárnami sledován, ale nedochází ke zpeněžování podle obsahu kaseinu v mléce. Nejvyšších hodnot dosahuje obsah kaseinu v listopadu, prosinci a lednu. Mezi dojenými plemeny skotu je vykazován nejvyšší obsah kaseinu u plemene jersey. Obsah kaseinu se

22

jeví na základě dostupných údajů z literatury jako uspokojivý ukazatel pro selekci. Tento ukazatel má význam zejména v sýrařských oblastech (například v Itálii u plemene brown swiss a ve Švýcarsku) (Hřeben, Bucek, 2005). Společný evropský trh s mléčnými výrobky včetně mléka postupně začíná klást stále větší nároky především na prvovýrobu. Obsah mléčných složek, především bílkoviny začíná významně ovlivňovat cenu nakupovaného mléka od chovatelů. Velmi důležitou složkou mléka je pro zpracovatele sýrů především zastoupení kaseinu v mléce (Hřeben, Bucek, 2005). 3.3.3 Lokalizace genu CSN3 Gen pro mléčný protein kappa kasein (CSN3) je u skotu lokalizovaný na 6. chromozomu a kóduje informaci pro jeden z nejdůležitějších proteinů mléka, který je součástí tzv. kaseinového komplexu (Neubauerová, 2000). Na obrázku 1 je znázorněno umístění genu CSN3 na chromozomu 6 (BTA6) (Smith et al., 1997). Primární struktura bez karbohydrátové části proteinu obsahujícího 169 aminokyselin je ukázán na obrázku 2 (NG-KWAI-HANG, 2003).

Obr. 1 Lokalizace genu CSN3 na 6. chromozomu u skotu (Smith et al., 1997).

23

Obr. 2 Primární struktura κ-kaseinu B (NG-KWAI-HANG, 2003). Referenční protein pro κ- kasein je κ-CN A-1P. Je složen ze 169 aminokyselinových zbytků následovně: Asp4, Asn8, Thr15, Ser12, Ser P1, Pyroglu1, Glu12, Gln14, Pro2O, Gly2, Ala14, Cys2, Val11, Met2, Ile12, Leu8,Tyr9, Phe4, Lys9, His3, Trp1 a Arg5. Vypočtená molekulová hmotnost je 19037 Da (Farrell et al., 2004). 3.3.4 Variabilita genu CSN3 V genu CSN3 je známo 11 genetických variant. Nejběžnější alely jsou označovány písmenem A a B. Varianta B se od A odlišuje substitucí Ile za Thr na pozici 136 a Ala za Asp na pozici 148. A varianta je predominantní u mléčných plemen s výjimkou plemene Jersey. Další alela C se liší od alely A náhradou His 97 za Arg 97. Alela E se liší od alely A náhradou Gly 155 za Ser 155. PAGE analýzou byla alela D označena jako nová varianta, ale tato alela byla později zjištěna jako identická ke CSN3 C. Nesprávnou identifikací CSN3 D indikovalo potřebu pro sekvenační analýzy (PCR apod.) k potvrzení nových genetických variant pro všechny kaseiny. CSN3 F byl objeven pomocí PCR u Zebu a křížence černobílého skotu. Tato analýza odhalila dvounukleotidovou změnu mezi CSN3 A a CSN3 F: G za T na druhé pozici kódující Thr 145 (nezpůsobuje změnu proteinu) a T za G na druhé pozici Asp 148 (který poskytuje Val 148 v F

24

variantě). Tento druhý protein byl označen F1. Druhá F varianta, která obsahuje substituce a která přinesla změnu z Arg 10 na His 10 (Arg10His) byla považována za F2. Stejné výzkumy pojmenovaly následující variantu G. Tato nová alela byla popsána u Alpských plemen. G variantu způsobuje Arg 97 v CSN3 B, který je změněn na Cys 97. Opět tato varianta byla označena jako G1. Jiná varianta CSN3 byla nalezena u yaka (Bos grunniens) a byla také označena jako CSN3 G. Ta se odlišuje od CSN3 A mutací Asp148Ala a kodony pro rezidua 167 a 168 jsou rozdílné, ale to nepřinese změnu fenotypu proteinu. Tato pozdější varianta (Asp148Ala) byla označena G2. Další CSN3 H se odlišuje od A varianty změnou Ser104Ala. Varianta CSN3 I se liší od CSN3 A změnou Ser104Ala. Konečně CSN3 J byl objeven u Bos taurus na Pobřeží Slonoviny. Zdá se, že tato varianta vznikla z CSN3 B varianty mutací Ser155Arg. Rozdíly v pozicích a aminokyselinách jednotlivých variant jsou znázorněny v tabulce 8 (Farrell et al., 2004). Tab. 8 Pozice a aminokyselinové rozdíly v proteinu κ-kaseinu (Farrell et al., 2004). Varianta A B C E F1 F2 G1 G2 H I J

Pozice a aminokyselina v proteinu 10 Arg

97 Arg

104 Ser

135 Thr

136 Thr Ile

148 Asp Ala

155 Ser

His Gly His

Ile Ile

Cys

Val Ala Ala Ala

Ile Ala Ile

25

Ala

Arg

3.3.5 Frekvence alel a genotypů genu CSN3 v populaci V ČR nebyly dosud

chovatelé ani plemenářské organizace

pod

ekonomickým tlakem, který by nutil systematicky sledovat a publikovat zastoupení genotypů CSN3 alespoň u býků vybraných k opakovanému nasazení. Jsou však v posledních dvaceti letech období, kdy bylo genotypování prováděno často, především v 90. letech. V období let 1994 až 1998 se genotypování provádělo u všech býků vybraných k opakovanému nasazení v populacích plemene českého strakatého a holštýnského plemene. Po roce 1999 se touto problematikou zabývaly pouze některé plemenářské organizace. V grafech 1 a 2 jsou uvedeny výsledky rozborů laboratoře imunogenetiky Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. na stanovení genotypů CSN3 u býků českého strakatého (192 případů) a holštýnského plemene (182 případů). Vedle hlavního informačního zdroje byly rovněž využity některé volně dostupné informace o sledovaných plemenících z materiálů společností Natural, s.r.o., CZ DELTA, s.r.o. a Plemo, a.s. Do sledování byly zařazeni býci ročníku narození 1985 až 2003. Z grafu 2 je patrný vyšší podíl genotypu AA u holštýnského plemene (63,2 %) v porovnání s českým strakatým plemenem (43,2 %). Výraznější rozdíl mezi oběma plemeny byl rovněž vykázán u genotypu AB (47,4 % u plemene českého strakatého a 30,2 % u plemene holštýnského) a u genotypu BB (7,3 % u plemene českého strakatého a 3,3 % u plemene holštýnského) (Hřeben, Bucek, 2005). Běžně se vyskytují pouze alely A a B, přičemž je zřejmá převažující tendence alely A a jednotlivá plemena se liší pouze výší frekvence výskytu. Frekvence alel C a E jsou velmi nízké (Neubauerová 2000). Gazdová et al., (2007) sledovali frekvence rozložení genotypů a alel genu CSN3 u českého strakatého a holštýnského plemene. Hlavní mléčná plemena, jako je holštýnské plemeno, má nižší frekvenci alely B, naopak plemena s kombinovanou užitkovostí, jako je české strakaté plemeno, má vyšší frekvenci alely B genu CSN3. Jejich výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

26

Tab. 9 Absolutní (n) a relativní (r) frekvence genotypů a relativní frekvence alel CSN3 (Gazdová et al., 2007). Plemeno České strakaté

n

807

AA

AB

n

r

n

r

n

r

286

0,36

406

0,5

115

0,14

A

B

0,61

0,39

AA Holštýnské

488

BB

AB

BB

n

r

n

r

n

r

261

0,53

187

0,38

40

0,08

A

B

0,73

0,27

Kučerová et al., (2004) sledovali plemeníky a zjistili 3 genotypy markeru CSN3. Genotypy AA s četností 38 %, AB s četností 48 % a BB 14 %. Alelická četnost alely A byla 0,62 a četnost alely B byla 0,38. Kučerová et al., (2006) ve sledované populaci pozorovali frekvence genotypu CSN3 AA 35,4 % a BB 13,0 %. Ve své práci nalezli jen nízké frekvence genotypů obsahující alelu E. Genotyp AE se vyskytl ve frekvenci 2,3 %, genotyp BE 2,5 %. Genotyp EE nebyl v celé pozorované populaci nalezen. Frekvence CSN3 genotypů podle Bovenhuise et al., (1992) je u genotypu AA 63,63 %, AB 32,62 % a genotypu BB je 3,75 %. Studii prováděl na holštýnském skotu. Tsiaras et al., (2005) sledovali frekvence genotypů genu CSN3 u 278 krav holštýnského plemene. Pozoroval pouze genotypy AA a AB s frekvencemi 0,89 a 0,11. Absence genotypu BB mohlo být podle autora připsáno náhodě, v kombinaci s nízkou frekvencí B varianty u holštýnského plemene. Odhad alelových frekvencí byl 0,94 a 0,06 pro A a B v tomto pořadí. NG-Kwai-Hang et al., (1984) prováděli studii na 2045 kravách holštýnského plemene. Frekvence alely A byla 0,744 a frekvence alely B 0,256. Holštýnské krávy měly asi 53 % homozygotů pro alelu A, 4 % pro alelu B a 43 % pro heterozygotní genotyp AB. Freyer et al., (1999) uvádí v tabulce 10 frekvence alely CSN3 B u některých plemen skotu spolu s autory, kteří tyto frekvence prezentovali.

27

Tab. 10 Alelové frekvence CSN3 B u mléčných plemen (Freyer et al., 1999). Plemeno Holštýn DSR SMR Montbiliarde Jersey Braunvieh

Počet krav 3346 481 804 646 437 1742

CSN3B 0,13 0,2 0,28 0,37 0,56 0,59

Autor Oloffs Panicke Panicke Grosclaude Erhardt Ortner

Pozn. DSR – německý černobílý skot, SMR – kříženec německého černobílého skotu, 25 % jersey a 50 % holštýn.

Bobe et al., (1999) zjišťovali genotypy a frekvence genotypů pro CSN3 u 233 krav holštýnského plemene. Genotyp AA mělo 166 krav (68,3 %), BB 8 (3,4 %) a genotyp AB mělo 66 krav (28,3 %). Graf č. 1 Frekvence genotypů CSN3 u býků holštýnského a českého strakatého plemene (Hřeben, Bucek, 2005). 100 1,6

5,3

1,1

1,0

7,3

1,0

2,2

80

3,3

30,2 39,0

47,4

60

40 63,2

52,9 43,2

20

0 celkem

českéstrakaté

AA

28

AB

AE

holštýnské

BB

BE

1,1

Graf č. 2 Celková frekvence genotypů CSN3 (Hřeben, Bucek, 2005).

AE 2%

BE 1%

BB 5%

AA 53% AB 39%

3.3.6 Vliv genu CSN3 na mléčnou produkci krav CSN3 je používaný jako genový marker ve šlechtění skotu, protože byly nalezeny efekty na mléčnou produkci. Gen CSN3 a jeho varianta B částečně zvyšuje podíl kappa kaseinu v celkovém mléčném proteinu. Hlavně genotyp CSN3 BB je asociován s obsahem proteinu a tuku. Naopak genotyp CSN3 AA je vázán s vyšším výnosem mléka, proteinů a tuku (Gazdová et al., 2007). Dle Kučerové et al., (2004) je alela A podmiňující pro vyšší dojivost, ale nižší obsah bílkovin a tuku v mléce a horší kvalitu mléčné bílkoviny. Zatímco alela B, ovlivňuje vyšší obsah bílkovin a tuku a lepší kvalitu bílkoviny, ale na druhou stranu ovlivňuje také nižší nádoj. Dle Hřebena a Bucka (2005) mají menšinově se vyskytující genotypy AE a EE výrazně negativní vliv na kvalitu mléka. Gazdová et al., (2007) uvádí v tabulce 11 metodu nejmenších čtverců a standardní chyby pro selektované znaky genotypů genu CSN3, kde jsou statisticky významné rozdíly v obsahu mléčného proteinu mezi genotypy CSN3 (genotypy BB > AB > AA). Z toho vyplývá pozitivní efekt genotypu CSN3 BB na obsah proteinu. Velmi významné rozdíly zjistili mezi obsahem tuku a proteinu u českého strakatého a holštýnského skotu. V jejich studii české strakaté plemeno

29

mělo významně vyšší obsah proteinu a nižší tuk než plemeno holštýnské. Lokus CSN3 významně neovlivňoval obsah tuku a laktózy. Tab. 11 Metoda nejmenších čtverců a standardní chyby pro selektované znaky a genotypy CSN3 genu. Metoda nejmenších čtverců a standardní chyby pro rozdíly mezi českým strakatým a holštýnským plemenem (Gazdová et al., 2007). Plemeno

CSN3

České strakaté

Holštýn

3,44 ± 0,03A 3,44 ± 0,03A 3,54 ± 0,04B

3,53 ± 0,04a

3,42 ± 0,04b

4,23 ± 0.08

4,04 ± 0,09A 4,39 ± 0,10B

AA Mléčný protein Mléčný tuk

AB

BB

4,22 ± 0.08

4,04 ± 0,10

Pozn. hodnoty s rozdílným horním indexem označují významné úrovně uvnitř řady: P≤0,05 (a,b), P≤0,01(A,B)

V práci Kučerové et al., (2004) byly zjišťovány genotypy markeru CSN3 u 37 plemeníků českého strakatého skotu a u 5506 jejich dcer byly sledovány ukazatele mléčné užitkovosti za první normovanou laktaci. Dcery po otcích s genotypem AA nadojily na první normované laktaci o 157 kg a 289 kg více mléka oproti dcerám s genotypem AB a BB. Dcery po otcích AB a BB tak vyprodukovaly 97 % a 94% nádoje dcer po otcích AA. Rozdíl mezi skupinami AA a AB byl statisticky středně významný. Obdobné výsledky byly zjištěny u množství bílkovin a tuku v mléce. Dcery plemeníků s genotypem AA vyprodukovaly o 6 kg více bílkovin a o 9 kg více tuku v porovnání s dcerami plemeníků genotypu AB. Rovněž tento rozdíl byl statisticky středně významný. Byl zjištěn statisticky vysoce významný rozdíl v obsahu bílkovin v mléce a středně významný rozdíl v obsahu tuku v mléce mezi dcerami po plemenících s genotypem BB a dcerami po plemenících s genotypem AA a AB. Obsah bílkovin a tuku byl nejvyšší u genotypu BB oproti genotypům AA a AB, které činily pouze 96 % obsahu bílkovin genotypu BB. Kučerová et al., (2006) našli významné rozdíly mezi genotypy CSN3 lokusu pro procento proteinu a množství proteinu. Genotypy BB byly asociovány s vyšší plemennou hodnotou (PH) pro procento proteinu, ale nižší PH pro množství proteinu, zatímco genotyp BE souvisel s vyšší PH hodnotou 30

pro množství proteinu ale nižší hodnotou pro procento proteinu. To znamená, že alela E spolu s alelou B dávají efekt podobný genotypu AA. Nicméně v této studii genotyp AA byl asociován s nižší průměrnou PH pro množství mléka. Tab. 12 Vztah mezi genotypy genu CSN3 a parametry mléčné produkce (Kučerová et al., 2006) Genotyp CSN3

Počet zvířat

AA AB AE BB BE

156 206 10 57 11

Průměrné plemenné hodnoty pro Protein Protein (kg) (%) Dojivost Tuk (kg) a -113,3 -2,31 0,022 -3,15 -62,6 -0,45a 0,019a -1,84 -92,0 -1,62 0,010 -3,56 a -102,1 -2,22 0,038 -3,67 0,9 0,11 0,018 -0,07

Tuk (%) 0,020 0,003 -0,008 0,007 -0,011

Pozn. a znamená významný rozdíl P<0,05 mezi dvěma označenými genotypy

NG-Kwai-Hang et al., (1984) uvádí ve své práci, že zvířata s genotypem CSN3 BB produkovaly o 12 kg více proteinu než zvířata s CSN3 AA a AB. Protože dojivost nebyla ovlivněna variantami genu CSN3, rozdíly v produkci proteinu byly od CSN3 BB v obsahu o 0,13 % více proteinu než CSN3 AA. Výsledky Tsiarase et al., (2005) indikovaly, že CSN3 má významný vliv na výnos a obsah proteinu (genotyp AB > AA). Zvířata s genotypem AB produkovaly o 21 (± 9) kg více mléčného proteinu než zvířata s genotypem AA. Vyšší bylo i procento proteinu v mléce o 0,08 % (± 0,04). Na obsah tuku a množství laktózy neměl vliv. Nezjistil také žádné asociace mezi polymorfismy genu CSN3 a reprodukčními vlastnostmi. Bovenhuis et al., (1992) také uvádí významný vliv genotypů CSN3 na mléčnou produkci. V jeho práci uvádí, že CSN3 BB krávy produkovaly o 173 kg mléka méně než krávy s genotypem CSN3 AA. Nicméně CSN3 genotypy měly vysoce významný vliv na obsah proteinu. Zvířata s genotypem BB produkovaly o 0,08 % vyšší obsah proteinu než zvířata s genotypem AA. Efekt genotypů CSN3 na procento tuku nebyl významný. Nicméně významný efekt CSN3 genotypů byl zjištěn na kilogramy tuku. Zde B alela byla asociována s nižším výnosem tuku. Žádný významný efekt CSN3 genotypů na množství proteinu nebyl v této práci zjištěn.

31

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Údaje o zvířatech Ke stanovení genotypů genu CSN3 bylo použito 392 zvířat ze tří chovů v ČR. Byly zde zahrnuty zvířata na první až sedmé laktaci, počty zvířat v jednotlivých laktacích jsou uvedeny v tabulce 13 . Jednalo se o plemena české strakaté

a

holštýnské,

případně

kříženky

těchto

plemen.

Zastoupení

v jednotlivých oddílech plemenné knihy (PK) je znázorněno v tabulce 14. Z této tabulky vyplývá, že nejvyšší zastoupení mělo plemeno české strakaté vedené v oddílu plemenné knihy CA (48,4 % zvířat) a dále plemeno holštýnské, vedené v oddílu plemenné knihy HA (29,5 %). Tab. 13 Zastoupení krav v jednotlivých laktacích Laktace 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Součet

Počet kusů 157 93 66 40 20 11 5 392

Proc. zastoupení 40,05 23,72 16,84 10,2 5,1 2,81 1,28 100

Tab. 14 Zastoupení krav v oddílech plemenné knihy Chov 1

Počet kusů Proc. zastoupení 2 Počet kusů Proc. zastoupení 3 Počet kusů Proc. zastoupení Počet kusů Součet Proc. zastoupení

CA 72 80,9 105 80,8 0 177 48,4

Oddíl PK Součet CB CC HA HB HC HD 7 10 0 0 0 0 89 7,87 11,2 7 18 0 0 0 0 130 5,38 13,9 0 0 108 7 28 4 147 73,5 4,76 19,1 2,72 14 28 108 7 28 4 366 3,83 7,65 29,5 1,91 7,65 1,09 100

32

Pozn. Oddíl plemenné knihy HA – 100% podíl krve plemene holštýn, HB – podíl krve plemene holštýn 87,5 % a více, HC – podíl krve plemene holštýn 75-87 %, HD – podíl krve plemene holštýn 50-74 %. Oddíl plemenné knihy CA – podíl krve plemene české strakaté 75 % a více, CB – podíl krve plemene české strakaté 51-74 %, CC – podíl krve plemene české strakaté 25-50 %.

4.2 Stanovení parametrů mléčné užitkovosti Všechny sledované parametry mléčné produkce (dojivost, procento tuku, procento proteinu, procento laktózy a počet somatických buněk) byly zjištěny v kontrole užitkovosti. Procento tuku, procento proteinu a procento laktózy byly stanoveny dle normy ČSN 57 0536 „Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním

analyzátorem“

pomocí

přístroje

Bentley

2000

(Bentley

Instruments). Počet somatických buněk byl stanoven fluoro-opto-elektronickým přístrojem Somacount 500 (Bentley Instruments). Všechny údaje o zvířatech pocházely z databáze Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat na MZLU v Brně.

4.3 Stanovení genotypů genu CSN3 Pro izolaci DNA byl použit komerční set Jetquick blood and cell culture DNA spin kit 250. Z vyizolované DNA se namnoží cílový fragment DNA metodou PCR a následně se stanoví genotypy s využitím metody RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) a gelové elektroforézy. 4.3.1 Izolace DNA z mléka Aby bylo možné pracovat s DNA je třeba ji nejdříve upravit tím, že se zbaví proteinů, které ji obalují. Tomuto procesu se říká izolace. K izolaci DNA byla vyvinuta řada metodik v různých modifikacích. Pro izolaci DNA byl v mém případě použit komerční set Jetquick blood and cell culture DNA spin kit 250 (firma Genomed GmbH). Jako zdroj DNA bylo použito mléko. Pracovní potřeby: Mikrozkumavky 2 ml, stojan, sterilní rukavice, proteáza, mikropipety a špičky k mikropipetám, termostat, centrifuga, pufry K1, KX, K2, eluační pufr, mléko.

33

Pracovní postup: 1. 1 ml mléka se odpipetuje do 1,5 ml zkumavky. Poté se zahřeje na 50 °C, centrifuguje se 1 min. 3000x g. 2. Do čisté zkumavky se napipetuje 200 µl spodní frakce (bez mléčného tuku). 3. Přidá se 20 µl Protease K a promíchá se se vzorkem. 4. Pak se přidá 200 µl pufru K1 a důkladně se promíchá. 5. Následuje inkubace při 30 min./62 °C. 6. Přidá se 200 µl ethanolu a důkladně a jemně se promíchá. 7. Přenese se na kolonku a centrifuguje 1 min. 10 000x g. 8. Sběrná zkumavka se vylije, přidá se 500 µl KX a centrifuguje 1 min. 10 000x g. 9. Sběrná zkumavka se opět vylije, přidá se 500 µl K2, centrifuguje 3 min. 10 000x g. 10. Vylije se obsah sběrné zkumavky a centrifuguje se na sucho max. 1 min. 11. Kolonka se přenese na popsanou 1,5 ml Eppendorfovu zkumavku, přidá se 100 µl elučního pufru a nechá se 2 min. při pokojové teplotě. 12. Pak se centrifuguje 2 min. 10 000x g a čirý roztok se přenese do sterilní zkumavky. 4.3.2 Amplifikace sekvence DNA metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) Polymerázová řetězová reakce je metoda rychlého a snadného zmnožení stejného úseku DNA. PCR se sestává z několika kroků. Prvním krokem je denaturace,

kdy

dojde

k rozrušení

vodíkových

můstků

a

rozvolnění

dvoušroubovice. Výsledkem je jednovláknová DNA. Druhým krokem je nasedání primerů na specifická místa DNA. Na primery nasedá polymeráza. Posledním třetím krokem je prodlužovací fáze. Zde dochází k samotné syntéze DNA, ve směru od 5´ ke 3´ přirůstá vlákno komplementární k původní molekule DNA. Tyto tři kroky se cyklicky opakují 20 – 40krát. Metodika byla provedena dle Mitry et al., (1998). Velikost PCR produktu byla 379 bp. Pracovní potřeby: Termální cykler (PTC-200, MJ Research Inc.), centrifuga, PCR mikrozkumavky 0,2 ml, mikropipety a špičky k mikropipetám,

34

mrazící box, stojan, sterilní rukavice, destilovaná voda, směs nukleotidů, pufr pro PCR, roztok primerů A a B, Taq DNA polymeráza, roztok vyizolované DNA. Použité primery: přímý: 5‘ CACGTCACCCACACCCACATTTATC 3‘, zpětný: 5‘ TAATTAGCCCATTTCGCCTTCTCTGT 3‘ Pracovní postup: 1. Do zkumavky se napipetuje 13,8 µl destilované vody. 2. Odebere se 2,5 µl pufru a přidá se do zkumavky. 3. Poté se přidá 1,5 µl MgCl2, 1 µl směsi nukleotidů, 0,5 µl primeru A a 0,5 µl primeru B. 4. Nyní se přidá 0,2 µl polmerázy. 5. Přidá se 5,0 µl vlastní DNA a vše se řádně promíchá. 6. Zkumavka se vloží do centrifugy a krátce se stočí. 7. Nyní se zkumavka vloží do termálního cykleru předem vyhřátého na 95 °C a spustí se reakce. Tab. 15 Složení reakční směsi pro PCR Chemikálie dH2O 10*PCR MgCl2 dNTP Primer A Primer B Taq Polymeraza DNA

množství (µl) 13,8 2,5 1,5 1,0 0,5 0,5 0,2 5,0

Tab. 16 Podmínky PCR reakce Denaturace proteinazy Vlastní PCR Denaturace Annealing Elongace Závěrečná elongace

94 °C 94 °C 60 °C 72 °C 72 °C

5 min. 0,30 s. 0,30 s. 0,30 s. 2 min.

Po provedené PCR reakci byla provedena kontrola PCR produktu pomocí gelové elektroforézy. 35

4.3.3 Identifikace alel genu CSN3 metodou RFLP Pomocí

polymorfizmu

délky

restrikčních

fragmentů

(RFLP)

se

identifikují alely na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Namnožená genomová DNA (PCR produkt) je štěpena příslušnou restrikční endonukleázou a separována pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. Vizualizace DNA se provádí pomocí ethidiumbromidu. Pracovní

potřeby:

Centrifuga,

Eppendorfovy

zkumavky

0,5

ml,

mikropipety a špičky k mikropipetám, sterilní rukavice, termostat, vana na elektroforézu,

TBE

pufr,

3%

agarózový

gel

s ethidiumbromidem,

elektroforetický zdroj, transiluminátor, destilovaná voda, pufr pro restrikční enzym, restrikční enzym HinfI, nanášecí pufr na elektroforézu (směs sacharózy s bromfenolovou modří), vzorek PCR produktu, hmotnostní marker (vzorek fragmentů DNA o daných velikostech). Tab. 17 Složení reakční směsi pro RFLP Chemikálie dH2O Pufr HinfI PCR produkt

množství (µl) 2,6 2,0 0,4 5,0

Enzym HinfI štěpí PCR produkt (velikost 379 bp): - alela A - 3 fragmenty o velikostech 156 bp, 132 bp a 91 bp. - alela B - 2 fragmenty o velikostech 288 bp a 91 bp. Pracovní postup: 1. Odebere se 10 µl PCR produktu a přenese se do zkumavky. 2. Přidá se 3 µl destilované vody, 1,5 µl pufru pro restrikční enzym a 0,5 µl restrikčního enzymu HinfI. 3. Zkumavka se vloží na 3 hodiny do termostatu předehřátého na 37 °C. 4. Pak se na plato s jamkami přidá kapka nanášecího pufru, k ní se přidá 5 µl štěpeného PCR produktu a důkladně se promíchá. 5. Směs se pak nanáší do příslušných jamek agarózového gelu. 6. Poté se zapojí elektrický zdroj.

36

7. Na zdroji se nastaví napětí 80V na 15 min a spustí se. 8. Po uplynutí 15 minut se vypne zdroj a za použití rukavic se vyjme gel z vany a vložíme pod UV zářič. 9. Z ozářeného gelu se pak odečte genotyp daného jedince.

4.3.4 Příprava gelu pro gelovou elektroforézu Gelová elektroforéza je fyzikálně-chemická metoda pro dělení látek v elektrickém poli. Zařízení se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, vlastního držáku gelu, ve kterém bude k separaci docházet, a externího zdroje stejnosměrného napětí. DNA migruje směrem od katody (- pól) k anodě (+ pólu). Rychlost pohybu studované DNA závisí jednak na jejích vlastnostech (molekulová hmotnost - velikost, elektrický náboj, prostorové uspořádání), na vlastnostech nosiče (gelu), prostředí (pufru) a na přivedeném napětí. Pro separaci molekul o určité velikosti je třeba volit správnou koncentraci gelu a délku separace. Pracovní potřeby: TBE pufr, ethidiumbromid, agaróza, elektroforetická vana (s anodou, katodou, pufrem a vaničkou), externí zdroj stejnosměrného napětí, izolepa, hřebínek, varné sklo, mikrovlnná trouba, rukavice Pracovní postup: 1. Vanička se oblepí izolepou, čímž se zajistí zatuhnutí gelu ve vaničce. 2. Připraví se 3% roztok agarózy a TBE pufru. 3. Následně se roztok vloží do mikrovlnné trouby a nechá se opakovaně procházet varem do doby, než bude roztok čirý. 4. Poté se přidá 3 µl ethidiumbromidu a důkladně se roztok promíchá. 5. Roztok se pak přelije do přichystané vaničky, nasadí se hřebínek a nechá se ztuhnout.

37

4.4 Matematicko-statistické vyhodnocení Pro statistické analýzy byl použit smíšený lineární model (MLM), proc mixed metoda REML (Restricted Maximum Likelihood) programem SAS for Windows 9.1.3. Model pro stanovení asociací genotypů genu CSN3 s mléčnou užitkovostí pro plemeno:

(

)

yijklmn = µ + Geni + Chovj + Gen∗ Chovk + Pleml + Laktm + Otecn + b xijklmn − x + eijklmn y ijklmn = užitkový znak µ = průměrná hodnota sledované vlastnosti Gen i = vliv genotypů genu CSN3, pevný efekt, i = AA, AB, BB Chov j = vliv chovu, pevný efekt, j = 1, 2, 3 Gen * Chov

k

= vliv interakce genotypů genu CSN3 a chovu, pevný efekt,

k = 1, …, 9 Plem l = vliv plemene, pevný efekt, l = CA, CB, CC, HA, HB, HC, HD Lakt m = vliv pořadí laktace, pevný efekt, m = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Otec n = vliv otce, náhodný efekt, n =1, . . ., 76

(

)

b xijk − x = regrese na den laktace, pevný efekt e ijklmn = reziduum Model pro stanovení asociací genotypů genu CSN3 s mléčnou užitkovostí u plemene holštýn:

(

)

yijkl = µ + Geni + Lakt j + Oteck + Pleml + b xijkl − x + eijkl y ijkl = užitkový znak µ = průměrná hodnota sledované vlastnosti Gen i = vliv genotypů genu CSN3, pevný efekt, i = AA, AB, BB Lakt j = vliv pořadí laktace, pevný efekt, j = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Otec k = vliv otce, náhodný efekt Plem l = vliv plemene, pevný efekt, l = CA, CB, CC, HA, HB, HC, HD

(

)

b xijkl − x = regrese na den laktace, pevný efekt e ijkl = reziduum 38

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Analýza genu CSN3 dle různých kritérií 5.1.1 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) Populace

je

v genetické

rovnováze,

když

frekvence

genotypů

pozorovaných (P) se statisticky neliší od frekvencí genotypů za genetické rovnováhy (O). Rovnice pro výpočet χ2: n

(Pi − Oi )2

i =1

Oi

χ =∑ 2

5.1.1.1 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) u testované populace bez rozlišení plemen Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy bez rozlišení plemene je uveden v tabulce 18 a výsledek je znázorněn tučně. Tab. 18 Tabulka pro výpočet χ2 bez rozlišení plemen

Pozorované frekvence (P) Očekávané relativní frekvence Očekávané absolutní frekvence (O) (P - O) χ2 =

Frekvence genotypů CSN3 AA AB BB 157 184 47 0,4118

0,4598

0,1283

159,7963

178,4072

49,7964

-2,7963 0,0489

5,5928 0,1753

-2,7964 0,1570

Součet 388 1,00

0,3813

Vypočtená hodnota χ2 = 0,3813 se porovná s tabulkovou hodnotou příslušné pravděpodobnosti (95 a 99 %) a se stupněm volnosti (n), které jsou uvedeny v tabulce 19. Stupeň volnosti se vypočítá dle rovnice n = počet tříd dat počet parametrů odhadovaných z dat - 1. Pro tento případ se n = 3 – 1 – 1 = 1.

39

Tab. 19 Tabulkové hodnoty χ2 Hladina významnosti 0,05 0,01

1 3,84 6,35

Stupně volnosti (n) 2 3 4 5,99 7,81 9,48 9,21 11,34 13,27

5 11,07 15,08

H0 (nulová hypotéza) – není rozdíl mezi četnostmi P a O 2 χ tab

(3,84; 6,35) >

2 χ vyp

(0,3813) ~ je shoda mezi pozorovanými a

očekávanými četnostmi na hladině pravděpodobnosti 95 i 99 % a nulová hypotéza (H0) se nezamítá. Populace je pro daný lokus v rovnováze. 5.1.1.2 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) u plemene holštýn Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy u plemene holštýn pomocí χ2 testu je znázorněno v tabulce 20. Výsledek je označen tučně. Tab. 20 Tabulka pro výpočet χ2 pro plemeno holštýn

Pozorované frekvence (P) Očekávané relativní frekvence Očekávané absolutní frekvence (O) (P - O) χ2 =

Frekvence genotypů CSN3 AA AB BB 78 56 13 0,5271

0,3940

0,0789

77,4860

57,9216

11,5924

0,5140 0,0034

-1,9216 0,0637

1,4076 0,1709

Součet 147 1,00

0,2381

Stupeň volnosti n = 1 2 χ tab

(3,84; 6,35) >

2 χ vyp

(0,2381) ~ je shoda mezi pozorovanými a

očekávanými četnostmi na hladině pravděpodobnosti 95 i 99 % a nulová hypotéza (H0) se nezamítá. Sledovaná populace holštýnského plemene je pro daný lokus v rovnováze.

40

5.1.1.3 Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody – (χ2 test) u českého strakatého plemene Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy u českého strakatého plemene pomocí χ2 testu je znázorněno v tabulce 21. Výsledek je označen tučně. Tab. 21 Tabulka pro výpočet χ2 pro plemeno české strakaté

Pozorované frekvence (P) Očekávané relativní frekvence Očekávané absolutní frekvence (O) (P - O) χ2 =

Frekvence genotypů CSN3 AA AB BB 79 128 34 0,3521

0,4826

0,1653

84,8513

116,3066

39,8421

-5,8513 0,4035

11,6934 1,1756

-5,8421 0,8566

Součet 241 1,00

2,4358

Stupeň volnosti n = 1 2 χ tab

(3,84; 6,35) >

2 χ vyp

(2,4358) ~ je shoda mezi pozorovanými a

očekávanými četnostmi na hladině pravděpodobnosti 95 i 99 % a nulová hypotéza (H0) se nezamítá. Sledovaná populace českého strakatého plemene je pro daný lokus v rovnováze. 5.1.2 Frekvence genotypů a alel genu CSN3 ve všech chovech Ve všech sledovaných chovech byla zjištěna relativní frekvence alely A 0,6418 a frekvence alely B 0,3582 (tabulka 23). Relativní frekvence genotypu AA byla 0,4046, u genotypu AB 0,4742 a u genotypu BB 0,1211 (tabulka 22). Toto zastoupení genotypů a alel je porovnatelné s výsledky uváděnými Gazdovou et al., (2007). Ostatní mnou nalezeni autoři své práce zaměřili pouze na jednotlivá plemena a to převážně na plemeno holštýn.

41

Tab. 22 Relativní frekvence genotypů genu CSN3 ve všech sledovaných chovech Genotypy AA AB BB

Počet kusů 157 184 47

Relativní frekvence 0,4046 0,4742 0,1211

Tab. 23 Relativní frekvence alel genu CSN3 Alela A B

Počet kusů 388

Relativní frekvence 0,6418 0,3582

5.1.3 Zastoupení genotypů genu CSN3 v jednotlivých chovech Frekvence genotypů a alel genu CSN3 v jednotlivých chovech jsou uvedeny v tabulkách 24 a 25. Z tabulek vyplývá, že chov 2 měl výrazně vyšší frekvenci alely B než chov 3. Chov 3 měl naopak nejvyšší frekvenci alely A. Tento závěr je dán hlavně tím, že v chovu 3 byla zastoupena plemena holštýnského skotu, u kterého je známa nižší frekvence alely B na rozdíl od kombinovaného plemene české strakaté (chov 1 a 2). Vzhledem k tomuto faktu byly i relativní frekvence genotypu AA v chovu 3 výrazně vyšší než v chovu 1 a 2. Chov 1 měl oproti chovu 2 výrazně nižší frekvenci genotypu BB, i když zde byly zastoupeny zvířata českého strakatého skotu. Rozdíl může být způsoben použitím různých býků v připařovacím plánu v jednotlivých chovech. Tab. 24 Relativní frekvence genotypů genu CSN3 dle jednotlivých chovů Chov 1 2 3

Počet kusů 91 150 147

AA 0,3956 0,2867 0,5306

AB 0,5275 0,5333 0,381

BB 0,0769 0,18 0,0884

Tab. 25 Relativní frekvence alel genu CSN3 dle jednotlivých chovů Chov 1 2 3

A 0,6594 0,5534 0,7211

42

B 0,3406 0,4466 0,2789

5.1.4 Zastoupení genotypů genu CSN3 v jednotlivých oddílech plemenné knihy V tabulce 26 jsou uvedeny frekvence genotypů genu CSN3 dle jednotlivých oddílů plemenné knihy plemene holštýn. Z tabulky je patrné, že téměř dvě třetiny zvířat pocházelo z oddílu plemenné knihy HA. Tabulka 28 obsahuje údaje o frekvencích genotypů CSN3 za plemeno české strakaté a jejich zastoupení v jednotlivých oddílech plemenné knihy. U českého strakatého plemene bylo v oddílu plemenné knihy CA zastoupeno 80 % všech sledovaných zvířat. V oddílu PK CA převažoval genotyp AB s nejvyšší frekvencí (55,17 %), zatímco v oddílu HA měl nejvyšší frekvenci genotyp AA (53,7 %). V tabulkách 27 a 29 jsou uvedeny relativní frekvence alel v jednotlivých oddílech plemenné knihy. Zde je také patrný rozdíl v rozložení alel u jednotlivých plemen, kdy plemeno holštýn mělo frekvenci alely A převyšující 0,7 v nejvíc zastoupených oddílech plemenné knihy. Zatímco plemeno české strakaté mělo frekvenci alely A nižší (0,586 v oddílu CA, 0,643 v oddílu CB a 0,589 v oddílu CC). Vyšší frekvence alely A v oddílu PK CB může být způsobena malým počtem pozorování. Z výsledků vyplývá, že plemeno holštýn mělo vyšší frekvenci alely A než plemeno české strakaté, což je dáno rozdílnou plemennou příslušností. Výsledky jsou srovnatelné s výsledky od Gazdové et al., (2007), kteří se také zabývali plemeny holštýn a české strakaté.

43

Tab. 26 Rozložení frekvence genotypů genu CSN3 v jednotlivých oddílech plemenné knihy holštýnského plemene Počet kusů HA 108 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK HB 7 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK HC 28 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK HD 4 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK Součet 147 Rel. f. g. plemene PK

Genotyp CSN3 Součet AA AB BB 1,00 0,537 0,370 0,093 39,46 27,21 6,80 73,47 0,744 0,714 0,769 0,714 0,286 0,000 1,00 3,40 1,36 0,00 4,76 0,064 0,036 0,000 0,500 0,429 0,071 1,00 9,52 8,16 1,36 19,05 0,180 0,214 0,154 0,250 0,500 0,250 1,00 0,68 1,36 0,68 2,72 0,013 0,036 0,077 0,531 0,381 0,088 1,00

Tab. 27 Frekvence alel genu CSN3 dle jednotlivých oddílů plemenné knihy plemene holštýn Plemeno holštýn Počet kusů Frekvence alel

A B

HA 108 0,722 0,278

Oddíl PK HB HC 7 28 0,857 0,714 0,143 0,286

HD 4 0,5 0,5

Tab. 28 Rozložení frekvence genotypů genu CSN3 v jednotlivých oddílech plemenné knihy plemene české strakaté Počet kusů CA 174 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK CB 14 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK CC 28 Rel. f. g. v dané PK Proc. zast. g. od. PK z celé PK Rel. f. daného g. za celou PK Součet 216 Rel. f. g. plemene PK

44

Genotyp CSN3 AA AB BB Součet 0,310 0,552 0,138 1,00 25,00 44,44 11,11 80,56 0,783 0,821 0,800 0,429 0,429 0,143 1,00 2,78 2,78 0,93 6,48 0,087 0,051 0,067 0,321 0,536 0,143 1,00 4,17 6,94 1,85 12,96 0,130 0,128 0,133 0,319 0,542 0,139 1,00

Tab. 29 Frekvence alel genu CSN3 dle jednotlivých oddílů plemenné knihy plemene české strakaté Plemeno české strakaté Počet kusů Frekvence alel

Oddíl PK CA CB CC 174 14 28 A 0,586 0,643 0,589 B 0,414 0,357 0,411

5.1.5 Zastoupení genotypů genu CSN3 v jednotlivých laktacích V této práci bylo pracováno se zvířaty na první až sedmé laktaci. V tabulce 30 jsou zvířata rozděleny do jednotlivých pořadí laktace a jsou k nim vypočteny frekvence genotypů genu CSN3. Z této tabulky vyplývá, že v první laktaci bylo zahrnuto 40 % zvířat a nejvyšší frekvenci měl genotyp AB (48,72 %). V tabulce 31 a 32 jsou uvedeny frekvence alel u plemene holštýn a českého strakatého plemene v tomto pořadí. Z tabulek vyplývá, že téměř dvě třetiny zvířat zahrnutých ve výpočtu byly z 1. a 2. laktace. U sledovaných plemen v prvních dvou laktacích byly frekvence alel genu CSN3 obdobné jako u frekvencí alel genu CSN3 dle plemenné příslušnosti. Frekvence alel A a B v dalších laktacích dost kolísá, což bylo dáno malým počtem pozorování. Tab. 31 Relativní frekvence alel genu CSN3 v jednotlivých laktacích u plemene holštýn Plemeno holštýn Počet kusů Frekvence alel

A B

Laktace 1. 2. 3. 4. 5. 53 44 24 17 6 0,726 0,682 0,729 0,824 0,667 0,274 0,318 0,271 0,176 0,333

6. 3 0,667 0,333

7. 0 0 0

Tab. 32 Relativní frekvence alel genu CSN3 v jednotlivých laktacích u plemene české strakaté Plemeno české strakaté Počet kusů Frekvence alel

A B

Laktace 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 103 47 41 23 14 8 5 0,558 0,596 0,671 0,674 0,464 0,750 0,400 0,442 0,404 0,329 0,326 0,536 0,250 0,600

45

Tab. 30 Zastoupení genotypů genu CSN3 v jednotlivých laktacích Počet kusů 1. 156 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. 2. 91 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. 3. 65 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. 4. 40 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. 5. 20 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. 6. 11 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. 7. 5 Rel. f. genotypu v dané laktaci Pr. zast. g. lakt. ze všech lakt. Rel. f. daného g. za všechny lakt. Součet 388 Relativní frekvence Lakt.

46

Genotypy CSN3 Součet AA AB BB 0,372 0,487 0,141 1,00 14,95 19,59 5,67 40,21 0,369

0,413

0,468

0,374 8,76

0,528 0,099 12,37 2,32

0,217

0,261

0,192

0,462 0,462 7,73 7,73

0,077 1,29

0,191

0,163

0,106

0,525 5,41

0,425 0,050 4,38 0,52

0,134

0,092 0,043

0,350 0,350 0,300 1,80 1,80 1,55 0,045 0,038

0,128

0,546 1,55

0,091 0,26

0,364 1,03

1,00 23,45

1,00 16,75

1,00 10,31

1,00 5,15

1,00 2,84

0,038 0,022 0,021 0,200 0,400 0,400 0,26 0,52 0,52 0,006

0,011

0,043

0,405

0,474

0,121

1,00 1,29

1,00

5.2 Analýza asociace genotypů genu CSN3 se znaky mléčné produkce V této práci byly vyhodnoceny asociace polymorfismu genu CSN3 a dojivosti, procenta tuku, proteinu a laktózy, počtu somatických buněk a dále asociace různých genotypů genu CSN3 a různých chovů ve vztahu k dané užitkovosti. 5.2.1 Odhad asociace genu CSN3 a dojivosti V tabulce 33 jsou uvedeny odhadované hodnoty pro dojivost v kg mléka pro plemeno holštýn a české strakaté. Byla použita metoda nejmenších čtvercových středních hodnot (LSM) a jejich standardní chyby (SE). Tabulka 34 uvádí diferenci odhadu nejmenších čtverců průměrů, jejich střední chybu a hladinu průkaznosti. Hodnoty jsou uvedeny samostatně pro obě plemena. Z této tabulky vyplývá, že není statisticky průkazný rozdíl mezi dojivostí a danými genotypy genu CSN3 v rámci daného plemene. Také NG-Kwai-Hang et al., (1984) a Tsiaras et al., (2005) nenašli statisticky průkazný efekt různých variant genu CSN3 na dojivost. Tento výsledek neodpovídá studii Kučerové et al., (2004) a Bovenhuisovi et al., (1992), kteří vliv genotypu genu CSN3 na dojivost uvádí. Různé výsledky v pracích různých autorů svědčí o vlivu prostředí, ve kterém se sledovaná populace vyskytuje. Tab. 33 Odhadovaná dojivost v kg mléka pro dané genotypy genu CSN3 u plemene holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB BB AA AB BB

47

LSM ± SE 31,413 ± 1,891 30,324 ± 1,856 31,976 ± 2,851 24,163 ± 0,988 23,215 ± 0,984 22,570 ± 1,423

Tab. 34 Diference nejmenších čtverců průměrů a standardní chyba pro odhad dojivosti v kg mléka a genotypů genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB AA BB AB BB AA AB AA BB AB BB

Odhad diference ± SE 1,0892 ± 1,4732 -0,5625 ± 2,5010 -1,6517 ± 2,5550 0,9485 ± 0,9130 1,5926 ± 1,4816 0,6441 ± 1,4224

Pr NS NS NS NS NS NS

Pozn. NS = not significant (nevýznamné)

Mezi jednotlivými genotypy genu CSN3 a chovy 1 a 2 nebyly v dojivosti nalezeny žádné statisticky významné rozdíly. 5.2.2 Odhad asociace genu CSN3 a procenta tučnosti v mléce Tabulka 35 uvádí odhad procenta tuku v mléce pro plemeno holštýn a české strakaté v tomto pořadí. Tabulka 36 uvádí diferenci odhadu nejmenších čtverců průměrů, jejich střední chybu a hladinu průkaznosti. Nebyl statisticky průkazný rozdíl mezi procentem tuku a danými genotypy genu CSN3 u daných plemen. Pouze u českého strakatého plemene se blížil průkaznosti (Pr<0,1) rozdíl mezi genotypy AA a BB v procentu tuku. Výsledek se neshoduje s výsledky Gazdové et al., (2007), Bovenhuise et al., (1992) a Tsiarase et al., (2005), kteří nenašli statisticky průkazný vliv na procento tuku. Různé výsledky mohly být způsobeny rozdílným vlivem prostředí na sledované populace zvířat. Dále byl nalezen rozdíl statisticky se blížící průkaznosti (Pr<0,1) mezi genotypem AA v chovu 2 a genotypem BB v chovu 1. V chovu 2 zvířata s genotypy BB měly o 0,5334 % (±0,2919 SE) nižší tučnost mléka než zvířata z chovu 2 a genotypy AA.

48

Tab. 35 Odhadované procento tuku v mléce pro stanovené genotypy genu CSN3 u plemene holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB BB AA AB BB

LSM ± SE 3,9444 ± 0,1452 3,9589 ± 0,1423 4,0795 ± 0,2173 3,9478 ± 0,1414 3,9981 ± 0,1399 4,2461 ± 0,1832

Tab. 36 Diference nejmenších čtverců průměrů pro odhad procenta tuku a genotypů genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB AA BB AB BB AA AB AA BB AB BB

Odhad diference ± SE -0,0144 ± 0,1116 -0,1351 ± 0,1892 -0,1206 ± 0,1931 -0,0503 ± 0,1110 -0,2982 ± 0,1744 -0,2479 ± 0,1661

Pr NS NS NS NS * NS

Pozn. NS = not significant (nevýznamné), * = statisticky blížící se průkaznosti Pr<0,1

5.2.3 Odhad asociace genu CSN3 a procenta proteinu v mléce Odhad procenta proteinu v mléce k danému genotypu je znázorněn v tabulce 37 pro plemena holštýn a plemeno české strakaté. Diference odhadu nejmenších čtverců průměrů pro obě sledované plemena jsou uvedeny v tabulce 38. U obou plemen není statisticky průkazný vliv genotypů genu CSN3 na procento proteinu v mléce. Studie Gazdové et al., (2007), Kučerové et al., (2004), Bovenhuise et al., (1992) a Tsiarase et al., (2005) naopak vliv genotypu genu CSN3 na procento proteinu uvádí. Lze tedy opět usuzovat na rozdílnost podmínek prostředí, ve kterých byly pozorované populace sledovány.

49

Tab. 37 Odhadované procento proteinu mléka a daných genotypů genu CSN3 pro plemena holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB BB AA AB BB

LSM ± SE 3,3983 ± 0,0648 3,4008 ± 0,0641 3,4860 ± 0,0992 3,5974 ± 0,0470 3,6644 ± 0,0471 3,5695 ± 0,0666

Tab. 38 Diference nejmenších čtverců průměrů a standardní chyby pro odhad procenta proteinu a genotypů genu CSN3 u plemen holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB AA BB AB BB AA AB AA BB AB BB

Odhad diference ± SE -0,0025 ± 0,0528 -0,0877 ± 0,0895 -0,0852 ± 0,0918 -0,0670 ± 0,0429 0,0279 ± 0,0688 0,0949 ± 0,0660

Pr NS NS NS NS NS NS

Pozn. NS = not significant (nevýznamné)

Byly nalezeny rozdíly statisticky se blížící průkaznosti (Pr<0,1) mezi genotypy AB chovu 1 a 2 a genotypy BB v chovu 1. Rozdíl mezi zvířaty s genotypy AB chovu 1 a zvířaty s genotypy BB chovu 1 byl 0,1913 (± 0,1143 SE) % proteinu ve prospěch genotypu BB chovu 1. Zvířata s genotypy AB z chovu 2 měly o 0,1879 (± 0,1097 SE) % méně proteinu než zvířata s genotypy BB z chovu 1. Tento výsledek může být dán malým počtem pozorování genotypu BB v chovu 1 (7 zvířat).

5.2.4 Odhad asociace genu CSN3 a procenta laktózy v mléce Odhady procenta laktózy u jednotlivých genotypů genu CSN3 jsou uvedeny v tabulce 39 pro plemena holštýn a české strakaté. V tabulce 40 jsou uvedeny diference nejmenších čtverců průměrů pro procento laktózy a genotypů genu CSN3. Z této tabulky vyplývá pro plemeno české strakaté rozdíl statisticky se blížící průkaznosti (Pr<0,1) mezi genotypy AB a BB. Další vlivy genotypů

50

nejsou statisticky průkazné. Pro plemeno holštýn nebyl zjištěn žádný statisticky významný vliv genotypů genu CSN3 na procento laktózy. Práce Gazdové et al., (2007) a Tsiarase et al., (2005) uvádí, že nenašli žádný vliv genotypu CSN3 na procento laktózy. Laktóza v mléce je dána druhem savce a je jen minimálně ovlivnitelná vlivy vnějšího prostředí. Jelikož se jedná o rozdíl statisticky blížící se průkaznosti, bereme tuto hodnotu jako orientační. K závěru , že je vliv určitého genotypu na obsah laktózy by rozdíl musel být na hladině průkaznosti alespoň Pr<0,05. Proto nelze určit, zda tento vliv má vypovídající hodnotu. Pro potvrzení nebo vyvrácení (Pr<0,05) vlivu genotypu CSN3 na obsah laktózy bylo by potřeba zahrnout do studie větší počet pozorování. Tab. 39 Odhad nejmenších čtvercových středních hodnot pro procento laktózy v mléce a jednotlivé genotypy genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Plemeno

Genotypy AA AB BB AA AB BB

Holštýn

České strakaté

LSM ± SE 4,8246 ± 0,0322 4,8568 ± 0,0318 4,8647 ± 0,0493 5,0266 ± 0,0328 5,0292 ± 0,0328 4,9473 ± 0,0478

Tab. 40 Odhad diference nejmenších čtverců průměrů a standardní chyby pro procento laktózy a genotypů genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB AA BB AB BB AA AB AA BB AB BB

Odhad diference ± SE -0,0322 ± 0,0261 -0,0401 ± 0,0443 -0,0079 ± 0,0454 -0,0027 ± 0,0307 0,0793 ± 0,0499 0,0819 ± 0,0481

Pr NS NS NS NS NS *

Pozn. NS = not significant (nevýznamné), * = statisticky blížící se průkaznosti Pr<0,1

Z analýzy diference mezi genotypy a chovy vyplývají následující závěry: - Statisticky vysoce průkazný rozdíl (Pr<0,01) mezi zvířaty s genotypy AB chovu 1 a zvířaty s genotypy BB chovu 2. Diference byla odhadnuta na 0,1427 % (± 0,0518 SE) laktózy v mléce.

51

- Statisticky průkazný rozdíl (Pr<0,05) mezi zvířaty s genotypy AA chovu 2 a zvířaty s genotypy BB chovu 2. Diference byla odhadnuta na 0,1215 % (± 0,0551 SE) laktózy v mléce. - Rozdíl statisticky se blížící průkaznosti (Pr<0,1) mezi zvířaty s genotypy AA chovu 1 a zvířaty s genotypy BB chovu 2. Diference byla odhadnuta na 0,0979 % (± 0,0538 SE) laktózy v mléce. - Rozdíl statisticky se blížící průkaznosti (Pr<0,1) mezi zvířaty s genotypy AB chovu 2 a zvířaty s genotypy BB chovu 2. Diference byla odhadnuta na 0,089 % (± 0,0489 SE) laktózy v mléce.

5.2.5 Odhad asociace genu CSN3 a počtu somatických buněk v mléce Tabulka 41 uvádí odhad počtu somatických buněk a daných genotypů genu CSN3. Odhad diference nejmenších čtvercových středních hodnot pro počet somatických buněk je v tabulce 42 pro plemeno holštýn a pro plemeno české strakaté. V pozorovaných populacích obou plemen je statisticky neprůkazný vliv genotypů na počet somatických buněk. V žádných literárních zdrojích jsem nenašel vliv genotypu genu CSN3 na počet somatických buněk v mléce. Tab. 41 Odhadovaný počet somatických buněk v mléce (tis./ml) pro dané genotypy genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB BB AA AB BB

52

LSM ± SE 557,72 ± 205,83 607,18 ± 203,57 659,53 ± 315,10 201,53 ± 59,10 182,22 ± 59,05 231,32 ± 85,61

Tab. 42 Odhadovaná diference a standardní chyby pro počet somatických buněk v mléce (tis./ml) u daných genotypů genu CSN3 pro plemena holštýn a české strakaté Plemeno Holštýn

České strakaté

Genotypy AA AB AA BB AB BB AA AB AA BB AB BB

Odhad diference ± SE -49,462 ± 167,69 -101,810 ± 284,27 -52,345 ± 291,66 19,304 ± 55,097 -29,792 ± 89,288 -49,096 ± 86,006

Pr NS NS NS NS NS NS

Pozn. NS = not significant (nevýznamné)

Mezi jednotlivými genotypy genu CSN3 a chovy 1 a 2 nebyly nalezeny žádné statisticky významné diference.

53

6 ZÁVĚR Tato práce byla zpracována na základě dvou plemen ze tří chovů v ČR. Jednalo se o plemena holštýn a české strakaté. Obě sledovaná plemena byla pro daný lokus CSN3 v genetické rovnováze. Ve všech chovech byla zjištěna frekvence genotypu CSN3 AA 0,4046, genotyp BB měl frekvenci 0,1211. Posuzoval jsem také frekvence genotypů a alel v jednotlivých oddílech plemenné knihy a pořadí laktace. Plemeno české strakaté mělo vyšší frekvenci alely B ve všech oddílech plemenné knihy než plemeno holštýn. Tento trend je shodný také pro jednotlivé pořadí laktace. Frekvence alel a genotypů genu CSN3 odpovídají frekvencím uváděným jinými autory. V této práci nebyly nalezeny žádné statisticky významné (Pr<0,05, Pr <0,01) asociace mezi genotypy a sledovanými znaky mléčné produkce (dojivost, procento tuku, procento bílkovin, procento laktózy a počet somatických buněk). Byly zaznamenány rozdíly statisticky se blížící průkaznosti (Pr<0,1) mezi genotypy AA a BB na procento tuku a také mezi genotypy AB a BB na procento laktózy u plemene české strakaté. Tyto rozdíly nebyly statisticky příliš významné a proto by bylo potřeba tyto vlivy ověřit na větším počtu pozorovaných zvířat. Obsah kaseinu se jeví na základě dostupných údajů z literatury jako uspokojivý ukazatel pro selekci, BB CSN3 má pozitivní efekt na obsah proteinu. Proto se tento genotyp jeví jako zřejmý kandidát pro cílenou selekci mířící ke zlepšování znaků mléčné produkce. Selekce na určitou variantu proteinu kontrolovaného jedním genem může být docela snadné a může přispět ke zlepšení mléčných stád. Otázkou pouze zůstává, jestli mlékárny budou mléko od krav s genotypy CSN3 BB vykupovat za cenu, která by byla pro chovatele zajímavější. Díky molekulární genetice by se mohly tvořit stáda s vybraným genotypem BB a jejich mléko by se mohlo používat díky lepší výtěžnosti sýřeniny pouze k výrobě sýrů. Do těchto stád by se používali pouze otestovaní býci nesoucí genotyp BB.

54

7 POUŽITÁ LITERATURA

Anonym: Základní charakteristika mléka [on-line] 2006 [cit. 2007-11-13]. Dostupný z WWW: .

Bobe, G., Beitz, D. C., Freeman, A. E., Lindberg, G. L. Effect of milk protein genotypes on milk protein composition and its genetic parameter estimates. Journal of Dairy Science 82 (1999): s. 2797-2804. Bovenhuis, H., Van Arendonk, J. A. M., Korver, S. Association between milk protein polymorphisms and milk production traits. Journal of Dairy Science 75 (1992): s. 2549-2559. ČSN

57

0536

Stanovení

složení

mléka

infračerveným

absorpčním

analyzátorem. Praha: Český normalizační institut, 1999. 12 s. Čejna, V., Chládek, G. Rozdíly v základních parametrech mléka mezi dojnicemi holštýnského a montbeliardského plemene [on-line] 2005 [cit. 2007-10-22]. Dostupný z WWW: . Čejna, V., Chládek, G. Vliv plemene a pořadí laktace na obsah kaseinu v kravském mléce [on-line] 2007 [cit. 2007-10-22]. Dostupný z WWW: . FALCONER, D.S., MACKAY, T.F.C. . Introduction to quantitative genetics . 4th edition. Harlow : Pearson education limited, 1996. 464 s. ISBN 978-0-58224302-5.

55

Farrell Jr., H. M., Jimenez-Flores, R., Bleck, G. T., Brown, E. M., Butler, J. E., Creamer, L. K., Hicks, C. L., Hollar, C. M., Ng-Kwai-Hang, K. F., Swaisgood, H. E. Nomenclature of the proteins of cows milk – sixth revision. Journal of Dairy Science 87 (2004), s. 1641-1674. Freyer, G., Liu, Z., Erhardt, G., Panicke, L. Casein polymorphism and relation between milk production traits. Journal of Animal Breeding and Genetic 116 (1999), s. 87-97; ISSN 0931-2668. Gazdová, V., Humpolíček, P., Déduchová, V., Filkuková, J., Dvořák, J. Effect of C-CSN and B-CSN genotypes on milk production traits in czech fleckvieh and holstein breed. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis 1 (2007), ročník LV, s. 55-58. Hayes, J. F., NG-Kwai-Hang, K. F., Moxley, J. E. Heritability of milk casein and genetic and phenotypic correlations with production traits. Journal of Dairy Science 67 (1984): s. 841-846. Hřeben, F., Bucek, P. Možnosti měření obsahu kaseinu v mléce a výsledky analýz laboratoře imunogenetiky Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. na genotyp kapa kaseinu u býků českého strakatého a holštýnského plemene [online]

2005

[cit.

2007-10-22].

Dostupný

z WWW:

. Jelínek, P., Koudela, K. Fyziologie hospodářských zvířat. 1. vyd. Brno : Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003. 409 s. ISBN 80-7157-644-1 Kučerová, J., Němcová, E., Štípková, M., Vrtková, I., Dvořák, J., Frelich, J., Bouška, J., Maršálek M. Vliv markerů CSN3 a ETH10 na parametry mléčné užitkovosti u českého strakatého skotu. Journal of Central European Agriculture 5 (2004): s. 303-308.

56

Kučerová, J., Matějíček, A., Janderová, O.M., SØrensen, P., Němcová, E., Štípková, M., Kott, T., Bouška, J., Frelich, J. Milk protein genes CSN1S1, CSN2, CSN3, LGB and their relation to genentic values of milk production parameters in Czech Fleckvieh. Czech J. Animal Science 51 (2006) (6): s. 241-247.

Mášová, H., Šustová, K. Obsah kaseinu u plemen české strakaté a holštýnské [on-line] 2007 [cit. 2007-10-22]. Dostupný z WWW: . Mitra, A., Schlee, P., Krause, I., Blusch, J., Werner, T., Balakrishnan, C.R., Pirchner, F. Kappa-casein polymorphisms in Indian dairy cattle and buffalo: A new genetic variant in bufalo. Animal Biotechnology 9 (2) (1998): s. 81-87. Neubauerová, V. Detekce polymorfismu genetických markerů u skotu [on-line] 2000

[cit.

2007-04-22].

Dostupný

z WWW:

http://xarquon.jcu.cz/zf/veda_a_vyzkum/svoc_a_dsp/svoc/2000/sbdsp/asekz oo/Neubauerov%E1.rtf. NG-Kwai-Hang, K. F., Hayes, J. F., Moxley, J. F., Monardes, H. G. Association of genetic variants of casein and milk serum proteins with milk, fat and protein production by dairy cattle. Journal of Dairy Science 67 (1984): s. 835-840. NG-KWAI-HANG, K. F. . Encyclopedia of dairy sciences : Milk proteins. 1st edition. Vol. 3. Editor by Roginski, H., Fuquay, J.W., Fox, P.F. . London : Academic Press, 2003. ISBN 0-12-227238-2. Heterogenity, fractionation and isolation, s. 1881-1894. SAS Institute Inc. 2004. SAS 9.1.3. Cary, NC.

57

Smith, T.P.L., Lopez-Corrales, N., Grosz, M.D., Beattie, C.W., Kappes, S.M. Anchoring of bovine chromosomes 4, 6, 7, 10 and 14 linkage group telomeric endsvia FISH analysis of lambda clonek. Mammalian Geonome 8 (1997). s. 333-336. Soria, L.A., Iglesias, G.M., Huguet, M.J., Mirande, S.L. A PCR-RFLP test to detect allelic variants of the bovine kappa-casein gene. Animal Biotechnology 14 (2003): s. 1-5. Tsiaras, A. M., Bargouli, G. G., Banos, G., Boscos, C. M. Effect of kappa CN and beta LG loci on milk production traits and reproductive performance of holstein cows. Journal of Dairy Science 88 (2005): s. 327-334.

58

8 SEZNAM TABULEK

Tab. 1 Složení mléka některých savců – kaseinová mléka (http://www.vscht.cz). Tab. 2 Průměrné složení a variabilita kravského mléka (http://www.vscht.cz). Tab. 3 Charakteristiky hlavních proteinů kravského mléka (NG-KWAI-HANG, 2003). Tab. 4 Koeficienty heritability pro studované vlastnosti (Hřeben, Bucek, 2005). Tab. 5 Koeficienty heritability a směrodatné odchylky pro množství kaseinu, procento kaseinu, kaseinové číslo a znaky produkce (Hayes et al., 1984). Tab. 6 Genetické a fenotypové korelace mezi každým z množství kaseinu, procenta kaseinu a kaseinovým číslem a množstvím mléka, množstvím tuku, množstvím proteinu, procento tuku a procento proteinu (Hayes et al., 1984). Tab. 7 Odhad genetických korelací mezi sledovanými vlastnostmi (Hřeben, Bucek, 2005). Tab. 8 Pozice a aminokyselinové rozdíly v proteinu κ-kaseinu (Farrell et al., 2004). Tab. 9 Absolutní (n) a relativní (r) frekvence genotypů a relativní frekvence alel CSN3 (Gazdová et al., 2007). Tab. 10 Alelové frekvence CSN3 B u mléčných plemen (Freyer et al., 1999). Tab. 11 Metoda nejmenších čtverců a standardní chyby pro selektované znaky a genotypy CSN3 genu. Metoda nejmenších čtverců a standardní chyby pro rozdíly mezi českým strakatým a holštýnským plemenem (Gazdová et al., 2007). Tab. 12 Vztah mezi genotypy genu CSN3 a parametry mléčné produkce (Kučerová et al., 2006) Tab. 13 Zastoupení krav v jednotlivých laktacích Tab. 14 Zastoupení krav v oddílech plemenné knihy Tab. 15 Složení reakční směsi pro PCR Tab. 16 Podmínky PCR reakce Tab. 17 Složení reakční směsi pro RFLP Tab. 18 Tabulka pro výpočet χ2 bez rozlišení plemen Tab. 19 Tabulkové hodnoty χ2 Tab. 20 Tabulka pro výpočet χ2 pro plemeno holštýn

59

Tab. 21 Tabulka pro výpočet χ2 pro plemeno české strakaté Tab. 22 Relativní frekvence genotypů genu CSN3 ve všech sledovaných chovech Tab. 23 Relativní frekvence alel genu CSN3 Tab. 24 Relativní frekvence genotypů genu CSN3 dle jednotlivých chovů Tab. 25 Relativní frekvence alel genu CSN3 dle jednotlivých chovů Tab. 26 Rozložení frekvence genotypů genu CSN3 v jednotlivých oddílech plemenné knihy holštýnského plemene Tab. 27 Frekvence alel genu CSN3 dle jednotlivých oddílů plemenné knihy plemene holštýn Tab. 28 Rozložení frekvence genotypů genu CSN3 v jednotlivých oddílech plemenné knihy plemene české strakaté Tab. 29 Frekvence alel genu CSN3 dle jednotlivých oddílů plemenné knihy plemene české strakaté Tab. 30 Zastoupení genotypů genu CSN3 v jednotlivých laktacích Tab. 31 Relativní frekvence alel genu CSN3 v jednotlivých laktacích u plemene holštýn Tab. 32 Relativní frekvence alel genu CSN3 v jednotlivých laktacích u plemene české strakaté Tab. 33 Odhadovaná dojivost v kg mléka pro dané genotypy genu CSN3 u plemene holštýn a české strakaté Tab. 34 Diference nejmenších čtverců průměrů a standardní chyba pro odhad dojivosti v kg mléka a genotypů genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Tab. 35 Odhadované procento tuku v mléce pro stanovené genotypy genu CSN3 u plemene holštýn a české strakaté Tab. 36 Diference nejmenších čtverců průměrů pro odhad procenta tuku a genotypů genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Tab. 37 Odhadované procento proteinu mléka a daných genotypů genu CSN3 pro plemena holštýn a české strakaté Tab. 38 Diference nejmenších čtverců průměrů a standardní chyby pro odhad procenta proteinu a genotypů genu CSN3 u plemen holštýn a české strakaté Tab. 39 Odhad nejmenších čtvercových středních hodnot pro procento laktózy v mléce a jednotlivé genotypy genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté

60

Tab. 40 Odhad diference nejmenších čtverců průměrů a standardní chyby pro procento laktózy a genotypů genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Tab. 41 Odhadovaný počet somatických buněk v mléce (tis./ml) pro dané genotypy genu CSN3 pro plemeno holštýn a české strakaté Tab. 42 Odhadovaná diference a standardní chyby pro počet somatických buněk v mléce (tis./ml) u daných genotypů genu CSN3 pro plemena holštýn a české strakaté

61

9 SEZNAM ZKRATEK h2 – koeficient heritability r – genetické nebo fenotypové korelace SE – standardní chyba (Standard Errors) LSM - nejmenší čtvercová střední hodnota (Least-Squares Means) CSN3 – označení genu κ-kaseinu C-CSN, κ-CN – další možné označení pro gen κ-kaseinu BTA6 – označení pro 6. chromozom skotu PK – plemenná kniha HA – oddíl plemenné knihy, kde je 100% podíl krve plemene holštýn, HB – oddíl plemenné knihy, kde je podíl krve plemene holštýn 87,5 % a více, HC – oddíl plemenné knihy, kde je podíl krve plemene holštýn 75-87 %, HD – oddíl plemenné knihy, kde je podíl krve plemene holštýn 50-74 %. CA – oddíl plemenné knihy, kde je podíl krve plemene české strakaté 75 % a více, CB – oddíl plemenné knihy, kde je podíl krve plemene české strakaté 51-74 %, CC – oddíl plemenné knihy, kde je podíl krve plemene české strakaté 25-50 %. DNA – deoxyribonukleová kyselina PAGE – polyakrylamidová gelová elektroforéza PCR – polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) bp – páry bází (base pair) dH2O – destilovaná voda dNTP – deoxyribonukleozidtrifosfát RFLP – polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism) TBE pufr – tris-borátový pufr MLM – smíšený lineární model (Mixed Linear Model) REML - REstricted Maximum Likelihood χ2 – chí kvadrát P – pozorované absolutní frekvence O – očekávané absolutní frekvence n – stupně volnosti H0 – nulová hypotéza 62

Rel. f. g. – relativní frekvence genotypů Proc. zast. g. – procentické zastoupení genotypů Rel. f. daného g. – relativní frekvence daného genotypu Proc. zast. g. od. PK - procentické zastoupení genotypů oddílu PK Rel. f. – relativní frekvence lakt. – laktace Pr – hladina průkaznosti NS – not significant (nevýznamné) y ijkl = užitkový znak µ = průměrná hodnota sledované vlastnosti Gen i = vliv genotypů genu CSN3, pevný efekt, i = AA, AB, BB Lakt j = vliv pořadí laktace, pevný efekt, j = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Otec k = vliv otce, náhodný efekt Plem l = vliv plemene, fixní (pevný) efekt, l = CA, CB, CC, HA, HB, HC, HD

(

)

b xijkl − x = regrese na den laktace, pevný efekt e ijkl = reziduum Mol. hmot. – molekulová hmotnost Konc. – koncentrace Detek. genet. varianty – detekované genetické varianty β-LG - β-laktoglobulin α-LA - α-laktalbumin Sér. albumin - Sérový albumin Imunoglob. – Imunoglobulin DSR – německý černobílý skot SMR – kříženec německého černobílého skotu, 25 % jersey a 50 % holštýn PH – plemenná hodnota

63