COMPUTER PROCESSING FOR IMAGE ANALYSIS OF EARLY SOMATIC EMBRYOS GROWTH OF NORWAY SPRUCE (PICEA ABIES /L./ KARST.) POČÍTAČOVÉ ZPRACOVÁNÍ PRO ANALÝZU OBRAZU RANÝCH SOMATICKÝCH EMBRYÍ SMRKU ZTEPILÉHO (PICEA ABIES /L./ KARST.) Petřek J.1, Vlašínová H.1, Kizek R.2, Vacek J.2, Víteček J.1, Havel L.1 1
Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail:
[email protected]
ABSTRACT The image analysis is non-destructive and easy method used for growth in vitro quantification of early somatic embryos (ESEs) Norway spruce (Picea abies /L./ Karst.). Computer programs GRAB-IT and Image-Pro and CCD-camera fixed to stand were employed for Image analysis. CCD-camera (with relative standard deviation 0.31 %) digitalized clusters of early somatic embryos (ESEs) and gave data about its areas. Using the image analysis enable to compare area of ESE clusters in time and observe its growth without destruction and contamination of study material in comparison with weighing or calculating of cells. The image analysis was compared with gravimetric method. ESEs P. abies, clone 2/32 were simultaneously weighed and scanned by CCD-camera. It was seem that increase of ESE cluster area is equivalent to increase of its fresh weight. Consequently it is possible to use image analysis for observation of culture growth. The image analysis is suitable for determination form, color and size of cells, cell groups and other differentiated structures. Keywords: Image analysis, Norway spruce, blue spruce, Picea abies, Picea pungens early somatic embryo, gravimetric analysis, 2/32, PE14, E2 ABSTRAKT Analýza obrazu je nedestruktivní a jednoduchá metoda, kterou lze sledovat růst raných somatických embryí smrku ztepilého (Picea abies /L./ Karst.) v podmínkách in vitro. Ke snímání obrazu byla použita CCD-kamera pevně fixovaná ke stativu a počítačové programy GRAB-IT a Image-Pro. CCD-kamera digitalizuje shluky raných somatických embryí (SRSE) a poskytuje údaje
o jejich ploše (růstu) se střední relativní chybou 0.31 %. Pomocí metody
analýzy obrazu lze srovnávat plochy SRSE v čase, a tím pozorovat růst kultury, aniž by docházelo k destrukci nebo kontaminaci studovaného materiálu, jako je tomu v případě vážení nebo počítání buněk. Analýza obrazu byla srovnána s gravimetrickou metodou. SRSE P. abies
1
klonu 2/32 byly současně váženy a snímány CCD-kamerou. Ukázalo se, že nárůst plochy SRSE je ekvivalentní nárůstu jejich čerstvé hmotnosti; je tedy možné tuto metodu využít k pozorování růstu kultury. Analýzu obrazu lze využít při stanovení tvaru, barvy a velikosti buněk, buněčných skupin i jiných diferenciovaných struktur. Klíčová slova: analýza obrazu, smrk ztepilý, smrk pichlavý, Picea abies, Picea pungens, rané somatické embryo, gravimetrická analýza, 2/32, PE14, E2 ÚVOD Explantátové kultury rostlin vznikají aseptickou kultivací izolovaných částí rostlin za definovaných experimentálních podmínek. Pro odvození explantátové kultury je vhodné jakékoliv rostlinné pletivo obsahující funkční totipotentní buňky. Růst a vývoj explantátových kultur výrazně ovlivňuje průběh kultivace (růstové médium, světelný režim, teplota atd.), případně může stimulovat a urychlovat průběh morfogenního procesu (organogenezi, somatickou
embryogenezi,
somatickou
polyembryogenezi,
pylovou
embryogenezi
či
androgenezi). Při somatické embryogenezi vznikají ze somatických buněk embrya, která během svého
vývoje
procházejí
podobnými
vývojovými
fázemi
jako
embrya
zygotická.
Charakteristické rysy vzniku raných somatických embryí u jehličnanů byly popsány [1-4]. Jádro tubulární buňky (megakaryocyt) se rozdělí na dvě jádra; první postupuje k pólu a druhé se stává apoptotické a je eliminováno [5,6]. První jádro se následně několikrát dělí a vznikají tak embryonální buňky vytvářející rané somatické embryo (Obr. 1A). Raná somatická embrya smrku (RSE) se skládají z embryonální skupiny, embryonálních tubulárních buněk a embryonálního suspenzoru (Obr. 1A,B). Obr. 1: Schéma vzniku somatických embryí u smrku; (a) jádro tubulární buňky (megakaryocyt), (b) dělící se na dvě jádra, (c, d) první postupuje k pólu a druhé se stává apoptotické a je eliminováno, (e) první jádro se několikrát dělí a vznikají tak embryonální buňky, (f) ze kterých se vytváří rané somatické embryo s 1-embryonální skupinou, 2- embryonálními tubulárními buňkami a 3-embryonálním suspensorem (A). Mikroskopický snímek raného somatického embrya smrku ztepilého, klon 2/32 (Mikroskop Olympus AX 70); (a) embryonální skupina, (b) embryonální tubulární buňky, (c) embryonální suspensor; úsečka: 250 µm (B). a
A
b
c
B
a f
1
b 2
c 3
e
d
2
250 µm
Buňky embryonální skupiny se stále dělí a jejich prodlužováním na distálním konci vznikají tubulární buňky, z nichž vzniká embryonální suspenzor, jehož buňky jsou uvolňovány do média [3,7]. Dochází tak k neustálému oddělování nových tubulárních a suspenzorových buněk směrem od embryonální skupiny a tvoří se shluky raných somatických embryí (SRSE), jak je ukázáno na Obr. 2. Obr. 2: SRSE, klon 2/32, po 14 denní kultivaci in nature fotografie z různého úhlu (Fotoaparát Olympus Digital Camera C-4040 ZOOM); (1) 0°, (2) 45°, (3) 90° (C).
0°
1
45° 2 90° 3 Na základě podobnosti raných somatických embryí (RSE) a raných zygotických embryí je možné použít RSE jako odvozenou modelovou kulturu, u které se dají předpokládat podobné fyziologické odpovědi jako je tomu u zygotické embryogeneze [1,6,8]. Nejčastější metodou, která umožňuje sledovat fyziologické odpovědi při vlastní technice pasážování RSE, popřípadě při odpovědi na určitý podnět (např. snížení koncentrace složek v živného roztoku, vynechání růstového regulátoru, nebo aplikace tzv. elicitorů do média), je vážení. Tato metoda ovšem není využitelná při experimentu probíhajícím v čase, tedy při pozorování růstu jednotlivých SRSE v průběhu celého experimentu. Gravimetrická metoda umožňuje pouze pozorování na jeho začátku a na konci, neboť při vážení dochází k mechanickému poškození struktury SRSE a tím ke zpomalení jejich růstu. Analýza obrazu (Image analysis) je vhodným nástrojem ke sledování růstu SRSE smrku v podmínkách in vitro během celého pokusu. K vlastní analýze obrazu je využívána CCD-kamera (charge-coupled device) a počítačové programy GRAB-IT a ImagePro. Analýza obrazu je metodou, u které lze sledovat růst i u značně heterogenních struktur SRSE bez zásahu do rostoucí kultury. MATERIÁL A METODY Rostlinný materiál Při experimentech byly využity kultury raných somatických embryí smrku ztepilého (Picea abies /L./ Karst.), charakterizované jako klony 2/32 (Beskydy), E2 (Brno) a smrku pichlavého (Picea pungens Engelm.), klon PE 14 (Brno). Embrya byla kultivována ve sterilních plastových Petriho miskách (průměr 90 mm, 30 ml LP/2 média). Na jednu misku připadlo vždy 10 SRSE.
3
SRSE byla pasážována pod mikroskopem (PZO, Poland) po 14 dnech za striktně sterilních podmínek (flow box Galaire HF 36). Při pasáži byly z horních partií SRSE odebírány části s vyvinutými skupinami embryonálních buněk o hmotnosti přibližně 2,5 – 5,0 mg a přenášeny na novou Petriho misku s LP/2 médiem. SRSE byly kultivovány ve tmě při teplotě kolem 23 °C. Kultivační médium Všechny výše uvedené kultury byly dlouhodobě kultivovány na kultivačním médiu LP/2 [7], které bylo modifikováno 9 µM 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinou a 4,4 µM benzylaminopurinem
[6].
Anorganické
i
organické
složky
média
byly
rozpuštěny
v deionizované destilované vodě, pH bylo upraveno na hodnotu 5,7 – 5,8 pomocí KOH/HCl (pH metr Schott CG 842). Následně byla anorganická část média sterilizována při teplotě 121°C a tlaku 100 kPa po dobu 30 minut (Tuttnauer 3870 EA); organická část byla sterilizována membránovou filtrací (Whatman Puradisc 25 AS 0,2 µm). Světelná mikroskopie SRSE SRSE byly velmi opatrně rozředěny v destilované vodě a nakápnuty na podložní sklíčko. Mikroskopický preparát byl pozorován přístrojem Olympus (AX 70) při zvětšení 10krát. Digitální fotografie SRSE SRSE byly fotografovány z různého úhlu přímo na LP/2 médiu pomocí digitálního fotoaparátu Olympus Digital Camera C-4040 ZOOM. Vážení SRSE Růst SRSE byl zjištěn vážením, které bylo prováděno ve flow-boxu (Galaire HF 36) na analytických vahách (Denver Instrument APX-153). SRSE byly velmi opatrně očištěny od média pomocí fosfátového pufru (pH 7.0). Analýza obrazu SRSE Pro zjištění plochy SRSE byla nutná digitalizace obrazu každé Petriho misky. Digitalizace byla prováděna kamerou CCD Sony (UPV-GDS 8 000). Pro vyhodnocení jednotlivých ploch byl využit program IMAGE – PRO. Statistické metody Pro statistické hodnocení bylo využíváno tabulkového procesoru Excel (Microsoft). VÝSLEDKY A DISKUSE Morfologie RSE a SRSE U raných somatických embryí (RSE) smrku kultivovaných na LP/2 médiu po dobu 14 dní ve tmě byla studována jejich morfologie světelným mikroskopem. Na mikroskopickém preparátu byla pozorována velmi dobře vyvinutá RSE (Obr. 1B). Prostorová struktura jednotlivých SRSE byla sledována pomocí digitálního fotoaparátu. Na obrázku 2 je ukázán
4
SRSE při jeho snímání z různých úhlů. Jak je z obrázku dobře patrné nejvhodnějším se zdá být úhel 90°, u kterého je prostorová struktura SRSE velmi dobře pozorovatelná. Analýza obrazu Obrazy jednotlivé Petriho misky byly digitalizovány pomocí CCD-kamery. Petriho miska s SRSE byla nejprve umístěna pod objektiv kamery a osvětlena zářivkami ze spodu a dvou stran. Pro kalibraci digitalizovaného obrazu pomocí programu IMAGE-PRO PLUS bylo nutné nasnímat vhodné měřítko. Samotná digitalizace byla řízena PC prostřednictvím programu GRAB-IT. Pro získání kvalitního obrazu bylo nezbytné nastavit vhodnou expozici a rozlišení kritického detailu (místo nejostřejšího vidění předmětu). Získaný digitalizovaný obraz byl uložen do vytvořené složky paměti počítače. Metoda umožnila velmi rychle a snadno vypočítat plochu všech digitalizovaných SRSE při jejich automatickém načtení v programu. Při konstantním nastavení metody bylo možné studovat pouze změny plochy SRSE v čase. Pokud byly SRSE velmi malé velikosti (do
10 mm2) bylo potřeba každé digitalizované SRSE
v programu ručně označit, protože automatické načtení výrazně zvýšilo chybu stanovení (více než 15%). Celý postup zjišťování ploch jednotlivých SRSE je shrnut na Obr. 3A. Obr. 3: Schéma analýzy obrazu kultury raných somatických embryí smrku ztepilého; (a) digitalizace obrazu Petriho misky se SRSE pomocí CCD kamery, (b) načteno do programu Grab-It, (c) počítačový obraz, (d) výpočet plochy programem Image-Pro (A). Závislost průměrných ploch SRSE na nastavení rozlišení CCD kamery (B). Znázornění rozdílů nasnímané plochy SRSE od optimálního rozlišení 5 pixelů na mm2 (0 %) (C). Další podrobnosti jsou uvedeny na obrázku 1. A
S oftw are G rab -IT b C C D -kam era
PC
a
S oftw are Im a ge -P ro
d V Ý S LE D K Y vyp očten á plo cha S R S E
c
B
C 9
Plocha SRSE (%)
5 pixelů /mm2
17
5
1
-3
Pixel ( mm2)
5
16.0
9.9
13.2
8.0
6.7
5.7
4.2
3.8
3.3
2.7
13.2
8.0
5.7
3.3
4.2
Pixel ( mm2)
2.8
-7
15 2.7
Plocha SRSE (mm 2)
19
Při výpočtu přírůstku SRSE vycházíme z původní velikosti. Výsledný přírůstek představuje procento, o kolik se daný SRSE po dobu kultivace zvětšil. Pro výpočet byla využita následující rovnice: Pp = ((In / Io) – 1) . 100
[%], kde
Pp = přírůstek SRSE vyjádřený v procentech, In = plocha SRSE po n dnech kultivace [mm2], Io = plocha SRSE na začátku kultivace [mm2]. Rozlišení kritického detailu Při různém nastavení objektivu kamery byly programem IMAGE-PRO vypočítány různé velikosti ploch u totožných SRSE smrku. Bylo zjištěno, že se stoupajícím rozlišením klesá velikost plochy jednotlivých SRSE. Při rozlišení 2.8 až 3.6 pixelů na mm2 je digitalizovaná plocha nadhodnocena asi o 16% (proti rozlišení 5 pixelů na mm2) a hodnoty plochy jsou velmi variabilní, neboť není správně rozeznán okraj SRSE. Při vyšším rozlišení kritického detailu se variabilita výrazně snižuje a roste přesnost určení plochy SRSE (Obr. 3B,C). Při hodnotách snímání obrazu nad 5 pixelů na mm2 je proces snímání obtížnější a méně reprodukovatelný (v zorném poli kamery není celá plocha Petriho misky). Pro další experimenty bylo vybráno rozlišení kritického detailu 5 pixelů na mm2, které zajišťuje dobré určení hodnoty plochy SRSE (Obr. 3B,C) a zároveň je vhodné pro konstantní nastavení metody při jejím rutinním využití, tedy aby byla v zorném poli kamery snímána vždy celá plocha (Petriho miska). Porovnání přírůstku hmotnosti a plochy SRSE u klonu 2/32 Pro zjištění plochy SRSE byla snímána Petriho miska se SRSE na počátku experimentu a dále v příslušných časových intervalech (Obr. 4). Průměrné relativní přírůstky hmotnosti a plochy SRSE v průběhu čtrnáctidenní kultivace vykazovaly lineární striktně trend (y = 14.872x - 9.6697, R2 = 0.99). Při kultivaci SRSE po dobu 35 dnů byla linearita zachována při parametrech rovnice přímky: y = 9.0561x - 6.0197, R2 = 0.9833. Bylo zjištěno, že hmotnost SRSE v porovnání s jejich plochou roste rychleji, a to po celou dobu kultivace (směrnice jejich přímek se od sebe výrazně liší). Pozorované rozdíly jsou pravděpodobně způsobeny růstem SRSE do výšky, což analýzou obrazu nelze zachytit [9]. I přes zjištěný rozdíl obou metod je určení plochy SRSE vhodným nástrojem pro stanovení růstové charakteristiky SRSE (Obr. 4).
6
Průměrný přírůstek SRSE (%)
Obr. 4: Růstová křivka SRSE klonu 2/32 při kultivaci 35 dnů (A) 15 dnů (B); chybová úsečka vyznačuje střední chybu. Další podrobnosti jsou uvedeny na obrázku 2.
Průměrný přírůstek SRSE (%)
1200
800
240 hmotnos t
160
plocha
80
0 0
5 10 Čas kultivace SRSE (d)
15
400
hmotnost plocha
0 0
10
20
30
Čas kultivace SRSE (d)
Analýza růstu klonů 2/32, E2 a PE14 Vypracovaná metoda analýzy obrazu byla testována na studium růstu dalších klonů smrku (E2 a PE 14). Průměrné přírůstky plochy u jednotlivých klonů viz. Obr. 5. Pozorovaná rozdílná rychlost růstu jednotlivých klonů je pravděpodobně způsobena jejich rozdílnou metabolickou aktivitou [9,10]. Obr. 5: Růst SRSE klonů 2/32, E2 a PE14 v 7, 14, 21 a 28 dnech kultivace. Další podrobnosti jsou uvedeny na obrázku 2.
Plocha SRSE (mm2)
600
2/32. PE 14 E2
400
200
0 7
14 21 Čas kultivace SRSE (d)
28
ZÁVĚR Cílem práce bylo sledování růstu kultury raných somatických embryí smrku ztepilého klonů 2/32, E2 a smrku pichlavého klon PE 14. Růst byl studován optimalizovanou metodou analýzy obrazu. Metoda se jeví jako vhodná pro nedestruktivní a rutinní studium růstu SRSE. PODĚKOVÁNÍ Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a Národního výzkumného centra LN00A081.
7
POUŽITÁ LITERATURA [1]
P.K. Gupta, D.J. Durzan, Bio-Technol. 4 (1986) 643.
[2]
P. Gupta, A. Dandekar, D. Durzan, Plant Sci. 58 (1988) 85.
[3]
D.J. Durzan, K. Jokinen, M.P. Guerra, A. Santerre, V. Chalupa, L. Havel, Int. J. Plant Sci. 155 (1994) 677–688.
[4]
D.J. Durzan, Int. J. Plant Sci. 157 (1996) 17–26.
[5]
L. Havel, D.J. Durzan, Bot. Acta 109 (1996) 268–277.
[6]
L. Havel, D.J. Durzan, Int. J. Plant Sci. 157 (1996) 8–16.
[7]
S. Arnold, Journal of Plant Physiology 128 (1987) 233.
[8]
H. Vlašínová, L. Havel, Journal of Plant Physiology 154 (1999) 212.
[9]
J. Petřek, J. Vacek, H. Vlašínová, R. Kizek, L. Havel, S. Procházka, Plat Cell Rep. (2003).
[10]
J. Petřek, Diplomová práce, Ústav zakládání a pěstění lesů, MZLU, Brno, 2003, p. 88.
8
