Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně

VLIV ASIMILOVATELNÉHO DUSÍKU NA PRŮBĚH FERMENTACE MOŠTŮ RÉVY VINNÉ Disertační práce

Vedoucí disertační práce

Vypracoval

Doc. RNDr. Ing. Marie Kyseláková, CSc. Lednice 2010

Ing. Mojmír Baroň

Mendel university in Brno

EFFECT OF ASSIMILABLE NITROGEN ON GRAPE MUST FERMENTATION PhD - Dissertation

Supervisor

PhD - Student

Doc. RNDr. Ing. Marie Kyseláková, CSc. Lednice 2010

Ing. Mojmír Baroň

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že disertační práce byla vypracována samostatně, že všechny použité literární zdroje jsou správně a úplně citovány. Tato práce je z hlediska obsahu majetkem Zahradnické fakulty MENDELU v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkana ZF MENDELU.

.......................................... podpis doktoranda

Rád

bych

poděkoval

na rodině,

tomto

místě

přátelům

a

především své ženě Kateřině za vstřícnost a podporu, kterou mi poskytli při zpracování této práce. Můj vděk patří také paní Doc. RNDr. Ing. Marii Kyselákové CSc. za pomoc a cenné rady.

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné

SOUHRN Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné Disertační práce byla zaměřena na problematiku asimilovatelného dusíku v moštech z Mikulovské a Znojemské vinařské podoblasti, jeho utilizaci během fermentace a postfermentační produkty. Dále se práce zaobírá různými faktory ovlivňující obsah asimilovatelného dusíku v hroznech. Součástí práce je také sledování rozdílů odběru dusíkatých látek u dvou různých komerčně dostupných druhů kvasinek a prověření metod detekce dusíkatých zdrojů. V teoretické části je podrobně popsána evoluce dusíkatých látek v révě vinné. Pozornost je dále věnována především problematice utilizace dusíkatých zdrojů kvasinkami a důsledkům ovlivňujících organoleptické vlastnosti vína. Závěr teoretické části tvoří kompilace dostupných analytických metod detekce dusíkatých látek. Pro pokus byl vytvořen plán odběru vzorků v letech 2007 a 2008 obsahující varianty z různých vinařských podoblastí, s různým způsobem zatravnění meziřadí, dvojicí podnoží a odrůd. Vzorky byly odebrány u moštů, kde byl měřen obsah amonných iontů a asimilovatelného dusíku, a mladých vín, kde byla sledována změna asimilovatelného dusíku a produkce kyseliny octové během fermentace. Výsledky byly hodnoceny nejdříve jako celek bez ohledu na jednotlivé ovlivňující faktory. Sloužily tak k monitorování obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z jižní Moravy a k obecným závěrům, kde se potvrdilo, že tyto mošty obsahují vysoké množství amonných iontů a asimilovatelného dusíku a nemají tudíž problémy s výživou kvasinek během fermentace. Taktéž průměrná produkce kyseliny octové ukazuje na bezproblémový průběh fermentace bez přídavku výživy u většiny moštů. Posléze byla data statisticky zpracována a hodnocena z hlediska jednotlivých ovlivňujících faktorů a jejich interakcí. Zde byly nalezeny velice zajímavé rozdíly ve způsobu zatravnění a v příjmu dusíkatých látek jednotlivých odrůd. Interakce druhého řádu pak rozkryly vztahy mezi ročníky a chováním podnoží a odrůd. Další pokusná část byla zaměřena na rozdílný odběr volných aminokyselin odlišnými druhy kvasinek („aromatické“ a „neutrální“) během fermentace. Potvrdil se

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné intenzivnější odběr „aromatických“ kvasinek, avšak výsledky nebyly jednoznačné. Velkou neznámou v problematice dusíkatých látek v enologii zůstává aminokyselina prolin. Poslední část práce se věnuje analytickým metodám detekce dusíku využitelného kvasinkami. Pozornost byla zaměřena na spektrofotometrickou metodu využívající ninhydrin jako derivatizační činidlo a na metodu formaldehydové titrace. Výsledky potvrdily univerzálnost, jednoduchost a dostatečnou přesnost formaldehydové titrace, jejíž aplikace v praxi by přinesla značné výhody technologům a je v závěru této práce vřele doporučována.

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné

SUMMARY Effect of assimilable nitrogen on grape must fermentation This PhD-dissertation thesis deals with the content of assimilable nitrogen in grape musts, its consumption by yeasts during fermentation and production of postfermentation products (metabolites). Various factors influencing the content of assimilable nitrogen in grapes were investigated as well. The author also presents information about monitoring of differences existing in contents of nitrogen compounds in fermenting musts started with two different types of commercially available yeasts and about screening methods used for the detection of N-sources. In the theoretical part, the evolution of nitrogen compounds in grape vine is described in detail. Attention was paid above all to the problem of utilization of nitrogen sources by yeasts and to factors influencing sensory characteristics of wine. The theoretical part of this thesis also presents a survey of analytical methods enabling to detect nitrogen compounds. Experiments were performed according to a sampling plan elaborated for years 2007 and 2008. Experimental variants involved wine samples originating from different South Moravian wine-growing subregions, different types of inter-row grass stand, and different combinations of rootstocks with varietal scions. Samples were taken not only from fermenting musts but also from young wine and the following parameters were estimated: content of ammonium ions, content of assimilable nitrogen, changes in the level of assimilable nitrogen, and production of acetic acid in the course of fermentation. At first, the obtained results were evaluated as a whole, i.e. regardless to individual factors mentioned above. These data enabled to monitor contents of assimilable nitrogen in musts and to draw a general conclusion that these musts contain high concentrations of both ammonium ions and assimilable nitrogen so that there is no danger of having problems with the nutrition of yeasts in the course of fermentation. Also the average production of acetic acid was low; this indicated that in the majority of must samples without added nutrients, the course of fermentation was smooth and trouble-free. All results were statistically analysed and evaluated with regard to individual factors influencing the content of assimilable nitrogen in must and wine and also to their interactions. Very interesting differences existed between variants with different types

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné of grassland stands on the one hand and the uptake of nitrogen compounds by individual varieties. Interactions of the second order indicated that there were different relationships between vintage years on the one hand and the behaviour of rootstocks and varieties on the other. In another experiment, the differences in the uptake of free amino acids by different species of yeasts (i.e. "aromatic" and "neutral" ones) in the course of fermentation were studied. The obtained results confirmed that in case of "aromatic" yeasts the uptake of nutrients was higher; however, this difference was not significant. It can be said that proline still remains to be a great “unknown variable” as far as the problem of supply of nitrogen compounds in oenology is concerned. The final part of this thesis deals with analytical methods used for detection of nitrogen available for yeasts. Attention was paid to a spectrophotometric method using ninhydrin as a derivatizing agent and to the method of formaldehyde titration. The obtained results confirm that the method of formaldehyde titration is universal, simple and sufficiently accurate so that it can be recommended for oenological practice as a useful and efficient analytical tool.

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné

OBSAH 1. 2.

ÚVOD........................................................................................................................9 TEORETICKÁ ČÁST ...........................................................................................10 2.1 Dusíkaté sloučeniny .........................................................................................10 2.1.1 Dusík a réva vinná .....................................................................................10 2.1.2 Evoluce dusíkatých látek v hroznech.......................................................12 2.2 Asimilovatelný dusík v moštu a víně ..............................................................23 2.2.1 Amonné ionty v moštu...............................................................................23 2.2.2 Aminokyseliny v moštu .............................................................................24 2.3 Utilizace asimilovatelného dusíku kvasinkami..............................................25 2.3.1 Asimilační mechanismy dusíku ................................................................26 2.3.2 Syntéza aminokyselin ................................................................................28 2.3.3 Katabolismus aminokyselin ......................................................................32 2.3.4 Důsledky utilizace dusíku .........................................................................34 2.4 Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace ...................................46 2.4.1 Vliv asimilovatelného dusíku na stavbu buněčné stěny kvasinek .........46 2.4.2 Vliv asimilovatelného dusíku na rychlost fermentace............................47 2.5 Požadavky na výživu .......................................................................................48 2.5.1 Příjem dusíku.............................................................................................48 2.5.2 Vliv provzdušnění a přídavku dusíku na průběh a úplnost fermentace ..................................................................................................52 2.6 Metody stanovení .............................................................................................54 2.6.1 Metody stanovení veškerého asimilovatelného dusíku...........................54 2.6.2 Metody stanovení volných aminokyselin .................................................55 2.6.3 Metody stanovení amonných iontů ..........................................................59 3. CÍL PRÁCE............................................................................................................61 4. DESIGN POKUSU.................................................................................................62 5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................64 5.1 Materiál.............................................................................................................64 5.1.1 Výběr podnože ...........................................................................................64 5.1.2 Výběr odrůdy .............................................................................................65 5.1.3 Výběr vinařské podoblasti ........................................................................67 5.1.4 Výběr agrotechnických podmínek ...........................................................68 5.1.5 Materiál, metodika zpracování a odběr vzorků......................................68 5.2 Metody měření .................................................................................................70 5.2.1 Stanovení cukernatosti refraktometrem..................................................70 5.2.2 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku (α-dusíku) formaldehydovou titrací............................................................................71 5.2.3 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku (α-dusíku) spektrofotometricky po derivatizaci ninhydrinem .................................72 5.2.4 Stanovení amonných iontů a kationtů elektromigrační metodou .........73 5.2.5 Stanovení kyseliny octové elektromigrační metodou .............................74 5.2.6 Stanovení aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s předkolonovou derivatizací ..........................75

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné 5.2.7 Meteorologická data ..................................................................................77 6. VÝSLEDKY ...........................................................................................................82 6.1 Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy............................................82 6.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech ......85 6.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008 ...............................87 6.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech z vinařských podoblastí Mikulovsko a Znojemsko..........................................................................89 6.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech....92 6.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech ....................................................................................................94 6.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech ...............97 6.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory.....................................................100 6.2 Změna asimilovatelného dusíku před a po fermentaci...............................104 6.3 Vliv množství asimilovatelného dusíku v moštech na produkci kyseliny octové...............................................................................................................106 6.4 Dynamická změna jednotlivých aminokyselin během fermentace za přítomnosti odlišných druhů kvasinek ........................................................107 6.5 Porovnání metody FAN a formaldehydové titrace .....................................109 6.5.1 Metoda FAN.............................................................................................109 6.5.2 Formaldehydová titrace ..........................................................................110 7. DISKUSE ..............................................................................................................112 7.1 Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy..........................................112 7.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech ....112 7.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008 .............................113 7.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech z vinařských podoblastí Mikulovsko a Znojemsko........................................................................114 7.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech.114 7.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech ..................................................................................................114 7.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech .............115 7.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory.....................................................116 7.2 Změna asimilovatelného dusíku před a po fermentaci...............................118 7.3 Vliv množství asimilovatelného dusíku v moštech na produkci kyseliny octové...............................................................................................................118 7.4 Dynamická změna jednotlivých aminokyselin během fermentace za přítomnosti odlišných druhů kvasinek ........................................................119 7.5 Porovnání metody FAN a formaldehydové titrace .....................................119 8. ZÁVĚR..................................................................................................................121 9. DOPORUČENÍ PRO PRAXI A DALŠÍ VÝZKUM .........................................123 10. SEZNAM GRAFŮ ...............................................................................................125 11. SEZNAM TABULEK ..........................................................................................127 12. POUŽITÁ LITERATURA..................................................................................128 13. PŘÍLOHY……………………………………………………………………………136

Úvod

1. ÚVOD Je známo, že dusík silně ovlivňuje růst letorostů a barvu listů révy vinné. Nadbytek dusíku však vede také k nadměrnému růstu, vyšší náchylnosti k houbovým chorobám, vadnutí třapiny a k celkovému snížení kvality hroznů. Naopak nedostatek dusíku omezuje intenzitu růstu a snižuje výnos. Optimalizace dusíkatého hnojení vyžaduje přesné znalosti časového průběhu příjmu dusíku rostlinou.1 V posledních letech se stále častěji objevují práce a diskuse na téma asimilovatelného dusíku a jeho vlivu na fermentaci hroznových moštů. Ve světě je tato problematika v hojné míře řešena. U nás až na minimum výjimek se vědecké práce tímto problémem nezabývají. Dusíkaté látky uložené v bobulích jsou velmi důležité pro rozmnožování a vlastní činnost kvasinek. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae, které při kvašení vždy převládají, mohou využít dusík ve formě aminokyselin či amonných iontů a odtud je odvozen všeobecně používaný termín „dusík asimilovatelný kvasinkami“. Nedostatek asimilovatelného dusíku v moštu je znám jako hlavní důvod zpomalené a neúplné fermentace2,3 a produkce sirných sloučenin4,5. Celkový obsah dusíku v moštu může dále postihnout také aroma vína6 a ovlivnit produkci kyseliny octové či vysoce karcinogenního ethylkarbamátu.7 V praxi se setkáváme s nedostatkem asimilovatelného dusíku v prvé řadě u špatně vyzrálých hroznů, dále u stresovaných hroznů pocházejících z vinic nedostatečně hnojených dusíkem či bylo-li během vegetace sucho či vysoké teploty. V těchto případech je nutné nedostatek asimilovatelného dusíku kompenzovat přídavkem živných solí do moštu, určených pro kvasinky, případně vitamínu B1 (tiaminu).8 Přirozeně hrozny s vyšší cukernatostí potřebují k řádnému prokvašení asimilovatelného dusíku více. Je známo, že obsah asimilovatelného dusíku moštu je závislý na hnojení, klimatických podmínkách, na délce vyluhování slupek v moštu, ale také na odrůdě, ročníku, původu a v neposlední řadě na technologii výroby vína.9,10,11 Mimo všechny tyto faktory z velké části závisí využití asimilovatelného dusíku na metabolismu kvasinek a podmínkách fermentace. Nejvíce zastoupené aminokyseliny u moštů jsou arginin, prolin, kyselina glutamová, glutamin a kyselina γ-aminomáselná.

9

Teoretická část

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1

Dusíkaté sloučeniny

2.1.1 Dusík a réva vinná Dusík se v révě vinné zúčastňuje jako stavební látka tvorby mnoha sloučenin. Vzhledem k tomu, že urychluje růst révy vinné, bývá jeho používání přirovnáváno k ovládání plynového pedálu při jízdě autem. Působí příznivě i na plodnost révy, pokud je ve vyrovnaném poměru s ostatními živinami. Je složkou chlorofylu a spoluzajišťuje tak přeměnu sluneční energie na energii chemickou, je stavebním kamenem všech aminokyselin, ze kterých se tvoří bílkoviny. V hnojivech se vyskytuje ve formě amoniakální (čpavkové) NH4+, kterou rostliny více přijímají na alkalické půdě. Pro tvorbu bílkovin se musí v pletivech tato forma vázat na glycidy, protože již malé přebytky amoniakální formy jsou pro buňky toxické. Dále se dusík vyskytuje v ledkové formě (dusitanové, dusičnanové) NO2- či NO3-. V této formě se může ukládat i v buňkách a neškodí jim. Pro tvorbu bílkovin se musí redukovat na formu NH4+. Dále může být v hnojivech ve formě anodické (močovina) NH2-, kterou nemůže rostlina přímo přijímat.

2.1.1.1 Nedostatek dusíku Nedostatek dusíku se na révě projeví světle zelenožlutým zbarvením listových čepelí, červenavým zbarvením os letorostů, které zůstávají slabé a jejich vrcholky jsou vzpřímené. Též listové řapíky mají načervenalé zbarvení, listové čepele jsou malé, stejně jako hrozny. Růst je pomalý, asimilace nízká, a proto je i cukernatost nízká. Jakost vína trpí nízkou extraktivností.

2.1.1.2 Nadbytek dusíku Naopak nadbytek dusíku se projeví hlavně zjemněním pletiv na celé rostlině. Proto se zvyšuje vnímavost k napadení houbovými chorobami a snižuje se vzdornost proti 10

Teoretická část suchu a mrazu. Vyzrálost dřeva se zhoršuje, zvyšuje se sprchavost a projevuje se vadnutí i hnití třapiny a hnití bobulí.

2.1.1.3 Interakce s jinými živinami Interakce s jinými živinami se projevuje v tom, že dusík podporuje příjem fosforu, pokud se dává v mírných dávkách. Vysoké dávky dusíku brzdí příjem fosforu, což lze využít při přehnojení fosforem. Vysoká hladina draslíku v révě podporuje příjem dusíku. Je-li obsah draslíku v půdě nízký, pak jeho příjem brzdí vyšší dávky dusíkatých hnojiv a současně se málo využívají amoniakální hnojiva. Dáváme-li vyšší dávku síranu draselného, pak je lepší použít dusík v amonné formě. Jinak k draselné soli lze využít dusičnany. NH4+ forma je antagonistou k hořčíku, který se těžko přijímá na písčitých půdách, proto na těchto půdách musíme hnojit především ledkovým dusíkem, abychom nezvyšovali nedostatek hořčíku. Při větším nadbytku dusíku může vzniknout nedostatek bóru. Síran amonný používáme hlavně na vápenitých půdách, protože se při jeho použití spotřebovává vápník. Ledek vápenatý používáme hlavně na kyselých a suchých půdách, protože forma NH4+ zvyšuje příjem vody a to hlavně tehdy, kdy se současně přijímá chlór. Ledek se však vymývá z půdy rychleji než síran amonný.

2.1.1.4 Příjem dusíku Příjem dusíku je závislý nejen na velikosti úrody, ale též na velikosti keřů. Dále jsou velké rozdíly mezi podnožemi a mezi naštěpovanými odrůdami, stejně jako mezi různými stanovišti. Dusík se přijímá a nejvíce potřebuje před rašením a při počátečním růstu letorostů, dále po odkvětu při nasazování a růstu bobulí a v menší míře při zaměkávání bobulí.

2.1.1.5 Dávkování dusíku Dávkování dusíku se řídí obdobím potřeby a vododržnosti půdy, jakož i odrůdou. V hlinitých půdách můžeme používat močovinu, dále síran amonný, který se rozmetává v předjaří. Obě hnojiva se mohou ve vododržných půdách použít v celé dávce najednou. Používáme-li ledek amonný s vápencem, pak dáváme v těžké půdě 2/3 dávky zjara a 1/3 po odkvětu. V lehké štěrkovité půdě dáme 1/2 dávky zjara a 1/2 dávky po odkvětu. Velmi opatrně hnojíme dusíkem odrůdy ‘Neuburské’, ‘Sauvignon’, ‘Tramín’ a ‘Veltlínské červené rané’, které rostou bujně a využívají dusík lépe než ostatní odrůdy, 11

Teoretická část což platí především o ‘Neuburském’. Při nízké potřebě dusíku (bujné odrůdy, vododržná půda) dávkujeme zjara 30 kg dusíku na hektar (tj. 10 kg ledku amonného s vápencem na 1000 m2 vinice). Druhá dávka dusíku se dává v době před odkvetením révy, tak aby se účinek dusíku projevil po nasazení bobulí. Většinou se doporučuje paušální dávka 20 kg na 1 ha (tj. 10 kg ledku vápenatého na 1000 m2 vinice), která se dává ve formě rychle působícího ledku vápenatého. Protože se obsah dusíku v půdě rychle mění, nemůžeme se opírat o půdní rozbor a dávky musíme volit do značné míry podle pozorování růstu a úrodnosti. Kdybychom se chtěli blíže informovat o správnosti postupu, museli bychom kontrolovat příjem dusíku pomocí listové diagnostiky.

2.1.1.6 Vliv na jakost vína Na jakost vína působí dusík příznivě tím, že se zvyšuje extraktivnost a plnost vín, stoupá výtěžnost moštu, ale zvyšuje se i obsah bílkovin a množství zákalů.12

2.1.2 Evoluce dusíkatých látek v hroznech Zásoby révy dusíkatými látky obstarává jak phloem (lýko), tak xylem (dřevo) rostliny. Transport dusíku v révě se neodmyslitelně odehrává ve formě amonných iontů nebo aminokyselin. Nitráty se vyskytují spíše zřídka z důvodu jejich rychlé redukce v kořenovém a listovém systému. Glutamin reprezentuje okolo 50 % organického dusíku. Z pohledu dusíkatých látek existují dvě důležité syntézy v tvorbě hroznů. První v období tvorby bobulí a druhá v období zaměkávání bobulí a konce zrání. Těsně před koncem zrání může koncentrace dusíku opět stoupnout. Při sběru je polovina dusíku v rostlině obsažena v bobulích. Pokud jsou hrozny nezralé reprezentuje více než polovinu dusíkatých látek amonný ion. Od zaměkávání bobulí potom koncentrace amonných iontů klesá, přičemž roste koncentrace organických dusíkatých látek. Množství volných aminokyselin během zrání roste 2 až 5 násobně, dosahujících 2 – 8 g.l-1 jako ekvivalentu leucinu. Ve zralém moštu reprezentují aminokyseliny 50 – 90 % celkového dusíku. Syntéza amonných kationů s α – ketoglutarovou kyselinu tvoří asimilační cestu dusíkatých látek v hroznech. Tato syntéza je katalyzována enzymy glutamin syntetázou a glutamát dehydrogenázou. Ostatní aminokyseliny jsou syntetizovány přesunem dusíku z kyseliny glutamové na příslušné uhlíkaté skelety. 12

Teoretická část Při zpracování zralých hroznů tvoří arginin 6 – 40 % celkového dusíku moštu a je tudíž dominantní aminokyselinou. Ve skutečnosti hraje velice důležitou roli v metabolismu dusíkatých látek uvnitř bobulí (viz Graf 1). Existuje blízké spojení mezi argininem a jinými aminokyselinami (ornithinem, aspartovou a glutamovou kyselinou či prolinem). Ve výsledku může během zrání transformací argininu hladina prolinu stoupnout 25 – 30-krát. Navíc aspartová kyselina ovlivňuje rezervu kyseliny oxaloctové, která se podle potřeby mění během zrání na kyselinu jablečnou nebo cukry. Zrání je také doprovázeno aktivní syntézou proteinů. Koncentrace rozpustných proteinů dosahuje maxima před úplnou zralostí a potom pozvolna klesá. Množství proteinů se tak může v moštu pohybovat v rozmezí 1,5 – 100 mg.l-1. Koncentrace vysokomolekulárních nerozpustných proteinů, součástí buněčných stěn, je vysoká od počátku vývoje bobulí a růst pokračuje i během zrání. Mošt ze zralých hroznů obsahuje sotva 20 % celkového dusíku bobulí. Zbytek zůstává ve slupkách a zrncích, ačkoli se ke konci zrání mění v rozpustnou formu dusíku (amonné ionty a aminokyseliny).

Graf 1: Úloha argininu v metabolismu dusíku bobulí.

2.1.2.1 Celkový dusík Obsah celkového dusíku (vyjádřeno v g.l-1 dusíku) v hroznovém moštu slouží jako ukazatel zralosti v závislosti na ročníku. Může se rok od roku lišit i čtyřnásobně 13

Teoretická část v závislosti na odrůdě révy a oblasti pěstování. Například v oblasti Champagne je obsah dusíku v moštech z bílých odrůd dvou až třínásobný než v oblasti Bordeaux. Tento fakt má potom jistě za důsledek rozdílný přístup k fermentaci.13 Dusíkaté látky, které nejsou spotřebovány během fermentace, pak logicky zůstávají ve víně, kde jsou potom součástí bezcukerného extraktu. Obecně mají červená vína v průměru téměř dvojnásobné množství dusíku oproti vínům bílým. Je to způsobeno technikou zpracování, zahrnující vyšší teplotu macerace, která evokuje snadné uvolňování dusíkatých látek ze slupek a semen. Váha dusíkatých sloučenin ve víně, počítána aproximativně s použitím empirického koeficientu 6,25, je v rozmezí 0,5 až 4,0 g.l-1. To znamená, že u suchých vín můžou tyto látky reprezentovat až 20 % bezcukerného extraktu.

2.1.2.2 Minerální dusík Minerální dusík, ve formě amonných solí, je během růstové fáze nejběžnější formou v dužině bobulí. Amoniakální dusík reprezentuje 80 % celkového dusíku vznikajícího přeměnou dusíkatých látek asimilovaných kořeny rostliny. Má dominantní vliv na změnu barevnosti bobulí a jeho koncentrace začíná rapidně klesat s počátkem transaminačních reakcí. V Krebsově cyklu a prodýcháváním cukrů vzniká velké množství α-ketokyselin, jejichž aminace vede k formování mnoha dusíkatých organických látek (viz 2.1.2 Evoluce dusíkatých látek). Jakmile jsou hrozny plně zralé, minerální dusík reprezentuje méně než 10 % celkového dusíku. Amonné ionty jsou nejsnadněji využitelným zdrojem kvasinek. Jejich koncentrace rapidně ovlivňuje dynamiku, se kterou mošt začíná fermentovat stejně jako potenciál samotné fermentace. Tato forma dusíku ke konci alkoholové fermentace obvykle úplně zmizí. V případě, že koncentrace amonných iontů v moštu je nižší než 50 mg.l-1 se pro zajištění hladkého průběhu rozkvasu doporučuje přidat fosfát či sulfát diamonný v množství 10 g.hl-1. Systematické přidávání amonných solí bez analýz o nutnosti přídavku se silně nedoporučuje. Může totiž snadno dojít k tvorbě vína s nízkou koncentrací vonných látek, především vyšších alkoholů, jejich esterů a etylacetátů mastných kyselin.

14

Teoretická část Během školení a zrání na kvasnicích či po malolaktické fermentaci se může ve víně objevit několik desítek mg.l-1 anorganického dusíku. Bakterie účastnící se přeměny kyseliny jablečné na mléčnou neasimilují amonné ionty a ve skutečnosti je mohou i vylučovat.

Přesto

se

doporučuje

přidávat

fosfát

diamonný

v kombinaci

s thiaminpyrofosfátem do vín, u nichž zamýšlíme druhou fermentaci v uzavřeném tanku či láhvi.

2.1.2.3 Různé formy organického dusíku Existuje mnoho organických látek obsahujících dusík. V následující sekci jsou popsány nejdůležitější z nich.

1. Aminokyseliny s obecným vzorcem:

Aminokyseliny mají molekulární hmotnost pod 200 g.mol-1 a ve víně a moštu jich bylo identifikováno 32 (viz Tabulka 1). Aminokyseliny zaručují v moštu a víně pufrovou kapacitu.14 Tyto sloučeniny jsou velice užitečné kvůli jejich antioxidačním, antimikrobiálním, emulgujícím a povrchově aktivním vlastnostem.

15

Teoretická část Tabulka 1: Aminokyseliny v hroznech a víně

16

Teoretická část

17

Teoretická část Aminokyseliny jsou deriváty karboxylových kyselin, které obsahují ve svých molekulách jednu nebo několik aminoskupin. Z pohledu struktury jsou v moštu a víně, z přítomných 20 běžných aminokyselin s výjimkou γ – aminobutyrové kyseliny a β – alaninu, všechny α – aminokyseliny (karboxylová skupina a aminoskupina jsou vázány na stejný uhlík v řetězci). Aminokyseliny jsou tedy amfoterní sloučeniny. Podle schématu:

může být R vodík, jak je tomu v případě jedné aminokyseliny glycinu (glycocollu), prototypu aminokyseliny, jenž je součástí mnoha proteinů. Substituent R vázaný na Cα se označuje jako postranní řetězec a rozhoduje o individuálním charakteru aminokyseliny. Může to být také alifatický, aromatický nebo heterocyklický substituent, který může obsahovat další amino- a karboxylové skupiny. Aminokyseliny se rozdělují podle několika hledisek. Prvním kritériem je rozdělení na aminokyseliny kódované a nekódované (nestandardní). Kódované aminokyseliny jsou buď vázané, zabudované do molekul proteinů podle genetického kódu uchovávaného v DNA, nebo volné, které tvoří aminokyselinovou hotovost, tzv. pool. Nekódované aminokyseliny jsou často jednoduché deriváty základních 20-ti aminokyselin, jiné mají neobvyklou strukturu. Bývají důležitými složkami biologicky aktivních polypeptidů, jsou např. nervovými mediátory (glycin, kyselina γaminomáselná)

nebo

meziprodukty

různých

metabolických

pochodů

(např.

meziprodukty biosyntézy močoviny jako citrulin a ornithin). Biologický význam většiny nestandardních aminokyselin není přesně znám, ale jejich toxicita svědčí o jejich roli v ochraně organismu.15 Nejpoužívanější dělení aminokyselin je podle polarity jejich postranních řetězců; tak se rozlišují tři hlavní typy aminokyselin:

1) s nepolárním postranním řetězcem – jsou ve vodě méně rozpustné než ostatní a uplatňují se v hydrofobních interakcích bílkovin. Patří sem glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, methionin, prolin, fenylalanin a tryptofan

18

Teoretická část 2) s polárním nenabitým postranním řetězcem – mohou vytvářet vodíkové můstky. Řadí se sem serin, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin a cystein

3) s polárním nabitým postranním řetězcem – podílejí se na elektrostatických interakcích proteinů a) zásadité aminokyseliny, při fyziologickém pH kladně nabité – tj. lysin, arginin a histidin b) kyselé aminokyseliny, při fyziologickém pH záporně nabité – tj. kyseliny asparagová a glutamová.

Z biologického hlediska je důležité dělení aminokyselin na esenciální a neesenciální podle

schopnosti

organismu

danou

aminokyselinu

syntetizovat.

Esenciální

aminokyseliny musí živočichové bezpodmínečně získat s potravou. Při jejich nedostatečném příjmu dochází k vážným poruchám metabolismu a déletrvající nedostatek může končit smrtí. Živočišné organismy podle druhu potřebují 8 až 10 esenciálních aminokyselin. Pro člověka jsou to valin, leucin, isoleucin, lysin, threonin, methionin, fenylalanin a tryptofan. Histidin a arginin jsou postradatelné jen v dospělosti, v době vývoje v dětském věku jsou esenciální. Další dvě aminokyselin jsou podmíněně postradatelné pouze při dostatku esenciálních aminokyselin, z nichž se tvoří, a to tyrosin vznikající z fenylalaninu a cystein syntetizovaný z methioninu.16 Jsou-li v proteinu obsaženy všechny esenciální aminokyseliny, jde o tzv. plnohodnotný protein. Neesenciální aminokyseliny potřebuje organismus ke svému růstu, ale dovede je syntetizovat z esenciálních aminokyselin. U člověka mezi ně patří glycin, alanin, serin, citrulin, tyrosin, cystein, prolin, kyseliny asparagová a glutamová. Aromatické cykly tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu působí jako chromofory a absorbují ultrafialové záření v oblasti 260 – 300 nm. Toho se využívá při jejich analytickém důkazu a při stanovení jejich koncentrace v peptidech a proteinech. Chemické vlastnosti aminokyselin jsou závislé na funkčních skupinách obsažených v jejich molekule. Uplatňují se především aminoskupiny a karboxylové skupiny. V kyselém prostředí je disociace karboxylu potlačena a aminokyselina se chová jako zásada – aminoskupina poutá protony na volný elektronový pár a vzniká kation. V zásaditém prostředí je naopak podpořena disociace karboxylů – aminokyselina vytváří anion. Ve vodných roztocích se aminokyseliny chovají jako amfoterní

19

Teoretická část elektrolyty. Na základě ionizace kyselé nebo bazické skupiny, aminokyseliny vyjadřují ve dvou rovnováhách. Jsou úplně disociovány (kromě aromatických aminokyselin). Disociace jednotlivých skupin závisí na pH. Při určitém pH se kladný náboj aminoskupiny vyrovná náboji karboxylu a celkový náboj molekuly je nulový. Je to tzv. izoelektrický bod pI a aminokyselina se nachází v tzv. izoelektrické formě, což je vlastně bipolární ion (amfion), navíc má aminokyselina minimální rozpustnost a nemigruje v elektrickém poli, třeba u elektroforézy. Různé náboje v molekule aminokyselin při daném pH se dá využít v separaci a stanovení pomocí iontoměničů.

V jiných aminokyselinách je uhlík spojený se skupinou, která je chirální. Toto spojení dává asymetrickou vlastnost běžnou pro většinu biologicky důležitých látek: optickou aktivitu. Všechny přírodní aminokyseliny jsou opticky aktivní a podle stáčení polarizovaného světla se označují L - a D - aminokyseliny. Optická aktivita závisí na typu postranního řetězce, ale také na rozpouštědlu či pH roztoku. Existují aminokyseliny nesoucí tři funkční skupiny. Záleží jestli je v postranním řetězci obsažena kyselá nebo bazická skupina. Kyselina aspartová a glutamová jsou kyselé aminokyseliny, zatímco lysin, histidin, ornithin, citrulin a arginin jsou aminokyseliny bazické. Jiné aminokyseliny s více funkčními skupinami nejeví bazický nebo kyselý charakter. Obsahují hydroxyskupinu (serin, threonin a tyrosin), thiolovou nebo sulfidickou skupinu (cystein a methionin). Pouze aminokyseliny se třemi funkčními skupinami jsou zapojeny do katalytických vlastností enzymů. Je to překvapující skutečnost, že jenom několik málo aminokyselin je odpovědných za aktivitu enzymů, při jejich tak obrovském množství.

2.

Oligopeptidy a polypeptidy vznikají spojením určitým počtem aminokyselin

pomocí peptidické vazby.

20

Teoretická část

Oligopeptidy obsahují maximálně čtyři aminokyseliny. Polypeptidy mají vysokou molární hmotnost (pod 10 000 g.mol-1) a mohou být separovány pouhou filtrací (ultrafiltrací, mikrofiltrací či nanofiltrací) a reprezentují majoritního dusíkatého zástupce ve víně. Některé malé peptidy mají také příjemné senzorické vlastnosti, které jsou ku prospěchu výroby vín. Dusík ve formě oligopeptidů není v moštu či víně lehce stanovitelný. Oligopeptidy v sobě obsahují dusík maximálně ze čtyř aminokyselin. Klasickým a nejdůležitějším zástupcem je tripeptid glutathion. Je známo, že mléčné bakterie obsahují aminopeptidázy, díky kterým jsou schopny asimilovat některé oligopeptidy, speciálně tripeptidy.17 Tyto sloučeniny mají organoleptické vlastnosti ovlivňující chuť vína, ale další studie se tímto problémem nezabývaly.

3. Proteiny

jsou

makromolekuly

vzniklé

spojením

velkým

množstvím

aminokyselin. Jejich molární hmotnost je nad 10 000 g.mol-1 a jejich struktura obsahuje krom peptidické vazby i postranní vazby, které vytváří třírozměrné struktury: sférickou, helix, apod. Hrozny a následně víno obsahují mnoho proteinů s širokým rozsahem molární hmotnosti (30 000 – 150 000 g.mol-1). Některé nestabilní proteiny jsou zodpovědné za zákaly v bílých vínech. Jiné proteiny se spojují s frakcemi sacharidů, např. mannoproteiny či isolektiny, identifikovány v moštu odrůdy Chardonnay.18

4. Amidy s obecným vzorcem:

21

Teoretická část

Tato kategorie je reprezentována malým množstvím asparaginu a glutaminu. Močovina je také počítána do této skupiny:

stejně jako ethylkarbamát:

který je velice přísně kontrolován z důvodu jeho vysoké zdravotní závadnosti.

Močovina je diamid kyseliny uhličité. Může být také považována za amid kyseliny karbamové. Další reakcí močoviny s amoniakem vzniká organický imid zvaný guanidin. Izomerace kyanátu amonného na močovinu představuje v živém organismu most mezi anorganickou a organickou chemií.

Močovina je bezbarvá tuhá látka s teplotou tání 132 °C a vysokou rozpustností ve vodě (1000 g.l-1) a etanolu (100 g.l-1). Má chemické vlastnosti amidů. Může být hydrolyzována na kyselinu uhličitou a amoniak.

Toho je ve velké míře využíváno v zemědělství a v mnoha chladících systémech. Má také velmi široký rozsah průmyslových využití. Močovina se stanovuje pomocí enzymu ureázy a následné detekce uhličitanu amonného. Víno obsahuje méně než 1 mg.l-1 a je jistě mikrobiálního původu. Močovina je z hlediska vinařství důležitá především jako prekurzor etylkarbamátu. Enzym ureáza se extrahuje z bakterie Lactobacillus fermentum. Předmět měření je redukce nadměrného množství močoviny ve víně, aby se předešlo vzniku etylkarbamátu. 22

Teoretická část Močovina je finální produkt metabolismu savců a představuje způsob odbourání dusíku z denaturovaných proteinů.

5.

Nukleový dusík je přítomny v purinových a pyrimidinových bázích,

nukleosidech a nukleotidech a nukleových kyselinách. Tato forma dusíku v moštu či víně zatím nebyla studována.

6.

V hexozách byl nalezen dusík ve formě aminoskupin vzniklých v cukrech

záměnou –OH skupiny za –NH2 - glukosamin a galaktosamin. 7.

Pyraziny jsou šestičlenné heterocykly obsahující dva dusíky a čtyři uhlíky.

Postranní uhlovodíkové řetězce často mění jejich velmi výrazné aromatické vlastnosti, které jsou zodpovědné například za aroma charakteristické pro ‘Cabernet Sauvignon’.

2.2

Asimilovatelný dusík v moštu a víně

Dusík asimilovatelný kvasinkami se dělí na amoniové ionty a volné aminokyseliny. Jeho obsah v moštech se pohybuje v rozmezí desítek až stovek mg N.l-1 (s optimem kolem 200) a většinou postačuje k tomu, aby mohla být fermentace úplná. Následující

sekce

obsahuje

dosavadní

znalosti

o

amonných

iontech

a

aminokyselinách vyskytujících se v hroznech potažmo moštu, jejich obvyklé koncentrace a principy jejich změn v souvislosti s dozráváním hroznů. Jsou diskutovány nejvíce zastoupené aminokyseliny a jejich variabilita v moštech. Další část se věnuje mechanismům asimilace, biosyntézy a degradace aminokyselin a amonných iontů uvnitř kvasinek. Taktéž jsou diskutovány důsledky těchto metabolismů, které probíhají během alkoholové fermentace či malolaktické fermentace a ovlivňují produkci nových látek ve víně.

2.2.1 Amonné ionty v moštu Obsah amonných iontů v hroznech byl od šedesátých let spojován s procesem dozrávání hroznů. Ukázalo se, že značně variuje v závislosti na klimatu, ročníku,

23

Teoretická část odrůdě, podnoži a oblasti pěstování. Koncentrace amonných iontů v moštu začíná nabírat na vážnosti především v teplých oblastech v případě přezrálého materiálu. Běžné hodnoty amonia se pohybují v rozmezí desítek až stovek mg.l-1.19 Množství amonných iontů v moštu může být použit jako indikátor rychlosti fermentace, jelikož slouží výhradně ke stavbě buněčných stěn kvasinek a tvorbě proteinů.20 Jejich obsah by neměl významně převyšovat množství potřebné k těmto procesům a to především z důvodů zdravotních. Při přebytku amonných iontů dochází k vzniku řady nežádoucích produktů jako jsou těkavé kyseliny, močovina apod.21,22

2.2.2 Aminokyseliny v moštu Aminokyseliny tvoří hmotnostně největší část celkového dusíku v moštu a víně. Volné aminokyseliny se pohybují v koncentraci 1 – 4 g.l-1, v závislosti na ročníku. Ve zralých hroznech aminokyseliny obvykle reprezentují 30 – 40 % celkového dusíku. Obvykle se ukazuje dominantní obsah některých aminokyselin v moštech, hlavně argininu, prolinu, α – alaninu, serinu, kyseliny glutamové a její amidové formy glutaminu, který zajišťuje transport amonných iontů. Arginin a prolin jsou charakteristické pro jisté odrůdy. Prolin je nejvíce zastoupen u odrůd ‘Chardonnay’, ‘Cabernet Sauvignon’ a ‘Merlot’, naopak arginin dominuje v odrůdách ‘Pinot Noir’ a ‘Aligoté’. Na rozdíl od prolinu, arginin je bez větších problémů asimilován kvasinkami. Výsledky23 také demonstrují zvýšení volných aminokyselin během zrání. Koncentrace se od zaměkání po optimální zralost více než zdvojnásobí. Ačkoli se tento jev opakuje každý rok, nelze udělat jednoznačný závěr. Obsahy aminokyselin v období dozrávání často kolísají a potenciál fermentace neroste spolu se zralostí hroznů především kvůli koncentraci prolinu. Ve skutečnosti je potřeba provést mnohem detailnější analýzy jednotlivých aminokyselin a především prolinu a argininu. Obsah prolinu se dva týdny před sběrem rapidně zvýší. Z toho důvodu byly studovány nejvíce zastoupené odrůdy oblasti Champagne. Byla sledována korelace obsahu prolinu a poměru cukr/kyseliny, jako zralosti hroznů (IM).24,25 Korelace mezi těmito parametry byla formulována do následující rovnice.

24

Teoretická část

Prolin by mohl být znakem zralosti. Což může vysvětlovat také fakt snížení potenciálu fermentace při zralosti hroznů. V letech, kdy jsou hrozny dost zralé musí být mošt monitorován a může být zapotřebí přídavek fosfátu či sulfátu diamonného. To je důležité především u odrůd, kde je obsah prolinu vysoký, jako je například Chardonnay. U této odrůdy se může dva týdny před sběrem význačně zvýšit obsah prolinu a obsah argininu zůstává téměř stejný.

2.3

Utilizace asimilovatelného dusíku kvasinkami

Mimo aminokyselin z hroznů, které mohou být částečně nebo úplně metabolizovány kvasinkami během růstové fáze, jsou některé aminokyseliny produkovány kvasinkami na konci kvašení. Některé jsou uvolněny proteolýzou během autolýzy mrtvých kvasinek, jiné jsou produkovány enzymatickou degradací hroznových proteinů. Navíc jsou zdrojem živin pro bakterie během jablečno-mléčného kvašení. Obsah aminokyselin v moštu je závislý na hnojení, klimatických podmínkách a v neposlední řadě na původu hroznů. Během samotné fermentace pak mimo všechny tyto faktory z velké části závisí obsah aminokyselin na metabolismu kvasinek a podmínkách fermentace (kmen kvasinek, teplota, doba uložení na kvasnicích, přídavek amonné soli, apod.).9 Vývoj jednotlivých aminokyselin během fermentace a následně jejich složení v hotovém víně je také značně ovlivněno technologií. Například vína vyrobená v atmosféře CO2 obsahují méně kyseliny asparagové, serinu, alaninu, valinu, tyrosinu, lysinu a histidinu, ale podstatně více treoninu a citrulinu.26 Ohřev rmutu má velký vliv na celkový obsah dusíku v moštech, zejména na jeho biologický potenciál, tj. na schopnost prokvašení. Ohřevem se obsah celkového dusíku zvýší, obsah bílkovinného dusíku sníží. Je to způsobeno eliminací bílkovin teplem, jejich sloučením s tříslovinami nebo i štěpením proteolytickými enzymy. Ohřevem se uvolní dusík obsažený v semínkách a třapinách a přejde do moštu, tím se obsah celkového dusíku zvyšuje. Bílkovinný dusík se teplem eliminuje, takže jeho obsah klesá. Obohacení moštu sloučeninami dusíku se pokládá za přínos, protože se projeví zvýšeným biologickým potenciálem kvasinek. Ohřev rmutu při zpracování hroznů zvyšuje obsah téměř všech aminokyselin. 25

Teoretická část Vína z lisovaných hroznů mají vždy vyšší obsah dusíkatých látek než vína ze samotoků. Zvyšováním tlaku při lisování se zvyšuje i obsah dusíkatých látek. Rozdílné podmínky výroby vína (např. teplota a rychlost kvašení) mohou zvýšit obsah aminokyselin ve víně, vliv má i jablečno-mléčná fermentace.8 Jablečno-mléčná fermentace obvykle nastává na konci alkoholové fermentace, je to biologický proces odkyselování. Tento proces uskutečňují mléčné bakterie (Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus). Mnoho výrobců povzbuzuje tuto reakci očkováním čisté kultury, jejíž volba opět ovlivňuje utilizaci dusíkatých látek.27 Koncentrace aminokyselin se během jablečno-mléčné fermentace mění, u některých se koncentrace zvyšuje, u jiných snižuje. Vína po jablečno-mléčné fermentaci mají nižší koncentrace argininu, γ-aminomáselné kyseliny a methioninu.28 Podle některých autorů jablečno-mléčná fermentace koncentraci aminokyselin značně redukuje krom fenylalaninu a ornithinu, který vzniká z argininu působením mléčných bakterií, a následně se přeměňuje na prolin a močovinu.29 Jiní autoři tvrdí, že jablečno-mléčná fermentace neredukuje obsah tyrosinu a fenylalaninu.30 Důležité je také zda byla fermentace provedena apikulátními či ušlechtilými kmeny kvasinek.31 Odrůda, region a ročník ovlivňuje koncentraci aminokyselin, avšak alkoholová a jablečno-mléčná fermentace může tento znak zamaskovat. Z toho důvodu je autentifikace vín dle jednotlivých aminokyselin jen velmi obtížná a dosažitelná pouze při striktním dodržením stále stejné technologie. Aminokyselinový profil byl úspěšně využit při rozlišování původního šampaňského od šumivých vín. Celkový obsah aminokyselin je v šampaňském víně podstatně vyšší, kromě argininu.

2.3.1 Asimilační mechanismy dusíku Penetrace amonia a aminokyselin do těl kvasinek aktivuje množství membránových proteinových transportérů či permeas. S. ceravisiae má nejméně dva specifické přenašeče amoniových iontů.32 Jejich aktivita je inhibována několika aminokyselinami, v nekompetitivním chováním. Transport aminokyselin zajišťují dvě odlišné skupiny přenašečů: Obecná aminokyselinová permeasa (OAP) transportuje všechny aminokyseliny. Amonný ion inhibuje a zastavuje činnost OAP. OAP se proto uplatňuje během druhé

26

Teoretická část poloviny fermentace, kdy už mošt neobsahuje amonné ionty. Hraje tedy roli tzv. „dusíkového mrchožrouta“ ve smyslu likvidace zbylých aminokyselin.33 Do druhé skupiny přenašečů patří specifické permeasy. S. ceravisiae má mnoho těchto specifických permeas pro aminokyselin (nejméně 11). Každá z nich zajišťuje transport jedné či několika aminokyselin. Na rozdíl od OAP avšak amonný ion nelimituje aktivitu těchto permeas. Od začátku „lag“ fáze během prvního stadia fermentace zajišťují tito přenašeči rapidní asimilaci aminokyselin obsažených v moštu.34

Glutamát

a

glutamin,

křižovatky

syntézy

aminokyselin,

nejsou

jedinými

asimilovanými aminokyselinami. Prakticky většina aminokyselin je z moštu vyčerpána během fermentace prvních 30 g cukru. Alanin a arginin jsou aminokyseliny nacházející se běžně v moštech. Kvasinky tyto aminokyseliny a amonný ion využívají až po vyčerpání ostatních aminokyselin, které jsou akutně zapotřebí. Mimoto, kvasinky masivně asimilují arginin pouze v případě vyčerpání všech amonných iontů z media. Někdy také nezkonzumují kys. γ-aminomáselnou. V drtivé většině nespotřebují ani prolin, ačkoli se v moštu vždy nachází. Během fermentace spotřebují kvasinky 1 - 2 g.l-1 aminokyselin. S blížícím se koncem fermentace kvasinky vylučují signifikantní, ale různé množství aminokyselin. Na konci alkoholové fermentace zbude několik set miligramů aminokyselin na litr, z čehož z pravidla více jak polovinu tvoří právě prolin. V protikladu s hexosami, které vnikají do těl kvasinek pomocí usnadněné difuse, amonium a aminokyseliny vyžadují aktivní transport. Jejich koncentrace v buňkách kvasinek je vyšší než v okolním mediu. Permeasy zajišťují transport molekul aminokyselin (nebo amonných iontů) s transportem protonů. Protony se pohybují směrem koncentračního gradientu, koncentrace protonů v prostředí je vyšší než v cytoplasmě. Aminokyseliny a protony jsou svázány do stejného transportního proteinu a prochází stěnou simultánně. Takový transport dvou látek stejným směrem se nazývá symport (viz Graf 2). Samozřejmě proton procházející stěnou musí být následně vyloučen, aby nedocházelo k okyselování cytoplasmy. Tento pohyb je opět proti gradientu koncentrace a vyžaduje tudíž energii. ATP-asa zajišťuje exkreci protonů přes plasmatickou membránu, známou jako protonová pumpa.

27

Teoretická část

Graf 2: Transport aminokyselin skrze plazmatickou membránu.

Etanol silně limituje transport aminokyselin. Modifikuje složení a vlastnosti fosfolipidů plasmatické membrány. Membrána se tak stává více permeabilní. Protony z prostředí masivně vnikají do cytoplasmy pomocí jednoduché difuse. ATP-asa v membráně musí rapidně navýšit svou aktivitu pro vyrovnání vnitrobuněčného pH. V okamžiku, kdy nastane tato situace je symport aminokyselin zastaven. Jinak řečeno, na začátku fermentace a do doby, kdy je koncentrace etanolu nízká, mohou kvasinky rapidně asimilovat aminokyseliny a koncentrovat je do vakuol pro jejich pozdější využití.35

2.3.2 Syntéza aminokyselin Amonné ionty a aminokyseliny nacházející se v moštu zásobují kvasinky dusíkem. Kvasinky také mohou aminokyseliny zpracovávat rovnou na skládání proteinů. Fixují amonný ion na uhlíkatý skelet získaný z metabolismu cukrů. Kvasinky tak využívají stejný reakční postup jako všechny organismy. Důležitou roli v tomto procesu hrají aminokyseliny glutamát a glutamin.36,37 NADP+ glutamát dehydrogenáza (NADP+ GDH), produkovaná genem GDH1, produkuje glutamát (viz Graf 3) z amonného iontu a molekuly kyseliny α-ketoglutarové, která je meziprodukt cyklu kyseliny citrónové. Kvasinky také vlastní NAD+ glutamát dehydrogenázu (NAD+ GDH), produkt GDH2 genu. Tato dehydrogenáza se uplatňuje

28

Teoretická část v katabolismu glutamátů. Doprovází inverzní reakci osvobozující amonný ion na syntézu glutaminu.

Graf 3: Inkorporace amonného iontu za vzniku glutamátu.

Aktivita NADP+ GDH je na maximu v případě, že je v mediu dostatečné množství amonných iontů jako zdroje dusíku. Aktivita NAD+ GDH je principiálně na maximu v případě, že zdroj dusíku bude glutamát. Glutamin syntetáza (GS) vytváří z glutamátu a amonného iontu glutamin. Tato amidace ovšem vyžaduje hydrolýzu molekuly ATP (viz Graf 4).

Graf 4: Syntéza glutaminu.

Během transaminačních reakcí slouží glutamát jako donor aminoskupiny v syntéze různých aminokyselin. Pyridoxal fosfát je transaminační kofaktor (viz Graf 5), je získáván z pyridoxinu (vitamin B6).

29

Teoretická část

Graf 5: Pyridoxal fosfát a pyridoxamin fosfát.

Uhlíkový skelet aminokyselin pochází z meziproduktů glykolýzy (pyruváty, 3fosfoglyceráty, fosfoenolpyruváty), Krebsova cyklu (α-ketoglutaráty, oxalacetáty) nebo z pentózo-fosfátového cyklu (ribóza 5-fosfát, erytróza 4-fosfát). Některé z těchto reakcí jsou velmi jednoduché, jako vznik asparátu nebo alaninu transaminací glutamátu na oxalacetát nebo pyruvát:

Oxalacetát + glutamát → aspartát + α-ketoglutarát

Pyruvát + glutamát → alanin + α-ketoglutarát

Ostatní biosyntézní cesty jsou komplexnější, ale stále probíhají v kvasinkách stejně jako ve zbytku živého světa. Aminokyseliny mohou být klasifikovány do šesti biosyntetických rodin v závislosti na jejich původu a uhlíkatém prekursoru (Graf 6).

30

Teoretická část

Graf 6: Biosyntézní cesty aminokyselin.

1.

Z glutamátu a α-ketoglutarátu je formován glutamin, prolin a arginin.

2.

Asparagin, methionin, lysin, treonin a isoleucin vznikají z aspartátu, který byl získán

z oxalacetátu.

adenosylmethioninu,

ATP který

může je

aktivovat

následně

methionin

za

vzniku

S-

demethylován

za

vzniku

S-

adenosylhomocysteinu. Hydrolýzou, která uvolní adenin vzniká homocystein. 3.

Pyruvát je počáteční látka při tvorbě alaninu, valinu a leucinu.

4.

3-fosfoglycerát vede k formaci serinu a glycinu. Kondenzace homocysteinu a serinu produkuje cystathionin, prekurzor cysteinu.

5.

Imidazolový cyklus histidinu vzniká z ribózy-5-fosfátu a adeninu ATP.

6.

Aminokyseliny obsahující aromatický cyklus (tyrosin, fenylalanin, tryptofan) jsou získávány z erytrozy 4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu. Tyto dvě sloučeniny jsou meziprodukty pentozového cyklu a glykolýzy. Jejich kondenzace formuje

31

Teoretická část shikimáty. Kondenzáty těchto sloučenin s jinou molekulou fosfoenolpyruvátu produkují chorismáty, prekurzory aromatických aminokyselin.38

2.3.3 Katabolismus aminokyselin Amonný ion je pro syntézu aminokyselin potřebných k produkci proteinů základní složkou, ale kvasinky ne vždy najdou potřebné množství ve svém prostředí. Naštěstí jsou schopny získávat amonium i z ostatních aminokyselin pomocí různých reakcí. Nejběžnější reakční cesta je přenos α-amino skupiny některé z dostupných aminokyselin na α-ketoglutarovou kyselinu za vzniku glutamátu. Tato reakce je katalyzována aminotransferasou či transaminasou jejichž složkou je pyridoxal fosfát (PLP). Glutamat je následně oxidativní cestou deaminován za vzniku NH4+ (Graf 7). Tyto dvě reakce mohou být následovně shrnuty: α-aminokyselina + NAD+ + H2O → α-ketokyselina + NH4+ +NADH + H+

Graf 7: Oxidativní deaminace aminokyselin, katalyzovaná transaminázou a glutamát dehydrogenázou.

Během transaminace je pyridoxal fosfát přechodně transformován na pyridoxamin fosfát (PMP). Aldehydická skupina PLP se váže na ε-amino skupinu lysinové části, která je aktivním centrem aminotransferasy. Tím vzniká meziprodukt (E-PLP) (Graf 8).

32

Teoretická část

Graf 8: Úloha pyridoxal fosfátu v transaminačních reakcích.

α-Aminoskupina aminokyseliny nahradí ε-amino skupinu navázanou na PLP. Rozštěpením tohoto meziproduktu pak vzniká PMP a keto-kyselina, odpovídající zúčastněné aminokyselině. PMP následně může cyklem reagovat s jinou keto-kyselinou za vzniku nové, potřebné aminokyseliny a současně se regeneruje na PLP. Tyto reakce mohou být shrnuty do následujícího schématu:

Aminokyselina 1 + E-PLP → keto-kyselina 1 + E-PMP

Keto-kyselina 2 + E-PMP → aminokyselina 2 + E-PLP

V souhrnu:

Aminokyselina 1 + keto-kyselina 2 → keto-kyselina 1 + aminokyselina 2

Některé aminokyseliny jako jsou serin a threonin obsahují hydroxylovou skupinu na β-uhlíku a mohou být přímo deaminované dehydratací. Tuto reakci katalyzuje dehydratasa za vzniku příslušné keto-kyseliny a amonia (Graf 9).

33

Teoretická část

Graf 9: Deaminace serinu pomocí dehydratázy.

2.3.4 Důsledky utilizace dusíku Tak jako u všech organismů i u kvasinek je velmi důležitá povaha jejich výživy. Na základě dostupnosti výživy a podmínek utilizace dusíku je kvasinkami produkováno velké množství látek značně ovlivňující finální produkt – víno. Některé z těchto látek nesou pozitivní charakter a jiné mohou být zdrojem organoleptických defektů39,40

2.3.4.1 Vznik sirnatých látek

Nejběžnější vadou vína související se stresem kvasinek je zápach a chuť po sulfidech a merkaptanech známých pod pojmem „sirka“.41 Nejčastěji jde o produkci sulfanu neboli sirovodíku připomínajícího zápach shnilých vejcí. Je jasné, že jde o produkt metabolismu sirnatých látek. Ačkoli vznik této vady vína je stále předmětem diskuzí, již desítky let je známo, že v případě nedostatku asimilovatelného dusíku je riziko vysoké (viz Graf 10).42

34

Teoretická část

-1

Graf 10: Lineární a nelineární regrese vývoje H2S (µg.l ) v závislosti na koncentraci volného -1 42 amino-dusíku (mg.l ) během fermentace.

Další známou příčinou této vady je redukce síranových a siřičitanových aniontů na sulfidy během alkoholové fermentace (viz Graf 11). Tento jev je opět doprovázen nedostatečnou výživou kvasinek. Dle některých prací43 je zásadní především koncentrace amonných iontů a methioninu v médiu.44

35

Teoretická část

Graf 11: Koloběh sirnatých látek v buňce kvasinky.

2.3.4.2 Vznik vyšších alkoholů a esterů Alkoholy s více než dvěma atomy uhlíku jsou známy jako vyšší alkoholy. Několik z nich jsou vyráběny v průběhu fermentace a dosahují koncentrace v řádu 150 - 550 mg.l1 45

. Tyto alkoholy a jejich estery mají velmi intenzivní vůně, které hrají důležitou roli v

36

Teoretická část aroma vína. V přirozené koncentraci (méně než 300 mg.l-1) přispívají k aromatické složitosti vína. Ve vyšším obsahu maskují potenciál vína. Jinak je tomu v případě fenyletanolu jehož vysoká koncentrace je žádána pro jeho krásnou květnatou vůni. Estery těchto alkoholů mají často příjemné ovocné a květinové vůně podílející se především na aroma mladých vín. Kvasinky mohou vylučovat keto-kyseliny vzniklé z deaminace aminokyselin pouze po jejich dekarboxylaci na aldehydy a následné redukci na alkoholy (Graf 12). Tento mechanismus, známý jako Ehrlichova reakce, vysvětluje vznik vyšších alkoholů ve víně. Tabulka 2 ukazuje některé vyšší alkoholy a jejich korespondující aminokyseliny, jako prekursory těchto alkoholů.

Graf 12: Formování vyšších alkoholů z aminokyselin (Ehrlichova reakce).

Několik experimentů však jasně ukázalo, že za vznik vyšších alkoholů ve víně není zodpovědná pouze reakční cesta degradace aminokyselin. Nejméně propan-1-ol a butan1-ol

nemají

prekursory

v aminokyselinách,

sic

jsou

ve

víně

obsaženy

v nezanedbatelném množství. Navíc syntézy některých aminokyselin neprodukují odpovídající vyšší alkoholy, ačkoli jsou tyto aminokyseliny v mediu obsaženy. Není žádný jasný vztah mezi množstvím aminokyselin v moštu a množstvím odpovídajících vyšších alkoholů ve víně. Objevilo se, že vyšší alkoholy produkované kvasinkami jsou spojeny nejen s degradací aminokyselin, ale také se syntézou keto-kyselin. Tyto keto-kyseliny jsou získávány při metabolismu cukrů. Například již zmíněný propan-1-ol nemá korespondující aminokyselinu. Je totiž produkován z α-ketomáselné kyseliny, která může vznikat z pyruvátu a acetyl koenzymu A. α-Ketoisokaproát je prekursor isoamylalkoholu a meziprodukt syntézy leucinu, který může být produkován také z αacetolaktátu získaného z pyruvátu. Některé zdroje uvádí, že většina vyšších alkoholů ve víně je formována při metabolismu cukrů bez zapojení aminokyselin46 jiné to popírají.47 37

Teoretická část Tabulka 2: Vyšší alkoholy, jejich koncentrace ve víně a prekurzory vzniku.

Fyziologická funkce vyšších alkoholů produkovaných kvasinkami není zcela jasná. Je možné, že jde pouze o zbytky metabolismu cukrů, detoxikační proces vnitrobuněčného media nebo způsob regulování metabolismu aminokyselin. S výjimkou fenyletanolu, který má ve vůni charakter růží, vyšší alkoholy nevoní sami o sobě příliš vábně. Většina, jako třeba isoamylalkohol, má těžký odér rozpouštědel. Methionol je zvláštní alkohol, protože obsahuje atom síry. Vůní připomíná vařené zelí a má nejnižší práh citlivosti (1,2 mg.l-1). Může být zodpovědný za 38

Teoretická část mnoho zápachů a reduktivních vad aroma vína. Obecně by se vinaři měli vyvarovat přílišného množství vyšších alkoholů ve víně, nicméně jejich přiměřená koncentrace je neodmyslitelnou součásti komplexnosti aroma vína. Naštěstí jejich organoleptický dopad je omezený jejich obvyklou koncentrací, ale zaleží také na celkové aromatické intenzitě vína. Například nadměrný výnos či déšť v období dozrávání hroznů může naředit mošt, což ve vůni vede k nízké koncentraci příjemných aromatických látek a těžkému charakteru vyšších alkoholů. Parametry, které mají dopad na vysokou produkci vyšších alkoholů jsou dobře známy: Vysoké pH, rostoucí teplota fermentace, přílišné množství vzduchu při kvašení. Při výrobě červeného vína, kdy dochází k luhování rmutu, rostoucí teplotě a přístupu kyslíku, nelze vznik vyšších alkoholů omezit. Při výrobě bílého vína teplota fermentace do 22 °C zamezuje tvorbě vyšších alkoholů. Nedostatek amonných iontů a aminokyselin v moštu paradoxně vede také k přehnanému formování vyšších alkoholů. V těchto podmínkách musí kvasinky pečlivě využívat veškerý dusík dostupný z transaminačních reakcí. Zbylé uhlíkové skelety jsou pak po řadě reakcí vyloučeny ve formě vyšších alkoholů. Odkalení moštu obecně vede k omezení vzniku vyšších alkoholů. Další faktory ovlivňující vznik vyšších alkoholů je druh kvasinek. Jisté typy, jako je Hansenula anomala jsou dlouho známy jako producenti vyšších alkoholů, především v aerobních podmínkách.48 Ukázalo se, že S. bayanus (krom uvarum) produkují prokazatelně vyšší množství fenyletanolu než S. cerevisiae, u kterých záleží také na druhu.49 Produkce vyšších alkoholů (vyjma fenyletanolu) by mělo být jedním z kritérií selekce dalších kvasinek.46 V důsledku esterifikační aktivity produkují kvasinky také řadu esterů (řádově mg.l-1). Nejdůležitějším z těchto acetátů jsou isoamylacetát (banánové aroma) a fenyletylacetát (aroma růží). Etylestery středně dlouhých mastných kyselin sem také patří, ačkoli tvorba těchto esterů není spojena s metabolismem dusíku. Ty jsou formovány kondenzací acetylkoenzymu A. Tyto estery mají daleko zajímavější aroma než ostatní. Hexanoát má květnato-ovocné aroma připomínající zelené jablíčko. Etyldekanoát má odér mýdla. Při výrobě bílého vína lze zvýšit produkci těchto esterů snížením teploty fermentace a zvýšením čistoty moštu. Jistý typ kvasinek (71B) produkuje širokou paletu těchto sloučenin, což přispívá ke kvasnému charakteru mladých vín. Estery jsou však

39

Teoretická část během prvního roku zrání v láhvi rapidně hydrolyzovány a nemají pak velký vliv na charakter bílého vína.

2.3.4.3 Vliv asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin Těkavé kyseliny a acetáty, jsou důležitou součástí aroma vína. Jejich zvýšená koncentrace může negativně ovlivnit kvalitu vína. Množství těkavých kyselin produkovaných během kvašení se pohybuje v mezích 0,25 – 0,5 g.l-1, ale může být mnohem vyšší díky různým podmínkám fermentace, například špatnému zdravotnímu stavu hroznů nebo oxidačním prostředím. Asimilovatelný dusík ovlivňuje také množství těkavých kyselin ve víně. Bylo zjištěno, že obsah glycerolu je od obsahu dusíku nezávislý.50 Ke studiu vlivu dusíku na těkavé kyseliny ve víně bylo použito 12 různých moštů s vysokou cukernatostí, které byly zakvášeny v laboratorních podmínkách. Asimilovatelný dusík na začátku fermentace ovlivnil množství vzniklých těkavých kyselin, především kyseliny octové (viz Graf 13).

50

Graf 13: Vliv asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin.

Dále se v práci uvádí nový poznatek o optimálním přidaném množství amonných iontů. Přidáním síranu amonného na koncentraci 210 mg N.l-1 lze snížit množství vznikajících těkavých kyselina o 40 % oproti neošetřenému moštu. Navíc v případě neopatrného a přehnaného přídavku výživy na koncentraci 300 mg N.l-1 se sice docílí

40

Teoretická část velmi rychlého průběhu fermentace, avšak za cenu vyššího množství těkavých kyselin (viz Graf 14).

50

Graf 14: Vliv přídavku dusíku na obsah těkavých kyselin.

Další z vlivů přídavku asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin je správné načasování. Pokud se přidá potřebné množství výživy na začátku fermentace, sníží se obsah vznikajících těkavých kyselin okolo 20 - 30 %. Pokud však přijde přídavek výživy až ve stacionární fázi, dojde k nárůstu rychlosti fermentace, ale množství těkavých kyselin se neredukuje ba naopak hrozí jejich nárůst.50

2.3.4.4 Vznik biogenních aminů Bioaminy nebo-li biogenní aminy, vzorcem R – NH2, jsou také sledovány z důvodu zdravotní závadnosti na člověka (histamin). Již od dob Hippokrata jsou biogenní aminy nebo-li bioaminy považovány za zdraví škodící látky. Jejich hlavní výskyt je v jídlech a nápojích produkovaných mléčnými bakteriemi, jako jsou třeba sýry, sušené salámy, jablečné víno a pivo. Byly také nalezeny v nesprávně skladovaných potravinách jako jsou ryby a maso. Ze všech látek spadajících do této skupiny je především histamin hlavním cílem kontrol. Histamin způsobuje alergické reakce a bolesti hlavy. Vína ho

41

Teoretická část obsahují řádově jednotky či desítky mg.l-1 a i takové koncentrace jsou v některých evropských zemích zakázány.

Dnes existují analytické metody identifikující a stanovující až dvacet bioaminů současně.51,52 Toto uspořádání umožňuje detailní zkoumání těchto sloučenin s cílem odstranění jejich možný negativní vliv po požití vína. Z biochemického pohledu vznikají bioaminy dekarboxylací aminokyselin pomocí aktivity enzymu zvaného dekarboxyláza.53 Tento proces se děje výhradně za přítomnosti pyridoxal fosfátu, který obsahují kvasinky a některé druhy bakterií. Biogenní aminy tak vznikají pouze při fermentaci. Jistý druh bakterií jako jsou Pediococcus nebo Lactobacillus tímto enzymem disponují. Mohou ho však také syntetizovat indukčně v přítomnosti nějakého prekurzoru. Arginin je jedním z častých prekurzorů některých bioaminů. Graf 15 ukazuje dekarboxylaci arginindekarboxylázou za vzniku agmatinu, prekurzoru bioaminu putrescinu. Ornithin může být přímí prekurzor putrescinu a zapříčiňovat tak vznik dalších dvou bioaminů, sperminu a spermidinu. Arginin je tak přímí či nepřímí prekurzor čtyř biogenních aminů. Krom zmíněných bioaminů jsou přítomni ve víně ještě methylamin, dimethylamin, ethylamin, hexylamin, isopentylamin, piperidin, propylamin, pyrolidin a tryptamin. Vína u kterých proběhla malolaktická fermentace mají obsah biogenních aminů logicky vyšší než vína, u kterých malolaktická fermentace neproběhla. Běžná koncentrace bioaminů ve víně je do několika desítek mg.l-1.54,55 Histamin se objevuje ve víně již během alkoholové fermentace, ale jeho obsah se zvyšuje především během malolaktické fermentace. Neexistuje žádná korelace mezi obsahem histidinu v moštu a obsahem histaminu ve víně. Ačkoli vína obsahují několik mg.l-1 histaminu, koncentrace histaminu u některých vín přesahuje 10 mg.l-1, což je v rozporu s legislativou některých států. Přesný důvod a podmínky zodpovědné za vznik většího

množství

histaminu

ve

víně

zatím

není

docela

dobře

známí.

Nejpravděpodobnější vysvětlení zatím stojí na přítomnosti určitých druhů bakterií, které mají vysoký obsah histidindekarboxylázy.

42

Teoretická část Jak se dá očekávat ošetření vína 50 g.hl-1 bentonitu výrazně snižuje koncentraci bioaminů. Toto ošetření je částečně účinné z důvodu kladného náboje aminů při pH vína a negativním náboji bentonitu.

43

Teoretická část

Graf 15: Role argininu při syntéze biogenních aminů.

44

Teoretická část

2.3.4.5 Vznik ethylkarbamátu Etylkarbamát je etylester kyseliny karbamové.

Jakkoli je kyselina karbamová nestálá a rozpadá se velice rychle na oxid uhličitý a amoniak, její estery jsou stabilní a nazývají se uretany. Ve vinařství, a obecně v jakémkoli kvasném průmyslu, je etylkarbamát považovaný za nezáviděníhodný karcinogen. Tento fakt je však zveličován médii. Etylkarbamát má ve vyšších dávkách také utišující a spánek indukující vlastnosti. V minulosti byla tato látka používána v potravinářském průmyslu a především do nápojů jako konzervační prostředek, ale nyní je již zakázán. Bylo napsáno mnoho prací na téma obsahu etylkarbamátu ve vínech z různých oblastí.56,57 Bylo zjištěno, že obsah etylkarbamátu se různí spolu s odrůdami, přehnaným hnojením ve vinici, ale tyto faktory nejsou příliš signifikantní. Vyšší obsah etylkarbamátu může být také způsoben technologií – vysokou teplotou při maceraci nebo neodstopkováním hroznů. Karbamát syntetizují kvasinky a obsahují také jeho prekurzory. Svou roli hrají také bakterie. Vína po malolaktické fermentaci mají vždy o několik µg.l-1 karbamátů více. Přitom nemají všechny druhy bakterií stejný vliv. Heterofermentativní bakterie rodu Oenococcus oeni produkují méně karbamátů než homofermentativní bakterie rodu Lactobacillus plantarum. Navíc byla nalezena korelace mezi koncentrací bioaminů a etylkarbamátu. Tyto negativní projevy bakterií jsou umocněny zvýšeným pH vína. Vliv na obsah etylkarbamátu má také skladování. Podmínky skladování a především teplota během distribuce a prodeje vín mohou způsobit zvýšení těchto nežádoucích látek. Za zvýšení koncentrace karbamátů ve starších ročnících vín je zodpovědná především močovina a některé aminokyseliny – arginin, citrulin apod.

45

Teoretická část

2.4

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace

2.4.1 Vliv asimilovatelného dusíku na stavbu buněčné stěny kvasinek Nízký obsah asimilovatelného dusíku má za důsledek sníženou rychlost průběhu fermentace.58,59 Limitující obsah asimilovatelného dusíku je zodpovědný za redukci tvorby buněčných stěn kvasinek a nepřímo tedy způsobuje sníženou schopnost glykolýzy. Tyto efekty také záleží na zdroji dusíku. Jako výborný zdroj dusíku jsou považovány amonné ionty, glutamin či asparagin. Naopak velmi špatné zdroje jsou prolin, který se v podstatě nespotřebovává a močovina.60 Kvasinky rychle odjímají dusíkaté látky z media a skladují je ve svých vakuolách pro pozdější využití. Předpokládá se, že tento způsob adaptace má význam v dalších fázích fermentace, kdy je již v mediu naakumulované větší množství etanolu, který má silné inhibiční účinky na transport aminokyselin. Chemické složení buněčných stěn záleží na kultivačních podmínkách a kompozici media. Uvádí se, že syntéza buněčné hmoty kvasinek je přímo úměrná množství asimilovatelného dusíku v mediu, dokud není obsah dusíkatých látek v kvasinkách na hranici 50 % jejich váhy. Také bylo zjištěno, že kvasinky dokáží syntetizovat veškeré proteiny z anorganického dusíku v podobě amonných iontů a organického uhlíku.61 Plasmatická membrána je místo prvotního kontaktu buňky s okolím a tudíž samotné přežití celé kvasinky závisí na flexibilní a adaptabilní kapacitě této membrány. V buněčných stěnách kvasinek je obsah mastných kyselin jeden z nejvíce variabilních faktorů, který je přímo ovlivněný především teplotou, výživou a rychlostí růstu. Studium vlivu asimilovatelného dusíku na množství mastných kyselin v membránách buněčných stěn kvasinek ukázalo, že v případě vysokého obsahu asimilovatelného dusíku v mediu se růst kvasinek směsí aminokyselin a amonia zpomaluje.62 Dále se zjistily rozdíly v obsahu nasycených a nenasycených mastných kyselin v závislosti na složení prostředí. V prostředí samotných amonných iontů či samotných aminokyselin bylo v membráně detekováno menší množství mastných kyselin s vysokým stupněm nenasycenosti, než v případě směsi aminokyselin a amonia. Vysoký stupeň nenasycenosti mastných kyselin v membráně je charakteristický pro tzv. suché

46

Teoretická část kvasinky, které jsou schopny zpracovat veškerý zkvasitelný cukr na alkohol i při vysokém procentu alkoholu v médiu.63

2.4.2 Vliv asimilovatelného dusíku na rychlost fermentace Asimilovatelný dusík je jedním z hlavních komponentů moštu, jenž je zodpovědný za rychlost a úplnost fermentace. Touto problematikou se v dnešní době zabývá velké množství studií, nicméně výsledky a tvrzení jsou mnohdy protichůdné. Studie kinetiky alkoholové fermentace čtyř komerčně dostupných kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae v syntetickém prostředí s vysokým obsahem cukru za různých počátečních koncentrací asimilovatelného dusíku ve formě amonných iontů (120 – 290 mg N.l-1) ukázala, že více než růst buněčné hmoty je ovlivněna rychlost spotřeby cukrů. Byly objasněny tři hlavní efekty na rychlost spotřeby cukrů. Pro maximální rychlost spotřeby cukrů existuje optimální počáteční koncentrace amonných iontů v médiu. Jestliže je koncentrace vyšší nastává inhibice.64 V poslední řadě bylo zjištěno, že rychlost spotřeby cukrů je úměrná počáteční koncentraci asimilovatelného dusíku. Ve všech případech spotřeba amonných iontů rostla s počáteční koncentrací a optimální nároky se pohybovaly mezi 0,62 až 0,91 mg N na gram cukru v závislosti na druhu kvasinek. U různých druhů kvasinek nebyla nalezena obecná korelace mezi rychlostí spotřeby cukru a nároky na dusík.65 Další zajímavá práce byla zaměřena na alkoholovou fermentaci běžící při konstantní rychlosti regulovanou přídavkem asimilovatelného dusíku a kontrolovanou produkcí oxidu uhličitého. Během regulační periody byl držen obsah dusíku v buňkách kvasinek, a tím i aktivita, na konstantní hodnotě. Tímto způsobem upravená fermentace sloužila k porovnání efektivnosti přídavku různých aminokyselin během stacionární fáze. Výsledky byly porovnávány s předchozími studiemi.66,67,68 Jako předmět dalších studií byly vybrány aminokyseliny glycin, jehož asimilace byla překvapivě shledána velmi dobrou a methionin, který byl sice asimilován, nicméně ho bylo k udržení konstantní rychlosti fermentace, na rozdíl od jiných aminokyselin, potřeba signifikantně více.69

47

Teoretická část

2.5

Požadavky na výživu

2.5.1 Příjem dusíku Henschke a Jiránek70 analyzovali spousty teoretických prací na toto téma. Tyto práce byly uskutečněny ve velice širokém rozsahu podmínek a tak nejsou vždy úplně použitelné v praxi. Hroznový mošt obsahuje relativně vysokou koncentraci dusíkatých látek (0,1 – 1 g rozpustného dusíku na litr), ačkoli tato čísla reprezentují pouze čtvrtinu dusíku obsaženého v bobulích. Tyto látky tvoří amonné ionty (3 - 10 % celkového dusíku), aminokyseliny (25 - 30 %), polypeptidy (25 - 40 %) a proteiny (5 – 10 %). Koncentrace dusíku v hroznech závisí především na odrůdě, podnoži a podmínkách růstu – zvláště na hnojení. Je snížena v případě napadení plísní a v případě, že rostlina trpí suchem, které je obecně spíše pozitivní pro produkci kvalitních červených vín. Obsah dusíku v hroznech je velice variabilní i z hlediska hustoty a uspořádání výsadby. V přezrálých hroznech se může obsah dusíku zvýšit v důsledku snížení obsahu vody. Při výrobě suchých bílých vín ovlivňuje obsah amonných látek a bílkovin doba a způsob extrakce. Pomalé lisování a macerace slupek zvyšuje obsah extrahovaných látek a tím i látek dusíkatých.71 Kvasinky nezbytně potřebují přijímat dusík z moštu pro jejich růst. Amonné ionty jsou snadno asimilovatelné a můžou po syntéze nahrazovat jakékoli potřeby dusíkatých látek, především aminokyselin, avšak polypeptidy a bílkoviny neovlivňují růst S. cerevisiae dokud je nedokáží hydrolyzovat. S. cerevisiae nepotřebují přímo aminokyseliny při příjmu dusíkatých látek, dokud jsou schopny je individuálně syntetizovat. Přídavek aminokyselin však kvasinky stimuluje více než pouhé amonné ionty. Směs amonných iontů a aminokyselin se ukázal jako nejlepší zdroj dusíku. Kvasinky využívají aminokyseliny trojím způsobem:

1.

Přímou integrací bez transformace na bílkoviny.

2.

Ziskem aminoskupiny, která je dále použita na syntézu jiných látek obsahující tuto skupinu. Zbylý uhlíkový skelet je vyloučen. Takové reakce vedou k formování vyšších alkoholů ve víně.

48

Teoretická část 3.

Molekuly aminokyselin mohou být použity jako zdroj uhlíku v metabolických reakcích. Kvasinky zároveň zužitkovávají zbylý amoniakální dusík.

Asimilace různých aminokyselin závisí na fungování transportního systému a na systému regulace metabolismu.72 Vlivem různorodosti složení moštu nejsou výsledky vždy identické. Asimilace aminokyselin neznamená vždy růst těl kvasinek. Nejsnadněji asimilovatelné aminokyseliny nejsou nejvíce zastoupeny v buňkách kvasinek, nýbrž jsou nejlépe transformovatelné. Kvasinky mají obtíže asimilovat arginin pokud je jediným zdrojem dusíku, je však asimilován pokud je dodán ve směsi s ostatními aminokyselinami. Kvasinky ho nevyužívají pokud je ve směsi amonný iont.73 K eliminování obtížností spojených se složením moštu, Henschke a Jiranek70 uskutečnili experiment v modelovém prostředí. Jejich výsledky znamenaly nový způsob vnímání této problematiky. Ačkoli komplexní směs aminokyselin a amonných solí je efektivnější pro růst kvasinek a rychlost fermentace, v praxi jsou používány amonné soli pro zvýšení koncentrace dusíku v moštu a to především z důvodu jednoduchosti. Byly dosaženy pozitivní výsledky při laboratorních pokusech, ale jejich efektivita se ztrácí v praktických podmínkách. Navíc přídavek asimilovatelného dusíku není vždy řešením problematické finální fáze fermentace, i když akceleruje fermentaci v počátku. Velice dlouhou dobu byl jako amonná sůl používán fosfát amonný. Fosfátový ion vyskytující se také v metabolismu cukrů byl také považován za výhodu pro fermentaci. Ve skutečnosti je mošt dostatečně bohatý na fosfáty a z tohoto důvodu je výhodnější použití síranu amonného jako výživy kvasinek. EU reguluje přídavky obou solí na 30 g.hl-1, odpovídající množství 63 mg.hl-1 dusíku. V USA je limit 95 g.hl-1 fosfátu amonného. V Austrálii nesmí přídavek vést ke koncentraci fosfátů vyšší než 40 g.hl-1. Standardní množství je kolem 10 – 20 g.hl-1. 100 g amonných solí fosfátů či sulfátů obsahuje přibližně 27 g amonia a 73 g fosfátových a sulfátových iontů. Přídavek této formy dusíku zvyšuje aciditu, jelikož obsahuje silný anion. Přídavkem 10 g amonné soli na hektolitr může vzrůst kyselost moštu o 0,35 g.l-1 (ek. H2SO4) nebo o 0,52 g.l-1 (ek. kyseliny vinné). Počáteční koncentrace amonných iontů a aminokyselin v moštu je jeden z nejdůležitějších faktorů výživy. Pokud je koncentrace amonných iontů nižší než 25 mg.l-1, je nezbytné ho přidat. Vhodná je koncentrace mezi 25 a 50 mg.l-1. Nad tuto koncentraci nemá přídavek dusíku smysl. Je nepravděpodobné, že by přídavek ovlivnil

49

Teoretická část aktivaci fermentace. Pokud jsou hodnoty, vyjádřeny ve smyslu volného amino-dusíku (FAN – free amino nitrogen) detekovatelného pomocí ninhydrinu, mezi 70 a 140 mg.l-1, pak je pro úplnou fermentaci nezbytné mít koncentraci cukrů mezi 160 a 250 g.l-1.70 Bely a kol. (1990)58 zjistili, že přídavek dusíku byl efektivní, pokud byla koncentrace asimilovatelného dusíku pod 130 mg.l-1, ale naopak je-li vyšší než 200 – 350 mg.l-1, je další přídavek spíše škodlivý. Aernyho (1996)74 formaldehydový index umožnil jednoduché vyhodnocení množství volných aminokyselin a amonných iontů. Formaldehydový index rovný jedné odpovídá 14 mg.l-1 volného amino-dusíku. Podle Lorenziniho (1996)75 je přídavek dusíku do moštů švýcarských odrůd nezbytný pokud je index menší než 10 a doporučený index je 10 – 14. Formaldehydová metoda slouží jako rychlé a jednoduché zjištění asimilovatelného dusíku (mimo prolin). Tato metoda je často využívána pro monitorování zralosti a fermentace. U kvasinek S. cerevisiae požadavky na dusík variují druh od druhu, Julien a kol. (2000)76 tak navrhly test pro srovnání požadavků na dusík jednotlivých kmenů kvasinek S. cerevisiae během stacionární fáze fermentace. Během testu bylo měřeno množství dusíku potřebného na udržení konstantní rychlosti fermentace během stacionární fáze. Požadavky na dusík se lišil o násobek 2 – 26. Určení potřeby dusíku hraje důležitou roli při výběru druhu kvasinek použitých pro mošty s nedostatečným množstvím dusíku. Studie z Bordeaux z let 1996 až 2000, Masneuf a kol. (2000)77 naměřili množství dusíku 36 – 270 mg.l-1 v bílých moštech s nedostatkem u 22 % vzorků (množství menší než 140 mg.l-1). V červených 46 – 354 mg.l-1 s nedostatkem v 49 % vzorků a v rosé 42 – 294 mg.l-1 s nedostatkem v 60 % a 89 % u botrytických moštů. Choné (2000)78 analyzoval mošt odrůdy ‘Cabernet Sauvignon’ v roce 1997 a zjistil signifikantní rozdíly v množství dusíku, od 95 – 218 mg.l-1. Dokonce byly nalezeny rozdíly v koncentraci u moštů z rostlin v rámci jednoho vinohradu, 25 – 45 mg.l-1 nebo rozdíly v moštech z hroznů v rámci jedné silněji plodící rostliny, 152 – 294 mg.l-1. Všechna tato data ukazují výskyt a frekvenci nedostatku asimilovatelného dusíku v moštech, který je daleko běžnější, než se dříve předpokládalo, což je možné částečně přisoudit také technice obdělávání vinohradu. Obecně byla přijímána myšlenka, že množství dusíku v moštech ze severních vinohradů severní hemisféry (vlivem teploty, oceánského klima) je dostatečně vysoké. Přídavek dusíku je extrémně důležitý k zisku dobré kinetiky fermentace. V některých případech je dokonce výhodné použít více než 40 g.l-1 síranu amonného, což vyžaduje

50

Teoretická část změnu legislativy EU (povoleno do 30 g.l-1). Některé výzkumy ukázaly, že přehnané zvýšení množství dusíku může mít negativní vliv i na rychlost fermentace, proto je vhodné uzpůsobit množství přídavku podle množství dusíku přirozeně zastoupeného v moštu a ujistit se, že celkové množství nepřesahuje 200 mg.l-1. Přídavek nadměrného množství dusíku může zbýt jako zbytkový dusík po konci fermentace. Ačkoli na toto téma nejsou žádná dostupná data, zbylý dusík může mít negativní vliv na mikrobiální stabilitu vína. Přebytek amonného dusíku také může vést k modifikaci aroma vína, jelikož kvasinky nemají potřebu deaminovat aminokyseliny, za produkce vyšších alkoholů a jejich esterů jak bylo rozebráno v kapitole 2.3.4.2. To ovlivňuje aroma především bílých vín. Koncentrace cukrů v moštu ovlivňuje dopad dávkování dusíku na rychlost fermentace. Pro běžné koncentrace cukru (kolem 200 g.l-1) přídavek dusíku zvýší biomasu kvasinek, čímž v důsledku zvýší rychlost fermentace, fermentace je pak úplná během několika dnů. Pro mošty s vysokou koncentrací cukru je situace značně složitá. Mošty často trpí nedostatkem jak dusíkatých látek, tak látek zajišťující prokvasitelnost těchto moštů, tzv. survival faktorů. V takovém případě platí, že fermentace je po přídavku výživy na začátku akcelerována, oproti kontrolnímu vzorku. Jak fermentace pokračuje, mezera mezi kontrolním a přiživeným vzorkem se zmenšuje. Nakonec se, z důvodu nedostatku nedusíkatých látek, fermentace spontánně zastaví na podobném množství reziduálního cukru. Křivka II (Graf 16) popisuje efekt přidaného dusíku (nebo jiný aktivační efekt) na mošt s vysokou koncentrací zbytkového cukru, normální koncentrací dusíku a nedostatku „survival“ faktorů. Na druhou stranu, pokud je zpomalení fermentace zapříčiněno pouze nedostatkem dusíku, přídavek amonné soli fermentaci stimuluje (křivka III, Graf 16). Zpomalení fermentace může být někdy tímto způsobem eliminováno.

51

Teoretická část

Graf 16: Příklad teoretické aktivace fermentace moštů. S0: počáteční koncentrace cukru v médiu, S1: koncentrace cukru po dokvašení. (I) Kontrola: zastavení fer. Při zbytkovém cukru S0 – S1, (II) výživou aktivovaná fer. s nedostatkem „survival“ 71 faktorů, (III) výživou aktivovaná fer. s nedostatkem dusíkatých látek.

Ostatní faktory ovlivňují asimilaci dusíku během fermentace. Kvasinky mají druhově specifické vlastnosti.79 Henschke a Jiranek70 ukázali, že různé druhy S. Cerevisiae fermentující hroznové mošty asimilují množství dusíku variující od 329 – 451 mg.l-1 při 15,5 °C a 392 – 473 mg.l-1 při 20 °C. Což ukazuje mimo jiné i na to, že s rostoucí teplotou roste množství potřebného dusíku.80

2.5.2 Vliv provzdušnění a přídavku dusíku na průběh a úplnost fermentace Julien a kol. (2000)76 srovnávali potřeby dusíku a kyslíku několika druhů kvasinek používajících se ve vinařství. Kyslík má největší efekt na asimilování dusíku. Je dlouho známo, že kvasinky potřebují v prostředí kyslíku více dusíku.81 To bylo objeveno, když v prostředí bez kyslíku kvasinky spotřebovaly 200 mg.l-1 asimilovatelného dusíku, zatímco v prostředí s kyslíkem spotřebovaly 300 mg.l-1. V aerobním prostředí mohou spotřebovat až 735 mg.l-1 dusíku bez proporcionálního navýšení počtu buněk. V experimentu uskutečněném Rozés a kol. (1988)82 byl použit mošt obsahující 222 g.l-1 cukru a normální obsah amonného dusíku (35 mg.l-1 NH4+ odpovídá přibližně 200 mg.l-1 dusíku) a byla předčasně ukončena fermentace za nepřístupu vzduchu. Přídavkem 0,15 g.l-1 NH4+ (nebo 0,5 g.l-1 síranu amonného) vzrostla rychlost fermentace na začátku, ale nezvýšilo se množství prokvašeného cukru. Naopak provzdušněním třetího

52

Teoretická část dne od začátku fermentace bylo dosaženo vyšší rychlosti a úplného prokvašení cukru. Přídavek NH4+ nezvýšil kinetiku fermentace, naopak po akceleraci začátku fermentace se aktivita kvasinek zastavila na 9 g.l-1 zbytkového cukru. Samozřejmě musí být výsledky těchto experimentů vztaženy k podmínkám pokusu (obsah cukru a dusíku v moštu). Výsledek tak nemusí být za jiných podmínek stejný, především když v experimentu byl signifikantní nedostatek dusíku. V každém případě experiment prokázal, že přídavek dusíku nemusí vždy eliminovat problémy s úplným dokončením fermentace. Je potřeba pomocí dalších experimentů s nedostatkem dusíku nalézt možné řešení. Dopad kyslíku na kinetiku fermentace, bez ohledu na jakýkoli přídavek amonných iontů, je podle všeho komplikovaný a závisí na mnoha faktorech, stejně tak, jako na parametrech moštu (obsah cukru a případný nedostatek dusíku) a fyzikálních podmínkách fermentace.83 V každém případě přídavek dusíku akceleruje fermentaci a ta probíhá rychleji a úplně. Je však stále obtížné identifikovat podmínky, během kterých přidaný dusík prodlouží konverzi cukru a zamezuje zastavení fermentace, a to především u moštů s vysokým obsahem cukru. Načasování přídavku amonných solí je velmi důležité. Přídavek před začátkem fermentace způsobí, že kvasinky mají nejlepší podmínky během růstové fáze, kdy je v mediu malé množství alkoholu. Dokáží asimilovat přídavek dusíku (100 mg.l-1) z 50 – 100 %. Zvýšení asimilace dusíku však nutně neznamená zvýšení potenciálu fermentace. To vysvětluje, proč přídavek dusíku neakceleruje finální fázi fermentace či restartování zastavené fermentace. Sablayrolles a kol. (1996)83 zveřejnili jiné zjištění. Podle těchto autorů je nejvýhodnější

přídavek

dusíku

spolu

s provzdušněním

uprostřed

fermentace.

Kombinace těchto operací má daleko větší dopad na kinetiku fermentace, než samotné provzdušnění a ukazuje tak optimální řešení pro eliminaci předčasného ukončení fermentace.84 Lze konstatovat že, přídavek amonných solí do moštu s nízkým obsahem dusíkatých látek (do 140 mg.l-1) zvýší kinetiku fermentace s různým efektem na růst kvasinek a konverzi cukru. Pro maximální efektivitu by neměl celkový dusík po přídavku překročit 200 mg.l-1. Některé experimenty ukázaly zpomalení fermentace nadměrným přídavkem amonných solí. Pokud mošt má dostatečné množství dusíkatých látek, přídavek dusíku pouze akceleruje začátek fermentace, ale efekt se v dalším průběhu ztrácí. Přídavek

53

Teoretická část amonných solí nevyřeší problémy ve finální fázi fermentace moštů s vysokým obsahem cukru či striktně anaerobních podmínek fermentace. Ačkoli přídavek amonných solí usnadňuje fermentaci moštů s nedostatkem dusíku, pro komplexní náhled na problematiku by měl být obsah dusíkatých látek analyzován před zahájením fermentace spolu s množstvím cukru a kyselin. Přídavek kyslíku na začátku fermentace, kdy jsou kvasinky v růstové fázi je stále nejlepší způsob akcelerace a zamezení předčasného zastavení fermentace. Názory na optimální načasování přídavku amonných solí se liší od počátku do poloviny fermentace. V každém případě je přídavek výživy efektivní jako akcelerátor fermentace, než jako prevence před zůstatkem nechtěného zbytkového cukru.71,85 Přídavky v pozdějších fázích fermentace jsou již bezpředmětné a mohou způsobovat spoustu negativ.

2.6

Metody stanovení

Metody stanovení jsou pro pochopení záměrně rozděleny na: - stanovení veškerého asimilovatelného dusíku - stanovení jednotlivých aminokyselin - stanovení amonných iontů.

2.6.1 Metody stanovení veškerého asimilovatelného dusíku V minulosti byla navržena řada metod na měření asimilovatelného dusíku. Je nutné podotknout, že jejich výsledky nejsou vždy jednoznačné a není dosud známo, která z metod je stoprocentně spolehlivá. Metoda FAN (free amino nitrogen) byla poprvé popsána v roce 1972 v EBC (the European Brewing Commission). Metoda využívá jako činidlo ninhydrin, které reaguje spolu s volnou α-aminokyselinou za vzniku CO2, NH3 a příslušného aldehydu. Vzorky jsou měřeny na spektrofotometru. Metoda indikuje všechny α-aminokyseliny včetně prolinu, což zkresluje množství asimilovatelného dusíku v moštu. Ninhydrin reaguje částečně také s amonnými ionty. Obdržené výsledky jsou dobrým odhadem indexu

54

Teoretická část výživnosti zkoumaných šťáv (spodní mez detekce 18,1 mg.l-1). Metoda je podrobně popsána v experimentální části (viz sekce 5.2.2). Přesnější metoda používající o-ftaldialdehyd (NOPA)86 je schopna detekovat dusík přítomný v α-aminokyselinách pomocí derivatizace primární aminoskupiny specifickou látkou o-ftaldialdehydem (OPA). Metodou NOPA je detekováno asi 3,5 % amoniových iontů, které jsou druhým hlavním zdrojem asimilovatelného dusíku. Některé zdroje87 uvádí shodu výsledků metod FAN a NOPA a jiné88 tuto shodu popírají. Další jednoduchou a poměrně přesnou metodou je formaldehydová titrace spojená s potenciometrickou detekcí. Tato metoda je aparaturně nenáročná a má dosti nízkou spodní mez detekce (8,5 mg.l-1)89,71. Tato metoda bude také podrobně popsána v experimentální části.

2.6.2 Metody stanovení volných aminokyselin Z důvodu rozlišení amonných iontů a jednotlivých aminokyselin a jejich případného vývoje v čase je potřeba složitějších analytických postupů a přístrojů. V této části práce je představeno několik nejběžnějších z nich.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) Tato metoda pracuje s úzkými kolonami (průměr 2 až 8 mm) k jejichž plnění se používá tříděný materiál s malými částicemi (o průměru 3 až 10 mm). Průtok pohyblivé kapalné fáze zde neprobíhá účinkem gravitace, ale pod tlakem čerpadla. Eluát vytékající z kolony prochází průběžně detektorem, který automaticky a kontinuálně měří některou z fyzikálních vlastností eluátu, např. absorpci v UV nebo viditelné oblasti spektra (spektrofotometrické UV-VIS detektory), fluorescenci (fluorescenční detektory), vodivost (vodivostní detektory), index lomu (refraktometrický detektor) apod. Poloha píku na ose x (retenční čas) charakterizuje kvalitu a výška píku (případně plocha píku) udává kvantitu po srovnání se současně děleným standardem nebo použitím

vnitřního

standardu.

K derivatizaci

se

nejčastěji

používají

látky

dietyletoxymetylenmalonát (DEEMM), o - ftaldialdehyd (OPA), merkaptoethanol a fenylisothiokyanát (PITC).

55

Teoretická část Předností HPLC je rychlost analýzy, vysoká dělící schopnost, možnost automatické detekce, identifikace a kvantitativního vyhodnocení chromatogramu. Touto technikou je možné dělit i termolabilní a polární látky. V současné době se jedná o metodu nejpoužívanější a její podrobný popis včetně podmínek separace bude popsán v experimentální části.

Kapilární zónová elektroforéza Zahrnuje separaci směsi různých ionogenních látek v roztoku průchodem elektrického proudu, detekci zón a následné kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení záznamu signálu. Základní charakteristikou zónové elektroforézy je migrace vzorku v prostředí základního elektrolytu, který vede elektrický proud, ale také pufruje potřebnou vlastnost elektrolytu, např. pH. Složení základního elektrolytu je konstantní podél celé migrační dráhy a nemění se s časem. Díky tomu jsou efektivní mobility a tím i migrační rychlosti složek vzorku konstantní během celé analýzy. Pro separaci je nutné, aby migrační rychlosti různých látek byly navzájem různé. Toho se dosáhne vhodnou volbou základního elektrolytu. Prakticky se postupuje tak, že do kapiláry naplněné základním elektrolytem se dávkuje vzorek a po vložení elektrického napětí mezi konce kapiláry začne protékat elektrický proud. Jednotlivé složky vzorku začnou migrovat navzájem různými rychlostmi, čímž dochází k separaci. Vytvořené zóny separovaných látek procházejí detektorem v různých časech. Kvalitativním údajem je migrační čas, což je doba od startu pro průchod zóny detektorem, anebo odpovídající vzdálenost na záznamu analýzy od startu k maximu detekovaného píku. Provádí se srovnání migračních časů píků analyzovaných látek se standardy analyzovanými za týchž podmínek. Kvantitativní analýza je založena na srovnávání velikosti plochy nebo výšky píku vzorku a standardu. Při stanovení aminokyselin pomocí kapilární zónové elektroforézy je problémem schopnost aminokyselin být podle pH prostředí ve formě kationtů nebo aniontů, není však snadné najít podmínky, při kterých by všechny aminokyseliny migrovaly stejným směrem. Aby putovaly ke katodě, používá se někdy elektroosmóza. Většina aminokyselin neabsorbuje v UV oblasti, je proto nutné připravit deriváty aminokyselin, které mohou být detekovány UV nebo fluorescenčním detektorem. K derivatizaci se používá nejčastěji fenylisothiokyanát (PITC).

56

Teoretická část Nízké meze detekce (10-7 mol.l-1), reprodukovatelných migračních časů a vysoké přesnosti dávkování vzorku se dosahuje spojením kapilární zónové elektroforézy s izotachoforézou. Jako derivatizační činidla se používají o-ftaldialdehyd a fluorescein isothiokyanát.

Papírová chromatografie (PC) a tenkovrstvá chromatografie (TLC) Rozdělovací chromatografie na papíře je technika, která se dříve používala hlavně pro analýzu aminokyselin a sacharidů v biologických tekutinách. Pro časovou náročnost je dnes její použití omezené. V rutinním provozu se obvykle nahrazuje tenkovrstevnou chromatografií. Rozdělovací chromatografie na papíře využívá různé rozpustnosti dělených látek ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách. Jedna kapalina (nepohyblivá fáze) je zakotvena do chromatografického papíru, který je nosičem, na němž dělení probíhá. Druhá kapalina, která představuje mobilní fázi, se pohybuje po chromatografickém papíře. Látky se dělí na základě rozdělovacích koeficientů definovaných jak poměr koncentrací látky rozpuštěné ve dvou kapalných, vzájemně nemísitelných fázích (vodné a organické). Dělení látek probíhá na chromatografickém papíře, jehož vlákna poutají nepohyblivou kapalnou fázi z atmosféry chromatografické komory. Můžeme si tuto fázi představit jako „vlhkost papíru“. Pohyblivá kapalná fáze je obvykle organická fáze, do které je zasunut spodní okraj chromatografického papíru s nanesenými vzorky. Přetéká přes nepohyblivou vodnou fázi zadržovanou vlákny papíru. Dělené látky se rozpouštějí ve vodné i organické fázi podle svých rozdělovacích koeficientů a pohybují se různou rychlostí po papíře ve směru toku pohyblivé fáze. Tím dochází k dělení látek v podobě skvrn nebo pásů. Kombinací papírových a sloupcových metod je chromatografie na tenkých vrstvách. Liší se hlavně tím, že zvolený materiál je rozprostřen na skleněné, celuloidové nebo hliníkové podložce, kde tvoří tenkou vrstvu. Využívá principů rozdělovací, adsorpční, ionexové i afinitní chromatografie. V praxi je velmi oblíbená pro svoji rychlost (10 až 30 minut) a jednoduchost provedení.

57

Teoretická část

Iontově výměnná chromatografie (IEC) Je založená na výměně iontů mezi pevnou fází (iontoměnič) a mezi vodnou pohyblivou fází. Touto technikou je možné dělit pouze takové látky, které jsou ve vodných roztocích disociovány na ionty. Principem metody je tedy dělení látek iontové povahy podle velikosti svých disociačních konstant a tedy podle velikosti elektrického náboje. Iontoměniče jsou vysokomolekulární látky nerozpustné ve vodě, které mají schopnost provádět výměnu iontů. Podle chemického složení rozlišujeme ionexy anorganické (zeolit – tj. alkalicko-hlinité křemičitany) nebo ionexy organické (syntetické pryskyřice – např. styren – divinylbenzenové kopolymery). Molekula ionexu má na svém povrchu řadu funkčních skupin (např. –SO3H, –NH2, –OH, –COOH apod.), podle kterých dělíme iontoměniče na katexy (vyměňují vodíkové ionty za kationty) a anexy (vyměňují hydroxylové ionty za anionty). Výměna iontů je vratný pochod. Dělení probíhá na kolonách, které jsou obvykle temperovány a naplněny iontoměničem. Dělené ionty jsou reverzibilně poutány na jeho funkční skupiny různě velkými elektrostatickými silami. Látky poutané pevněji se budou nacházet v horní části kolony a naopak. Rozdělené látky se ze sloupce uvolní technikou eluční chromatografie (promýváním sloupce pufrem) nebo gradientovou elucí (sloupec se promývá pufry, ve kterých se mění iontová síla a pH). Ionty vázané na iontoměnič se postupně z ionexu vytěsní a nahradí za ionty z pufru. Opouštějí kolonu v pořadí pevnosti vazby – nejdříve vytéká látka nejméně pevně vázaná. Frakce jsou odděleně jímány automatickým sběračem frakcí a vyhodnoceny. Pro úspěšné dělení je třeba zvolit správný druh ionexu i velikost jeho částic. Používá se čistých komerčních ionexů pro analýzy. V jiném případě je třeba převést iontoměnič do žádaného cyklu podle návodu výrobce (do vodíkového cyklu proléváním sloupce roztokem kyseliny chlorovodíkové a do hydroxylového cyklu roztokem hydroxidu sodného). Cyklus úpravy je třeba několikrát opakovat. Po barevné reakci rozdělených aminokyselin s ninhydrinem se provádí kontinuální měření absorbance při dvou vlnových délkách, registrované zapisovačem. Primární aminokyseliny dávají s ninhydrinem fialové zbarvení detekovatelné při vlnové délce 570 nm, sekundární aminokyseliny (prolin, hydroxyprolin) zbarvení žluté s maximální absorpcí při 440 nm.

58

Teoretická část Poloha píku (retenční čas na ose x) určuje kvalitu a je pro danou aminokyselinu charakteristická. Z plochy píku pak stanovujeme množství aminokyseliny ve vzorku srovnáním s plochou píku známého množství standardu této aminokyseliny.

Nukleární magnetická rezonance (NMR) NMR spektroskopie patří mezi optické metody. Je to nedestruktivní, selektivní metoda schopná simultánní detekce velkého počtu

nízkomolekulárních složek

v komplexních směsích. Velkou výhodou je jednoduchá a časově nenáročná příprava vzorku. Metoda NMR využívá magnetických vlastností některých atomů, které mohou v magnetickém poli absorbovat elektromagnetické záření, jehož vlnová délka odpovídá radiovým vlnám. Na spektru se získají absorpční maxima, ze kterých můžeme určit strukturu organických látek i jejich konfiguraci. Atomová jádra prvků s lichým protonovým nebo hmotnostním číslem mají magnetický moment a v magnetickém poli se orientují do určitých poloh, kterým odpovídají určité energetické hladiny. NMR využívá pro měření vodík 1H a uhlík

13

C.

Do grafické závislosti se vynáší na osu x chemický posun δ (tj. relativní vyjádření rozdílu mezi polohou signálu standardu a měřené látky), na osu y intenzita naměřeného signálu. Signály aminokyselin ve víně jsou v NMR spektru překryty signály sloučenin ve víně převládajících, tj. voda, ethanol a glycerol, je proto nutno tyto signály potlačit.

2.6.3 Metody stanovení amonných iontů Měření amonných iontů se provádí nejčastěji enzymatickou či spektrofotometrickou cestou. Při enzymatickém stanovení se využívá enzymu glutamátdehydrogenázy.

Spektrofotometrické metody Existuje řada spektrofotometrických metod, kde je využíváno specifických reakcí k tvorbě barevných sloučenin. Tímto způsobem lze při různých vlnových délkách kvantifikovat množství amonných iontů v měřeném vzorku. 59

Teoretická část

Stanovení s Nesslerovým činidlem Stanovení je založeno na reakci amoniaku a hydroxidu alkalických kovů s tetrajodortuťnatanem

sodným

nebo

draselným

za

vzniku

Millonovy

báze

(oxodimerkuriaminjodid). Uvedený jodid je málo rozpustná žlutohnědá sloučenina, která za podmínek stanovení při nízkých koncentracích amoniaku vytváří žlutohnědé koloidní roztoky, které lze fotometricky vyhodnotit. Metoda je vhodná ke stanovení amonných iontů v koncentraci od 0,05 až 4 mg.l-1.

Iontově selektivní metody Při iontově selektivních metodách je využito migrace kladně nabitých amonných iontů v elektrickém poli a jejich následná kvantifikace dle kalibrační křivky. Do iontově selektivních metod patří také izotachoforéza, která bude popsána podrobně v experimentální části (viz kapitola 5.2).

60

Cíl práce

3. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo zjistit běžné koncentrace asimilovatelného dusíku ve velkém počtu hroznů z různých vinařských podoblastí jižní Moravy v ročnících 2007 a 2008. Dále bylo cílem porovnat množství asimilovatelného dusíku v hroznech odrůd ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’ v ročnících 2007 a 2008 pro různé vinařské podoblasti, agrotechnické podmínky a odlišné podnože Kober 5 BB a SO 4. Vždy varioval jeden faktor a ostatní ovlivňující faktory byly fixovány. Následně byla ve stejných variantách sledována změna asimilovatelného dusíku (před a po fermentaci). U všech pokusů byl měřen současně obsah amonných iontů a cukernatost. U mladých vín bylo monitorováno množství kyseliny octové v souvislosti s obsahem výživy během fermentace, z čehož bylo cílem vyvodit důsledky nedostatečného či naopak nadměrného množství výživy pro průběh fermentace a vznik post-fermentačních produktů. Sekundárním cílem bylo zjištění vlivu asimilovatelného dusíku na průběh fermentace za přítomnosti dvou různých druhů komerčně dostupných kvasinek S. cerevisiae. V průběhu alkoholové fermentace byl u těchto vzorků sledován vývoj jednotlivých aminokyselin se zaměřením na pořadí a dynamiku utilizace. Posledním

cílem

práce

bylo

porovnat

ninhydrinovou

metodu

FAN

a

formaldehydovou titraci u dostatečně průkazného počtu analýz a vyvodit shodu či neshodu jejich výsledků.

61

Design pokusu

4. DESIGN POKUSU Kvůli rozdílným požadavkům na příjem dusíku tvoří vybrané odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’. Z důvodu odlišné srážkové činnosti a půdních vlastností jsou vzorky odebírány ze dvou různých vinařských podoblastí, Mikulovské a Znojemské. Dalším sledovaným vlivem je střídavé zatravnění meziřadí oproti meziřadí nezatravněnému. Z hlediska studia vlivu jednotlivých podnoží révy jsou sledovány podnože Kober 5 BB a SO 4, jejichž rozdíl v příjmu dusíku by měl být markantní a představují současně podnože často využívané v daných lokalitách. Pro maximální srovnávací schopnost je vždy zafixován zbytek sledovaných faktorů ovlivňujících měření. Příklad: Vzorek 1 tvoří odrůda ‘Ryzlink rýnský’ z Mikulovské podoblasti, střídavě zatravněné meziřadí, na podnoži Kober 5 BB. Vzorek 2 odrůda ‘Veltlínské zelené’ z Mikulovské podoblasti, střídavě zatravněné meziřadí, na podnoži Kober 5 BB atd.

Tabulka 3: Plán jednotlivých variant pro rok 2007 a 2008.

Oblast 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Zatravnění

Podnož Kober 5 BB

S

SO 4 Kober 5 BB

M N

SO 4 Kober 5 BB

S

SO 4 Kober 5 BB

Z N

SO 4

62

Odrůda RR VZ RR VZ RR VZ RR VZ RR VZ RR VZ RR VZ RR VZ

17 18

Design pokusu Tím je získáno 16 základních variant v roce 2007 a tentýž počet v roce 2008. Další 4 varianty v každém roce představují dvojice moštů (3 a 4) zakvášených pomocí dvou druhů kvasinek. Zde je sledován vývoj aminokyselin v pěti bodech fermentace (varianty 17 a 18). Tento design pokusu vyústil v 52 vzorků (16 variant před a po fermentaci plus 4 varianty v pěti bodech fermentace) v roce 2007 a stejného počtu v roce 2008. Bohužel se 4 varianty (viz Tabulka 3 - červeně vyznačené) nepodařilo zajistit a tím se počet vzorků omezil na 44 (12 variant před a po fermentaci plus 4 varianty v pěti bodech fermentace). Odběr vzorků dle designu pokusu viz Přílohy. Z 12 variant bylo každý rok vyrobeno 14 vín, přičemž dvě varianty (3 a 4) byly zakvašeny pomocí dvou druhů kvasinek. V součtu bylo v každém roce provedeno 24 měření cukernatosti, 48 měření celkového asimilovatelného dusíku (před a po fermentaci), 24 měření amonných iontů (před fermentací) a 24 měření kyseliny octové (po fermentaci). Všechny rozbory měly dvě opakování. Dále 20 měření sedmnácti nejzastoupenějších aminokyselin. V součtu bylo provedeno 280 různých měření ve dvou letech. Posledním cílem práce bylo porovnání metod FAN – detekce na základě ninhydrinových komplexů a formaldehydové titrace. U metody využívající ninhydrin byla vytvořena kalibrační řada. Dále byla tato metoda testována na odezvu aminokyselin s různým počtem atomů dusíku v molekule. Šlo o aminokyseliny L alanin, L - lysin a L - arginin. U formaldehydové titrace nebyla nutná kalibrace a metoda tak byla testována pouze na odezvu amonných iontů.

63

Experimentální část

5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1

Materiál

5.1.1 Výběr podnože Kober 5 BB. Roste bujně v podnožové vinici a na ni naštěpované evropské odrůdy mají také bujný růst. Postupně se zakládají podnožové vinice jen z osvědčených viruprostých klonů této podnože. Z našeho šlechtění je zapsán v SOK klon MO – XVI/50. Z německých klonů jsou nejznámější a nejvíce využívané 13 Gm, Fr. 148, Wü 137, 101 N. V rakousku vznikl z původních výsadeb F. Kobera ve Wiener Neustat klon vyšlechtěný J. Weissem, který nese označení opírající se o původní materiál: V. Berlandieri x V. Riparia Teleki, Selektion Kober Nr. 5 BB, Klon A 3/12 Weiss. Vzdornost proti révokazu je dobrá, proti háďátkům velmi dobrá, proti vyššímu obsahu vápna v půdě je v sušších půdách dostatečná, proti suchu je střední až vyšší. Osvědčuje se nejlépe na hlinitých i štěrkovitých půdách ve vlhkých oblastech a při nižším obsahu aktivního vápníku. Podnož Kober 5 BB je vhodná hlavně pro plodné odrůdy, které nejsou náchylné na sprchávání květenství a které nemají příliš plodný růst: ‘Ryzlink vlašský’, ‘MüllerThurgau’, ‘Veltlínské zelené’, ‘Sylvánské’, ‘Rulandské’, ‘Chardonnay’, ‘Modrý portugal’ a ‘André’. Při intenzivním pěstování révy je nutno vzít v úvahu, že odebírá z půdy přednostně dusík a fosfor a jen omezené množství draslíku a hořčíku, což může vést k nevyrovnané výživě. Projevuje se to pak často totálním vyčerpáním keřů a jejich odumíráním, a to hlavně na půdách pro ni méně vhodných, kde je obsah aktivního vápníku vyšší než 10 % za současného působení vyšší vlhkosti. Hodí se hlavně pro půdy neutrální, případně s kyselou reakcí, kde je lepší příjem draslíku. V nových výsadbách by se měly používat jen osvědčené a viruprosté klony podnože a vyloučit staré mateční vinice se širokou populací různých typů této podnože. Při předrychlování štěpů na této podnoži je třeba k vytvoření kalusu středně vysoká teplota (26 – 28 °C).

Oppenheim SO 4. V podnožové vinici roste středně bujně. Naštěpované odrůdy na ní rostou též středně bujně. V podnožové vinici vyzrává réví brzy a dobře. Urychluje 64

Experimentální část zrání hroznů a vyzrávání dřeva naštěpovaných odrůd. Má velmi dobrou vzdornost proti révokazu a háďátkům. Má velmi dobrou odolnost proti vysokému obsahu vápna v půdě (do 20 %). Je však málo suchovzdorná, a proto se hodí do hlinitých, rovnoměrně vlhkých půd. Nehodí se pro lehké a málo úrodné půdy, ani pro půdy vysychavé. Je vhodná pro všechny jakostní odrůdy a zejména pro takové, které jsou náchylné na sprchávání nebo příliš bujně rostou. Většina odrůd pro výrobu jakostních vín na ní dosahuje nejlepších výsledků. Plodné odrůdy se na ní mohou pěstovat jen v dobrých půdních podmínkách a při dobré výživě. Je vhodná i pro sklepníkovou kulturu révy vinné. V SOK je zapsán klon SO 4 PO – 07. Tato podnož, která pochází z původní podnože Teleki 4, byla vyšlechtěna ve vinařské škole a pokusném ústavu v Oppenheimu. Tam vznikla též její mutace, která má obojaké květy a přináší drobné plody. Byla nazvána Binova a je poněkud bujnějšího růstu, urychluje zrání plodů i dřeva a má ještě vyšší odolnost proti vápnu (do 30 % aktivního vápníku).

Tyto podnože byly vybrány z důvodu jejich rozdílného příjmu dusíku a bujnosti růstu. Jsou také jedny z mála, které mají tradici ve výsadbách ve vybraných vinařských podoblastech a tudíž byly vybrané naštěpované odrůdy relativně dostupné.

5.1.2 Výběr odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ je typickou odrůdou severních vinařských oblastí. Předpokládá se, že vznikl v Porýní jako samovolné křížení lesní révy s některým kultivarem dovezeným do tamní oblasti Římany. Raší pozdě, takže někdy unikne jarním mrazíkům, roste bujně, ve stáří středně, hrozny vyzrávají velmi pozdě, ale jejich jakost se dá vystupňovat pozdními sběry, které patří ke zvláštnostem vín vyráběných z této odrůdy. Je poměrně vzdorný proti houbovým chorobám, jen plíseň šedá napadá snadno třapinu, a to již před kvetením. Je proto vhodné použít přípravky proti plísní šedé před kvetením, případně po nasazení bobulí a před uzavřením hroznů. Trpí také fyziologickým vadnutím třapiny, hlavně při jednostranném přehnojením dusíkem a draslíkem, kdy se objeví bujný růst a zhoršený příjem vápníku a hořčíku. Platí to zvláště na kamenitých a suchých půdách, kam se často vysazuje. ‘Ryzlink rýnský’ je velmi náročnou odrůdou na polohu. Vyžaduje jen jižní svahy do 200 m nadmořské výšky. Nároky na půdu jsou malé. Vhodné jsou podnože SO 4, 5 C, 125 AA, K 1, G 26. Nesmí se vysazovat na bujné podnoži do dobré půdy, pak sprchá. 65

Experimentální část Svědčí mu větší vzdálenosti výsadby a řez na tažně, jejichž délka musí být volena tak, aby nevznikaly krátké letorosty s řídkými hrozny. Vhodné zatížení se pohybuje od 8 do 12 oček na m2 v závislosti na prošlechtění materiálu a požadavku na jakost hroznů. Vyžaduje vyrovnané hnojení a opatrnou aplikaci dusíku. Nesmí se hnojit čerstvým hnojem, používá se rozleželý kompost. Hlavní předností je vysoká odolnost proti mrazům, pravidelné sklizně, malá pracnost při ošetřování keřů, menší náchylnost k houbovým chorobám a výborné víno. Nedostatky jsou v pozdním zrání, náchylnosti na onemocnění třapiny a sklon ke sprchávání. ‘Ryzlink rýnský’ se řadí mezi světově uznávané nejlepší odrůdy pro výrobu jakostních vín.

‘Veltlínské zelené’ raší poměrně brzy, má středně bujný růst a hrozny vyzrávají pozdě. List je středně velký, pětilaločný, se středně hlubokými zářezy, vrcholky letorostů jsou bílé plstnaté. Hrozny jsou velké, křídlaté, se středně velkými bobulemi, zelené nebo zeleno-žluté barvy, v závislosti na prošlechtění jsou husté nebo řídké či sprchlé. Odolnost proti peronospoře je nižší, plísní šedou trpí málo, odolnost proti oidiu je střední. Zimními mrazy trpí středně, jarními více. Odrůda vyžaduje velmi dobré polohy a nejvhodnější jsou půdy hluboké, sprašové nebo hlinité, s dostatečnou vodní jímavostí. Dává dobré výsledky hlavně z osvědčeného klonového materiálu na podnožích Kober 5 BB, CR 2, K – 1, SO 4. Odrůda je vhodná pro Guyotův řez s jedním tažněm nebo pro vedení Vertiko s velmi krátkým řezem na čípky, případně i pro Moserovo vedení s řezem na střídavé čípky. Zatížení odpovídá v rozmezí 4 – 6 oček na m2. Na vápenitých půdách trpí chlorózou. Sklizně jsou vysoké a pravidelné. Víno je pepřnatě kořenité, někdy hořkomandlové, jindy s lipovou vůní na sprašových půdách. Je osvěžující příjemnými kyselinkami, pobízivé chuti a dosahuje výborné jakosti jen z velmi dobře vyzrálých hroznů, které zrají pomalu vzhledem ke své velikosti. Pro odrůdu je důležité sledovat pečlivě vývoj podmínek pro infekci houbovými chorobami koncem července, kdy je nejnáchylnější.12

Tyto odrůdy byly vybrány z důvodu jejich rozdílného příjmu dusíku a bujnosti růstu ve prospěch odrůdy ‘Veltlínské zelené’. Mají také tradici ve výsadbách ve vybraných vinařských podoblastech a tudíž byly relativně dostupné.

66

Experimentální část

5.1.3 Výběr vinařské podoblasti Mikulovská vinařská podoblast Mikulovskou vinařskou podoblast charakterizují vápencové elevace Pavlovských vrchů. Na jejich úbočích a v širším okolí jsou rozšířeny vápenité jíly, písky i mohutné sprašové návěje. Město Mikulov se v minulosti stalo významným vinařským střediskem díky výborným viničním polohám, jak v bezprostřední blízkosti města, tak v mnoha obcích v okolí, z nichž vynikly zejména Valtice ozdobené zámkem, v jehož sklepeních se nachází Národní salon vín. Ve Valticích je i naše nejstarší vinařská škola. Středem zdejší krajiny je Pálava - poslední výběžek vápencových Alp a perla vsazená na okraj lužních lesů dolního Podyjí. Tato chráněná krajinná oblast spolu s lednicko-valtickým areálem zve k výletům do přírody a k zastavení u dobrého vína v četných vinárnách a soukromých sklepech. Význačné postavení díky kvalitě vín si tu získaly již ve středověku obce Sedlec, Dolní Dunajovice, Pavlov, Perná, Dolní a Horní Věstonice, Novosedly a Brod nad Dyjí. Na vápenitých půdách v okolí Pálavy vyzrává ‘Ryzlink Vlašský’ do význačné jakosti odrůdového vína s nezaměnitelným charakterem zvláštní minerálnosti, která vynáší nenapodobitelnou souhrou pobízivou strukturu vín této staré odrůdy, která tu našla svůj pravý domov. Výbornou jakostí tu vynikají i ‘Rulandské bílé’ a ‘Chardonnay’. V hlinitějších půdách Dunajovických vrchů se k ‘Ryzlinku vlašskému’ přidává další odrůda typická pro Mikulovsko - ‘Vetlínské zelené’. Na méně vhodných polohách to je i ‘Müller Thurgau’ a na Valticku ‘Neuburské’ a ‘Sylvánské zelené’. Severně od Pálavy se nachází obce Strachotín, Pouzdřany a Popice známé víny ‘Ryzlinku Rýnského’, ‘Tramínu’ a ‘Pálavy’, která vznikla na Šlechtitelské stanici vinařské v Perné, podobně jako odrůda ‘Aurelius’.

Znojemská vinařská podoblast

Podoblast je součástí Lechovického bioregionu. Uplatňuje se v ní západní proudění a dešťový stín Českomoravské vysočiny spolu s občasnými vpády chladnějšího vzduchu. Tím se zpomalí vegetace ve prospěch zvýraznění aromatických látek v období zrání hroznů. Na jihu se vyskytuje štěrkopískové terasy a návěje spraší. Na severu přechází území kolem Dolních Kounic do prvohorních útvarů Brněnského masivu.

67

Experimentální část Město Znojmo bylo vždy význačným vinařským střediskem a dokládá to spleť dlouhých chodeb vinných sklepů přímo pod městem. V blízkosti města se táhnou prvotřídní viniční polohy od Kraví hory směrem na Hnánice se štěrkovým podložím překrytým místně spraší, případně i s polohami jílů. Od Znojma na jih se táhne podél hranice s Rakouskem řada známých viničních tratí přes Šatov, Chvalovice, Vrbovec, Hnízdo, Slup, Jaroslavice až do Hrušovan nad Jevišovkou, většinou s půdami sprašovými nebo štěrkopísky. Na východ podél Dyje jsou viniční svahy v Tasovicích a Hodonicích. Ve střední části Znojemska leží několik význačných viničních celků na Únanovce a Jevišovce se známými vinařskými obcemi Těšetice, Lechovice, Borovice. Velký areál vinic v okolí Hostěradic a Miroslavi je znám polohami Volné pole a Weinperky. Podoblast je hlavně známa bílými aromatickými víny. Bílé odrůdy tu jsou na ploše 2365 ha. Podle rozšíření jsou zastoupeny hlavně ‘Veltlínské zelené’, ‘Müller Thurgau’, ‘Ryzlink rýnský’, ‘Sauvignon’, ‘Ryzlink vlašský’, ‘Rulandské bílé’. Z výrazně aromatických odrůd to je hlavně ‘Tramín’, ‘Pálava’ a ‘Muškát Moravský’. Modré odrůdy jsou na ploše 1064 ha a to hlavně ‘Svatovavřinecké’, ‘Frankovka’, ‘Rulandské modré’ a ‘Zweigeltrebe’.

5.1.4 Výběr agrotechnických podmínek Z agrotechnických podmínek byly vybrány dvě varianty a to střídavé zatravnění a nezatravněné meziřadí. Smysl tohoto výběru tkví v možné konkurenci půdního porostu a tudíž sníženému odběru dusíku z půdy a v dostupnosti ve zvolených vinařských podoblastech.

5.1.5 Materiál, metodika zpracování a odběr vzorků Tabulka 4 znázorňuje původ jednotlivých hroznů. Červeně označené varianty se nepodařilo zajistit. Hrozny byly odebrány z velkého počtu keřů pro zajištění objektivity. Následně byly ručně odstopkovány a rozmačkány. Minimální hmotnost bobulí bez třapin činila 5 kg pro každou variantu. Po šetrném lisování na mechanickém lisu byl mošt sířen na 40

68

Experimentální část mg.l-1 SO2 a odkalen spontánní sedimentací (12 hodin v chladu). Následovalo zamražení moštů na – 18 °C. Po rozmražení byly odebrány první vzorky moštů (před fermentací). Poté byly mošty přelity do nádob o objemu 2 l a očkovány čistou kulturou kvasinek BS universální bílé (krom variant s různým druhem kvasinek). Kvašení probíhalo při sklepní teplotě cca 12 °C. Krom variant 17 a 18 (odběry během fermentace) proběhly odběry po fermentaci ve fázi ukončení produkce oxidu uhličitého.

Tabulka 4: Odběrná místa materiálu.

Oblast Zatravnění

Podnož

1

Odrůda RR

Kober 5 BB

2

VZ S

3

RR SO 4

4 5

VZ RR

M

Kober 5 BB

6 7

N

VZ RR

SO 4

8

VZ

9

RR Kober 5 BB

10

VZ S

11

RR SO 4

12 13 14 15

VZ Z

Kober 5 BB N

SO 4

16

RR VZ RR VZ

69

Zdroj Vinselekt Michlovský a.s. Rakvice Vinselekt Michlovský a.s. Rakvice Vinselekt Michlovský a.s. Rakvice Vinselekt Michlovský a.s. Rakvice ----------------Mojmír Baroň st. Lednice Školní zemědělský podnik Lednice Josef Smetana Lednice ÚKZÚZ Oblekovice ÚKZÚZ Oblekovice ÚKZÚZ Oblekovice ÚKZÚZ Oblekovice --------------------------------Ladislav Kříž Vrbovec -----------------

Experimentální část Varianty 17 a 18 (viz kap. 4) byly zakvašeny pomocí dvojice různých komerčně dostupných kvasinek S. cerevisiae - BS universální bílé a BS 2 aromatické. Odběry v pěti bodech fermentace probíhaly dle následujícího schéma.

Odběr

1

2

3

4

5

Hodiny od zákvasu

2

26

50

74

98

5.2

Metody měření

Metody měření byly zvoleny na základě dostupnosti analytických přístrojů v laboratoři ústavu vinohradnictví a vinařství a na základě zkušeností s danými metodami. Všechny použité analytické metody patří do referenčních metod a tudíž je jejich spolehlivost více než dostačující.

5.2.1 Stanovení cukernatosti refraktometrem Princip: Obsah cukru v moště stanovíme na základě měření indexu lomu světla refraktometrem jako rozpustnou sušinu moštu vyjádřenou v hmotnostních % sacharózy.

Přístroje a pomůcky: Refraktometr měřící s přesností 0,1 % rozpustné sušiny nebo index lomu na čtyři desetinná místa, kalibrovaný při 20 °C.

Postup: Zkoušený mošt temperujeme na 20 °C a filtrujeme (20 - 25 ml) přes složenou suchou gázu do 25 ml kádinky (první podíly filtrátu se nejímají). Odměříme teplotu filtrátu s přesností na 0,5 °C. Stanovíme hmotnostní % rozpustné sušiny filtrátu s přesností 0,1 %. Měření několikrát opakujeme. Provedeme korekci jednotlivých výsledků podle tabulky korekčních hodnot koncentrace rozpustné sušiny měřené refraktometricky vyjádřené v hmotnostních % sacharózy podle teploty měření.

70

Experimentální část

Vyhodnocení: Jednotlivá měření statisticky zpracujeme a na základě stanovení obsahu rozpustné sušiny nalezneme koncentraci redukujících cukrů v testovaném moště.

5.2.2 Stanovení celkového asimilovatelného formaldehydovou titrací

dusíku

(α-dusíku)

Protože aminokyseliny mají amfoterní povahu, není možné použít k jejich stanovení běžné acidometrické nebo alkalimetrické titrace. Aminoskupinu však lze zablokovat, např. reakcí s formaldehydem:

2

HCHO

+

NH2-CHR-COOH

→

2(HO-CH2-)2N-CHR-COOH

(dimethylolaminoskupina)

Pak se plnou měrou uplatní kyselý charakter karboxylové skupiny. Takto modifikované aminokyseliny můžeme titrovat hydroxidy podobně jako např. kyselinu octovou.

Roztoky a materiál: 0,1 M a 0,01 M vodný roztok hydroxidu sodného. Neutrální roztok formaldehydu: k 50 ml 40 % formaldehydu přidáme 1 ml 0,5 % alkoholického roztoku fenolftaleinu. Následně přidáme 0,01 M NaOH až do slabě růžového zbarvení. 0,5 % alkoholický roztok fenolftaleinu.

Pracovní postup: 10 ml vzorku zneutralizujeme 0,1 M roztokem NaOH a přidáme 5 ml neutrálního roztoku formaldehydu. Následně směs titrujeme 0,01 M roztokem NaOH do růžového zbarvení (bod ekvivalence pH 8,8).

Vyhodnocení: Pomocí spotřeby roztoku NaOH vypočítáme ekvivalentní množství aminodusíku. 71

Experimentální část 1 ml 0,01 M NaOH odpovídá 0,14 mg N. Údaj v mg N byl přepočítán na objemovou jednotku původního vzorku: x = a*0,14*100*f x – množství dusíku v mg N.l-1 a – spotřeba roztoku NaOH v ml f – faktor roztoku NaOH

Chemikálie: •

NaOH (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

fenolftalein (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

formaldehyd (c = 40 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

Formaldehydová metoda současně detekuje část amonných iontů (80 - 120 %), které reagují s formaldehydem za vzniku hexamethylentetraaminu a příslušného množství oxoniových iontů.

5.2.3 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku spektrofotometricky po derivatizaci ninhydrinem

(α-dusíku)

Pro měření asimilovatelného dusíku byla použita ninhydrinová metoda. Tato metoda byla poprvé zveřejněna roku 1948 (Moore a Stein, 1948)90. Od té doby prošla tato metoda mnohými úpravami vedoucí k jejímu zjednodušení a přizpůsobení pro různý původ vzorků. V literatuře lze najít různé kombinace experimentálních podmínek. Ke zjednodušení metody, komplikovaných experimentálních podmínek a zvýšení efektivnosti výrazně přispěla práce.91 Tato práce se zabývá vztahem doby ohřevu, pH a kompozicí pufrů na formování barevných sloučenin.

Pracovní postup: Příprava 4N pufru octanu sodného byla provedena přídavkem kyseliny octové do hydroxidu sodného.92,93 Pro upravení pH pufru byl použit roztok hydroxidu sodného resp. kyseliny chlorovodíkové. 72

Experimentální část V 75 ml dimetylsulfoxidu (DMSO) bylo rozpuštěno 2 g ninhydrinu a 0,3 g hydrindantinu. Po přidání 25 ml pufru octanu sodného byl roztok umístěn do lednice při 4 °C. Čerství roztok ninhydrinu byl připraven každý pracovní den. Roztok aminokyselin (1 ml) a ninhydrinu (1 ml) byl nastříknut do zkumavky a ohříván ve vroucí vodní lázni po dobu 10 min. Po zahřátí je roztok neprodleně zchlazen v ledové lázni. Po přidání 5 ml 50 % alkoholu je vzorek řádně protřepán a absorbance je měřena při 570 nm na spektrofotometru. Od každého vzorku byly provedeny dva nezávislé experimenty a výsledná hodnota byla tvořena průměrem těchto hodnot. Kalibrace byla vytvořena komerčně dostupným softwarem lineární regresí metodou nejmenších čtverců. Ninhydrinová metoda současně detekuje část amonných iontů (30 – 35 %).

Přístroje a chemikálie: •

spektrofotometr (HELIOS γ, Thermo electron, Velká Británie)

•

kyseliny chlorovodíková (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

NaOH (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

dimethylsulfoxid (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

ninhydrin (Sigma Aldrich, USA)

•

hydrindantin (Sigma Aldrich, USA)

5.2.4 Stanovení amonných iontů a kationtů elektromigrační metodou Princip: Izotachoforéza je moderní analytická separační technika. Umožňuje analyzovat směsi ionogenních látek v roztocích a získat v krátké době (obvykle 4 až 40 minut) snadno vyhodnotitelné údaje o kvalitativním i kvantitativním složením vzorku. Běžná chyba kvantitativního stanovení je 1 – 3 %, v řadě případů je však dosažitelná chyba nižší. Izotachoforéza pracuje s malým množstvím vzorku a zpravidla umožňuje stanovit již desítky ng látek, což při nástřiku jednotek až desítek µl vzorku vede k analyzovatelným koncentracím na úrovni desítek až jednotek ppm. Izotachoforéza náleží mezi elektroforetické techniky: je založena na migraci nabitých částic v elektrickém poli. Specifikem metody je přítomnost ostrých zónových rozhraní

73

Experimentální část oddělujících odseparované zóny jednotlivých čistých složek vzorku, které migrují za sebou stejnou rychlostí (odtud název izo-tacho). K potlačení elektroosmózy je využíváno přídavku hydroxypropylmetylcelulózy (HPMC).

Úprava vzorku: Ředění vzorku 1/100. V případě nutnosti byl vzorek zbaven volného oxidu uhličitého zahřátím nebo ultrazvukem. Před analýzou bylo nutné odstranit mechanické nečistoty filtrací nebo odstředěním. Detekční limity jsou pro amonný ion 0,2 mg.l-1, pro draslík 0,4 mg.l-1, pro sodík a vápník 0,2 mg.l-1a pro hořčík 0,1 mg.l-1.

Podmínky analýzy: Vedoucí elektrolyt: 5 mM H2SO4 + 7 mM-18-crown-6 + 0,1 % HPMC Koncový elektrolyt: 10 mM (1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan) BTP Hnací proud: počáteční 100 µA, koncový 50 µA Doba analýzy: 10 minut Mód analýzy: kationický

Přístroje a chemikálie: •

Isotachoforéza (Ionosep 2003, Recman, ČR)

•

kyseliny sírová (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

kyselina 18-crown-6 (Sigma Aldrich, USA)

•

HPMC (Sigma Aldrich, USA)

•

BTP (Sigma Aldrich, USA)

5.2.5 Stanovení kyseliny octové elektromigrační metodou Úprava vzorku: Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 1 ml vína a 1 ml 30 % peroxidu vodíku (odstranění siřičitanu, který migruje ve směsné zóně s jantaranem). Baňka se doplní po značku a roztok se analyzuje bez dalších úprav. Jelikož se přítomný siřičitan oxiduje peroxidem vodíku na síran, je nutné pro kvantitativní analýzu síranu analyzovat ještě

74

Experimentální část 100x zředěný roztok vína bez přídavku peroxidu vodíku. V případě analýz perlivých vín je nutno zbavit vzorek volného oxidu uhličitého zahřátím nebo ultrazvukem. Detekční limity pro 100x ředěný vzorek se pohybují od 50 do 200 mg.l-1. Podmínky analýzy: Vedoucí elektrolyt: 10 mM HCl +5,5 mM BTP + 0,1 % HPMC (pH 6,2) Koncový elektrolyt: 5 mM MES (kyselina morfolinethansulfonová) Hnací proud: počáteční 70 µA, koncový 30 µA Doba analýzy: 20 minut Mód analýzy: anionický

Přístroje a chemikálie: •

Isotachoforéza (Ionosep 2003, Recman, ČR)

•

kyseliny chlorovodíková (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

HPMC (Sigma Aldrich, USA)

•

BTP (Sigma Aldrich, USA)

•

MES (Sigma Aldrich, USA)

5.2.6 Stanovení aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s předkolonovou derivatizací Při stanovení aminokyselin je mobilní fází demineralizovaná voda a acetonitril. Aminokyseliny se převádí před analýzou na stabilní derivát, který neintegruje s nosičem.

Mezi

hlavní

výhody HPLC

patří

především

rychlost,

účinnost,

automatizovatelnost, snadná kvantifikovatelnost výsledků a reprodukovatelnost. Mobilní fáze je kapalina a může být jenosložková nebo vícesložková. V této práci byla použita vícesložková s gradientovou elucí. Výhodou gradientové eluce je vyšší citlivost, lepší rozdělení složitějších směsí a kratší čas analýzy. Pro analýzu byl použit Waters Alliance HPLC systém se separačním modulem 2695. Tento modul ovládá programování metody, složení a průtok mobilní fáze, průtok kapaliny pro oplach těsnění pístů a jehly, dávkování vzorků, průtočné odplyňování, činnost externích detektorů, vyhřívání kolony, vyhřívání a chlazení vzorků a umožňuje ukládání metod. Režim externího řízení je zajištěn chromatografickým programem Empower.

75

Experimentální část Přístroje: •

ultrazvuková lázeň

•

demineralizátor (Mili-Q)

•

třepačka

•

vakuová odparka

•

vortex

•

kapalinový chromatograf – Waters Alliance HPLC systém

Podmínky Waters Alliance 2695: •

Kolona: AccQ Tag Amino Acid Analysis (4 µm Nova-Pak C18, 3,9 mm × 150 mm)

•

Detektor: fluorescenční (excitační vlnová délka 250 nm, emisní 395 nm)

•

Mobilní fáze: A 100 mL AccQ Tag eluent (acetát-fosfátový pufr) v 1 l demineralizované vody B acetonitril C demineralizovaná voda (18 MΩ)

•

Průtok: 1 ml.min-1

•

Nástřik: 10 µL

•

Teplota: 37°C

•

Max tlak: 4000 psi (26 MPa)

•

Doba analýzy: 53 minut

•

Doba zdržení rozpouštědla: 20 minut

•

Gradient: Čas (min) počáteční 0,5 18,0 19,0 29,5 33,0 36,0 65,0 100,0

Průtok (ml.min-1) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,0

%A

%B

%C

100 99 95 91 83 0 100 0 0

0 1 5 9 17 60 0 60 60

0 0 0 0 0 40 0 40 40

76

Experimentální část Chemikálie: •

kyseliny chlorovodíková (c = 0,1 mol.dm-3, Penta, ČR)

•

kyselina α-aminomáselná (Sigma Aldrich, USA)

•

borátový pufr (AccQ Taq Eluent A koncentrát, Waters Corporation, USA)

•

methanol (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

acetonitril (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR)

•

odplyněná demineralizovaná voda

•

derivatizační

činidlo

Waters

AccQ

Fluor

(6-aminoquinolyl-N-

hydroxysuccinimidyl karbamát, Waters Corporation, USA)

Příprava vzorku: Do 100 ml Erlenmayerovy baňky bylo napipetováno 10 ml vzorku a 12 ml methanolu, baňka byla zakryta alobalem a přes noc byl vzorek deproteinován v mrazáku. Druhý den byl vzorek přefiltrován do hruškové baňky a na odparce vyhřáté na 50°C byl odpařen do sucha, poté byl vložen do exikátoru (min. 2 hodiny). Odparek byl rozpuštěn v 0,1 M HCl a roztok převeden do 50 ml odměrné baňky, následováno přídavkem 2 ml vnitřního standardu. Poté byl roztok přefiltrován přes mikrofiltr do vialek a následovala derivatizace vzorku.

Příprava standardu: Bylo naváženo 6,45 mg kyseliny aminomáselné do 25 ml baňky, obsah byl doplněn po rysku demineralizovanou vodou (2,5 mM roztok). Pak bylo do vialky napipetováno 40 µL vnitřního

standardu,

40 µL standardní

směsi

aminokyselin

a

920 µL demineralizované vody.

5.2.7 Meteorologická data Znojemsko má velmi teplé mezoklima s dešťovým stínem z Českomoravské vrchoviny, odkud občas sestupuje chladný vrchovinný vzduch a retarduje vegetaci. Je považováno za extrémně suchý region. Mikulovsko

je

nejtypičtějším

panonským

bioregionem,

v němž

vystupuje

z Mikulovské pahorkatiny Pálava jako bradlo tvořené jurskými vápenci, obklopené

77

Experimentální část křídovými sedimenty a s místním zastoupením spraší. Srážková činnost je zde z důvodu pálavských vrchů dosti nesourodá. V roce 2007 a 2008 byla posbírána meteorologická data z obou vinařských podoblastí. Konkrétně šlo o stanoviště Mikulovsko – Březí, Znojemsko – Oblekovice. V rámci experimentu byl sledován úhrn srážek a denní teploty pro vegetační období, tj. v měsících duben až říjen. Veškerá meteorologická data viz Přílohy. V roce 2007 činil v Oblekovicích pro období duben až říjen úhrn srážek 346,6 mm, průměrná denní teplota byla 16,37 °C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 17. Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2007 - Oblekovice 160

25

srážky teplota vzduchu

140

20

100

15

80 10

60

Teplota [oC]

Úhrn srážek [mm]

120

40 5 20

Říjen

Září

Srpen

Červenec

Červen

Květen

0 Duben

0

Graf 17: Meteorologická data ze stanice Oblekovice pro vegetační období v roce 2007.

Na stanovišti v Březí činil úhrn srážek za stejné období 403,58 mm a průměrná teplota byla 16,36 °C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 18.

78

Experimentální část

Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2007 - Březí 160

25

srážky teplota vzduchu

140

20

100

15

80 10

60

Teplota [oC]

Úhrn srážek [mm]

120

40 5 20

Říjen

Září

Srpen

Červenec

Červen

Květen

0 Duben

0

Graf 18: Meteorologická data ze stanice Březí pro vegetační období v roce 2007.

V roce 2008 činil v Oblekovicích pro období duben až říjen úhrn srážek 363,5 mm, průměrná denní teplota byla 15,34 °C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 19.

79

Experimentální část

Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2008 - Oblekovice 120

25

srážky teplota vzduchu 20

80 15 60 10

Teplota [oC]

Úhrn srážek [mm]

100

40 5

20

Říjen

Září

Srpen

Červenec

Červen

Květen

0 Duben

0

Graf 19: Meteorologická data ze stanice Oblekovice pro vegetační období v roce 2008.

Na stanovišti v Březí činil úhrn srážek za stejné období pouze 262,4 mm a průměrná teplota byla 16,95 °C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 20.

80

Experimentální část

Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2008 - Březí 120

25

srážky teplota vzduchu 20

80 15 60 10

Teplota [oC]

Úhrn srážek [mm]

100

40 5

20

Říjen

Září

Srpen

Červenec

Červen

Květen

0 Duben

0

Graf 20: Meteorologická data ze stanice Březí pro vegetační období v roce 2008.

Srovnání meteorologických dat z obou stanic ukazuje, že v roce 2007 byl úhrn srážek pro Znojemskou vinařskou podoblast nižší a to především v nejdůležitějších měsících – červen, červenec, srpen a září. Naopak v roce 2008 byl úhrn srážek výrazně nižší pro Mikulovskou vinařskou podoblast. Tato data potvrzují značnou ročníkovou nesourodost srážkové činnosti napříč ročníky pro obě oblasti.

81

Výsledky

6. VÝSLEDKY 6.1

Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy

Ke zpracování dat byly použity komerčně dostupné softwary EXCEL a STATISTICA verze 9,0. Z důvodu velkého množství dat a grafů jsou především v případech ANOVA a bodových grafů uvedeny jen průkazné výsledky. Srovnávací grafy znázorňují průměrné hodnoty jednotlivých variant. Jako srovnávací znak průkaznosti vlivu faktorů byl vybrán interval směrodatné chyby průměru. V každé sekci je také formou histogramů sledována intervalová četnost. Zde je pozornost soustředěna na obsahy amonných iontů nižší než 70 mg.l-1, u kterých může potenciálně nastat problém s iniciací fermentace a na extrémní obsahy asimilovatelného dusíku (zkratka AN – assimilable nitrogen) – nižší než 200 mg.l-1 a vyšší než 300 mg.l-1, takové mošty mohou špatně prokvášet, respektive mohou následně vína vykazovat vyšší množství těkavých kyselin21. Následující dvojice tabulek obsahuje původní matrici dosažených výsledků za rok 2007 a 2008. Jsou zde znázorněny veškeré zkoumané varianty, příslušné výsledky tvoří průměry dvou měření. Veškerá data viz Přílohy.

Tabulka 5: Naměřená data pro rok 2007. Cukernatost NH4+ Vzorek Oblast Zatravnění Podnož Odrůda Ref. mg.l-1 M S K5BB RR 20 179,1 1 M S K5BB VZ 21 142,6 2 M S SO4 RR 24,5 81,56 3 M S SO4 VZ 23,5 116,9 4 M N K5BB VZ 22,5 148,9 5 M N SO4 RR 19,5 172,08 6 M N SO4 VZ 23 144 7 Z S K5BB RR 22 95,47 8 Z S K5BB VZ 20,5 133,92 9 Z S SO4 RR 23 120,5 10 Z S SO4 VZ 22,5 101,42 11 Z N SO4 RR 24,5 92,1 12 Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

82

AN mg.l-1 273,01 286,80 259,23 263,36 390,22 168,22 381,94 169,60 215,10 165,46 274,39 242,68

Výsledky Tabulka 6: Naměřená data pro rok 2008.

Vzorek Oblast Zatravnění Podnož M S K5BB 1 M S K5BB 2 M S SO4 3 M S SO4 4 M N K5BB 5 M N SO4 6 M N SO4 7 Z S K5BB 8 Z S K5BB 9 Z S SO4 10 Z S SO4 11 Z N SO4 12 Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

Cukernatost NH4+ Odrůda Ref. mg.l-1 RR 19,50 119,30 VZ 21,50 108,48 RR 18,50 149,65 VZ 19,50 125,25 VZ 19,50 137,28 RR 20,00 140,04 VZ 20,50 102,15 RR 22,50 109,50 VZ 24,50 118,10 RR 23,00 119,50 VZ 19,50 122,73 RR 20,50 104,96

AN mg.l-1 215,10 267,50 151,67 237,16 286,80 248,19 386,08 227,15 278,53 218,52 333,68 246,82

Následující tabulka ukazuje dosažené výsledky obsahů amonných iontů a asimilovatelného dusíku v moštech za zkoumané období bez ohledu na ročníky.

Tabulka 7: Statisticky zpracované souhrnné výsledky pro rok 2007 a 2008. Proměnné +

Počet měření 48 48

Průměr

Int. spolehl. 117,3 238,7

124,4 NH4 257,8 AN Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

Int. Medián spolehl. 131,5 121,6 276,9 251,7

Minimum Maximum Sm.odch. 79,5 149,7

186,8 402,5

24,6 65,7

V letech 2007 a 2008 bylo u moštů z vinařské oblasti Morava naměřeno 48 hodnot amonných iontů s průměrem 124,4 mg.l-1 a 48 hodnot asimilovatelného dusíku s průměrem 257,8 mg.l-1 (viz Tabulka 7).

83

Výsledky Histogram: NH4+ K-S d=,08323, p> .20; Lilliefors p> .20 Očekávané normální 22 20 18

Počet pozorování

16 14 12 10 8 6 4 2 0 50

75

100

125

150

175

200

x <= hranice kategorie

Graf 21: Rozdělení četností obsahu amonných iontů.

Graf 21 ukazuje četnost obsahu amonných iontů u všech zkoumaných vzorků. Nejvíce hodnot amonných iontů bylo naměřeno v intervalu 100 – 125 mg.l-1. Pod 70 mg.l-1 amonných iontů neobsahoval žádný vzorek.

Histogram: Asimilovatelný dusík K-S d=,13488, p> .20; Lilliefors p<,05 Očekávané normální 20 18 16

Počet pozorování

14 12 10 8 6 4 2 0 100

150

200

250

300

x <= hranice kategorie

Graf 22: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku.

84

350

400

450

Výsledky Graf 22 ukazuje četnost obsahu asimilovatelného dusíku u všech zkoumaných vzorků. Nejvíce hodnot asimilovatelného dusíku bylo naměřeno v intervalu 250 – 300 mg.l-1. Pod 200 mg.l-1 obsahovalo 8 vzorků, 16,67 %. Naopak nad 300 mg.l-1 to bylo taktéž 8, 16,67 %.

6.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech Tabulka 8 znázorňuje korelační matici cukernatosti (ref.), obsahu amonných iontů a asimilovatelného dusíku ve všech měřených moštech. Červené hodnoty ukazují na průkaznou korelaci mezi obsahem NH4+ a cukernatostí. Tabulka 8: Korelační tabulka pro cukernatost, amonné ionty a asimilovatelný dusík. Sm.odch. Ref. AN Proměnné Průměry NH4+ Ref.

21,48 124,40 257,80

NH4+ AN

1,85 24,58 65,69

1,00 -0,52 0,14

-0,52 1,00 0,03

0,14 0,03 1,00

Pozn.: AN – asimilovatelný dusík Byly sestaveny bodové grafy. Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a cukernatostí moštů byla shledána neprůkaznou (Graf 23), stejně jako korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a amonných iontů (Graf 24). X: Ref. N = 48 Průměr = 21,479167 Sm.Odch. = 1,847823 Max. = 25,000000 Min. = 18,500000

Bodový graf: Cukernatost vs. Asimilovatelný dusík AN

= 149,46 + 5,0442 * Ref. Korelace : r = ,14190

Y: AN N = 48 Průměr = 257,801667 Sm.Odch. = 65,687577 Max. = 402,470000 Min. = 149,690000

20 10 0 500 Asimilovatelný dusík [mg/l]

450 400 350 300 250 200 150 100 50 16

18

20

22

24

Cukernatost [Ref.]

26

28 0

10

95% hladina spolehlivosti

Graf 23: Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a cukernatostí moštu.

85

20

Výsledky Bodový graf: NH4+ vs. Asimilovatelný dusík AN

X: NH4+ N = 48 Průměr = 124,395417 Sm.Odch. = 24,576341 Max. = 186,801300 Min. = 79,521000

= 246,59 + ,09009 * NH4+ Korelace : r = ,03371

Y: AN N = 48 Průměr = 257,801667 Sm.Odch. = 65,687577 Max. = 402,470000 Min. = 149,690000

20 10 0 500 Asimilovatelný dusík [mg/l]

450 400 350 300 250 200 150 100 50 40

60

80

100

120 NH4+

140

160

180

200

[mg/l]

220 0

10

20

95% hladina spolehlivosti

Graf 24: Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a množstvím amonných iontů.

Byla však nalezena již zmiňovaná průkazná negativní korelace mezi množstvím amonných iontů a cukernatostí (viz červená čísla Tabulka 8 a Graf 25).

Bodový graf: Cukernatost vs. NH4+

X: Ref. N = 48 Průměr = 21,479167 Sm.Odch. = 1,847823 Max. = 25,000000 Min. = 18,500000

NH4+ = 271,41 - 6,844 * Ref. Korelace : r = -,5146

Y: NH4+ N = 48 Průměr = 124,395417 Sm.Odch. = 24,576341 Max. = 186,801300 Min. = 79,521000

20 10 0 220 200

NH4+ [mg/l]

180 160 140 120 100 80 60 40 16

18

20

22

24

Cukernatost [Ref.]

26

28 0

20

95% hladina spolehlivosti

Graf 25: Korelace mezi obsahem amonných iontů a cukernatostí moštu.

86

10

Výsledky

6.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008 V sekci 5.1.2 jsou výsledky porovnány z hlediska ročníku 2007 a 2008. Tabulka 9 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro oba roky.

Tabulka 9: Statisticky zpracované výsledky pro rok 2007 a 2008. Rok NH4+ Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. 2007 127,38 114,09 140,67 257,50 226,73 288,28 2008 121,41 115,08 127,75 258,10 233,10 283,10 Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

Srovnání ročníků 2007 a 2008 ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší v roce 2007 (viz Graf 26).

Srovnání koncentrace NH4+ v letech 2007 a 2008 170

160

150

NH4+ [mg/l]

140

130

120

110 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

100

90 2007

2008 Rok

Graf 26: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech v letech 2007 a 2008.

Dále v tomto roce byly obsahy těchto iontů značně variabilnější než v roce 2008, jak lze usoudit z četností histogramu (viz Graf 27).

87

Výsledky Histogram: NH4+ Rok: 2007 NH4+ = 24*10*normal(x; 127,3792; 31,4724) Rok: 2008 NH4+ = 24*10*normal(x; 121,4117; 15,0055) 8 7 6

Počet pozorování

5 4 3 2 1 0 60

80 70

100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190

60

80 70

Rok: 2007

100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190 Rok: 2008

NH4+ [mg/l]

Graf 27: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro rok 2007 a 2008.

Naopak průměrný obsah celkového asimilovatelného dusíku byl mírně vyšší v roce 2008 (viz Graf 28). Z hlediska variability byl trend stejný jako v roce předešlém (viz Graf 29). Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíku v letech 2007 a 2008 340 320

Asimilovatelný dusík [mg/l]

300 280 260 240 220 200 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

180 160 2007

2008 Rok

Graf 28: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech v letech 2007 a 2008.

88

Výsledky Histogram: Asimilovatelný dusík Rok: 2007 AN = 24*50*normal(x; 257,5021; 72,881) Rok: 2008 AN = 24*50*normal(x; 258,1013; 59,2072) 12

10

Počet pozorování

8

6

4

2

0 100 150 200 250 300 350 400 450

100 150 200 250 300 350 400 450

Rok: 2007

Rok: 2008 Asimilovatelný dusík [mg/l]

Graf 29: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro rok 2007 a 2008.

Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l-1 byl 0 pro oba roky. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l-1 bylo 6 v roce 2007 a 2 v roce 2008. Naopak 4 vzorky v každém roce disponovaly obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l-1.

6.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech Mikulovsko a Znojemsko

z

vinařských

podoblastí

V sekci 5.1.3 jsou výsledky porovnány z hlediska vinařských podoblastí – Mikulovské a Znojemské. Tabulka 10 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro obě vinařské podoblasti.

Tabulka 10: Statisticky zpracované Znojemsko. Podoblast NH4+ Int. spolehl. Mikulovsko 133,38 123,00 Znojemsko 111,82 105,37 Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

výsledky pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Int. spolehl.

AN

Int. spolehl.

Int. spolehl.

143,76

272,52

244,46

300,59

118,27

237,19

213,96

260,42

89

Výsledky Srovnání podoblastí ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl prokazatelně vyšší v Mikulovské vinařské podoblasti (viz Graf 30), kde byly obsahy těchto iontů také značně variabilnější (viz Graf 31). Srovnání koncentrace NH4+ pro vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko 170

Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

160 150

NH4+ [mg/l]

140 130 120 110 100 90 M

Z Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko

Graf 30: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko. Histogram: NH4+ Podoblast: M NH4+ = 28*10*normal(x; 133,3779; 26,7739) Podoblast: Z NH4+ = 20*10*normal(x; 111,82; 13,7861) 7 6

Počet pozorování

5 4 3 2 1 0 60

80 70

100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190

60

Podoblast: M

80 70

100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190 Podoblast: Z

NH4+ [mg/l]

Graf 31: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko.

90

Výsledky Stejně tak byl průměrný obsah asimilovatelného dusíku průkazně vyšší v hroznech z Mikulovské podoblasti (viz Graf 32). Z hlediska variability byl trend stejný (viz Graf 33). Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíkupro vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko 360 Průměr Průměr±SmCh 340 Průměr±SmOdch

Asimilovatelný dusík [mg/l]

320 300 280 260 240 220 200 180 M

Z Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko

Graf 32: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko. Histogram: Asimilovatelný dusík Podoblast: M AN = 28*50*normal(x; 272,5214; 72,375) Podoblast: Z AN = 20*50*normal(x; 237,194; 49,6346) 14 12

Počet pozorování

10 8 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450

100 150 200 250 300 350 400 450

Podoblast: M

Podoblast: Z Asimilovatelný dusík[mg/l]

Graf 33: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko.

91

Výsledky Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l-1 byl 0 pro obě podoblasti. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l-1 byl 4 pro podoblast Mikulovskou a 4 pro Znojemskou. Naopak 6 vzorků z podoblasti Mikulovské disponovalo obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l-1, oproti Znojemské, kde byly pouze 2.

6.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech V sekci 5.1.4 jsou výsledky porovnány z hlediska podnoží Kober 5BB a SO 4. Tabulka 11 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro obě sledované podnože. Tabulka 11: Statisticky zpracované výsledky pro podnož Kober 5BB a SO 4. Podnož NH4+ Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. K 5BB

129,27

117,83

140,70

260,98

233,54

288,42

SO 4

120,92

111,41

130,42

255,53

227,90

283,17

Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

Srovnání jednotlivých podnoží ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší pro podnož Kober 5BB (viz Graf 34). Srovnání koncentrace NH4+ na podnožích K5BB a SO4 160

Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

150

NH4+ [mg/l]

140

130

120

110

100

90 K5BB

SO4 Podnož

Graf 34: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z podnože Kober 5BB a SO 4.

92

Výsledky Variabilita obsahu amonných iontů byla pro měřené vzorky vyšší u podnože Kober 5BB (viz Graf 35) Histogram: NH4+ Podnož: K5BB NH4+ = 20*10*normal(x; 129,265; 24,4344) Podnož: SO4 NH4+ = 28*10*normal(x; 120,9171; 24,5184) 6

5

Počet pozorování

4

3

2

1

0 60

80 70

90

100 120 140 160 180 200 110 130 150 170 190

60

80 70

Podnož: K5BB

90

100 120 140 160 180 200 110 130 150 170 190 Podnož: SO4

NH4+ [mg/l]

Graf 35: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro podnož Kober 5BB a SO 4.

Stejně tak byl průměrný obsah celkového asimilovatelného dusíku v průměru vyšší v hroznech vypěstovaných na podnoži Kober 5BB (viz Graf 36). Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíku na podnoži K5BB a SO4 340 320

Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

Asimilovatelný dusík [mg/l]

300 280 260 240 220 200 180 160 K5BB

SO4 Podnož

Graf 36: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z podnože Kober 5BB a SO 4.

93

Výsledky Naopak větší počet extrémních hodnot asimilovatelného dusíku byl nalezen u podnože SO 4 (viz Graf 37). Histogram: Asimilovatelný dusík Podnož: K5BB AN = 20*50*normal(x; 260,982; 58,6311) Podnož: SO4 AN = 28*50*normal(x; 255,53; 71,2681) 12

10

Počet pozorování

8

6

4

2

0 100

150

200

250

300

350

400

450

100

150

Podnož: K5BB

200

250

300

350

400

450

Podnož: SO4 Asimilovatelný dusík [mg/l]

Graf 37: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro podnož Kober 5BB a SO 4.

Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l-1 byl 0 pro obě podnože. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l-1 byl 2 pro podnož Kober 5BB a 6 pro SO 4. Podobně 2 vzorky na Kober 5BB disponovaly obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l-1, oproti podnoži SO 4, kde bylo naměřeno takových hodnot 6.

6.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech V sekci 5.1.5 jsou výsledky porovnány z hlediska zatravnění meziřadí. Tabulka 12 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro obě sledované varianty. Tabulka 12: Statisticky zpracované výsledky pro střídavé a nezatravněné meziřadí. Zatravnění NH4+ Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. S

121,50

113,23

129,77

239,77

222,15

257,39

N

130,19

115,58

144,80

293,87

250,90

336,84

Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

94

Výsledky Srovnání střídavého a nezatravněného meziřadí ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší pro meziřadí nezatravněné (viz Graf 38).

Srovnání koncentrace NH4+ při střídavém a nezatravněném meziřadí 160 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

150

NH4+ [mg/l]

140

130

120

110

100

90 S

N Zatravnění S-střídavé, N-nezatravněné

Graf 38: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech ze střídavého a nezatravněného meziřadí.

Z histogramu (Graf 39) lze vyčíst vysokou četnost obsahu amonných iontů v extrémních hodnotách, což ukazuje na velkou nevyrovnanost těchto iontů v hroznech z vinic bez zatravněného meziřadí.

95

Výsledky Histogram: NH4+ Srovnani_zatravneni 10v*48c Zatravnění: S NH4+ = 32*10*normal(x; 121,4988; 22,9344) Zatravnění: N NH4+ = 16*10*normal(x; 130,1888; 27,4186) 10 9 8

Počet pozorování

7 6 5 4 3 2 1 0 60

80 70

100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190

60

80 70

100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190

Zatravnění: S

Zatravnění: N NH4+ [mg/l]

Graf 39: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro střídavě zatravněné a nezatravněné meziřadí.

Stejně tak byl obsah celkového asimilovatelného dusíku průkazně a výrazně vyšší u hroznů pocházejícího z nezatravněných vinic (viz Graf 40), kde byla také vyšší variabilita hodnot (viz Graf 41). Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíku při střídavém a nezatravněném meziřadí 400 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

380

Asimilovatelný dusík [mg/l]

360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 S

N Zatravnění S-střídavé, N-nezatravněné

Graf 40: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech ze střídavého a nezatravněného meziřadí.

96

Výsledky

Graf 41: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro střídavé a nezatravněné meziřadí.

Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l-1 byl 0 pro obě alternativy. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l-1 byl 6 pro střídavé zatravnění a 2 pro nezatravněné meziřadí. 2 vzorky ze střídavého zatravnění disponovaly obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l-1, oproti černému úhoru, kde bylo takových hodnot naměřeno 6. Na tomto místě je však nutné vzít v úvahu dostupnost materiálu, který limitoval počet variant s nezatravněným meziřadím na 16, oproti 32 ze zatravnění střídavého.

6.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech V sekci 5.1.6 jsou výsledky porovnány z hlediska odrůdy. Tabulka 13 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro odrůdy ‘Veltlínské zelené’ a ‘Ryzlink rýnský’.

97

Výsledky

Tabulka 13: Statisticky zpracované výsledky pro odrůdu ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’. Odrůda

NH4+

Int. spolehl.

Int. spolehl.

AN

Int. spolehl.

Int. spolehl.

RR

123,65

110,70

136,60

215,47

198,18

232,76

VZ

125,14

117,93

132,36

300,13

275,50

324,76

Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

Srovnání odrůd ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší pro odrůdu ‘Veltlínské zelené’ (viz Graf 42).

Srovnání koncentrace NH4+ u odrůd Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené 160 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

150

NH4+ [mg/l]

140

130

120

110

100

90 RR

VZ Odrůdy RR-Ryzlink rýnský, VZ-Veltlínské zelené

Graf 42: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’.

Histogram (Graf 43) ukazuje širokou intervalovou četnost obsahu amonných iontů u odrůdy ‘Ryzlink rýnský’.

98

Výsledky HIstogram: NH4+ Odrůdy: RR NH4+ = 24*10*normal(x; 123,6467; 30,6724) Odrůdy: VZ NH4+ = 24*10*normal(x; 125,1442; 17,0964) 7 6

Počet pozorování

5 4 3 2 1 0 60

80 70

90

100 120 140 160 180 200 110 130 150 170 190

60

Odrůdy: RR

80 70

90

100 120 140 160 180 200 110 130 150 170 190 Odrůdy: VZ

NH4+ [mg/l]

Graf 43: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro odrůdu ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’.

Obsah celkového asimilovatelného dusíku byl průkazně a výrazně vyšší u hroznů pocházejících z odrůdy ‘Veltlínské zelené’ (viz Graf 44), byla zde také vyšší variabilita hodnot (viz Graf 45). Srovnání koncentrace asimilovatelného u odrůd Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené 380 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch

360

Asimilovatelný dusík [mg/l]

340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 RR

VZ Odrůdy RR-Ryzlink rýnský, VZ-Veltlínské zelené

Graf 44: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’.

99

Výsledky Histogram: Asimilovatelný dusík Odrůdy: RR AN = 24*50*normal(x; 215,4713; 40,9389) Odrůdy: VZ AN = 24*50*normal(x; 300,1321; 58,3248) 14 12

Počet pozorování

10 8 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450

100 150 200 250 300 350 400 450

Odrůdy: RR

Odrůdy: VZ Asimilovatelný dusík [mg/l ]

Graf 45: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro odrůdu ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’.

Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l-1 byl 0 pro obě alternativy. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l-1 byl 8 pro ‘Ryzlink rýnský’ a 0 pro ‘Veltlínské zelené’. Naopak 0 vzorků ‘Ryzlinku rýnského’ disponovalo obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l-1, oproti ‘Veltlínu zelenému’, kde takových hodnot bylo naměřeno celých 8.

6.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory Část 5.1.7 obsahuje výsledky a vztahy získané pomocí analýzy rozptylu (ANOVA). Analýza byla provedena do stupně 2. Vyšší stupeň byl vzhledem k počtu měření považován za irelevantní. Jako průkazné vyšly následující interakce.

Interakce ročníku a podnože ve vztahu k množství amonných iontů

V roce 2007 bylo naměřeno prokazatelně vyšší množství amonných iontů u podnože Kober 5BB než v roce 2008. Naopak u podnože SO 4 byl tento trend mírně opačný a neprůkazný (viz Graf 46).

100

Výsledky

Graf 46: Vliv interakce ročníku a podnože na množství amonných iontů.

Interakce oblasti a zatravnění ve vztahu k množství amonných iontů U hroznů pocházejících z Mikulovské vinařské podoblasti bylo naměřeno prokazatelně vyšší množství amonných iontů u střídavého zatravnění než u hroznů ze Znojemska. Stejný a mnohem silnější rozdíl byl naměřen u nezatravněného meziřadí (viz Graf 47). Vliv interakce podoblasti a zatravnění na množství NH4+ Wilksova lambda=,82141, F(3, 30)=2,1742, p=,11174 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby 170

Zatravnění Zatravnění

160

Koncentrace NH4+ [mg/l]

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 M

Z Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko

Graf 47: Vliv interakce podoblasti a zatravnění na množství amonných iontů.

101

S N

Výsledky Interakce ročníku a podoblasti ve vztahu k množství asimilovatelného dusíku

V roce 2007 bylo naměřeno prokazatelně vyšší množství asimilovatelného dusíku u hroznů z Mikulovska než v roce 2008. Naopak u hroznů ze Znojemska byl tento trend opačný a daleko výraznější (viz Graf 48).

Vliv interakce ročníku a podoblasti na množství asimilovatelného dusíku Wilksova lambda=,45681, F(3, 30)=11,891, p=,00003 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby

Koncentrace asimilovatelného dusíku [mg/l]

330 Podoblast Podoblast

320

M Z

310 300 290 280 270 260 250 240 230 220 2007

2008 Ročník

Graf 48: Vliv interakce ročníku a podoblasti na množství asimilovatelného dusíku.

Interakce podoblasti a podnože ve vztahu k množství asimilovatelného dusíku V hroznech z Mikulovské vinařské podoblasti bylo na podnoži SO 4 naměřeno prokazatelně nižší množství asimilovatelného dusíku než u hroznů ze Znojemska. Na podnoži Kober 5BB byla interakce neprůkazná (viz Graf 49).

102

Výsledky Vliv interakce podoblasti a podnože na množství asimilovatelného dusíku Wilksova lambda=,43750, F(3, 30)=12,857, p=,00001 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby

Koncentrace asimilovatelného dusíku [mg/l]

330 Podnož Podnož

320

K5BB SO4

310 300 290 280 270 260 250 240 230 220 210 M

Z Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko

Graf 49: Vliv interakce podoblasti a podnože na množství asimilovatelného dusíku.

Interakce zatravnění a podnože ve vztahu k množství asimilovatelného dusíku V hroznech ze střídavého zatravnění bylo na podnoži SO 4 naměřeno prokazatelně nižší množství asimilovatelného dusíku než u hroznů ze Znojemska. Na podnoži Kober 5BB byl sice trend stejný, ovšem interakce byla neprůkazná (viz Graf 50). Vliv interakce zatravnění a podnože na množství asimilovatelného dusíku Wilksova lambda=,80907, F(3, 30)=2,3598, p=,09131 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby

Koncentrace asimilovatelného dusíku [mg/l]

360 Podnož Podnož

340

K5BB SO4

320 300 280 260 240 220 200 S

N Zatravnění S-střídavé, N-nezatravněné

Graf 50: Vliv interakce zatravnění a podnože na množství asimilovatelného dusíku.

103

Výsledky Interakce zatravnění a odrůdy ve vztahu k množství asimilovatelného dusíku V hroznech z vinice se střídavým zatravněním bylo u odrůdy ‘Veltlínské zelené’ naměřeno prokazatelně nižší množství asimilovatelného dusíku než u hroznů z vinice s nezatravněným meziřadím. U odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ nebyla interakce průkazná (viz Graf 51). Vliv interakce zatravnění a odrůdy na množství asimilovateln ého dus íku Wilksova lambda=,59527, F(3, 30)=6,7991, p=,00124 Dekompozice efektivní hypotézy Koncentrace asimilovatelného dusíku [mg /l]

Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby 450 Odrůdy Odrůdy

400

RR VZ

350 300 250 200 150 S

N Zatravnění S-střídavé, N-nezatravněné

Graf 51: Vliv interakce zatravnění a odrůdy na množství asimilovatelného dusíku.

6.2

Změna asimilovatelného dusíku před a po fermentaci

V sekci 5.2 jsou shrnuty výsledky 48 měření změny asimilovatelného dusíku před a po fermentaci, či-li spotřeby asimilovatelného dusíku kvasinkami. Průměrná hodnota byla 162,6 mg.l-1 (viz Tabulka 14). Následně je znázorněn histogram, kde se ukázala nejvyšší četnost v intervalu 150 – 200 mg.l-1 (viz Graf 52) a graf pozitivní korelace mezi spotřebou a množstvím asimilovatelného dusíku v moštech (viz Graf 53).

Tabulka 14: Statisticky zpracované výsledky změny asimilovatelného dusíku před a po fermentaci. N Int. Int. Proměnné Průměr Medián Minimum Maximum Sm.odch. platných

spolehl.

48 162,6 148,7 AN Pozn.: AN – asimilovatelný dusík

spolehl. 176,5

104

163,1

76,6

284,5

47,8

Výsledky Histogram: Spotřeba asimilovatelného dusíku během fermentace K-S d=,09846, p> .20; Lilliefors p> .20 Očekávané normální 30

25

Počet pozor.

20

15

10

5

0 50

100

150

200

250

300

x <= hranice kategorie

Graf 52: Rozdělení četností spotřeby asimilovatelného dusíku během fermentace.

Bodový graf: Asimilovatelný dusík před fermentací vs. Spotřeba asimilovatelného dusíku

X: AN před N = 48 Průměr = 257,801667 Sm.Odch. = 65,687577 Max. = 402,470000 Min. = 149,690000

Spotřeba AN = -2,189 + ,63922 * AN před Korelace : r = ,87922

Y: Spotřeba AN N = 48 Průměr = 162,603333 Sm.Odch. = 47,756997 Max. = 284,460000 Min. = 76,590000

20 10

Spotřeba asimilovatelného dusíku [mg/l]

0 350 300 250 200 150 100 50 0 50

100

150

200

250

300

350

400

450

Koncentrace asimilovatelného dusíku před fermentací[mg/l]

500 0

10

20

95% hladina spolehlivosti

Graf 53: Korelace mezi množstvím asimilovatelného dusíku před fermentací a jeho spotřebou během fermentace.

105

Výsledky

6.3

Vliv množství asimilovatelného dusíku v moštech na produkci kyseliny octové

V sekci 5.3 jsou shrnuty výsledky 48 měření koncentrace kyseliny octové po fermentaci, či-li v mladém víně (všechna data viz Přílohy). Průměrná hodnota byla 215,8 mg.l-1 (viz Tabulka 15). Následně je znázorněn bodový graf koncentrace amonných iontů a kyseliny octové. Byla nalezena negativní korelace mezi množstvím amonných iontů v moštech a produkcí kyseliny octové během fermentace (viz Graf 54).

Tabulka 15: Statisticky zpracovaná data produkce kyseliny octové během fermentace. Int. Int. Proměnné N Průměr Medián Minimum Maximum Sm.odch. platných

Kyselina octová

48

215,8

spolehl.

spolehl.

201,0

230,6

216,5

135,0

307,0

Bodový graf: NH4+ vs. Kys. octová

50,88

X: NH4+ N = 48 Průměr = 124,395417 Sm.Odch. = 24,576341 Max. = 186,801300 Min. = 79,521000

Kys. octová = 313,13 - ,7823 * NH4+ Korelace : r = -,3779

Y: Kys. octová N = 48 Průměr = 215,812500 Sm.Odch. = 50,876554 Max. = 307,014700 Min. = 134,960800

20 10

Koncentrace kyseliny octové [mg/l]

0 360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 40

60

80

100

120

Koncentrace

140

160

NH4+ [mg/l]

180

200

220 0

10

20

95% hladina spolehlivosti

Graf 54: Korelace mezi množstvím amonných iontů v moštu a produkcí kyseliny octové během fermentace.

106

Výsledky

6.4

Dynamická změna jednotlivých aminokyselin během fermentace za přítomnosti odlišných druhů kvasinek

Byla naměřena změna koncentrace aminokyselin (všechna data viz Přílohy) v pěti bodech fermentace u čtyř variant zakvašených pomocí aromatických (kvasinky BS 2 aromatické) a neutrálních aktivních suchých vinných kvasinek (kvasinky BS universální bílé). Odběry během fermentace probíhaly dle designu pokusu (viz sekce 4). Do následujícího srovnání bylo vybráno pět aminokyselin s nejvyšší koncentrací v moštu. Kyselina glutamová (glu), arginin (arg), threonin (thr), alanin (ala) a prolin (pro). U každé dvojice je dodrženo stejné měřítko osy Y. Změna obsahu aminokyselin během fermentace

Změna obsahu aminokyselin během fermentace 450,0

450,00

glu

arg

arg

thr 350,0

thr

ala

ala

pro

pro

400,0

400,00 350,00 Koncentrace [mg/l]

glu

300,0

300,00 250,00

250,0

200,00

200,0

150,00

150,0

100,00

100,0

50,00

50,0

0,00

0,0

1

2

3

4

5

1

2

Odběry během fermentace

3

4

5

Odběry během fermentace

Graf 55: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 17 ročník 2007.

První dvojici tvoří varianta 17: Odrůda ‘Ryzlink rýnský’, podnož SO 4, zatravnění střídavé, Mikulovská podoblast, ročník 2007 (viz design pokusu). Vlevo zákvas aromatické kvasinky, vpravo neutrální. Změna obsahu aminokyselin během fermentace

Změna obsahu aminokyselin během fermentace

500,00

500,00

450,00

glu450,00 arg 400,00 thr ala350,00

glu

pro300,00

pro

350,00

Koncentrace [mg/l]

Koncentrace [mg/l]

400,00

300,00 250,00 200,00 150,00

thr ala

250,00 200,00 150,00

100,00

100,00

50,00

50,00

0,00

arg

0,00 1

2

3

4

5

Odběry během fermentace

1

2

3 Odběry během fermentace

Graf 56: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 18 ročník 2007.

107

4

5

Výsledky Druhou dvojici tvoří varianta 18: Odrůda ‘Veltlínské zelené’, podnož SO 4, zatravnění střídavé, Mikulovská podoblast, ročník 2007 (viz design pokusu). Vlevo zákvas aromatické kvasinky, vpravo neutrální. Změna obsahu aminokyselin během fermentace

Změna obsahu aminokyselin během fermentace

900,00

900,00

800,00

800,00

700,00

700,00

thr

600,00

ala

glu

Koncentrace [mg/l]

Koncentrace [mg/l]

arg

600,00

pro

500,00 glu arg400,00

500,00 400,00

thr300,00 ala 200,00 pro

300,00 200,00 100,00

100,00

0,00

0,00 1

2

3

4

5

1

2

Odběry během fermentace

3

4

5

Odběry během fermentace

Graf 57: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 17 ročník 2008.

Třetí dvojici tvoří opět varianta 17, ale ročník 2008 (viz design pokusu). Vlevo zákvas aromatické kvasinky, vpravo neutrální.

Koncentrace [mg/l]

Změna obsahu aminokyselin během fermentace

Změna obsahu aminokyselin během fermentace

300,00

300,00 glu

250,00

arg 250,00 thr

arg

200,00

ala 200,00 pro

ala

150,00

150,00

100,00

100,00

50,00

50,00

0,00

glu thr pro

0,00 1

2

3

4

5

Odběry během fermentace

1

2

3

4

5

Odběry během fermentace

Graf 58: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 18 ročník 2008.

Poslední dvojici tvoří opět varianta 18, ale ročník 2008 (viz design pokusu). Vlevo zákvas aromatické kvasinky, vpravo neutrální. Kvasinky dokázaly během velice krátké doby (v řádů hodin) utilizovat značnou část aminokyselin z média. Aromatické kvasinky vykazovaly obecně rychlejší odběr

108

Výsledky aminokyselin. Za pozornost stojí především aminokyselina prolin (považována v anaerobním prostředí prakticky za neutilizovatelnou), která značně měnila během fermentace svou koncentraci.

6.5

Porovnání metody FAN a formaldehydové titrace

Posledním cílem práce bylo porovnání výsledků detekčních metod FAN a formaldehydové titrace. Obě metody pracují s vysokou přesností a detekční limity jsou dostatečně nízké87.

6.5.1 Metoda FAN U metody FAN byla sestrojena kalibrační křivka, kde měřenou látku představovala aminokyselina L - alanin. Po proložení bodů lineární regresí byla získána rovnice regrese, jejíž spolehlivost činila R2 = 0,9994 (viz Graf 59).

Kalibrace asimilovatelného dusíku u metody FAN 2,5 y = 0,185x + 0,1286 R2 = 0,9994

Absorbance

2

1,5

1

0,5

0 0

2

4

6

8

Koncentrace asimilovatelného dusíku [mg/l]

Graf 59: Kalibrační křivka u metody FAN.

109

10

12

Výsledky Poté byla metoda FAN testována na různé aminokyseliny s vyšším počtem dusíku v molekule. Zde byla nalezena velká disproporce mezi odezvou na aminokyseliny alanin, lysin a arginin (viz Graf 60) Na základě této odezvy na arginin, který obsahuje ve své molekule dusíky čtyři, byl asimilovatelný dusík u všech zkoumaných vzorků měřen formaldehydovou titrací.

Kalibrace aminokyselin u metody FAN 1,6 1,4

Absorbance

1,2 1 0,8 Ala 0,6

Arg Lys

0,4

Lineární (Arg) Lineární (Lys)

0,2

Lineární (Ala)

0 0

1

2

3

4

Koncentrace asimilovatelného dusíku [mg/l]

Graf 60: Kalibrační křivky jednotlivých aminokyselin u ninhydrinové metody FAN.

6.5.2 Formaldehydová titrace U formaldehydové titrace nebylo nutné dělat kalibraci, jelikož výsledek vychází ze stechiometrie neutralizační rovnice a lze ho vypočítat přímo. Jedinou veličinou k ověření tak zůstalo detekované množství amnonných iontů. Byl

zrealizován

experiment

s přídavkem

hydrogenfosforečnanu amonného (viz Graf 61).

110

amonných

iontů

ve

formě

Výsledky

Detekované množství amonných iontů [mg/l

Detekce amonných iontů metodou formaldehydové titrace 600 y = 1,0314x - 1,9304 R2 = 0,9998

500 400 300 200

Amonné ionty 100

Lineární (Amonné ionty)

0 0

100

200

300

400

500

600

Přidané množství amonných iontů [mg/l]

Graf 61: Detekce amonných iontů formaldehydovou titrací.

Průměrné množství detekovaných amonných iontů činilo 102,44 % množství přidaného ve formě hydrogenfosforečnanu amonného.

111

Diskuse

7. DISKUSE 7.1

Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy

Jelikož na území České republiky nebyla provedena žádná měření zabývající se problematikou asimilovatelného dusíku (dále AN) a dusíkatých látek obecně, je nutné výsledky této práce diskutovat pouze v měřítku hodnot dosažených v jiných vinařských zemích. I v takových případech však jde o relativně málo prací a jejich záběr neodpovídá záběru této práce. V letech 2007 a 2008 bylo proměřeno 48 moštů z Mikulovské a Znojemské vinařské podoblasti. Bez ohledu na ovlivňující faktory činila průměrná hodnota amonných iontů 124,4 mg.l-1, což poukazuje na fakt, že mošty z vinařské oblasti Morava nemají bez přídavku výživy problém s iniciací a rychlostí fermentace. Dle dostupných zdrojů 86,65,88 jde o koncentraci vyšší než je obvyklé. Nicméně se dá očekávat, že obsah amonných iontů v hroznech bude pro oblasti s chladnějším klimatem vyšší. Ve většině moštů se pohybovala tato koncentrace v rozmezí 100 – 125 mg.l-1. Pod, z hlediska iniciace fermentace, kritických 75 mg.l-1 nebyl naměřen žádný vzorek. Taktéž průměrná hodnota AN 257,8 mg.l-1 se ukazuje v porovnání s optimem 190 – 200 mg.l-1 jako dostačující i pro mošty s vyšší cukernatostí. Jeden vzorek vykazoval koncentraci pod 150 mg.l-1. Takový mošt je již nutné suplementovat před počátkem fermentace výživou. Naopak 8 moštů (16,67 %) vykazovalo množství dusíku vyšší než 300 mg.l-1, což může vést k vyšší produkci kyseliny octové během fermentace. 32 moštů (66,67 %) obsahovalo 200 – 300 mg.l-1 AN, takové množství je možné považovat za více než dostačující pro zkvasitelnost moštů běžné cukernatosti i vyšších přívlastků.

7.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech Z bodových grafů v sekci 6.1.1 lze vyčíst, že se jednoznačně neprokázala korelace zralosti hroznů a množství AN. Stejně tak spolu nesouvisí množství AN a amonných iontů. V této problematice je stále velkou neznámou aminokyselina prolin, jejíž detekce je značně obtížná. Metoda formaldehydové titrace detekuje jen 12 – 16 % prolinu přítomného v médiu.94,88 Částečná detekce prolinu pak může značně zkreslovat

112

Diskuse porovnávané koncentrace AN a amonných iontů. Prolin se také v posledních letech spojuje s indexem zralosti. Je pravděpodobné, že během dozrávání koncentrace AN roste, ale variabilní část amonných iontů je transformována do prolinu, který však je měřen jen částečně. Tímto způsobem selhává korelace mezi koncentrací AN a cukernatostí (viz Graf 23) a množstvím AN a NH4+ (viz Graf 24). Byla však podle očekávání nalezena negativní korelace mezi cukernatostí a koncentrací amonných iontů. Z této závislosti lze vyvodit, že v letech 2007 a 2008 bylo množství amonných iontů nižší se stoupající cukernatostí hroznů. To potvrzuje předpoklad, že se amonné ionty během zrání transformují na organické zdroje dusíku. Je známo, že v případě přezrálého materiálu je pro zajištění iniciace fermentace nutný přídavek amonných iontů. Z dosažených výsledků je však patrné, že pro naši vinařskou oblast přichází přídavek amonných iontů za účelem zajištění rychlé iniciace fermentace v úvahu jen v opravdu výjimečných případech. Ze všech měřených moštů nebyl jediný s koncentrací pod 75 mg.l-1.

7.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008 Meteorologická data (viz 5.2.7) ukázala, že je klima v našich vinařských podoblastech napříč ročníky značně proměnlivé. Srovnání amonných iontů a AN z hlediska ročníků 2007 a 2008 neukázala žádné značné rozdíly. Hodnoty byly velice blízké (viz Graf 26 a Graf 28) a to i přes různé klimatické podmínky. Jediným nalezeným rozdílem byla variabilita hodnot a to především u amonných iontů, která byla značná u ročníku 2007. Tato variabilita může být způsobena větší srážkovou činností během vegetačního období v roce 2007. S vyšším úhrnem srážek jde ruku v ruce vyšší transport dusíkatých látek rostlinou a tím pádem i vyšší možnost projevu ostatních faktorů, jako je především podnož a odrůda. V roce 2008 bylo během vegetačního období extrémní sucho. Tím je značně limitována i variabilita dusíkatých látek.

113

Diskuse

7.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech Mikulovsko a Znojemsko

z

vinařských

podoblastí

Mikulovsko charakterizují vápencové elevace Pavlovských vrchů. Na jejich úbocích a v širším okolí jsou rozšířeny vápenité jíly, písky i mohutné sprašové návěje. Oproti tomu Znojemsko je tvořeno prahorními útvary, jejichž výběžky daly vzniknout především kamenitým půdám. Srovnání vinařských podoblastí Mikulovsko a Znojemsko ukázala prokazatelně vyšší množství amonných iontů i celkového AN na Mikulovsku (viz Graf 30 a Graf 32). To může být zapříčiněno hned několika faktory. Především půdními podmínkami. Těžší jílové půdy mohou být v průměru pro tvorbu dusíkatých látek příznivější.

7.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech Kober 5 BB je bujně rostoucí podnož vhodná pro hlinité i štěrkovité půdy ve vlhkých oblastech a při nižším obsahu aktivního vápníku. Je vhodná hlavně pro plodné odrůdy, které nejsou náchylné na sprchávání květenství a které nemají příliš plodný růst, protože odebírá z půdy přednostně dusík a fosfor a jen omezené množství draslíku a hořčíku, což může vést k nevyrovnané výživě. Oppenheim SO 4 roste středně bujně, urychluje zrání hroznů a vyzrávání dřeva naštěpovaných odrůd. Je však málo suchovzdorná, a proto se hodí do hlinitých, rovnoměrně vlhkých půd, snáší velmi dobře půdy vápenité (do 20 %). Může se na ní pěstovat jen v dobrých půdních podmínkách a při dobré výživě. Porovnáním dosažených výsledků na podnoži Kober 5BB a Oppenheim SO 4 nebyly získány žádné průkazné rozdíly (viz Graf 34 a Graf 36). Obecně je Kober 5BB považován za velice bujnou podnož s přednostním odběrem dusíku z půdy. Ačkoli byly v průměru hodnoty na této podnoži vyšší, nebyly rozdíly průkazné.

7.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech Problematika trvalých travních porostů je velmi složitou, ale velmi zajímavou oblastí agrotechniky vinice. Trvalé zatravnění meziřadí vinic má v našich klimatických 114

Diskuse podmínkách opodstatnění jak z hlediska agrotechnického, biologického, ekologického, tak i ekonomického. Mimo ostatní výhody v sobě trvalé zatravnění meziřadí, ať už celoplošné či ob řádek, skýtá výhodu vyrovnanějšího uvolňování živin. Zatravnění meziřadí bylo jeden z nejzajímavějších ovlivňujících faktorů. Výsledky ukázaly značné rozdíly ve střídavém a nezatravněném meziřadí (viz Graf 38 a Graf 40). Množství AN v hroznech bylo podstatně vyšší u varianty s nezatravněným meziřadím. Naopak hodnoty ze střídavého zatravnění vykazovaly menší odchylky. Konkrétně u střídavého zatravnění vykazovalo 24 z 32 (75 %) vzorků množství AN mezi 200 – 300 mg.l-1, oproti nezatravněné variantě, kde to bylo pouze 8 z 16 (50 %). Z toho lze usuzovat, že travnatý porost v meziřadí sice odebírá znatelnou část AN révě a představuje tudíž konkurenční prostředí, ale na druhou stranu zajišťuje určitou stabilizaci přísunu dusíkatých látek. Funguje jako rezervoár dusíkatých látek pro révu a při vhodně zvoleném typu nízkorostoucích trav se jedná o variantu výhodnější. Otázkou zůstává trvalé zatravnění meziřadí pro extrémně suché oblasti jako například Znojemsko.

7.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech ‘Ryzlink rýnský’ je typickou odrůdou severních vinařských oblastí. Vyžaduje vyrovnané hnojení a opatrnou aplikaci dusíku. Hlavní předností je vysoká odolnost proti mrazům, pravidelné sklizně, malá pracnost při ošetřování keřů, menší náchylnost k houbovým chorobám a výborné víno. Nedostatky jsou v pozdním zrání, náchylnosti na onemocnění třapiny a sklon ke sprchávání. ‘Veltlínské zelené’ raší poměrně brzy, má středně bujný růst a hrozny vyzrávají pozdě. Odrůda vyžaduje velmi dobré polohy a nejvhodnější jsou půdy hluboké, sprašové nebo hlinité, s dostatečnou vodní jímavostí. Srovnání odrůd ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’ výrazně potvrdilo předpoklad, že ‘Veltlínské zelené’ je odrůda s vysokým odběrem dusíkatých látek, ať už ve formě bílkovin, tak AN. V případě amonných iontů byly rozdíly neprůkazné (viz Graf 42). Velice široký interval koncentrace amonných iontů u odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ je pravděpodobně kvůli jeho pozdnímu zrání. V případě koncentrace AN však byl rozdíl značný ve prospěch odrůdy ‘Veltlínské zelené’ (viz Graf 44). U této odrůdy bylo také naměřeno 8 hodnot nad 300 mg.l-1.

115

Diskuse

7.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory Velmi zajímavou částí práce jsou bezesporu výsledky dosažené pomocí statistické metody analýzy rozptylu (ANOVA). Tato analýza byla provedena do stupně dva a sleduje tak maximálně dva ovlivňující faktory a jejich interakce. Jako první průkazná interakce vyšla v případě ročníku a podnože ke vztahu k amonným iontům. Jak lze vidět (Graf 46), v roce 2007 bylo na podnoži Kober 5BB dosaženo vyššího množství amonných iontů než v roce 2008. Podnož SO 4 vykazovala podobné hodnoty v obou sledovaných letech. Tato interakce je pravděpodobně způsobena tím, že podnož Kober 5BB odebírá z půdy přednostně dusík a reagovala tak velmi intenzivně na suchý ročník 2008 rychlejší transformací amonných iontů na organický dusík. Naopak středně bujnou podnož SO 4 nesnášející sucho lze považovat z hlediska dusíkatých látek za vyrovnanější. Odběr dusíku této podnože není tak intenzivní a její reakce na suchý ročník byla z hlediska amonných iontů minimální. Další průkazná interakce vyšla mezi vinařskými podoblasti a způsobem zatravnění ve vztahu k amonným iontům. Graf 47 znázorňuje průkazně vyšší koncentrace amonných iontů pro Mikulovskou vinařskou podoblast pro obě sledované varianty zatravnění meziřadí. Na Znojemsku, kde je nízká srážková činnost, je nižší transport dusíkatých látek a současně jejich rychlejší přeměna v aminokyseliny. Velice nápadný je opět rozdíl mezi střídavým zatravněním a nezatravněným meziřadím. Na tomto místě se opět potvrzuje pozitivní stabilizující vliv střídavého zatravnění. To opět tlumí vliv nízké srážkové činnosti. Jak výrazný vliv má na množství AN v hroznech klimatická různorodost demonstruje Graf 48. Je zde znázorněná interakce ročníku a podoblasti na množství AN v hroznech. Obsah AN jasně koreluje s průměrným úhrnem srážek ve vegetačním období v obou oblastech (viz Graf 62). V roce 2007 byla zaznamenána nižší srážková činnost ve stanici Oblekovice (Znojemsko), kdežto v extrémně suchém ročníku 2008 to bylo naopak ve stanici Březí. Tomuto průběhu odpovídá i množství AN v hroznech z obou lokalit.

116

Diskuse

Úhrn srážek ve vegetačním období 430 Znojemsko 410

Mikulovsko

Úhrn srážek [mm]

390 370 350 330 310 290 270 250 2007

2008 Ročník

Graf 62: Úhrn srážek ve vegetačním období v letech 2007 a 2008 pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko.

Interakce podoblasti a podnože ve vztahu k množství AN znázorňuje Graf 49. Z výsledků lze konstatovat, že i přes nízký srážkový úhrn vyhovuje podnoži SO 4 více půdní složení vinařské podoblasti Znojemsko, než podnoži Kober 5BB a z hlediska AN zde vykazuje vyšší hodnoty. Další zajímavé výsledky přinesla prokázaná interakce zatravnění a podnože k množství AN (Graf 50). U obou podnoží vyšly hodnoty AN u varianty bez zatravnění meziřadí vyšší, než v případě střídavého zatravnění. Obzvláště hrozny na podnoži SO 4 vykazovaly značné rozdíly. V obou případech lze prokázat konkurenci travního porostu ve vinici. Podnož SO 4 má však mělčí kořenový systém a je možné se tedy domnívat, že pro ni travní porost představuje vyšší odběr dusíku. Je opět nutné podotknout, že počet variant z nezatravněného meziřadí byl podstatně nižší. Poslední interakci tvoří zatravnění a odrůda ve vztahu k množství AN (Graf 51). U odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ vyšly u obou agrotechnických podmínek prakticky stejné výsledky. Naopak u odrůdy ‘Veltlínské zelené’ se ukázal značný vliv nezatravněného meziřadí, který se promítl ve výrazně vysoké hodnoty AN (průměr téměř 400 mg.l-1)! Jak se již ukázalo ve srovnání odrůd, ‘Veltlínské zelené’ má výrazně vyšší odběr

117

Diskuse dusíkatých látek z půdy a jakmile se jí dá prostor, v podobě nezatravněného meziřadí, hodnoty AN jsou hluboko za žádanými koncentracemi.

7.2

Změna asimilovatelného dusíku před a po fermentaci

Průměrná hodnota spotřeby AN kvasinkami činila 162,6 mg.l-1. Tato hodnota je vzhledem k cukernatostem moštů plně v souladu s jinými pracemi.50,69 Navíc se potvrdila nejvyšší četnost spotřeby v intervalu 150 – 200 mg.l-1, kde bylo naměřeno 25 hodnot (52 %). Byla nalezena velice silná pozitivní korelace mezi množstvím AN před fermentací a jeho spotřebou (Graf 53). Tato korelace v podstatě vypovídá o faktu, že pokud je v prostředí více AN, tak ho kvasinky využijí. Samozřejmě z toho plyne vyšší populace kvasinek v mediu a tím i vyšší rychlost fermentace.50

7.3

Vliv množství asimilovatelného dusíku v moštech na produkci kyseliny octové

Vztah mezi množstvím AN a produkcí kyseliny octové nebyl potvrzen. Především z důvodu nedostatku AN to však bylo možné předpokládat, jelikož ze všech měřených moštů obsahoval pouze jeden pod 150 mg.l-1 AN. Kvasinky v podstatě nebyly vlivem nedostatku výživy ve stresovém prostředí a neměly tudíž žádný důvod produkovat vyšší množství těkavých kyselin. Naopak vyšší koncentrace AN zvýšily produkci kyseliny octové, avšak tato korelace nebyla dostatečně silná (korelační koeficient na hladině spol. 95 %, r = 0,193, data neukázány). Pro shodu těchto výsledků se zahraničními prameny50,95 by bylo nutné mít k dispozici širší interval koncentrací AN v moštech. Stejně jako v případě práce Hernandez - Orte a kol.96 byla nalezena korelace mezi množstvím amonných iontů v moštu a produkcí kyseliny octové kvasinkami viz Graf 54. Potvrdilo se, že v případě vyšších koncentrací amonných iontů kvasinky produkují méně kyseliny octové. Vyšší množství amonných iontů v médiu totiž zkracuje „lag“ fázi fermentace, při které se vytváří značné množství kyseliny octové.

118

Diskuse

7.4

Dynamická změna jednotlivých aminokyselin během fermentace za přítomnosti odlišných druhů kvasinek

Byla změřena změna koncentrace sedmnácti aminokyselin během fermentace u dvou různých komerčních druhů kvasinek. Vývoj pěti aminokyselin s nejvyšší počáteční koncentrací je znázorněn na Graf 55 až 58. Všechny zkoumané aminokyseliny vyjma prolinu byly v průběhu fermentace utilizovány. Rychlost a úplnost odběru aminokyselin byla vyšší u kvasinek BS 2 aromatické. Je pravděpodobné, že pro vyšší (především esterovou) aktivitu potřebuje tento druh kvasinek vyšší množství AN. Nutno podotknout, že již první odběr (2 hodiny od zákvasu) a čas manipulace s odebraným vzorkem se bohužel ukázal jako dosti dlouhý interval pro utilizaci části aminokyselin. Velkou neznámou představuje v této problematice aminokyselina prolin. Bezesporu jde o nejzajímavější aminokyselinu, jejíž cesta z hroznů až do vína není vůbec jasná. I v této práci byla koncentrace prolinu nevyzpytatelná a neprojevovala žádný trend. Ačkoliv je prolin nejméně upřednostňovaným zdrojem dusíku pro mnoho laboratorních kmenů S. cerevisiae, je nejhojnějším zdrojem dusíku v hroznech. Když ostatní zdroje dusíku, jako čpavek, asparagin a glutamin jsou nedostupné, S. cerevisiae rozkládají v mitochondriích prolin na glutmát.97 Tato degradace je katalyzována prolin oxidázou, která je kódována jadernými geny PUT1 a PUT2.98,99 Tento jev se objevuje pouze v přítomnosti prolinu a absence přednostního zdroje dusíku.100,101 Přítomnost lepšího zdroje dusíku, jako jsou amonné ionty nebo glutamin, potlačuje využití prolinu touto cestou – efekt známý jako katabolická represe dusíku (Nitrogen Catabolic Repression). Tato katabolická dráha může vysvětlovat nevyzpytatelné chování prolinu během fermentace a jistě stojí za velkou pozornost pro další výzkum.102,103

7.5

Porovnání metody FAN a formaldehydové titrace

Porovnání metody FAN využívající ninhydrin a formaldehydové titrace přineslo zajímavé zjištění. U metody FAN využívající ninhydrin byla nalezena různá odezva na aminokyseliny L - alanin, L - lysin a L - arginin (Graf 60). U aminokyseliny L argininu metoda detekovala krom α – dusíku ještě dusík jiný. Vzhledem k faktu, že arginin je spolu s prolinem nejzastoupenější aminokyselinou v hroznech, mohou být výsledky měření touto metodou značně nepřesné. 119

Diskuse Metoda formaldehydové titrace je aparaturně nenáročná a její vypovídací schopnost je velmi dobrá87,88. Dokonce se měřením (viz Graf 61) potvrdilo, že metoda detekuje 80 – 100 % amonných iontů, což je pro dobrý odhad množství AN v hroznech vynikající.

120

Závěr

8. ZÁVĚR V letech 2007 a 2008 byly zmapovány koncentrace amonných iontů a asimilovatelného dusíku u moštů z vinařských podoblastí jižní Moravy. Tyto obsahy se ukázaly jako vyšší oproti zahraničním hodnotám a především z vysoké koncentrace amonných iontů je jasné, že tyto mošty nemají bez přídavku výživy problém s iniciací a úplností fermentace. Potvrdil se známý vztah mezi klesajícím množstvím amonných iontů a rostoucí cukernatostí. Ze zkoumaných variant bylo nalezeno vyšší množství asimilovatelného dusíku pro Mikulovskou vinařskou podoblast oproti Znojemské a pro nezatravněné meziřadí oproti zatravnění střídavému. Také zvolené odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’ vykazují značné rozdíly v přijímání dusíkatých látek ve prospěch odrůdy ‘Veltlínské zelené’, která je známá svým tradičně vysokým obsahem bílkovin. Při zkoumání interakcí bylo prokázáno a nastíněno několik nových a zajímavých postřehů, jako vliv ročníku a podnože k amonným iontům, který potvrzuje vyrovnanost a universálnost podnože SO 4. Dále pak vliv interakce ročníku a podoblasti na množství asimilovatelného dusíku, který velice dobře koreluje s úhrnem srážek v daných lokalitách. Silná interakce byla prokázána mezi způsobem zatravnění meziřadí a druhem podnože ke vztahu k množství asimilovatelného dusíku. Tím byl potvrzen očekávaný konkurenční vztah travního porostu k révě vinné. Především podnož SO 4 se zdá být kvůli mělčímu kořenovému systému k této konkurenci citlivější. Poslední interakce, zatravnění a odrůda ve vztahu k množství asimilovatelného dusíku, ukázala intenzivní odběr odrůdy ‘Veltlínské zelené’, u které především při nezatravněném meziřadí vystoupaly hodnoty daleko za žádanou mez. Průměrná spotřeba asimilovatelného dusíku kvasinkami plně souhlasila se zahraniční literaturou a potvrdila optimum mezi 150 a 200 mg.l-1. Byla nalezena silná korelace mezi množství asimilovatelného dusíku v moštu a jeho spotřebou kvasinkami. Produkce kyseliny octové během fermentace u zkoumaných variant se ukázala být relativně nízká. Byl prokázán vztah mezi rostoucím množstvím amonných iontů a klesající produkcí kyseliny octové. Sledovaná změna koncentrací aminokyselin během fermentace při použití dvou různých komerčně dostupných kvasinek vyústila v utvrzení, že „aromatický“ druh kvasinek (BS 2 aromatické) odebírá dusík z média rychleji a důsledněji, ačkoli je toto 121

Závěr srovnání

dosti

nejednoznačné,

především

kvůli

nevyzpytatelnému

chování

aminokyseliny prolin. Ze srovnání

metod

detekce

asimilovatelného

dusíku

vyšla lépe metoda

formaldehydové titrace, která je aparaturně nenáročná, rychlá a dostatečně přesná.

122

Doporučení pro praxi a další výzkum

9. DOPORUČENÍ PRO PRAXI A DALŠÍ VÝZKUM Z výsledků této práce lze konstatovat, že problematika asimilovatelného dusíku je značně komplikovaná a vyžaduje rozsáhlejší a dlouhodobější charakter sledování. Již množství asimilovatelného dusíku v hroznech naráží na velkou řadu ovlivňujících faktorů – ročník, zatravnění, podnož, odrůda atd. Stejně tak samotný přechod těchto látek do moštu je ovlivněn délkou a teplotou macerace či způsobem lisování. A aby toho nebylo málo tak využití dusíkatých zdrojů kvasinkami se různí druh od druhu a je výrazně ovlivněno podmínkami technologie – teplotou fermentace, přístupem kyslíku atd. Tento obtížně uchopitelný problém lze vyřešit jen rozsáhlou databází naměřených dat napříč delšího časového úseku a přesným dodržením podmínek experimentů zajišťujících objektivitu získaných výsledků. Na základě dosažených hodnot lze doporučit vyšší obezřetnost v přidávání výživy ve formě amonných solí. Obsahy nutričních látek a především amonných iontů se ukázaly být více než dostačující i pro mošty s vyšší cukernatostí. V případě neuváženého přidávání výživy během fermentace se vlivem snazší utilizace amonných iontů výrobce ochuzuje o přirozenou část buketu vína vzniklého degradací aminokyselin, které lépe stimulují kvasinky a ovlivňují více komplexnost vznikajícího vína. Ideální metodou pro jednoduché, rychlé a dostatečně přesné měření nutričních látek v moštu je formaldehydová titrace, kterou by bylo vhodné rozšířit do všech větších i menších provozů. Především v kombinaci s pH-metrem lze během jednoho měření, v řádech několika minut stanovit tři hlavní parametry moštu: pH, veškeré titrovatelné kyseliny a množství asimilovatelného dusíku. Spolu se znalostí cukernatosti moštu pak lze přistupovat ke každé šarži individuálně a mít tak lepší kontrolu nad technologií. Bezesporu by takové zavedení do praxe vyústilo i ve značné úspory nákladů na výživu kvasinek. Při zakládání vinohradů je nutné mít na mysli vztahy jednotlivých podnoží, odrůd a způsobů zatravnění meziřadí, aby nedocházelo k extrémním synergickým vlivům jako například v případě nezatravněného meziřadí, podnože Kober 5BB a odrůdy ‘Veltlínské zelené’, u takové vinice pak lze předpokládat množství dusíkatých látek hluboko za žádanou mezí.

123

Doporučení pro praxi a další výzkum Jednoznačně nejzajímavější linkou táhnoucí se touto prací je aminokyselina prolin. Již její neznámý vztah s dozráváním hroznů, přes využití kvasinkami až po její velice obtížné stanovení je výzva pro další výzkumné aktivity na Ústavu vinohradnictví a vinařství. Za tímto účelem byla vyvinuta nová metoda stanovení prolinu v moštech či víně pomocí kapilární izotachoforézy (podmínky metody neukázány), kterou je ještě nutné doladit do posledních detailů a otestovat na větším počtu zkoumaných vzorků. Na základě získaných dat vývoje aminokyselin během fermentace byla navržena katabolická a anabolická cesta této aminokyseliny v těle kvasinky (data neukázána).104

124

Seznam obrázků

10. SEZNAM GRAFŮ Graf 1: Úloha argininu v metabolismu dusíku bobulí. .........................................................13 Graf 2: Transport aminokyselin skrze plazmatickou membránu.......................................28 Graf 3: Inkorporace amonného iontu za vzniku glutamátu. ...............................................29 Graf 4: Syntéza glutaminu. .....................................................................................................29 Graf 5: Pyridoxal fosfát a pyridoxamin fosfát. ......................................................................30 Graf 6: Biosyntézní cesty aminokyselin. ...............................................................................31 Graf 7: Oxidativní deaminace aminokyselin, katalyzovaná transaminázou a glutamát dehydrogenázou. ........................................................................................32 Graf 8: Úloha pyridoxal fosfátu v transaminačních reakcích. ............................................33 Graf 9: Deaminace serinu pomocí dehydratázy. .................................................................34 Graf 10: Lineární a nelineární regrese vývoje H2S (µg.l-1) v závislosti na koncentraci volného amino-dusíku (mg.l-1) během fermentace.41 .......................35 Graf 11: Koloběh sirnatých látek v buňce kvasinky. ...........................................................36 Graf 12: Formování vyšších alkoholů z aminokyselin (Ehrlichova reakce). ....................37 Graf 13: Vliv asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin. ..................................40 Graf 14: Vliv přídavku dusíku na obsah těkavých kyselin..................................................41 Graf 15: Role argininu při syntéze biogenních aminů.........................................................44 Graf 16: Příklad teoretické aktivace fermentace moštů.. ...................................................52 Graf 17: Meteorologická data ze stanice Oblekovice pro vegetační období v roce 2007...............................................................................................................................78 Graf 18: Meteorologická data ze stanice Březí pro vegetační období v roce 2007. ......79 Graf 19: Meteorologická data ze stanice Oblekovice pro vegetační období v roce 2008...............................................................................................................................80 Graf 20: Meteorologická data ze stanice Březí pro vegetační období v roce 2008. ......81 Graf 21: Rozdělení četností obsahu amonných iontů.........................................................84 Graf 22: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku. .........................................84 Graf 23: Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a cukernatostí moštu.........85 Graf 24: Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a množstvím amonných iontů. ..........................................................................................................86 Graf 25: Korelace mezi obsahem amonných iontů a cukernatostí moštu.......................86 Graf 26: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech v letech 2007 a 2008. ...............87 Graf 27: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro rok 2007 a 2008....................88 Graf 28: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech v letech 2007 a 2008...............................................................................................................................88 Graf 29: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro rok 2007 a 2008...............................................................................................................................89 Graf 30: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko............................................................................................90 Graf 31: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko............................................................................................90 Graf 32: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko.........................................................................91 Graf 33: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko. ........................................................................91 Graf 34: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z podnože Kober 5BB a SO 4. .............................................................................................................................92 Graf 35: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro podnož Kober 5BB a SO 4. .............................................................................................................................93

125

Seznam obrázků Graf 36: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z podnože Kober 5BB a SO 4. .................................................................................................................93 Graf 37: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro podnož Kober 5BB a SO 4. .................................................................................................................94 Graf 38: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech ze střídavého a nezatravněného meziřadí...........................................................................................95 Graf 39: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro střídavě zatravněné a nezatravněné meziřadí. ..............................................................................................96 Graf 40: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech ze střídavého a nezatravněného meziřadí...........................................................................................96 Graf 41: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro střídavé a nezatravněné meziřadí. ..............................................................................................97 Graf 42: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’. ..................................................................................................98 Graf 43: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro odrůdu ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’. ..................................................................................................99 Graf 44: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z odrůdy ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’. ....................................................................................99 Graf 45: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro odrůdu ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’. ..................................................................................100 Graf 46: Vliv interakce ročníku a podnože na množství amonných iontů......................101 Graf 47: Vliv interakce podoblasti a zatravnění na množství amonných iontů. ............101 Graf 48: Vliv interakce ročníku a podoblasti na množství asimilovatelného dusíku..........................................................................................................................102 Graf 49: Vliv interakce podoblasti a podnože na množství asimilovatelného dusíku..........................................................................................................................103 Graf 50: Vliv interakce zatravnění a podnože na množství asimilovatelného dusíku..........................................................................................................................103 Graf 51: Vliv interakce zatravnění a odrůdy na množství asimilovatelného dusíku.....104 Graf 52: Rozdělení četností spotřeby asimilovatelného dusíku během fermentace..................................................................................................................105 Graf 53: Korelace mezi množstvím asimilovatelného dusíku před fermentací a jeho spotřebou během fermentace.........................................................................105 Graf 54: Korelace mezi množstvím amonných iontů v moštu a produkcí kyseliny octové během fermentace. ......................................................................................106 Graf 55: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 17 ročník 2007........107 Graf 56: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 18 ročník 2007........107 Graf 57: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 17 ročník 2008........108 Graf 58: Vývoj aminokyselin během fermentace u varianty číslo 18 ročník 2008........108 Graf 59: Kalibrační křivka u metody FAN. ..........................................................................109 Graf 60: Kalibrační křivky jednotlivých aminokyselin u metody FAN. ............................110 Graf 61: Detekce amonných iontů formaldehydovou titrací.............................................111 Graf 62: Úhrn srážek ve vegetačním období v letech 2007 a 2008 pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko. ......................................................................117

126

Seznam tabulek

11. SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Aminokyseliny v hroznech a víně.............................................................................16 Tabulka 2: Vyšší alkoholy, jejich koncentrace ve víně a prekurzory vzniku..............................38 Tabulka 3: Plán jednotlivých variant pro rok 2007 a 2008. ........................................................62 Tabulka 4: Odběrná místa materiálu. ..........................................................................................69 Tabulka 5: Naměřená data pro rok 2007.....................................................................................82 Tabulka 6: Naměřená data pro rok 2008.....................................................................................83 Tabulka 7: Statisticky zpracované souhrnné výsledky pro rok 2007 a 2008. .............................83 Tabulka 8: Korelační tabulka pro cukernatost, amonné ionty a asimilovatelný dusík................85 Tabulka 9: Statisticky zpracované výsledky pro rok 2007 a 2008..............................................87 Tabulka 10: Statisticky zpracované výsledky pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko. ..............................................................................................................89 Tabulka 11: Statisticky zpracované výsledky pro podnož Kober 5BB a SO 4. ..........................92 Tabulka 12: Statisticky zpracované výsledky pro střídavé a nezatravněné meziřadí..................94 Tabulka 13: Statisticky zpracované výsledky pro odrůdu ‘Ryzlink rýnský’ a ‘Veltlínské zelené’......................................................................................................................98 Tabulka 14: Statisticky zpracované výsledky změny asimilovatelného dusíku před a po fermentaci. .............................................................................................................104 Tabulka 15: Statisticky zpracovaná data produkce kyseliny octové během fermentace...........106

127

Použitá literatura

12. POUŽITÁ LITERATURA 1

KRAUS V., KUTTELVAŠER Z., VURM B. Encyklopedie českého a moravského vína. 1. vyd. Praha: Melantrich, 1997. 223 s. ISBN 80-7023-250-1.

2

BOULTON R. B., SINGLETON V. L., BISSON L. F., KUNKEE R. E. Principles and practices of winemaking. New York: Chapman & Hall Enology Library Press, 1996. pp.169–174.

3

KUNKEE R. E. Relationship between nitrogen content of must and sluggish fermentation. In: Proceedings of the international symposium on nitrogen in grapes and wine. 1991. (pp. 148–155). Seattle: J.M. Rantz Press.

4

GIUDICI P., KUNKEE R. E. The effect of nitrogen deficiency and sulfur-containing amino acids on the reduction of sulphate to hydrogen sulfide by wine yeasts. American Journal of Enology and Viticulture, 1994, 45, 107–112.

5

HENSCHKE P. A., JIRANEK V. Hydrogen sulphide formation during fermentation: Effect if nitrogen composition in model grape must. In: Proceedings of the international symposium on nitrogen in grapes and wine. 1991. (pp. 172–184). Seattle: J.M. Rantz Press.

6

RAPP A., VERSINI G. Influence of nitrogen compounds in grapes or aroma compounds wines. In: Proceedings of the international symposium on nitrogen in grapes and wine. 1991. (pp. 156–164). Seattle: J.M. Rantz Press.

7

OUGH C. S., CROWELL E. A., MOONEY L. A. Formation of ethyl carbamate precursors during grape juice (Chardonnay) fermentation. I – Addition of amino acids, urea, and ammonium: effects of fortification on intracellular and extracellular precursors. American Journal of Enology and Viticulture.1988. 39, 243–249.

8

ŠŤAVÍKOVÁ L. Vliv technologie výroby vína na obsah volných aminokyselin v odrůdových vínech Veltlínské zelené a Svatovavřinecké. Brno, 2006. 75 s. Diplomová práce na VUT v Brně, FCH. Vedoucí práce Miroslav Hrstka.

9

SOUFLEROS E. H., BOULOUMPASI E., TSARCHOPOULOS C., BILIADERIS C. G. Primary amino acid profiles of Greek white wines and their use in classification according to variety, origin and vintage. Food chemistry, 2003, vol. 80, pp. 261-273. ISSN 0308-8146.

10

ETIÉVANT P., SCHLICH P., BOUVIER J.C. Varietal and Geographic Classification of French Red Wines in Terms of Elements, Amino Acids and Aromatic Alcohols. J.Sci. Food Agric, 1998. vol. 48, pp. 25-41.

11

ARVANITOYANNIS I.S., KATSOTA M.N., PSARRA E.P., SOUFLEROS E.H., KALLITHRAKA S. Application of quality control methods for assessing wine authenticity: Use of multivariate analysis (chemometrics). Trends Food Sci. Technol. 2000. vol. 10, pp. 321–336.

128

Použitá literatura

12

KRAUS V., HUBÁČEK V., ACKERMANN P. Rukověť vinaře. 1. vyd. Praha: Květ, 2000. 262s. ISBN 80-85362-34-1.

13

RIB´EREAU-GAYON J., PEYNAUD E., SUDRAUD P., RIB´EREAU-GAYON P. Sciences et Techniques du Vin, Vol. I: Analyse et Controle du Vin. Dunod, Paris, 1982.

14

DARTIGUENAVE C., JEANDET P., MAUJEAN A. Changes in the buffering capacity of model solutions of 40 mM tartaric or malic acids in relation to amino acids. Am. J. Enol. Vitic. 2000, 51, 347−351.

15

VOET D., VOETOVÁ J. G. Biochemie. 1.vyd. Praha: Victoria Publishing, 1995. 1325 s. ISBN 80-85605-44-9.

16

VODRÁŽKA Z. Biochemie. 2. oprav.vyd. Praha: Academia, 1996. 191 s. ISBN 8020006-00-1.

17

RIBÉREAU-GAYON P., DUBOURDIEU D., DONECHE B., LONVAUD A. Handbook of Enology, Volume II: The Chemistry of Wine and Stabilization and Treatments. 2006 John Wiley & Sons, Ltd ISBN: 0-470-01037-1.

18

BERTHIER L., MARCHAL R., DEBRAY H., BONNET E. AND JEANDET MAUJEAN A. J. Isolation of isolectins from Vitis vinifera L. Cv. Chardonnay grape berries. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2193-2197.

19

OUGH C. S. Winemaking basics. 1. title New York: Binghamton, 1991. 663 st. ISBN 156022-006-6.

20

STEIDL R. Sklepní hospodářství. 1. vyd.: Rychnov nad Kněžnou: Uniprint s. r. o., 2002. 307 st. ISBN 80-903201-0-4.

21

BELY M., RINALDI A., DUBOURDIEU D. Influence of assimilable nitrogen on volatile acidity production by Saccharomyces cerevisiae during high sugar fermentation, J. Biosci. Bioeng. 2003, 96, pp. 507–512.

22

COULON J., HUSNIK J. I., INGLIS D. L., VAN DER MERWE G. K., LONVAUD A., ERASMUS D. J., VAN VUUREN H. J. J. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae to Minimize the Production of Ethyl Carbamate in Wine. Am. J. Enol. Vitic., June 1, 2006; 57(2): 113 - 124.

23

GARDE—CERDAN T., LORENZO C., LARA J. F., PARDO F., ANCINAZPILICUETA C., SALINAS M. R. Study of the Evolution of Nitrogen Compounds during Grape Ripening. Application to Differentiate Grape Varieties and Cultivated Systems J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 2410–2419.

24

MILLERY A., DUTEURTRE B., BOUDAILLE J. P., MAUJEAN A. Différentiation des trois cépages champenois à partir de l'analyse des acides aminés libres des moûts des récoltes 1983 et 1984. Revue Française d'Oenologie. 1986, 103, pp. 32–50.

25

STINES A. P., GRUBB J., GOCKOWIAK H., HENSCHKE P. A., HOJ P. B., HEESWIJCK R. Proline and arginine accumulation in developing berries of Vitis

129

Použitá literatura

Vinifera L. in Australian vineyeards: Influence of vine cultivar, berry maturity a tissue type. Australian J. of Grape a Wine Research. 2000, 6, 150 – 158. 26

FARKAŠ J. Technologie a biochemie vína. 2. přeprac. a doplň. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1980. 870 s.

27

CHRISTAKI T., TZIA C. Quality and safety assurance in winemaking. Food Control, 2002. vol. 13. pp. 503-517. ISSN 0956-7135.

28

CSOMÓS E., SIMON-SARKADI L., KÁTAY G. Y., KIRÁLY-VÉGHELY Z. S., DIÓFÁSI L., TYIHÁK E. Determination of Biologically Active Compounds in Wines using Overpressured-Layer Chromatography, Czech Journal of Food Sciences, 18 2000, pp. 184–185.

29

DAVIS C.R., WIBOWO D., FLEET G.H., LEE T.H. Growth and metabolism of lactic acid bacteria during fermentation and conservation of some Australian wines. Food Techology, 1986. vol. 38. pp. 35-40. ISSN 0015-6647.

30

LIU S.Q., DAVIS C.R., BROOKS J.D. Growth and metabolism of select eslactic acid bacteria in synthetic wine. American Journal of Enology and Viticulture, 1995. vol. 46. pp.166-174.

31

HERBERT P., CABRITA M.J., RATOLA N., LAUREANO O.,ALVES A. Free amino acids and biogenic amines in wines and musts from the Alentejo region. Evolution of amines during alcoholic fermentation and relationnship with variety, sub-region and vintage. Journal of Food Engineering, 2005. vol. 66. pp. 315-322.

32

MARINI A. M., SOUSSI-BOUDEKOU S., VISSERS S., ANDRE, B. A family of ammonium transporters in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 1997, 17, 42824293.

33

MAGASANIK B, KAISER C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 2002, May 15, 290, 1-18.

34

SCHREVE J.L., GARRETT, J.M. Yeast Agp2p and Agp3p function as aminoacid permeases in poor nutrient conditions. Biochemical and Biophys. Res. Com. 2004, 313, 745 - 751.

35

BAROŇ M., Asimilovatelný dusík v moštech révy vinné aneb sypat či nesypat. Vinařský obzor. 2009, 12, 561 - 562. ISSN 1212 - 7884.

36

AMAYA K. R, KOCHERGINSKAYA S. A, MACKIE R. I, CANN I. K. Biochemical and mutational analysis of glutamine synthetase type III from the rumen anaerobe Ruminococcus albus 8. J. of Bacteriology, 2005, 187(21), 7481 - 7491.

37

LLORCA O., BETTI M., GONZALEZ J. M., VALENCIA A., MARQUEZ A. J., VALPUESTA J. M. The three-dimensional structure of an eukaryotic glutamine synthetase: functional implications of its oligomeric structure. J. of Struct. Biol. 2006, 156(3), 469 - 479.

38

BRAUS G. H. Aromatic amino acid biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae: a model system for the regulation of a eukaryotic biosynthetic pathway. Microbiol. Rev. 1991, 55(3), 349-370.

130

Použitá literatura

39

ESCHENBRUCK R. Sulphate uptake and sulphite formation related to the methionine and/or cysteine content of grape must during the fermentation by strains of Saccharomyces cerevisiae. Vitis, 11, 1972. vol.3. pp. 222-227.

40

SCHUBERT H. L., RAUX E., BRINDLEY A. A., LEECH H. K., WILSON K. S., HILL C. P., WARREN M. J. The structure of Saccharomyces cerevisiae Met8p, a bifunctional dehydrogenase and ferrochelatase. EMBO J. 2002, 21, 2068–2075.

41

MENDES-FERREIRA A, DEL OLMO M., GARCIA-MARTINEZ J., JIMÉNEZMARTÍ E., LEAO C., MENDES-FAIA A., PEREZ-ORTIN J. E. Saccharomyces cerevisiae signature genes for predicting nitrogen deficiency during alcoholic fermentation. Appl Environ Microbiol 2007, 73, 5363–5369.

42

VOS P. J. A., GRAY R. S. The origin and control of hydrogen sulfide during fermentation of grape must. Am. J. Enol. Vitic. 1979, 30, 187-197.

43

SPIROPOULOS A., TANAKA J., FLERIANOS I. BISSON L. F. Characterization of hydrogen sulfide formation in commercial and natural wine isolates of Saccharomyces. Am J Enol Vitic. 2000, 51, 233–247.

44

FERREIRA A. M., BARBOSA C., FALCO V., LEAO C., MENDES-FAIA A. Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts: effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2009, 36 (4), 571 – 583.

45

DICKINSON J. R., SALGADO L. E. J., HEWLINS M. J. E. The catabolism of amino acids to long chain and complex alcohols in Saccharomyces cerevisiae. J. of Biol. Chem. 2003, 278(10), 8028 – 8034.

46

MILLER A. C., WOLFF S. R., BISSON L. F., EBELER S. E. Yeast Strain and Nitrogen Supplementation: Dynamics of Volatile Ester Production in Chardonnay Juice Fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 2007, 58, 470-483.

47

HERNÁNDEZ-ORTE P., IBARZ M.J., CACHO J.F., FERREIRA V. Effect of the addition of ammonium and amino acids to musts of Airen variety on aromatic composition and sensory properties of the obtained wine. Food Chem. 2005, 89,163174.

48

INGRAHAM J. L., GUYMON J. F. The formation of higher aliphatic alcohols by mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics, New York, v.88, p.157-166, 1960.

49

CARRAU, F.M. Characterization of yeast in relation to the ability to utilize nitrogen – Studies of aroma compounds. PhD thesis. 2003, Universidad de la Republica, Uruguay.

50

BELY M., RINALDI A., DUBOURDIEU D. Influence of assimilable nitrogen on volatile acidity production by Saccharomyces cerevisiae during high Sugar Fermentation. J. Biosci Bioeng. 2003, 96(6), 507-512.

51

LETHONEN P. K., SAARINEN M., VESANTO M., RIEKKOLA M. L. Determination of wine amines by HPLC using automated precolumn derivatisation with o-

131

Použitá literatura

phthalaldehyde and fluorescence detection. Z. Lebeusm. Unters. Forsch. 1992, 194, 434–437. 52

OGURI S., YONEYA Y., MIZUNUMA M., FUJIKI Y., OTSUKA K., TERABE S. Selective detection of biogenic amines using capillary electrochromatography with an on-column derivatization technique. Anal Chem.2002, Jul 15, 74(14), 3463-3469.

53

MARCOBAL A., POLO M.C., MARTÍN-ÁLVAREZ P.J, MORENO-ARRIBAS M.V. Biogenic amine content of red Spanish wines: comparison of a direct ELISA and an HPLC method for the determination of histamine in wine. Food Research International, 2005. vol. 38. pp. 387-394.

54

LONVAUD-FUNEL A. Biogenic amines in wines: role of lactic acid bacteria, FEMS Microbiol. Lett. 2001, 199, 9–13.

55

COSTANTINI A., VAUDANO E., DEL PRETE V., DANEI M., GARCIA-MORUNO E. Biogenic Amine Production by Contaminating Bacteria Found in Starter Preparations Used in Winemaking. J. Agric. Food Chem. 2009, 57 (22), 10664–10669.

56

SCHLATTER J., LUTZ W. K.. The carcinogenic potential of ethyl carbamate (urethane): Risk assessment at human dietary exposure levels. Food Chem. Toxicol. 1990, 28, 205 - 211.

57

COULON J., HUSNIK J. I., INGLIS D. L., VAN DER MERWE G. K., LONVAUD A., ERASMUS D. J., VAN VUUREN H. J. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae to Minimize the Production of Ethyl Carbamate in Wine. Am. J. Enol. Vitic. 2006, 57, 2, 113 – 124.

58

BELY M., SABLAYROLLES J. M., BARRE P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic in enological conditions. J. Ferm. Bioeng. 1990, 70, 246–252.

59

BLATEYRON L., ORTIZ-JULIEN A; SABLAYROLLES J. M. Stuck fermentations: oxygen and nitrogen requirements – importance of optimising their addition. Aust. N.Z. Grapegrower Winemaker. 2003, 478, 73-79.

60

TER SCHURE E. G., VAN RIEL N. A. W., VERRIPS C. T. The role of ammonia metabolism in nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev. 2000, 24, 67–83.

61

ABRAMOV S. A., EFENDIEVA D.A., KOTECKO S. T. Effect of growth medium on protein content of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl. Biochem. Microbiol. 1994, 30 (2), 225–227.

62

BELL S. J., HENSCHKE P. A. Implications of nitrogen nutrition for grapes, fermentation and wine. Aust. J. Grape Wine Res. 2005, 11, 242-295.

63

TORIJA M. J., BELTRAN G., NOVO M., POBLET M., ROZÉS N., GUILLAMÓN J. M., MAS A. Effect of the nitrogen source on fatty acid composition of Saccharomyces cerevisiae, Food Mikrobiology. 2003, 20, 255 – 258.

64

VARELA C., PIZARRO F., AGOSIN E. Biomass content governs fermentation rate in nitrogen-deficient wine musts. Appl Environ Microbiol. 2004, 70, 3392–3400.

132

Použitá literatura

65

TAILLANDIER P., RAMON PORTUGAL F., FUSTER A., STREHAIANO P. Effect of ammonium concentration on alcoholic fermentation kinetics by wine yeasts for high sugar content. Food Microbiol. 2007, Feb 24, 95-100.

66

BAUER F. F., PRETORIUS I. S. Yeast stress response and fermentation efficiency: how to survive the making of wine – S. Afr. J. Enol. Vitic. 2000, 21, 27-51.

67

GARDE-CERDAN T., ANCIN-AZPILICUETA C. Effect of the addition of different quantities of amino acids to nitrogen-deficient must on the formation of esters, alcohols, and acids during wine alcoholic fermentation. LWT-Food Sci. Technol. 2008, 41, 501– 510.

68

BELTRAN G., ESTEVE-ZARZOSO B., ROZES N., MAS A., GUILLAMON J. M. Influence of the timing of nitrogen additions during synthetic grape must fermentations on fermentation kinetics and nitrogen consumption. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005, 53, 996 – 1002.

69

MANGINOT C., SABLAYROLLES J. M., ROUSTAN J. L., BARRE P. Use of constant rate alcoholic fermentations to compare the effectiveness of different nitrogen sources added during the stationary phase. Enzyme Microb. Technol. 1997, 20, 373 – 380.

70

JIRANEK V., LANGRIDGE P., HENSCHKE P. A. Amino acid and ammonium utilization by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts from a chemically defined medium. Am. J. Enol. Vitic. 1995, 46, 75 – 83.

71

RIBÉREAU-GAYON P., DUBOURDIEU D., DONECHE B., LONVAUD A. Handbook of Enology, Volume I: The Microbiology of Wine and Vinifications. 2006 John Wiley & Sons, Ltd ISBN: 0-470-01034-7.

72

UGLIANO M., HENSCHKE P. A., HERDERICH M. J., PRETORIUS I. S. Nitrogen management is critical for wine flavour and style. The Australian and New Zealand Wine Industry Journal. 2007, 22, No. 6. 24 – 30.

73

LOURENS K., REID G. Yeast nutrient management in winemaking. The Australian & New Zealand Grapegrower & Winemaker. 2002, 50 – 54.

74

AERNY J. Composés azotes des moûts et des vins, Revue Suisse de Viticulture, Arboriculture, Horticulture. 1996, 28, pp. 161 – 165.

75

LORENZINI, F. Teneur en azote et fermentescibilité des moûts de Chasselas. Revue. Suisse Vitic. Arboric. Hortic. 1996, Vol. 28 (3),169 - 174.

76

JULIEN A., ROUSTAN J. L., DULAU L., SABLAYROLLES J. M. Comparison of nitrogen and oxygen demands of enological yeasts: Technological consequences. Am. J. Enol. Vitic. 2000, 51 (3), 215 - 222.

77

MASNEUF I., MURAT M. L., CHONÉ X., DUBOURDIEU D. Dosage systématique de l'azote ssimilable : détecter les carences au chai. Viti. 2000, 249, 19-22.

78

CHONÉ X., 2001. Contribution à l'étude des terroirs de Bordeaux: Étude des déficits hydriques modérés, de l'alimentation en azote et de leurs effets sur le potentiel

133

Použitá literatura

aromatique des raisins de Vitis vinifera L. cv. Sauvignon blanc. Disertační práce, Universita v Bordeaux II, 188 p. 79

CARRAU F. M., MEDINA K., FARINA L., BOIDO E., HENSCHKE P. A., DELLACASSA E. Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts: effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains. FEMS Yeast Res. 2008, 8, 1196–1207.

80

BELTRAN G., ROZÈS N., MAS A., GUILLAMÓN J. M. Effect of low-temperature fermentation on yeast nitrogen metabolism. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2007, 23 (6), 809 – 815.

81

RIBÉREAU-GAYON P., LAFON-LAFOURCADE S., BERTRAND A. Le debourbage de mouts de vendange blanche. Conn. Vigne. Vin. 1975, 9, pp. 117 – 139.

82

RÓZES N., CUZANGE B., LARUE F., RIBÉREAU-GAYON P. Incidence sur la du moût de raisin en sulfate d'ammonium. Conn. Vigne. Vin. 1988, 22 (2), pp. 163 – 167.

83

SABLAYROLLES J. M., DUBOIS C., MANGINOT C., ROUSTAN J. L., BARRE P. Effectiveness of combined ammoniacal nitrogen and oxygen additions for completion of sluggish and stuck wine fermentations. J. Ferm. Bioeng. 1996, 82, 377 - 381.

84

SABLAYROLLES J. M., BLATEYRON L. Bull. OIV, 2001, 845–846.

85

LOURENS K., REID G. Stuck fermentation Management. The Australian & New Zealand Grapegrower & Winemaker. 2003, February, 72 – 74.

86

DUKES B. C., BUTZKE C. E. Rapid determination of primary amino acid in grape juice using an o-phthaldialdehyde/N-acetyl-Lcysteine spectrophotometric assay. American Journal of Enology and Viticulture. 1998, 49, 125–134.

87

SHIVELY C. E., HENICK-KLING T. Comparison of two procedures for assay of free amino nitrogen. American Journal of Enology and Viticulture, 2001, 52, 400–401.

88

GUMP B. H., ZOECKLEIN B. W., FUGELSANG K. C., WHINTON R. S. Comparison of analytical methods for prediction of prefermentation nutritional status of grape juice. American Journal of Enology and Viticuture. 2002, 53(4), 325-329.

89

GUMP B. H., ZOECKLEIN B. W., FUGELSANG K. C. Prediction of prefermentation nutritional status of grape juice-The formol method. In: Methods in Biotechnology. Humana Press, Inc. Totowa NJ. 2000, pp. 283-296.

90

MOORE S., STEIN W. H. Photometric ninhydrin Metod for use in the chromatography of amino acids. Journal of Biological Chemistry. 1948, 176, 367 – 388.

91

SUN S. W., LIN Y. C., WENG Y. M., CHEN M. J. Efficiency improvements on ninhydrin method for amino acid quantification. Journal of Food Composition and Analysis. 2006, Vol: 19, 112 – 117, ISSN: 08891575.

92

MOORE S., STEIN W. H. Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. Journal of Biological Chemistry. 1948, 176, 367 – 388.

134

Použitá literatura

93

PROCHAZKOVA S., VARUM K. M., OSTGAARD K. Quantitative determination of chitosans by ninhydrin, Carbohydrate Polymers. 1999, 38, 115 – 122.

94

LEGODI L. M. Improving wine yeast for fructose and nitrogen utilization. Master of Science Thesis. Stellenbosh University. 2009, 72 st.

95

VILANOVA M., UGLIANO M., VARELA C., SIEBERT T., PRETORIUS I. S., HENSCHKE P. A. Assimilable nitrogen utilisation and production of volatile and nonvolatile compounds in chemically defined medium by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts. Appl. Microbiol. Biotech. 2007, 77, 145 - 157.

96

HERNÁNDEZ-ORTE P., BELY M., CACHO J., FERREIRA V. Impact of ammonium additions on volatile acidity, ethanol, and aromatic compounds production by different Saccharomyces cerevisiae strains during fermentation in controlled synthetic media. Aust. J. Grape. Wine Res. 2006, 12, 150 - 160.

97

BRANDRISS M. C, MAGASANIK B. Genetics and physiology of proline utilization in Saccharomyces cerevisiae: enzyme induction by proline. J. Bacteriol. 1979, 140, 498 503.

98

SAXENA D., KANNAN K. B., BRANDRISS M. C. Rapamycin treatment results in GATA factor-independent hyperphosphorylation of the proline utilization pathway activator in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 2003, 2(3), 552 - 559.

99

WANG S. S., BRANDRISS M. C. Proline utilization in Saccharomyces cerevisiae: analysis of the cloned PUT1 gene. Mol. Cell Biol. 1986, 6(7), 2638-2645.

100

D'ALESSIO M., BRANDRISS M. C. Cross-Pathway Regulation in Saccharomyces cerevisiae: Activation of the Proline Utilization Pathway by Gal4p In Vivo. Journal of Bacteriology, 2000, 182, 3748-3753.

101

HUANG H. L., BRANDRISS M. C. The regulator of the yeast proline utilization pathway is differentially phosphorylated in response to the quality of the nitrogen source. Mol. Cell Biol. 2000, 20(3), 892 - 899.

102

LEVERENTZ M. K., CAMPBELL R. N., CONNOLLY Y., WHETTON A. D., REECE R. J. Mutation of a Phosphorylatable Residue in Put3p Affects the Magnitude of Rapamycin-induced PUT1 Activation in a Gat1p-dependent Manner. J. Biol. Chem. 2009, 284, 24115-24122.

103

TER SCHURE E. G., VAN RIEL N. A., VERRIPS C. T. The role of ammonia metabolism in nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Rev. 2000, 24(1), 67 - 83.

104

BAROŇ M., Hon na mineralitu. Vinařský obzor. 2010, 3, 120 - 121. ISSN 1212 - 7884.

135