Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
STANOVENÍ ESTROGENŮ V ODPADNÍCH VODÁCH Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracovala:
Doc. Mgr. Bořivoj Klejdus Ph.D.
Marie Šnóblová
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Stanovení estrogenů v odpadních vodách vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně, dne………………………….. Podpis ……………………
Poděkování Ráda
bych
touto
cestou
poděkovala
vedoucímu
své
bakalářské
práce
Doc. Mgr. Bořivoji Klejdusovi Ph.D. za jeho odborné připomínky, rady, cenné informace a také za jeho trpělivost a ochotu. Chci poděkovat také za to, že mi bylo umožněno pracovat v laboratoři kapalinové chromatografie na Ústavu chemie a biochemie MZLU v Brně a získat tak nové a užitečné zkušenosti pro mé budoucí působení v praxi.
ANOTACE Osud přirozených steroidních hormonů, estrogenů, v těle člověka, následné vstupy do životního prostředí – odpadních vod a metody jejich detekce jsou hlavním tématem této práce. Názvem estrogeny se označují jednak přirozené steroidní hormony, secernované především v ovariích, ale také synteticky připravené látky jiné struktury s tímto účinkem. Estrogenní hormony jsou pouze přirozené látky, ať již izolované nebo synteticky připravené, a jsou pojmem užším, estrogeny (látky s estrogenním účinkem) pojmem širším. Estrogenní hormony ovlivňují řadu pochodů a jsou proto nezbytné pro správný vývoj a reprodukci organizmu. Na druhé straně, vlivem znečištěného prostředí, s rostoucí spotřebou antikoncepčních přípravků a ostatních léčiv na hormonální bázi, dochází ke vzniku hormonální nerovnováhy, což se může projevit celou řadou nežádoucích efektů u lidské i zvířecí populace. Odkazem je možné vyústění v epidemii reproduktivních abnormalit, kam patří vytrvale narůstající počet rakovin, neplodnost, nízká úroveň spermií či hermafroditizmus u ryb a obojživelníků. Seznámit se a upozornit na tuto problematiku je hlavním cílem této práce.
ANNOTATION Destiny of natural steroid hormones, estrogens in human’s body and following inputs in nature – waste water and methods of their detection are primary goals of this thesis. So called estrogens are partly natural steroid hormones secreted especially in ovaries or synthetically prepared substances of different structure with equal effect. Estrogen hormones are pure natural materials, either isolated or synthetically prepared and estrogens are substances with estrogenic effects. Estrogen hormones influence several processes and are necessary for regular evolution and reproduction of organism. On the other hand, by influence of polluted environment with increasing consumption of anticonceptive preparatives and other hormone platform pharmaceuticals, is caused origin of hormone imbalance, which can initiate a number of adverse effects in human or animal
population.
Possible
results
are
sterility,
low
number
of
sperm
or hermaphroditism by fish or amphibians. Introduction and caution about this problem is main goal of this thesis.
OBSAH
ÚVOD..................................................................................................................................11 CÍL PRÁCE........................................................................................................................14 LITERÁRNÍ PŘEHLED ..................................................................................................16 1. VNITŘNÍ SEKRECE A ENDOKRINOLOGIE .......................................................................17 2.
HORMONY ..................................................................................................................17
3.
ŽENSKÉ POHLAVNÍ HORMONY ....................................................................................22 3.1 Estrogeny...............................................................................................................23 3.1.1 Chemická struktura a biosyntéza estrogenů......................................................23 3.1.2 Metabolizmus estrogenů ...................................................................................25 3.1.3 Transport, degradace a mechanizmus účinku estrogenů ..................................25 3.1.4 Fyziologické účinky estrogenů .........................................................................27 3.1.5 Terapeutické užití .............................................................................................28 3.1.6 Dostupné látky ..................................................................................................29 3.2 Menstruační cyklus................................................................................................30 3.2.1 Ovariální steroidy .............................................................................................31 3.2.2 Estrogen produkovaný placentou......................................................................32 3.3 Hormonální antikoncepce .....................................................................................32
4.
ESTROGENY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ ..........................................................................34 Úvod ..............................................................................................................................34 4.1 Environmentální estrogeny ...................................................................................35 4.1.1 Působení environmentálních estrogenů ............................................................35 4.1.2 Toxicita .............................................................................................................35 4.2 Vliv estrogenních látek na vývoj ...........................................................................36 4.3 Vztah struktury a estrogenní aktivity.....................................................................37 4.4 Antiestrogeny.........................................................................................................37 4.5 Metabolizmus a vylučování estrogenů do životního prostředí..............................38
5.
METODY STANOVENÍ ESTROGENŮ ..............................................................................40 5.1 Validace metod pro analýzu estrogenů .................................................................40 5.2 Postup při stanovení estrogenů.............................................................................41
5.2.1 Zpracování vzorků ............................................................................................41 5.3 Analytické detekční metody ...................................................................................41 5.3.1 Metody založené na plynové chromatografii (GC-MS a GC-MS-MS)............41 5.3.2 Metody založené na vysoko účinné kapalinové chromatografii (HPLC).........42 5.3.3 Metody založené na imunochemických technikách .........................................43 5.4 Použití analytických metod pro steroidní estrogeny .............................................43 5.4.1 Odpadní vody a kaly .........................................................................................43 5.4.2 Povrchové vody a sedimenty ............................................................................44 DISKUSE............................................................................................................................46 ZÁVĚR ...............................................................................................................................51 SOUPIS LITERATURY ...................................................................................................54 PŘÍLOHY...........................................................................................................................58
PŘÍLOHY - SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ: Tab. 2-1. Klasifikace hormonů podle mechanizmu účinku .................................................59 Tab. 2-2. Obecné znaky hormonálních skupin ....................................................................60 Obr. 2-1. Gonan ...................................................................................................................60 Obr. 2-2. Metabolizmus ovariálních steroidních hormonů..................................................61 Obr. 2-3. Cesty syntézy hlavních skupin steroidních hormonů. ..........................................62 Obr. 3-1. Vzorce estrogenních hormonů .............................................................................65 Obr. 3-2. Biosyntéza a metabolizmus estrogenů .................................................................65 Obr. 3-3. Konjugované vylučovací formy estrogenů ..........................................................66 Obr. 4-1. Reaktivace estrogenu do aktivní formy – uvedeno na př. estradiolu ...................67 Tab. 4-1. Fyzikálně chemické charakteristiky steroidních hormonů...................................67 Tab. 5-1. Nejnižší pozorované účinné koncentrace estrogenů při studiu ryb v literatuře ...67
SLOVNÍK POUŽITÝCH ZKRATEK: Seznam zkratek hormonů: ACTH Adrenokortikotropní hormon = kortikotropin DES Diethylstilbestrol E1 Estron E2 17β-estradiol EE2 17α-ethinylestradiol E2-17α 17α-estradiol E3 Estriol FSH Folikuly stimulující hormon = folitropin GnRH Hormon uvolňující gonadotropiny = LHRH = hormon uvolňující luteinizační hormon = LRH = hormon uvolňující luteotropin = LRF = luteotropin uvolňující faktor LRF hCG Choriový gonadotropin LH Luteinizační hormon = ICSH = hormon stimulující intersticiální buňky LTH Luteotropní hormon = luteotropin = PRL = prolaktin MeEE2 Mestranol MSH Melanoforový hormon = melanotropin PTH Parathormon SHBG Globulin vázající sexuální hormony STH = GH Růstový hormon = somatotropní hormon = somatotropin T4 Thyroxin T3 Trijodthyronin TSH Tyreotropní hormon = tyreotropin Seznam ostatních zkratek: ČOV Čistírna odpadních vod DDT Dichlordifenyltrichlorethan DHEA Dehydroepiandrosteron DNA Deoxyribonukleová kyselina EREs Estrogen response elements ER Estrogenní receptor HDL Vysokodenzní lipoproteiny
HRE Hormone response element HRT Hormonální substituční léčba LDL Nízkodenzní lipoproteiny NADPH Redukovaná forma NADP – nikotinamidadenindinukleotidfosfát P450c17 17α-hydroxyláza P450c17 17,20 lyáza P450c17 Lyáza PCB Polychlorované bifenyly PCDD Polychlorované difenyl-p-dioxiny PCDF Polychlorované difenyl-furany p.o. Per os (Podávání ústy) TCDD 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin ŽP Životní prostředí Seznam zkratek analytických metod: APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation APPI Atmospheric Pressure Photo Ionisation CI Chemical ionisation DAD Diode Array Detector EI Electron impact ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ESI Electrospray ionisation GC Gas Chromatography GPC Gel Permeation Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography LC Liquid Chromatography LLE Liquid-liquid Extraction LOEC Lowest Observed Effect Level Concentration LOD Level Limit Of Detection LOQ Level Limit Of Quantification MS Mass Spectrometry MS-MS Tandem Mass Spectrometry NOEC No Observed Effect Concentration PLE Pressurised Liquid Extraction
RIA Radio Immunoassay SPE Solid-phase Extraction STP Sewage Treatment Plan
11
ÚVOD
12
Člověk spolu s ostatními živočichy a rostlinami žije v zevním prostředí, které mu poskytuje veškeré základní podmínky potřebné pro život. Jednotlivé organizmy se ovlivňují jednak mezi sebou navzájem, ale také právě s vnějším prostředím. Rovnováha koloběhu jednotlivých součástí celku je v průběhu dlouhého časového úseku narušována a to zejména lidskou činností. Člověk ovlivňuje nejen flóru i faunu, její bohatost, rozmanitost i množství, ale i sebe mutagenními, teratogenními i karcinogenními vlivy toxických látek. Kromě zevního prostředí má pro existenci člověka – jako pro každý mnohobuněčný organizmus – význam i tzv. vnitřní prostředí tvořené jednak tekutinami mimobuněčnými, extracelulárními, obklopující buňky a zprostředkovávající spojení mezi zevním prostředím a vnitřkem buněk, a také tekutinami nitrobuněčnými neboli intracelulárními. V živých organizmech tak díky vnitřnímu prostředí dochází k neustálé přeměně látek, energií a výměně informací s okolím. Z termodynamického hlediska jsou proto otevřeným systémem. Podmínkou existence živého systému je, aby byl udržován v ustáleném stavu charakterizovaném tím, že vlastnosti určující vnitřní prostředí jsou konstantní. Stálost vnitřního prostředí = homeostáza je neustále vyvažována neurohumorální regulací. Regulační mechanizmy umožňují produkci jednotlivých látek podle potřeby zvýšit nebo omezit, až zastavit. Má-li organizmus přežívat, musí se neustále přizpůsobovat změnám prostředí. Musí tedy stále upravovat své vnitřní vztahy, aby odpovídaly vztahům organizmu k vnějšímu prostředí. Kromě udržování konstantnosti vnitřního prostředí řídí regulační systémy i růst, zrání a reprodukci organizmu. Funkční součástí regulačního systému jsou látky nazývané hormony, do nichž se mimo jiné řadí i steroidní hormony. Součástí této skupiny jsou pohlavní inkrety zvané estrogeny, které jsou hlavním předmětem této práce. Nejprve bude nastíněn obecný přehled o estrogenech, jejich metabolizmus, biosyntéza, účinky a použití syntetických derivátů v hormonální antikoncepci. Dále bude sledována expoziční cesta estrogenů do životního prostředí. Estrogeny se mohou dostat do rozličných složek prostředí. Mohou se stát součástí odpadních vod, kalů z ČOV, povrchových vod, sedimentů, půd, zejména jako důsledek metabolizmu nejen člověka, nýbrž i hospodářských zvířat. Následně bude obecně pojednáno o možných a v současné době dostupných metodách detekce estrogenů. Tato problematika je v současnosti prozatím málo prozkoumána. Existuje nevelké množství odborných prací, které se snaží objasnit možná rizika na zdraví populací, nalézt vhodné metody pro stanovení těchto látek v prostředí a hledat cesty k jejich odstranění
13
či zabránění jejich negativních účinků. S rostoucí spotřebou antikoncepčních kontraceptiv, i jiných léků na hormonální bázi a s rozvojem antropogenní činnosti se mimo přirozené estrogeny mohou do životního prostředí dostat i syntetické estrogeny a látky estrogenní povahy. Problematika látek estrogenní povahy zde bude jen naznačena, neboť přesahuje předmět této práce. Sledovány budou hlavně přirozené estrogeny estron, estradiol, estriol. Ze syntetických pak ethinylestradiol, mestranol a diethylstilbestrol. Tyto látky jsou na jedné straně pro správnou funkci organizmu nepostradatelné, na straně druhé mohou ovlivňovat endokrinní systémy a následně reprodukci a vývoj lidské a zvířecích populací. Kontaminace organizmu je dána především potravou. Existují významné důkazy o tom, že populace lidské i volně žijících organizmů byly a jsou škodlivě ovlivňovány expozicí chemickými látkami v prostředí, což je potvrzeno především modulací různých endokrinních systémů. Řada vědeckých studií z poslední doby popisuje endokrinní abnormality u specifických populací ryb, ptáků, savců i člověka.
14
CÍL PRÁCE
15
Základním cílem mého projektu byla snaha o poznání a porozumění osudu přirozených estrogenů uvnitř organizmu, o jejich metabolizmu, účincích, expozičních cestách v životním prostředí a metodách detekce v odpadních vodách přitékajících kanalizační sítí na čistírnu odpadních vod. Jako modelové sloučeniny byly vybrány přirozené steroidní estrogeny produkované hlavně ovárii; estron, estradiol, estriol. Dále bylo poukázáno na některé syntetické estrogeny, a to ethinylestradiol, mestranol a diethylstilbestrol. Důvodem byly především pravděpodobné efekty na vznik rakoviny (převážně endometria a také prsu), negativní efekty na reprodukci mužského organizmu (při expozici mužského plodu, případně novorozence prostřednictvím mateřského mléka), dané inhibicí spermatogeneze a snížením počtu spermií a další negativní efekty na zdraví, převážně reprodukci, lidského organizmu. Kromě toho byly důvodem také účinky těchto látek na divokou populaci, zejména ryb, neboť ovlivňují plodnost a sexuální vývoj.
16
LITERÁRNÍ PŘEHLED
17
1. Vnitřní sekrece a endokrinologie Endokrinní a nervový systém tvoří funkční jednotku regulací, přičemž rychlé regulační zásahy jsou zprostředkovány nervstvem, volnější popudy udržování homeostázy pak systémem vnitřní sekrece. Centrální nervová soustava ovlivňuje také vnitřní sekreci a naopak hormony mohou ovlivňovat funkční centra nervové soustavy. Reakcí se specifickým receptorem, tj. vazbou na určité makromolekuly buněk, se vyvolá řada fyzikálně-chemických změn, jejichž výsledkem je nakonec regulační efekt. Podněty mohou být přenášeny také pouze čistě krevní cestou bez součinnosti nervové soustavy. Takové orgány vylučující specifické látky působící regulačně krevní cestou na orgány jiné, jsou nazývány žlázami s vnitřní sekrecí neboli endokrinními žlázami. Endokrinologie je naukou o vnitřní sekreci. Činnost žláz s vnitřní sekrecí je řízena jednak humorálně autoregulací, jednak nervově vegetativním systémem. Obě regulační složky jsou neodlučitelné a plynule do sebe zasahují. Žlázy s vnitřní sekrecí produkují buď hormon jediný, nebo několik specifických inkretů. Některé jsou činné od narození, jiné rozvíjejí plnou činnost teprve dospíváním, nebo jsou aktivní periodicky. Důležitost endokrinních orgánů pro normální stav organizmu nezávisí přímo na jejich velikosti nebo hmotnosti. Soubor všech endokrinních žláz určitého organizmu označujeme jako endokrinní systém, čímž je vyznačena jeho funkční jednota a vzájemná závislost jeho jednotlivých částí. Poruší-li se jeden endokrinní orgán, má to nejčastěji odezvu i na ostatních, které mohou původní poruchu druhotnými změnami regulace zastírat. [14]
2.
Hormony Žlázy endokrinního systému secernují do krve specifické látky, které označujeme
jako hormony, jež regulují činnost jiných vzdálených tkání a to stimulačně nebo inhibičně. Hormony lze klasifikovat podle způsobu produkce; chemického složení; vzdálenosti, na kterou působí; dále dle charakteristik rozpustnosti; umístění receptorů a povahy signálu, kterého se používá k zprostředkování hormonálního účinku uvnitř buňky. Klasifikace založená na posledních dvou vlastnostech je uvedena v Přílohách v Tab. 2-1. Obecné charakteristiky každé skupiny jsou v Tab. 2-2.
18
Rozdělení hormonů podle způsobu produkce: 1. neurosekreční hormony: produkovány nervovými buňkami = neurosekrece 2. tkáňové hormony: produkovány tkáněmi, působí zpravidla v místě svého vzniku 3. endokrinní hormony: produkovány žlázamy s vnitřní sekrecí Endokrinní hormony pak rozdělujeme takto: A) HORMONY HYPOTHALAMO-HYPOFYZÁRNÍ SOUSTAVY I. Hormony adenohypofýzy = glandotropní hormony = glandotropiny 1. Tyreotropní hormon = tyreotropin = TSH 2. Adrenokortikotropní hormon = kortikotropin = ACTH 3. Růstový hormon = somatotropní hormon = somatotropin = STH = GH 4. β-endorfin 5. Gonadotropní hormony a) Folikuly stimulující hormon = folitropin = FSH b) Luteinizační hormon = LH = hormon stimulující intersticiální buňky = ICSH c) Luteotropní hormon = luteotropin = LTH = prolaktin = PRL II. Hormon střední části hypofýzy Melanoforový hormon = melanotropin = MSH III. Hormony neurohypofýzy 1. Vasopresin 2. Oxytocin B) HORMON EPIFÝZY Melatonin C) HORMON BRZLÍKU Thymokrescin = thymozin D) HORMONY ŠTÍTNÉ ŽLÁZY 1. Thyroxin T4 a trijodthyronin T3 2. Thyreokalcitonin = kalcitonin E) HORMON PŘÍŠTITNÝCH TĚLÍSEK Parathormon F) HORMONY SLINIVKY BŘIŠNÍ = PANKREATU 1. Inzulín 2. Glukagon
19
G) HORMONY NADLEDVIN I. Hormony dřeně nadledvin Adrenalin a noradrenalin II. Hormony kůry nadledvin 1. Mineralokortikoidy 2. Glukokortikoidy 3. Pohlavní hormony a) Androgeny b) Gestageny a estrogeny H) HORMONY POHLAVNÍCH ŽLÁZ I. Mužské pohlavní hormony Testosteron II. Ženské pohlavní hormony 1. Estrogeny – estradiol, estron, estriol 2. Gestageny a) Progesteron b) Choriongonadotropin c) Relaxin Hormony je možno schématicky dělit do několika skupin také podle jejich chemického složení a struktury. První skupinu tvoří hormony odvozené od aminokyseliny tyrozinu, sem patří hormony dřeně nadledvin a štítné žlázy. Druhou skupinu tvoří hormony se strukturou peptidovou, složené seřetězením různých aminokyselin. Patří sem jednoduché peptidy secernované v hypothalamu a neurohypofýze i peptidy složité, mající již vlastnosti bílkovin – tzv. proteohormony. Třetí skupinu hormonů z chemického hlediska tvoří hormony se strukturou steroidní, odvozené z cholesterolu, tzv. steroidní hormony, secernované gonádami a kůrou nadledvin. Popis k Tab. 2-1.: Hormony I. skupiny jsou lipofilní a s vyjímkou T3 a T4 jsou odvozeny z cholesterolu. Po sekreci se tyto hormony vážou na transportní proteiny: tím se obchází problém jejich rozpustnosti v krvi a prodlužuje se jejich plazmatický poločas. Volný hormon snadno prochází plazmatickou membránou všech buněk a setká se se svými
20
receptory v cytozolu nebo v jádře cílových buněk. Komplex ligand-receptor je patrně intracelulárním poslem v této skupině.
Řízení
sekrece
hormonů
v
endokrinních
žlázách
záleží
na
buněčných
mechanizmech převádějících specifický podnět k biosyntéze nebo uvolnění hormonu z buněk. „Účinek“ hormonu je obvykle velmi komplexní. Pro praktické použití je důležité znát, v jaké formě je příslušný hormon účinný, jak je nutné ho podávat, jakou má stabilitu a jaká je jeho účinná dávka za různých okolností. Některé z těchto faktorů souvisí s chemickou povahou hormonu, jiné se stavem organizmu a funkční pohotovostí jednotlivých žláz. Hormonální regulace probíhá s určitou dobou latence. Okamžité regulační zásahy v těle se dějí nervovou cestou, i když je třeba znovu zdůraznit, že jak nervové, tak i humorální hormonové řízení spolu úzce souvisí, popřípadě jedno v druhé přechází. Hormony, jejichž produkce je podněcována sekrecí hypofýzy, samy inhibují činnost hypofýzy zpětnou vazbou. Účinky hormonů jsou zprostředkovány vazbou hormonů na receptorové molekuly: to jsou místa, kde se hormony vážou při zprostředkování jejich reakcí. V extracelulární tekutině jsou hormony přítomny ve velmi nízkých koncentracích, obecně v rozmezí od 10-15 do 10-19 mol/l. To je mnohem nižší koncentrace, než je koncentrace mnoha strukturně příbuzných molekul (steroly, aminokyseliny, peptidy, proteiny) a jiných molekul, které jsou v koncentracích v rozmezí 10-5 do 10-3 mol/l. Receptory musí tedy rozlišovat nejen mezi malými koncentracemi různých hormonů, ale také mezi jednotlivými hormony a 106 x až 109 x vyššími koncentracemi jiných látek a předávat vazebnou informaci do post receptorových dějů. Hormony jsou allosterickými efektory, které mění konformaci allosterických receptorových proteinů, na něž se vážou. Protože v každém účinném kontrolním systému musí existovat mechanizmus zastavení reakce, obvykle končí účinky vyvolané hormony, když se efektor (hormon) oddělí od receptoru. Všechny receptory – ať pro polypeptidy nebo steroidy – mají nejméně dvě funkční domény. Rozpoznávací doména váže hormon a druhá oblast produkuje signál, který spojuje rozpoznání hormonu s nějakou intracelulární funkcí. Spojení (převod signálu) se obecně děje dvěma cestami. Polypeptidové a proteinové hormony a katecholaminy
21
se vážou na receptory umístěné v plazmatické membráně, a tak dají vznik signálu, regulujícímu různé intracelulární funkce: často se to děje změnou aktivity nějakého enzymu. Steroidní hormony a hormony štítné žlázy interagují s intracelulárními receptory a komplex hormon-receptor dává vznik signálu. Byla identifikována aminokyselinová sekvence těchto dvou domén mnoha polypeptidových receptorů pro hormony. Receptory pro steroidní hormony mají několik funkčních domén: jedna váže hormon, druhá se váže na určitou oblast DNA, třetí aktivuje (nebo potlačuje) transkripci genu a čtvrtá může specifikovat vysoceafinitní vazbu na DNA. Receptor je definován svou duální funkcí – vazbou a spojením – a právě spojení vazby hormonu s převodem signálu, tzv. receptor-efektorové spojení je to, co zajišťuje první krok k zesilování reakce na hormon. Tato duální funkce také odlišuje receptory cílových buněk od plazmatických vazebných (nosičových) proteinů: ty také vážou hormon, ale nedávají vznik signálu. [27] Hormony steroidní Jako steroidy se označují sloučeniny s cyklopentano-perhydrofenanthrenovým skeletem, složeným ze 4 kruhů – gonan (vzorec uveden v Přílohách – Obr. 2-1.). Jsou to látky ve vodě skoro nerozpustné, lipofilní, pokud nejsou ve formě esterů s kyselinou sírovou, ve formě glukuronidů nebo glykozidů. Mezi steroidy patří hormony pohlavní (sexuální), které se dělí na ženské (estrogeny, gestageny) a mužské (androgeny). Dále sem patří hormony produkované kůrou nadledvin (kortikoidy). Z dalších přirozených látek mají steroidní strukturu steroly, žlučové kyseliny, aglykony srdečních glykozidů, některé sapogeniny a alkaloidy. Některé z těchto přírodních látek jsou vhodnou surovinou pro syntetickou přípravu steroidních hormonů. Základní izolace účinných steroidů ze žláz byly v počátcích ztíženy nedostatečnou metodikou při čištění a dělení látek strukturou vzájemně podobných v mikroměřítku, nezbytném pro nepatrná množství hormonů ve žlázách. Teprve chromatografické postupy umožnily účinné izolace jednotlivých steroidních hormonů v čistém stavu. Steroidní hormony se již nepřipravují ze žláz, ale synteticky z některých přírodních steroidů, zejména rostlinných. Většina farmaceutických preparátů steroidních hormonů jsou dnes syntetické steroidní estery se složkou kyseliny propionové, nebo trimethyloctové apod. Estery steroidních hormonů mají protrahované působení, je to způsobeno pomalejší
22
resorpcí těchto látek a jejich zvolněnou inaktivací v organizmu, zvláště v játrech, takže se dosáhne vyšších hladin hormonů po delší dobu. Metabolizmus ovariálních steroidních hormonů a cesty syntézy hlavních skupin steroidních hormonů jsou uvedeny v Přílohách – Obr. 2-2. a 2-3.
3.
Ženské pohlavní hormony Ženské pohlavní hormony, tj. estrogeny a gestageny (progestiny) jsou především
vytvářeny ve vaječnících, proto se pro ně někdy používá název ovariální hormony. Dalším místem jejich tvorby je kůra nadledvin (u žen i mužů), u mužů varlata a v těhotenství i placenta. Ovariální hormony jsou zodpovědné za rozvoj ženského pohlaví, vývin sekundárních pohlavních znaků, ovlivňují psychosexuální funkce žen, po pubertě vyvolávají cyklické změny spojené s ovulací, a konečně hrají také významnou roli při těhotenství. Ženské pohlavní hormony mají mnohačetné indikace. Používají se jako substituční léky při hypogonadizmu, v gynekologii k úpravě ovulace a menstruačního cyklu, a v řadě farmaceutických indikacích, nejčastějšími indikacemi je jejich použití jako antikoncepční látky, protinádorové látky a v dermatologii. Kromě indikací v gynekologii, se používají jako hormonální substituční léčba (HRT) u žen především po menopauze. Orálně a transdermálně podávané estrogeny a gestageny patří mezi nejčastěji předepisovaná léčiva. V terapii mají význam i látky s antiestrogenními a antigestagenovými účinky. Pohlavní žlázy (gonády) Tyto žlázy tvoří hlavní část reprodukčního ústrojí u živočichů, kteří mají nejčastěji pohlaví oddělené. Každý jedinec je vybaven pouze jedním druhem žláz, buďto samčími nebo samičími. Jen zřídka se vyskytuje pohlavní obojetnost (hermafroditizmus). Pohlaví (sexus) je u obratlovců určeno genotipově. [14] Gonády jsou bifunkční orgány, které produkují zárodečné buňky a pohlavní hormony. Mezi oběma funkcemi je úzký vztah, protože pro vývoj zárodečných buněk je zapotřebí vysokých lokálních koncentrací pohlavních hormonů. Ovaria produkují vajíčka a pohlavní hormony estrogeny a progesteron, varlata produkují spermatozoa a testosteron. Tak jako v nadledvinách, i v gonádách se tvoří mnoho steroidů, ale jen několik z nich je aktivních jako hormony. Tvorba těchto hormonů je přesně regulována zpětnými vazbami,
23
ve kterých se účastní hypofýza a hypothalamus. Hormony gonád působí nukleárním mechanizmem, podobným mechanizmu působení steroidních hormonů kůry nadledvin.
3.1 Estrogeny 3.1.1 Chemická struktura a biosyntéza estrogenů Estrogenní aktivita je výrazná jak u steroidních, tak některých nesteroidních látek, z nichž je nejznámější diethylstilbestrol. Z přirozeně se vyskytujících látek je nejúčinnější 17β-estradiol, po něm následuje estron a nejnižší účinnost má estriol. 17α-epimer je daleko méně účinný nežli přirozený hormon estradiol. Všechny tyto látky jsou steroidy s 18ti uhlíky, fenolovým A kruhem, a hydroxynebo ketoskupinou na C17. Alkylací na A kruhu dochází ke snížení vazebné kapacity příslušných látek na estrogenní receptory. Substituce ethinylem na C17 výrazně zesiluje účinek po p.o. podání. Chemické vzorce uvedeny v Přílohách – Obr. 3-1. Biochemické cesty, včetně hlavních enzymů a jejich intracelulární lokalizace jsou podobné v ovariích, varlatech a nadledvinách. Steroidní hormony jsou syntetizovány z cholesterolu, který je přítomný v ovariu jak volný, tak i esterifikovaný s mastnými kyselinami (estery cholesterolu). Cholesterol získaný jak z cirkulujících lipoproteinů, tak z esterů cholesterolu se konvertuje v ovariích na pregnenolon odstraněním 6 uhlíkového fragmentu izokapronové kyseliny. Tato reakce nebo skupina reakcí je rychlost limitujícím krokem v biosyntetických procesech a je kontrolována luteinizačním hormonem (LH) z adenohypofýzy. Pregnenolon tvořený touto reakcí může být konvertován na progesteron nebo
17α-hydroxypregnenolon.
Konverze
3β-hydroxysteroiddehydrogenázy a ∆5
4
na
progesteron
vyžaduje
působení
ketosteroid izomerázy, která posune dvojnou
vazbu z ∆5 na ∆4 pozici. Progesteron se secernuje žlutým tělískem ve velikých množstvích po ovulaci. Slouží však také jako prekurzor pro androgeny a estrogeny, protože je substrátem
pro
P450c17
(17α-hydroxyláza),
která
přeměňuje
progesteron
na 17α-hydroxyprogesteron v endoplazmatickém retikulu. Po 17α-hydroxylaci může být dvouuhlíkový postranní řetězec odštěpen pomocí enzymu P450c17 (17,20 lyáza) za vzniku androgenů. 17α-hydroxypregnenolon
se
přeměňuje
pomocí
P450c17
(lyáza)
na dehydroepiandrosteron (DHEA). Tento může být pak přeměněn na androstendion. Relativní příspěvek těchto metabolických cest k produkci androgenů není jasný.
24
Androstendion je hlavní androgen secernovaný ovarii, ale uvolňují se také malá množství DHEA a testosteronu. Estradiol je syntetizován z androgenů skupinou enzymů nazývaných aromatázový komplex nebo systém. Tento proces má tři stupně: hydroxylace methylové skupiny na 19 uhlíku, oxidace této skupiny a hydroxylace v 3 α pozici. Soudí se, že tyto tři kroky nastávají v mikrozomální frakci. Tyto tři hydroxylační kroky vyžadují O2 a NADPH. Aromatázový enzymový komplex pravděpodobně zahrnuje P450-oxidázu se smíšenou funkcí. Když je substrátem tohoto enzymového komplexu testosteron, vzniká estradiol, kdežto z aromatizace androstendionu vzniká estron. Estron vzniká také z estradiolu působením 17-hydroxysteroiddehydrogenázy, z estronu může dále vznikat estriol působením 16α-hydroxylázy, který však může být vytvářen
také
přímo
z
17-hydroxysteroiddehydrogenázy
estradiolu nebo
působením
aromatizací
16α-hydroxylázy
a
16α-hydroxyandrostendionu
působením 17-hydroxysteroiddehydrogenázy. Během menstruačního cyklu je regulace biosyntézy a uvolňování kontrolována gonadotropiny, stejně jako lokálními faktory. U mužů 80 % estradiolu pochází z periferní aromatizace testosteronu. U žen jsou androgeny též významnými substráty, protože až 50 % estradiolu v těhotenství vzniká aromatizací androgenů. Konečně je konverze androstendionu na estron hlavním zdrojem estrogenů u postmenopauzálních žen. Aromatázová aktivita je přítomna v tukových buňkách a též v játrech, v kůži a v jiných tkáních. Zvýšená aktivita tohoto enzymu se podílí na „estrogenizaci“, která je typická pro takové stavy jako je cirhóza jater, hyperthyreóza, stárnutí a obezita. Schéma biosyntézy estrogenů uvedeno v Přílohách – Obr. 3-2. Vztah mezi estrogeny a gonadotropiny Hypothalamus a hypofýza tvoří jednotku, která řídí funkci řady endokrinních žláz, mezi něž patří i gonády, a také řadu fyziologických funkcí. Adenohypofýza
(přední
lalok
hypofýzy)
secernuje
pod
kontrolou
hypothalamických hormonů řadu hormonů (trofní hormony), které regulují růst a funkci jiných endokrinních žláz nebo působí na metabolické procesy v jiných cílových tkáních. Hypothalamické hormony je možno rozdělit na ty, které se secernují do hypofyzárních
25
portálních cév = hypofýzotropní hormony, a na ty, které se v neurohypofýze (zadní lalok hypofýzy) secernují přímo do krve = neurohypofyzární hormony. Hypothalamické hormony jsou uvolňovány v pulzech a izolovaná adenohypofýza odpovídá lépe na pulzatilní přívod těchto hormonů, než na jejich kontinuální působení. Sekrece většiny adenohypofyzárních hormonů se řídí hormony stimulačními. Některé hypofýzotropní hormony jsou multifunkční. Mezi hypofýzotropní hormony, regulující sekreci hormonů adenohypofýzy patří GnRH (hormon uvolňující gonadotropiny). GnRH, nazývaný rovněž hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH), hormon uvolňující luteotropin (LRH) a luteotropin uvolňující faktor (LRF) je lineární dekapeptid syntetizovaný neurosekrečními buňkami uloženými uvnitř hypothalamu. Tento hormon stimuluje sekreci LH (luteinizační hormon) a FSH (folikuly stimulační hormon) z adenohypofýzy a je důležitý pro jejich syntézu a uvolňování. Uvolňování GnRH je ovlivněno hladinou pohlavních hormonů v krvi, která přichází do hypothalamu. LH a FSH patří mezi gonadotropní hormony, které ovlivňují gonády, regulují ovariální tvorbu estrogenů a progesteronu. Oba hormony mají zpětnovazební inhibiční účinky na hypothalamus i hypofýzu. [36] 3.1.2 Metabolizmus estrogenů Estrogeny jsou skupina hormonů syntetizovaných v různých tkáních, především pak v ovariích, která kromě estrogenů aktivně syntetizují a secernují různé hormony. Hlavním přirozeným hormonem ovariálních folikulů je 17β-estradiol. U některých druhů je hojnější estron syntetizovaný v řadě tkání. V těhotenství se tvoří relativně více estriolu, a to v placentě. Cirkulující estradiol se rychle přeměňuje oxidací v játrech na estron 17β-hydroxysteroidnídehydrogenázou.
Malé
množství
estronu
znovu
vstupuje
do cirkulace, avšak většina je dále metabolizována na 16α-hydroxyestron (který je potom přeměněn na estriol) nebo 2-hydroxyestron, katecholestrogen. Mnoho ze zbývajícího estronu je konjugováno a tvoří estronsulfát. Estriol je většinou přeměňován na estriol-3-sulfát-16-glukuronid před vyloučením ledvinami. Konjugované vylučovací formy estrogenů – viz Přílohy - Obr. 3-3. 3.1.3 Transport, degradace a mechanizmus účinku estrogenů Estrogeny jsou v plazmě silně vázány na plazmatické proteiny. Estradiol se silně váže na transportní globulin, nazývaný globulin vázající sexuální hormony (SHBG) a
26
s menší afinitou se váže také na albumin. Ethinylestradiol se váže jen na albumin. Transportní proteiny vytvářejí rezervoár hormonů v krvi a pro svou poměrně vysokou vazebnou kapacitu patrně vyrovnávají („pufrují“) náhlé změny v plazmatických hladinách. SHGB je syntetizován v játrech, a protože syntéza je stimulována estrogeny a inhibována androgeny, hladina je dvakrát vyšší u žen než u mužů. Poměr volného a vázaného estradiolu se během menstruačního cyklu výrazněji nemění. Avšak rozdíl ve vazebné schopnosti může mít význam po menopauze nebo u žen s abnormální funkcí ovarií spojenou s nadměrnou produkcí androgenů. Rychlost sekrece ovariálních steroidů se podstatně mění v průběhu menstruačního cyklu a je přímo úměrná jejich syntéze v ovariích. Nenastává jejich skladování: jsou secernovány hned jak jsou vyrobeny. Konjugované steroidy jsou ve vodě rozpustné a nevážou se na transportní proteiny: jsou proto rychle vylučovány žlučí, stolicí a močí. Účinné jsou jen volné frakce hormonu. Díky lipofilní povaze, estrogeny snadno prostupují do nitra buňky. Estrogeny působí na základě své schopnosti vázat se na intracelulární receptory: komplex hormonreceptor se pak váže na specifické oblasti chromatinu nebo DNA (nebo obou) a vyvolává změny v rychlosti transkripce specifických genů. Interakce receptor-DNA umožňuje různým transaktivačním doménám každého receptoru působit na aktivitu genů, přilehlých k hormon-responzivnímu
elementu
(hormone
response
element,
HRE).
Zvýšená
(nebo snížená) aktivita specifických genů vede ke změnám syntézy specifických proteinů. Tímto způsobem je ovlivněna celá řada metabolických a reprodukčních procesů. [27] Sekvence aminokyselin v molekulách receptorů pro estrogeny (ER) byly odvozeny z analýzy sekvencí bází příslušných cDNA. Tyto receptory patří do genové rodiny (používá se i pojem „nadrodina“), protože sem patří i deriváty vitaminu A, D, thyroxinu a kortikoidů. Každý receptor má několik funkčních domén. Degradace estrogenů závisí na stadiu menstruačního cyklu a období pre- a postmenopauzálním. Obecně se dá říci, že estrogeny jsou rychle degradovány v játrech s t1/2 v minutách. Estradiol je nejdříve metabolizován na méně účinný estron a estriol. Dále vznikají neaktivní metabolity a následuje jejich konjugace s glukuronovou a sírovou kyselinou.
Existuje
i
enterohepatální
cirkulace
a
vylučování
estrogenů
močí.
Ethinylestradiol je metabolizován značně pomaleji než estradiol, jeho t1/2 je 13-27 hodin. Mestranol se v játrech metabolizuje na účinný ethynilestradiol. Měření hladin estrogenů v plazmě a moči má velký diagnostický význam. Hladiny estrogenů jsou přesně známy a ukazují na ovariální funkčnost. Po menopauze klesají
27
hladiny estrogenů zhruba na jednu desetinu normálního množství. U dívek před pubertou nejsou zjistitelné hladiny estrogenů. Během těhotenství se stává placenta hlavním zdrojem estrogenů. Estrogeny, podobně jako jiné steroidní hormony, působí prostřednictvím cytoplazmatických receptorů. Jejich největší koncentrace jsou v reprodukčních orgánech, prsech, hypothalamu, hypofýze, kostech, játrech a dalších tkáních. Označují se jako estrogen-dependentní tkáně. 3.1.4 Fyziologické účinky estrogenů Ovariální hormony připravují struktury ženského reprodukčního systému na reprodukci tím, že vyvolávají zrání primordiálních zárodečných buněk; podporují vývoj tkání, které umožní implantaci blastocysty; zajišťují „hormonální načasování“ ovulace; zajišťují prostředí potřebné pro těhotenství a poskytují hormonální podněty pro porod a laktaci. V prvním období těhotenství estrogeny zklidňují dělohu, zatímco na konci těhotenství zvyšují tonus děložního svalstva. Estrogeny jsou nutné pro normální vyzrávání ženy. Stimulují vyzrávání pochvy, dělohy, vejcovodů v době puberty, stejně jako vytváření sekundárních pohlavních znaků. Stimulují vývoj stromatu mléčné žlázy a růst duktů prsu a jsou zodpovědné za zrychlení růstové fáze a uzávěr epifýz dlouhých kostí, které se objeví v pubertě. Mění distribuci tělesného tuku, takže se vytvoří typická konfigurace ženského těla, včetně nahromadění tělesného tuku kolem boků a na prsou. Větší množství stimuluje vznik pigmentace kůže. Navíc ke svému účinku na děložní svalovinu, estrogeny také hrají důležitou roli ve vývoji sliznice endometria. Nepřetržitá expozice po dlouhé období k estrogenům vede k abnormální hyperplazii endometria, která je obyčejně spojena s abnormálním krvácením. Když je produkce estrogenů během normálního lidského menstruačního cyklu přesně koordinována s produkcí progesteronu, nastává pravidelné periodické krvácení a odlučování endometriální sliznice. Estrogeny mají řadu důležitých metabolických účinků. Zdá se, že jsou částečně zodpovědné za udržování normální struktury kůže a krevního řečiště u žen. Estrogeny snižují rychlost resorpce kosti pomocí antagonizování účinku parathormonu (PTH) na kost, nestimulují kostní novotvorbu. Nedostatek estrogenů v menopauze vede k osteoporóze. Estrogeny mohou mít důležitý účinek na střevní absorpci, protože snižují motilitu střeva.
28
Navíc k stimulaci syntézy enzymů, vedoucích k růstu dělohy, mění v těle produkci a aktivitu mnohých jiných enzymů. V játrech se zvyšuje syntéza vazebných a transportních proteinů, včetně proteinů pro estrogeny, testosteron a thyroxin. Estrogeny zvyšují srážlivost krve. Změny ve složení plazmatických lipidů způsobené estrogeny, jsou zvýšení vysokodenzních lipoproteinů (HDL) a mírnou redukci nízkodenzních lipoproteinů (LDL) a snížení plazmatického cholesterolu. Hladina plazmatických triglyceridů se zvyšuje. Estrogeny mají mnoho dalších účinků. Jsou zodpovědné za chování zvířat během estru a mají vliv na libido u lidí. Estrogeny usnadňují přestup intravaskulární tekutiny do extracelulárního prostředí, čímž vzniká edém. Z toho vznikající snížení plazmatického volumu způsobuje kompenzační retenci sodíku a vody ledvinami. Estrogeny rovněž modulují kontrolu funkce hladkých svalů sympatikem. [12] Mezi nejčastější nežádoucí účinky při podávání estrogenů patří nauzea, velmi často se vyskytuje na počátku těhotenství, kdy je provázena zvracením, průjmy a nechutenstvím. Z ostatních nežádoucích účinků je třeba uvést napětí v prsech, bolesti hlavy, retenci vody, kožní alergické reakce a tromboembolii. Možnost
vyvolání
karcinomů
vlivem
působení
estrogenů
nebo
účinku
p.o. kontraceptiv je hlavní obavou při podávání těchto látek; bývají hlavně postiženy prsy a děloha. 3.1.5 Terapeutické užití Terapeuticky se estrogeny používají k substituční léčbě při poruše funkce ovarií, u nádorů prostaty a jako složka antikoncepčních přípravků. Velice moderní je dnes hormonální substituční léčba v klimakteriu a menopauze. Zatímco v prvých dvou případech se látky podávají parenterálně nebo v tabletách, jako antikoncepce se používají p.o. přípravky či náplasti a jako hormonální substituce se používají náplasti a formy vtíratelné do kůže. Estrogeny se používají v těchto indikacích: Hypofunkční poruchy menstruačního cyklu ve fertilním věku. V této indikaci se podávají jak samotné estrogeny, tak v kombinaci s gestageny. Posun menstruace. Společné podávání estrogenů a gestagenů alespoň po 10 dnů je následováno po jeho přerušení do 3 dnů menstruačním krvácením. Podávání obou dvou hormonů po 20 dnů cyklu vede k oddálení menstruace.
29
Léčba dysmenorey. Podáním estrogenů se zablokuje ovulace. Následující anovulační krvácení není bolestivé. Estrogeny se dále používají při poruchách celkového i lokálního vývoje, při hypopituitarizmu a ovariální dysgenezi. Další indikací je suprese laktace a léčba některých nádorových onemocnění (např. karcinomu prostaty). Dalšími indikacemi jsou podávání estrogenů v dermatologii ke zlepšení trofiky kůže. 3.1.6 Dostupné látky Estery estrogenů a některé syntetické látky mají delší účinky než přirozený hormon estradiol a jeho metabolity. Při nedostatečné činnosti ovarií, ale v přítomnosti dělohy, je vždy nezbytná cyklická kombinace estrogenů s gestageny. Častou indikací podávání estrogenů je osteoporóza. Estrogeny se nejčastěji podávají orálně (často v kombinaci s gestageny), ale vzhledem k lipofilii těchto látek je možná i jejich aplikace ve formě náplastí a mastí. Estradiol (Estradiolum, ESTROFEM 1MG až 4MG, tbl., obd.) je přirozeným estrogenem. Je určen k suplementaci při nedostatečné produkci endogenních estrogenů ovariálních. Jde o stavy primární i sekundární, v reprodukčním věku a postmenopauze. Nebyla-li odstraněna děloha, je nezbytné doplňovat podávání estradiolu cyklickou aplikací vhodného progestinu, aby docházelo k deskvamaci proliferovaného endometria (tj. pseudomenstruaci) a vylučovalo se tak riziko endometriálního karcinomu. Také pro prevenci karcinomu mléčné žlázy je nutno estradiol doplňovat cyklickým podáváním progestinu. Výhodou lékové formy v náplasti, která se podává 1-2 x týdně, je obcházení jater a metabolizování látky. P.o. dávkování bývá 2-4 mg denně. Existují i přípravky pro lokální aplikaci, včetně aplikace do vagíny. Při dlouhodobém podávání je největším nebezpečím vznik karcinomu endometria (z toho důvodu se vždy kombinuje s gestageny). Estradiol dipropionát (Estradioli dipropionas, AGOFOLLIN, inj.), estradiol benzoát (Estradioli benzoas, AGOFOLLIN DEPOT, inj., FOLIVIRIN, inj.) a estradiol valerát (Estradioli valeras, NEOFOLLIN, inj.) jsou syntetické estery estradiolu, které mají delší dobu působení než estradiol a jsou spolu s progestiny velmi častou součástí hormonální substituční terapie. Estriol (Estriolum, OVESTIN 1MG seu 2MG, tbl.) je dalším přirozeným estrogenem, který málo ovlivňuje endometrium a má dlouhodobější působení.
30
Konjugované
estrogeny
(Estrogena
coniugata,
OESTROFEMINAL,
cps.,
PREMARIN, tbl. obd.) jsou extrakty z moče březích klisen; mají relativně slabé účinky (patří mezi tzv. „slabé“ nebo „zbrzděné“ estrogeny) a používají se u výpadových jevů v menopauze. Mestranol (Mestranolum, řada kombinovaných přípravků s gestageny) je polosyntetický estrogen určený především k p.o. substituci ovariálních hormonů. V organizmu se metabolizuje na vlastní účinný ethinylestradiol. Ethinylestradiol (Ethinylestradiolum, řada kombinovaných přípravků s gestageny) je syntetický estrogen používaný v řadě přípravků pro p.o. antikoncepci. Některé deriváty s estrogenními účinky, jako jsou syntetické estrogeny nesteroidní povahy, stilbestroly (Diethylstilbestrolum, Diethylstilbestroli dipropionas, AGOSTILBEN inj.) a jeho ester s kyselinou fosforečnou fosfestrol (Fosfestrolum) se používají při protinádorové terapii, např. u karcinomu prostaty. Řada estrogenových látek je spolu s gestageny součástí antikoncepčních přípravků a přípravků určených k hormonální substituční terapii. [36]
3.2 Menstruační cyklus Ženský reprodukční systém podléhá sérii pravidelných cyklických změn nazývaných menstruační cyklus. Probíhá u žen ve fertilním období a představuje periodickou přípravu organizmu pro oplodnění. Jestliže k němu nedojde, začíná po 25-35 dnech, se střední hodnotou 28 dnů, krvácení, jež je výsledkem odlučování endometriální sliznice dělohy. Jako prvý den ovulačního cyklu se označuje prvý den menstruace, která obvykle trvá 5 dnů. Normální menstruační cyklus je výsledkem interakce hypothalamu, hypofýzy a ovarií s výslednými změnami v cílových tkáních reprodukčního traktu. Ačkoliv každá z výše uvedených komponent je důležitá pro normální reprodukční funkci, ovarium hraje v tomto procesu centrální roli, protože je zodpovědné za cyklické změny, ale i délku menstruačního cyklu. Cyklus můžeme rozdělit na folikulární (proliferační) fázi, kdy dochází ke zrání folikulů a tvorbě estrogenů; dále luteální fázi, která nastává po ovulaci a kdy se vytváří žluté tělísko, jež produkuje převážně gestageny a menstruační fázi. Menstruační cyklus začíná v době prudkého poklesu plazmatických hladin estrogenů a progesteronu. To má za následek prudký vzestup sekrece hypofyzárního FSH, který vede ke zvětšení několika primordiálních folikulů, přičemž jeden z nich dozrává
31
(Graafův folikul) a secernuje estrogeny. Jejich hladina dosahuje maxima kolem 13-14 dne, tj. těsně před ovulací a zcitlivuje hypofýzu na GnRH. V této době prudce stoupá nejen hladina FSH, ale i LH. LH se uvolňuje buď následkem vysoké hladiny estradiolu „pozitivní zpětnou vazbou“ nebo jako reakce na náhlý pokles z této vysoké hodnoty. Důsledkem hladin FSH a LH dochází k ruptuře folikulu a ovulaci. Vrchol hladin LH tedy značí konec folikulární fáze. Hladiny progesteronu jsou během folikulární fáze velmi nízké. Kontinuální podávání vysokých dávek estrogenů – jak je tomu v perorálních antikonceptivech – potlačuje uvolňování LH a FSH a inhibuje účinek GnRH na hypofýzu. Okamžikem ovulace nastává luteální fáze menstruačního cyklu. Po ovulaci buňky granulózy foliklu luteinizují a tvoří corpus luteum (žluté tělísko). Tato struktura brzy začne produkovat progesteron a trochu estradiolu. Hladina estradiolu vrcholí uprostřed luteální fáze a pak klesá k velmi nízké hodnotě. Hlavním hormonem luteální části cyklu je progesteron. Pro udržování časného žlutého tělíska je zapotřebí LH, který hypofýza poskytuje asi po 10 dní. Pokud nastane implantace, funkci LH přebere choriový gonadotropin (hCG): to je placentární hormon velmi podobný LH a tvořený cytotrofoblastovými buňkami implantovaného raného embrya. hCG stimuluje biosyntézu progesteronu ve žlutém tělísku až do doby, kdy placenta začne produkovat velká kvanta progesteronu. Pokud nenastane implantace, žluté tělísko regreduje a začne menstruace. Poté, co se odloučí endometrium, začíná nový cyklus. Luteální fáze trvá vždy 14 ± 2 dny. Odchylky v délce cyklu jsou téměř vždy dány změnami fáze folikulární. 3.2.1 Ovariální steroidy Ovarium kromě estrogenů secernuje také gestageny a androgeny. Mnoho z těchto steroidů je rovněž secernováno nadledvinami, nebo může být tvořeno periferní konverzí z jiných steroidních prekurzorů. Proto plazmatická koncentrace těchto hormonů nemusí přesně vyjadřovat steroidogenní aktivitu ovaria. Estradiol je pravděpodobně nejdůležitější sekreční produkt ovaria pro svou biologickou účinnost i pro rozmanité fyziologické účinky na periferní cílové tkáně. Plazmatická koncentrace estradiolu během prvé poloviny folikulární fáze je nízká, obyčejně méně než 50 pg/ml (0,18 nmol/l). Asi jeden týden před středem cyklu s vrcholem gonadotropinové hladiny se začne koncentrace estradiolu rychle zvyšovat a dosahuje vrcholu přibližně 200-300 pg/ml (0,73-1,1 nmol/l) den před nebo méně často v den vrcholu
32
výdeje LH. Zvýšení plazmatického estradiolu těsně koreluje se zvětšením velikosti preovulačního folikulu. Po LH vrcholu sérová hladina estradiolu na několik dní rychle klesne. Pak nastává sekundární zvýšení hladiny plazmatického estradiolu a dosahuje vrcholu ve středu luteální fáze jako projev sekrece estrogenů z corpus luteum. Plazmatický profil estronu během menstruačního cyklu je podobný jako u estradiolu, ale změny v koncentracích jsou menší než u estradiolu, takže poměr estronu k estradiolu kolísá během cyklu. Poměr je nejvyšší v čase menstruace, kdy sekrece estradiolu je minimální, a nejnižší v preovulační periodě, kdy sekrece estradiolu je maximální. Zatímco většina estradiolu v periferní cirkulaci je výsledkem přímé ovariální sekrece, významný díl cirkulujícího estronu pochází z estradiolu a periferní konverze androstendionu. Katetrizační studie ukázaly, že zvýšená plazmatická koncentrace estradiolu v preovulační fázi a ve středu luteální fáze cyklu je odrazem sekrece z ovaria, které obsahuje dominantní neboli preovulační folikul, z kterého se později stává corpus luteum. 3.2.2 Estrogen produkovaný placentou Implantovaná blastocysta tvoří trofoblast, který se pak organizuje v placentu. Placenta zajišťuje nutriční spojení mezi embryem a krevním oběhem matky a též produkuje řadu hormonů (estrogeny, hCG, gestageny (progestiny), placentární laktogeny). Během těhotenství se postupně zvyšují plazmatické hladiny estradiolu, estronu a estriolu. V největší míře se tvoří estriol a v jeho tvorbě se odráží řada fetoplacentárních funkcí. Fetální nadledvina produkuje DHEA a DHEA-sulfát, které se ve fetálních játrech konvertují na 16α-hydroxyderiváty. Ty pak placenta mění na estriol, a ten dále putuje přes placentární oběh do matčiných jater, kde nastává konjugace na glukoziduronáty a pak exkrece ledvinami do moče. Stanovení vylučování estriolu močí se používá ke sledování řady procesů vznikajících mezi matkou a plodem. [27]
3.3 Hormonální antikoncepce Pro klinické použití je nyní dostupné veliké množství orálních antikoncepčních prostředků obsahujících estrogeny nebo gestageny (nebo oboje). Tyto přípravky se různí v chemickém složení a jak je možné očekávat, mají mnohé vlastnosti společné, ale jsou zde
33
rovněž rozdíly. Hlavními kritérii pro hodnocení jednotlivých metod ženské antikoncepce je účinnost a tolerance. Mechanizmus působení p.o. kontraceptiv, jehož cílem je zabránit oplození vajíčka, spočívá v blokádě ovulace útlumem produkce hypofyzárních gonadotropinů vlivem negativní zpětné vazby; dalším mechanizmem je ovlivnění cervikálního hlenu, endometria a vejcovodů, které brání průchodu a nidaci vejce. Kontracepční účinnost je zaručena působením gestagenů; estrogeny zajišťují především pravidelnost menstruačního cyklu. Vývoj hormonálních antikonceptiv je určen základním požadavkem: při zachování antikoncepčního působení přivádět do organizmu ženy co nejmenší množství hormonů, a tím snížit na minimum nežádoucí vedlejší účinky. Jako orální antikoncepční prostředky se používají dva typy preparátů: Monofázické, bifázické a trifázické kombinace estrogenů a gestagenů a gestageny bez průvodního podávání estrogenů. [12] Od podávání přípravků, které pro první polovinu cyklu obsahovaly pouze čistý estrogen, se pro výrazné nežádoucí účinky již upustilo, takže ve všech preparátech mono-, bi- i tri-fázických se od 1. dne menstruačního cyklu až do 21. dne podává kombinace estrogenu a gestagenu. Kromě u monofázického typu se u dvou- a tří-fázových přípravků mění v průběhu cyklu poměr používaných dávek obou komponent. Po tomto období následuje 7 dnů přestávka v aplikaci účinných látek. Pro přehlednost aplikace se do konce cyklu podávají neúčinné preparáty, aby mohla žena začít s novým balením nový čtyřtýdenní cyklus antikoncepce. Nejužívanějším estrogenem v kombinovaných antikoncepčních přípravcích je ethinylestradiol (Ethinylestradiolum); ve starších přídavcích byl podáván především mestranol
(Mestranolum).
Mezi
používané
gestageny
patří
norethisteron
(Norethisteronum) a levonorgestrel (Levonorgestrelum). V novodobějších přípravcích jsou obsaženy progestiny III. generace, nejčastěji desogestrel (Desogestrelum), gestoden (Gestodenum) a norgestimat (Norgestimatum), které mají příznivé účinky na spektrum lipidů. Dále je to např. Nomegestrolacetát (Nomegestroli acetas, LUTENYL, tbl.), cyproteron-acetát a drospirenon (Drospirenonum, YADINE, drg.) používaný zejména v poslední době. Negativní účinky Při podávání p.o. kontracepce se uvádí celá řada nažádoucích účinků, které mohou být nejen nepříjemné, ale mohou vést i k dlouhodobějším poruchám. Např. napětí prsů,
34
změny tělesné hmotnosti, depresivní nálady, poruchy libida, žaludeční obtíže, bolesti hlavy aj. Z dlouhodobějších a závažnějších nežádoucích příznaků se uvádí zvýšení krevního tlaku, poruchy funkce jater a nepříznivé ovlivnění spektra plazmatických lipidů. Při otěhotnění v důsledku selhání steroidní kontracepce hrozí riziko vzniku vrozených vývojových vad plodu. Pozitivní účinky Jako
pozitivní
rysy
terapie
p.o.
kontraceptivy se
uvádějí
pravidelnost
menstruačního cyklu, odstranění dysmenorey a snížení výskytu ovariálních cyst. Protože přípravky pro p.o. kontracepci představují také hormonální substituční léčbu, lze některé z nich použít k úpravě menstruačního cyklu a u žen v klimakteriu k substituci chybějících ženských hormonů. [36]
4.
Estrogeny v životním prostředí
Úvod Potenciál určitých chemických látek ovlivňovat endokrinní systémy a následně reprodukci a vývoj lidské a zvířecích populací, je v současné době velmi dobře poznán. Existují významné důkazy o tom, že populace lidské i volně žijících organizmů byly a jsou škodlivě ovlivňovány expozicí chemickými látkami v prostředí, což je potvrzeno především modulací různých endokrinních systémů. Řada vědeckých studií z poslední doby popisuje endokrinní abnormality u specifických populací ryb, ptáků, savců i člověka. [16] Steroidní hormony jsou člověku i živým organizmům vlastní a jsou nezbytné pro plnění nejrůznějších funkcí v těle. Do prostředí jsou vylučovány metabolizmem a právě tehdy mohou představovat riziko nejen pro organizmy, ale i pro lidskou populaci, zvláště dostanou-li se do potravního řetězce. Mezi estrogeny patří i látky synteticky vyrobené, které se používají k nejrůznějším účelům, zejména jako antikonceptiva a k léčbě nemocí spojených s hormonálními poruchami. Nezanedbatelným zdrojem látek estrogenní povahy mohou být odpady produkované z živočišných farem (dobytčích a prasečích). Odpadní vody z městských čistíren, ale i odpady z čistíren průmyslových, zemědělské odpadní vody, či jejich úniky, přidávají velké množství exogenních sloučenin do vodních ekosystémů. Bylo prokázáno, že látky s estrogenní aktivitou, obsažené ve vodním prostředí, mohou ovlivňovat faunu a jsou hlavním původcem feminizace ryb. Průzkumy ukázaly, že hlavními látkami představujícími riziko pro populace organizmů
35
jsou přirozené sloučeniny estrogenů: estron, 17β-estradiol, estriol, dále syntetický ethinylestradiol. Výčet steroidních estrogenů je rozsáhlý a i další sloučeniny mohou být důvodem k zamyšlení. V této práci je pozornost obrácena na nejvýznamnější sloučeniny skupiny steroidních estrogenů, které pro životní prostředí představují největší riziko. Tyto látky jsou uvedeny v Přílohách na Obr. 3-1. spolu s jejich plnými jmény a fyzikálně-chemickými charakteristikami, které jsou v Tab. 4-1.
4.1 Environmentální estrogeny Na druhé straně mnoho přírodních i člověkem vyrobených chemických látek vyskytujících se v životním prostředí vykazuje estrogenní aktivitu. Jedním typem těchto látek jsou tzv. environmentální estrogeny, které mají vliv na vývoj a fyziologii organizmu velice shodný s estrogenní kontrolou reprodukce organizmů. Mohou být jak rostlinného původu - fytoestrogeny (kumestrol, genistein), tak mohou pocházet i z antropogenních zdrojů produkovány jako pesticidy nebo odpadní produkty při různých výrobních procesech (o,p´-DDT, polychlorované bifenyly, atd.). Kontaminace organizmu je dána převážně potravou. Problematika environmentálních estrogenů je zde jen nastíněna, neboť svým rozsahem přesahuje předmět této práce. Cílem celé práce je pojednat zejména o přirozených estrogenech produkovaných lidským metabolizmem, o jejich expozičních cestách v životním prostředí – odpadních vodách a metodách detekce. 4.1.1 Působení environmentálních estrogenů Environmentální estrogeny iniciují svůj účinek v živém organizmu podobně jako endoestrogeny
interakcí
s
jaderným
receptorovým
systémem.
[15]
Výsledný
estrogen-receptorový komplex interaguje s nukleotidovou sekvencí známou jako „estrogen response elements“ (EREs), a tím zahájí transkripci DNA. Tedy všechny estrogeny (environmentální i vnitřní) působí přes receptor tak, že ho z neaktivní formy převedou na aktivní. [7] 4.1.2 Toxicita Toxicita environmentálních estrogenů může zahrnovat celou řadu faktorů a může se projevit několika příbuznými, ale rozdílnými mechanizmy. První, nejběžnější typ toxicity je dán vazbou environmentálních estrogenů na estrogenový receptor a následnou
36
zvýšenou estrogenní odpovědí. Toxicita se v tomto případě projeví hyperestrogenizmem, nadměrnými fyziologickými efekty estrogenních hormonů. [7, 32] Při druhém typu toxicity se spíše uplatní chemické vlastnosti environmentálních estrogenů než hormonální. Je to např. tvorba DNA aduktů. Třetí typ toxicity environmentálních estrogenů je dán nerovnovážnou estrogenní odpovědí v cílové tkáni. To může nastat dvěma způsoby. Buď se environmentální estrogen váže na receptor, ale výsledná konformace je odlišná od konformace vzniklé s vnitřním estrogenem, čili transkripce i výsledný efekt jsou odlišné. Nebo estrogenní odpovědi mohou vykazovat rozdílné dávka-odpověď závislosti.
4.2 Vliv estrogenních látek na vývoj Vznik rakoviny, jak je známo, je dán změnami v genotypu, které se projeví transformací normální buňky na maligní. Ukázalo se, že steroidní hormony jsou zodpovědné za vznik chromozomových abnormalit v tkáňových kulturách. Navíc, u diethylstilbestrolu (DES) a estradiolu byly prokázány genové mutace a inhibice mitózy v in vitro buněčných kulturách. Další studie potvrdily, že estrogen může indukovat dva typy
genetických
které nepředstavují
změn,
numerické
poškození
DNA,
chromozomové a
strukturální
změny
(aneuploidy),
chromozomové
aberace,
které představují potenciální riziko. Estrogenní látky mohou procházet placentou nebo mohou přecházet z mateřského mléka do novorozence a být tak potenciálním rizikem vzniku různých abnormalit v estrogen-cílových tkáních u potomků obou pohlaví. Tyto abnormality zahrnují rakovinu prsu, endometriózu, adenokarcinom dělohy u samičího pohlaví, dále změny v pohlavní diferenciaci, a u samčího pohlaví snížení počtu spermií, benigní hyperplazii prostaty, rakovinu prostaty a varlat a s tím spojené reproduktivní problémy. Často se jako modelová estrogenní látka používá syntetický estrogen diethylstilbestrol (DES) a jako biologický materiál se nejčastěji používají myši, jelikož zde existuje velice dobrá korelace mezi získanými daty u člověka a u myši. Biologická aktivita přirozených estrogenů je dána ovlivněním jaderného receptorového proteinu, neboli jsou to ligand-faktory indukující transkripci genu stimulací genové regulace v příslušných buňkách. Analýzou receptor-vazebné aktivity se zjistilo, že environmentální estrogeny působí stejným mechanizmem.
37
Určení hormonálních aktivit environmentálních estrogenů vyžaduje znalosti o jejich biopřístupnosti, lipofilitě, metabolizmu a farmako-kinetice, které však nejsou zcela popsány a zpravidla se značně liší od steroidních estrogenů.
4.3 Vztah struktury a estrogenní aktivity Značné množství chemických látek jak přírodních, tak antropogenních, o různé chemické struktuře vykazuje estrogenní aktivitu. Zatím nelze na základě struktury jednotlivých látek předpovědět, zda-li bude daná látka estrogenní, či nikoli. Ale v zásadě většina estrogenních látek má společné strukturální rysy, a to přítomnost fenolu nebo jeho funkčního ekvivalentu, lipofilitu, odolnost vůči metabolizmu, schopnost bioakumulace. Estrogenní látky můžeme rozdělit na přírodní a syntetické. K přírodním estrogenům patří bioflavonoidy a různé mykotoxiny. Rostlinné bioflavonoidy zahrnují spoustu látek rozdílné chemické struktury, jako jsou flavony, flavonony, flavonoly, izoflavony a příbuzné kondenzované produkty (např. kumestrol). Množství rostlinných potravin dále obsahuje jiné zástupce přírodních estrogenů - 17β-estradiol a estron. Estrogeny přírodního původu dále zahrnují vaječné steroidní hormony, značné množství přírodních produktů je produkováno rostlinami a mikroby. Ke kontaminaci živočišných organizmů pak často dochází potravou a jejich účinek může být ovlivněn působením střevních bakterií. Dihydroxystilbeny a jeho deriváty jsou zástupci syntetických estrogenních látek. Navíc, některé průmyslové a environmentální chemické kontaminanty vykazují také estrogenní aktivitu a jsou to organochlorované pesticidy (o,p´-DDT), methoxychlor a další. K syntetickým estrogenům dále náleží kromě napodobenin neestrogenních hormonů i různé fenolické sloučeniny vznikající při různých průmyslových procesech (výroba fenolických plastů, neionogenních detergentů atd.), dále značné množství průmyslových látek, zemědělských pesticidů a jejich metabolitů, případně chlorovaných derivátů vykazuje estrogenní aktivitu. [16]
4.4 Antiestrogeny Bylo popsáno, že řada environmentálních chemikálií a látek přítomných v potravinách vykazuje tzv. antiestrogenní aktivitu, to znamená, že jsou potenciálními inhibitory estrogenem indukovaných efektů. Zástupci těchto látek jsou TCDD a příbuzné halogenované aromatické sloučeniny (PCDD, PCDF, PCB), které se váží na Ah receptor.
38
Kromě látek, které se váží na Ah receptor mají antiestrogenní aktivitu i jiné látky jako vitamin A a příbuzné retinoidy, forbol estery, terpeny, mastné kyseliny a polysacharidy. Mnoho slabých estrogenů, např. bioflavonoidy, mohou v některých koncentracích působit i jako antiestrogeny. Antiestrogeny
jsou
podle
definice
látky
zeslabující
normální
působení
endoestrogenů. Inhibují působení estrogenů tím, že soutěží s 17β-estradiolem o estrogenní receptor. Mnoho halogenovaných aromatických sloučenin a dioxinů, jako TCDD, vykazují antiestrogenní vlastnosti, ale jejich působení je mediováno více skrze Ah receptor než prostřednictvím estrogenového receptoru. Podobně i antiestrogenní působení estrogenů vyskytujících se v potravinách, jako některé fytoestrogeny, je pravděpodobně kontrolováno neestrogen-receptorovým mechanizmem. Antiestrogenní aktivita může být škodlivá, jestliže blokuje působení estrogenů během sexuální diferenciace nebo v pubertě. Ale jinak se antiestrogenní aktivita využívá především při léčbě rakoviny způsobené působením estrogenů. Jedním z nejpoužívanějších antiestrogenů je tamoxifen, který je efektivní ve všech stadiích rakoviny prsu a v současné době se testuje, zda-li jej nelze využít i k prevenci vzniku nádoru. Tamoxifen patří do velké skupiny syntetických nesteroidních antiestrogenů, které působí jako částečný agonista estrogenní aktivity. Naproti tomu tzv. čisté antiestrogeny kompletně blokují estrogenní aktivitu, proto mohou být efektivnější při léčbě rakoviny prsu. Zatím je to však ve stadiu vývoje. V životním prostředí a potravě jsou tedy přítomny jak látky estrogenní, tak i antiestrogenní, které působí společně na lidský organizmus. Odhad rizika působení těchto látek není jednoduchý, jelikož tyto látky působí proti sobě. Důležité je si také uvědomit, že tyto látky neovlivňují jen člověka, ale stejnými efekty působí na řadu populací volně žijících organizmů.
4.5 Metabolizmus a vylučování estrogenů do životního prostředí Aby bylo možno posoudit a odhadnout estrogenní potenci povrchových vod, je důležité znát mechanizmy a kinetiku dekonjugace estrogenů. Ženské tělo primárně vylučuje estrogeny močí v biologicky inaktivní formě jako sulfátové a glukuronidové konjugáty. Takovéto konjugáty mohou, v závislosti na různých faktorech, být štěpeny, což způsobí reaktivaci estrogenů do aktivní formy [28] (viz Přílohy - Obr. 4-1.). Znalost
39
těchto faktorů umožní předpovídat, jestli existují dostatečně vysoké koncentrace volných a aktivních sloučenin schopných vyvolat estrogenní reakci v zasaženém živém organizmu. Jsou známé různé glukuronidové konjugáty estrogenů. [30] Konjugace E2 a EE2 může nastat v C3 pozici, v C17 pozici a v obou C3 a C17 pozicích. Konjugáty estriolu se vyskytují ve všech předchozích pozicích a může nastat také v pozici C18. Sulfatizaci je také možné očekávat ve všech výše zmiňovaných pozicích na molekule. Existují také konjugáty mající jak glukuronidaci, tak i sulfatizaci. Protože estrogenní receptor je nespecifický receptor, odpověď bude záviset pouze na dekonjugaci v C pozici. Podobné nejisté cesty mohou být identifikovány pro ostatní estrogeny. Veškeré produkty lidského metabolizmu odchází kanalizační sítí na ČOV. Estrogeny obsažené ve zněčištěné vodě mohou být buď odstraněny degradací nebo jsou absorbovány do kalu. Jestliže nedojde k jejich odstranění, dostávají se do vodních toků, kde mohou absorbovat do sedimentu či jiných pevných částic. Estrogeny absorbované do čistírenského kalu mohou znovu vstoupit do vodní fáze, když je kal rozpouštěn a mohou se dostat na zemědělské plochy, když je kal používán pro hnojení půdy. [11] Jelikož jsou estrogeny vylučovány v konjugovaných formách, je pochopení procesů určujících cesty znečištění značně komplikováno. Je dobře známo, že mikroorganizmy mohou reaktivovat estrogeny rozkladem konjugovaných sloučenin. [4, 28, 38] Protože se nekonjugované estrogeny více vážou s pevnými látkami (např. čistírenský kal), než relativně hydrofilní konjugované formy, je důležité zhodnotit, zda ČOV jako chemické reaktory produkují volné estrogeny nebo jestli působí pozitivně odstraňováním volných estrogenů. Důležité jsou proto monitorované koncentrace konjugovaných, stejně jako nekonjugovaných estrogenů, aby bylo možné pochopit procesy spojené s odstraněním estrogenů v ČOV.
Několik autorů uvádí množství estrogenů uvolňovaných lidmi. [17, 20, 35] Obecně vnitřní vylučování hormonů zdravou premenopauzní ženou je uváděno v rozsahu 10 až 100 µg estrogenů za den. Množství vyloučeného E1 je typicky dvakrát tak vysoké než E2 a E3. Po menopauze ženy vylučují pouze mezi 5 a 10 µg estrogenu denně. U běžného muže/člověka je to průměrně od 2 do 25 µg za den. [43] Těhotné ženy mohou vylučovat až 300 µg za den, ale průměrné hodnoty jsou okolo 250 µg/den. [20] U žen užívajících antikoncepční tablety se předpokládá vylučování celé denní dávky 25-50 µg.
40
5.
Metody stanovení estrogenů Výzkum zkoumající rozsah, důsledky znečištění a metody pro řešení způsobených
komplikací je velmi závislý na spolehlivých metodách pro detekci látek a jejich metabolitů v životním prostředí. Ukázalo se, že estrogeny způsobují negativní efekty u ryb již při koncentraci 0,1 ng/l (viz Přílohy – Tab. 5-1.). Aby mohly být steroidní hormony popsány a sledovány v jednotlivých složkách životního prostředí, je potřeba nalézt jednoduché, specifické, citlivé chemické analytické metody, které budou účinné i při velmi nízkých koncentracích estrogenních látek. V následující části této práce budou nastíněny existující chemické metody z hlediska jejich schopnosti určit estrogenní aktivitu. Optimální chemické analýzy je dosaženo jen tehdy, pokud je chování analyzované substance (analyt) dobře pochopeno v každém z níže uvedených kroků. Je důležité si uvědomit, že chyba učiněná v jednom z těchto kroků (např. během vzorkování), může mít důsledky pro celou analytickou metodu.
5.1 Validace metod pro analýzu estrogenů Pro každou metodu analýzy chemických látek je nejdůležitější schopnost poskytovat včasná, přesná a spolehlivá data. Hodnocení metody by se proto mělo stát nedílnou součástí procesů vývoje analytických metod. K tomuto účelu byly vydány detailní návody, které určují, jak má být hodnocení metod prováděno. [41] Kvalita celého analytického procesu je popsána pomocí validačních kroků. Tyto jsou definovány na základě hodnotící procedury, včetně analýzy řady vzorků v matrici. Je důležité zdůraznit, že validace by měla pokrýt všechny kroky analytického postupu (včetně vzorkování, skladování a přípravy). Pro analýzu estrogenů jsou validační parametry velmi důležité, zejména z důvodu různorodosti jejich původu. Hlavní problém při stanovení estrogenů je selektivita, neboť pohlavní hormony patří do skupiny steroidů podobných chemických vlastností a tudíž může docházet k ovlivnění dalšími steroidními sloučeninami obsaženými v matrici. Je proto nutné dokumentovat selektivitu analytických metod. Důležitým kriteriem pro výběr analytických metod steroidních estrogenů v reálných vzorcích jsou limity detekce a kvantifikace (LOQ a LOD).
41
5.2 Postup při stanovení estrogenů Analytické chemické metody zahrnují celou řadu kroků. Jednotlivé části jsou v této práci naznačeny pouze v obecném pohledu. 5.2.1 Zpracování vzorků Zpracování vzorků zahrnuje sběr vzorků, uchovávání a ošetřování. Následuje příprava vzorků, jež zahrnuje přípravu a čištění vzorku pro chemické analýzy a kvantitativní rozbor, do něhož řadíme filtraci, extrakci, čištění a evaporaci. Do přípravy vzorků řadíme dále dekonjugační techniky používající enzymatickou hydrolýzu. Nezbytnou součástí je použití vnitřních standardů, jež umožní získat přesné hodnoty koncentrací estrogenních sloučenin. Standard by měl být co nejčistší (téměř 100%). Množství estrogenu přítomného v určitém množství standardního materiálu by mělo být přesně známo. Proto by měl být používán certifikovaný referenční materiál. [11]
5.3 Analytické detekční metody Estrogeny mohou být detekovány pomocí několika různých detekčních metod. Účelem této kapitoly je stručně popsat některé metody publikované ve vědecké literatuře. Je důležité zdůraznit, že techniky používané pro detekci estrogenů jsou používány v jiném kontextu než v environmentální analýze a proto existuje velký podíl literatury týkající se jiných oblastí (viz např. [34] ), ale tato zde nebude diskutována. Jak již bylo řečeno, estrogeny se vyskytují v různých složkách životního prostředí. Jelikož není osud těchto látek v prostředí dosud dostatečně prozkoumán, existuje v současné době jen málo prací týkajících se analytických metod s uspokojivými validačními metodami pro detekci steroidních estrogenů. Uspokojivá analýza byla doposud provedena především ve vzorcích povrchových a odpadních vod. V následující stati bude pojednáno o stanovení estrogenů právě v těchto matricích. 5.3.1 Metody založené na plynové chromatografii (GC-MS a GC-MS-MS) Princip Vzorek se dávkuje do proudu plynu, který jej dále unáší kolonou. Proto se mobilní fáze nazývá nosný plyn. Aby vzorek mohl být transportován, musí se ihned přeměnit na plyn. V koloně se složky separují na základě různé schopnosti poutat se na stacionární
42
fázi. Složky opouštějící kolonu indikuje detektor. Signál z detektoru se vyhodnocuje a z jeho časového průběhu se určí druh a kvantitativní zastoupení složek. Nezastupitelný význam má spojení plynového chromatografu s hmotnostním spektrometrem GC-MS. Ionty jsou v hmotnostním spektru analyzovány kvadrupólovým analyzátorem či iontovou pastí, kde je prostor analýzy iontů společný s iontovým zdrojem. Pro každou složku lze získat její hmotnostní spektrum a identifikovat ji porovnáním jejího spektra s knihovnou spekter sloučenin uloženou v počítači. [18] GC-MS-MS je separační metoda spojující plynovou chromatografii (GC) s hmotnostní spektrometrií (MS-MS) v uspořádání za sebou. MS-MS instrument zvyšuje selektivitu analýzy a také redukuje interference v matrici, pakliže je analyt částí komplikovaného materiálu. Speciální verze MS-MS instrumentů je iontová past MS-MS. Umožňuje nástroji zachytit velké množství molekul pro ionizaci, tudíž se zvyšuje citlivost instrumentu. Samostatně používaná plynová chromatografie (GC) pro analýzu přírodních estrogenů ve složitých environmentálních matricích bez hmotnostní spektrometrie (MS) není doporučována. Derivatizační činidla Za
účelem
zlepšení
stability
sloučenin,
citlivosti
a
přesnosti
GC-MS
nebo GC-MS-MS analýzy se používají vždy derivatizační činidla. Analyty jsou obvykle derivatizovány v OH skupinách steroidních kruhů. 5.3.2 Metody založené na vysoko účinné kapalinové chromatografii (HPLC) Princip V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina. Na rozdíl od plynové chromatografie rozhodují o separaci složek vzorku nejen jejich interakce se stacionární fází, ale rovněž velmi výrazně použitá mobilní fáze. Jsou využitelné všechny možné mechanizmy separace – adsorpce, rozdělování na základě různé rozpustnosti, iontová výměna, molekulově sítový efekt nebo specifické interakce v afinitní chromatografii. Klasické kolonové provedení se stalo základem vysokotlaké neboli vysoko účinné kapalinové chromatografie (HPLC – High Performance Liquid Chromatography). K účinné separaci je třeba použít dostatečně malých částic sorbentu, která kladou prostupující kapalině značný odpor. Proto je nutné pracovat při vysokém tlaku. [18]
43
Systémy vysoko účinné kapalinové chromatografie se pro environmentální analýzu používají méně než plynová chromatografie (GC). Nedávné přístrojové vylepšení však zvýšilo citlivost těchto systémů a proto větší využívání těchto metod je namístě. Hlavní výhodou je,
že glukuronické a sulfátové metabolity mohou
být detekovány
i bez derivatizace potřebné v GC systémech. 5.3.3 Metody založené na imunochemických technikách (imunokvantitativní analýza) Princip imunokvantitativní analýzy Základem je schopnost protilátek specificky rozeznat a vytvářet stabilní komplexy s antigeny. Protilátky jsou proteiny, které se specificky vážou na molekuly látek v nekovalentních vazbách. Imunochemické techniky se díky vysoké citlivosti, jednoduchému použití, krátkému času analýzy, efektivním nákladům a dalším výhodám dostávají do popředí zájmu v oblasti environmentální analýzy. [9, 33, 42] Upřednostňují se hlavně jako nástroj pro zjišťování environmentálních kontaminantů. Doposud jsou hojně využívány především ve zdravotnictví [26], včetně metod pro detekci estrogenů. [8] Představují tak možnou alternativu pro stanovení steroidních estrogenů v jednotlivých složkách životního prostředí. Hlavním nedostatkem je nicméně absence prahu, pod kterým vzorky mohou být považovány za negativní. Imunokvalitativní analýza by měla vždy být potvrzena specifickou chemickou analýzou.
5.4 Použití analytických metod pro steroidní estrogeny 5.4.1 Odpadní vody a kaly Koncentrace steroidních estrogenů ve vzorcích odpadních vod a kalů z ČOV jsou tak nízké, že je potřeba nalézt a použít co nejcitlivější analytické metody. Pro čištění vzorků musí být navíc použita speciální metodika, zejména v surové odpadní vodě a kalech. Na jedné straně jsou ČOV hlavními producenty znečištění steroidními estrogeny, na straně druhé poskytují důležitý proces pro redukci problému. Klíčem pro vyřešení problému je detailní pochopení procesů, určujících osud steroidních estrogenů v ČOV.
44
Detekce steroidních estrogenů ve vzorcích z odpadních vod byla úspěšně provedena použitím GC-MS, GC-MS-MS a LC-MS-MS. Kombinace LC s MS-MS je jedinou metodou vhodnou pro analýzu konjugovaných metabolitů steroidních estrogenů. Přitékající odpadní vody obsahují velké množství organických a anorganických látek, částice hmoty a svou přítomností mohou rušit detekci steroidních estrogenů. Příprava vzorků odpadních vod je proto na přítoku náročnější, než u vzorků odpadních vod na odtoku z ČOV. Výše uváděné metody jsou pro přitékající odpadní vody stejné jako pro odtékající, ale počet kroků, kterými vzorek musí být zakoncentrován je nižší kvůli potížím s ucpáváním v SPE kartridžích. Koncentrace konjugátů estrogenů jsou vyšší v přitékajících odpadních vodách, než ve vodách odtékajících. Příčinou toho je probíhající dekonjugace v ČOV. Z tohoto důvodu se metoda LC-MS-MS jeví vhodnější pro přitékající odpadní vody. Analýza estrogenů v odpadních kalech je zjevně extrémně komplikovaná. Doposud jen jedna studie prezentovala realizovatelnou analytickou metodu. [39] 5.4.2 Povrchové vody a sedimenty Kvůli
vysokému
obsahu
částic
hmoty
je
filtrace
nezbytnou
operací
před prekoncentrací vzorku. Tato musí být vzhledem k velmi nízké koncentraci estrogenů v povrchové vodě prováděna tisícinásobně i vícekrát před samotnou analýzou. Nejvhodnějšími analytickými metodami se jeví
tandemově uspořádané MS systémy
(LC nebo GC). Zkoušeny byly i metody pracující na jiném principu detekce (UV-detekce, Fluorescence, GC- nebo LC-MS), ale tyto jsou méně citlivé a méně reprodukovatelné. Analýza steroidních estrogenů v mořské vodě byla prováděna jen v málo případech. Hlavní rozdíl mezi slanou a sladkou vodou z chemického pohledu, je obsah různých anorganických solí. Steroidní estrogeny jsou očekávány v nižších koncentracích ve slané vodě kvůli jejich naředění. Proto se využívají stejné metody jak pro vodu sladkou, tak i slanou. [11] Několik analytických metod bylo prezentováno pro sedimenty sladkovodní [24, 25, 29, 39] a slanovodní. [40] Všechny metody používají extrakci, po níž následují metody pro čištění extraktu. Díky nízkým koncentracím je před analýzou nutný
45
prekoncentrační krok. Ke stanovení se využívá jak GC, tak i LC spojené s hmotnostní spektrometrií. Použití tandemově uspořádaných MS-MS systémů je preferováno kvůli vysokým koncentracím potenciálně rušících substancí, které mohou být přítomny ve vzorku.
46
DISKUSE
47
Správná funkce gonád je nezbytná pro reprodukci, a tím pro udržení druhu. Naproti tomu pochopení endokrinní fyziologie a biochemie reprodukčního procesu představuje základ mnoha přístupů k antikoncepci. Účinky estrogenů a jejich derivátů jsou rozmanité. Jsou nepostradatelné při vývoji ženských pohlavních znaků, účastní se menstruačního cyklu, jsou nutné k udržení těhotenství, zvýšené hladiny zpětnovazebně inhibují účinky na sekreci LH a FSH a je jich zapotřebí pro udržování metabolizmu kůže, kostí a svalů. Estrogeny mají kromě pozitivních účinků také nežádoucí účinky, z nichž nejčastějšími je nauzea, napětí v prsech, bolesti hlavy, retence vody, kožní alergické reakce, tromboembolie, zvýšení hladin plazmatických triglyceridů a koncentrace cholesterolu ve žluči. Hlavní obavou je možnost vyvolání karcinomů vlivem jejich působení nebo účinku p.o. kontraceptiv. Do životního prostředí se steroidní hormony dostávají vylučovací soustavou člověka, především žen a stávají se jeho nevyhnutelnou součástí. Významným zdrojem jsou i výkaly hospodářských zvířat. Játra konvertují estradiol a estron na estriol cestami znázorněnými v Přílohách na Obr. 3-2. Estradiol, estron i estriol jsou pak substráty pro jaterní enzymy, které k molekulám přidávají glukoziduronátové a sulfátové skupiny. Konjugované steroidy jsou ve vodě rozpustné a nevážou se na transportní proteiny: jsou proto rychle vylučovány žlučí, stolicí a močí. [27] Z těla vystupují ve formě neaktivních sloučenin. Působením různých faktorů se převádí do aktivní formy a potravním řetězcem mohou vstupovat zpět do organizmu. Přes své receptory zde vyvolávají složité děje, vedoucí ke změnám, či růstu cílových buněk. Fakt, že přebytek některých hormonů ovlivňuje nadměrný růst buněk, potvrzuje předpoklad moderní endokrinologie, zabývající se vlivem nadbytku pohlavních hormonů a jeho vlivu na vznik některých nádorů. Např. estrogen vyvolává stimulaci buněčného růstu již v koncentraci 10-12 M! Představu o tom, že pohlavní hormony mohou způsobit nebo přinejmenším podpořit růst nádorů založily časné studie Bittnera, Hugginse, Furtha a dalších. Zejména nádory prsu, prostaty a endometria mohou být závislé na steroidních hormonech. Steroidní hormony mohou jak inhibovat, tak i stimulovat buněčný růst. Estradiol může stimulovat růst prsů, resp. prostatické tkáně. Sloučeniny, které inhibují působení estrogenů, se využívají při léčbě nádorů prsu a prostaty. Jedná se o látky s antiestrogenní
48
účinností,
které
působí
kompeticí
s
estradiolem
o
intracelulární
receptory.
Např. Klomifencitrát (Clomid), Nafoxidin či Tamoxifen. Existuje řada důkazů, které potvrzují, že vznik lidských zhoubných nádorů není výsledkem jediné genetické události. Hormony k tomuto procesu pravděpodobně přispívají, jelikož jsou známy mnohé kancerogenní přírodní a syntetické steroidní a steroidům podobné látky. Zvláště steroidní estrogeny a xenobiotické stilbeny (např. diethylstilbestrol) mohou způsobit poškození DNA buď přímo tvorbou mutagenních DNA aduktů a řetězcových zlomů, nebo nepřímo tvorbou toxických hostitelských molekul a nitrobuněčných volných radikálů. Předpokládá se, že pohlavní steroidy samy o sobě mohou hrát patogenní roli u téměř 30 % všech karcinomů v USA. Meningiomy a karcinomy štítné žlázy a ledvin ukazují značnou nesrovnalost v poměru výskytu (a prognózy) u mužů a žen, a tak rovněž naznačují tropní vlivy pohlavních hormonů na nádorový růst. [12] Do prostředí se stejným způsobem dostávají i syntetické estrogeny, zejména z antikoncepčních pilulek a z preparátů používaných v hormonální substituční terapii u žen v menopauze. Přes milion českých žen užívá antikoncepci. Vyplývá to z údajů Ústavu zdravotnických informací a statistiky (ÚZIS). Podle ÚZIS se ženy v posledních deseti letech stále více rozhodují pro antikoncepci hormonální, zatímco počet uživatelek antikoncepce nitroděložní klesá. Z celkového počtu žen s antikoncepcí užívalo v roce 2004 její hormonální variantu 81,8 % a nitroděložní 18,2 %. [45] Ohroženo není jen zdraví přímých uživatelek hormonální antikoncepce. Jak upozorňují například experti z World Wildlife Fund – nejprestižnější nevládní organizace na ochranu životního prostředí na světě – má masivní užívání hormonální antikoncepce a substituční podávání ženských hormonů v klimakteriu za následek zvyšování těchto látek v životním prostředí. Prostřednictvím moči se dostávají do odpadních vod a vrací se tak zpět do potravního řetězce. Bezprostředně jsou ohroženy ryby a obojživelníci, u nichž byla prokázána změna pohlaví vlivem estrogenních hormonů. Na změnu pohlaví ryby stačí bohužel nepatrné koncentrace. Vypadá to, že pokud se nepodaří zabránit vstupu látek s hormonálním působením do řek, můžeme se dočkat vymizení rybích samců z populace. Což by mělo dalekosáhlé důsledky pro další vývoj života na celé planetě.
49
Plynová chromatografie kombinovaná s hmotnostní spektrometrií pro analýzu steroidních estrogenů v životním prostředí (GC-MS, GC-MS-MS) Pro určení estrogenů v environmentálních vzorcích je dominantní metodou GC-MS a GC-MS-MS. Detekce je dosažena v EI modu ionizace. Tyto metody poskytují dostatečnou selektivitu a citlivost k analýze přírodních estrogenů v komplikovaných matricích jako čištěná odpadní voda. Hlavním rozdílem mezi jedním MS a MS-MS je v selektivitě analýzy. Při samostatném použití hmotnostní spektrometrie jsou problémem interference a to zejména při stanovení EE2. Měřené koncentrace jsou někdy vyšší než očekávané, což znamená, že tento rozdíl může být způsoben interferencí přírodních organických látek. Při MS-MS může být tato interference zredukována použitím jednoho nebo více dceřiných iontů pro kvantifikaci. Jednou z hlavních nevýhod je použití derivačních reagentů v přípravě vzorků pro GC analýzu přírodních steroidů.
Vysoko účinná kapalinová chromatografie kombinovaná s hmotnostní spektrometrií pro analýzu steroidních estrogenů v životním prostředí (LC-MS, LC-MS-MS) Kombinace kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií představuje významnou úlohu pro analýzu steroidních estrogenů v environmetálních vzorcích. Probíhající vývoj této metody s možností analýzy estrogenů bez derivatizace může v budoucnu nahradit plynovou chromatografii kombinovanou s hmotnostní spektrometrií. Nejvyšší citlivosti v analýze steroidních estrogenů v environmentálních vzorcích je dosaženo použitím LC-MS s technikami ESI [3, 6, 10, 19], APCI [22, 23] a také nově vyvinutou ionizační technikou APPI [31], která má za cíl zvýšit citlivost o 1-2 řády v porovnání s APCI. [1, 2] Tato metoda zatím nebyla použita pro environmetální vzorky a proto otázky problémů spojených s matricí zůstávají nezodpovězeny. Také použití MS-MS instrumentu značně zvýšilo selektivitu a citlivost.
Vzhledem k omezené citlivosti není překvapivé, že existuje pouze několik zmínek o metodách environmentální analýzy pohlavních hormonů s použitím detektorů jiných než hmotnostních spektrometrů. Snyder a kol [37] použil ke stanovení estradiolu (E2), ethinylestradiolu (EE2) a řadě syntetických fenolických endokrinních disruptorů fluorimetrický detektor. Ying a kol [44] nedávno prezentoval podobnou metodu. Použití
50
fluorimetrického detektoru je kvůli značným problémům s interferencí z matrice a nízké senzitivitě málo užíváno a doporučováno. Stejně tak i fotometrický diode array detektor (DAD) není díky nízké citlivosti a interferenci dalších sloučenin ve vzorku pro environmetální analýzu doporučován. Možným způsobem využití ale může být kombinace s technikami přípravy vzorků, kdy dojde ke značnému zakoncentrování analytů.
Imunokvalitativní metody pro analýzu steroidních estrogenů v životním prostředí Imunochemické metody jsou také velmi citlivé, přinejmenším pro analýzu odpadní vody. Hlavním nedostatkem je mez detekce, zvláště ve spojení s estrogeny v životním prostředí, protože přítomnost těchto látek v koncentracích blízko nebo pod detekčními limity je stále schopna způsobit různé efekty na životním prostředí. Dalšími nevýhodami jsou nízká selektivita, variabilita a adsorpce do vazebných míst u silně znečištěných vzorků. Proto nejsou tyto metody doporučovány jako samostatné "analytické nástroje". Pro svůj potenciál poskytovat užitečná data jsou ale užívány v kombinaci s LC-MS-MS nebo GC-MS-MS či jednotlivou MS. [11]
51
ZÁVĚR
52
Hormony produkované žlázami s vnitřní sekrecí tvoří nezbytnou součást regulačního systému v lidském těle, neboť ovlivňují řadu procesů. Do této skupiny patří i tzv. steroidní hormony, které zahrnují skupinu ženských pohlavních hormonů, estrogenů. Tyto jsou produkované především v ovariích, v menší míře v kůře nadledvin, a ovlivňují především správný vývoj a schopnost reprodukce organizmu. Udržování hormonální rovnováhy je vlivem poškozeného životního prostředí a masovým užíváním hormonálních léčiv narušováno. To se projevuje celou řadou negativních efektů. Nejběžnější typ toxicity je dán vazbou estrogenů na estrogenový receptor a následnou zvýšenou estrogenní odpovědí. Toxicita se v tomto případě projeví hyperestrogenizmem, nadměrnými fyziologickými efekty estrogenních hormonů. Protože byla popsána řada endokrinních abnormalit u specifických populací ryb, ptáků, savců i člověka, je aktuálnost tohoto problému namístě. Hlavními obávanými sloučeninami, které se podílí na vzniku nádorových onemocnění, negativně působí na reprodukci mužského organizmu a způsobují feminizaci ryb a obojživelníků, jsou přirozené estrogenní hormony estron, estradiol, estriol a také syntetické estrogeny, zejména ethinylestradiol a diethylstilbestrol. Estrogenní hormony iniciují svůj účinek v živém organizmu interakcí s jaderným receptorovým
systémem.
Výsledný
estrogen-receptorový
komplex
interaguje
s nukleotidovou sekvencí známou jako „estrogen response elements“ (EREs), a tím zahájí transkripci DNA. Endoestrogeny tedy působí přes receptor tak, že ho z neaktivní formy převedou na aktivní. Stejným mechanizmem působí i environmentální estrogeny. Steroidní estrogeny jsou primárně vylučovány močí v konjugované, biologicky inaktivní formě jak lidmi, tak zvířaty. Tyto konjugáty mohou, v závislosti na různých faktorech, být štěpeny, což způsobí reaktivaci estrogenů do aktivní formy. Kanalizací se dostávají do čistírny odpadních vod. Zde jsou částečně vázány do kalu, degradovány mikroorganizmy nebo přechází do recipientu, jelikož metody jejich odstranění v současnosti nejsou plně známy a jsou ve fázi výzkumu. Prozatím je proto nutný důsledný monitoring jak na přítoku do ČOV, tak i na odtoku. Koncentrace estrogenů v odpadních vodách jsou značně nízké, což vyžaduje pečlivě zvolit a nalézt vhodnou analytickou metodu. Vhodnými metodami se jeví dekonjugační techniky, které umožňují detekovat celou koncentraci estrogenu, po níž následuje GC-MS či LC-MS analýza. Aby byly zajištěny výsledky dostatečně vysoké kvality, je nezbytně nutné použít GC-MS
53
nebo LC-MS či imunochemické metody. Jestliže jsou splněna určitá kvalifikační kritéria, pak mohou být GC-MS a LC-MS použity i pro velmi komplikované matrice. UV, GC-FID a HPLC nejsou obecně doporučovány kvůli jejich nízké citlivosti a redukované selektivitě. Nejvhodnějšími analytickými metodami jsou LC-MS-MS nebo GC-MS-MS, jelikož poskytují nejvyšší citlivost (nejnižší LOD nebo LOQ) (LOD = 0,1 ng/l) a selektivitu. Imunochemické metody jsou také velmi citlivé (LOD = 0,05 - 850 ng/l), přinejmenším pro analýzu odpadní vody. Díky nízké selektivitě, variabilitě ale nejsou tyto metody doporučovány jako samostatné "analytické nástroje". Pro svůj potenciál poskytovat užitečná data jsou proto užívány v kombinaci s LC-MS-MS nebo GC-MS-MS, či jednotlivou MS. Během několika příštích let bezpochyby uvidíme obecné použití těchto vyspělých technik, integrovaných do úplně automatizovaných, on-line systémů. Tyto integrované systémy zlepší analytický výkon (selektivitu, spolehlivost a opakovatelnost), zvýší průtok vzorků a sníží provozní náklady a riziko kontaminace. Další vývoj nových odběrových technik v on-line nebo off-line režimu, za použití materiálů pro molekulární otisky a imunoafinitní kartridže, které se v současné době vyvíjí, může být očekáván v blízké budoucnosti. Tyto pokroky slibují zjednodušení detekce a měření látek estrogenní povahy nejen v odpadních vodách, ale i v jiných složkách životního prostředí. Zavedení biosenzorů, z nichž většina je stále ve fázi prototypů, přinese další alternativu k tradičním metodám na poli monitorování estrogenních sloučenin.
54
SOUPIS LITERATURY [1] ALARY, J.-F. Comparative Study. LC-MS/MS Analysis of Four Steroids Compounds Using a New Photoionization Source and a Conventional APCI Source. Proceedings of the 49th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. May 27-31, 2001, Chicago, Illinois, 2001. [2] ALARY, J.-F., et al. Comparative LC-MS/MS Analysis of Four Neurosteroids Compounds and their Acetyl-PentaBenzyl Derivatives Using a Photoionization Ion Source and a Conventional Atmospheric-Pressure Chemical Ionization Source. Proceedings of the 49th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. May 27-31, 2001, Chicago, Illinois, 2001. [3] BARONTI, C., et al. Monitoring Natural and Synthetic Estrogens at Activated Sludge Sewage Treatment Plants and in a Receiving River Water. Environ Sci Technol, 2000, 34:5059-5066. ISSN 0013-936X. [4] BELFROID, A.C., et al. Analysis and occurrence of Estrogenic hormones and their glucuronides in surface water and waste water in The Netherlands. Sci Total Environ, 1999, 225:101-108. ISSN 0048-9697. [5] ČERNÝ, V. Chemie steroidních sloučenin. 1. vyd. Praha: Nakladatelství Československé akademie věd. 1960. 1295 s. ISBN 547.92-3010. [6] D'ASCENZO, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci Total Environ, 2003, 302:199-209. ISSN 0048-9697. [7] DeROSA, C., et al. Environmental exposures that affect the endocrine system: public health implications. J. Toxicol. Environ. Hlth, Part B. 1998, 1, 3-26 s. ISSN 0098-4108. [8] DIAMANDIS, E.P.; CHRISTOPOULUS, T.K. Immunoassay. Academic Press. 2003. [9] EMON, J.M.V.; GERLACH, C.L. Environmental monitoring and human exposure assessment using immunochemical techniques. J Microbiol Meth, 1998, 32:121-131. ISSN 0167-7012. [10] FERGUSON, P.L., et al. Determination of steroid estrogens in wastewater by immunoaffinity extraction coupled with HPLC-electrospray-MS. Anal Chem, 2001, 73:3890-3895. ISSN 0003-2700.
55
[11] FLEMING, I.; HALLING-SÖRENSEN, B. Evaluation of Analytical Chemical Methods for Detection of Estrogens in the Environment. Working Report, 2003, no. 44. ISSN neuvedeno. [12] GREENSPAN,
Francis
S.;
BAXTER,
John
D.
Základní
a
klinická
endokrinologie. 1. české vyd. Nakladatelství H & H Vyšehradská. 2003. 843 s. ISBN 80-86022-56-0. [13] HAMSÍK, A.; ŠANTAVÝ, F. Lékařská chemie: díl IV. - biochemie. 5. vyd. Praha: Státní zdravotnické nakladatelství. 1956. 680 s. ISBN 30108-29-110.785. [14] HANČ, O.; PÁDR, Z. Hormony: úvod do jejich chemie a biologie. 2. české vyd. Praha: Academia. 1982. 856 s. ISBN 509-21-857. [15] HOIVIK, D. J.; SAFE, S. H. Effects of Xenobiotics on Hormone Receptors. In: Toxicant-Receptor Interactions. (M. S. Denison and W. G. Helferich) Taylor and Francis, Ch., 1998, 3, 53-68 s. [16] HOLOUBEK, I.; ČADOVÁ L. Estrogeny v životním prostředí. Masarykova univerzita v Brně: Recetox (Research centre for Environmental Chemistry and EcoTOXicology). 2000. Klinická onkologie – zvláštní číslo. [17] CHRISTENSEN, F.M. Pharmaceuticals in the Environment - A Human Risk. Regul Toxicol Pharm, 1998, 28:212-221. ISSN 0273-2300. [18] CHURÁČEK, J. et al. Analytická separace látek. Praha: SNTL-Nakladatelství technické literatury. 1990. 384 s. 157 obr. ISBN 04-626-90. [19] ISOBE, T., et al. Determination of estrogens and their conjugates in water using solid-56 phase extraction followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 2003, 984:195-202. ISSN 0021-9673. [20] JOHNSON, A.C., et al. Comment on "Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 1. Chemical Fractionation and in Vitro Biological Screening". Environ Sci Technol, 1999, 33:369-370. ISSN 0013-936X. [21] KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 1. vyd. Ostrava: Nakladatelství P. Klouda. 1998. 203 s. ISBN 80-902155-0-5. [22] LAGANA, A., et al. Trace analysis of estrogenic chemicals in sewage effluent using liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp, 2000, 14:401-407. ISSN 0951-4198.
56
[23] LAGANA, A., et al. Liquid chromatography tandem mass spectrometry applied to the analysis of natural and synthetic steroids in environmental waters. Anal Lett, 2001, 34:913-926. ISSN 0003-2719. [24] LOPEZ de ALDA, M.J.; BARCELO, D. Use of solid-phase extraction in various of its modalities for sample preparation in the determination of estrogens and progestogens in sediment and water. J Chromatogr A, 2001, 938:145-153. ISSN 0021-9673. [25] LOPEZ de ALDA, M.J., et al. Occurrence and analysis of estrogens and progestognes in river sediments by liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry. Analyst, 2002, 127:1299-1304. ISSN 0003-2654. [26] LUPPA, P.B.; SOKOLL, L.J.; CHAN, D.W. Immunosensors-principles and applications
to
clinical
chemistry.
Clin
Chim
Acta,
2001,
314:1-26.
ISSN 0009-8981. [27] MURRAY, R. K., et al. Harperova Biochemie. 4. vyd. Jinočany: H & H. 2002. 852 s. s obr. ISBN 80-7319-013-3. [28] PANTER, G.H., et al. Transformation of a non-oestrogenic steroid metabolite to anoestrogenically active substance by minimal bacterial activity. Chemosphere, 1999, 38:3579-3596. ISSN 0045-6535. [29] PETROVIC, M.; TAVAZZI, S.; BARCELO, D. Column-switching system with restricted access pre-column packing for an integrated sample cleanup and liquid chromatographic-mass spectrometric analysis of alkylphenolic compounds and steroid sex hormones in sediment. J Chromatogr A, 2002, 971:37-45. ISSN 0021-9673. [30] RITTER, J.K.: Roles of glucuronidation and UDP-glucuronosyltransferases in xenobiotic bioactivation reactions. Chem-Biol Interact, 2000, 129:1-208. ISSN 0009-2797. [31] ROBB,
D.B.;
photoionisation:
COVEY, An
T.R.;
ionization
BRUINS, method
for
A.P.
Atmospheric
liquid
pressure
chromatographymass
spectrometry. Anal Chem, 2000, 72:3653-3659. ISSN 0003-2700. [32] SAFE, S. H.; GAIDO, K. Phytoestrogens and anthropogenic estrogenic compounds. Environ Toxicol Chem, 1998, 17, 119-126 s. ISSN 0730-7268. [33] SHERRY, J. Environmental Immunoassays and Other Bioanalytical Methods: Overview and Update. Chemosphere, 1997, 34:1011-1025. ISSN 0045-6535.
57
[34] SHIMADA, K.; MITAMURA, K.; HIGASHI, T. Gas chromatography and highperformance liquid chromatography of natural steroids. J Chromatogr A, 2001, 935:141-172. ISSN 0021-9673. [35] SHORE, L.S.; SHEMESH, M. Naturally Produced Steroid Hormones and their Release into the Environment. Pure Appl Chem. (In Press). ISSN 0033-4545. [36] SIXTUS, H. Speciální farmakologie: díl 6., hormony a vitaminy. 1. vyd. Praha. 1998. 140 s. ISBN 80-71847836. [37] SNYDER, S.A., et al. Analytical methods for Detection of Selected Estrogenic Compounds in Aqueous Mixtures. Environ Sci Technol, 1999, 33:2814-2820. ISSN 0013-936X. [38] TERNES, T.A.; KRECKEL, P.; MUELLER, J. Behaviour and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants - II. Aerobic batch experiments with activated sludge. Sci Total Environ, 1999, 225:91-99. ISSN 0048-9697. [39] TERNES, T.A., et al. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Anal Chem, 2002, 74:3498-3505. ISSN 00032700. [40] THOMAS, K.V., et al. Characterization of estrogenic compounds in water samples collected from United Kingdom Estuaries. Environ Toxicol Chem, 2001, 20:2165-2170. ISSN 0730-7268. [41] THOMPSON, M.; ELLISON, S.L.R.; WOOD, R. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl Chem, 2002, 74:835-855. ISSN 0033-4545. [42] VANDERLAAN, M.; WATKINS, B.E.; STANKER, L. Environmental Monitoring by immunoassay. Environ Sci Technol, 1988, 22:247-254. ISSN 0013-936X. [43] WILLIAMS, C.L.; STANCEL, G.M. Estrogens and Progestins. Eds.: Hardman, J. G.; Goodman Gilman, A.; Limbird, L. E., 1996. [44] YING, G.G.; KOOKANA, R.S.; CHEN, J. On-Line Solid Phase Extraction and Fluorescence Detection of Selected Endocrine Disrupting Chemicals in Water By High-Performance Liquid Chromatography. J environ Sci, 2003, B37:225. ISSN 0360-1234. [45] Ústav zdravotnických informací a statistiky (ÚZIS) [databáze online]. URL: http://www.uzis.cz/cz/dps/index.html. Aktualizováno: 2006-3. [cit. 2006-5-4].
58
PŘÍLOHY
59
Tab. 2-1. Klasifikace hormonů podle mechanizmu účinku [27] I. skupina: Hormony, které se vážou na intracelulární receptory Androgeny Mineralokortikoidy Estrogeny Gestageny (progestiny) Glukokortikoidy Hormony štítné žlázy Kalcitriol II. skupina: Hormony, které se vážou na receptory na povrchu buněk A. Druhým poslem je cAMP Acetylcholin Glukagon α2-Adrenergní katecholaminy Lidský choriový gonadotropin (hCG) β-Adrenergní katecholaminy Lipotropin (LHP) Adrenokortikotropní hormon (ACTH) Luteinizační hormon (LH) Angiotenzin II Melanocyty stimulující hormon (MSH) Antidiuretický hormon (ADH) Opiody (endorfiny atd.) Kalcitonin Parathormon (PTH) Kortikotropin-uvolňující hormon Somatostatin (CRH) Folikuly-stimulující hormon (FSH) Thyreoideu stimulující hormon (TSH) B. Druhým poslem je cGMP Atriový natriuretický faktor (ANF) C. Druhým poslem je vápník nebo fosfatidylinositidy nebo obojí Acetylcholin (muskarinové rec.) Gonadotropiny uvolňující hormon (GnRH) α1-Adrenergní katecholaminy Angiotenzin II Cholecistokinin Gastrin D. Intracelulární posel je neznám Choriový somatomammotropin (CS) Epidermální růstový faktor (EGF) Fibroblastový růstový faktor (FGF) Růstový hormon (GH, STH) Inzulín
Oxytocin Látka P Thyreotropin uvolňující hormon (TRH) Vasopresin Insulinu podobné růstové faktory (IGF I a II) Nervový růstový faktor (NGF) Destičkový růstový faktor (PDGF) Prolaktin
60
Tab. 2-2. Obecné znaky hormonálních skupin [27] Skupina I Steroidy Jodthyroniny Kalcitriol
Typy
Rozpustnost Transportní proteiny Plazmatický poločas Receptor Madiátor x)
V tucích (lipofilní)
Skupina II Polypeptidy Proteiny Glykoproteiny Katecholaminy Ve vodě (hydrofilní)
Ano
Nex)
Dlouhý (hod až dny)
Krátký (min)
Intracelulární Komplex hormonreceptor
Na plazmatické membráně
Není jisté, zda platí absolutně
12 11 1
H
2
10
3
5 4
9
H 13
H
16 14
8
H 6
Obr. 2-1. Gonan
7
17
H
15
cAMP, Ca2+, metabolity komplexních fosfatidylinozitolů, jiné
61
Obr. 2-2. Metabolizmus ovariálních steroidních hormonů [12] .
62
Obr. 2-3. Cesty syntézy hlavních skupin steroidních hormonů. Cholesterol se získává syntézou z acetátu nebo z lipoproteinových částic. U pregnenolonu je vyznačeno očíslování uhlíků steroidní molekuly. [12]
63
Název
Vzorec
Estron (E1) O H3C
12 11
17
13
16
14
15
H 1
9
2
10
8
H 3
H
5
7
4
HO
6
17 β – estradiol (E2) OH H3C
12 11 1
9
2
10
8
3
5
7
4
HO
17
13
16
14
15
6
17α – estradiol (E2-17α) OH H3C
12 11 1
9
2
10
3
16
14
15
8
5
7
4
HO
17
13
6
17α – ethinylestradiol (EE2) H3C 12 11 1 2
9 10
H
3
HO
5 4
13
16
14
15
H 7
6
C 17
8
H
OH CH
64
Mestranol (MeEE2) OH H3C
C
12
1 2
11
13
17
9
14
16
10
3
8
5
15
7
4
H3C O
CH
18
6
Estriol (E3) OH H3C
12 11 1 2 3
HO
9 10
13
16
14
15
8
5 4
OH
17
7 6
Diethylstilbestrol CH3
OH
H3C
HO
Dienestrol OH
H3C
HO
CH3
65
Hexestrol CH3
H3C
Obr. 3-1. Vzorce estrogenních hormonů
Obr. 3-2. Biosyntéza a metabolizmus estrogenů [12]
OH
66
OH H3C
O H3C
COOH O
H
O
H OH
H
HO
HSO3O
H H
3-estronsulfát
OH
3-glukuronid estradiolu
OH H3C
CH3O
HO 2-methoxyestradiol
Obr. 3-3. Konjugované vylučovací formy estrogenů
67
O-GLU 12 11 1
9
2
10
3
17
13
16
14
15
8
5
7
4
HO
H3C
Biologicky aktivní
6
OH
O-GLU H3C
12 11 1 2
9 10
3
H3C
12 16
14
15
11 1
De-konjugace
8
5 4
GLU-O
Biologicky inaktivní
17
13
2
7
3
6
9 10
16
14
15
8
5 4
HO
17
13
7 6
Biologicky aktivní OH H3C
12 11 1 2 3
GLU-O
9 10
16
14
15
8
5 4
17
13
7
Biologicky inaktivní
6
Obr. 4-1. Reaktivace estrogenu do aktivní formy – uvedeno na př. estradiolu [11] Tab. 4-1. Fyzikálně chemické charakteristiky steroidních hormonů [11] Název
Molekulová hmotnost [kg/mol]
Rozpustnost ve vodě [mg/L, 20°C]
Tlak Log K [mm Hg]
E1
270,4
13
2,3 . 10-10
3,43
-11
3,94 4,01
E2 E2-17α
272,4 272,4
13 -
2,3 . 10 -
EE2
296,4
4,8
4,5 . 10-11
4,15
-10
4,67 2,81
MeEE2
310,4
0,3
7,5 . 10
E3
288,4
13
6,7 . 10-15
Tab. 5-1. Nejnižší pozorované účinné koncentrace estrogenů při studiu ryb v literatuře [11] Látka
Druh ryby LOEC [ng/l] 8 Estron Halančík (Oryzias latipes) 0,5 17β-estradiol Střevle tlustonohá (Pimephales promales) 0,03 17α-ethinylestradiol Halančík (Oryzias latipes)
