Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
NÁVRH UČEBNÍHO TEXTU „POTRAVINÁŘSKÁ MYKOTOXIKOLOGIE“ PRO STŘEDNÍ ODBORNÉ ŠKOLY Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracoval:
Prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc.
Mgr. Stanislav Hamerský
2
3
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na
téma Návrh učebního textu „Potravinářská
mykotoxikologie“ pro střední odborné školy vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně dne………………………….. Podpis ………………………………
4
Poděkování
Rád bych na tomto místě poděkoval paní prof. RNDr. Martě Tesařové, CSc. za vedení této bakalářské práce, věcné připomínky a cenné rady. Dále chci poděkovat paní MVDr. Janě Vyhnálkové, vyučující SPŠCH Brno za průběžné konzultace při psaní učebního textu.
5
ANOTACE
A draft for the Teaching Text „Food mycotoxicology“ for the Secondary Technical Schools
This work provides a survey of the up-to-date knowledge of moulds producing mycotoxins and specifies the importance of knowledge of mycotoxins for the secondary technical school students specialized in food industry.
The work includes a draft for the teaching text for the optional subject Food Mycotoxicology for the secondary technical schools. It responds to the fact that there are no teaching texts reflecting the up-to-date knowledge of food industry available for the specialized branch of studies at the secondary technical schools.
The draft teaching text can be used for teaching as well as some passages of the text for teaching the compulsory subject Microbiology.
6
OBSAH
1.
Úvod – výuka potravinářské mikrobiologie na SOŠ v minulosti a dnes, vývoj učebních textů .....................................................................8
2.
Cíle a metodika – čím jsem se zabýval, jak a proč ...................................................10
3.
Výuka mykotoxikologie potravin na SOŠ s chemickým a potravinářským zaměřením ....................................................................................11
4.
Učební text „Potravinářská mykotoxikologie“ .........................................................12
4.1
Všeobecná část ..............................................................................................................14
4.1.1 Úvod ..............................................................................................................................14 4.1.2 Z historie mykotoxikologie ...........................................................................................14 4.1.3 Charakteristika plísní ....................................................................................................17 4.1.4 Nezbytné minimum z toxikologie .................................................................................21 4.1.5 Cizorodé látky v potravinách ........................................................................................22 4.1.6 Mykotoxiny a jejich dělení ...........................................................................................24 4.1.7 Toxinogenita .................................................................................................................29 4.1.8 Ekologická funkce mykotoxinů ....................................................................................31 4.2
Speciální část .................................................................................................................32
4.2.1 Přehled nejdůležitějších mykotoxinů ............................................................................32 4.2.1.1 Aflatoxiny .....................................................................................................................32 4.2.1.2 Ochratoxin A .................................................................................................................34 4.2.1.3 Sterigmatocystin ............................................................................................................36 4.2.1.4 Patulin ...........................................................................................................................37 4.2.1.5 Cyklopiazonová kyselina ..............................................................................................38 4.2.1.6 Citrinin ..........................................................................................................................40 4.2.1.7 Trichotheceny ................................................................................................................41 4.2.1.8 Zearalenon .....................................................................................................................43 4.2.1.9 Fumonisiny ....................................................................................................................44 4.2.1.10 Některé další mykotoxiny ...........................................................................................45 4.2.2 Limity pro obsah mykotoxinů v potravinách ................................................................48 4.2.3 Detoxikace mykotoxinů ................................................................................................51
7
4.2.4 Onemocnění člověka způsobená mykotoxiny – mykotoxikózy ...................................53 4.2.4.1 Ergotismus ....................................................................................................................53 4.2.4.2 Akutní kardiální beri-beri ..............................................................................................55 4.2.4.3 Alimentární toxická aleukie (ATA) ..............................................................................55 4.2.4.4 Toxická hepatitida .........................................................................................................56 4.2.4.5 Primární hepatom ..........................................................................................................56 4.2.4.6 Aflatoxiny vyvolaný Reyův syndrom ...........................................................................57 4.2.4.7 Kwashiorkor ..................................................................................................................57 4.2.4.8 Útlum imunity ...............................................................................................................58 4.2.4.9 Hyperestrogenismus ......................................................................................................59 4.2.5 Praktické rady k ochraně zdraví ....................................................................................60 4.2.5.1 Nákup potravin ..............................................................................................................60 4.2.5.2 Uchování a skladování potravin v domácnosti .............................................................60 4.2.5.3 Očista a desinfekce v domácnosti .................................................................................60 4.2.5.4 Příznaky růstu a rozmnožování plísní v potravinách ....................................................61 4.2.5.5 Zbytkové potraviny .......................................................................................................61 4.2.5.6 Epidemiologicky rizikové potraviny .............................................................................62 4.2.5.6.1 Chléb a pečivo ............................................................................................................62 4.2.5.6.2 Masné výrobky ...........................................................................................................63 4.2.5.6.3 Sýry ............................................................................................................................64 4.2.5.6.4 Ovoce a zelenina ........................................................................................................64 4.2.5.6.5 Výrobky z ovoce a zeleniny .......................................................................................65 4.2.5.6.6 Sušené plody ..............................................................................................................66 4.2.5.6.7 Rýže ...........................................................................................................................67 4.2.5.6.8 Kojenecká a dětská výživa .........................................................................................67 4.2.6 Slovníček pojmů ...........................................................................................................69 5.
Závěr ............................................................................................................................72
6.
Literatura .....................................................................................................................74
8
1. ÚVOD
–
VÝUKA
POTRAVINÁŘSKÉ
MIKROBIOLOGIE
NA
SOŠ
V MINULOSTI A DNES, VÝVOJ UČEBNÍCH TEXTŮ Výuka odborných předmětů na středních odborných školách má oproti výuce všeobecně vzdělávacích předmětů svá specifika a vyžaduje tedy také speciální učební texty, které akcentují požadavky na profil absolventa střední odborné školy podle konkrétního studijního programu a oboru. Před rokem 1989 zajišťovalo tehdejší Státní nakladatelství technické literatury vydávání celostátních středoškolských odborných učebnic pro všechny střední školy zařazené do sítě SOŠ s technickým zaměřením, přičemž tyto učebnice byly koncipovány podle tehdejších platných osnov pro výuku daných odborných předmětů. Dnes je však u nás situace zcela odlišná a v důsledku politických a společenských změn, které po roce 1989 nastaly, nemají již SOŠ zajištěny přísun aktualizovaných učebnic pro odborné předměty. Dlužno dodat, že osnovy pro tyto odborné předměty také nedoznaly změn, které by díky rozvoji zejména technických a biologických disciplin zasloužily. V dnešní době je na trhu nabízena celá řada učebnic všeobecně vzdělávacích předmětů jako například biologie, chemie, zeměpisu atd., většinou s přívlastkem „pro gymnázia a střední školy gymnazijního typu“. Méně se však již setkáme s nabídkou učebnic pro odborné střední školy a pro úzce profilované odborné střední školy neexistují povětšinou žádné aktuální učební texty, odrážející nejnovější poznatky v oboru. Od školního roku 2005/2006 působím jako učitel na Střední průmyslové škole chemické v Brně, na které studují studenti mimo jiné také ve studijním oboru „analýza potravin“. Situaci ohledně učebnic či jiných učebních textů pro předmět mikrobiologie jsem konzultoval s vyučující tohoto předmětu MVDr. Janou Vyhnálkovou, která mi potvrdila, že v podstatě nemá k dispozici žádný vhodný učební text k tomuto předmětu. Jistěže takové učební texty vycházejí, avšak prakticky pouze v podobě vysokoškolských skript a učebnic, které jsou pro výuku na střední škole nevhodné. Je tedy na vyučujícím, aby si sám obsahovou náplň předmětu nachystal ve formě příprav na vyučování a následně je předával svým studentům. Pro studenty samotné by však učební text, ze kterého by mohli čerpat znalosti, byl jistě vhodnou pomůckou.
9
Rozhodl jsem se tedy, že v rámci zpracování mé bakalářské práce na Agronomické fakultě MZLU v Brně, se pokusím navrhnout podobu konkrétního učebního textu pro potravinářský směr studia na SPŠCH a to konkrétně pro volitelný předmět „potravinářská mykotoxikologie“. Některé pasáže tohoto učebního textu mohou být také využity pro výuku povinného předmětu mikrobiologie.
10
2. CÍLE A METODIKA – ČÍM JSEM SE ZABÝVAL, JAK A PROČ Souhrnně lze říci, že jsem si kladl za cíl vypracovat v rámci své bakalářské práce učební text primárně určený pro potravinářskou větev studia na Střední průmyslové škole chemické v Brně, který by mohl být případně použit i na jiných středních odborných školách s potravinářským zaměřením. Mám-li shrnout metody, které jsem použil k dosažení uvedeného cíle, budu zde jmenovat především práci s odbornou literaturou, která znamenala zjišťování základních i nejnovějších poznatků týkajících se toxinogenních plísní a mykotoxinů obsažených v potravinách, jejich utřídění – systematizaci s důrazem na hledisko dodržení veškerých didaktických zásad pro zpracování učebního textu, dále pak konzultace s vyučujícími SPŠCH v Brně a v neposlední řadě také vlastní práci se studenty střední školy, kdy jsem zjišťoval z jaké poznatkové základny mohu u studentů střední školy vycházet a také jaký lze z jejich strany očekávat zájem o problematiku mykotoxinů obsažených v potravinách.
11
3. VÝUKA MYKOTOXIKOLOGIE POTRAVIN NA STŘEDNÍCH ODBORNÝCH ŠKOLÁCH S CHEMICKÝM A POTRAVINÁŘSKÝM ZAMĚŘENÍM
Přestože v posledních letech je napadení potravin plísněmi a jeho následkům věnována zvýšená pozornost, v učebnicích mikrobiologie pro SPŠ potravinářské či v učebnicích biochemie pro SPŠ chemické najdeme o mykotoxinech pouze zmínku. Odpovídá to skutečnosti kterou jsem zmiňoval již v úvodu této práce, totiž že učebnice pro SOŠ byly koncipovány tak, aby odpovídaly platným vyučovacím osnovám pro daný předmět, a že problematika potravinářské mykotoxikologie nebyla do těchto osnov obšírněji zařazena. S narůstajícím množstvím nových poznatků z této oblasti a s narůstajícími nároky na kvalitu potravin je však třeba v tomto směru také aktualizovat výuku na střední odborné škole, která připravuje odborníky pro potravinářskou praxi. Právě z těchto důvodů jsem se rozhodl svůj učební text zaměřit na mykotoxikologii. Protože při psaní textu vycházím z praxe učitele na Střední průmyslové škole chemické, zaměřuji také tento text spíše na chemickou podstatu mykotoxinů obsažených v potravinách a jejich vlivem na kvalitu potravin, nežli na morfologii a ekologii plísní. Přínos učebního textu ale nespočívá pouze v tom, že přináší aktuální a pro studenty snad zajímavou učební pomůcku. Na středních školách se perspektivně počítá se zaváděním některých inovativních metod výuky, které se již nyní osvědčují v základním školství, jako například tzv. projektového vyučování [29, 34]. Rozsah ani zaměření této práce mi nedovolují se o projektové vyučovací metodě více rozepsat, avšak chtěl bych i přesto na tomto místě zdůraznit, že zmiňovaný učební text může být i vhodnou inspirací a pramenem pro některé středoškolské školní projekty.
12
4. UČEBNÍ TEXT „POTRAVINÁŘSKÁ MYKOTOXIKOLOGIE“
Na tomto místě uvádím doslovné znění jednotlivých kapitol učebního textu „Potravinářská mykotoxikologie“. Kapitoly jsou číslovány desetinným systémem a číslování kapitol učebního textu odpovídá číslování kapitol této bakalářské práce bez první číslice „4“.
OBSAH
1.
Všeobecná část
1.1
Úvod
1.2
Z historie mykotoxikologie
1.3
Charakteristika plísní
1.4
Nezbytné minimum z toxikologie
1.5
Cizorodé látky v potravinách
1.6
Mykotoxiny a jejich dělení
1.7
Toxinogenita
1.8
Ekologická funkce mykotoxinů
2.
Speciální část
2.1
Přehled nejdůležitějších mykotoxinů
2.1.1
Aflatoxiny
2.1.2
Ochratoxin A
2.1.3
Sterigmatocystin
2.1.4
Patulin
2.1.5
Cyklopiazonová kyselina
2.1.6
Citrinin
2.1.7
Trichotheceny
2.1.8
Zearalenon
2.1.9
Fumonisiny
2.1.10 Některé další mykotoxiny 2.2
Limity pro obsah mykotoxinů v potravinách
13
2.3
Detoxikace mykotoxinů
2.4
Onemocnění člověka způsobená mykotoxiny
2.4.1
Ergotismus
2.4.2
Akutní kardiální beri-beri
2.4.3
Alimentární toxická aleukie (ATA)
2.4.4
Toxická hepatitida
2.4.5
Primární hepatom
2.4.6
Aflatoxiny vyvolaný Reyův syndrom
2.4.7
Kwashiorkor
2.4.8
Útlum imunity
2.4.9
Hyperestrogenismus
2.5
Praktické rady k ochraně zdraví
2.5.1
Nákup potravin
2.5.2
Uchování a skladování potravin v domácnosti
2.5.3
Očista a desinfekce v domácnosti
2.5.4
Příznaky růstu a rozmnožování plísní v potravinách
2.5.5
Zbytkové potraviny
2.5.6
Epidemiologicky rizikové potraviny
2.5.6.1 Chléb a pečivo 2.5.6.2 Masné výrobky 2.5.6.3 Sýry 2.5.6.4 Ovoce a zelenina 2.5.6.5 Výrobky z ovoce a zeleniny 2.5.6.6 Sušené plody 2.5.6.7 Rýže 2.5.6.8 Kojenecká a dětská výživa 2.6
Slovníček pojmů
14
4. 1 VŠEOBECNÁ ČÁST 4.1.1 ÚVOD
Učební text, který se vám dostává do rukou, má být názorným a systematickým přehledem základních a nejdůležitějších toxinů produkovaných skupinou organismů, označovanou jako plísně. Tyto organismy mají v potravinářství nesmírný význam, a to jak svou žádoucí nebo nežádoucí účastí v technologických výrobních procesech, tak i jako velmi nebezpečný činitel, který může nejen působit velké ekonomické škody znehodnocováním potravin, ale také nepříznivě ovlivňovat zdraví lidí konzumujících kontaminované potraviny. Plísně se používají
na výrobu krmiv, fermentovaných potravin, sýrů, enzymů,
organických kyselin, antibiotik, steroidů a stimulátorů růstu rostlin. Na druhé straně mají plísně významný podíl na chorobách člověka a zvířat i rostlin a znehodnocování krmiv i potravin. Do této nežádoucí kategorie patří toxinogenní houby se svými sekundárními metabolity – mykotoxiny. Do první poloviny 20. století se o mykotoxiny a mykotoxikózy (onemocnění způsobené plísněmi) projevoval velmi malý zájem (s výjimkou námelových alkaloidů). Až po obrovských ekonomických ztrátách, které v 60. letech zavinila záhadná choroba krůt „X“ (Turkey X disease) v Anglii a po následujícím objevu aflatoxinů se začíná v této oblasti intenzivně bádat (viz následující kapitolu).
4.1.2 Z HISTORIE MYKOTOXIKOLOGIE
První doložené zprávy o toxicitě plesnivých potravin pocházejí z konce minulého století z Japonska. Některé z nich navazují na lidové zkušenosti, tradované ve východní Asii po staletí. Zejména je popsána mnohaletá lidová zkušenost, že žlutou rýži je třeba vystavit na několik hodin v tenké vrstvě prudkému slunci, aby pozbyla svoji toxicitu (fotolýza mykotoxinu citreoviridinu). V první polovině dvacátého století bylo známo o toxickém účinku plesnivých potravin již více. Ve 30. a 40. letech byly na území tehdejšího SSSR zkoumány vzorky obilí, napadené plísněmi rodu Fusarium. Ty, i jejich extrakty vykazovaly toxicitu pro pokusná zvířata a v praxi byly spojeny s onemocněním, které je nyní nazýváno alimentární
15
toxická aleukie (ATA), a které bylo v té době známo pod mnoha synonymy (např. "septická angína") [32]. Ve 40. letech se objevil na trhu "zázrak z plísní", penicilín, zachraňující životy u dříve naprosto beznadějných pacientů s infekcemi. Jeho rozšíření přispěla i 2. světová válka. Nadšení nad penicilínem a záhy plejádou dalších antibiotik zcela přehlušilo starší poznatky o toxicitě plísní, navíc často publikované pouze v národních jazycích a v periodicích a sbornících lokálního významu. Představa bylinkářů, léčících "podivnou plesnivinou" úspěšně i velmi těžké choroby, nalezla své místo i v krásné literatuře a dodnes přežívá i v literatuře spekulativní či alternativní. Představa autorů o penicilínu působí v této souvislosti dost bizarně, a to ze dvou důvodů: přírodní penicilín se rozkládá v žaludku a nelze jej podávat ústy jako lék (V-penicilín v tabletách je produktem farmaceutického průmyslu), takto podaný penicilín může naopak vyvolávat závažné alergické potíže. Může také negativně ovlivňovat mikroflóru trávicího ústrojí. Objevitel penicilinu sir Alexander Flemming měl mimořádné štěstí v tom, že nalezl penicilin produkující kmen, který současně neprodukoval žádný mykotoxin. Kmeny s produkcí penicilínu a neprodukující zároveň žádnou toxickou látku jsou značně vzácné. Sir Alexander Flemming nalezl jeden, jeho pozdější američtí spolupracovníci druhý. Originální produkční kmen nalezli i českoslovenští vědci, vyvíjející na konci 2. světové války v poloilegálních podmínkách preparát Mykoin B, což byl originální československý penicilín. Většina výrobců však nakonec přešla na kmen US provenience, který měl nejvýhodnější produkční vlastnosti [32]. Obnovení zájmu o toxické látky z plísní přišlo později a nečekaně. V roce 1960 uhynulo na farmách Nové Anglie několik desítek tisíc krůťat na chorobu, tehdy pojmenovanou turkey-X disease. V té době již byla pokročilejší analytická chemie a již po krátké době objeveno několik toxických látek. Byl také podán průkaz jejich původu z arašídů, které tvořily součást krmné směsi pro krůťata, a rovněž byla zjištěna produkce těchto látek plísněmi, které se v arašídech masově vyskytovaly. Protože se produkující plíseň nazývá Aspergillus flavus, byly nalezené jedy nazvány aflatoxiny. K jejich bližší identifikaci byla použita písmena, zprvu B pro modře (blue) a G pro zeleně (green) světélkující pod dlouhovlnným ultrafialovým zářením (365 nm) a číselnými indexy, značící jejich pořadí na chromatogramu při tehdy užívané tenkovrstevné chromatografii. I později byla tato tradice alespoň částečně dodržena,
16
aflatoxiny M byly nalezeny v mléce, H v játrech (hepar), P byly v době svého objevu považovány za specifické pro primáty [32]. Poměrně rychle byla zavedena práce s mykotoxiny i do tehdejší ČSSR. K zahájení výzkumu mykotoxinů na lékařské fakultě v Brně došlo v souvislosti s následující událostí. V jednom ze závodů tehdejší Fruty došlo k zaplísnění rajčat. To vedlo k výraznému senzorickému znehodnocení výrobků silně hořkou chutí. Navíc, pracovníci hygienické služby, provádějící tehdy senzorické zkoušky, onemocněli s příznaky poškození jater. Řešením problému byl tehdy pověřen doc. RNDr. Miroslav Polster, CSc., který se spojil s řadou zahraničních pracovišť a postupně přešel z výzkumu bakteriálního metabolismu na problematiku mykotoxinů.. Posléze začal výzkum veterinárních toxikóz na tehdejší VŠV Brno (nyní VFU Brno), v Hradci Králové (Dvořáčková) a ve výzkumném ústavu ČSAV v Olešnici v Orlických horách. Referenční laboratoř pro analýzu mykotoxinů byla zřízena při KHS Plzeň. Na Slovensku byl výzkum mykotoxinů a plísní soustředěn na Výzkumném ústavu preventivného lekárstva v Bratislavě. V 70. letech se výzkum i rutinní testování nejdůležitějších mykotoxinů rozšířil na mnoho dalších pracovišť. V současné době představuje vrcholové pracoviště pro mykotoxiny v potravinách a potravinových surovinách Centrum hygieny potravinových řetězců (CHPŘ) na Státním zdravotním ústavu v Brně [32]. Dnes výzkum toxinogenních plísní a mykotoxinů dosahuje velkého rozsahu. Vedle již značně prozkoumaných aflatoxinů, ochratoxinu A, patulinu jsou studovány fuzáriové mykotoxiny (trichotheceny, fumonisiny, beauvericin, zearalenon, fusarin C) a alternáriové mykotoxiny (alternariol, altenuen, kyselina tenuazonová). Základní toxikologický výzkum mykotoxinů ovšem nebyl zatím ukončen a nadále probíhá. Každým rokem jsou objevovány a chemicky charakterizovány další a další nové toxické metabolity plísní (např. nové fusariové mykotoxiny - chlamydosporoly, visoltricin a acuminatopyrone) . V posledních letech byly zjištěny neurotoxické vlastnosti metabolitu mikroskopické houby Diplodia maydis (Stenocarpella maydis) při pokusech na opicích. V Africe se stále více objevují případy poškození zdraví člověka neurologického charakteru. Toxikologové proto uvažují o významu tohoto zatím chemicky neidentifikovaného toxinu pro obyvatele Afriky, kteří stále více přecházejí na monocereální dietu na bázi kukuřice. Kukuřice může uvedený toxin, ale i další mykotoxiny (např. fumonisiny), obsahovat [17].
17
4.1.3 CHARAKTERISTIKA PLÍSNÍ
Plísně jsou mnohobuněčné, eukaryotní,
heterotrofní, saprofytické nebo
parazitické mikroorganismy, jejichž stáří se odhaduje na 300 milionů let. Patří do skupiny mikroskopických hub, která je zařazena do říše hub (Fungi). Z celkového počtu 100 000 druhů hub reprezentují mikroskopické houby zhruba 64 000 druhů obsažených v 6000 rodech. Velká morfologická rozmanitost, adaptabilita a schopnost plísní přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám, umožňuje jejich výskyt prakticky všude tam, kde existuje organická hmota. V životním a pracovním prostředí člověka jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých i odumřelých organismů, předmětů, v krmivech, v potravinových surovinách rostlinného původu a v potravinách. Potraviny jsou velmi vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování toxinogenních plísní a pro následnou produkci mykotoxinů [1]. Pro zopakování morfologie některých nejdůležitějších plísní z potravinářského hlediska si uveďme následující nákresy:
Obr. č. 1: Nákres Aspergillus flavus
18
Obr. č. 2: Nákres Penicillium roqueforti
Obr. č. 3: Nákres Alternaria alternata
19
Obr. č. 4: Nákres Stachybotrys charatum
Obr. č. 5: Nákres Phoma eupyrena
20
Obr. č. 6: Nákres Fusarium culmorum
Toxinogenní a patogenní plísně (zhruba 350 druhů) a jejich mykotoxiny patří k významným faktorům, které mohou zhoršovat zdraví člověka i chovaných zvířat. V součastné době je známo přes 300 mykotoxinů. Toxikologický výzkum v oblasti hodnocení zdravotního rizika mykotoxinů na základě současných poznatků prokázal, že lidská populace je exponována mykotoxinům zejména z potravin (z celkového počtu 114 druhů plísní v potravinách, produkuje 65 druhů mykotoxiny). Toxinogenní druhy se vyskytují ve všech hlavních taxonomických skupinách hub. Nejznámější mykotoxiny jsou však metabolickými produkty rodů Aspergillus, Penicillium, Claviceps, Alternaria, Stachybotrys, Myrothecium, Phoma a Diploidia [1].
Pro produkci mykotoxinů toxinogenními plísněmi platí následující pravidla: •
Určitý mykotoxin může být produkován zástupci několika rodů toxinogenních plísní.
•
Určitý druh toxinogenních plísní může produkovat více mykotoxinů.
21
•
Záchyt toxinogenních plísní v potravinách ještě neznamená přítomnost mykotoxinů v potravinách (produkce mykotoxinů závisí zejména na typu potraviny, způsobu jejího uchování, teplotě a přítomnosti mikrobiálních překážek, např. konzervačních látek).
•
Ne všechny kmeny potenciálně toxinogenních plísní jsou toxinogenní. Upraveno podle [1].
4.1.4 NEZBYTNÉ MINIMUM Z TOXIKOLOGIE •
Toxikón - řecké slovo jed, do této kategorie látek patří všechny látky, které mají výrazný škodlivý účinek na organismus již při malých dávkách.
•
Toxikologie - věda o jedech, zabývající se nežádoucími biologickými vlastnostmi látek. Za zakladatele toxikologie je považován Paracelsus , středověký lékař 16. století.
Jedy mají tři základní vlastnosti: •
fyzikální – vzhled, zápach, hustota, barva, apod.
•
chemické – do jakých reakcí vstupují, reaktivita, apod.
•
biologické – toxické účinky na organismus jako celek, a to: •
akutní - projeví se ihned po požití
•
pozdní - projevují se následně po nějakém čase, látka se zpravidla do organismu
dostává
postupně,
opakovaně,
odtud
možnost
tzv.
chronických účinků.
Toxicita Toxické účinky se zjišťují dopředu, tzv. biologickým pokusem (ten se bohužel dodnes provádí na zvířatech, jako jsou myši, morčata a opice). Míra toxicity se měří a uvádí v tzv. letální dávce , tj. dávka smrtelná, označuje se LD50, uvádí se v gramech, nebo miligramech na 1 kilogram živé hmotnosti. Číslo 50 značí, že při požití daného množství látky uhyne 50% živých organismů a 50% přežije.
22
Toxické účinky se zkoumají pomocí testů a můžeme je rozdělit na: •
subakutní toxicitu (účinky jedu se projeví do 28 dní)
•
akutní toxicitu (účinky jedu se projeví do 90 dní)
•
chronická toxicita (účinky jedu se projeví do 1-2 let)
Důležité speciální účinky jedů: •
karcinogenní účinky - je problém je dokázat, sleduje se vznik konkrétního nádoru (na potkanech), většinou se jedná o dlouhodobé pokusy
•
mutagenní účinky - látky s těmito účinky jsou schopny vyvolávat změny v molekulách DNA, v 95% případech mutagenním účinkům předchází účinky karcinogenní
•
teratogenní účinky - zasahují do vývoje embrya, negativně ovlivňují embryonální vývoj
•
strumigenní účinky - vliv na závažná onemocnění štítné žlázy, ovlivňují distribuci jódu do štítné žlázy (inhibice transportu I2 do štítné žlázy) Upraveno podle [30].
4.1.5 CIZORODÉ LÁTKY V POTRAVINÁCH Upraveno podle [36]
Jednoznačně
nejvýznamnější
cestou
expozice
člověka
mykotoxinům
jsou
kontaminované potraviny, i když za určitých okolností může být značné riziko spojeno i s vdechováním spor plísní či prachových částic obsahujících tyto toxiny (např. při manipulaci s kontaminovanou potravinou).
Cizorodé látky v potravinách jsou rozděleny do tří základních skupin: •
kontaminanty
•
potravinová aditiva
•
sekundární cizorodé látky
23
Kontaminanty Jedná se o znečišťující látky, které se do potravin dostávají nahodile. Patří sem: •
přírodní toxiny - jsou obsaženy nejčastěji v rostlinách, méně pak v živočišných tkáních, tyto látky většinou fungují jako strumigeny, karcinogeny a mutageny. Např. kyanovodík, který je obsažen v jádrech meruněk, v některých luštěninách, dále solanin, který se vyskytuje v klíčících nebo nezralých bramborách, a saponiny, které se vyskytují ve špenátu a sóji, pokud by se izolovaly, tak by měly karcinogenní a mutagenní účinky
•
pesticidy
•
průmyslové jedy
Potravinová aditiva Přidávají se do potravin, pro zlepšení jejich prodejních vlastností (komerční účel). Patří sem látky prodlužující trvanlivost výrobků, např. při výrobě vína, zpracování masa, výroba sirupů, hořčice, mléka. Dále to jsou různá barviva ovlivňující vzhled potravin, aromatické látky na změnu vůně, látky měnící fyzikální vlastnosti výrobků (barva, vzhled).
Sekundární cizorodé látky Jsou látky vzniklé nežádoucími reakcemi v potravinách díky špatnému skladování, mohou vzniknou následujícími procesy: •
plesnivěním (prorůstání potravin různými druhy plísní)
•
hnitím (anaerobní rozklad bakteriemi)
•
tlením (aerobní rozklad)
•
kvasnými procesy (kvašení, výroba ethanolu, vína, octa, kvasné procesy jsou někdy žádoucí, někdy nikoliv)
V následujících kapitolách se budeme zabývat toxickými látkami, které se mohou v potravinách vyskytovat jakožto produkty plísní – mykotoxiny.
24
4.1.6 MYKOTOXINY A JEJICH DĚLENÍ
Mykotoxiny jsou účinné látky mikroskopických hub (plísní), nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a hospodářská zvířata. Rozlišení na toxiny bílkovinné a nebílkovinné povahy má praktický význam. Plísně jsou s to produkovat značné množství bílkovinných toxinů, které mají mnoho shodných rysů s bakteriálními toxiny. Jejich význam z hlediska kontaminace potravin je však zanedbatelný. Uvedená definice se vypořádává zejména s historickými okolnostmi, za jakých pojem "mykotoxiny" vznikl a s tím, že tatáž látka může být v jednom případě mykotoxinem a v jiném antibiotikem. Na této definici se shodli českoslovenští odborníci na problematiku plísní a mykotoxinů během konference "Mykotoxiny", pořádané Československou vědeckou společností pro mykologii při ČSAV v Praze roku 1983 [32]. Poznámka: Mykotoxiny tedy představují toxické látky nebílkovinné povahy. Nepočítáme mezi ně však toxiny vyšších hub, přestože některé z nich jsou mykotoxinům podobné. Uvedené uspořádání odpovídá situaci, jaká se po objevení mykotoxinů vytvořila. Zatímco toxiny vyšších hub jsou tradičně sledovány toxikology (popř. soudními toxikology), toxiny bílkovinné povahy bakteriology (jsou na jejich studium metodicky i technicky vybavení), byly od počátku 60. let sledovány nově objevené mykotoxiny především na pracovištích, zaměřených na hygienu či toxikologii výživy a krmiv. Z tohoto historického důvodu je oddělení mykotoxinů od ostatních podobných látek poněkud nelogické. Mykotoxiny rovněž rozlišujeme od fytotoxinů (vyvolávají onemocnění rostlin), antibiotik a toxinů, působících vůči bezobratlým živočichům. Látky, které působí na uvedené skupiny organismů a vedle toho ještě na člověka a hospodářská zvířata, označujeme však jednoznačně jako mykotoxiny [32].
Mezi mykotoxiny s významným zdravotním dopadem se řadí především námelové látky, aflatoxiny, trichotheceny, zearalenony, ochratoxiny, sterigmatocystin, cyklopiazonová kyselina, penicilová kyselina, patulin, citrinin, rubratoxiny, skupina tremorgenních látek a fumonisiny Některé významné mykotoxiny a jejich producenty uvádí tabulka:
25
Tab. č. 1: Některé významné mykotoxiny a jejich producenti [32] Mykotoxin
Producenti
Aflatoxiny
Aspergillus flavus, A. parasiticus
Deoxynivalenol
Fusarium graminearum, F. culmorum, F. roseum
Ochratoxin A
Aspergillus ochraceus, P. verruculosum
Patulin
Penicillium expansum, P. patulum, Byssochlamys nivea
Sterigmatocystin
Aspergillus flavus, A. versicolor,
Citrinin
Penicillium citrinum, P. roqueforti, Aspergillus Candidus
Kyselina α-cyklopiazonová Penicillium cyclopium, P. cammemberti, Aspergillus flavus Zearalenon
Fusarium graminearum, F. roseum, F. culmorum
Podle toxických účinků mykotoxinů na cílové orgány je můžeme rozdělit na několik skupin: Tab. č. 2: Toxické účinky mykotoxinů na cílové orgány [26] Dermatotoxiny trichotheceny, verrucariny, sporidesminy, psolareny Genotoxiny
aflatoxiny, citrinin, fumonisiny, ochratoxin A, patulin, griseofulvin, sterigmatocystin, trichotheceny, zearalenony
Hematotoxiny
aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny, zearalenony
Hepatotoxiny
aflatoxiny, sterigmatocystin, luteoskyrin
Imunotoxiny
aflatoxiny, ochratoxin A, patulin, trichotheceny, gliotoxin, sporidesmin
Nefrotoxiny
citrinin, ochratoxin A
Neurotoxiny
fumonisiny, fumitremorgeny, verruculogeny, penitrem A
Genitotoxiny
zearalenony
Toxiny působící na orgány patulin dýchacího traktu Toxiny působící na orgány trichotheceny trávicího traktu
26
Rozdělení mykotoxinů podle chemické struktury je nejjednodušší. Jeho výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoli látky o známé chemické struktuře. Toto dělení mykotoxinů ilustruje tabulka:
Tab. č. 3: Rozdělení mykotoxinů podle chemické struktury [26] Furanofurany
aflatoxiny, sterigmatocystin, versicolorin, aj.
Substituované pyreny a
kyselina koji, sekalonové kyseliny aj.
hydroxypyreny Substituované chinony
luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin, viridicatumtoxin aj.
Nenasycené laktony
patulin, kyselina penicillová, kyselina mykofenolová, alternariol, citreoviridin, ochratoxiny, rubratoxin B, 4,5,8-trimetylpsoralen aj.
Griseofulviny
griseofulvin
Epoxytrichotheceny
T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, vomitoxin (=deoxynivalenol), nivalenol, fusarenony, verrucariny, roridiny, satratoxiny aj.
Polycyklické
kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy aj.
substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy
gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, fumitremorgen, verruculogeny, brevianamidy aj.
Mykotoxiny jiné struktury zearalenon, curvularin, citrinin, PR-toxin, canthecellin, moniliformin, kyselina betanitropropionová aj.
Mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jsou to sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na souhře enzymatických aktivit v buňce. Na druhé straně ovšem neexistence genů pro klíčové enzymy této tvorby je spojena s naprostou neschopností kultury tvořit daný mykotoxin (skupinu mykotoxinů). Z hlediska druhových či genetických podmínek toxinogenity jde o schopnost plísně produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně prekursoru, zpravidla přes meziprodukty, na mykotoxin. Některé prekursory mohou být samy o sobě rovněž mykotoxiny. Nalézáme je u některých druhů, neschopných jejich další přeměny. U druhů, kde biochemická přeměna pokračuje k dalším látkám, je nacházíme často pouze ve
27
stopových koncentracích. Např. versicoloriny jsou poměrně častým toxickým metabolitem některých druhů rodů Aspergillus a Penicillium. V některých kmenech A. flavus nebo A. parasiticus dochází k jejich další přeměně, jejímž výsledkem jsou mj. aflatoxiny. V některých případech je popsána schopnost produkovat více konečných sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Podle způsobu biosyntézy (podle biochemických prekurzorů) můžeme mykotoxiny rozdělit následovně:
Tab. č. 4: Rozdělení mykotoxinů podle způsobu biosyntézy [33] Biosyntéza moniliforminu
moniliformin (z kyseliny octové)
Biosyntéza z polyketidů
patulin, ochratoxin, emodin, kyselina sekalonová, aflatoxiny aj.
Biosyntéza z isoprenoidů
trichotheceny, roquefortiny aj.
Biosyntéza z aminokyselin
kyselina cyklopiazonová, cyklické dipeptidy aj.
Co se týče biochemického působení mykotoxinů na buňku, vystihuje jej následující tabulka, ze které je dobře patrné nejpravděpodobnější primární biochemické poškození buňky vybranými mykotoxiny (následuje kaskáda vedoucí k buněčné smrti neboli apoptóze).
Tab. č. 5: Rozdělení mykotoxinů podle účinků na buňku [32] Inhibitory tvorby energie citreoviridin, luteoskyrin, xanthomegnin, kyselina sekalonová D, moniliformin Inhibitory proteosyntézy
trichotheceny, ochratoxin A
Tremorgeny
penitremy (A B C), fumitremorginy (A a B), verruculogeny
Modifikátory cytoskeletu griseofulvin, cytochalasiny, cyclochlorotin Estrogenní mykotoxiny
zearalenon
(hormonální rozvrat) Karcinogenní mykotoxiny
aflatoxin B1
28
Zkoumáme-li mykotoxiny z hlediska jejich toxicity, zjistíme, že nejtoxičtější mykotoxiny mají LD50 pro běžná laboratorní zvířata podobnou jako KCN (tj. cca 1 mg.kg-1 tělesné hmotnosti). Této hodnotě se blíží např. penitrem A. Většina důležitých mykotoxinů má LD50 asi desetinásobnou (jsou tedy toxické méně). Existuje ovšem možnost vysoké toxicity vůči organismům v určité fázi vývoje (např. toxicita aflatoxinu B1 vůči savčím a ptačím mláďatům bývá i více než desetinásobná proti toxicitě vůči dospělcům), jiné jsou s to vyvolat v dávkách netoxických pro dospělé úhyn plodu. Toxicita pro člověka je vždy pouhým odhadem podle toxicity vůči různým živočichům a dalším biologickým objektům. Karcinogenní účinky se zpravidla projevují již při dávkách, které nemají jiné pozorovatelné účinky. U některých látek je nutné zohledňovat i chronické nekarcinogenní účinky. Na základě extrapolací je poté stanovována tolerovatelná denní dávka, tj. taková, která by ani při dlouhodobém příjmu neměla vyvolávat negativní účinky. Podle akutní toxicity můžeme mykotoxiny rozdělit následovně: Tab. č. 6: Rozdělení mykotoxinů podle akutní toxicity (podle [26]) Silně toxické
aflatoxiny, patulin, luteoskyrin, sporidesminy, ochratoxin A, cyklochlorotin (= islandotoxin), zearalenon (F-2 toxin), T-2 toxin, DAS (diacetoxyscirpenol), citreoviridin, rubratoxiny, penitrem A (nejnižší LD50 ze známých mykotoxinů)
Středně toxické
citrinin, kyselina penicillová, sterigmatocystin, kyselina cyklopiazonová
Slabě toxické
griseofulvin, kyselina koji, trihothecin, kyselina mykofenolová, chaetomin
29
Konkrétní hodnoty LD50 pro některé mykotoxiny uvádí tabulka: Tab. č. 7: Rozdělení mykotoxinů podle akutní toxicity (podle [3]): Mykotoxin
Toxicita, LD50
Citreoviridin
myš – 7,5 mg/kg i.p. myš – 20 mg/kg i.p.
Citrinin
myš – 35 mg/kg i. p. myš – 110 mg/kg i. p.
Cyklopiazonová kyselina
potkan – 2,3 mg/kg i. p.
Ochratoxin A
potkaní mládě – 22 mg/kg orálně
Patulin
myš – 5 mg/kg i. p. myš – 35 mg/kg orálně
Roquefortin C
myš – 340 mg/kg i.p.
i. p. znamená intraperitoneální injekci (do pobřišnicové dutiny).
4.1.7 TOXINOGENITA
Toxinogenitou se nazývá schopnost organismů tvořit toxiny. Aplikováno na plísně jde o schopnost tvorby mykotoxinů. Všechny kmeny druhů plísní, u nichž byla zjištěna produkce určitého mykotoxinu, považujeme za potenciálně toxinogenní pro daný mykotoxin. Pokud u konkrétních kmenů stanovíme toxinogenitu, hovoříme potom o toxinogenitě (pozitivní) nebo netoxinogenitě (negativní). Pozitivní toxinogenita pak znamená, že daný kmen je za určitých podmínek schopen produkovat daný mykotoxin. Vyšetření konkrétního kmene má tedy vždy vyšší výpovědní hodnotu než pouhé konstatování jeho příslušnosti ke druhu, který je schopen v některých případech produkovat mykotoxiny. Tvorba mykotoxinů je závislá vedle druhu mikroskopické houby na chemických, fyzikálních a biologických podmínkách růstu [32]. Již jsme si objasnili, že mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jsou to sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na aktivitě určitých enzymů v buňkách plísní. U mnohých mikroskopických vláknitých hub je popsána schopnost produkovat více konečných
30
chemických sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Převahy určité konkrétní sloučeniny v kultuře lze potom dosáhnout např. změnou teploty nebo specifickými inhibitory některých enzymů [32]. Mezi nejdůležitější fyzikální vlastnosti ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří teplota. Zpravidla existuje určité teplotní rozmezí, ve kterém mohou být mykotoxiny produkovány, přičemž od optima směrem k limitům klesá jednak množství produkovaného toxinu, jednak často i procento kmenů, schopných produkovat detekovatelné množství mykotoxinu [32]. Důležité jsou osmotické vlastnosti substrátu, charakterizované nejlépe tzv. vodní aktivitou (aw). I zde existuje zpravidla rozmezí hodnot, ve kterém lze zaznamenat produkci mykotoxinů. Je nutno zdůraznit, že posun aw mimo optimální hodnoty neznamená usmrcení kultury. Dochází k přežívání spor a za určitých okolností i myceliálních buněk. Po návratu vodní aktivity do rozmezí slučitelného s dalším růstem plísně dojde k jejímu dalšímu nárůstu [32]. Pro představu o vlivu vodní aktivity na růst plísně a produkci mykotoxinů si uveďme následující údaje: Optimální aktivita vody pro většinu plísní je aw > 0,95. Aspergillus flavus má spodní hranici růstu při aw = 0,78 a tvorby aflatoxinů při aw = 0,28 až 0,84 [3]. Čas musíme chápat jako rovněž fyzikální veličinu. I na něm závisí obsah mykotoxinů v substrátu, protože mycelium začne produkovat měřitelná množství mykotoxinů až po určité době (Aspergillus flavus např. od období, kdy začne sporulovat) a po vyčerpání zdrojů v substrátu se produkce zastaví. Obsah mykotoxinů poté klesá přirozeným rozkladem [32]. Z chemických faktorů je důležitý přísun energie a nezbytných chemických látek, které buňky plísní potřebují jako vstup do svého metabolismu. V některých případech ovšem množství živin naopak omezuje produkci mykotoxinu, protože kultura není nucena aktivovat některé enzymatické systémy a jejich nízká aktivita v kultuře vede i k nízké až nedetekovatelné produkci sekundárních metabolitů. Důležitý je také přísun kyslíku. Při jeho nedostatku dochází k poklesu produkce mykotoxinů a posléze k zástavě růstu kultury . Naopak je znám vliv látek aktivujících enzymatické systémy, jako jsou např. barbituráty, PCB, některá rozpouštědla a pod., které mohou produkci mykotoxinů až zmnohonásobit [11].
31
Toxinogenita je stanovována zpravidla kultivací izolovaného kmene za standardních podmínek, které se podle autora metody blíží optimálním podmínkám produkce mykotoxinu. V některých případech je možné volit takové složení substrátu, které umožňuje zjednodušený postup při jeho analýze [32]. Poznámka: Toto si můžeme demonstrovat na následujícím příkladě: Pro aflatoxiny byla vypracována metoda stanovení jejich produkce kmeny Aspergillus flavus a A. parasiticus na karlovarských sucharech. Na uvedeném substrátu dochází poměrně rychle k silné produkci aflatoxinů, dané patrně kombinovaným vlivem struktury substrátu, obsahu živin a obsahu mikroelementů v tomto materiálu. Suchary rovněž prakticky neobsahují látky rušící při tenkovrstevné chromatografii, takže lze analyzovat již hrubý acetonový nebo chloroformový extrakt z kultury bez jakékoli další úpravy kromě zahuštění [33].
Přítomnost spor toxinogenního kmene neznamená zdaleka ještě výskyt mykotoxinů. V naprosté většině případů jsou samy o sobě prosty mykotoxinů, jen několik málo druhů plísní obsahuje významné množství svých mykotoxinů ve sporách (Stachybotrys atra, Pithomyces chartarum). Znamená však, že jakmile nastanou vhodné podmínky pro růst mycelia a produkci mykotoxinů, pak k této produkci s vysokou mírou pravděpodobnosti také dojde [2].
4.1.8 EKOLOGICKÁ FUNKCE MYKOTOXINŮ
Úloha mykotoxinů v ekologii mikroskopických hub není dosud zcela jasná. Předpokládá se všeobecně, že za určitých okolností je jejich produkce pro daný kmen plísně výhodná – dává se do souvislosti s antibiotickou a antifungální aktivitou některých mykotoxinů [32]. Uvedené zvýhodnění toxinogenních kmenů platí patrně pouze za zvláštních podmínek. V kulturách se běžně stává, že plísně svou mykotoxinogenitu postupně nebo i náhlým skokem ztrácejí. Rovněž je známo, že při současném pěstování toxinogenního a netoxinogenního kmene stačí relativně nízká příměs spor netoxinogenního kmene v kultuře, aby produkce mykotoxinů dramaticky poklesla [32]. Sami lidé vytvářejí, zejména při velkovýrobě potravin a krmiv, ekologické systémy, v nichž se mohou mikroskopické houby dobře množit, a na něž se postupně adaptují [32].
32
4.2 SPECIÁLNÍ ČÁST 4.2.1 PŘEHLED NEJDŮLEŽITĚJŠÍCH MYKOTOXINŮ
4.2.1.1 AFLATOXINY
Historie objevu Jak již bylo zmíněno v kapitole 1.2 (Z historie mykotoxikologie), k objevení aflatoxinů došlo při hledání příčin hromadného výskytu onemocnění drůbeže (Turkey X disease) v Anglii roku 1960. Brzy se zjistilo, že choroba není infekční, ale že má dietetický charakter: základní a složkou krmiva pro drůbež byla moučka z brazilské podzemnice olejné. V chloroformovém extraktu z krmiva se zjistila toxická složka, která způsobovala onemocnění a na papírových chromatogramech tvořila modře fosforeskující skvrnu. Současně se prokázalo, že v toxických „oříšcích“ podzemnice se nachází Aspergillus flavus jako producent toxinu, který pojmenovali aflatoxin. Tenkovrstevnou chromatografií se tento aflatoxin rozdělil na čtyři složky: dvě jevily modrou fluorescenci a dostaly označení aflatoxin B1 a B2, další dvě fosforeskovaly tyrkysově a dostaly označení aflatoxin G1 a G2. Jejich chemické struktury byly objasněny již v roce 1963. Z extraktů z mléka od krav, které byly krmeny podzemnicovou moučkou byly později izolovány další dva aflatoxiny – aflatoxin M1 a M2 [1].
Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Za základní považujeme aflatoxiny B1, B2, G1, a G2. Aflatoxiny dalších řad (M, P, H, Q aj.) byly nejprve zjištěny jako metabolity předchozích jmenovaných aflatoxinů v organismu lidí a zvířat (např. aflatoxiny M1 a M2 vznikají v organismu dojnic při podání krmiva kontaminovaného aflatoxiny B1 a B2 jejich hydroxylací), později byli ovšem nalezeni a vyselektováni jejich producenti [36]. Aflatoxin B1 je nejsilnější dosud známý přírodní karcinogen. Častý výskyt jaterních karcinomů u populace v některých oblastech východní Asie a Afriky se dává do souvislostí s vysokým dietárním příjmem aflatoxinů. Aflatoxin B1 působí také akutně hepatotoxicky [36]. Poznámka: Jeden z nejtragičtějších případů akutní otravy člověka aflatoxiny byl zaznamenán i Indii v roce 1974, kdy v důsledku konzumace plesnivé kukuřice onemocnělo zhruba 1000 lidí, z nichž 100 zemřelo. Hodnota LD50
33
pro psy se pro aflatoxin B1 pohybuje v rozmezí 0,35 – 0,50 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, odhad hodnoty LD50 pro člověka je poněkud vyšší [36].
Mechanismus působení aflatoxinů v lidském organismu souvisí s interakcí jejich reaktivních metabolitů s DNA a následnou inhibicí její replikace a transkripce. Aktivovaný derivát aflatoxinu tedy inhibuje také syntézu RNA, proteinů a další následné děje. Proto vedle výše popsaných syndromů existuje řada dalších negativních biologických odezev vyvolaných těmito mykotoxiny. Jako příklady lze uvést Reyův syndrom, respirační onemocnění, chronickou gastritidu, duševní retardaci dětí a stavy snížení imunity [36].
Obr. č. 7: Chemická struktura aflatoxinu B1
Producenti, výskyt Nejvýznamnějšími producenty aflatoxinů jsou kmeny Aspergillus flavus a A. parasiticus. Produkce aflatoxinů silně závisí na teplotě, vlhkosti, přístupu vzduchu, struktuře a chemickém složení substrátu. Např. byly prokázány inhibiční účinky tvorby aflatoxinů u kofeinu [36]. Důležité jsou i vlivy doprovodné mikroflóry (např. inhibice tvorby aflatoxinů vlivem Aspergillus niger) [32].
34
Nejvyšší nálezy aflatoxinů byly zaznamenány u podzemnice olejné, pistácií, paraořechů a kukuřice. Nižší hladiny aflatoxinů lze obvykle nalézt i v mandlích, vlašských ořechách, hrozinkách, fících a různých druzích koření. Aflatoxiny jsou poměrně hydrofilní sloučeniny a proto není jejich afinita k tukové složce potravinářských surovin vysoká, např. při výrobě rostlinných olejů se koncentrují ve šrotech. Při zpracování mléka, při kterém dochází k oddělení mléčného tuku, je potom nutné počítat s relativním nárůstem aflatoxinu M1 např. v odtučněném tvarohu, syrovátce, podmáslí apod.
Závěrem je nutno zdůraznit, že
většina problémů s aflatoxiny u nás souvisí především s dovezenými potravinami, krmivy a surovinami. Riziko napadení příslušnými toxinogenními plísněmi je totiž vysoké především v subtropických a tropických klimatických podmínkách [36].
4.2.1.2 OCHRATOXIN A
Historie objevu K objevu ochratoxinů došlo v Jihoafrické republice při laboratorním vyšetřování toxinogenních hub izolovaných ze zemědělských plodin. Producenty těchto toxinů byly plísně Aspergillus ochraceus a kukuřice infikovaná touto plísní způsobila smrt pokusných zvířat [36].
Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Ochratoxin A obsahuje ve své molekule fenylalanin a substituovaný 3,4dimethylisokumarin. Mechanismus toxicity ochratoxinu A spočívá v tom, že fenylalaninová část jeho molekuly je t-RNA zaměněna za fenylalanin. Ten je však v ochratoxinu A navázán na kumarinovou část, která brání jeho navázání do proteinového řetězce. Tím dojde k zastavení proteosyntézy [32]. Někteří autoři [1] popisují i negativní zásah ochratoxinu A do procesů glukoneogeneze a dýchacího řetězce. Nejzávažnějším biologickým účinky na úrovni organismu je nefrotoxicita, dále byla prokázána jeho hepatotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita [36].
35
Poznámka: U člověka je expozice ochratoxinu A spojována s tzv. balkánskou endemickou nefropatií – onemocněním ledvin (BEN z angl. Balcan Endemic Nephropathy) [36].
Obr. č. 8: Chemická struktura ochratoxinu A
Producenti, výskyt Kromě již zmíněného Aspergillus ochraceus jsou producenty ochratoxinu A také další druhy rodů Aspergillus a také Penicillium, především Penicillium viridicatum [36]. Ochratoxin se nejčastěji vyskytuje v cereáliích (naše obilí zpravidla obsahuje detekovatelné, ale podlimitní koncentrace). Dalším zdrojem jsou masné výrobky, což je dáno faktem, že ochratoxin A vytváří rezidua ve tkáních. Např. význačným zdrojem ochratoxinu je vepřová krev, v níž je ochratoxin vázán na albumin (to je příčinou možného výskytu ochratoxinu A v krevních specialitách), v játrech koncentrace dosahují až stovek µg.kg-1. Byla rovněž popsána produkce ochratoxinu A kulturními plísněmi, používanými k finalizaci některých uzenářských výrobku (uherský salám apod.) [36]. Významným zdrojem ochratoxinu též může být káva. Toto zjištění souvisí s nálezy toxikologicky významných koncentrací ochratoxinu A v lidské krvi v krevních konzervách (Německo, Rakousko, Švýcarsko). Při cíleném pátrání po zdroji byl prokázán právě původ z kávy [33].
36
4.2.1.3 STERIGMATOCYSTIN
Chemická struktura, účinky na organismus Sterigmatocystin je sekundární metabolit plísní chemicky podobný aflatoxinům. Zdá se, že část biochemických pochodů, vedoucích ke tvorbě mykotoxinů, mají sterigmatocystin a aflatoxiny společnou [36]. Tento mykotoxin je pro člověka akutně silně toxický (hepatotoxicita) a obdobně jako aflatoxiny vykazuje prokazatelnou hepatokarcinogenitu [36].
Obr. č. 9: Chemická struktura sterigmatocystinu
Producenti, výskyt Jedním z nejvýznačnějších producentů je Aspergillus versicolor, mezi typické producenty patří i Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus [36]. Dále je produkován širším spektrem druhů Chaetomium a Emericella, dále druhy Bipolaris nodulosa, Farrovia malayensis a Monocillium nordinii [32]. Přítomnost sterigmatocystinu (obvykle spolu s aflatoxiny) byla prokázána v cereáliích, kávových zrnech, z živočišných produktů pak v šunce, salámech i sýrech [36].
37
4.2.1.4 PATULIN
Historie objevu Patulin byl původně ve 40. letech popsán jako antibiotikum a dokonce po krátký čas léčebně využíván. Byl charakterizován jako antibiotikum účinné proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím, popsány byly i jeho antivirové účinky (inhibice replikace retrovirů). Po objevení karcinogenity vůči zvířatům byl stažen a dnes je považován za nebezpečný mykotoxin [32, 36].
Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Chemicky se patulin řadí mezi mykotoxiny laktonového typu. Je velmi dobře rozpustný ve vodě. Karcinogenita a mutagenita patulinu souvisí s inhibicí transkripce RNA a selektivním poškozováním DNA. Prokázány byly také negativní účinky na gastrointestinální trakt, neurotoxické a imunotoxické efekty [36].
Obr. č. 10: Chemická struktura patulinu
38
Producenti, výskyt Je produkován řadou druhů mikroskopických hub rodů Aspergillus, Byssochlamys a Penicillium (název je odvozen od P. patulum) [1]. V přírodě je poměrně rozšířen, důležitá je zejména jeho produkce na kazícím se ovoci, velice často v jablkách, ale prokázán byl i v hroznech, pomerančích apod. Jde o relativně běžný kontaminant ovocných koncentrátů a džusů vyrobených z těchto surovin, zejména bylo-li k jejich výrobě použito ovoce ve vysokém stupni zralosti či poškozené. Závažnou je zejména kontaminace ovocných dření, určených pro dětskou a kojeneckou výživu [33].
Detoxikace Patulin je jeden z mála dobře detoxikovatelných mykotoxinů. Odstranění mycelia, případně i s částí přilehlé biomasy nemá pro dekontaminaci význam, protože ve vodě dobře rozpustný lakton snadno difunduje do celého objemu materiálu. Lze ovšem uvést následující doporučení:
Zahuštění ovocné šťávy vakuovou destilací snižuje obsah patulinu v průměru o 25 %.
Pasterace (90˚C po dobu 10s) HTST – z angl. High Temperature Short Time sníží obsah patulinu v jablečném džusu o 20 %. Při dlouhodobém záhřevu při 125˚C (4,5 hod.) by se snížil obsah patulinu až o 90 %.
Ke snížení obsahu patulinu v potravinách dochází zřejmě také při mikrovlnném ohřevu (o 40 až 95 % původní koncentrace).
Byl prokázán rozklad patulinu během alkoholického kvašení (ve vínech se patulin prakticky nevyskytuje).
Upraveno podle [36].
4.2.1.5 CYKLOPIAZONOVÁ KYSELINA
Chemická struktura, účinky na organismus Kyselina α-cyklopiazonová je metabolicky odvozena od aminokyseliny tryptofanu [1]. Co se týče biologického působení, při podání této látky pokusným zvířatům per os dochází především k postižení trávicí trubice (druhová specifita místa postižení je dána místem jejího
39
největšího vstřebávání) a jater. Při podání obcházejícím jaterní bariéru byly pozorovány u běžných hospodářských a laboratorních zvířat (savců) křeče a úhyn. Byly popsány zejména změny v transportu iontů vápníku, vedoucí k osmotické smrti buněk (tedy i nekrotické změny kosterní svaloviny i myokardu). Kyselina cyklopiazonová je považována za potenciální karcinogen, zjistila se její mutagenita pro Salmonella typhimurium [1].
Obr. č. 11: Chemická struktura kyseliny cyklopiazonové
Producenti, výskyt Kyselina cyklopiazonová je produkována větším množstvím druhů rodů Aspergillus a Penicillium. Byla objevena v roce 1968, kdy byla izolována z Penicillium cyclopium. V menším množství se mykotoxin pravidelně vyskytuje v plísňových sýrech pod pokryvem Penicillium camemberti, vyskytuje se i v tavených sýrech (sem se dostává s plesnivými odkrojky), plísňových salámech apod. Nedodržení klasické technologie camembertských sýrů může vést k mohutnému (až o tři řády) vzestupu její koncentrace v plísňovém pokryvu. Obsah kyseliny cyklopiazonové se také zvyšuje v sýrech s bílou plísní na povrchu při jejich nevhodném skladování, především při vyšších teplotách [31]. Dalším uvažovaným zdrojem je drůbeží maso (rezidua vzniklá příjmem kyseliny cyklopiazonové krmivem) [32].
40
4.2.1.6 CITRININ Chemická struktura, účinky na organismus Původně byl objeven a používán (ve 40. letech 20. století) jako antibiotikum, ale pro značnou toxicitu byl vyřazen jako silný mykotoxin. Citrinin je silně nefrotoxický a interferuje s metabolickými procesy v játrech (inhibuje některé enzymy, zejména zasahuje do metabolismu lipidů), což vede k jejich poškození. V experimentech se zvířaty byla prokázána jeho karcinogenita i mutagenita [36]. Může se vyskytovat společně s ochratoxinem a snad jde i o jeho prekursor [32]. Inhibuje také růst rostlin a hub tím, že poškozuje funkci jejich buněčných membrán [1].
Obr. č. 12: Chemická struktura citrininu
Producenti, výskyt Je produkován některými druhy rodu Penicillium a také Aspergillus. V mírném klimatickém pásmu a tedy i v našich podmínkách je zejména kontaminantou obilí [32].
41
4.2.1.7 TRICHOTHECENY Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Z hlediska chemické struktury představují trichotheceny tricyklické seskviterpeny, které obsahují šestičlenný cyklus s dvojnou vazbou mezi uhlíky C-9 a C-10, a epoxyskupinu (v poloze C-12 a C-13). Podle dalších chemických znaků se rozlišují na 4 skupiny: •
Trichotheceny bez kyslíkové skupiny v poloze C-8. Např. trichodermin, trichodermol, scirpentol, diacetoxyscirpenol (anguidin).
•
Trichotheceny s neketonovou kyslíkovou skupinou na C-8. Např. T-2 toxin, HT-2 toxin, krotocin.
•
Trichotheceny s ketoskupinou v poloze C-8. Např. Trichothecin, deoxynivalenol, nivalenol, fusarenon-X.
•
Makrocyklické trichotheceny (obsahují makrocyklický kruh mezi C-4 a C-15). Např. verrukariny, roridiny, satratoxiny Upraveno podle [1].
Obr. č. 13: Chemická struktura trichothecenu diacetoxyscirpenolu
42
Z početných biologických účinků trichothecenů je možné jmenovat symptomy jako zvracení, bolesti břicha, hlavy, dráždění pokožky, krevní poruchy a další. Tyto látky jsou účinné inhibitory syntézy proteinů (účinek trichothecenů jako inhibitorů eukaryotické proteosyntézy je dobře popsán) a DNA a mají imunosupresivní vlastnosti [1]. Na základě experimentů se zvířaty se některé z nich (zvláště T-2 toxin) považují za potenciálně karcinogenní a mutagenní [36] a při podáváni T-2 toxinu myším se zjistily negativní účinky na plodnost i jeho teratogenní účinek [1]. Účinky trichothecenů na člověka (projevy akutní otravy) lze dobře ilustrovat na příkladu alimentární toxické aleukie (ATA). Toto onemocnění bylo zaznamenáno v mírném zeměpisném pásmu, které se táhne od jihu Sibiře přes Ruskou tabuli až po Balkán.Nejrozsáhlejší epidemie byla popsána v bývalém Sovětském svazu ve 40. letech minulého století, kdy v důsledku válečných událostí zůstalo obilí (hlavně proso) na poli pod sněhem a zde bylo napadeno chladnomilnými fusariemi. Obilí sklízené až na jaře bylo extrémně kontaminováno a stalo příčinou úmrtí pravděpodobně několika desítek tisíc lidí (oficiálně přiznané číslo je 17 000). Typickými příznaky ATA je postižení trávicího ústrojí, zvracení, průjmy, celková slabost a horečka. V pozdějších fázích onemocnění dochází k rozsáhlému snížení počtu bílých a červených krvinek i krevních destiček, k rozvoji rozsáhlých kožních vyrážek a v poslední fázi se projevují různé infekce vyvolané pro zdravého člověka banální neškodnou mikroflórou [36]. Poznámka: Podle některých zpráv byly týmy vědců, řešících tento problém v Sovětském svazu, ve 40. letech rozehnány, protože nedokázaly zvládnout masový výskyt ATA v sovětském zázemí během 2. světové války. Většina tehdejších výzkumů totiž sklouzla ke sledování bakterií, napadajících nemocné. Ty jsou z hlediska patogeneze této choroby v podstatě irelevantní (podobně jako původci sekundární infekce u nemocných s AIDS) a zprávy o toxicitě z obilných extraktů a plísňových kultur byly odmítány či zpochybňovány. Exaktní modelový pokus, prokazující původ ATA z otravy fusariovými mykotoxiny provedl až Ueno v 70. letech [32]. V menším rozsahu došlo k hromadným onemocněním ATA v 50. a 60. letech téhož století i v Maďarsku a ve Francii [36].
Kromě akutní a chronické toxicity pro obratlovce mají trichotheceny další, poměrně široké spektrum biologických účinků. Jsou to antibakteriální, antivirové, antifungiální,
43
antiprotozoální, cytostatické, insekticidní i fytotoxické vlastnosti. Znamená to, že mnohé trichotheceny mohou mít i praktické využití [1].
Producenti, výskyt Nejvýznamnějšími
producenty
trichothecenů
jsou
zástupci
rodů
Fusarium,
Trichothecium, Myrothecium, Trichoderma a Stachybotrys [1]. Poznámka: Stachybotrys je plíseň známá již od starověku, která dnes opět budí pozornost. Zástupci tohoto rodu rostou přednostně na substrátech bohatých na celulosu (dřevo, papír, bavlna), přičemž neobvyklým rysem oproti ostatním plísním je vysoký obsah trichothecenů, speciálně T-2 toxinu v jejich sporách. Vdechování spor může vést k prudkému plicními krvácení, u dětí byly zaznamenány i smrtelné případy [36].
Největším problémem ve smyslu rizika dietární expozice člověka těmto mykotoxinům (tzn. možnost příjmu potravou) je kontaminace cereálií.Trichotheceny byly zaznamenány v pšenici, kukuřici, prosu ječmeni, ale také v sójových bobech, v semenech olejnin, v banánech a mangu a též i v pivu, kam přechází z kontaminovaného ječmene. Přenos trichothecenů do potravin živočišného původu (do masa, mléka či vajec) je zanedbatelný [36].
4.2.1.8 ZEARALENON
Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Zearalenon a jeho deriváty jsou makrocyklické sekundární metabolity hub. Přestože nemá steroidní strukturu, má účinky steroidních hormonů estrogenů. Rozeznáváme účinky estrogenní, antiestrogenní, antiandrogenní a anabolický, které jsou u jeho derivátů různým způsobem zastoupeny [32]. Akutní toxicita zearalenonu je velmi nízká, nicméně jeho příjem ve stravě může vyvolat (díky fyziologickému působení) hyperestrogenní syndrom. Ve světovém písemnictví existují i práce, dokazující přítomnost statistických korelací mezi výskytem zearalenonu a trichothecenů v potravě matek během těhotenství a výskytem některých poruch nervového systému (včetně schizofrenie) v jejich potomstvu [33]. Některé deriváty zearalenonu mají
44
potlačeny ostatní účinky kromě anabolického a používají se k výkrmu dobytka jako anabolika (v USA) [1].
Obr. č. 14: Chemická struktura zearalenonu
Producenti, výskyt Zearalenon je produkován různými fusariemi, které kolonizují především kukuřici, ječmen, oves, pšenici a čirok [1]. Kromě těchto obilovin se také vyskytuje v semenech řepky [36]. Největší problémy mohou vzniknout u zemědělců - samozásobitelů, kteří v případě napadení obili konzumují vysoké koncentrace. U běžné populace se mykotoxiny z obilí míšením šarží ředí na velmi nízké koncentrace. Problémy mohou nastat též u konzumace naklíčeného obilí a dalších semen, kdy během klíčení mohou fusaria vyrůst a naprodukovat mykotoxiny (zejména je to problém u vegetariánů a veganů, u kterých tvoří podobné potraviny vyšší procento celkové dávky potravin) [33].
4.2.1.9 FUMONISINY
Chemická struktura, účinky na organismus a mechanismus působení Jde o skupinu látek (fumonisin A1, A2, B1 - B4; nejčastěji je nalézán fumonisin B1), odvozených od nenasycených mastných kyselin. Na rozdíl od mnoha jiných mykotoxinů jsou lépe rozpustné ve vodě než v málo polárních rozpouštědlech (jsou to poměrně polární látky) .
45
Zajímavá je jejich strukturní podobnost se sfingosinem. Biochemickou podstatou jejich toxických účinků je interference s metabolismem sfingolipidů a tím patrně narušení membránových struktur [32].
Obr. č. 15: Chemická struktura fumonisinu B2 V experimentu vyvolávají u některých zvířat zhoubné nádory. U člověka existují epidemiologické souvislosti s výskytem karcinomu jícnu (některé studie z Jižní Afriky a Číny). Jednoznačné jsou důkazy jejich hepatotoxicity a nefrotoxicity [36].
Producenti, výskyt Jsou produkovány některými druhy mikroskopických hub rodu Fusarium a patrně i dalšími plísněmi. V našich podmínkách je hlavním zdrojem této skupiny mykotoxinů v lidské výživě kukuřice včetně výrobků z ní (lupínky apod.) [32]. Fumonisiny byly nalezeny též v rýži, prosu aj. [36].
4.2.1.10 NĚKTERÉ DALŠÍ MYKOTOXINY
Luteoskyrin Je hepatotoxický a karcinogenní. Blokuje v buňkách enzymy oxidativní fosforylace. U nás se může vyskytovat v rýži, zejména takové, která podlehla plesnivění v průběhu transportu [27].
46
Obr. č. 16: Chemická struktura luteoskyrinu
Rubratoxin Existují rubratoxin A a rubratoxin B (důležitější). Bývají produkovány Penicillium rubrum. RB je hepatonefrotoxický, v akutní otravě má LD50 poněkud nižší než aflatoxiny. Zpráv o rubratoxinech je málo, u nás se jimi dosud nikdo systematicky nezabýval [28].
Obr. č. 17: Chemická struktura rubratoxinu B
47
Cyklochlorotin Starší název této látky je islanditoxin. Byl odvozen od Penicillium islandicum; novější název je odvozen od struktury molekuly, kde jsou aminokyseliny uspořádané do kruhu a v centru molekuly je atom chloru. Mykotoxiny atakují cytoskelet, podobně jako chemicky podobné toxiny Amanita phalloides. Celkově se posuzuje jako hepatotoxin, má snad vztah i ke karcinomu jater v zemích s hojným konzumem rýže. U nás bývá nalézán v rýži, z tohoto substrátu lze vypěstovat i silně produkující kmeny [27].
Penicillová kyselina Jde o látku chemicky příbuznou patulinu. Její biologické účinky jsou podobné (včetně karcinogenity) a často se vyskytuje za podobných podmínek jako patulin (někdy i společně). Její význam je proti patulinu poněkud menší [36].
Tremorgeny Tremorgeny jsou chemicky nesourodá skupina mykotoxinů, produkovaných různými druhy mikroskopických hub, především rodů Aspergillus a Penicillium. Význačnou spojující vlastností těchto látek je skutečnost, že pokusná zvířata po jejich podání hynou za třesů a křečí (tremorgenní = doslova "třesotvorné"). Uvedené toxiny tedy atakují nervový systém. Mají poměrně značný letální účinek, podle hodnot LD50 patří mezi nejtoxičtější mykotoxiny. Mezi nejdůležitější mykotoxiny této skupiny patří roquefortiny, které produkují některé kmeny plísní Penicillium roquefortii používané k výrobě sýrů s modrou plísní v těstě [36] (pro člověka snad neškodné, ale myši jsou vůči nim vysoce citlivé), citreoviridin, aflatrem, penitremy a další. Do určité míry je možné k nim přiřadit i výše uvedenou kyselinu cyklopiazonovou [33].
48
4.2.2 LIMITY PRO OBSAH MYKOTOXINŮ V POTRAVINÁCH
Většina států přijala legislativní limity koncentrací mykotoxinů v potravinách, tyto však často spíše odrážející analytické schopnosti než dokonalé poznání zdravotního významu. Jeden z největších problémů je nalézt limity přijatelné jak pro konzumenta, tak pro výrobce. Nejvyšší přípustné množství (NPM) v potravinách u nás stanoví vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 53/2002 Sb., kterou se stanoví chemické požadavky na zdravotní nezávadnost jednotlivých druhů potravin a potravinářských surovin, podmínky použití látek přídatných, pomocných a potravních doplňků, ve znění vyhlášky č. 233/2002 Sb. a také vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 305/2004 Sb., kterou se stanoví druhy kontaminujících a toxikologicky významných látek a jejich přípustné množství v potravinách (tato vyhláška je v souladu s právem Evropských společenství). Stanovené limitní hodnoty jednotlivých kontaminujících látek platí pro jedlý podíl potraviny. Jedlým podílem se rozumí potravina zbavená nejedlých částí (např. slupka, pecky apod.). Co se týče označení „potraviny obecně A“ a „potraviny obecně B“, jsou tyto kategorie potravin jmenovány příslušnou vyhláškou a vycházejí z předpokládané průměrné spotřeby potravin. Tab. č. 7: Nejvyšší přípustná množství (NPM) pro aflatoxin B1 Potravina Dětská a kojenecká výživa
NPM µg.kg-1 0,5
Arašídy určené k přímé spotřebě
2
Arašídy jako surovina k třídění nebo jinému fyzickému
8
ošetření před použitím k přímé spotřebě Ořechy a sušené ovoce jako surovina
5
Ořechy a sušené ovoce pro přímou spotřebu
2
Koření
20
Obiloviny a výrobky z nich
2
Kakao
10
Potraviny obecně A
5
Potraviny obecně B
20
49
Tab. č. 8: NPM pro aflatoxin M1 NPM µg.kg-1
Potravina Mléko syrové i tepelně ošetřené
0,05
Mléčná kojenecká a dětská výživa
0,05
Součtové hodnoty nejvyšších přípustných množství aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 udává tabulka: Tab. č. 9: NPM pro aflatoxiny B1, B2, G1 a G2 NPM µg.kg-1
Potravina Ořechy včetně arašídů a sušené ovoce pro přímou spotřebu
4
Arašídy jako surovina k třídění nebo jinému fyzickému
150
ošetření před použitím k přímé spotřebě Ořechy a sušené ovoce jako surovina
100
Obiloviny
4
Dětská výživa (od ukončeného 12. měsíce)
2
Kojenecká výživa (od narození do ukončeného 12. měsíce)
1
Potraviny obecně A
8
Potraviny obecně B
40
Tab. č. 10: NPM pro sterigmatocystin Potravina
NPM µg.kg-1
Potraviny obecně A
5
Potraviny obecně B
20
Pro mykotoxiny deoxynivalenol, patulin a ochratoxin A jsou v citované vyhlášce stanoveny hodnoty tzv. přípustného množství (PN). Při zjištění, že je hodnota přípustného množství v potravině překročena do 50 %, odebere se ze šarže, ze které byla tato potravina vybrána, odpovídající počet vzorků (n). V případě, že překročení přípustného množství nebude prokázáno u většího počtu vzorků než M, bude potravina posouzena jako zdravotně nezávadná. Při překročení o více než 50 % PM se potravina nepokládá za zdravotně nezávadnou.
50
Pro deoxynivalenol stanoví vyhláška tyto hodnoty PM při n/M = 5/2: Potravina
PM µg.kg-1
Obilí
2000
Mouka
1000
Rýže
2000
Kukuřice
2000
Tab. č. 11: PM pro deoxynivalenol
Pro patulin stanoví vyhláška tyto hodnoty PM při n/M = 5/2: Potravina
PM µg.kg-1
Potraviny obecně A
50
Potraviny obecně B
100
Tab. č. 12: PM pro patulin
Pro ochratoxin A jsou stanoveny tyto hodnoty PM při n/M = 5/2: Potravina
PM µg.kg-1
Mouka a cereální výrobky
3
Potraviny obecně A
5
Potraviny obecně B
10
Tab. č. 13: PM pro ochratoxin A
51
4.2.3 DETOXIKACE MYKOTOXINŮ
Úplné vyloučení rozvoje toxinogenní mikroflory v zásadě není možné. V řadě případů je třeba detoxikovat, dekontaminovat velká množství plodin či krmiv, abychom zabránili ekonomickým ztrátám a ochránili zdraví konzumentů či hospodářských zvířat [36]. V praxi zahrnují detoxikační a dekontaminační postupy inaktivaci nebo rozklad příslušných mykotoxinů, přičemž se očekává nejen pokles koncentrací původně obsažených toxinů, ale zároveň se požaduje, aby nedošlo ke vzniku toxických produktů ani k významnému poklesu nutriční hodnoty daného materiálu. Obecně existují 3 kategorie řešení, vycházející z fyzikálních, chemických či biologických principů [36]. Fyzikální metody
Upraveno podle [36]
Mechanické třídění. Specifickým rysem kontaminace zemědělských plodin mykotoxiny je extrémní nehomogenita jejich distribuce v daném materiálu. Z tohoto důvodu je jedním z účinných opatření pro snížení rizika kontaminace potravin mechanické odstranění napadených částic, ať již realizované ručně nebo jiným způsobem. Ke snížení obsahu mykotoxinů dochází také při mytí vodou.
Inaktivace teplem. Tepelné ošetření kontaminovaných surovin způsobuje v řadě případů pokles hladin mykotoxinů. Zvláště termostabilní jsou však rizikové aflatoxiny, k významnému snížení jejich obsahu dochází až při teplotách kolem 200˚C. Velmi termostabilní jsou také námelové alkaloidy a zearalenon.
Extrakce rozpouštědly. Účinného odstranění aflatoxinů z olejninových šrotů lze dosáhnout pomocí různých rozpouštědel (aceton, ethanol). Jde však o ekonomicky nákladný proces, který navíc vede k ochuzení šrotů o řadu rozpustných živin a může mít vliv na organoleptické vlastnosti.
Adsorpce. Používání různých sorbentů pro odstranění mykotoxinů bylo a je předmětem intenzivního studia. Např. pro odstranění aflatoxinů z mléka se osvědčil hydratovaný hlinitokřemičitan vápenatý či bentonit. Zmíněné materiály se někdy přidávají přímo do krmiv s cílem imobilizovat mykotoxiny přímo v trávicím traktu hospodářských zvířat (snížením přenosu do krevního oběhu). V současné době je na trhu např. přípravek „Mycoad“ od americké firmy Special nutrients, Inc.
52
Poznámka: Např. přídavek hydratovaného hlinitokřemičitanu vápenatého do krmiva dojnic snížil exkreci aflatoxinu M1 o 24 až 44 %. Slibné jsou i experimenty s imobilizací zearalenonu. Otevřená ovšem zůstává otázka, zda použití těchto chemisorbentů zároveň nevede k nežádoucímu snížení příjmu některých esenciálních minerálních látek či vitaminů rozpustných ve vodě [36].
Chemické metody Mykotoxiny se zpravidla vyznačují značnou chemickou odolností vůči vlivům prostředí. Ve velkém se provádí pouze detoxikace u aflatoxinů. Nejčastěji se užívá promývání substrátů kapalným čpavkem, jsou známy i pokusy o detoxikaci pomocí kyseliny octové [32]. Dalšími testovanými činidly byly chlornan sodný a peroxid vodíku – praktickému použití v širším měřítku zde ovšem brání nežádoucí oxidace řady složek ošetřovaných materiálů [32]. K částečné degradaci aflatoxinů B1 a G1 vede též reakce s oxidem siřičitým. Toto konzervační činidlo může rozkládat i patulin [36].
Biologické metody Biologickou detoxikací se v praxi rozumí biotransformace či biodegradace účinkem enzymů, při níž vznikají metabolity, které v případě příjmu hospodářskými zvířaty buď toxicitu nevykazují nebo jsou méně toxické než výchozí toxin a z organismu mohou být snadno vyloučeny. Studovány byly např. bakterie Flavobacterium aurantiacum a některé houby rodu Rhizopus. Slibné výsledky při detoxikaci trichothecenů přinesly např. biotechnologické metody využívající mikroflóru trávicího traktu monogastrických zvířat). Biotechnologické metody mají oproti chemickým řadu předností (nepoužívají se agresivní činidla zhoršující vlastnosti materiálu, přínosem je často i zlepšení stravitelnosti materiálů) [36]. V některých případech mykotoxiny nepřecházejí do finálního výrobku (u obilí např. do škrobu a do lihu) a kontaminované šarže potraviny je nutno přednostně určit právě pro takové výroby [32]. V minulosti se velice často používalo ředění kontaminované potraviny nezávadnou, aby koncentrace mykotoxinů klesla pod stanovený limit. Takovéto opatření by dnes již nemělo být tolerováno, protože jednak limity nemají charakter nejvyšší přípustné koncentrace, jednak
53
u karcinogenů (tedy i karcinogenních mykotoxinů) je výskyt nádorů v populaci závislý na celkovém množství karcinogenu požitého populací, nikoli na jeho koncentraci (podobně jako u nádorů vyvolaných ionizujícím zářením) [32]. Domácká
dekontaminace
potravin
je
prakticky neproveditelná,
cena
jejich
analytického zkoušení zpravidla mnohonásobně přesahuje cenu zplesnivělé potraviny. Proto je nejlepší napadenou potravinu bez lítosti vyhodit. Někdy prováděné okrájení nemá význam, protože mykotoxiny substrátem rychle difundují a v některých substrátech (např. chléb) může být i v hloubce makroskopicky neviditelné mycelium, které však může produkovat mykotoxiny. U kapalných a rosolovitých substrátů (kompoty, džemy, marmelády apod.) je situace ještě jednoznačnější, zde v úvahu padající mykotoxiny (zejména patulin a kyselina penicillová) velice rychle difundují, takže jejich koncentrace je v celém objemu napadeného balení prakticky stejná. Napadené potraviny by měly být rovněž znehodnoceny tak, aby nedošlo k jejich následné konzumaci lidmi, vybírajícími odpad z kontejnerů či ke zkrmení hospodářským zvířatům [32].
4.2.4
ONEMOCNĚNÍ
ČLOVĚKA
ZPŮSOBENÁ
MYKOTOXINY
–
MYKOTOXIKÓZY 4.2.4.1 ERGOTISMUS
Jde o onemocnění, známé od pradávna. Příčina, nákaza obilí (hlavně žita) paličkovice nachová (Claviceps purpurea), byla rozpoznána v minulém století. Od té doby se v Evropě vyskytují pouze náhodné otravy. Prakticky ve všech evropských zemích je zaveden státní výkup obilí, které se mj. také zbavuje námelových sklerocií. Při poslední větší epidemii v r. 1954 byl postižen pouze dobytek. Častěji se vyskytuje v rozvojových zemích (Etiopie). ojedinělé případy bývají občas dokumentovány v Severní Africe [33]. Za první dokumentovanou epidemii ergotismu je považován některými odborníky tzv. Thúkididův mor (jedna z morových epidemií, popsaná antickým historikem Thúkididem). Lesný považuje tuto epidemii za některou z hemorrhagických horeček (podobnou Ebole) [8]. Proti tomu lze namítnout [33] především to, že tyto horečky jsou velice úzce vázány na prostředí tropického deštného pralesa. Navíc, pokud by se dokázala šířit i mimo toto prostředí,
54
tak by patrně její působení nezůstalo omezeno na celkem přesně definovanou oblast Atiky, což se právě v tomto případě stalo. V současné době u nás touto chorobou občas onemocní menší děti, pokud nebyly řádně poučeny rodiči a učiteli a ochutnají ze zvědavosti podívá "zrna", trčící nápadně z žitných klasů. Námelová sklerocia mají údajně vcelku příjemnou houbovou, na konci trochu palčivou, chuť, takže je děti požijí. Naštěstí se většinu takovýchto případů podaří zachránit [15]. Onemocnění způsobují alkaloidy, nacházející se ve sklerociích houby. Tyto látky jsou zároveň důležitou surovinou pro farmaceutický průmysl.
Obr. č. 11:Chemická struktura ergotaminu – jednoho z námelových alkaloidů
Otrava má dvě formy: vaskulární (cévní) a psychotropní. U vaskulární formy dominují spasmy (tzn. zúžení) drobných cév, vyvolávající při opakovaném působení toxinů a po větších dávkách odumření okrajových částí těla (ušní boltce, nos, brady, rty, prsty apod.). Ve středověku se onemocnění nazývalo "nemoc sv. Antonína" a byl dokonce založen zvláštní mnišský řád sv. Antonína, pečující o postižené touto chorobou (popř. následkem toho invalidní). Ve stadiu akutní otravy je známo náhlé přechodné oslepnutí, vyvolané spasmem drobných cév na sítnici. U psychotropní formy se vyskytují zejména tělové a sluchové halucinace, korespondující s lidovými představami o příznacích očarování. Je pravděpodobné, že v pozadí některých čarodějnických procesů byly epidemie ergotismu, nejlépe je toto dokumentováno u tzv. Salemského čarodějnického případu ze sklonku 17. století [33].
55
Příznaky vaskulárního ergotismu rovněž připomínají známou "červenou smrt" z povídky E. A. Poea. Vzhledem k tomu, že autor žil v oblasti, kde se hojně pěstovalo žito, obilnina nejčastěji napadaná touto houbou, a za studenějších a vlhčích let zde byly podmínky ke vzplanutí menších epidemií, mohl být v tomto svém díle (jako ostatně i v řadě dalších) inspirován realitou [33].
4.2.4.2 AKUTNÍ KARDIÁLNÍ BERI-BERI
Toto onemocnění bylo popsáno před r. 1910 a poté za 2. sv. války z bojů britských jednotek s Japonci v jižní Asii. Onemocnění se, stejně jako klasická beri-beri (onemocnění vyvolané nedostatkem vitaminu B1), projevuje křečemi a vzestupnou paralýzou. Na srdci je výrazná porucha rytmu. Onemocnění může skončit úmrtím na zástavu srdce v diastole. Není léčitelné vitamínem B1 [32]. Vyvolávajícím toxinem akutní kardiální beri-beri je citreoviridin, který je produkován především Penicillium citreoviride do rýže. Toxin má jasně žlutou barvu, která je na rýži patrná ("žlutá rýže"). Vztah mezi žlutým zabarvením rýže a chorobou byl odborně popsán počátkem dvacátého století, tehdy v japonštině publikované práce však zcela zapadly. Obyvatelstvo oblastí s výskytem "žluté rýže" ji vystavuje v tenké vrstvě slunečním paprskům, čímž dochází k účinné detoxikaci (citreoviridin je silně fotolabilní). Je to jeden z mála případů, kdy lze levně a jednoduše detoxikovat nějaký mykotoxin [33].
4.2.4.3 ALIMENTÁRTNÍ TOXICKÁ ALUKIE (ATA)
O tomto onemocnění bylo již pojednáno v předcházejících kapitolách. Viz kapitolu 2.1.7 Trichotheceny. Onemocnění probíhá ve třech fázích: V první dochází k prudkému nástupu příznaků v oblasti trávicího ústrojí. Objeví se záněty sliznice, zvracení, průjmy - i krvavé. Ve druhé se dostavuje zdánlivá úleva, doprovázená poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek (úbytek červených krvinek u těžších případů nastává později). Ve třetí fázi jsou nemocní postiženi jednak bakteriálními infekcemi, a to banální a pro normálního člověka neškodnou flórou, jednak krvácením (i vykrvácení žen během měsíčků). Často bývají postiženy krční
56
mandle, proto byla choroba známa i pod synonymem "septická angína". Přeživší nemocní se dostávají do několikaměsíčního období rekonvalescence. Při chorobě je důležitý zejména přísun plnohodnotných bílkovin, poněkud kompenzující pokles proteosyntézy, vyvolaný trichotheceny [32]. Mechanismem působení trichothecenů na úrovni buňky jsou různé typy blokády tvorby proteinového řetězce. Může být narušena jak iniciace tak prolongace, popř. terminace. Jsou poškozeny především tkáně s vysokou metabolickou aktivitou a bohatou proteosyntézou. Vedle toho mají tyto toxiny v dostatečné koncentraci také místní, nekrotizující, účinky. Je rovněž narušena hemostáza (tzn. zástava krvácení) [33].
4.2.4.4 TOXICKÁ HEPATITIDA
Jako téměř každý hepatotoxin mohou aflatoxiny při chronické expozici vyvolávat poškození jater, mající charakter zánětu. Totéž mohou způsobovat i jiné hepatotoxické mykotoxiny, jako např. cyklochlorotin či luteoskyrin. Toto onemocnění se vyskytuje především u obyvatel rozvojových zemích a v chudých vrstvách, častěji se vyskytuje hepatitida hospodářských zvířat [33].
4.2.4.5 PRIMÁRNÍ HEPATOM
Karcinogenita aflatoxinů se projevuje především indukcí nádoru, vycházejícího z hepatocytů, funkčních buněk jaterního parenchymu. Nádory jater patří u nás k deseti nejčastějším usmrcujícím nádorům, u obou pohlaví usmrcují přibližně 3% pacientů se zhoubnými nádory (rutinní statistiky podle lokalizace nádoru). Vedle primárního hepatomu se v této lokalizaci uplatňují i další nádory, nicméně primární hepatom je mezi nimi nejčastější. Karcinogenita aflatoxinu je rozsáhle prozkoumána, a to od biochemických mechanismů účinku přes biologické modely (tkáňové kultury, pokusná zvířata) až po epidemiologické studie na lidských populacích. Navázaný aflatoxin lze nalézt i ve speciálně zpracovaných histologických preparátech jater postižených osob. Takto byl zpracován materiál i pacientů z ČSSR a byl u nich aflatoxin v játrech nalezen. Primární hepatom má rovněž vztah k nosičství viru infekční hepatitidy B. Prodělání uvedené choroby zvyšuje riziko
57
karcinomu jater cca dvacetinásobně. Tento virus je nyní považován za jeden z prokázaných lidských onkovirů, ovšem k onkogenezi potřebuje přítomnost karcinogenní látky, což je velice často právě aflatoxin. Je prokázán vznik volných radikálů z aflatoxinu, vážících se na DNA. Je rovněž popsána korelace mezi aflatoxiny v potravě a v lidském séru, je též popsán přechod aflatoxinů skrze placentu do plodu a do mateřského mléka. Nejvyšší hodnoty aflatoxinu v lidském biologickém materiálu bývají nalézány v tropických rozvojových zemích [32].
4.2.4.6 AFLATOXINY VYVOLANÝ REYŮV SYNDROM
Reyův syndrom je polyetiologický chorobný stav ( tzn. může být způsoben mnoha faktory) , který lze vyvolat i některými léky (např. Acylpyrin), jedy, virovou infekcí a snad existuje i dědičná dispozice. Bylo prokázáno, že u řady kojenců do 1 roku života (a zejména do 6 měsíců), krmených umělou výživou, je etiologickým faktorem (tzn. původcem choroby) aflatoxin.V Československu bylo publikováno kolem 100 ověřených případů (aflatoxiny byly nalezeny buď ve tkáních dítěte nebo alespoň v toxikologicky významném množství ve výživě), odhady celkového počtu zpravidla přesahují 300 [4]. Onemocnění se vyznačuje rychlým přechodem do těžkého bezvědomí po horečnatém onemocnění s nespecifickými příznaky, připomínajícími virózu. V komatu se projeví současné těžké postižení jater a mozku, které je i příčinou smrti [33]. Byly popsány i dva případy vrozeného Reyova syndromu, kdy se dítě s jeho příznaky narodilo a zemřelo do 24 hod poté. V obou případech šlo o matky pracující v živočišné výrobě i ve vysokém stupni těhotenství, u nichž se předpokládá profesionální expozice matky (aflatoxiny v prachu z krmiv) a následná intrauterinní expozice plodu (tzn. působení mykotoxinů na plod v děloze matky) [4].
4.2.4.7 KWASHIORKOR
Kwashiorkor se vyskytuje převážně v rozvojových zemích s výskytem hladomorů. Je původně popsán jako výživová dysbalance, kdy při relativním energetickém dostatku (zajištěném převážně sacharidy) je nedostatek plnohodnotných bílkovin. U postižených je
58
normální nebo jen mírně ztenčená vrstva podkožního tuku, ale současně se vyskytují hladové edémy (tzv. otoky z hladu), vyvolané nedostatkem bílkovin v krvi [33]. Při výzkumech v Etiopii a dalších zemích byl zjištěn úzký vztah mezi výskytem tohoto onemocnění a příjmem aflatoxinů potravou, zejména u dětí. U nejtěžších forem kwashiorkor byly zjištěny vždy aflatoxiny v potravě i tělních tekutinách (krev, moč) v toxikologicky významném množství. V souvislosti s podobnými výzkumy byly v subsaharských afrických zemích prokázány u části populace aflatoxiny v mateřském mléku, a pupečníkové krvi u novorozenců [33].
4.2.4.8 ÚTLUM IMUNITY
Blokáda proteosyntézy zastavuje množení rychle proliferujících (rychle se množících) buněk, kam patří i buňky imunitního systému. Ten je znám z experimentálních aflatoxikóz na zvířatech. U člověka se předpokládá jeho uplatnění v karcinogenezi (tzn. mechanismu vzniku zhoubného nádoru), tj. aflatoxiny nejsou jen iniciátory, ale také promotory karcinogeneze [33]. Zajímavým nálezem je výskyt toxikologicky významných množství aflatoxinů v heroinu, upraveném pro pouliční prodej. Dostává se tam v souvislosti se ředěním původně až 80% preparátu distributory a jeho uchováváním v podmínkách, umožňujících růst plísní a produkci aflatoxinů. Byla vyslovena domněnka, že alespoň část celkové tělesné zchátralosti lze u intravenózních heroinových narkomanů připsat na vrub aflatoxinu [33]. Uvedené údaje jsou mj. dávány do souvislosti s adaptací HIV 1 a HIV 2 na lidskou populaci. Dále se uvažuje o spoluúčasti imunosuprese (tzn. potlačení imunity) vyvolané mykotoxiny na etiologii (tzn. původ) epidemií, včetně pravého moru (u této choroby se navíc předpokládá, že mykotoxiny v obilí mohly být primární příčinou hynutí krys, po nichž nastala invaze jejich nakažených blech na lidskou populaci). U zvířat známe ještě účinek aflatoxinu, který lze označit jako "celkové neprospívání". Při podávání nízkých dávek, hluboko pod prahem chronické toxicity, lze na velkých počtech zvířat prokázat nižší hmotnostní přírůstky a vyšší nemocnost (např. srovnání dvou vepřínů). Při stovkových počtech zvířat může rozdíl ve hmotnosti exponovaných a neexponovaných činit až hmotnost několika kusů. U lidské populace lze podobný efekt rovněž předpokládat [33].
59
4.2.4.9 HYPERESTROGENISMUS
Zearalenon s účinky estrogenů v potravě (zejména obilniny a výrobky z nich) může vyvolat hyperestrogenní syndrom. Je znám především u dobytka, kdy jsou popsány záněty rodidel, zmetání a poruchy plodnosti u samců [28]. Existuje spekulativní úvaha, že nízký věk puberty dívek v některých rozvojových zemích může souviset s konzumem tohoto mykotoxinu v potravě. V ČSSR bylo zachyceno několik případů hyperestrogenismu u dětí, kde vektorem (tzn. přenašečem) bylo maso slepic, konzumované rodinami pracovníků drůbežáren v neobvyklém množství (režijní cena masa). Zearalenon a příbuzné látky byly prokázány jak v drůbeži, tak i v používaném krmivu [33]. Anabolické vlastnosti derivátů zearalenonu, zearalanů, jsou využívány v komerčních výkrmových preparátech [1].
60
4.2.5 PRAKTICKÉ RADY K OCHRANĚ ZDRAVÍ Upraveno podle [25] 4.2.5.1 NÁKUP POTRAVIN
K nákupu potravin využívejte senzorického (smyslového) hodnocení a sledování záruční doby (doby doporučené spotřeby, doby minimální trvanlivosti). Všímá si také jakosti potravin, údajů na etiketě, obalu (zejména jeho neporušenosti) a způsobu uchování potravin v prodejně (zda je např. zboží, které má být uchováno v chladícím boxu, skutečně v něm uloženo).
4.2.5.2 UCHOVÁNÍ A SKLADOVÁNÍ POTRAVIN V DOMÁCNOSTI
I zde má nezastupitelnou úlohu značení potravin – konzument zde vyčte optimální způsob uchování a skladování potravin. Při vhodném skladování a uchování potravin ve vhodném obalu se toxinogenní mikroskopické houby nemohou v potravinách vlivem řady přirozených překážek uplatnit. Dostane-li se však potravina do optimálních vnějších podmínek (teplota, vodní aktivita) a vnitřní faktory jsou také příznivé pro růst toxinogenních plísní a produkci mykotoxinů (např. vhodné složení substrátu, nepřítomnost mikrobiálních překážek), stane se potravina velmi vhodná pro růst a rozmnožování plísní a je velká pravděpodobnost, že se v ní vytvoří mykotoxiny. Abyste zabránili rozvoji plísní, zbytky jídel a potravin nenechávejte dlouho v chladničce a ve spíži. Použité obaly na chléb (např. mikrotenové sáčky) opakovaně nepoužívejte a vyhoďte je do komunálního odpadu.
4.2.5.3 OČISTA A DESINFEKCE V DOMÁCNOSTECH
Výskyt plísní v prostředí domácnosti závisí zejména:
na způsobu provádění úklidu a dezinfekce v kuchyni – dostatečné větrání, pravidelné malování, pravidelné odstraňování organických odpadků, pravidelná očista a používání vhodných desinfekčních prostředků v domácnosti (v kuchyni, chladničce a spíži) zamezí
61
přítomnosti a rozvoji toxinogenních plísní a tím znemožní možnost druhotného nakažení potravin v domácnosti.
na dodržování obecných hygienických zásad – velký význam má povědomí obyvatel domácnosti o nutnosti dodržování obecných hygienických zásad v domácnosti (např. v kuchyni, v chladničce, ve spíži)
na klimatických podmínkách – výskyt mikroskopických hub v ovzduší je příznivější zvláště na jaře a na podzim.
4.2.5.4 PŘÍZNAKY RŮSTU A ROZMNOŽOVÁNÍ PLÍSNÍ V POTRAVINÁCH
Kontrolujte smyslově potraviny, které konzumujete. Ke zrakovému posouzení potraviny použijte lupu – růst plísní může být někdy zaměněn např. za pomoučení, zaplísnění může být nerozpoznatelné prostým okem, zvláště v prvních dnech růstu, či mu nemusí být věnována dostatečná pozornost. Také pach může v některých případech signalizovat přítomnost a aktivitu plísní na potravinách.
4.2.5.5 ZBYTKOVÉ POTRAVINY
Platí zásada nedávat zkažené ani zaplesnivělé potraviny zvířatům. Zbytkové potraviny určené pro zvířata, např. chléb je potřebné nakrájet na plátky do 1 cm (nenechávat v celku), usušit, zabalit do papírového sáčku a uložit v suchu. V případě, že se krmí prasata v domácnosti plesnivým chlebem, který je kontaminován mykotoxiny např. ochratoxinem A, dochází k jeho toxickému působení a je ovlivněn zdravotní stav zvířete. Po porážce je ochratoxin detekován ve vysokých koncentracích v krvi a orgánech prasat. Následně se pak dostává do zabijačkových výrobků (jelit, jitrnic, tlačenky). Po konzumaci uvedených potravin je spotřebitel exponován ochratoxinu A, který je dáván do souvislosti s nádorovým onemocněním ledvin. U kojících žen se může dostat do mateřského mléka.
62
4.2.5.6 EPIDEMIOLOGICKY RIZIKOVÉ POTRAVINY
Mezi rizikové potraviny z hlediska kontaminace mykotoxiny patří zejména:
chléb, pečivo - (aflatoxiny, ochratoxin A)
masné výrobky - trvanlivé salámy - (aflatoxiny, ochratoxin A)
tvrdé a tavené sýry - (aflatoxiny, ochratoxin A, sterigmatocystin)
plísňové sýry - (kyselina cyklopiazonová)
ovoce, zelenina, konzervované ovocné a zeleninové potraviny - kompoty, džemy, marmelády - (aflatoxiny, ochratoxin A, patulin)
koření - (aflatoxiny)
sušené plody např. fíky - (aflatoxiny), hrozinky - (ochratoxin A)
rýže - (aflatoxiny, citrinin, luteoskyrin)
kojenecká výživa - (aflatoxiny)
4.2.5.6.1 CHLÉB A PEČIVO
Kontaminace chleba a pečiva plísněmi:
kontaminace chleba a pečiva plísněmi z prostředí pekárny, přepravních prostředků, přepravek, z prostředí obchodu
kontaminace chleba po dotyku špinavou rukou
Doporučení:
nakupujte chléb a pečivo pouze v množství podle požadavků a potřeb členů rodiny - v případě, že zjistíte, že chléb nebude do 48 hodin zkonzumován, můžete ho dát zabalený v mikrotenovém sáčku do mrazničky.
na dovolenou si kupujte balený chléb s prodlouženou trvanlivostí - konzumní chléb i moskevský chléb často velmi brzy zplesniví.
pečivo a chleba v obchodě neosahávejte rukou - jestliže chcete zjistit jeho čerstvost, navlíkněte si na ruku vnější stranou mikrotenový sáček a vnitřní stranou sáčku proveďte kontrolu hmatem. Jestliže se rozhodnete pro jeho koupi, druhou rukou přetáhnete sáček přes chléb. Jestliže se nerozhodnete pro jeho koupi, pak použitý sáček odhoďte do
63
odpadkového koše. (Při manipulaci s obalovým materiálem není přípustné pomáhat si foukáním do sáčků, sliněním prstů a pod.)
dodržujte základní hygienická pravidla při manipulaci s chlebem v domácnosti. Nenechávejte chléb zbytečně ležet bez obalu na kuchyňské lince.
plesnivý chléb nekonzumujte, ani nedávejte hospodářským nebo domácím zvířatům
zbytkový chléb - nakrájejte na krajíce do 1 cm (nenechávat chléb vcelku), usušte, zabalte do papírového sáčku a uložte v suchu
zbytkové pečivo - (rohlíky) v případě, že ho druhý den nezkonzumujete, důkladně usušte a v případě potřeby postrouhejte na strouhanku a uložte na suchém místě
mikrotenový sáček je vhodný hygienický přepravní obal pouze pro krátkodobé skladování chleba do dvou dnů
4.2.5.6.2 MASNÉ VÝROBKY
Možnosti kontaminace:
ve výrobě - nesprávné rozvěšení salámů při uzení vede k tomu, že kouř, jehož složky mají fungicidní /protiplísňový/ účinek, nemá přístup k celému povrchu salámu - právě v místě dotyku dvou salámů rostou plísně nejčastěji
v prodejně - nevhodné uchování salámů při prodeji
Doporučení:
nakupujte pouze jakostní trvanlivé masné výrobky bez viditelných smyslových změn
nakupujte pouze v množství podle požadavků a potřeb členů rodiny
dodržujte základní hygienická pravidla při manipulaci s trvanlivými masnými výrobky
porcované trvanlivé masné výrobky, balené ve vakuu nebo v ochranné atmosféře, po otevření obalu bezezbytku zkonzumujte
64
4.2.5.6.3 SÝRY
Možnosti kontaminace: Z hlediska možné kontaminace toxinogenními plísněmi a mykotoxiny jsou významné zejména tvrdé sýry. Z hlediska možné produkce mykotoxinů “kulturními plísněmi” i vybrané plísňové sýry camembertského a roquefortského typu. Jestliže dojde u tavených sýru k zaplesnivění, většinou je spotřebitel zlikviduje popřípadě reklamuje v prodejně. U tvrdých sýrů dochází často k okrajování. V případě plísňových sýrů musí být porost kulturní plísně bílý a jednolitý po celé ploše, bez nežádoucích “divokých” plísní.
Doporučení:
nakupujte pouze jakostní trvanlivé sýry bez viditelných smyslových změn - sýry musí být uchovány ve funkčním chladicím boxu
u tavených sýrů zkontrolujte záruční dobu a neporušenost obalu
nakupujte pouze v množství podle požadavků a potřeb členů rodiny
plísňové sýry - skladujte v domácnostech v chladničce dle doporučení výrobce
plísňové sýry si nekupujte na letní dovolenou v případě, že nezabezpečíte jejich uchování při chladničkové teplotě
dodržujte základní hygienická pravidla při manipulaci zejména s porcovanými sýry
porcované trvanlivé masné výrobky, balené ve vakuu nebo v ochranné atmosféře, po otevření obalu bezezbytku zkonzumujte
4.2.5.6.4 OVOCE A ZELENINA
Možnosti kontaminace:
při sklizni
při nevhodném skladování
Poznámka: Jestliže bylo jablko kontaminováno sporami toxinogenní plísně Penicillium expansum, byly v něm stanoveny vysoké hodnoty patulinu jak v nahnilé, tak i ve zdravé vykrájené části.
65
Doporučení:
nakupujte ovoce a zeleninu v čerstvém stavu
nakupujte pouze v množství podle požadavků a potřeb členů rodiny
v žádném případě nekupujte ovoce a zeleninu plesnivé, nahnilé - vzhledem k relativně vysoké ceně ovoce a zeleniny na trhu nereaguje prodejce dostatečně pružně na situaci, že mu uvedené produkty “leží dlouho na pultě”. Sníží cenu, až když začíná docházet ke ztrátě čerstvosti a k prvním příznakům počátečního kažení ovoce nebo zeleniny. (Mykotoxin patulin mohou obsahovat i lesní plody např. přezrálé borůvky)
nekupujte nahnilé banány - spotřebitel mnohdy neodliší nahnilé banány od přezrálých
nevykrajujte plesnivé a nahnilé ovoce a zeleninu
před nákupem ovoce a zeleniny, které neznáte, se seznamte s možnostmi jejich použití objevuje se řada druhů exotického ovoce a zeleniny, které spotřebitel většinou nezná. Neví, jaká jejich část se může konzumovat, jak se upravuje, ani jak má vypadat v době zralosti.
dodržujte základní hygienická pravidla při manipulaci s ovocem a zeleninou před konzumací - omýt v pitné vodě, důležité je dodržování značení ovoce v obchodní síti, kdy by ovoce mělo být na obalech viditelně označeno nápisy, např. "plody chemicky ošetřeny", "kůra nezpůsobilá k používání", atd.
4.2.5.6.5 VÝROBKY Z OVOCE A ZELENINY
Možnosti kontaminace:
kontaminace surovin – viz předchozí kapitolu
při otevření výrobku před konzumací - záleží na časovém úseku, během kterého bude výrobek zkonzumován, a na podmínkách uchování výrobku (informace o uchování a spotřebě kupovaných zavařenin je na etiketách)
66
Doporučení:
používejte k zavařování a k výrobě moštu nezávadné suroviny
dodržujte základní hygienická pravidla při přípravě zavařenin a moštů v domácnostech - v případě, když porušíte správnou technologickou praxi, zákonitě dojde k tomu, že výrobek může zplesnivět
suroviny před zpracováním důkladně operte pitnou vodou
používejte čisté, ve vařící vodě vypláchnuté sklenice a nová víčka - pokud nejsou určena na více použití
po naplnění obsahu sklenice otřete její okraj čistou utěrkou či ubrouskem namočeným v čistém lihu
použijte dostatečnou teplotu a dobu záhřevu podle typu výrobků při zavařování
nekonzumujte plesnivé kompoty, zavařeniny a mošty !!!
nepoužívejte nahnilou a zaplesnivělou surovinu k přípravě pokrmů !!! - vykrájení poškozených částí nestačí, zdravá část po vykrájení může být kontaminována mykotoxiny
4.2.5.6.6 SUŠENÉ PLODY
Možnosti kontaminace:
při sklizni - spory plísní kontaminují povrch ovoce a ořechů z okolního prostředí
při zpracování surovin na sušené plody - během technologického zpracování a sušení, a podmínkách, jak bude dále skladován a uchováván, a úrovni hygieny při zpracování
Doporučení:
používejte k vlastnímu sušení tuzemských plodů pouze nezávadnou surovinu
při sušení plodů je nutné použít vhodné technologické zařízení, např. sušičku a sušené plody následně vhodně uchovat
nakupujte pouze jakostní subtropické a tropické sušené plody
nekupujte “podezřele levné” sušené plody - arašídy, pistácie a para ořechy především horší jakosti jsou často kontaminovány mykotoxiny
67
4.2.5.6.7 RÝŽE
Možnosti kontaminace:
při sklizni - spory plísní kontaminují obilku rýže z okolního prostředí
při zpracování
Doporučení:
nakupujte pouze rýži nejvyšší jakosti
v případě, že koupíte rýži horší jakosti, přebírejte ji
properte rýži před vařením na sítku vařící vodou
skladujte rýži v suchu
4.2.5.6.8 KOJENECKÁ A DĚTSKÁ VÝŽIVA
Kojenci a malé děti do věku 1 roku se významně liší od ostatní populace zejména v nutričních požadavcích (konzumuje specifickou stravu, konzumuje mnohem více stravy na jednotku hmotnosti než dospělá populace atd.). Mykotoxiny jsou pro uvedenou populační skupinu vysoce nebezpečné chemické látky, známé svými toxickými účinky včetně vztahu ke karcinogenezi a vývojové toxicitě. Efekty expozice se mění s věkem. Toxický vliv mykotoxinů nemusí být bezprostřední, ale může se projevit v pozdějším věku a ovlivnit tak zdravotní stav dospělé populace. Záleží zejména na druhu mykotoxinu, jeho vstřebávání, přeměně a vylučování a stupni dozrávání cílových orgánů a tkání. Ve sdělovacích prostředcích byla, zejména v posledních letech, problematika výživy kojenců a dětí ve vztahu k mykotoxinům již několikrát otevřena (např. výskyt aflatoxinů v sojovém mléce, či úmrtí kojenců na tzv. Reyův syndrom, který je dáván do souvislosti s aflatoxiny) a vyvolává obavy rodičů o zdraví svých dětí . Proto je důležité, aby kojenecká výživa byla zdravotně nezávadná i z hlediska obsahu toxinogenních plísní a mykotoxinů.
Možnosti kontaminace:
při manipulaci a přípravě kojenecké výživy v kuchyni
68
při uchování otevřeného balení - v prostředí kuchyně, kde je vysoká relativní vlhkost, či spotřebitel vloží do balení mokrou odměrku, dojde k jeho zvlhčení a následně může dojít k růstové aktivitě plísní
Doporučení:
nakupujte pouze kojeneckou výživu u níž zkontrolujete záruční dobu a neporušenost obalu
nakupujte kojeneckou výživu častěji v menším množství
dodržujte základní hygienická pravidla při manipulaci a při přípravě kojenecké výživy v domácnosti
uchovávejte kojeneckou výživu na suchém místě
nenechávejte kojeneckou výživu zbytečně ležet otevřenou na kuchyňské lince
69
4.2.6 SLOVNÍČEK POJMŮ
anamorfa - nepohlavní (asexuální) stádium v životním cyklu houby, nejčastěji konidiové stádium, vytvářející spory mitoticky arthrokonidie - konidie vznikající rozpadem (fragmentací) vlákna na jednotlivé buňky askoma (askokarp) - obecný termín pro plodnice vřeckovýtrusých hub (Ascomycetes) askospora - spora vzniklá ve vřecku po předchozím pohlavním rozmnožování (typ meiospory), u vřeckovýtrusých hub (Ascomycetes) askus (vřecko) - tenkostěnná buňka, v níž se tvoří askospory; obvykle se nachází uvnitř askokarpu bakteriocin- antimikrobiální látka peptidového charakteru produkovaná bakteriemi, neinhibuje růst producenta biseriátní - ve dvou vrstvách, např. konidiofory u rodu Aspergillus, na jejichž měchýřcích vyrůstá vrstva metul a vrstva fialid dermatotoxiny – látky působící toxicky na kůži estrogeny – ženské pohlavní hormony fialida - typ konidiogenní buňky, tj. specializované buňky tvořící blastické konidie genitotoxin – látka působící toxicky na rozmnožovací soustavu genotoxin – látka poškozující genetickou informaci buňky hematotoxin – látka působící toxicky na systém krve hepatotoxin – látka působící toxicky na játra hyfa - vlákno houby, s přehrádkami či bez přehrádek chlamydospora - asexuální, silnostěnná, odpočívající spora sloužící obvykle k přečkání nepříznivých podmínek imunotoxin – látka působící toxicky na imunitní systém inkubace - doba, po kterou je houba kultivována, aby se vyvinuly typické znaky kmen- izolát mikroskopické houby nebo bakterie udržovaný v čisté kultuře na živných médiích kolumela - zduřelý sterilní konec sporangioforu uvnitř sporangia (u zástupců řádu Mucorales) konidie - nepohyblivá spora vzniklá při nepohlavním rozmnožování (mitospora)
70
konidiofor - specializované vlákno, často typicky větvené, nesoucí konidiogenní buňky, jež produkují konidie kultivace - pěstování mikroorganismů na umělých živných médiích v laboratorních podmínkách makrokonidie - větší typ konidií, obvykle vícebuněčných (u hub tvořících 2 typy konidií, např. u rodu Fusarium) meiospora - spora vzniklá po předchozím pohlavním rozmnožování a meioze (např. askospora) metula - část konidioforu, podpůrná buňka pod konidiogenní buňkou (fialidou), (např. u rodu Penicillium, Aspergillus, Clonostachys) mikrokonidie - menší typ konidií, obvykle jednobuněčných (u hub tvořících 2 typy konidií, např. u rodu Fusarium) mitospora - spora vzniklá při nepohlavním rozmnožování (např. konidie) mycelium - vláknitá stélka hub mykologie - věda o houbách mykotoxin - toxický sekundární metabolit hub nefrotoxin – látka působící toxicky na ledviny neurotoxin – látka působící toxicky na nervový systém ostiolum - ústí u plodnic vřeckovýtrusých hub (např. u perithecií) nebo u pyknid, kterým jsou vytlačovány nebo vystřelovány spory ven prototunikátní - mající vřecka s tenkou stěnou, která se v době zralosti rozpouští (lyzuje) psychrofilní - houby rostoucí dobře při nízkých teplotách, často okolo 0 °C pyknida - lahvicovité konidioma s ústím, připomíná tvarem perithecium, avšak uvnitř obsahuje konidiofory s konidiemi rhizoidy - vlákna houby rozvětvená v substrátu podobně jako kořínky rostlin, sloužící k zakotvení v substrátu a absorpci živin (např. u rodu Rhizopus) saprotrofové - organismy získávající energii ke svému životu z mrtvé organické hmoty sklerocium - tvrdý sterilní útvar tvořený kompaktním myceliem hub, schopný přečkat nepříznivé podmínky spora - obecný termín pro rozmnožovací částici, ze které může vzniknout nový jedinec sporangiofor - specializované vlákno, často větvené, nesoucí jedno nebo více sporangií
71
sporangiospora - spora vzniklá nepohlavně uvnitř sporangia sporangium - uzavřený, nejčastěji kulovitý útvar, v němž vznikají nepohlavně sporangiospory stolon - vlákno sloužící k dalšímu šíření houby po substrátu (např. u rodu Rhizopus) tremorgeny – látky vyvolávající svalový třes a křeče uniseritání - v jedné vrstvě, např. konidiofory u rodu Aspergillus, na jejichž měchýřku vyrůstá pouze vrstva fialid xerofilní - rostoucí na substrátech s nízkou vodní aktivitou (např. na sušených potravinách)
72
5. ZÁVĚR V průběhu přípravy a realizace mé bakalářské práce jsem se nejprve při práci s odbornou literaturou blíže seznámil s problematikou kontaminace potravin toxinogenními plísněmi a jejich sekundárními metabolity – mykotoxiny. Posléze jsem z nashromážděných historických i nejnovějších poznatků vybral ty, které jsou podstatné pro studenta střední odborné školy s potravinářským zaměřením a uspořádal je do podoby učebního textu s názvem „Potravinářská mykotoxikologie“. Protože učební text učební text je primárně určený pro potravinářskou větev studia na Střední průmyslové škole chemické v Brně, akcentuje zejména chemický
přístup
k problematice
mykotoxinů
obsažených
v potravinách,
zatímco
morfologické, fyziologické a kultivační vlastnosti plísní nejsou popisovány, případně pouze okrajově. Učební text je rozdělen na část všeobecnou a speciální, přičemž členění na jednotlivé kapitoly využívá systému desetinného třídění. Úvodní kapitola spolu s kapitolou o historii mykotoxikologie vymezuje některé základní pojmy, uvádí jeden z dnešní významných problémů kvality potravin do historických souvislostí a nastiňuje též vývoj mykotoxikologie u nás. Další kapitoly ze všeobecné části se zabývají stručnou charakteristikou skupiny organismů produkující mykotoxiny, objasňují čtenáři některé základní obecně toxikologické pojmy, informují o začlenění mykotoxinů do systému cizorodých látek v potravinách. Stěžejními kapitolami ze všeobecné části jsou ty, které informují o členění mykotoxinů z nejrůznějších hledisek (podle produkčních organismů, chemické struktury, podle akutní toxicity a biochemického mechanismu působení, resp. podle toxických účinků na cílové orgány člověka) a o fyzikálních, chemických a biologických podmínkách toxinogenity vláknitých hub. Spíše okrajově je také zmíněna ekologická funkce mykotoxinů. Speciální část učebního textu je věnována systematickému popisu nejdůležitějších mykotoxinů z hlediska potravinářské praxe. U příslušného toxinu je uvedena chemická struktura, účinky na organismus (případně mechanismus působení), typické produkční organismy, přehled potravin, které jsou nejčastěji kontaminovány a u některých také např. zajímavosti z historie objevu daného mykotoxinu nebo i další informace. Při studiu speciální části získá čtenář také informace o limitních hodnotách obsahu mykotoxinů ve vybraných potravinách, o možnostech detoxikace některých mykotoxinů a o nejznámějších a nejdůležitějších mykotoxikózách.
73
Závěrečná kapitola shrnuje nejdůležitější praktické rady, kterých by měl konzument potravin dbát, aby pokud možno co nejvíce eliminoval expozici vlastního organismu mykotoxinům. Speciálně se tato kapitola zabývá některými potravinami, které jsou z hlediska kontaminace mykotoxiny rizikové, přičemž velký důraz je kladen na praktickou využitelnost uvedených doporučení. Při práci se studenty střední odborné školy jsem se ujistil, že poznatková základna průměrného studenta je pro porozumění učebnímu textu dostatečná, i když jako takový jde výrazně nad požadovaný standard studenta SOŠ (obsahuje převážně rozšiřující učivo) a je určen pro výuku volitelného předmětu. Předběžným dotazováním žáků jsem si také ověřil jejich poměrně značný zájem o problematiku mykotoxinů obsažených v potravinách. Učební text „Potravinářská mykotoxikologie“ má pracovní charakter. Jeho vydání v podobě skripta se předpokládá počátkem školního roku 2006/2007 s tím, že v budoucnu bude doplněn a případně přepracován podle potřeby.
74
6. LITERATURA
1.
Betina, V.: Mykotoxíny: Chémia - biológia - ekológia. Bratislava, Vydavateľstvo Alfa 1990.
2.
Březina, P., Kachlík, P., a kol..: Kontaminace sušeného mléka pro dětskou a kojeneckou výživu plísňovými sporami v závislosti na výskytu plísní v domácnosti. Bulletin Československej společnosti mikrobiologickej, 35/1995.
3.
Hocking, A.D.: Toxinogenic Aspergillus Species. In Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J.: Food microbiology. Washington DC, ASM Press 2001, s. 451 – 466.
4.
Dvořáčková, I: Aflatoxin jako rizikový faktor lidského zdraví; Mikroskopické houby a jejich toxické produkty jako faktory ovlivňující zdraví zvířat a člověka. [sborník konference], Brno, 1989.
5.
Geryk, E. a kol.: Zhoubné novotvary, jižní Morava - rok 1994, předběžné údaje. Masarykův onkologický ústav, Brno, 1996.
6.
Jičínská, E., Havlová, J.: Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských výrobcích. Praha, Ústav zemědělských a potravinářských informací 1995.
7.
Keidel, W. D. a kol.: Stručná učebnica fyziológie. Bratislava, Vydavatelstvo Slovenskej akadémie vied, 1973.
8.
Lazarovskis, I.: Přehled klinických symptomů a syndromů. Praha, Avicenum 1986.
9.
Lesný, I.: Druhá zpráva o nemocech slavných. Praha, VPK 2001.
10. Lüllmann H., Mohr K., Wehling M.: Farmakologie a toxikologie. Praha, Grada Publishing 2002. 11. Matoušková, J., Kaláčová, D: Podmínky produkce mykotoxinu kyseliny cyklopiazonové kmeny Aspergillus flavus. Brno, LF UJEP 1989. 12. Ministerstvo zdravotnictví ČR: Vyhláška č. 233/2002 Sb. 13. Ministerstvo zdravotnictví ČR: Vyhláška č. 305/2004 Sb. 14. Ministerstvo zdravotnictví ČR: Vyhláška č. 53/2002 Sb. 15. Nováček, P.: Seznámení žáků 1. stupně základní školy s jedovatými a nebezpečnými rostlinami a houbami. Dipl. práce, PedF MU, Brno, 1995. 16. Ostrý, V, Ruprich, J.: Fumonisiny, mykotoxiny produkované Fusarium spp. Mykologické listy 60 / 1997.
75
17. Ostrý, V. : CHPŘ Brno SZÚ - Zprávy centra. CHPŘ Brno SZÚ 6 /1997. 18. Ostrý, V., Polster, M.: Kulturní mykoflora sloužící k výrobě poživatin a produkce mykotoxinů. Brno, Meeting bulletin z celostátní konference "Mikroskopické houby a jejich toxické produkty jako faktor ovlivňující zdarví zvířat a člověka" 1989. 19. Ostrý, V., Ruprich, J.: Mykotoxiny v potravinách - výskyt a stanovení mykotoxinu kyseliny cyklopiazonové ve svalovině brojlerů kuřat a krůt. Veterinářství 5 / 1994. 20. Ostrý, V.: Historie epidemií ergotizmu. Mykologické listy 75 / 2000. 21. Ostrý, V.: Ochrana zdraví občanů v domácnostech: plísně a mykotoxiny v potravinách. Výživa a potraviny 2 / 1999. 22. Ostrý, V.: Praktické aspekty ochrany a podpory veřejného zdraví před plísněmi a mykotoxiny. Sborník Zkušenosti s asanací a dezinfekcí lokalit kontaminovaných plísněmi. Sdružení pracovníků DDD Praha, ČSVTS Praha, 1999. 23. Ostrý, V.: Užitečné a škodlivé plísně v potravinách. Výživa a potraviny 2 / 1999. 24. Ostrý, V.: Vláknité mikroskopické houby (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Praha, Státní zdravotní ústav 1998. 25. Ostrý. V.: Plísně na potravinách. SZÚ na http://www.chpr.szu.cz dne 2. 9. 2005. 26. Polster, M.: Mykotoxiny. ČSVSM, Brno 1975. 27. Polster, M.: Nižší houby. In Hrubý, S. a spol.: Mikrobiologie v hygieně výživy. Praha, Avicenum 1984. 28. Polster, M.: Toxigenní plísně a mykotoxiny v potravinách. Brno, Ústav pro další vzdělávání středních zdavotnických pracovníků Brno 1971. 29. Průcha, J.: Moderní pedagogika. Praha, Portál 1997. 30. Riedl O., Vondráček V. a kol.: Klinická toxikologie. Praha, Avicenum 1971. 31. Šimůnek, J., Březina, P., Ježová. J.: Riziko mykotoxinu kyseliny cyklopiazonové ze sýrů fermentovaných kulturní plísní Penicillium camemberti. Veterinární péče v potravinářském průmyslu 2/1990. 32. Šimůnek, J., Březina, P.: Mykotoxiny. Vysoká vojenská škola pozemního vojska, Fakulta ekonomiky obrany státu, Vyškov 1996 33. Šimůnek, J.: Mykotoxiny. Získáno z http://www. Verze 1.3 únor 2003, dne 2.9.2005 34. Švecová, M.: Teorie a praxe zařazení školních projektů ve výuce přírodopisu, biologie a ekologie. Praha, UK 2004.
76
35. Tvrdoň, M.: Školní atlas mikroorganismů. Praha, SNTL 1978. 36. Velíšek, J.: Chemie potravin 3. Tábor, OSSIS 2002.
