Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně

Disertační práce

Biogenní aminy v hroznech révy vinné a ve víně Ing. Jaromír Veverka

Vedoucí práce: doc. Dr. Ing. Marie Kyseláková, CSc. Studijní program: Zahradnické inženýrství Studijní obor: Zahradnictví

Lednice 2012

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Biogenní aminy v hroznech révy vinné a ve víně vypracoval samostatně a všechny literární zdroje jsou správně a úplně citovány. Tato práce je z hlediska obsahu majetkem Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkana ZF MENDELU.

…………………………… Podpis doktoranda

Rád bych poděkoval všem, kteří mi poskytli podporu při zpracování této práce. Zejména paní š doc. Dr. Ing. Marii Kyselákové, CSc., za cenné rady a připomínky ohledně práce. Dále bych chtěl poděkovat doc. Ing. Františku Buňkovy za poskytnutí instrumentálního zařízení a pomoc při řešení analytické části práce.

Souhrn

Cílem práce bylo stanovení vybraných biogenních aminů u vybraných odrůd v hroznech révy vinné V literárním přehledu je popsána charakteristika biogenních aminů, jejich tvorba. Dále je specifikována tvorba biogenních aminů jednotlivými mikrobiologickými původci, jejich zdravotní vliv na lidský organismus. Pak je v práci charakterizován proces výroby vína a možné dopady tvorby a obsahu biogenních aminů při jeho výrobě. Vlastní práce je rozvržena do několika částí Byly monitorovány náhodně sebrané vzorky vína z celé moravské oblasti a analyzovány na obsahy biogenních aminů. V průběhu alkoholového kvašení, jablečnomléčného kvašení a v procesu čištění a školení byl sledován vývoj těchto látek. Byla sledována dynamika biogenních aminů během kvašení a byly zjišťovány BA po jabločnomléčném kvašení. Zjištění možnosti eliminace biogenních aminů při čiření vína – bylo sledováno snížení biogenních aminů při použití standartních čiřících látek (bentonit, želatina, PVPP, tosil). Sledované biogenní aminy (histamin, tyrozin, tryptamin, kadaverin, spermidin, spermin a putrescin) byly ve vzorcích analyzovány chromatografickým dělením a kvantifikovány srovnáním se standardy.

Summary

The aim of this work was the determination of selected biogenic amines in selected varieties vine fruit. The literature review describes the characteristics of biogenic amines, their creation, It is specified formation of biogenic amines individual microbiological agents and their health effects on the human organism. Then work characterized the winemaking process, and possible effects creation and content of biogenic amines in its manufacture. Custom work is divided into several parts Were monitored randomly collected samples of wines from around the Moravian region and analyzed the contents of biogenic amines. During alcoholic fermentation, jablečnomléčného fermentation and purification process was monitored training and development of these substances. Was observed dynamics of biogenic amines during fermentation and BA were determined after malolactical fermentation . Investigate the possibility of elimination of biogenic amines in wine clarification - were studied reduction of biogenic amines using standard fining agents (bentonite, gelatin, PVPP, Tosil). Watch biogenic amines (histamine, tyrosine, tryptamine, cadaverine, spermidine, spermine and putrescine) will be analyzed in a sample of chromatographic separation and quantified by comparison with standards.

Obsah 1. Úvod…………………………………………………………..……………………….

8

2. Biogenní aminy………………………………………………………...……………… 9 2.1. Výskyt biogenních aminů………………………………………………………… 9 2.1.1. Nefermentované potraviny………………………………………………… 9 2.1.2. Fermentované potraviny…………………………………………………… 10 2.2. Podmínky vzniku biogenních aminů……………………………………………… 12 2.3. Mikroorganismy produkující biogenní aminy……………………………………..15 2.3.1. Rod Bacillus……………………………………………………………….. 15 2.3.2. Rod Citrobacter……………………………………………………………. 16 2.3.3. Rod Clostridium…………………………………………………………… 16 2.3.4. Rod Escherichia…………………………………………………………… 17 2.3.5. Rod Hafnia………………………………………………………………… 17 2.3.6. Rod Klebsiella……………………………………………………………... 17 2.3.7. Rod Plesiomonas…………………………………………………………... 18 2.3.8. Rod Proteus………………………………………………………………... 18 2.3.9. Rod Pseudomonas…………………………………………………………. 18 2.3.10. Rod Salmonella……………………………………………………………. 19 2.3.11. Rod Shigella……………………………………………………………….. 19 2.3.12. Rod Serratia……………………………………………………………….. 19 2.3.13. Rod Lactobacillus…………………………………………………………. 19 2.3.14. Rod Pediococcus…………………………………………………………... 21 2.3.15. Rod Streptococcus…………………………………………………………. 21 2.3.16. Rod Micrococcus………………………………………………………….. 22 2.3.17. Rod Enterococcus…………………………………………………………. 22 2.3.18. Rod Leuconostoc…………………………………………………………... 24 2.3.19. Rod Oenococcus…………………………………………………………… 25 2.4. Biogenní aminy a zdravotní rizika………………………………………………... 28 2.4.1. Biologické účinky…………………………………………………………. 28 2.4.2. Otrava histaminem………………………………………………………… 30 2.4.3. Otrava tyraminem………………………………………………………….. 31 2.4.4. Role polyaminů……………………………………………………………. 32

2.4.5. Hygienické limity………………………………………………………….. 32 3. Metody stanovení biogenních aminů………………………………………………….. 34 4. Technologie výroby vína a biogenní aminy…………………………………………… 40 4.1. Tvorba BA ve víně………………………………………………………………... 40 4.2. Vliv zeměpisných podmínek při výrobě vína…………………………………….. 43 4.3. Vliv odrůdy na obsah BA…………………………………………………………. 43 4.4. Vliv technologie na obsah BA……………………………………………………. 44 4.5. Možné snížení BA………………………………………………………………… 44 4.6. Tvorba BA během alkoholového a JM kvašení…………………………………... 47 4.6.1. Tvorba BA během alkoholového kvašení…………………………………. 47 4.6.2. Tvorba BA během JMK…………………………………………………… 49 4.7. Vývoj biogenních aminů během zrání vína………………………………………. 53 4.7.1. Vývoj biogenních aminů ve zrajících v dubových sudech a nerezových nádobách……………………………………………………………………... 53 4.7.2. Vývoj aminů ve víně při skladování v láhvi………………………………. 56 5. Metodika………………………………………………………………………………. 58 5.1. Vzorky a jejich příprava…………………………………………………………... 58 5.1.1. Monitoring BA v moravských vínech……………………………………... 58 5.1.2. Sledování BA v průběhu alkoholového kvašení…………………………... 58 5.1.3. Pro zjištění vlivu napadení………………………………………………… 59 5.1.4. Srovnání BA u botrytických výběrů a nižších kategoriích vína…………… 59 5.1.5. Porovnání tvorby biogenních aminů u jablečnomléčného kvašení………... 60 5.1.6. Možnosti snížení BA u aplikace čiřících přípravků……………………….. 60 5.2. Chemikálie a standarty…………………………………………………………… 60 5.3. Stanovení biogenních aminů……………………………………………………... 61 6.

Výsledky……………………………………………………………………………… 63 6.1. Monitoring BA v moravských vínech…………………………………………….. 63 6.2. Sledování BA v průběhu alkoholového kvašení………………………………….. 68 6.3. Vliv na obsah BA při napadení hroznů houbovými chorobami…………………... 70 6.4. Srovnání BA u botrytických výběrů a nižších kategoriích vína…………………... 72 6.5. Porovnání tvorby biogenních aminů sledovaných u jablečnomléčného kvašení…. 74 6.6. Možnosti snížení BA u aplikace čiřících přípravků………………………………. 75

7. Statistické vyhodnocení………………………………………………………………... 77 8. Diskuse………………………………………………………………………………… 79 8.1. Monitoring BA v moravských vínech…………………………………………….. 84 8.2. Sledování BA v průběhu alkoholového kvašení………………………………….. 84 8.3. Vliv na obsah BA při napadení hroznů houbovými chorobami a srovnání BA u botrytických výběrů a nižších kategoriích vína…………………………………… 85 8.4. Porovnání tvorby biogenních aminů u jablečnomléčného kvašení……………….. 85 8.5. Možnosti snížení BA u aplikace čiřících přípravků……………………..………... 85 9. Závěr…………………………………………………………………………………… 86 10. Doporučení pro praxi a další výzkum…………………………………………………. 88 11. Seznam tabulek, obrázků a grafů…….………………………………………………… 89 Seznam použitých zkratek……………………………………………………………... 91 12. Použitá literatura……………………………………………………………………….. 92

1. Úvod Ve všech potravinách, které obsahují proteiny či volné aminokyseliny a podléhají mikrobiální či biochemické aktivitě, tak se v nich biogenní aminy (dále BA) mohou objevit. Množství vytvořených aminů silně závisí na povaze potravin a mikroorganismů. (Brink et al., 1990). Biogenní aminy jsou zastoupeny v širokém spektru potravinářských výrobků včetně rybích produktů, produktů masa, mléčných výrobků, vína, piva, zeleniny, plodů, ořechů a čokolády (Askar and Treptow, 1986; Brink et al., 1990). Biogenní aminy jsou organické sloučeniny odvozené od aminokyselin (AK), které se běžně podílejí na metabolických procesech v živých tkáních a vykazují různé biologické účinky. Mezi toxikologicky nejvýznamnější biogenní aminy patří tyramin a histamin. Tyramin zvyšuje krevní tlak, může způsobit u rizikových konzumentů migrenózní bolesti hlavy, krvácení do mozku a selhání srdce. Toxikologický limit se odhaduje na 100 mg.kg-1. Histamin způsobuje rozšíření periferních krevních cév, což vede ke snížení krevního tlaku a bolestem hlavy. Dále histamin indukuje kontrakci hladkých svalů vnitřností s následkem břišních křečí, průjmu a zvracení. Organismus člověka má k dispozici detoxikační mechanismy, které ale nejsou dostačující v případě některých konzumentů (alergici, pacienti konzumující inhibitory monoaminooxidázy [MAO] a diaminooxidázy [DAO]) nebo při příliš vysokém příjmu biogenních aminů v potravě. Víno jako potravinový doplněk je velmi přínosné pro lidský organismus, co se týká zdravotně prospěšných látek, ale také obsahuje škodlivé látky, jako alkohol, SO2, biogenní aminy a další. Jenže tyto nejsou v koncentracích, které by významně ovlivňovaly lidské zdraví. Tato práce se zabývá sledováním biogenních aminů v moravských vínech, dynamikou vývoje biogenních aminů během alkoholové fermentace a možnosti eliminace biogenních aminů ve víně.

1

2. Biogenní aminy 2.1.

Výskyt biogenních aminů

2.1.1. Nefermentovanané potraviny

V nefermentovaných potravinách je přítomnost biogenních aminů [BA] při vyšší koncentraci považována za nežádoucí mikrobiální aktivitu. Proto může být obsah biogenních aminů užívaný jako indikátor mikrobiální aktivity. Ať tak nebo onak, přítomnost biogenních aminů v jídle nemusí nutně korelovat s aktivitou mikroorganismů, protože nejsou vždy decarboxylaso-pozitivní (Santos et al., 1985; Vidal et al., 1990). Obsah histaminu, putrescinu a kadaverinu se většinou během skladování rybího masa zvýšuje, zatímco obsah sperminu a spermidinu se snižuje (Brink et al., 1990). Rybí maso. Tvorba histaminu v makrele a jiných mořských rybách, které obsahují hojně histidinu, byla přisuzována spíše mikrobiální aktivitě než aktivitě endogenní decarboxylasové (Baranowski et al., 1985; Halász et al, 1994). Ovoce, šťávy a zelenina. Některé šťávy, nektary a limonády vyrobené z pomerančů, malin, citrónů, grapefruitu, mandarinek, jahod, rybízu a hroznů obsahují i některé biogenní aminy v rozdílných koncentracích, přičemž nejvíce byl zastoupen putrescin (Maxa a Brandes,1993). Halászetal (1994) zjistil vysoký obsah aminů v pomerančovém džusu (noradrenalinu, tryptaminu), rajčeti (tyraminu, tryptaminu, histamin), banánu (tyraminu, noradrenalinu, tryptaminu, serotoninu), švestkách (tyraminu, noradrenalinu) a špenátu (histaminu). Phenylethylamin je přírodním produktem kakaových bobů a tak se vyskytuje v čokoládě, čokoládových výrobcích a cukrovinkách obsahující čokoládu. Dokonce i některé druhy hub mají vyšší hodnoty phenylethylaminu a bílý pepř obecný a sojová omáčka mají vyšší hodnoty pyrrolidinu (Pfundstein et al., 1991). Histamin a kadaverin byly zjištěny v karagenu z řas (Barwell, 1994). Maso. Podle Halász et al. (1994) čerstvé i zpracované vepřové maso obsahuje vyšší hodnoty spermidinu a sperminu ale nižší obsah noradrenalinu, putrescinu, histaminu, kadaverinu a tyraminu. Ve vařeném a syrovém hovězím a vepřovém mase bylo identifikováno několik biogenních aminů (Németh-Szerdahelyi et al., 1993). Histamin a podmínky pro jeho syntézu byly zjištěny

2

v hovězím a skopovém podle Teodorovic et al. (1994), a také v jiných druzích masa a produktů z masa jak zjistili Santos et al. (1985). Mléko. V mateřském mléce, byl zjištěný obsah sperminu, spermidinu a putrescinu s velkou proměnlivostí. Analýza mateřského mléka dokonce ukázala proměnou koncentraci sperminu a spermidinu mezi levou a pravou stranou hrudi (Romain et al., 1992).

2.1.2. Fermentovanané potraviny

Během fermentace potravin, kdy působí celá řada různých druhů mikroorganismů, z nichž část může být schopná produkce biogenních aminů, jsou největšími producenty značného množství putrescinu, kadaverinu, histaminu a tyraminu mléčné bakterie. (Brink et al., 1990). Sýry a mléčné výrobky. Po rybím mase je sýr nejčastější potravinou, která se spojuje s histaminovou otravou. První ohlášený případ s otravou byl v roce 1967 v Nizozemí a způsobil jej sýr Gouda (Stratton et al., 1991). Mnoho studií bylo podniknuto k tomu, aby se určil obsah aminů v sýrech. Různorodost aminů, jako histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, tryptamin a phenylethylamin byly nalezeny v mnoha druzích sýrů (Sumner et al., 1985; Iñigo et al., 1986; Vidaud et al., 1987; Stratton et al., 1991; Besancon et al., 1992; Celano et al., 1992; Diaz et al., 1992; Moret et al., 1992a, b; Lavanchy a Sieber, 1993). Histamin a tyramin se vyskytuje v hodnotách měnících se značně nejen mezi jinými variantami sýru ale uvnitř variant (Stratton et al., 1991). Kvašená zelenina. V technologii výroby mléčně kvašeného zelí je vlivem mikroorganismů očekáván zvýšený obsah biogenních aminů (Taylor et al., 1978; Brink et al., 1990), zvláště putrescinu, který je obsažen zejména v zelném láku. Velmi nízké hodnoty biogenních aminů byly zjištěny u asijských jídel. (Stratton et al., 1991). Víno a pivo. Agmatin, kadaverin, etanolamin, histamin, putrescin a tyramin jsou během alkoholového kvašení produkovány ve vyšším množství (Buteau et al., 1984). V červeném víně byl zjištěný histamin a tyramin (Bravo et al. (1983), Ough et al. (1987), Hanna et al. (1988), Littlewood et al. (1988), Stratton et al. (1991) a Pogorzelski (1992). V bílém a červeném víně bylo zjištěno větší množství těchto biogeních aminů: tyramin, histamin, tryptamin, monomethylamin, 2phenethylamin, putrescin, kadaverin, spermidin, iso a n-amylamine, pyrrolidin, iso- a n-butylamin, iso- a n-propylamine a etylamin (Ibe et al.,1991; Lehtonen et al., 1992).

3

V pivu byla zjištěna přítomnost tyraminu (Wheatley a Tinton, 1987; Halász et al., 1994) a histaminu (Dumont et al., 1992). Tab. 1: Obsah aminů (mg.l-1) v evropských (Izquierdo-Pulido et al., 1996) a českých pivech (Ka1ač et al., 1997)

Histamin Tyramin 2-Fenylethylamin Tryptamin Putrescin Kadaverin Agmatin Spermidin

Evropská piva (n = 195) xmax x Sx 1,2 2,4 21,6 6,5 9,0 67,5 0,4 0,8 8,3 0,4 1,0 5,4 4,8 2,3 15,2 2,4 6,1 39,9 10,5 5,8 40,9 0,7 1,0 až 6,8 -

Spermin

0,3

Biogenní amin

0,7

3,9

x 0,55 6,85 1,21 8,84 12,9 -

Česká piva (n = 78) xmax Sx 1,08 9,2 5,19 22,5 1,46 9,7 7,06 30,7 12,3 49,1 -

Fermentovné rybí produkty. Ačkoli byl udělán menší výzkum ke zjištění biogenních aminů ve fermentovaných rybích produktech, uvádí se, že hodnoty těchto aminů se mohou značně měnit. Yankahem et al. (1993) byly sledovány změny nestálých aminosloučenin během zpracování a skladování fermentovaných ryb. Bylo objeveno větší množství putrescinu, tyraminu, agmatinu a tryptaminu; histamin nebyl zjištěn. Jen spermidin byl vyšší po fermentaci. Mizutani et al., 1992 zjistil ornithin a citrullin jako produkty rozkladu argininu v rybí omáčce, a histamin. Ve studiích na sardeli Ayensa (1993) našel vysoké hodnoty biogenních aminů během výrobního postupu, což bylo zapříčiněno dlouhým časem při zpracování, jak tvrdí (Santos et al., 1986; Veciana et al., 1989). Hodnoty histaminu, který představuje toxický limit, jsou variabilní jako výsledek toxicity, která sníží množství konzumace, a mohou se objevit v rybích výrobcích. Tvorba histaminu je velmi proměnná a závislá na čase, teplotě, typu a množství mikroorganismů, které se zde mohou vyskytovat. Byla zjištěna velká korelace mezi smyslovým hodnocením kvality a obsahu putrescinu a kadaverinu v rybách (Sims et al., 1992).

4

-

2.2. Podmínky vzniku biogenních aminů Naprostá většina BA v potravinách vzniká dekarboxylací volných aminokyselin působením bakteriálních dekarboxyláz. Pro tvorbu významnějšího množství jsou nutné tři podmínky: •

dostupnost volných aminokyselin,

•

výskyt bakterií vybavených dekarboxylázami aminokyselin,

•

podmínky umožňující růst bakterií, biosyntézu dekarboxyláz a jejich aktivitu.

Významným předpokladem tvorby BA je proteolýza, ať už autolytická, či bakteriální.

Kromě toho byly ještě pozorovány velké rozdíly v obsahu aminů v různých dávkách stejné komerční značky fermentovaných výrobků. Přítomnost biogenních aminů v potravinách je důsledkem rovnováhy mezi fyzikálně chemickými charakteristikami produktu (pH, vodní aktivita, živiny), technologickými podmínkami (teplota, iniciátor zprostředkovávající fermentaci a použití surovin dobré hygienické kvality) a enzymatickou aktivitou přítomných mikroorganismů (Silla Santos, 1996., Peñas et al., 2010). Schopnost dekarboxylovat aminokyseliny je velmi rozmanitá. Dokonce i různé kmeny jednoho druhu se mohou lišit v produkci BA až o tři řády. Je proto téměř nemožné najít korelaci mezi obsahy BA a počty gramnegativních bakterií. Vzhledem k různorodosti druhů a kmenů jsou různé i optimální podmínky pro tvorbu BA, jako jsou teplota, pH, přístup kyslíku či obsah chloridu sodného. Většina aminů včetně histaminu je tepelně stálá. Některé dekarboxylázy si uchovávají aktivitu i po pasteraci, takže obsah BA může během skladování potravin ještě vzrůstat. Obsah aminů vyskytujících se v potravinách lze snížit několika způsoby: přídavkem enzymu diaminooxidázy (DAO; EC 1.4.3.6), oxidací BA za přítomnosti kyslíku na aldehydy nebo přídavkem sacharidů, které umožní reakci s aminy vedoucí k neenzymovému hnědnutí. Tyto úpravy však mají jen omezené použití. Rozhodující opatření spočívají v prevenci vzniku BA. Obecně lze obsah BA omezit náročným dodržováním hygieny surovin a zpracováním, což potlačí činnost bakterií způsobujících kažení. Při použití startovacích bakteriálních kultur omezujících spontánní fermentaci je třeba vybírat kmeny, které nejsou vybaveny dekarboxylázami (Křížek, Kalač, 1998).

5

Tab. 2: Biogení aminy, jejich prekursory, transformace a biologický význam (Velíšek, 2002)

6

Obr. 1: Tvorba biogenních aminů (Křížek, 1998)

7

2.3. Mikroorganismy produkující biogenní aminy Tab. 3: Významné bakterie produkující biogenní aminy (Sha1aby, 1996) Potravina ryby

sýry

maso a masné výrobky

fermentovaná zelenina fermentované produkty ze sóji

Mikroorganismy Morganella morganii, Klebsiella pneumonia, Hafnia alvei, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Bacillus sp., Staphylococcus xylosus Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. arabinosae, Streptococcus faecium, S. mitis, Bacillus macerans, Propionibacterium sp. Pediococcus sp., Lactobacillus sp., Pseudomonas sp., Streptococcus sp., Micrococcus sp., čeleď Enterobacteriaceae Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus sp. Rhizopus oligosporus, Trichosporon beigllii, Lactobacillus plantarum

Produkované aminy histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, agmatin, spermin, spermidin

histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, tryptamin

histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, fenylethylamin, tryptamin

histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, fenylethylamin, tryptamin histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, tryptamin

Jednotlivé rody a druhy produkující biogenní aminy 2.3.1. Rod Bacillus V přírodě je velmi rozšířený, sporotvorný a zahrnuje grampozitivní (G+), aerobní, případně fakultativně anaerobní tyčinky. Většina druhů tvoří proteolytické enzymy hydrolyzující želatinu a kasein, a amylolytické enzymy štěpící škrob a želatinu. Některé druhy syntetizují lecithinazu (B.cereus, B. thuringiensis, B. anthracis) a celou řadu hemolyzinů (B. cereus, B. megaterium, B. thuringiensis pod.). Řada druhů (B. subtilis, B. pumilis, B. licheniformis, B. brevis, a B. polymyxa) se využívá ve farmaceutickém průmyslu jako producenti antibiotik polypeptidové povahy (bacitracin, gramicidin a polymyxin). Bakteriálních amylas se využívá 8

v potravinářském průmyslu a proteáz v pracích prostředcích. Druhy patogenní pro hmyz se používají v boji proti škodlivému hmyzu (B. thuringiensis) jako komerčně vyráběný insekticid (Raymond et al., 2010). Pro kontrolu účinnosti sterilizace teplem včetně autoklávů, se používá B. stearothermophilus. Obligátně patogenní je B. anthracis, původce antraxu, enterotoxikózy vyvolávají svými toxiny B. cereus, případně některé kmeny B. subtilis, B. licheniformis a B. pumilis (Votava et al., 2006). Některé exopolysacharidy vylučované bacilem sp. prokázaly vynikající emulgační schopnosti využitelné pro odstranění těžkých kovů nebo ve farmaceutickém průmyslu (Liu et al., 2010). 2.3.2. Rod Citrobacter Patří mezi gramnegativní (G-) tyčinky a je podmíněným patogenem ve střevním traktu člověka a občasným patogenem močových cest. I u těchto bakterií přibývá kmenů produkujících širokospektré betalaktamázy. Často se jedná o kmeny málo virulentní, geny kódující rezistenci však mohou být přeneseny na virulentní kmeny jiných enterobakterií. Nejběžnějšími zástupci jsou druhy C. freundii, C. koseri (Votava et al., 2006). 2.3.3. Rod Clostridium Rod Clostridium zahrnuje sporulující bakterie rostoucí za anaerobních podmínek. Jsou (G+), peretrichní, pohyblivé, a jejich charakteristickou vlastností je tvorba oválných nebo kulatých endospor vyklenujících buňku. Bakterie se obvykle vyskytují jako saprofyté a účastní se hnilobných procesů. Jejich spory jsou vysoce rezistentní a jsou značně odolné vůči nepříznivým podmínkám vnějšího prostředí. Mohou se vyskytovat v půdě, vodě, prachu a mohou kontaminovat potraviny. Některé druhy mají silné proteolytické schopnosti a uplatňují se při anaerobním rozkladu potravin (C. sporogenes). Dalšími významnými druhy jsou C. acetobutylicum a C. butyricum, které se používají pro kvasnou výrobu kyseliny máselné a první z nich také pro výrobu butanolu a acetonu. Některé druhy produkují velmi nebezpečné toxiny. Z potravinářského hlediska jde o druh C. botulinum, jež produkuje tzv. botulotoxiny, které patří k nejúčinnějším jedům (Raphael et al., 2010). 1mg představuje smrtící dávku pro 16 000 lidí. Dalším producentem toxinů je druh C. perfringens. Otrava v tomto případě nastává po požití silně kontaminované potraviny o obsahu alespoň 106 g.ml-1. Nieto-Lozano et al., (2010) ve svém experimentu zjistili, že druh Pediococcus acidilactici má schopnost tvořit bakteriocin (pediocin PA-1), který výrazně přispívá k potlačení C. perfringens ve španělských fermentovaných salámech. Mezi další zástupce patří (C. tetanii -

9

tvoří neurotoxin; C. thermosacharolyticum - termofilní druh důležitý z konzervárenského hlediska) (Votava et al., 2006). Clostridium botulinum, které nemá proteolytické vlastnosti, představuje značné riziko kontaminace mléčných produktů, kde není jeho přítomnost předpokládána. Mléčné produkty bývají z hlediska rizika otravy botulinem považovány za relativně bezpečné (Malakar et al., 2010). 2.3.4. Rod Escherichia Z hygienického hlediska je rod Escherichia nejdůležitější. Jeho jednotlivé druhy jsou obyvately střevního traktu různých živočichů (Šilhánková, 2008). Snad nejznámějším a nejprostudovamějčím druhem je E. coli, neboť slouží jako modelový organismus pro biochemické, genetické (byla na ní prokázána bakteriální konjugace a replikace DNA, do jejího genomu byly vneseny geny pro nejrozmanitější látky, např. lidský inzulin, či interferon a geny kódující antigeny jiných mikrobů, což vede ke vzniku rekombinantních vakcín) a fyziologické studie. Pravidelně se vyskytuje v potravinářských surovinách, které byly v kontaktu s hnojenou půdou. Některé (enteropatogenní druhy E. coli čili EEC) způsobují průjmová střevní onemocnění a onemocnění močových cest (Votava et al., 2006). Pattarachai Kiratisin et al., (2008) ve své studii popsali velkou úmrtnost pacientů v Thajsku vlivem častého užívání antibiotik třetí generace např. (cefalosporin), vůčí kterým si bakterie E. coli a K. pneumoniae, vytvořily rezistenci, podobně jako u dalších antibiotik. 2.3.5. Rod Hafnia Jde o enterobakterii, která bývá v řadě případů kvůli biochemické blízkosti zaměňována za jiné bakerie (E. coli, Enterobacter atd.). Je o něco méně patogenní než enterobaktery a klebsiely. Není významným původcem gastroenteritid. Způsobuje spíše hafniové infekce, např. infekce oka. Hafnie je poměrně rezistentní na antibiotika. Jediným druhem je Hafnia alvei, která je přirozeným patogenem včel (Votava et al., 2006). Tento druh byl zjištěn i v potravinách (Vivas et al., 2008). 2.3.6. Rod Klebsiella Je blízký rodu Enterobacter. Je lépe adaptovaná i na život mimo střevo. Nejběžnějším druhem klebsiel je K. pneumonie a K. oxytoca. Biochemicky jsou klebsiely značně aktivní. Významné jsou pouzderné antigeny, které jsou výrazným faktorem virulence. Jako střevní komenzály jsou běžné méně než enterobaktery, zato jsou druhým nejběžnějším původcem uroinfekcí. Velmi významné jsou též infekce dýchacích cest (Votava et al., 2006). Autoři 10

(Chen et al., 2010) provádeli experiment s druhem K. oxytoca, kde sledovali možnost jejího využití k mikrobiální biodegradaci organonitrylových sloučenin přítomných v životním prostředí. 2.3.7. Rod Plesiomonas Plesiomonády byly nedávno vyčleněny z čeledi Vibrionaceae a přeřazeny mezi Enterobacteriaceae. Jediným zástupcem tohoto rodu je druh P. shigelloides, který je izolován z vody tropů a subtropů, sladkovodních i mořských ryb a z mnoha druhů zvířat, včetně skotu, prasat, koček, psů, ale hlavně studenokrevných - hadů, želv a také hmyzu. Jsou (G-) nesporulující tyčinky. Jsou to bakterie toxigenní a invazivní. Infekce jsou omezeny na dva projevy - průjmy a septikémie (Votava et al., 2006). 2.3.8. Rod Proteus Obecně se jedná o bakterie s mohutnou biochemickou, především proteolytickou aktivitou, štěpí močovinu, deaminují fenylalanin a tvoří sirovodík. Jsou to saprofyté dokonale přizpůsobení k likvidaci organických zbytků. K nejdůležitějším druhům patří P. mirabilis a P. vulgaris. Rod Proteus má velmi specifickou vlastnost: tvoří kolonie, ale zároveň se z místa inokulace plazí po povrchu agaru (Raussův fenomén). V lidském střevě se tyto bakterie nevyskytují jako běžná flóra, avšak patogenem bývají spíše mimo střevo, zejména v močových cestách (Votava et al., 2006). Proteus mirabilis, má schopnost tvořit biofilm, který ho činí rezistentním proti antimikrobiálním látkám a je příčinou zablokování močového katétru nebo cévek. Vzniklý biofilm je velmi těžké vymítit a stává se zdrojem sekundárních infekcí (Jones et al., 2009) 2.3.9. Rod Pseudomonas Zahrnuje přísně aerobní bakterie bez kvasných schopností. Některé druhy jsou pro své enzymové vybavení používány pro průmyslové oxidace různých organických sloučenin, hlavně při výrobě léků. Mají výrazné proteolytické a lipolytické schopnosti (Šilhánková, 2008). V potravinách se podílejí na vyvolávání cizích pachů a vůní, uplatňují se při kažení tuků, mléka i fermentovaných masných výrobků (Drosinos et al., 2005). Většinou jsou psychrofilní povahy. Významným zástupcem tohoto rodu je P. aeruginosa, jež je patogenní pro člověka, zvířata i rostliny. P aeruginosa může způsobit infekci jakéhokoli orgánu či systému těla. K těm nejhorším, a proto i nejobávanějším, patří infekty popálenin (smrtnost těchto sepsí je 60 %), sepse novorozenců a devastující infekce oka (Votava et al., 2006). 11

2.3.10. Rod Salmonella Rod Salmonella obsahuje pouze čtyři druhy a všechny jsou patogenní. Mezi významné zástupce tohoto rodu patří druh S. typhi, způsobuje velmi závažné, někdy dokonce smrtelné střevní onemocnění - břišní tyf (je patogenní pouze pro člověka). S. typhimurium, která je hojně rozšířená v přírodě, je patogenní pro člověka a hlodavce. S. enteritidis se často vyskytuje v trusu ptáků, odkud se může dostat do potravin. U člověka vede požití kontaminované potraviny k lehčím onemocněním, která jsou charakterizována průjmy a zvracením. U člověka je jedním z hlavních zdrojů salmonelózy vepřové maso (Górner et al., 2004). Salmonelóza může být smrtelná především u kojenců nebo malých dětí (Šilhánková, 2002). 2.3.11. Rod Shigella Shigella je bakterie zodpovědná za shigelózy a bacilární úplavici (objevena v roce 1897 japonským bakteriologem Kiyoshim Shigou). Biochemicky jsou shigely málo aktivní a jsou čistě lidským patogenem. U některých kmenů S. dysenterie je uplatňuje shiga toxin, který má enterotoxické, neurotoxické a cytotoxické účinky. Infekční dávka je velmi nízká (jen asi 100 bakterií) (Votava et al., 2006). 2.3.12. Rod Serratia Jsou výraznými patogeny, vzdorují desinfekci a najdeme je spíš ve vnějším prostředí než ve střevě. Nejčastějším představitelem je S. marcescens. Kmen S. marcescens HL1 ukázal silnou schopnost degradovat chloropren, trichlorethylen, tetrachlorethylen, a vinylchlorid (Li et al., 2008). Někdy tvoří pigment (prodigiosin), červené barvy, podle něhož dostal název další druh S. rubidea. Mohou způsobovat různé infekce např. dýchacích cest včetně pneumonií (Votava et al., 2006).

2.3.13. Rod Lactobacillus Většina druhů rodu Lactobacillus fermentuje glukózu a laktózu a odtud pochází jméno tohoto rodu. Náleží sem druhy bakterií, které tvoří část přirozené mikroflóry úst člověka, gastrointestinálního traktu a vagíny. Protože kyselina mléčná díky snížení pH zastavuje množení hnilobných bakterií, využívá se laktobacilů ke konzervaci potravin - ke kvašení zelí

12

a okurek - a k silážování píce. V mlékárenství se používá např. druh Latcobacillus delbrueskii ssp. bulgarikus k výrobě jogurtu. Lactobacillus acidophillus casei při přípravě sýrů. Laktobacily jsou nesporulující G+ tyčinky tvořící často řetízky. Většina laktobacilů, získaných z klinických vzorků, je mikroaerofilní, řidčeji jsou izolovány obligátní anaeroby. Jsou jen vzácně patogenní. Přesto jsou uváděny jako původci endokarditid, novorozeneckých meningitid, endometritid, abscesů, a bakteriemií a mohou osidlovat i močové cesty člověka (Merk et al., 2005). S těmito infekcemi jsou spojované rozmanité druhy laktobacilů, nejčastěji L. acidophilus. U ženy ve fertilním věku jsou příslušníci rodu Lactobacillus převážnou složkou poševní mikroflóry a nejvýznamnějším prvkem bránícím ascendentnímu pronikání infekce do dělohy. Dále se z obranných mechanismů uplatňuje kompetice o živiny, schopnost růstu v podobě biofilmu na sliznici, obsazení receptorů pro adhezi a tvorby antibakteriálních či toxických látek (peroxid vodíku, lekticiny). Léčba infekcí způsobených těmito vankomycinrezistentními bakteriemi je obvykle založena na vysokých dávkách penicilinu v kombinaci s gentamicinem. Velký význam fyziologické mikroflóry pro zdraví člověka je všeobecně znám. V tlustém střevě přispívá normální mikroflóra aktivně k řádnému průběhu metabolických procesů a je též podstatnou součástí protiinfekčních mechanismů střeva. Koncepce ovlivňování stavu mikroflóry a tím zdravotního stavu člověka je založena na využití probiotik a prebiotik (Berg, 1998). Prebiotika jsou nestravitelné potravinové doplňky (nejčastěji inulín, jeho deriváty a fruktooligosacharidy), které selektivně stimulují růst nebo životní aktivity laktobacilů a bifidobakterií (Candela et al., 2010; Wichienchot et al., 2010; Vergara et al., 2010). Nízkomolekulární látky s vlastnostmi prebiotik se přirozeně vyskytují např. v cibuli, česneku, pórku, artyčoku nebo čekance a v menší míře i v obilovinách. Dále jsou tyto oligosacharidy obsaženy v luštěninách. Probiotika jsou živé bakterie (nejčastěji právě laktobacily a bifidobakterie), dodávané organismu jako potravinové doplňky. Jsou to nepatogenní a netoxigenní druhy bakterií, které přežívají v potravinách a vydrží průchod prostředím žaludku a tenkého střeva. Laktobacily jsou probiotika kolonizující sliznici střeva, čímž dochází ke snížení klostridií na střevní sliznici, a snižují též možnosti adheze enteroaptogenních a enterotoxigenních kmenů, např. Escherchia coli, Salmonella typhimurium a Yersenia pseudotuberculosis. Suplementace 13

stravy probiotiky též vyvolává pokles rotavirových onemocnění u dětí a laktobacily byly opakovaně použity při léčbě pseudomembranózní kolitidy (kmen L. acidophilus GG kolonizuje střevo a tvoří metabolit toxický pro klostridia). Z imunologického hlediska se probiotika podílejí na imunostimulačním působení (složky stěny, zejména lipopolysacharid, lipoteichová kyselina a peptidoglykany, představují silné podněty pro slizniční a systémovou imunitu), takže mohou vést k potlačení zánětlivých procesů, nebo např. ke snížení projevů alergie na bílkoviny kravského mléka a atopického ekzému u dětí (Votava et al., 2006). Ne všechny experimenty s probiotiky však dopadají dle očekávání. Autoři Raimond., et al. (2010) uvádí, že v Nizozemsku byl zkoumán účinek podávání probiotik na vybrané skupině pacientů po těžké akutní pankreatitidě, na snížení infekčních komplikací. Výsledky této studie byly zcela v rozporu s očekáváním. Nedošlo ke znehodnocení infekčních komplikací, a navíc u pacientů užívajících probiotika přetrvával více než dvojnásobek relativního rizika úmrtnosti.

2.3.14. Rod Pediococcus Je mikroaerofilní až anaerobní, G+, tvoří buňky ve dvojicích nebo tetrádách. Některé druhy jsou velmi obávanými kontaminanty v pivovarnictví, neboť tvoří biacetyl. Druhy rodu Pediococcus se vyskytují v kysaném zelí, v silážích, a k zaočkování prátů při výrobě speciálních uzenářských výrobků, protože rychle tvoří kyselinu mléčnou, která potlačuje růst a rozvoj hnilobné mikroflóry (Šilhánková, 2008). Druh Pediococcus pentosaceus má schopnost produkovat bakteriociny např. (pentocin), který má širokou antimikrobiální aktivitu (Yanshun et al., 2010).

2.3.15. Rod Streptococcus Do rodu Streptococcus náleží fakultativně anaerobní G+ katalazanegativní koky, které se řadí do dvojic až řetízků, jejichž kolonie jsou i na obohacených půdách někdy velmi drobné. Jsou citlivé na vankomycin a mnohé na krevním agaru hemolyzují. Mezi streptokoky patří jak druhy obligátně patogenní, tak příslušníci normální mikroflóry sliznic lidí a zvířat. Pro klinické mikrobiology je užitečné dělit streptokoky podle hemolýzy. U streptokoků rozeznáváme hemolýzu beta, alfa a gama. Beta-hemolýza se projevuje odbarvením erytrocytů. Pokud dojde zároveň k projasnění půdy v okolí hemolytické kolonie,

14

označujeme hemolýzu jako úplnou, ale pokud půda v zóně hemolýzy zůstává zakalená, nazýváme tuto hemolýzu neúplnou. Úplnou hemolýzu působí Streptococcus pyogenes a beta-hemolytické streptokoky skupin C, G F, neúplná je typická pro Streptococcus agalactiae. V druhém případě pak označíme kmen za gama-hemolytický čili nehemolytický. Alfa- hemolýza je vidět u Streptococcus pneumonie (původce zápalu plic; Selickman et al., 2010) a dalších např. S. suis, S. anginosus group apod. Jak mezi viridujícími, tak beta- hemolytickými streptokoky se vyskytující kmeny nehemolytické, nejvíce ve skupině Streptococcus bovis. Důležitým kritériem dělení streptokoků je přítomnost skupinově specifického polysacharidu C. Je-li polysacharid C přítomen, pak umožňuje rozlišit antigenní skupiny A-Z dle Lancefieldové. Lékařsky vyznané streptokoky obsahují antigeny A (S. pyogenes), B (S. agalactiae), C (Streptococcus dysgalactiae ssp. Equisimilis a Streptococcus equi ssp. zooepidermicus), D (S. bovis), G (S. dysgalactiae ssp. equisimilis) a další (Votava et al., 2006).

2.3.16. Rod Micrococcus Mikrokoky jsou G+ katalazapozitivní a koagulazanegativní koky uspořádané často v tetrádách nebo paketech. Produkují pigment, rostou na běžných půdách ve žlutých až žlutozelených koloniích. Vyskytují se na kůži, v potravinách, v půdě, ve vodě, v prachu, obvykle jsou nepatogenní, ale u osob s oslabenou imunitou jsou spojovány s bakteriemi, endokarditidami, mozkovými abscesy či septickou artritidou. Do rodu patří nyní jen Micrococcus luteus a Micrococcus lylae. K léčbě lze použít vankomycin, penicilin či rifampicin. Kilic et al., (2008) ve svém experimentu popisují možnost využití rodu Micrococcus k degradaci těžkých kovů především chromu.

2.3.17. Rod Enterococcus Mikroskopicky se jedná o G+, oválné až lehce protáhlé koky uspořádané ve dvojicích, drobných shlucích nebo krátkých řetízcích. Jsou fakultativně anaerobní, katalasa negativní (některé kmeny produkují pseudokatalázu) Enterokokové infekce u člověka jsou přibližně v 90 % vyvolány Enterococcus faecalis, v 7 % Enterococcus faecuim. Další druhy (Enterococcus gallinarum, Enterococcus durans, Enterococcus casseflavus, Enterococcus mundtii, Enterococcus flavescens) se při infekcích uplatňují vzácně. 15

Enterokoky jsou kultivačně nenáročné, na krevním agaru rostou v drobných šedobílých koloniích 1-3 mm velkých, často se zónou viridace, vyjímečně s P-hemolýzou (některé kmeny E. durans). Existují však i kmeny rostoucí bez hemolýzy. Některé druhy enterokoků produkují žlutý pigment (E. casseflavius, E. mundii a E. flavescens). Kmeny druhů E. gallinarum, E. casseliflavus, E. flavescens a zčásti i E. faecium jsou pohyblivé (Franz et al., 2003). Pro záchyt enterokoků může být použita selektivně diagnostická půda Slanetz Bartley, která obsahuje azid sodný, trifenyltetrazoliumchlorid a glukosu. Enterokoky zde rostou v růžových až červených koloniích. Všechny enterokoky významné v humánní medicíně

hydrolyzují

pyrrolidonyl-ß-naftylamid

a

leucin-ß-naftylamid

(jsou

tedy

pyrrolidonylarylamidasa neboli PYR-pozitivní a leucinaminopeptidaza čili LAP- pozitivní), hydrolyzují skulin i v přítomnosti 40 % žluči, rostou na půdách obsahující až 6,5 % NaCl a v širokém rozmezí teplot 25 - 45° C. O vysoké odolnosti enterokoků dále svědčí jejich schopnost množit se při pH 4,8 až 11 a přežít půlhodinové zahřátí na 60° C (Moreno et al., 2006). Enterokoky mají společný skupinový antigen D (je jím glycerol-teichoová kyselina vázaná na buněčnou stěnu). Kmeny druhu Enterococcus avium mohou navíc syntetizovat skupinový polysacharid příslušející serologické skupině Q. Jak naznačuje jejich název, enterokoky tvoří součást normální střevní flóry. Patří mezi závažné podmíněné patogeny, infekce jimi způsobené mohou být endogenní i exogenní, často nosokomiální. Nosokomiální kmeny jsou často rezistentní na všechna konvenčně používaná antibiotika (Valenzuelet al., 2009). Enterokokové infekce jsou časté u dlouhodobě hospitalizovaných pacientů se zavedenými močovými a intravaskulárními katétry a u pacientů léčených širokospektrými antibiotiky, aminoglykosidy a cefalosporiny. Enterokoky jsou hlavně původci infekcí močových cest, ale jsou spojováni i s infekcemi ran a nitrobřišními záněty. Enterokoková endokarditida je častá u uživatelů injekčních drog nebo u starších osob a mívá poměrně vysokou mortalitu. Figurují i jako původci bakteriémií a katétrových sepsí, meningitid, peritonitid, osteomyelitid, infekcí žlučových cest a gynekologických zánětů. Enterokoky sice neprodukují toxin, ale jako faktory virulence se mohou uplatnit mnohé secernované produkty jako želatinasa (hydrolyzujje kolagen, želatinu, hemoglobin aj.) a substance typu chemoatraktans (láká neutrofily a může regulovat zánětlivou odpověď). Dále se mohou uplatnit kolonizační faktory, jako např. agregační substance (fimbrie, které

16

umožňují vazbu na epitelové buňky) nebo sacharidové adhesiny, které odpovídají za adherenci na buňky střeva a pochvy. Enterokoky navíc produkují bakteriociny - např. cytolysin, který inhibuje růst jiných G+ bakterií a usnadňuje tak enterokokům kolonizaci sliznic (Klein, 2003). A nakonec virulenci ovlivňují i bakteriální geny. Například rezistence na vankomycin je spojena s geny VanA,B,C. Gen VanC je gen přirozené rezistence některých enterokokových druhů na vankomycin a není přenosný. Naproti tomu geny VanA a VanB lze přenést plastidy, enterokoky do té doby citlivé tedy mohou přenosem těchto genů rezistenci získat (KasimogluDogru et al., 2010). Enterokoky jsou primárně zcela rezistentní k cefalosporinům I., II. a III. generace. K léčbě lehčích infekcí močového traktu se doporučuje ampicilin, nebo amplicilin s inhibitorem Plaktamas (kyselinu klavulanovou nebo sulbaktanem), fluorochinolony, nitrofurantoin. V léčbě ranných infekcí, abdominálních sepsí, urosepsí a endokarditid se uplatňují zejména kombinace amoniglykosidů s penicilinem, ampicilinem nebo glykopeptidy (vankomycinem, teikoplaninem). V současné době se zvyšuje rezistence k vankomycinu (tyto kmeny se označují jako VRE, z angl. Vancomycin-resistant enterococci) aminoglykosidům, ampicilinu a k dalším penicilinům (Morris-Downes et al., 2010; Wilson et al., 2002)). K léčebnému ovlivnění těchto rezistentních enterokoků lze použít linezolid, dalfopristin a některé nové fluorochinolony (Votava et al., 2006). Některé druhy enterokoků, např. Enterococcus faecium jsou využívány v potravinářském průmyslu jako součást startovacích nebo probiotických kultur. Nicméně, role enterokoků jako probiotik je stále kontroverzní, protože se velkou měrou podílejí na infekcích močových cest, bakteriémii, endokarditidách, kontaminaci katétrů atd. (Martín-Platero et al., 2009). Podle autorů Topcu et al., (2010) může být tento druh enterokoka použit k mikrobiální degradaci mykotoxinů aflatoxinu B1 a patulinu.

2.3.18. Rod Leuconostoc Leuconostoc je rod grampozitivních bakterií, čeleď Lactobacillaceae. Tvarem jsou vejčité koky, které často tvoří řetízky. Leuconostoc sp. jsou odolné vůči vancomycinu. Velikost buněk [µm]: 0,7-1,2 x 0,5-0,7, jsou fakultativně anaerobní, způsob výživy: chemoorganotrofní, optimální kultivační teplota: 20-25° C. Všechny druhy v rámci tohoto rodu jsou heterofermentativní a jsou schopné 17

produkovat dextran ze sacharózy. Jsou resistentní na antibiotikum vancomycin. Většinou vytváží sliz. Ve víně jsou zodpovědny také za 'negativní mléčné aroma' při vlastním kvašení, některé druhy také mohou způsobit infekci člověka. Leuconostoc spolu s dalšími bakterií mléčného kvašení, jako jsou Pediococcus a Lactobacillus způsobuje fermentaci mléčně zkvašeného zelí. V tomto procesu jsou cukry v čerstvé zelenině metabolizovány na kyselinu mléčnou, které jí dává kyselou chuť a dobrou schopnost skladovatelnost. Navíc, konečné produkty mají za následek různorodou vůni v kvasícím médiu. Leuconostoc při mléčném kvašení produkují důležité složky pro vůni, jako je diacetyl, který propůjčuje žádoucí máslovou vůni mléčně kvašeným produktům. Hlavní diagnostické znaky: katalasanegativní, fermentativní metabolismus, sacharidy štěpí na D(-) kyselinu mléčnou, octovou, ethanol a CO2, využívá citráty za tvorby diacetylu, acetoinu a CO2, nehydrolysuje arginin, neredukuje nitráty, některé kmeny produkují extracelulární dextrany. Výskyt a význam: vyskytuje se při degradaci rostlinného materiálu obsahující sacharidy, maso, mléko a mléčné výrobky; použití - fermentace potravin (zelenina, mléčné výrobky, sladová a obilná whisky, káva, kakao, vanilkové lusky) (Hutkins, R, 2006),.

2.3.19. Rod Oenococcus Oenococcus je rod grampozitivní bakterií, čeleď Leuconostocaceae. Obsahuje jeden druh v tomto rodu - Oenococcus oeni (který byl dříve znám jako Leuconostoc oenos - do roku 1995). V roce 2006, byl identifikován druh Oenococcus kitaharae. Jak jeho název napovídá, Oenococcus oeni (dříve Leuconostoc oeni) má velký význam v oblasti vinařství, kde se podílí na jablečnomléčném kvašení. Rozvoj bakterií ve víně závisí velkou měrou na sacharidech a organických kyselinách. Vedle kyseliny jablečné, která vede k odkyselení vína, je schopna degradace dalších organických kyselin, jako kyseliny citronové, což vede k vyšší tvorbě diacetylu (Fugelsang, 2007). Oenococcus

oeni

jsou

grampositivní,

nepohyblivé,

fakultativně

anaerobní,

katalázanegativní, elipsoidické až kulovité buňky, které se obvykle vyskytují v párech nebo řetízcích. Druh je heterofermentativní, v první řadě zkvašuje glukosu na kyselinu mléčnou. 18

Obr. 2: Bakterie JMK: izolované z vína pod rastrovacím elektronovým mikroskopem (Departement de Microscopie Electronique, univerzita Bordeaux) (Fugelsang, K. C. 2007) . (a) fotografie Lactobacillus plantarum - buňka: c cytoplazma; pm cytoplazmatická membrána; cw buněčná stěna; s přepážka; m mesosome; n jádra.

(b) fotografie Oenococcus oeni (rastrovací elektronový mikroskop).

19

Obr. 3: Syntéza argininu (Ribéreau-Gayon, 2005).

20

2.4. Biogenní aminy a zdravotní rizika Biogenní aminy jsou skupinou alifatických, aromatických nebo heterocyklických bází odvozených od aminokyselin, které vykazují různé biologické účinky. Některé biogenní aminy mají samy významné biologické vlastnosti, neboť jsou např. tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) a stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů živočichů (fenylethyi-amin), fytohormonů neboli auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin (Velíšek, 2002).

2.4.1. Biologické účinky Biogenní aminy jsou pro organismus nepostradatelné, ale ve vysokých koncentracích se mohou projevovat jako látky: psychoaktivní nebo vasoaktivní. Psychoaktivní aminy působí jako přenašeči v centrálním nervovém systému, vasoaktivní aminy působí přímo nebo nepřímo na vaskulární systém. Vasoaktivní aminy se podle účinku dělí na: -

vasokontraktibilní (např. tyramin)

-

vasodilatační aminy (např. histamin). Symptomy konzumace vysokých dávek biogenních aminů jsou zvracení, dýchací potíže, pocení, bušení srdce, hypotenze nebo hypertenze (histamin) a migrény (fenylethylamin, tyramin).

Monoaminoxidasa a diaminooxidasa jsou hlavními enzymy, které biogenní aminy odbourávají. Toxický účinek biogenních aminů je silně ovlivněn aktivitou těchto enzymů, která může být u jednotlivých jedinců různá a závislá na řadě faktorů, např. na přítomnosti inhibitorů (určitá léčiva) nebo potenciátorů. Vysoké koncentrace biogenních aminů není již schopen tento enzymový systém eliminovat. Při hodnocení toxického účinku je nutné zvažovat nejen přítomnost konkrétního aminu, ale i ostatních faktorů, jakými jsou množství spotřebované potraviny, přítomnost jiných toxických látek apod. Z tohoto důvodu je velmi obtížné stanovit hranici toxicity biogenních aminů. Koncentrace histaminu vyšší než 500-1000 mg.kg-1 se považují pro člověka za nebezpečné. Zvýšené množství histaminu může vyvolat anafylaktický šok (tj. silný otřes

21

provázený poruchou hlavních funkcí organismu) např. po bodnutí včelou, jejíž jed obsahuje histamin. V řadě zemí je předepsáno nejvyšší povolené množství histaminu a tyraminu. Znalosti o toxicitě ostatních biogenních aminů jsou nedostatečné. Pro fenylethylamin se uvádějí hodnoty 30 mg.kg-1. Tab. 4: Biogenní aminy, jejich prekurzory, produkty transformace a biologický význam (Velíšek, 2002) Biogenní amin Histamin

Původní Další produkty aminokyselina aminokyselin a transformace aminu histidin

kadaverin lysin

putrescin

arginin via ornithin nebo citrullin

N-methylputrescin, Spermidin, spermin

Agmatin

arginin

putrescin, Nmethylputrescin, spermidin, spermin

Fenylethyl fenylalanin amin Tyramin tyrosin

dopamin DOPA tryptamin tryptofan

tyramin, dopamin, adrenalin, noradrenalin dopamin, adrenalin, noradrenalin, synefřin, hordenin Noradrenalin, adrenalin Serotonin, melatonin

Biologický význam

lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak, sekreci žaludeční šťávy, účast při anafylaktickém šoku a alergických reakcích stabilizace makromolekul (nukleové kyseliny), subcelulárních struktur (ribosomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon stabilizace makromolekul (nukleové kyseliny), subcelulárních struktur (ribosomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon stabilizace makromolekul (nukleové kyseliny), subcelulárních struktur (ribosomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon prekurzor tyraminu prekurzor dopaminu, lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak a kontrakce hladkého svalstva mediatory sympatických nervů lokální tkáňové a rostlinné hormony (katecholaminy), vliv na krevní tlak, peristaltiku střev, psychické funkce

Biogenní aminy, zejména histamin, tyramin, putrescin, spermidin a spermin, jsou u živočichů potřebné pro řadu fyziologických funkcí. Při nadměrném příjmu potravou však mohou vyvolávat projevy otravy. Ovlivňují krevní tlak (histamin snižuje, tyramin zvyšuje), histamin má psychoaktivní účinky. Projevy intoxikace jsou nervové a kožní, zejména nucení ke zvracení, dýchací potíže, bušení srdce, bolení hlavy, zvýšení i pokles krevního tlaku, zrudnutí v obličeji, pálení v ústech, červená vyrážka na kůži (Brink et al., 1990). Jednoznačně 22

nejzávažnější jsou otravy histaminem. Ve střevním traktu savců působí značně účinný detoxikační systém, který dokáže metabolizovat normální příjem biogenních aminů potravou. Hlavní roli hrají hojně zastoupené enzymy monoaminooxidasa a již zmíněná diaminooxidasa. Ty však mají jen určitou kapacitu, která nezvládne nadměrný příjem biogenních aminů. Ten se může projevit již u potravin, které dosud nejeví senzoricky postřehnutelné projevy kažení. Enzymy působí ve střevním epitelu, takže do krevního oběhu se dostávají již produkty oxidace biogenních aminů. Aktivitu těchto

enzymů

snižuje

alkohol,

především

však

některé

léky,

tzv.

inhibitory

monoaminooxidasy. Nejvýraznější je to u některých psychofarmak. Nepříznivě působí zejména klasická antidepresiva Tranylcyprornin, Nardil, Anuredal a Imipramin, z nichž některá jsou nyní nahrazována preparáty s jinými farmakodynamickými účinky. Nežádoucí účinky byly zjištěny rovněž u izoniazidu používaného při léčbě tuberkulózy a u některých antimalarik. Velmi podstatné je, že detoxikační schopnost organismu je značně individuální a zhoršuje se např. při některých onemocněních. Proto je obtížné stanovit jednoznačné nejvyšší přijatelné koncentrace jednotlivých aminů. Škodlivé účinky dvou nejvýznamnějších - histamin a tyramin - mohou být zesíleny jednak ostatními současně přijímanými biogenní aminy, zejména putrescinu a kadaverinu, které vyčerpávají část detoxikační kapacity aminooxidas, jednak dosud neidentifikovanými látkami, které se předpokládají v potravinách, u nichž došlo k bakteriální degradaci bílkovin. Tyto látky by zřejmě měly po vstřebání vyvolat uvolňování histaminu vázaného v žírných buňkách a v dalších tělních rezervoárech, čímž by zesilovaly účinky histaminu přijatého potravou. Některé biogenní aminy jsou posuzovány jako potenciální karcinogeny. Zahříváním putrescinu může vznikat pyrrolidin, z kadaverinu piperidin. Tyto produkty mohou být za určitých podmínek nitrozovány obdobně jako sekundární aminoskupiny agmatin, spermidin a spermin (Sha1aby, 1996). Obsahy v pokusných dietách, které nevyvolaly u krys pozorovatelné nežádoucí účinky, byly 2 000 mg.kg-1 diety pro tyramin, 1 000 mg.kg-1 pro spermidin, ale jen 200 mg.kg-1 pro spermin (Til et al., 1997).

2.4.2. Otrava histaminem Histamin, který může zasahovat do řady fyziologických funkcí, je dvojího původu. V lidském organismu je uložen v žírných buňkách a v basofilních granulocytech, což je jeden z druhů bílých krvinek. Odtud se při alergické reakci uvolňuje do krevního oběhu. Druhým

23

zdrojem je potrava. Příjem histaminu potravou může vést ke stejným potížím, jako jeho uvolnění z tělních depozit. Projevy jsou obdobné jako alergie na určité potraviny, takže se intoxikace často mylně diagnostikuje jako alergická reakce. Otrava histaminem se však dá rozlišit podle toho, zda se již dříve vyskytla alergie na stejnou potravinu, zda došlo k projevům u více lidí a zda lze v dané potravině předpokládat vysoký obsah histaminu (Brink et. al, 1990). Rychlost, s jakou se dostaví účinky po příjmu histamin (někdy dokonce do pěti minut) nasvědčuje vstřebávání alespoň části histaminu, příp. i dalších biogenních aminů již z ústní dutiny, tedy dříve než může být detoxikován střevními aminooxidasami (Silla Santos, 1996). I když se pro otravu histamin traduje zesilující účinek dalších současně přijatých biogenní aminy, existují názory, že se tyto synergické účinky neuplatňují (Clifford et al., 1991). Inkubační doba je vesměs do 30 minut po požití. Projevy obvykle trvají několik hodin, někdy však až několik dnů. Otrava histaminem se proti jiným intoxikacím potravinami odlišuje projevy na kůži. Otravu lze rychle překonat podáním antihistaminik (Slorach, 1991). Metabolismus histamin v lidském organismu je dvojí: -

dusík v imidazolovém cykluje metylován pomocí histamin-N-metyltransferasy za

vzniku N-metyl-histaminu, který je dále oxidován MAO na N-metylimidazoloctovou kyselinu; -

působením diaminooxidasy je oxidován na imidazoloctovou kyselinu, která se váže na

ribosu (Stratton et al., 1991). V zemích s velkou spotřebou mořských ryb patří otravy histaminem k nejběžnějším typům otrav potravinami (Slorach, 1991). Proto se často používá pojmu skombrotoxikosa, neboť původcem jsou především tzv. skombroidní ryby a výrobky z nich. Jedná se o čeled makrelovité (Scombridae), představovanou zejména makrelami a tuňáky, rohoretky (Scomberesocidae, např. saira), ale také o ryby z čeledi sleďovité (Clupeidae), především sledě, sardinky a ančovičky.

2.4.3. Otravy tyraminem Tyramin je nejúčinnější ze skupiny tzv. vasoaktivních aminů, tj. látek, které zvyšují krevní tlak. Účinky tryptaminu a 2fenyletylaminu jsou slabší. Tyramin může při podávání léků inhibujících monoaminooxidasu vyvolat hypertenzní krizi se silnými bolestmi hlavy, krvácením do mozku i selháním srdce. Mírnější intoxikace tyramin se projevují jako migrény (Shalaby, 1996). Poprvé bylo zvýšení krevního tlaku vyvolané tyramin zjištěno po konzumaci sýrů u

24

pacientů léčených inhibitory monoaminooxidasy v 60. letech. Proto se intoxikace tyraminem často označuje jako „reakce na sýry" (angl. cheese reaction).

2.4.4. Role polyamidů Polyaminy, jimiž jsou z biologického hlediska spermidin, spermin a putrescin, příp. i kadaverin, jsou pro všechny živé buňky nepostradatelnou složkou, neboť se podílejí na syntéze nukleových kyselin a bílkovin. Donedávna se předpokládalo, že buňky kryjí jejich potřebu vlastní syntézou. Prokázalo se však, že lidský organismus využívá i polyaminy z potravy, které zřejmě ukládá jako rezervu ve svalech a kůži. Zvýšená spotřeba polyaminů se projevuje při nádorovém bujení. Za těchto okolností by měl být jejich příjem co nejnižší. Naproti tomu v obdobích, kdy je žádoucí intenzivní růst buněk, jako je hojení ran, pooperační stavy apod., může být žádoucí zvýšený příjem (Bardócz, 1989; Bardócz et al., 1993).

2.4.5. Hygienické limity Jak již bylo uvedeno, je určení nejvyšších přípustných koncentrací biogenní aminy v potravinách obtížné. Askar a Treptow (1986) uvádějí, že orální příjem 8-40 mg histaminu vyvolá projevy lehké otravy, 40 až 100 mg střední a nad 100 mg silné intoxikace. Na základě vyhodnocení 250 skombrotoxikos navrhli Bartolomew et al. (1987) považovat obsah histamin v rybách do 50 mg.kg-1 za bezpečný, 50-200 mg.kg-1 za potenciálně toxický, 200 až 1 000 mg.kg-1 za pravděpodobně toxický a nad 1 000 mg.kg-1 za toxický a nebezpečný pro spotřebu. Některé země stanovily maximální obsah histamin v rybách legislativně - např. Francie 100 mg.kg-1, Česká republika, Švédsko a Izrael 200 mg.kg-1, USA 500 mg.kg-1. V Evropské unii se od roku 1991 pro hodnocení partie čerstvých ryb z čeledí makrelovité a sleďovité odebírá devět kusů. U dvou z nich se připouští obsah histamin v rozmezí 100-200 mg.kg-1, u zbývajících sedmi musí být nižší než 100 mg.kg-1 (cit. Sha1aby, 1996). Ve Švýcarsku je hygienický limit obsahu histamin ve víně 10 mg.l-1, v ČR 20 mg.kg-1; v literatuře se však objevují návrhy snížit limit histamin v alkoholických nápojích na 2 mg.l-1 (Brink et al., 1990). Pro přijatelný obsah tyraminu se běžně uvádí široké rozpětí 100-800 mg.kg-1. V ČR je nyní přípustné množství pro sýry 200 mg.kg-1, pro červená vína 50 mg.kg-1 a pro ostatní potraviny 100 mg.kg-1. Příjem 10-80 mg tyramin může vyvolat otoky, více než 100 mg migrénu (Askar, 25

Treptow, 1986). Pro pacienty léčené inhibitory MAO by neměl příjem tyramin překročit 6 mg během čtyř hodin. Za riziková se považují např. piva s obsahem tyramin nad 10 mg.l-1 (Tai1or et al., 1995). Nejméně údajů je o fenyletylaminu, jehož obsah do 30 mg.kg-1 je pokládán za přijatelný. Obsah do 100-200 mg na 1 kg HI + TY + FEA by rovněž neměl představovat riziko (Nout, 1993). Pro ostatní biogenní aminy nebyly hygienické limity dosud navrhnuty. Legislativní limity obsahu BA V EU je legislativní limit stanoven Nařízením EP a Rady (ES) 2073/2005. O mikrobiologických kritériích pro potraviny (2005) jen pro histamin, a to u produktů rybolovu z druhů ryb spojených s vysokým množstvím histidinu (ryby čeledi Engraulidae, Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatoidae, Scombresosidae) a u produktů rybolovu, které byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku a byly vyrobeny z těchto druhů ryb. U ryb při odběru devíti vzorků musí být u sedmi z nich dodržen limit 100 mg.kg-1, dva vzorky mohou obsahovat 200 mg.kg-1 histaminu. V případě rybích produktů ošetřených enzymatickým zráním v láku, platí limit 200 mg.kg-1 u sedmi z devíti vzorků, dva mohou obsahovat 400 mg.kg-1. Limity platí pro výše uvedené produkty uvedené na trh během celé doby údržnosti. (Cwiková, 2009). Tab. 5: Obsahy putrescinu, spermidinu a sperminu v některých potravinách (Bardócz et al., 1993) Potravina Vepřové maso libové Hovězí maso vařené Kuřecí maso Treska Mléko polotučné Sýr čedar „mladý" Sýr čedar vyzrálý Chléb bílý Rýže vařená Brambory vařené Salát hlávkový Rajčata Hrášek zelený vařený Jablka Hrušky Pomeranče

putrescin 3,1 1,9-2,8 2,8 26-30 0,1 10-20 650 1,5-1,8 1,0 20 3,2-4,8 9-122 5,7 0,4-1,7 24 95-140

26

spermidin 2,8-4,7 5,4-6,5 9,0 1,0-1,5 0,3-0,6 77-104 190 8,0 1,4 15 4,0-8,0 2,0 62 2,4 15-73 9,0

spermin 29-68 22-32 57 2,9-6,2 0,2-0,4 23-37 22-38 3,5 8-10 5,0 0 0 32-69 0 8-47 0

3.

Metody stanovení biogenních aminů Pro stanovení BA byla v minulosti vyvinuta řada analytických postupů. Tyto metody jsou

obvykle účelově vypracovány pro typ materiálu, v němž mají být aminy stanoveny. Kromě vzorků poživatin a krmiv přicházejí v praxi nejčastěji v úvahu vzorky tělních tekutin (v oblasti medicíny i fyziologie). Menší část prací se zabývá výhradně stanovením diaminů a polyaminů, některé řeší pouze analýzu aromatických aminů. Pro účely potravinářské mají význam především postupy zaměřené na stanovení aromatických a heterocyklických biogenních aminů, či nejlépe na biogenní aminy jako celek, tedy včetně diaminů a polyaminů (Marcora et al., 2010). Ke stanovení BA se používá chromatografie, přičemž nejčastěji to bývá tenkovrstvá (TLC), plynová (GC) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) (Huang et al., 2010). Stanovení BA je poměrně náročné s ohledem na obvykle značné nároky na citlivost a přesnost stanovení. Dnes jsou již prakticky opuštěny postupy založené na přímém fotometrickém stanovení aminů v poživatinách, hlavně z důvodu malé selektivity stanovení. Svůj význam si však stále udržuje TLC. Hlavní předností TLC je její rychlost a cenová nenáročnost. Pro rychlá rutinní stanovení aminů zejména v potravinářské praxi lze tuto metodu doporučit. Je však nutné mít na paměti, že předseparace a rovněž derivatizace aminů je i při TLC nezbytná. Nearomatické biogenní aminy neabsorbují záření v UV/VIS oblasti a bez vhodné derivatizace je není možné detekovat způsoby běžnými v kapalinové chromatografi. Rovněž doprovodné rušivé složky musí být odděleny citlivě volenou předseparací. Nejobvyklejším předseparačním krokem je vzhledem k bazicitě aminů jejich extrakce ze vzorku zředěnou kyselinou chloristou či trichloroctovou. Pro mléčné výrobky se rovněž osvědčila jednoduchá extrakce metanolem za zvýšené teploty (60° C). Jiné postupy doporučují extrakci roztokem citranu sodného, okyselení extraktu zředěnou kyselinou trichloroctovou a centrifugační oddělení vysrážených bílkovin. Velice podobný a kvalitně diskutovaný přehled úprav různých potravinových vzorků a variant jejich extrakce podali Önal, A. (2007). Po izolaci aminů ze vzorku následuje zpravidla alkalizace aliktovního podílu extraktu a derivatizace aminů vhodným činidlem zpravidla na bázi chloridů aromatických kyselin. Nejrozšířenějším deprivatizačním činidlem je tzv. dansylchlorid (5dimethylaminonaftalen1-sulfonylchlorid). Dansylderiváty lze po HPLC separaci detekovat jak UV/VIS detektorem,

27

tak v případě požadavku vyšší citlivosti stanovení též fluorimetricky (Park et al., 2010). Nižší stabilita dansylderivátů při jejich uchovávání v laboratořích a rovněž jejich fotolabilita však vedly některé pracovníky k volbě jiných činidel, např. benzoylchloridu i k ptoluensulfonylchloridu. Ke stanovení aminů v sýrech a čokoládě byla rovněž použita GC. Amorim et al., (2010) uvádí ve své práci optimalizaci metody stanovení histaminu u čerstvých ryb iontově-selektivní elektrodou. Kromě patrně nejpoužívanější vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi je pro stanovení aminů v poživatinách velmi výhodná práce v režimu ionexové chromatografie. Touto technikou byly úspěšně stanoveny nejběžnější biogenní aminy PUT, KAD, SPM, AGM, HI a TY. Postup je vysoce vhodný zejména pro pracoviště, vybavená analyzátorem aminokyselin. Při vhodně zvoleném postupu pak lze kromě aminů stanovit současně široké spektrum aminokyselin. V posledních letech se intenzivně rozvíjí nová analytická technika – kapilární zónová elektrofororéza (CZE). Vzhledem k tomu, že detekce separovaných látek je podobně jako u HPLC založena na absorpci UV záření, je derivatizační krok obvykle nevyhnutelný. Vysokou citlivostí se vyznačuje detekce založena na snímání intenzity laserem indukované fluorescence (LIF) aminových derivátů. Pro vzorky poživatin byla rovněž navržena separace aminů

derivatizovaných

benzoylchloridem.

Dělení

probíhá

v

režimu

micelární

elektrokinetické kapilární chromatografie a doba trvání analýzy polyamidů a aromatických aminů nepřesahuje 35 minut (Křížek et al., 1998)

Princip chromatografie Chromatografie je separační metoda, při které se oddělují složky obsažené ve vzorku. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku. V chromatografii se vzorek vnáší mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze, nepohyblivé a pohyblivé. Vzorek je umístěn na začátek stacionární fáze. Pohybem mobilní fáze přes stacionární fázi je vzorek touto soustavou unášen. Složky vzorku mohou být stacionární fází zachycovány, a proto se při pohybu zdržují. Tím se postupně od sebe složky separují a na konec stacionární fáze se dostávají dříve složky méně zadržované.

28

Obr.4:

Schéma

kapalinové

chromatografie

(Anonym

1,

2010).

Dostupné

na



Rozdělení chromatografických metod Chromatografických metod je velké množství, proto je účelné jejich rozdělení do určitých skupin. Vzhledem ke značné různorodosti se dělí podle několika hledisek: - podle skupenství mobilní fáze dělíme chromatografii na kapalinovou (mobilní fází je kapalina) a plynovou (mobilní fází je plyn), - podle uspořádání stacionární fáze dělíme na kolonovou (stacionární fáze je umístěna v koloně) a papírovou, tenkovrstvou (stacionární fáze na plochém podkladu), -

podle povahy děje, který převládá při separaci, dělíme chromatografii na rozdělovací

(o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost složek vzorku ve stacionární fázi a mobilní fázi), Adsorpční (o separaci rozhoduje různá schopnost složek adsorbovat se na povrch stacionární fáze), Iontově-výměnná (o separaci rozhodují různě velké elektrostatické přitažlivé síly mezi funkčními skupinami stacionární fáze a ionty vzorku) a gelovou (složky se separují podle velikosti na pórovité stacionární fázi, menší molekuly vzorku se v pórech gelu zdržují déle).

Kapalinová chromatografie V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina. Během separace se analys rozděluje mezi mobilní a stacionární fázi. Čas, jaký stráví v jedné nebo druhé fázi, závisí na afinitě analitu každé z nich.

29

Kapalinový chromatograf Kapalinový chromatograf se skládá z těchto částí: 1.

Čerpadlo - kapalina se do kolony čerpá pístovými nebo membránovými čerpadly.

Čerpadlo dosahuje průtoku v rozsahu od mikrolitů do desítek ml za minutu. Materiál čerpadla (nerezová ocel, keramika, plast) nesmí být narušován mobilní fází a nesmí do ní uvolňovat žádné látky. 2.

Směšovací zařízení - složení mobilní fáze může zůstávat stále (izokratická eluce)

nebo se během separace mění (gradientová eluce). Na programované směšovací zařízení může s využitím zásobníku různých kapalin připravovat směs kapalin stálého složení nebo řídit změny ve složení výsledné mobilní fáze v průběhu separace. 3.

Dávkovací zařízení - slouží k zavedení vzorků do mobilní fáze.

4.

Kolony - se používají pouze náplňové. Mnoho rozličných aplikací kapalinové

chromatografie podmiňuje existenci velkého množství kolon různé délky, vnitřního průměru a náplně. Pro většinu rutinních analýz jsou kolony zhotoveny z nerezové oceli. Kolony pro analytické využití jsou poměrně krátké (zpravidla 10, 15 nebo 25 cm). Vnitřní průměr je 4,6 nebo 5 mm, vnější průměr VV palce (palec = coul = 2,54 cm). Běžný průtok eluentu je 1 - 2 ml za minutu. Pro rychlé separace, stačí-li účinnost do 4000 teoretických pater, jsou vhodné krátké analytické kolony délky jen 3cm. Jsou levnější a spotřebují malé množství mobilní fáze. Objemový průtok eluentu je 4 ml za minutu. Náplňový materiál pro analytické kolony má průměr 3 až 10 µm (kratší kolony jsou plněny jemnější náplní). Kolony s velmi malým vnitřním průměrem mají vnitřní průměr 1 - 2 mm a délku 25 - 50 cm. Mají vysokou účinnost, nejsou drahé a spotřebují málo rozpouštědla (10 – 100 µl za minutu). Jako ochrana hlavní kolony jsou hojně používány předkolony umístěné mezi čerpadlo a dávkovací zařízení nebo ochranné kolony umístěné mezi dávkovací zařízení a analytickou kolonu. Způsobují jen malé rozšíření pásů a chrání kolonu před nečistotami a nerozpustnými materiály. Nastavení teploty. Většina separací HPLC probíhá při laboratorní teplotě a nevyžaduje termostatování. Některé separace se významně zlepší zvýšením teploty, což většina nových chromatografů umožňuje. Programová změna teploty se však v HPLC nevyužívá (Klouda, 2003).

30

Detektory v kapalinové chromatografii Detektory v HPLC by měly být selektivní pro analýzy a málo citlivé na mobilní fázi. Průtočná cela detektoru musí snést tlak mobilní fáze a udržet těsnost. Nejpoužívanější detektory jsou fotometrický, refraktometrický a fluorescenční. Fotometrické detektory patří k nejběžnějším detektorům. Měří absorbanci eluátu vycházejícího z kolony. Pro optimální citlivost detektoru musí být zjištěna dostatečná absorpční dráha průtočné kyvety, jíž prochází paprsek. Jednodušší detektory měří při jedné vlnové délce v ultrafialové oblasti (například 254 nm - rtuťová výbojka), složitější dovolují nastavení vlnové délky pomocí monochromátu. Nejdokonalejší jsou schopny pomocí diodového pole (Diode Array detektor - DA) nebo CCD prvku proměřit absorpční spektrum v určené oblasti vlnových délek a uložit ho do paměti. Detekční limit je až 10-10 g.ml-1. Citlivost je pro jednotlivé látky různá a při zvolené vlnové délce závisí na velikosti molárního absorpčního koeficientu látky. Refraktometrický detektor (Refractive Index detektor - RI) měří rozdíly mezi indexem lomu fluátu a čisté mobilní fáze. Obsahuje-li fluát složku, objeví se výchylka. Tento typ detektoru sice není příliš citlivý (detekční limit 10-7 g.ml-1), ale je velmi univerzální. Při jeho použití je t řeba přísně dodržovat konstantní teplotu. Fluorescenční detektor je založen na principu fluorescence – schopnosti absorbovat ultrafialové záření a pak vysílat záření o vyšší vlnové délce, které se měří fotonásobičem kolmo na směr vstupujícího záření. Detektor má detekční limit až 1012g.ml-1 analytu. Je vysoce selektivní a lze jej vhodně kombinovat s fotometrickým detektorem (Klouda, 2003).

Obr. 5: Schéma kapalinového chromatografu (Anonym 2, 2010). Dostupné na 31

Využití kapalinové chromatografie Kapalinová chromatografie je vhodná pro separaci látek tepelně nestálých, silně polárních, iontových a vysokomolekulárních přírodních či syntetických polymerů. Na anylýzu těchto látek se kladou čím dál větší požadavky v souvislosti se stále rostoucími aplikacemi v oblasti klinické a biochemické analýzy, analýzy léčiv a metabolitů, s aplikacemi životního prostředí a v neposlední řadě i v potravinářské oblasti. V potravinářství pomocí HPLC metod zjišťujeme nejen nutriční ukazatele potravin, ale i zdravotní nezávadnost potravin. Jedním z mnoha ukazatelů zdravotní nezávadnosti potravin je přítomnost a koncentrace biogenních aminů (Eerola, 1993; Komprda et al., 2001; Pintado et al., 2008; Pensione et al., 2005; Tsai et al., 2007; Saccani et al., 2005; Mah et al., 2009; Fernández et al., 2007; Önal, 2007; Innocente et al., 2007).

32

4.

Technologie výroby vína a biogenní aminy

4.1. Tvorba biogenních aminů ve víně Tvorba biogenních aminů při technologii výroby vína je kromě nežádoucí mikrobiologické kontaminace hroznů, moštu a vína zapříčiněna alkoholovou fermentací a hlavně jablečnomléčnou fermentací. Aminy ve víně vznikají během vinifikačních procesů. Tvorba aminů byla pozorovaná během alkoholového kvašení v metabolismu různých kmenů kvasinek (Buteauetal., 1984; Vidal-Carou a Vidal-Carou and Mariné-Font,; Torrea a Ancín, 2002). Zvýšená koncentrace biogenních aminů byla také zjištěna během jablečnomléčné fermentace díky metabolismu mléčných bakterií (Aerny, 1985; Bauza et al., 1995; Gerbaux a Monamy, 2000). Kromě toho, velká proměnlivost v koncentraci aminů existuje mezi různými druhy vín, ale zde je příliš mnoho faktorů, které by měly vliv na koncentraci biogenních aminů. Mezi tyto faktory patří obsah dusíkatých látek v hroznu, ale jejich obsah závisí na dalších faktorech, jako na době zrání a na dusíkatém hnojení půdy. Bertrand et al. (1991) zjistili, že dusíkaté hnojení vinic u odrůdy Merlot vyrobené při vyšší hodnotě dusíkatých látek v hroznech, nemělo vliv na zvýšení koncentrace histaminu, putrescinu, kadaverinu a fenyletylaminu ve víně. Další důležitý faktor je metoda fermentace, kdy u červených vín je koncentrace aminů vyšší ve srovnání s víny růžovými nebo bílými (Radler a Fath, 1991; Zee et al., 1983). V tabulce 6 je obsah biogenních aminů v různých druzích vín z různých kategorií a různého zeměpisného původu. Víno obecně obsahuje vyšší koncentraci aminů než některé potraviny jako čerstvá zelenina a jogurt. Ale koncentrace těchto látek ve víně je nižší než v jiných fermentovaných potravinách jako je třeba sýr (tab. 7). V současné době je obsah biogenních aminů ve víně zdrojem zájmu výzkumu v mnoha zemích, pro jejich negativní účinek na lidské zdraví.

33

Tab. 6: Obsah biogenních aminů u některých vín (Radler a Fath, 1991; Zee et al., 1983). Druh vína

Histamin

Červenéšpanělsko Chardonnay mladé Červené – Turecko Chardonnay – řízené kvašení Mladá červená vína z oblasti Rioja Starší červená vína z oblasti Rioja Tokajská vína Červená, růžová, bílá vína – Francie

Cadaverin

Putrescin

Tyramin

0,00 – 25,00 (R)

0,,00 – 14,00 (R)

0,00 – 55,00 (R)

0,00 – 19,00 (R)

2Phenyleth ylamin 0,00 – 16,26 (R)

0,67 (A)

0,51 (A)

3,04 (A)

2,09 (A)

nd – 1,97 (R) 0,31 – 0,36 (R)

nd – 3,94 (R)

nd – 5,92 (R) 0,37 – 0,39 (R)

nd – 0,29 (R)

8,72 (A)

0,61 (A)

32,97 (A)

6,67 (A)

1,74 (A)

0,02 – 0,04 (M) 8,9 (A)

Spermin

Ethylamin

-

0,00 – 7,92 (R)

-

0,85 (A)

-

nd – 3,87 (R) 2,48 – 2,89* (R)

nd – 1,75 (R) 1,14 – 1,58 (R)

0,81 – 1,00 (R)

4,98 (A)

-

-

-

31,35 (A)

5,78 (A)

-

-

-

0,07 – 0,19 (M)

2,14 – 2,55 (M)

0,05 – 0,31 (M)

0,15 – 3,09 (M)

-

-

0,2 (A)

7,7 (A)

3,1 (A)

1,7 (A)

0,1 (A)

-

< 0,12

< 0,18

-

A: aritmetický průměr; M: vážený průměr; R: rozpětí (mezi min. a max. hodnotou) * hodnota odpovídá Phenylethylamin + Spermidin. Tab. 7: Obsah biogenních aminů u některých potravin (Radler a Fath, 1991; Zee et al., 1983) Druh potraviny Červené víno (mg/L) Brazilská piva (mg/L) Suché fermentované salámy (mg/kg) Čerstvý a konzervovaný tuňák (mg/kg) Čerstvá zelenina (mg/100g čerstvé váhy) Jogurty (mg/kg čerstvé váhy) Nezrající sýry (mg/kg čerstvé váhy) Zrající sýry (mg/kg čerstvé váhy)

Histamin

Cadaverin

Putrescin

Tyramin

2Phenyleth ylamin

Spermin

Spermidin

0 – 24

0–8

0 – 28

0 – 28

0 – 12,73

0 – 1,75

0 – 2,19

0 – 1,46

0 – 2,6

0,85 – 9,8

0,3 – 36,8

0 – 1,72

0 – 2,05

0–6

0 – 357,7

0 – 658,1

0 – 500,7

0 – 742,6

0 – 81

0 – 119

0 – 91,3

0 – 40,5

0 – 12,05

0 – 4,84

0 – 10,65

0 – 7,3

2,23 – 37

1,20 – 11,7

0 – 1,6

< 0,05

0,2 – 4,9

0 – 1,2

0 – 0,3

0 – 1,1

0,4 – 4,5

nd

0 – 0,27

nd

nd

nd

0 – 0,34

0 – 43

nd

0 – 0,27

nd

nd

nd

0,39 – 0,82

0 – 1,12

2,21 – 163,56

4,23 – 215,28

0 – 611,68

0 – 241,92

0 – 29,03

0 – 18,69

0 – 43,01

Obecně nízké koncentrace biogenních aminů jsou v hroznech. Jak uvádí Silla Santos, (1996) biogenní aminy, zvláště polyaminy, jsou nepostradatelné látky všech živých buněk, proto mohou být různé obsahy těchto látek nalezené v surovině, Tyto látky mohou být také 34

jako ochranný faktor pro špatně fungující buňku (Bouchereau et al., 1999). Některé aminy v malém obsahu jako putrescin, spermidin, a histamin jsou přirozenou složkou suroviny hroznů (Broquedis et al., 1989; Vidal-Carou et al., 1990; Hajos et al., 2000). Buteau a Duitchaever (1984) zjistili, že putrescin byl nejhojnější amin ve vínech odrůdy Villard Noir, zatímco Sass-Kiss et al. (2000) nalezli v několika jiných odrůdách nejhojnější spermidin, následovaný putrescinem. Hajos et al., (2000), Fern-Andy a Ferreira, (2000; Gonzalez-Marco et al., (2006) zjistili tyto dva aminy ve vyšších koncentracích v hroznech a moštech před fermentací. Bylo zjištěno, že tlak chorob ve vinici může zvýšit také obsah biogenních aminů v hroznech. Hajos et al. (2000) popsal, že v případě napadení révy, infekcí Botrytis cinerea může být příčinou zvýšení obsahu biogenních aminů. Co se týče vodního stresu, Bover-Cid et al. (2006) studoval jeho vliv na koncentraci putrescinu a kadaverinu, kde se neprojevil se jako faktor, který by měl vliv na obsah biogenních aminů. Jak je uvedeno v předchozím, celkový obsah biogenních aminů ve víně je velmi proměnný. Další faktory mohou modifikovat vývoj mikroorganismů, které syntetizují biogenní aminy. V tabulce č. 8 uvádí autor změny v hodnotách histaminu, tyraminu, putrescinu, a fenyletylaminu, v závislosti na různých faktorech, které ovlivňují některé vinifikační procesy. Vztah mezi spotřebou aminokyselin a tvorbou biogenních aminů během jablečno-mléčného kvašení sledoval Soufleros et al. (1998) a zjistili, že v průběhu jablečno-mléčného kvašení se obsah aminokyselin výrazně snížil, zatímco obsah biogenních aminů se zvýšil. Herbert et al. (2005) sledoval poměr mezi množstvím volných aminokyselin v moštu různých odrůd z oblasti Alentejo s celkovým množství biogenních aminů v hotovém červeném víně, které prošly jak alkoholovým tak jablečno-mléčným kvašením. Zjistili, že množství aminokyselin korespondovalo s vyšším množstvím biogenních aminů. Z těchto studií lze dojít k závěru, že vyšší obsahy aminokyselin v moštu jsou příčinou vyššího množství biogenních aminů po jablečno-mléčném kvašení. Avšak v reálných podmínkách je obtížné stanovit korelaci mezi koncentrací biogenních aminů a spotřebou aminokyselin během alkoholového kvašení. To by mohlo být způsobeno tím, že během alkoholové fermentace kvasinky využívají aminokyseliny v biosyntéze nebo jako zdroj dusíku a v menší míře v dekarboxylačních reakcích, kde vznikají biogenní aminy.

35

Tab. 8: Odchylky biogenních aminů v koncentracích (mg/L) ve vínech v závislosti na různém vinifikačním procesu (Herbert et al., 2005) Histamin Tyramin Macerace na slupkách < 10 dnů 1,83 ± 0,58 0,51 ± 0,47 > 10 dnů 4,48 ± 0,79 2,22 ± 0,65 Ročník 2001 4,87 ± 0,67 2,12 ± 0,55 2002 1,44 ± 0,69 0,62 ± 0,57 Veškerá SO2 < 50 mg/L 5,91 (n = 56) 3,62 (n = 54) 50-100 2,54 (n = 31) 2,30 (n = 30) mg/L > 100 mg/L 1,20 (n = 11) 1,91 (n = 11) Těkavé kyseliny < 0,5 g/L 4,01 (n = 11) 2,70 (n = 11) 0,5-1,0 g/L 4,12 (n = 70) 3,07 (n = 68) > 1,0 g/L 5,29 (n = 17) 2,94 (n = 16) Zákal Filtrované 11,2 ± 0,4 8,8 ± 0,5 víno Nefiltrované 11,1 ± 0,4 8,9 ± 0,4 víno * hodnota odpovídá Phenylethylamin + Spermidin.

Putrescin

2Phenylethylamin

3,32 ± 1,07 11,07 ± 1,46

2,70 ± 0,43 2,95 ± 0,59

9,69 ± 1,24 4,70 ± 1,29

3,36 ± 0,50 2,29 ± 0,52

-

-

-

-

-

-

15 ± 1,5

0,54 ± 0,03*

14 ± 1,0

0,60 ± 0,10*

4.2. Vliv zeměpisnýh podmínek na obsah biogenních aminů při výrobě vína Ve většině studií bylo zjištěno, že červená vína obsahují více biogenních aminů než bílá nebo růžová vína. Stejně tak různí autoři (Lehtonen, 1996; Torrea a Ancín, 2002;. Gloria et al, 1998) pozorovali, že putrescin je nejhojnější amin v červeném, bílém a růžovém víně. Zee et al. (1983) srovnával obsahy biogenních aminů v kanadských, amerických a evropských vínech z pohledu zeměpisných faktorů a různých vinifikačních postupů. Tito autoři zjistili, že se červená vína v obsahu histaminu a putrescinu výrazně liší od bílých vín, ale množství kadaverinu a tyraminu není nijak výrazné.

4.3. Vliv odrůdy na obsah aminů ve víně Množství histaminu a tyraminu bylo vyšší ve vínech u odrůd Tempranillo a Bobal než v odrůdě Garnacha. Obsah putrescinu v odrůdě Bobal byl o něco málo menší než v odrůdách Tempranillo a Garnacha. Obsahy fenylethylaminu byly shodné u všech těchto tří odrůd. Vzhledem k tomu, že půdy, na nichž byly odrůdy révy vinné pěstovány, byly podobného složení a víno bylo vyrobeno identickými enologickými postupy, rozdíly mezi obsahy v 36

histaminu, tyraminu, fenyletylaminu, mohly být způsobeny odlišným obsahem celkových aminokyselin u těchto odrůd nebo v důsledku různých schopností kmenů mléčných bakteriích izolovaných z těchto vín metabolizovat aminokyseliny (Oenococcus oeni, Pediococcus parvulus, Lactobacillus hilgardii a Lactobacilus brevis).

4.4. Vliv technologie na obsah BA Martín - Álvarez et al. (2006) studovali vliv některých technologických postupů na obsah biogenních aminů v červených vínech. Tato studie ukázala, že existuje variabilita mezi všemi biogenními aminy v závislosti na ročníku vína. Dále zjistili, že přídavek pektolytických enzymů neovlivnil obsah biogenních aminů a naproti tomu delší doba macerace slupek zvýšila tvorbu histaminu, tyraminu a putrescinu. Zrání vína na kalech především zvýšilo koncentrace putrescinu a methylaminu. Kiss a Sass-Kiss (2005) zjistili, že koncentrace biogenních aminů ve vínech napadených hroznů Botrytis cinerea je mnohem vyšší než v nenapadených.

4.5. Možnosti snížení biogenních aminů Některými technologiemi používanými při výrobě vína je možné snížit obsah biogenních aminů ve víně jako například při použití bentonitu (Vidal-Carou a Mariné-Font, 1985). Taktéž zjistili, že při snížení histaminu na polovinu, by měly být použity dávky 1 kg/hl bentonitu. Tato dávka je mnohem vyšší, než jsou obvyklé dávky používané během technologie výroby a to by mohlo ovlivnit hlavně barvu u červeného vína. Další technika navržená pro odstranění histaminu ve víně je tepelné zpracování hroznů po vylisování (Iñigo a Bravo, 1980). Ough a Daudt (1981) zjistili, že obsah těkavých aminů v odrůdě Pinot Noir a Ryzlink rýnský poklesl během alkoholového kvašení. Dalšími důležitými faktory, které ovlivňují koncentraci aminů ve víně, jsou podmínky, za nichž probíhá alkoholová i jablečno-mléčná fermentace. Různí autoři sledovali faktory, jako je pH, teplota, koncentrace SO2, zákal, a obsah těkavých kyselin. Vzhledem k tomu, že vinifikační podmínky mohou být velmi odlišné, vztah mezi těmito podmínkami a koncentrací biogenních aminů ve víně není moc dobře vypovídající. Nicméně, existují studie, které mohou poskytnout v tomto ohledu zajímavé informace. Zee et al. (1983) neshledali žádné vztahy mezi pH, obsahem alkoholu, a koncentrací aminů v kanadských, amerických a evropských vínech.

37

Tabulka 9: Srovnání účinku bentonitu a vyziny při snížení biogenních aminů ve víně (Woller, R.; Kobelt, S., 1990).

Látka

Biogenní amin

Bentonit

Histamin

Nulový

Tyramin

*

ß-Phenyletylamin

*

Putrescin Isopentylamin

Účinek Dobrý

Velmi dobrý

*

**

**

*

**

***

*

**

*

**

*

Cadaverin

Vyzina

Mírný

Amylamin

**

Spermidin

**

Spermin

**

Histamin

**

**

Cadaverin

**

*

Putrescin

**

*

Aerny (1990) publikoval, že vysoká hodnota pH má pozitivní vliv na množení bakteriálních kmenů, které mohou být zodpovědné za vyšší tvorbu biogenních aminů ve víně. Taktéž zjistili, že přidání SO2, a to i v malém množství, po alkoholové fermentaci potlačilo vývoj bakterií rodu Pediococcus, jsou to bakterie s vysokou tvorbou biogenních aminů. Bauza et al. (1995) zjistili, že kaly a matoliny mohou obsahovat vysoké hladiny biogenních aminů. I přesto, že usnadňují jablečno-mléčnou fermentaci, mohou zvýšit koncentrace těchto sloučenin ve víně. Gerbaux et al. (1997) zjistili, že ve víně bez aplikace lysozimu je vyšší populace bakterií po dobu několika měsíců oproti aplikaci s lysozimem a tím dochází ke zvýšení koncentrace biogenních aminů ve víně. Vidal-Carou et al. (1990) studoval vztah mezi koncentrací histaminu a tyraminu ve víně v závislosti na SO2 a těkavých kyselinách. Tito autoři zjistili, že existuje korelace (99,9%) mezi obsahem celkového oxidu siřičitého a biogenních aminů u červených vín, přičemž nejvyšší obsahy aminů byly zjištěny u vín s nízkým obsahem celkového oxidu siřičitého. Také došli k závěru, že existuje korelace (99,9%) mezi histaminem a tyraminem a obsahem těkavých kyselin v bílém a růžovém víně. Nicméně, Bauza et al. (1995) zjistili, že dávka SO2 (20-30 mg/L) je ke stabilizaci vína před lahvováním nedostatečná, aby zabránila tvorbě biogenních aminů během skladování v láhvi. Kromě toho, Vidal-Carou et al. (1991) se zabývali změnami obsahu histaminu a tyraminu během 38

skladování vína při různých teplotách. Žádné zvýšení obsahu biogenních aminů nebylo pozorováno během skladování vína, ale naproti tomu bylo zaznamenané snížení histaminu a tyraminu během skladování některých vín. Tyto změny byly nezávislé na teplotě skladování vína. Gardini et al. (2005) studovali vliv různých faktorů na tvorbu tyraminu, sperminu a spermidinu u kmene Oenococcus oeni v modelovém vzorku vína. Autoři zjistili, že koncentrace arabinosy měla vliv na koncentraci tyraminu. Také zaznamenali, že zvýšení koncentrace SO2 mělo za následek snížení sperminu a spermidinu. Tento vztah je ale v případě tvorby tyraminu složitější. Oxid siřičitý měl vliv na kumulaci tyraminu, ale závisel i na dalších proměnných, jako je pH. Jiménez-Moreno a Ancín-Azpilicueta (2004) studovali vliv zákalu vína na kumulaci biogenních aminů v průběhu zrání, a zjistili, že zákal nemá vliv na obsah biogenních aminů v odrůdě Merlot. Byl také studován vliv ostatních sloučenin ve víně, jako je kyselina jablečná, kyselina citronová, etanol a cukr. Rollan et al. (1995) došli k závěru, že vysoká koncentrace ethanolu (12% obj.), L-kyseliny mléčné, a kyseliny citronové sníží obsah histidinu činností dekarboxylázy buněk kmene Oenococcus oeni. Soufleros et al. (1996) zjistili, že biogenní aminy ve víně, s výjimkou fenyletylaminu a putrescinu, ukázaly negativní korelace s množstvím kyseliny jablečné a citronové. Lonvaud-Funel a Joyeux (1994) zjistili, že v chudých podmínkách pro růst bakterií jablečnomléčné fermentace (bez glukózy a kyseliny jablečné) byla produkce histaminu vyšší, zatímco Moreno-Arribas et al. (2000) zjistili, že tvorba tyraminu byla vyšší v bohatém médiu (s glukózou), takže se zdá, že tvorba těchto aminů nemá stejnou metabolickou roli pro mikroorganismy. Pokud jde o vliv různých faktorů vinifikace na tvorbu aminů, bylo vytvořeno mnoho studií. Na předním místě jsou práce práce Ough a Daudt (1981). Autoři studovali vliv teploty kvašení na koncentraci těkavých aminů v Rulandském modrém a Ryzlinku rýnském. Tvorba biogenních aminů je ovlivňována celou řadou faktorů, jejichž vliv nebyl beze zbytku prokázán, ale většina autorů uvádí vyšší obsah biogenních aminů je u červených vín než v růžovém nebo bílém víně, což je dáno faktory, které zvyšují tvorbu biogenních aminů během vinifikace červených vín, jako jsou vysoká teplota kvašení, zvýšená macerace ze slupek a peciček, příliš vysoké pH, více kvasniční biomasy (kalů), rozvoj jablečno-mléčného kvašení, a nízké hodnoty volného SO2. Vliv těchto faktorů je různý. Mají vliv na růst mikroorganismů s vysokou aktivitou enzymů, které produkují biogenní aminy. Je také třeba zdůraznit, že jakmile jsou aminy vytvořeny, jejich odstranění je velmi obtížné.

39

4.6.

Tvorba aminů během alkoholového a jablečno-mléčného kvašení

Aminy se tvoří v různých fázích vinifikace a proto obsah aminů ve víně je mnohem vyšší než v moštu, kde je koncentrace velmi nízká (Radler a Fäth, 1991). Vznik biogenních aminů byl pozorován během alkoholového kvašení, vzhledem k metabolismu různých kmenů kvasinek. Nejdůležitější pro vznik biogenních aminů je jablečno-mléčné kvašení. Dále jsou v literatuře popsány nejdůležitější aspekty o vzniku biogenních aminů v průběhu těchto dvou kvasných procesů.

4.6.1. Tvorba aminů během alkoholového kvašení Přeměna moštu na víno je výsledkem složitých procesů různých druhů kvasinek. Během první etapy kvašení, převládají apikulátní druhy s nízkou tolerancí k etanolu (Kloeckera, Hanseniaspora, Candida, Pichia, Torulaspora), a později jsou postupně nahrazovány druhy Saccharomyces cerevisiae, s vyšší tolerancí na ethanol. Avšak různé kmeny kvasinek mohou ovlivnit tvorbu biogenních aminů. Buteau et al. (1984) popsal zvýšení koncentrace histaminu, tyraminu, putrescinu, agmatinu a kadaverinu během alkoholového kvašení moštů odrůdy Villard Noir. Stejně tak, Bauza et al. (1995) zjistil zvýšení obsahu histaminu, putrescinu, a fenyletylaminu během alkoholového kvašení vína z údolí Rhôny, zatímco koncentrace tyraminu se navýšila až jablečno-mléčnuo fermentací. Oproti tomu, Vidal-Carou et al. (1990) nezjistil tvorbu histaminu během alkoholového kvašení, i když našel tyramin ve velmi nízkých koncentracích. Torrea-Goñi a Ancín-Azpilicueta, (2002-2001) studovali vliv různých kmenů Saccharomyces cerevisiae na koncentraci biogenních aminů ve vínech Chardonnay a Garnacha. Mošty byly inokulovány se třemi různými kmeny Saccharomyces cerevisiae (Na33 s neutrálním výrazem a dva kmeny s killer faktorem, D47 a KIM), a tyto vzorky byly srovnávány s kontrolním vzorkem, který kvasil spontáně. V těchto pracech bylo zjištěno, že během alkoholové fermentace jsou aminy tvořeny v závislosti na kmenu kvasinek, které se podílejí na kvašení, i když je tam nepatrný rozdíl v obsahu biogenních aminů ve vínech.

40

Tabulka 10: Koncentrace biogenních aminù (mg/L) po alkoholovém kvašení v růžovém víně (Gr - Garnacha} a bílém víno (Ch - Chardonnay) zaočkovaném různými kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae (Torrea a Ancín 2001; 2002) kontrola Na33 D47 Histamin Gr 428 ±36 406 ± 18 436 ± 39 Ch 210± 19 362 ±41 309 ± 38 Tyramin Gr 224 ± 15 227 ±25 nd Ch nd nd nd Putrescin Gr 11536 ±549 8751 ±302 11977 ±540 Ch 3074 ± 160 3745 ± 138 3910 ±282 Cadaverin Gr nd nd nd Ch nd nd nd a Phe + Spd Gr 99 ± 8 58 ± 4 234 ±24 Ch 2070 ± 110 2896 ± 161 2485 ± 150 Spermine Gr 27±3 24±4 92 ± 3 Ch 766 ± 52 I4S2± 116 1137 ±76 a Phenylethylamin + Spermidin; nd: nedetekováno

KIM 514 ±33 360 ± 22 101 ± 12 nd 10224 ± 908 3888 ± 105 nd nd I58± 15 2518 ± 190 164 ± 8 1575 ± 78

Jak je zřejmé z tab. 4 v těchto studiích nebyl nalezen žádný vztah mezi obsahem biogenních aminů ve víně a obsahem aminokyselin před alkoholovým kvašením. Tvorba těkavých aminů během fermentace byla ve všech případech nízká. Caruso et al. (2002) sledovali 50 kmenů kvasinek různých druhů (Saccharomyces cerevisiae, Kloeckera apiculata, Candida stellata, Brettanomyces bruxellienses a Metschnicowia pulcherrima) a zjišťovali jejich schopnost produkovat biogenní aminy. Došli ke zjištění, že všechny druhy vyprodukovaly velmi nízké nebo nezjistitelné množství histaminu, zatímco agmatin byl produkován všemi druhy kvasinek v rámci studie. Brettanomyces bruxellensis produkoval největší koncentraci celkových biogenních aminů, s průměrnou hodnotou 15 mg/L, po němž následuje Saccharomyces cerevisiae s průměrem kolem 12,14 mg/L. Histamin, putrescin, kadaverin a tryptamin byly produkovány všemi kmeny v nezjistitelném nebo nízkém množství, vždy méně než 4 mg/L. Obsah biogenních aminů vznikající během fermentace byl ovlivněn různými faktory. Vína prokvašená s nejaktivnějšími kvasinkovými kmeny (Saccharomyces cerevisiae) měla nejvyšší množství agmatinu. Kmeny Candida stellata, které měly dobrý průběh kvašení, se chovali podobným způsobem a také projevily dobrou schopnost produkovat kadaverin. Kmeny jiných druhů, které měly nízkou fermentační 41

schopnost, jako Kloeckera apiculata, Brettanomyces bruxellensis a Metschnicowia pulcherrima, prokázaly určité rozdílnosti v produkci agmatinu a fenyletylaminu. Závěrem lze říci, že aminy vznikají během alkoholového kvašení dokonce od samého začátku, a že apiculatní kvasinky mají schopnost vyšší tvorbu těchto látek. Bylo by zajímavé, kdyby se nové studie zaměřily najít kmeny kvasinek, které by byly schopny konzumace těchto látek jako zdroj dusíku v pozdních stádiích alkoholového kvašení, kdy je v médiu nedostatek dusíkatých zdrojů. Kromě toho by bylo zajímavé vybrat kmeny bakterií mléčného kvašení, které by byly schopny konzumace biogenních aminů jako zdroj dusíku při jablečno-mléčném kvašení (Ancín, 2008).

4.6.2. Tvorba aminů během jablečno-mléčného kvašení Jablečno-mléčné kvašení je velmi žádoucí po alkoholovém kvašení pro téměř všechna červená vína a některá bílá vína. Při této fermentaci je odbourována dekarboxylací hlavně kyselina L-jablečná. Stejně tak se metabolizují i jiné substráty, jako jsou aminokyseliny, ze kterých vznikají biogenní aminy. Ve víně byly identifikovány tyto druhy bakterií mléčného kvašení, které patří ke čtyřem rodům: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, a Pediococcus. To je dáno tím, že během alkoholového kvašení ostatní druhy bakterií jsou eliminovány a ve víně mohou zůstat jen výše uvedené druhy. Jak uvádí Lonvaud-Funel et al., (1991) Oenococcus oeni (Leuconostoc oenos) se vyskytuje převážně na konci a po alkoholovém kvašení, ale také se mohou objevit i některé z jiných rodů. Druh Leuconostoc oenos byl přeřazen z rodu Leuconostoc v roce 1995, kdy díky studií Dicks et al. (1995) byl klasifikován jako nový rod Oenococcus, s jediný druhem Oenococcus oeni. Fyziologické funkce dekarboxylace aminokyselin v buňkách bakterií nejsou dosud zcela jasné. Zdá se, že pro bakterie mléčného kvašení je tvorba biogenních aminů mechanismem ochrany proti nízkému pH (Lonvaud-Funel, 2001; Schelp et al, 2001; van de Guchte et al, 2002) nebo získání metabolické energie pomocí reakce aminokyselin dekarboxylací (Molenaar et al. 1993; Konnings et al, 1997; Abe et al, 2002). Kromě toho tvorba polyaminů, jako je putrescin, může být ovlivněna dalšími fyziologickými funkcemi u bakterií, jako je osmotický stres (Schiller et al., 2000), či oxidační stres (Tkachenko et al. 2001) a další odezvy bakteriálních buněk jako je cross-talk (Sturgill a Rather, 2004). Mnoho autorů se domnívá, že mléčné bakterie mají vliv na velkou kumulaci biogenních aminů ve víně (Soufleros et al, 1998; Bauza et al, 1995; Gerbaux a Monamy, 2000). Tabulka 11 ukazuje druhy mléčných bakterií, které jsou schopny produkovat biogenní aminy. Marcobal et al. (2006) našli zvýšení koncentrace aminů v první etapě jablečno-mléčného 42

kvašení. Oproti tomu výsledky ze studie provedené in vitro Pessionem et al. (2005) naznačují, že biosyntéza z aminokyselin enzymem dekarboxylázou, (která je rozhodující při tvorbě aminů) naznačují na tvorbu biogenních aminů u bakterií v exponenciální fázi růstu a hlavně na jeho konci fáze růstu. Někteří autoři nenašli žádný vztah mezi přítomností bakterií mléčného kvašení ve víně a tvorbě biogenních aminů. Buteau et al. (1984) zjistili, že biogenní aminy, zejména histamin, poklesly v průběhu jablečno-mléčného kvašení. Ough et al. (1987) studoval schopnost různých bakterií mléčného kvašení (Lactobacillus, Oenococcus a Pediococcus) na produkci histaminu z histidinu za vlivu různých podmínek kvašení a nenašli významné hodnoty histaminu při dekarboxylaci histidinu, ani v modelových vzorcích ani ve fermentovaných moštech. Tuto variabilitu ve svých výsledcích vysvětlují Coton et al (1998), Bover-Cid a Holzapfel (1999) a Leitão et al. (2000) skutečností, že mléčné bakterie mají různou schopnost pro tvorbu aminů, a tato schopnost spíše závisí na kmeni než na různých druzích.

Tabulka 11: Druhy mléčných bakterií schopné produkovat biogenní aminy (Ancín, 2008). Druh mléčných bakterií Reference Oenococcus oeni Histamin Lonvaud-Funel and Joyeux (1994) Coton et al. (1998b) Guerrini et al. (2002) Landete et al. (2005) Lactobacillus hilgardii Farias et al (1993) Landete et al. (2005b) Constantini et al. (2006) Lactobacillus 30a Moreno-Arribas et al. 2003 Constantini et al. 2006 Pediococcus damnosus Aemy (1985) Delfini (1989) Pediococcus parvulus Landete et al. (2005b) Lactobacillus brevis Tyramin Moreno-Arribas el al. (2000); Lucas and Lonvaud-Funel (2002); Lucas el al. (2003); Landete et al (2005a); Constantini et al. (2006) Lactobacillus hilgardii Moreno-Arribas et al. (2000) Leuconostoc mesenteroides Moreno-Arribas et al (2003) Phenyleihylamin Lactobacillus brevis

Lactobacillus hilgardii Lactobacillus plantarum

Moreno-Arribas et al. (2000); Landete et al. (2005a) Moreno-Arribas et al. (2000) Coton et al.(1999); Guerrini et al. (2002); Maicobal et al. (2004); Mangani el al (2005) Gale (1946); Tabor and Tabor (1985) Arena and Mane a de Nadra (2001) Arena and Manca de Nadra (2001)

Lactobacillus buchneri

Moreno-Arribas et al (2003)

Lactobacillus hilgardii Putrescin

Oenococcus oeni Lactobacillus 30a

43

Z dalších studií vyplývá, že tvorba histaminu a dalších biogenních aminů ve víně je díky choroboplodným bakteriím, především kmenu Pediococcus damnosus, a nikoli Oenococcus oeni, jak se dlouhou dobu domnívali autoři Aerny (1985) a Delfini (1989). Nicméně, Lonvaud-Funel a Joyeux (1994) izolovali kmen Oenococcus oeni, který byl schopný produkovat histamin z histidinu dekarboxylázou z vína v oblasti Bordeaux. Coton et al. (1998) přišel k závěru, že enzym histidin dekarboxyláza v buňkách Oenococcus oeni vyžaduje jako kofaktor pyridoxalfosfát. Stejně tak, Coton et al. (1998) zkoumali 118 vín z několika vinařských oblastí a došli k závěru, že prakticky polovina z těchto vín obsahuje bakterie mléčného kvašení s hdc genem, zodpovědným za histidin dekarboxylázovou činnost. Při izolaci a identifikaci kmenů odpovědných za tuto enzymatickou aktivitu, zjistili, že všechny z nich patřili k druhu Oenococcus oeni. Landete et al. (2005) analyzovali 136 kmenů bakterií mléčného kvašení, které patřily do různých druhů (Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, a Pediococcus) na přítomnost hdc genu a jejich schopnost tvořit histamin v syntetickém médiu. Tito autoři zjistili, že druh Oenococcus oeni, měl nejvyšší produkci histaminu, i když množství histaminu bylo menší, než produkovaly kmeny Lactobacillus a Pediococcus. Stejně tak i ostatní autoři (Guerrini et al. 2002) zjistili, že kmeny produkující histamin ve víně jsou velmi často z druhu Oenococcus oeni. Histidindekarboxylázovou aktivitou v buňkách Lactobacillus 30a se také zabývali MorenoArribas et al. (2003). Landete et al. (2005) zjistili, že stejně jako ostatní mléčné bakterie Oenococcus oeni, jako jsou Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus mali, Leuconostoc mesenteroides a Pediodoccus parvulus mohou přispět k syntézám histaminu ve víně. A uvedl, že nejvyšší produkci histaminu ve víně měly Lactobacillus hilgardii a Pediodoccus parvulus. S ohledem na syntézu tyraminu ve víně, Moreno-Arribas et al. (2000) studovali vznik tohoto aminu v různých bakteriích mléčného kvašení izolovaných z vzorků vína, ve kterých proběhla jablečno-mléčné fermentace. Došli k závěru, že Lactobacillus, je hlavní bakterií mléčného kvašení zodpovědné za tvorbu tyraminu ve víně. Jejich výsledky ukázaly, že některé kmeny Lactobacillus hilgardii a Lactobacillus brevis tvořily více tyraminu. Kromě toho, tito autoři zjistili, že Lactobacillus brevis IOEB 9809 a Lactobacillus hilgardii IOEB 9649 byly schopné produkovat tyramin a fenyletylamin současně. Gale (1946) uvádí, že některé kmeny za zvláštních podmínek kultivace mohou mít více než jednu amino dekarboxylázovou aktivitu. V pozdější studii, Moreno-Arribas a Lonvaud-Funel (2001) izolovali a charakterizovali enzym tyrosindekarboxylázu z Lactobacillus brevis IOEB 44

9809. Tito autoři zjistili, že tento enzym vyžaduje jako kofaktor pyridoxalfosfátu, stejně jako zjistili Coton et al. (1998) v případě enzymu histidindekarboxylázy u kmene Oenococcus oeni. Lucas a Lonvaud-Funel (2002) a Lucas et al. (2003) popsali kompletní sekvenci genu kódujícího tyrosindekarboxylázu Lactobacillus brevis IOEB 9809 a přilehlých genů nalezených ve stejném lokusu. Sekvence Lactobacillus brevis aktivní tyrosindekarboxylázy obsahovala čtyři kompletní geny, které kódují tRNA syntetázy tyrosyl, tyrosindekarboxylázy, pravděpodobné tyrosinpermeasa a Na+/H+ antiporter. Autoři Moreno-Arribas et al. (2003) uvádí, že Leuconostoc mesenteroides může být také odpovědný za tvorbu tyraminu ve vínech. Choudhury et al. (1990) publikovali, že kmen Oenococcus oeni je schopen tvořit tyramin i v laboratorních médiích. Naproti tomu autoři (Lehtonen et al, 1992; Guerrini et al, 2002; Constantini et al. 2006) uvádí, že tato metabolická vlastnost není příliš rozšířena u druhu Oenococcus oeni. Putrescin, biosyntetický předchůdce polyaminů, je tvořen dekarboxylací buď z ornitinu a argininu na agmatin, který se poté přemění na putrescin buď přímo, nebo nepřímo prostřednictvím N-carbamoylputrescinu (Tabor, C. W., a Tabor, H, 1985). Autoři se zabývali ornitin dekarboxylázou v činnosti bakterií mléčného kvašení, která byla popsána u Lactobacillus 30a. Později Coton et al. (1999) popisují, že kmen IOEB 8419 Oenococcus oeni izolovaný z vína, byl schopný produkovat putrescin. Moreno-Arribas et al. (2003) našli dva kmeny Lactobacillus buchneri schopny tvořit putrescin přes ornitindekarboxylázu. Vysoká koncentrace putrescinu byla pozorována u některých vín po jablečno-mléčné fermentaci, a tato koncentrace nemůže pocházet pouze z dekarboxylace volného ornithinu ve vínech, protože jeho koncentrace ve víně je obvykle nízká. Vyšší koncentraci putrescinu ve vínech autoři (Liu et al., 1996) vysvětlují tím, že nevzniká pouze z ornitinu, ale u bakterií mléčného kvašení je schopnost metabolizovat arginin i z jiných aminokyselin jak v moštu, tak ve víně. Arginin může být katabolizován přes arginin deiminázu (ADI) cestou, kterou katalyzují tři enzymy, arginin deimináza (ADI), ornitin transcarbamoyléza (OTC) a karbamátkináza (CK). Arena a Manca de Nadra (2001) studovali schopnost dvou kmenů Lactobacillus (Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum) tvořit putrescin agmatin z argininu a ornitinu v syntetickém médiu. Během růstu Lactobacillus hilgardii X1B, koncentrace argininu poklesla spolu s citrulinem a ornitinem (ADI cesta), kdežto koncentrace agmatinu a putrescinu (dekarboxylací) narůstala. Nicméně, kmen N4 Lactobacillus plantarum byl pouze schopný tvořit putrescin z argininu a ornitinu. Tato mléčná bakterie transformovala arginin na citrulin, během níž byla odstraněna NH2 skupina z argininu, a pak byl citrulin metabilitován na ornitin, který nakonec prošel dekarboxylací na putrescin. 45

Guerrini et al. (2002) prokázal, že dvě vlastnosti katabolické reakce (argininu a ornitinu degradace a dekarboxylace) nejsou nutně spoluúčastnící se při tvorbě putrescinu kmenů Oenococcus oeni. Později, Mangani et al. (2005) popsali, že Oenococcus oeni může produkovat putrescin ve vínech prostřednictvím metabiotické reakce s ornithinem, ale nemůže tvořit putrescin. Uvedené kmeny jsou schopny produkovat tento amin z ornitinu, ale nejsou schopny degradovat arginin. V této studii, produkce putrescinu prostřednictvím metabiotické reakce probíhala po dokončení jablečno-mléčného kvašení, zatímco konverze z ornithinu na putrescin ornitindecarboxylázou probíhala současně za snižování obsahu kyseliny L-jablečné. Z těchto výsledků lze usuzovat, že kontrola jablečno-mléčné fermentace je jedním z nejdůležitějších kontrolních opatření, k zabránění větší koncentraci biogenních aminů ve víně. Bylo by dobré udělat studii o aktivitě různých bakterií mléčného kvašení při tvorbě těchto látek. Je třeba izolovat a vybrat kmeny s malou nebo žádnou schopností tvorby biogenních aminů, ale také je nutné kontrolovat jejich účinnost a vhodnost pro specifické podmínky každého typu vína. Dále by bylo zajímavé studovat proteolytickou aktivitu jednotlivých kmenů, které mají vysokou proteolytickou aktivitu enzymu, jež by také mohl zvýšit riziko pro vznik biogenních aminů, zvýšením dostupnosti volných aminokyselin (Ancín, 2008).

4.7.

Vývoj biogenních aminů během zrání vína

Vývoj aminů během skladování vína v láhvi a v sudu nebyl příliš sledován, protože aminy jsou obvykle spojené s potravinami bohatými na bílkoviny s mikrobiální proteolytickou aktivitou. Víno, ačkoli není bohaté na bílkoviny, obsahuje vysoké množství volných aminokyselin, které mohou být dekarboxylovány zbytkem mikrobiální populace, a vznikají biogenní aminy. Aminokyseliny ve víně pocházejí z aminokyselin, které nevyužijí kvasinky během alkoholové fermentace a z cytoplazmatického obsahu kvasinek, který se uvolňuje na konci alkoholového kvašení (Ancín, 2008).

4.7.1. Vývoj biogenních aminů ve vínech zrajících v dubových sudech a nerezových nádobách Dub byl používán po staletí k výrobě sudů na skladování vína. Během zrání vína v sudu se ze dřeva uvolňují sloučeniny a pozvolně je způsobováno mírné okysličení vína. Marcobal et al. (2006) nenašli významné změny (p<0,05) v obsahu histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu s ohledem na obsahy těchto aminů v červeném víně po jablečnomléčné fermentaci, do kterého byl aplikován oxid siřičitý v dávce 100 mg/l SO2 na začátku alkoholového kvašení a 40 mg/l po dokončení jablečno-mléčného kvašení. Autoři došli k 46

závěru, že vysoké dávky SO2 zabraňují vzniku aminů během zrání vína. Sledovali v pěti španělškých vinařstvích změnu biogenních aminů u červených vín po dobu celého procesu vinifikace. Víno bylo v mladém stavu uloženo po dobu šesti měsíců v dubovém sudu. Naopak, Gerbaux a Monamy (2000) zjistili významné zvýšení koncentrace histaminu, tyraminu, a putrescinu během uložení v sudu u Chardonnay a Pinot Noir, zejména mezi čtvrtým a osmým měsícem zrání. V této práci byla sledována vína pocházející z různých vinařství v regionu Burgundska a vyrobená různými vinifikačními technologiemi, obvyklé v příslušném vinařství. Jiménez, Torrea, a Ancín (2003) studovali vývoj aminů během osmi měsíců u odrůdy Merlot při zrání v dubových sudech (Graf. 1). V této studii byla koncentrace histaminu a tyraminu zvýšena na začátku uložení a později se snížila, pravděpodobně v důsledku jejich degradace. Putrescin, který vznikal během zrání, dosáhl své maximální koncentrace na konci sledovaného období uložení. Koncentrace kadaverinu se zvýšila v průběhu prvního měsíce zrání a později se téměř nezměnila. Koncentrace phenylethylaminu + spermidinu ve víně byla zvýšena ve čtvrtém měsíci uskladnění v dubových sudech a koncentrace sperminu byla téměř nezměněna v průběhu sledovaného období.

47

Graf. 1: Změny biogenních aminů během zrání ve francouzských sudech (Allier a Nevers) a amerických sudech (Jiménez, Torrea, a Ancín, 2003)

Syntéza biogenních aminů během zrání vína v dubových sudech by mohla být způsobena přítomností zůstatku bakterií mléčného kvašení ve víně, které v případě nedostatku živin získávají energii přes dekarboxylaci aminokyselin (Konnings et al., 1997). Proto by se mohlo zdát, že během skladování vína přežívá více kmenů bakterií mléčného kvašení s dekarboxylázovou činností, než těch, které tuto činnost nemají (Lonvaud-Funel, 2001). Coton et al. (1998) zaznamenali, že po 2 měsících zrání populace bakterií Leuconostoc oenos 9204 zcela vymizela, zatímco stále existovala aktivita enzymů histidindescarboxiláz, která trvala i po 4 měsících. Toto by naznačovalo, že biogenní aminy by mohly být vytvořeny i po odumření životaschopných bakterií mléčného kvašení ve víně. Dalším faktorem, který by 48

mohl podpořit vznik aminů během zrání vína v sudu, je uvolňování aminokyselin po dokvašení v důsledku autolýzy některých kvasinek (Slaughter et al., 1987; Kruger et al, 1992) a změny plazmatické membrány živých kvasinek (Ayestarán et al, 1995; Monteiro a Bisson, 1991). V mnoha fermentovaných potravinách byla degradace histaminu a tyraminu pozorována v důsledku působení enzymu histaminoxidázy a tyraminoxidázy přítomné v některých bakteriích. Tyto enzymy snižují obsah histaminu a tyraminu (Voigt a Eitenmiller, 1978; Leuschner et al, 1998; Enes-Dapkevicius et al., 2000). Výsledky Jiménez, Torrea, a Ancína (2003) naznačují, že i ve víně existuje tato aktivita enzymu, a že katalyzuje oxidaci histaminu a tyraminu a tím se snižuje koncentrace v prvních měsících zrání vína v sudech. Není pravděpodobné, že by musel být požadavek na kyslík těchto enzymů limitujícím faktorem pro jejich činnost. Zrání vína v sudech může probíhat několika způsoby: buď se uchovává víno na kalech, nebo se filtruje. Jiménez-Moreno a Ancín-Azpilicueta (2003) studovali koncentraci biogenních aminů v červeném víně odrůdy Merlot po křemelinové filtraci a bez filtrace téměř po dobu jednoho roku. Vína zůstala po 243 dnů v sudech z amerického dubu a v sudech z francouzského dubu. Během zrání vína v sudu, zjistili, že dimethylamin a isobutylamin byly v menší koncentraci ve víně po 8 měsících skladování než na počátku, v mladém víně. Obsahy pyrrolidinu a etylaminu se zvýšily u několika vzorků na konci skladování, zatímco izopropylaminu, diethylaminu, amylaminu, a hexylaminu zůstaly prakticky stejné během celého skladování v sudu. Snížení koncentrací těkavých aminů by mohlo nastat díky spotřebě těchto aminů zbytky bakterií z populace ve víně (Boulton et al., 1996). Autoři došli k závěru, že křemelina má relativně velký povrch a záporný náboj a tak adsorbuje větší množství dusíkatých látek z moštu, jako aminokyseliny a proteiny, a lze očekávat, že budou částečně adsorbovány na povrchu. V důsledku tohoto by mohla filtrace pomocí křemeliny ovlivnit koncentraci biogenních aminů během školení a zrání vína. Výsledky práce ukázaly, že různé stupně zákalu vína neměly žádný vliv na změnu koncentrace biogenních aminů během skladování.

4.7.2. Vývoj aminů ve víně při skladování v láhvi Víno je dříve či později nalahvované a to je jeho finální a konečná nádoba. V láhvi víno bude ležet různou dobu v závislosti na tom, zda jsou to mladé typy vína nebo výběrové typy vína, které později dosáhnou plné zralosti v láhvi což má velký vliv na jejich kvalitu. Vidal Carou, Codony-Salcedo, a Marine-Font (1991) studovali vývoj čtyř komerčních druhů 49

vín, s různým obsahem histaminu a tyraminu během jejich uskladnění v láhvi v rozdílných teplotách. Autoři nenašli žádné zvýšení koncentrace těchto aminů v žádné z teplot skladování (4° C až 6° C, 20° C až 24° C, 30° C až 35° C). Sice našli snížení obsahu histaminu v jedné z láhví při teplotě mezi 20 - 24° C po 78 dnech skladování, ale ukázalo se, vzorek měl vyšší těkavost (těkavé kyseliny byly výšší než 1 g/L vyjádřeny jako kyselina octová). Rovněž, zjistili, že koncentrace tyraminu se snížila po 80 dnech skladování v jedné z láhví při teplotě mezi 4 - 6° C. Později, Landete et al. (2005) studovali vliv skladování v láhvi na obsah biogenních aminů v mladých typech vín z oblasti Utiel-Requena (Valencie, Španělsko) a zjistili zvýšení koncentrace histaminu během prvních 6 měsíců při uskladnění v láhvi. Po této době došlo ke snížení koncentrace sledovaného aminu. Během 12 měsíců při uskladnění v láhvi hodnoty tyraminu, putrescinu a fenyletylaminu neukázali nějakou důležitou změnu. Také Gonzalez Marco a Ancín-Azpilicueta (2006) studovali vývoj aminů odrůdy Chardonnay při skladování vína v lahvích v různých teplotách (4° C, 20° C, a 35° C) po dobu 105 dnů. Zjistili zvýšení koncentrace histaminu během prvních 45 dnů ve všech vzorcích, a to nezávisle na teplotě. Na konci sledované doby, při 20° C, byla naměřena vyšší koncentrace tohoto aminu než u ostatních vín uložených při více extrémních teplotách. Tento rozdíl je pravděpodobně kvůli faktorům, kterými byla decarboxylázová aktivita podporovaná více při pokojové teplotě než v extrémních teplotách při 4° C a 35° C. Navíc, tyramin, putrescin a kadaverin se při skladování jejich obsah prakticky neměnil kromě tyraminu, jehož koncentrace se snížila ve všech vzorcích po 75 dnech v láhvi. Dynamika sperminu byla úplně jiná než u ostatních aminů, který postupně mizel z vína ve všech vzorcích a tento proces probíhal rychleji ve víně při skladování při 4° C a 35° C než ve víně při pokojové teplotě. Byl také sledován vývoj těkavých aminů. Z čehož vyplynulo, že koncentrace etylaminu, pyrrolidinu, a hexylamin byly mírně vyšší na začátku skladování, zatímco koncentrace dimetylaminu se snížila až během prvních 45 dnů a dále zůstala stabilní. Koncentrace isobutylaminu a izopropylaminu neukázaly během sledované doby významné změny a obsah diethylaminu se při teplotě 35 °C ve víně mírně snížil.

50

5. Metodika 5.1 . Vzorky a jejich příprava 5.1.1. Monitoring BA v moravských vínech Bylo analyzováno 71 vzorků vín ročníků 1996 až 1999 z tehdejších 7 moravských vinařských oblastí a jeden vzorek ze Slovenska. Bylo připraveno 11 vzorků ze bzenecké oblasti, 10 vzorků z mutěnické oblasti, 5 vzorků z oblasti Podluží, 7 vzorků ze Strážnické oblasti, 1 vzorek z Uherskohradišťské, 14 vzorků z velkopavlovické, 23 vzorků ze znojemské oblasti. Byly v následujících jakostních kategoriích: 33 jako jakostní, 6 kabinetní, 27 pozdní sběr a 6 výběr z hroznů. Vzorky ošetřeny 100 mg.l-1 azidem sodným pro zabránění mikrobiální degradace, nebo ovlivnění analytických hodnot mikrobiální činností. Následně byly uloženy ve sklepních prostorách při teplotě 12 až 14 °C. Analýzy byly následně provedeny současně i se vzorky ostatních variant na obsah histaminu, tyraminu, putrescinu, cadaverinu, spermidinu, sperminu a agmatinu.

5.1.2. Sledování BA v průběhu alkoholového kvašení Byla sledována dynamika změn v obsahu biogenních aminů v průběhu alkoholového kvašení. Hrozny odrůdy Neburské byly sbírány 22. 10. 2004 při cukernatosti 21 °NM a následně zpracovány na mošt. Ten byl zakvašen čistou kulturou kvasinek Saccharomyces cerevisiae LW 415-58 v dávce 20g/hl. Z kvasícího moštu byly odebírány vzorky, které byly stabilizované 0,01% azidem sodným a následně analyzovány na obsah BA.

51

Tab. 12: Odebrané vzorky při alkoholovém kvašení Označení vzorku NG 1a NG 2a NG 2b NG 2c NG 2d NG 2e NG 2f NG 2g NG 2h NG 2i NG 2j NG 2k NG 2l

Datum odběru 19.10.2004 22.10.2004 25.11.2004 27.11.2004 29.11.2004 31.10.2004 2.11.2004 4.11.2004 6.11.2004 8.11.2004 10.11.2004 12.11.2004 14.11. 17.11. 21.11. 26.11. 20.12.

Popis Hrozen Mošt Kvasící mošt Kvasící mošt Kvasící mošt Kvasící mošt Kvasící mošt Kvasící mošt Dokvášení Dokvášení Dokvášení Dokvášení

5.1.3. Pro zjištění vlivu napadení Byly odebrány napadnuté a nenapadnuté hrozny z ročníku 2004, z nichž byl vylisován mošt, který byl stabilizován 0,01% azidem sodným a následně analyzován na obsah BA Tab. 13: Označení vzorků pro zjištění vlivu napadení hroznů patogeny Označení vzorku NG 1a NG 1b NG 1c NG 3a NG 3b RV 1a RV 1b FR

Datum odběru 19.10.2004 19.10.2004 19.10.2004 30.10.2004 30.10.2004 30.10.2004 30.10.2004 30.10.2004

Popis Zdravý hrozen Padlí 50% Botrytis 30% Zdravý hrozen Botrytis 30% Zdravý hrozen Botrytis 30% Zdravý hrozen

5.1.4. Srovnání BA u botrytických výběrů a nižších kategorií vína Byly zpracovány hrozny vždy ve dvou kategoriích ze stejné lokality Sauvignon pozdní sběr 07 a Sauvignon výběr z bobulí 07; Ryzlink rýnský pozdní sběr 07 a Ryzlink rýnský Výběr z cibéb 07; Rulandské šedé pozdní sběr 07 a Rulandské šedé výběr z cibéb 07. Vzorky vína byly odebrány ve fázi po skončení alkoholové fermentaci a samovolné sedimentaci, byly stabilizovány 0,01% azidem sodným a analyzovány na obsah BA

52

5.1.5. Porovnání tvorby biogenních aminů u jablečnomléčného kvašení Byla

sledována

tvorba

biogenních

aminů

za

použití

tří

komerčních

preparátů

jablečnomléčných bakterií Oenococcus oeni. Byly použity BIOSTART® FORTE SK2®; přípravek BIOLACT ACCLIMATÉE, což je směs tří kmenů bakterií Oenococcus oeni, které se od sebe geneticky liší a VINIFLORA® OENOS, což je kmen (DSM 7008 ) Oenococcus oeni. Těmito kulturami bylo zaočkováno víno a po skončení jeblečnomléčné fermentace odebrány vzorky pro stanovení biogenních aminů. Bylo použito víno odrůdy Frankovka p.s. z velkopavlovické podoblasti ročníku 2006. Vzorky vína byly odebrány ve fázi po skončení jablečnomléčné fermentace, byly stabilizovány 0,01% azidem sodným a analyzovány na obsah BA

5.1.6. Možnosti snížení BA u aplikace čiřících přípravků Bylo sledováno snížení biogenních aminů při aplikaci standardních čiřících látek (bentonit, želatina, tosil. Do bílého vína odrůdy MT byly přidány standarty biogenních aminů (histamin, tyramin, putrescin, cadaverin, spermidin, spermin) tak, aby koncentrace byla kolem 10 mg/L. Do tohoto vína byla aplikována dávka čiřících přípravků: Bentonit 50 g/hl, Bentonit 100 g/hl, Bentonit 150 g/hl, Bentonit 200 g/hl, Bentonit 50 g/hl, želatina 10 g/hl, Bentonit 100 g/hl + želatina 10 g/hl, Bentonit 100 g/hl + želatina 15 g/hl, Želatina 5 g/hl, Želatina 10 g/hl, Želatina 10 g/hl + tosil 100 ml/hl, Želatina 10 g/hl + tanin 10 g/hl. Po sedimentaci 24 hodin byl vzorek odfiltrován a analyzován na obsah BA. Současně byl analyzován vzorek vína s přidanými BA, který sloužil pro základní hodnoty BA.

5.2 . Chemikálie a standarty Histamin, tyramin, putrescine, kadaverin, agmatine, spermidin a spermin byly zakoupeny ze Sigmy Aldrich, Inc ., St. Louis, USA. Monohydrát kyselina citrónové, citronan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, bromid draselný, hydroxid draselný, hydroxid sodný thiodiglycol, azid sodný a isopropanol byl dodán Ingos, Praha, Česká republika. Ninhydrine, 2methoxyetanol (methylcellosolve) (4 mola/l), acetátový pufr (pH 5.5) a hydrindantin byly také zakoupeny od Ingos, Praha, Česká republika jak přípravky pro ninhydrinovou reakci (pro postkolonovou derivatizaci).

53

5.3 . Stanovení biogenních aminů Sto mililitrů vzorku vína bylo zakoncentrovano na vakuové odparce při 50 °C a odparek byl rozpuštěn v rozpouštěcím pufru (tab. 14) v 25 ml odměrné baňce, která byla 24 hodiny uložena při teplotě 3±1 °C. Pak byl vzorek odstředěn (10,000 × g po 30min při 3 °C), aby došlo k odstranění sedimentů. Následně byl filtrován se přes 0,45 µm filtr a analyzován. Sedm biogenních aminů (histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, agmatin, spermidin a spermin) bylo analyzováno na analyzátoru aminokyselin, což představuje speciální kompaktní kapalinový chromatograf pro analýzu aminokyselin a biogenních aminů; na ionexové koloně s postkolonovou derivatizací ninhydrinem. Analýzy se uskutečnily na tehdejším Ústavu potravinářského inženýrství UTB ve Zlíně. Malé množství (sto µl) směsi bylo automaticky vstříknuto do analyzátoru aminokyselin AAA400 (Ingos, Praha, Česká republika), který byl vybaven náplní kolony: OSTION Lg ANB; výška sloupce: 55 x 3,7 mm, s postkolonovou derivatizací ninhydrinem a spektrofotometrickým detektorem (při 570 nm). Aminy byly eluovány podle programu: 0–60 min pufr A a 60–86 min pufr B (složení pufrů je v tabulce). Pak se kolona regenerovala 0,2 mol/l NaOH pro 15 min a stabilizována dalších 19 min pufrem A. Teplota kolony byla temperována na 65 °C (0–41 min po dobu 111–120 min) a při 45 °C dalších (41–111 min). Ninhydrinové činidlo je složeno z ninhydrinu, 2 methoxyetanol (4 mola/l), acetátového pufru (pH 5,5) a hydrindantinu, což bylo doporučené výrobcem analyzátoru. Rychlost průtoku byla 0,3 ml/min a 0,2 ml/min pro ninhydrinové činidlo. Každý vzorek byl analyzován pětkrát.

Tab. 14: Složení (g) sodnocitrátotvého pufru 1 L Chemikálie Kyselina citrónová mono-hydrát Citronan sodný dihydrát Chlorid sodný Chlorid draselný Bromid draselný Hydroxid draselný Azid sodný Isopropanol Thiodiglycol (mL)

Pufr A 1,55 21,00 5,00 0 41,65 0 0 250,00 0

B 14,00 0 0 171,50 0 10,00 0 0 0

54

Nanášecí pufr 14,00 0 11,50 0 0 0 0,10 0 5,00

Graf 2: záznam detektoru standartu BA

Záznam detektoru směsi standardů BA (histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, agmatin, spermidin a spermin) v koncentraci 500 nmol/ml.

55

6. Výsledky 6.1. Monitoring BA v moravských vínech

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

RŠ

MT

FR

RŠ

MT

NG

RV

VZ

MP

MT

MM

RM

99

99

99

99

99

99

99

99

99

99

99

99

99

jakostní

jakostní pozdní sběr

jakostní pozdní sběr

jakostní výběr z hroznů pozdní sběr

jakostní

kabinetní

jakostní

kabinetní

kabinetní

ND

ND

spermine

0,89 0,082 9,2% 0,77 0,042 5,5% 1,17 0,090 7,7% 8,95 0,403 4,5% 0,95 0,072 7,6% 0,75 0,068 9,1% 0,82 0,058 7,1% 1,03 0,060 5,8% 2,01 0,084 4,2% 0,77 0,049 6,4% 0,92 0,068 7,4% 0,75 0,052 6,9% 1,84 0,101 5,5%

spermidine

mean ND 0,55 SD 0,033 CV 6,0% mean ND 2,23 SD 0,081 CV 3,6% mean ND 3,11 SD 0,393 CV 12,7% 0,36 1,82 mean SD 0,026 0,153 CV 7,2% 8,4% mean ND 1,33 SD 0,099 CV 7,4% ND 0,70 mean SD 0,049 CV 7,0% mean ND 0,83 SD 0,054 CV 6,5% mean ND 0,71 SD 0,051 CV 7,3% mean ND 1,74 SD 0,083 CV 4,8% mean ND 0,52 SD 0,045 CV 8,6% mean 0,13 1,56 SD 0,013 0,099 CV 10,6% 6,3% mean ND 1,82 SD 0,090 CV 4,9% mean 0,16 2,31 SD 0,008 0,118 CV 4,8% 5,1%

histamine

agmatine

2

MM

cadaverine

1

jakostní stupeň

putrescine

odrůda ročník

tyramine

Tab. 15: Výsledky BA v moravských vínech

oblast

bzenecká

velkopavlovická

mutěnická

strážnická

bzenecká

bzenecká

bzenecká

bzenecká

strážnická

bzenecká

velkopavlovická

strážnická

mutěnická

56

0,08 ND 0,006 7,6% 0,11 0,28 0,009 0,020 8,3% 7,2% ND ND

ND

ND

ND

ND

0,16 0,006 3,6% ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,11 0,007 6,7% ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,08 0,007 8,4% ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,10 0,008 7,9% ND

ND

ND

0,17 0,019 11,2% ND 0,06 0,005 9,1% ND 0,65 0,048 7,5%

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

VČR

MT

TČ

SG

FR

RB

TČ

VZ

RB

TČ

VZ

99

98

99

99

99

jakostní

jakostní pozdní sběr pozdní sběr

jakostní

99

jakostní

99

pozdní sběr

99

99

98

99

jakostní pozdní sběr pozdní sběr pozdní sběr

strážnická

velkopavlovická

mutěnická

velkopavlovická

bzenecká

bzenecká

velkopavlovická

velkopavlovická

mutěnická

znojemská

bzenecká

25

SG

99

výběr z hroznů

mutěnická

26

SV

99

jakostní

znojemská

27

ZW

99

jakostní

znojemská

28

29

30

MT

MM

MO

99

99

99

pozdní sběr

jakostní pozdní sběr

velkopavlovická

znojemská

SLOVENSKO

0,06 mean SD 0,006 CV 11,2% mean ND SD CV mean ND SD CV 0,10 mean SD 0,002 CV 2,2% ND mean SD CV mean 0,07 SD 0,004 CV 5,9% mean 0,16 SD 0,023 CV 14,5% mean 0,12 SD 0,001 CV 1,2% mean ND SD CV ND mean SD CV mean ND SD CV mean ND SD CV mean ND SD CV mean ND SD CV mean 0,10 SD 0,010 CV 10,0% mean ND SD CV mean ND SD CV

57

1,08 1,31 ND 0,072 0,148 6,7% 11,3% 0,06 0,06 ND 0,003 0,003 5,4% 4,7% 4,98 1,81 ND 0,387 0,089 7,8% 4,9% 1,66 0,88 ND 0,139 0,075 8,4% 8,6% 0,96 0,67 ND 0,020 0,010 2,1% 1,4% 1,00 0,82 ND 0,040 0,008 4,0% 1,0% 3,38 2,51 0,06 0,287 0,168 0,004 8,5% 6,7% 6,9% 0,96 1,51 ND 0,030 0,102 3,2% 6,8% 5,26 0,81 ND 0,380 0,057 7,2% 7,0% 2,86 1,36 ND 0,239 0,109 8,4% 8,0% 0,56 0,53 ND 0,024 0,070 4,3% 13,3% 2,46 1,03 ND 0,185 0,045 7,5% 4,4% 11,56 2,93 0,27 0,824 0,199 0,026 7,1% 6,8% 9,8% 5,18 2,30 0,14 0,494 0,178 0,024 9,5% 7,7% 17,5% 1,01 1,25 ND 0,096 0,017 9,4% 1,4% 0,33 0,24 ND 0,015 0,025 4,7% 10,6% 0,19 0,95 ND 0,014 0,036 7,6% 3,8%

ND

0,06 0,006 9,2% ND 0,04 0,007 17,4% ND ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,17 ND 0,022 13,5% 0,04 ND 0,001 2,6% 0,10 ND 0,005 4,4% 0,15 0,24 0,015 0,016 9,7% 6,4% 0,08 ND 0,010 11,9% ND ND

0,06 0,004 7,3% ND

ND

ND

ND

0,12 ND 0,016 13,3% ND 0,28 0,31 0,036 0,031 12,7% 9,9% ND ND ND

ND

ND

ND

0,79 0,049 6,2% ND

ND

ND

ND

ND

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

VZ

RB

VZ

SG

VZ

SV

PA

AU

RV

TČ

AU

FR

RR

MT

PA

RM

FR

98

99

99

96

99

99

jakostní

jakostní

jakostní

jakostní

jakostní

jakostní

99

jakostní

99

pozdní sběr

98

99

99

99

99

99

98

99

99

jakostní výběr z hroznů pozdní sběr výběr z hroznů

jakostní

jakostní pozdní sběr pozdní sběr pozdní sběr

mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD CV bzenecká mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD CV mutěnická mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD CV velkopavlovická mean SD CV mutěnická mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD CV znojemská mean SD uherskohradišťská CV mean SD CV velkopavlovická

58

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,07 0,004 6,4% 0,20 0,007 3,4% ND

ND

ND

0,07 0,005 6,7% ND

ND

ND

0,21 0,019 9,2% 0,10 0,008 7,8%

0,15 0,61 0,017 0,008 11,6% 1,4% 2,24 0,53 0,110 0,007 4,9% 1,3% 1,06 0,96 0,033 0,008 3,2% 0,8% 2,79 1,89 0,212 0,141 7,6% 7,5% 2,54 0,76 0,066 0,007 2,6% 0,9% 6,02 2,24 0,014 0,185 0,2% 8,3% 0,36 1,08 0,024 0,101 6,7% 9,3% 2,18 1,60 0,129 0,047 5,9% 2,9% 2,22 0,30 0,212 0,034 9,6% 11,4% 4,21 2,02 0,250 0,114 5,9% 5,7% 4,61 1,38 0,285 0,110 6,2% 8,0% 1,66 1,11 0,104 0,094 6,3% 8,4% 0,36 0,26 0,027 0,022 7,6% 8,6% 0,50 0,37 0,010 0,028 2,0% 7,6% 2,09 1,10 0,109 0,049 5,2% 4,5% 3,96 2,53 0,310 0,098 7,8% 3,9% 0,88 39,00 0,075 2,199 8,5% 5,6%

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,37 0,008 2,2% ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,31 0,023 7,4% 0,65 0,028 4,4%

ND

ND

ND

0,19 0,018 9,5% 0,23 0,029 12,3% 0,21 0,017 8,1% 0,16 0,017 10,3% 0,24 0,012 4,7% 1,52 0,097 6,4% 0,26 0,030 11,5% 1,08 0,013 1,2% 0,12 0,009 7,7% ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,12 ND 0,006 4,6% 0,25 0,25 0,030 0,004 12,3% 1,4% 0,26 ND 0,030 11,6% 0,16 ND 0,008 4,9% 0,07 ND 0,002 2,7% 0,92 ND 0,041 4,5% 0,55 ND 0,019 3,3%

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

SV

ZW

RB

PA

ZW

FR

VZ

TČ

VZ

MM

RV

FR

CS

MT

SV

VZ

RV

99

98

98

99

pozdní sběr

jakostní

jakostní výběr z hroznů

99

jakostní

99

pozdní sběr

99

pozdní sběr

98

pozdní sběr

99

99

99

99

99

99

99

99

99

pozdní sběr

jakostní

kabinetní pozdní sběr pozdní sběr pozdní sběr

jakostní

kabinetní

jakostní

velkopavlovická

znojemská

znojemská

znojemská

znojemská

znojemská

znojemská

znojemská

velkopavlovická

velkopavlovická

strážnická

podluží

mutěnická

podluží

mutěnická

strážnická

velkopavlovická

0,18 1,36 82,16 1,27 0,27 0,99 mean SD 0,014 0,133 4,994 0,074 0,029 0,097 CV 7,5% 9,8% 6,1% 5,8% 10,8% 9,9% mean 0,16 2,46 3,00 0,07 ND 0,19 SD 0,005 0,120 0,096 0,002 0,008 CV 3,3% 4,9% 3,2% 3,1% 4,5% mean ND 5,64 1,80 0,15 ND 0,15 SD 0,327 0,074 0,012 0,011 CV 5,8% 4,1% 7,6% 7,6% ND 3,25 2,21 ND ND 0,04 mean SD 0,118 0,077 0,004 CV 3,6% 3,5% 10,9% 0,06 3,75 1,90 ND ND 0,14 mean SD 0,001 0,285 0,133 0,009 CV 1,7% 7,6% 7,0% 6,1% mean 0,17 5,27 3,44 0,12 ND 0,04 SD 0,016 0,415 0,242 0,009 0,001 CV 9,8% 7,9% 7,0% 7,3% 2,9% mean 0,08 2,56 0,98 ND ND 0,19 SD 0,004 0,185 0,093 0,007 CV 4,8% 7,2% 9,5% 3,7% mean ND 0,11 0,26 ND ND ND SD 0,009 0,016 CV 7,9% 6,2% mean ND 0,26 1,05 ND ND 0,17 SD 0,029 0,083 0,016 CV 11,0% 8,0% 9,4% ND 0,39 0,83 ND ND 0,09 mean SD 0,017 0,071 0,008 CV 4,3% 8,6% 9,3% mean ND 0,06 0,79 ND ND ND SD 0,004 0,053 CV 6,9% 6,7% mean 0,08 7,03 2,21 0,11 ND 0,64 SD 0,008 0,204 0,077 0,010 0,023 CV 10,4% 2,9% 3,5% 9,1% 3,6% mean 0,09 0,76 2,84 0,31 ND 0,82 SD 0,004 0,055 0,066 0,013 0,012 CV 4,5% 7,2% 2,3% 4,4% 1,5% mean ND 7,05 0,73 ND ND 0,17 SD 0,436 0,039 0,016 CV 6,2% 5,4% 9,4% mean 0,10 2,74 1,72 0,13 ND 0,84 SD 0,002 0,151 0,199 0,021 0,091 CV 2,1% 5,5% 11,5% 15,7% 10,9% mean 0,06 0,91 0,90 0,97 ND 0,09 SD 0,001 0,077 0,068 0,030 0,004 CV 2,5% 8,5% 7,6% 3,1% 4,6% mean ND 0,60 0,94 0,03 ND 0,15 SD 0,046 0,081 0,000 0,011 CV 7,6% 8,7% 1,0% 7,7%

59

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

65

66

67

68

69

70

71

72

ZW

NG

NG

FR

TČ

MM

SV

ZW

99

99

99

pozdní sběr pozdní sběr

jakostní

99

jakostní

99

výběr z hroznů

99

pozdní sběr

99

99

jakostní

kabinetní

podluží

podluží

velkopavlovická

mutěnická

bzenecká

podluží

znojemská

strážnická

ND mean SD CV mean ND SD CV mean 0,07 SD 0,008 CV 10,7% 0,12 mean SD 0,001 CV 1,2% 0,07 mean SD 0,003 CV 4,6% mean 0,09 SD 0,005 CV 5,4% mean ND SD CV mean 1,70 SD 0,121 CV 7,1%

3,67 0,290 7,9% 6,18 0,375 6,1% 1,56 0,131 8,4% 2,11 0,141 6,7% 1,24 0,084 6,8% 3,91 0,334 8,5% 3,99 0,330 8,3% 1,65 0,107 6,5%

2,48 ND 0,227 9,1% 0,63 ND 0,038 6,0% 0,82 ND 0,025 3,0% 1,81 0,09 0,097 0,006 5,3% 6,7% 1,96 0,06 0,138 0,001 7,1% 2,1% 1,41 ND 0,072 5,1% 80,09 0,49 4,904 0,023 6,1% 4,7% 5,43 0,10 0,427 0,011 7,9% 11,9%

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,47 0,007 1,5% 0,12 0,007 6,2% 0,14 0,002 1,3% 1,09 0,077 7,0% 0,04 0,005 13,5% 0,30 0,027 8,8% ND

moravských oblastí. Byly odebrány vzorky vín v různých kvalitativních kategoriích většiny u nás pěstovaných odrůd, a stabilizovány azidem sodným a následně analyzovány na obsahy

ND…………. Hodnota byla od detekčním limitem měření SD………….. Směrodatná odchylka CV…………..Variační koeficient Mean……….. Aritmetický průměr

60

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,13 0,26 0,005 0,005 4,0% 1,9%

V tabulce jsou zaznamenány hodnoty BA z ročníků 1998 a 1999 u vín z tehdejších

BA.

ND

6.2. Sledování BA v průběhu alkoholového kvašení Tab. 16: Hodnoty BA v průběhu alkoholového kvašení

2a (mošt) 22.10. NG 2b (kvasící mošt) 25.10. NG 2c (kvasící mošt) 27.10. NG 2d (kvasící mošt) 29.10. NG 2e (kvasící mošt) 31.10. NG 2f (kvasící mošt) 2.11. NG 2g (kvasící mošt) 4.11. NG 2h (kvasící mošt) 6.11. NG 2i (kvasící mošt) 8.11. NG 2j (kvasící mošt) 10.11. NG 2k (kvasící mošt) 12.11. NG 2l (kvasící mošt) 14.11. NG 2 (kvasící mošt) 17.11. NG 2 (kvasící mošt) 21.11. NG 2 (kvasící mošt) 26.11. NG 2 (kvasící mošt) 20.12.

průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV

histami tyrami ne ne

putresci ne

cadaveri agmati ne ne

spermidi spermi ne ne

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,27 0,051 18,7% 0,35 0,031 8,8% 0,50 0,069 13,7% 0,56 0,083 14,9% 0,57 0,111 19,6% 0,57 0,039 6,9% 0,59 0,051 8,7% 0,51 0,010 1,9% 0,55 0,030 5,5% 0,62 0,011 1,7% 0,60 0,069 11,5% 0,59 0,068 11,4% 0,59 0,052 8,8% 0,60 0,053 8,8% 0,63 0,118 18,7% 0,67 0,055 8,2%

ND

ND

0,63 0,105 16,7% 0,11 0,017 14,9% 0,78 0,099 12,7% 0,86 0,059 6,9% 1,10 0,095 8,7% 1,00 0,177 17,6% 0,93 0,145 15,6% 1,27 0,186 14,7% 1,29 0,149 11,6% 1,36 0,214 15,8% 1,41 0,035 2,5% 1,43 0,125 8,7% 1,44 0,070 4,9% 1,47 0,028 1,9% 1,59 0,249 15,7% 1,62 0,079 4,9%

61

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Obsahy BA v průběhu a těsně po alkoholovém kvašení vína 1,80 1,60 1,40

mg/L

1,20

putrescine

spermidine

1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 18.10

28.10

7.11

17.11

27.11

7.12

17.12

Graf 3: Obsahy BA v průběhu a těsně po alkoholovém kvašení vína

Alkoholové kvašení, jak ukazuje graf, mělo vliv na zvýšení putrescinu a spermidinu jak ukatují hodnoty v tabulce a grafu. Spermidin poklesl během počátku kvašení, pravděpodobně sloužil během počátku kvašení jako zdroj utilizovaného dusíku pro kvasinky. Totéž se opakovalo při dokvášení tj. 7 až 10 den po začátku kvašení, kdy v moštu kvasinkám sloužily BA taktéž jako zdroj výživy.

62

27.12

6.3. Vliv houbových chorob na obsah BA při napadení hroznů Tab 17: Hodnoty BA zdravých a napadených hroznů

NG 1a (zdravý hrozen) 22.10. NG 1b (Padlí 50%) 22.10. NG 1c (Botrytis 30%) 22.10. NG 3a (zdravý hrozen) 30.10. NG 3b (Botrytis 30%) 30.10. RV 1a (zdravý hrozen) 30.10. RV 1b (Botrytis 30%) 30.10. FR (zdravý hrozen) 30.10.

průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV

tyramine putrescine spermidine ND ND 0,08 0,012 15,0% ND ND 0,12 0,017 13,8% ND ND ND

ND

ND

ND

ND

0,33 18,8%

2,10 0,103 4,9% 1,40 0,064 4,6% 0,80 0,070 8,7% 0,23 0,019 8,5% 1,04 0,016 1,5%

0,50 0,017 3,5% 1,89 0,048 2,5% 1,04 0,081 7,8% 0,47 0,041 8,8% 1,47 0,109 7,4%

S uvedené tabulky 17 a grafu 4 je velmi variabilní zvýšení či snížení obsahu BA v závislosti na kontaminaci hroznů mikrobiálním napadením.

63

Graf 4: Hodnoty BA zdravých a napadených hroznů tyramine

putrescine

spermidine

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00 NG 1a (zdravý hrozen)

NG 1b (Padlí NG 1c 50 %) (Botrytis 30 %)

NG 3a (zdravý hrozen) 30.10.

64

NG 3b (Botrytis 30 %) 30.10.

RV 1a (zdravý hrozen) 30.10.

RV 1b FR (zdravý (Botrytis 30 hrozen) %) 30.10. 30.10.

6.4. Srovnání BA u botrytických výběrů a nižších kategorií vína

spermine

RŠ VzCibéb 07

spermidine

RŠ PS 07

agmatine

RR VzCibéb 07 Sonberk

cadaverine

RR PS 07 Sonberk

putrescine

SG VZB 07

tyramine

SG PS 07 GC

průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV

histamine

Tab. 18: Hodnoty BA u botrytických výběrů a nižších kategorií vína

ND

0,80 0,033 4,1% 2,07 0,012 0,6% 1,06 0,072 6,8% 6,16 1,009 16,4% 1,74 0,076 4,4% 3,37 0,711 21,1%

1,46 0,059 4,0% 0,95 0,070 7,4% 0,67 0,185 27,8% 1,32 0,323 24,5% 2,06 0,136 6,6% 0,48 0,224 46,4%

ND

ND

0,98 0,044 4,5% ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

0,61 0,104 17,1% ND ND

ND

ND

ND

ND

ND

1,50 0,105 7,0% ND

ND

ND

Jak vyplývá z výsledků tabulky a grafu u vín vyšších jakostních stupňů došlo k nárůstu tyraminu jen, u kategorií výběru z cibéb odrůd RR a RŠ oproti kategoriím pozdní sběr téže odrůdy a i u odrůdy SG byl nárust u kategorie výběr z bobulí oproti pozdní sběr.

65

Graf 5: Hodnoty BA u botrytických výběrů a nižších kategorií vína 7,00

6,00

tyramine putrescine spermidine

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00 SG PS 07 GC

SG VZB 07

RR PS 07 Sonberk

RR VzCibéb 07 Sonberk

66

RŠ PS 07

RŠ VzCibéb 07

6.5. Porovnání tvorby biogenních bioge aminů sledovaných u jablečnomléč čnomléčného kvašení Tab. 19:: Hodnoty BA po prokvašení u tří t kmenů JMK bakterií Fr 06 PS SK2 průměr SD histamine 9,84 0,284 tyramine 10,60 0,051 putrescine 59,30 0,508 cadaverine ND agmatine ND spermidine 2,15 0,024 spermine ND

CV 2,9% 0,5% 0,9%

1,1%

Fr 06 PS biolact Alimaté Fr 06 PS Oenococus průměr SD CV prů průměr SD 10,09 0,181 1,8% 9,31 0,378 12,35 0,405 3,3% 9,74 0,195 60,15 2,067 3,4% 54,63 1,480 ND ND ND ND 2,48 0,149 6,0% 1,96 0,027 0,28 0,117 41,4% ND

CV 4,1% 2,0% 2,7%

1,4%

Graf 6: Hodnoty BA po prokvašení u tří t kmenů JMK bakterií 14

64

histamine tyramine

62

spermidine

12

spermine

60

putrescine

10

mg/L

8 56 6 54 4 52 2

50

0

48 Fr 06 PS SK2

Fr 06 PS biolact Alimaté

Fr 06 PS Oenococus

Z tabulky 19 a grafu 6 vyplývá, že u všech tří preparátů baterií JMK byly vyšší koncentrace putrescinu. V grafu jsou hodnoty putrescinu na svislé vedlejší ose vpravo, hodnoty ostatních BA jsou na svislé hlavní ose vlevo.

67

putrscine

58

6.6. Možnosti snížení BA u aplikace čiřících přípravků Tab. 20: Hodnoty BA po aplikaci čiřících přípravků dávka g/hl

Původní víno

Bentonit 50

Bentonit 100

Bentonit 150

Bentonit 200 Bentonit 50 želatina 10 Bentonit 100 želatina 10 Bentonit 100 želatina 15

Želatina 5

Želatina 10 Želatina 10 tosil 100 Želatina 10 tanin 10

průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV průměr SD CV

histamin tyramin putrescin cadaverin spermidin spermin 8,51 8,43 10,63 10,83 10,08 8,97 0,322 0,864 0,618 0,734 0,580 0,437 5,1% 3,8% 8,1% 5,7% 7,3% 6,5% 8,38 8,58 10,60 10,98 8,01 3,13 0,335 0,380 0,337 0,503 0,319 0,335 4,0% 4,4% 3,2% 4,6% 4,0% 10,7% 7,08 8,51 9,85 9,72 4,49 1,21 0,094 0,363 0,207 0,204 0,123 0,060 1,3% 4,3% 2,1% 2,1% 2,7% 5,0% 5,23 7,99 8,30 7,85 1,71 ND 0,258 0,573 0,406 0,503 0,137 4,9% 7,2% 4,9% 6,4% 8,0% 3,39 8,28 6,70 6,01 0,61 ND 0,228 0,325 0,366 0,022 0,075 2,2% 2,8% 4,8% 6,1% 3,5% 8,28 8,37 10,56 10,81 8,04 3,99 0,220 0,368 0,260 0,510 0,220 0,234 2,7% 4,4% 2,5% 4,7% 2,7% 5,9% 6,76 8,44 9,48 9,40 4,66 1,12 0,176 0,229 0,399 0,164 0,045 0,156 2,3% 2,1% 2,4% 4,2% 3,5% 4,0% 6,88 8,45 9,63 9,41 4,88 1,38 0,242 0,309 0,444 0,395 0,309 0,107 3,5% 3,7% 4,6% 4,2% 6,3% 7,8% 8,58 8,35 10,65 10,88 10,28 9,05 0,335 0,510 0,511 0,450 0,876 0,737 3,9% 6,1% 4,8% 4,1% 8,5% 8,1% 8,27 10,38 10,77 10,01 8,89 8,40 0,134 0,202 0,132 0,221 0,274 0,251 1,6% 2,4% 1,3% 2,0% 2,7% 2,8% 8,42 8,65 10,65 11,13 10,23 9,12 0,044 0,462 0,406 0,001 0,100 0,114 1,4% 0,5% 4,3% 3,7% 0,0% 1,1% 8,34 8,11 10,51 10,71 9,93 8,28 0,119 0,460 0,543 0,227 0,451 0,353 1,4% 5,7% 5,2% 2,1% 4,5% 4,3%

68

105 100 95 90

spermin spermidin

85

cadaverin

80

putrescin

75 70

tyramin

65

histamin

procenta

60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Graf 7: Hodnoty BA po aplikaci čiřících přípravků Pouze při použití čiřidel na bentonitové bázi dochází ke snížení BA. Je to dáno tím, že použití bentonitu eliminuje bílkoviny ve víně. U dávky 200 g bentonitu byl pokles u histaminu na 40 %, putrescinu na 63 %, kadaverinu na 56 %, spermidinu na 6 % a sperminu na nulovou koncentraci. Tyramin nebyl prakticky eliminován ani vysokými dávkami bentonitu. I když dávka bentonitu 200 g/hl vína je dost vysoká, u ročníků kde převládá teplé a sušší počasí během vegetace a hlavně v období dozrávání hroznů, je vyšší obsah bílkovin a dávky bentonitu se pohybují i nad 150 g/hl

69

7. Statistické vyhodnocení 7.1. Monitoring BA v moravských vínech

Graf 8. Vyhodnocení jakostních kategorií u jednotlivých podoblastí monitoringu BA putrescin.

Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby 30 25 20

putrescine

15 10 5 0 -5 -10 -15 bzenecká

podluží mutěnická

velkopavlovická strážnická znojemská

oblast

jakostní stupeň jakostní jakostní stupeň kabinetní jakostní stupeň pozdní sběr jakostní stupeň výběr z hroznů

Byly zjištěny průkazné rozdíly mezi oblastmi u pozdních sběrů. Oblast Velkopavlovická se lišila od od všech ostatních sledovaných. Mezi dalšími oblastmi nebyl zjištěn průkazný rozdíl.

70

Graf 9. Vyhodnocení jakostních kategorií u jednotlivých podoblastí monitoringu BA tyramin.

Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby 8 7 6 5

tyramine

4 3 2 1 0 -1 -2 bzenecká

podluží mutěnická

velkopavlovická strážnická znojemská

oblast

jakostní stupeň jakostní jakostní stupeň kabinetní jakostní stupeň pozdní sběr jakostní stupeň výběr z hroznů

Byly zjištěny průkazné rozdíly mezi oblastmi u pozdních sběrů. Oblast podluží se lišila od od všech ostatních sledovaných. Mezi dalšími oblastmi nebyl zjištěn průkazný rozdíl.

71

Graf 10. Vyhodnocení jakostních kategorií u jednotlivých podoblastí monitoringu BA spermidin.

Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby 1,4 1,2 1,0

spermidine

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 bzenecká

podluží mutěnická

velkopavlovická strážnická znojemská

oblast

jakostní stupeň jakostní jakostní stupeň kabinetní jakostní stupeň pozdní sběr jakostní stupeň výběr z hroznů

Byly zjištěny průkazné rozdíly mezi oblastmi u pozdních sběrů. Oblast Mutěnická se lišila od všech ostatních sledovaných. Mezi dalšími oblastmi nebyl zjištěn průkazný rozdíl. U kabinetních byl zištěn průkazný rozdíl mezi Mutěnickou a strážnickou. U jakostních byl zjištěn rozdíl mezi muěnickou a ostatními, a dále mezi velkopavlovickou a znojemskou.

72

Graf 11. Změny BA v průběhu alkoholového kvašení – putrescin

putrescine 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

putrescine

0,3 0,2 0,1 0 22.10

29.10

5.11

12.11

19.11

26.11

3.12

10.12

17.12

K průkaznému nárůstu došlo v termínech 25.10. a 27.10., v dalších termínech byly změny neprůkazné

Graf 12. Změny BA v průběhu alkoholového kvašení – spermidin

spermidine 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1

spermidine

0,8 0,6 0,4 0,2 0 22.10

29.10

5.11

12.11

19.11

26.11

3.12

10.12

17.12

K průkaznému poklesu došlo v termínu 25. 10. poté k průkaznému nárustu 27.10. 30.10., 6.11. v dalších termínech byly změny neprůkazné.

73

Graf 13 až 18. Změny BA při aplikaci čiřících přípravků do vína.

histamin 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

histamin

tyramin 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

tyramin

spermidin 12 10 8 6 4 2 0

spermidin

74

putrescin 14 12 10 8 6 4 2 0

putrescin

cadaverin 14 12 10 8 6 4 2 0

cadaverin

spermin 12 10 8 6 4 2 0

spermin

75

Jak je zřejmé z předchozích grafů pouze při použití čiřidel na bentonitové bázi došlo ke snížení BA. Ke snížení došlo u použití bentonitu, kdy byl pokles u histaminu až na 40 %, putrescinu na 63 %, kadaverinu na 56 %, spermidinu na 6 % a sperminu na nulovou koncentraci. Tyramin nebyl prakticky eliminován ani vysokými dávkami bentonitu.

76

8. Diskuse 8.1. Monitoring BA v moravských vínech Při sledování BA v sklizňovém roce 1999 byly zjištěny variabilní výsledky jednotlivých BA. Byly zjištěny ve všech vzorcích obsahy tyraminu a putrescinu. Ostatních sledovaných BA jsou zjištěny jen v některých vzorcích. Bohužel není známá technologie u sledovaných vzorků, tudíž nelze zcela přesně interpretovat vlivy technologie na obsahy BA. Při analýze měl jen jeden vzorek vyšší výraznou hodnotu v obsahu putrescinu a to č. 42 - SV99

pozdní

sběr oblast velkopavlovická, což bylo zapříčiněno pravděpodobně jablečnomléčným kvašením. V tehdejším období a ani dříve nebyla při výrobě červených vín v takové míře využívána technologie jeblečnomléčného kvašení při snižování obsahu kyselin ve víně a tak ve většině případů jsou hodnoty BA na hygienicky minimálních hodnotách. Jak uvádí celá řada autorů např. Ancín, 2008, a další je právě jablečnomléčné kvašení nejdůležitějším prvkem určující vyšší hodnotu BA.

8.2. Sledování BA v průběhu alkoholového kvašení V průběhu alkoholového kvašení byl nárůst BA u sledovanýchvzorků pouze ve zvýšení obsahu putrescinu a spermidinu. Spermidin poklesl hned na počátku kvašení, pravděpodobně sloužil během počátku kvašení jako zdroj utilizovaného dusíku pro kvasinky v následujícím období byl při aktivitě kvasinkových buněk setrvalý nárust. Taktéž při dokvášení tj. 7 až 10 den po začátku kvašení, byl znatelný pokles putrescinu a spermidinu, kdy v moštu kvasinkám sloužily BA taktéž jako zdroj výživy. Jak uvádí celá řada autorů (Caruso et al. 2002), že všechny druhy kvasinek vyprodukovaly velmi nízké nebo nezjistitelné množství histaminu, zatímco agmatin byl produkován všemi druhy kvasinek v rámci studie. Histamin, putrescin, kadaverin a tryptamin byly produkovány všemi kmeny v nezjistitelném nebo nízkém množství, vždy méně než 4 mg/L. Někteří autoři jako Buteau et al. (1984) popsali zvýšení koncentrace histaminu, tyraminu, putrescinu, agmatinu a kadaverinu během alkoholového kvašení moštů odrůdy Villard Noir. Stejně tak, Bauza et al. (1995) zjistil zvýšení obsahu histaminu, putrescinu, a fenyletylaminu během alkoholového kvašení vína z údolí Rhôny. Oproti tomu, Vidal-Carou et al. (1990) nezjistil tvorbu histaminu během alkoholového kvašení, i když našel tyramin ve velmi nízkých koncentracích. Torrea-Goñi a AncínAzpilicueta, (2002-2001) studovali vliv různých kmenů Saccharomyces cerevisiae na koncentraci biogenních aminů ve vínech Chardonnay a Garnacha. 77

8.3. Vliv na obsah BA při napadení hroznů houbovými chorobami a srovnání BA u botrytických výběrů a nižších kategoriích vína Při sledování hroznů napadených houbovými chorobami a zdravých hroznů se nenašlo výrazné zvýšení obsahu BA, což mohlo být zapříčiněno metabolickými změnami v bobuli. Tohle sledování bylo obtížné, protože ve vzorku byl velmi vysoký obsah cukrů, což značně ztížilo vlastní měření. U vín vyšších jakostních stupňů došlo k nárůstu tyraminu, u kategorií výběru z cibéb odrůd RR a RŠ oproti kategoriím pozdní sběr téže odrůdy. Dá se usoudit, že během napadení hroznů bude obsah BA vyšší, což publikovali (Kiss a Sass-Kiss, 2005).

8.4. Porovnání tvorby biogenních aminů u jablečnomléčného kvašení Při tvorbě biogenních aminů ve třech komerčních vzorcích jablečnomléčných bakterií bylo zjištěno, že nejnižší hodnoty všech jednotlivých BA měl, což je kmen (DSM 7008) Oenococcus oeni - VINIFLORA® OENOS. Ostatní dva BIOSTART® FORTE SK2® a BIOLACT ACCLIMATÉE, byly hodnoty slabě zvýšeny. Byly zjištěny vyšší koncentrace putrescinu u všech tří vzorků, což uvádí i (Tabor, C. W., a Tabor, H, 1985; Coton et al. 1999; Moreno-Arribas et al. 2003; Liu et al., 1996), kteří se zabývali ornitin dekarboxylázou v činnosti bakterií mléčného kvašení, která byla popsána u Lactobacillus 30a, a také vyšší koncentraci putrescinu ve vínech autoři vysvětlují tím, že nevzniká pouze z ornitinu, ale u bakterií mléčného kvašení je schopnost metabolizovat arginin i z jiných aminokyselin jak v moštu, tak ve víně.

8.5. Možnosti snížení BA u aplikace čiřících přípravků Pouze při použití čiřidel na bentonitové bázi došlo ke snížení BA. U dávky 200 g bentonitu byl pokles u histaminu na 40 %, putrescinu na 63 %, kadaverinu na 56 %, spermidinu na 6 % a sperminu na nulovou koncentraci. Tyramin nebyl prakticky eliminován ani vysokými dávkami bentonitu. I když dávka bentonitu 200 g/hl vína je dost vysoká, tak jak uvádí VidalCarou a Mariné-Font (1985), které zjistili, že při snížení histaminu na polovinu, by měly být dávky 1 kg/hl bentonitu. Tato dávka je mnohem vyšší, než jsou obvyklé dávky používané během technologie výroby a to by mohlo ovlivnit hlavně barvu u červeného vína.

78

9. Závěr V práci byly sledovány hodnoty BA při kontaminaci hroznů, během alkoholového a po jablečnomléčném kvašení, změny BA při vyšších kategorií vín, eliminace BA při použití čiřících přípravků a monitoring běžně vyrobených vín na obsah BA. Ze sledovaných hodnot biogenních aminů v této práci vyplynulo, že při monitoringu v ročníku 1999 nebyl nijak výrazně zvýšen jejich obsah ve sledovaných vínech. Jen jeden vzorek vykazoval vyšší hodnotu putrescinu, ale to bylo ve víně, u kterého proběhlo jablečnomléčné kvašení. V současné době se už většina červených vín vyrábí s technologií biologického odbourávání kyselin, tudíž by hodnoty BA byly poněkud vyšší. U sledování hodnot BA během alkoholového kvašení se zjistilo, že byl zvýšen pouze obsah putrescinu a spermidinu. Spermidin poklesl hned na počátku kvašení, kdy pravděpodobně sloužil během počátku kvašení jako zdroj utilizovaného dusíku pro kvasinky a v následujícím období byl při aktivitě kvasinkových buněk setrvalý nárust. Taktéž při dokvášení (tj. 7 až 10 den po začátku kvašení), byl znatelný pokles putrescinu a spermidinu, kdy BA v moštu kvasinkám sloužily BA taktéž jako zdroj výživy. I po skončení alkoholového kvašení byl obsah BA na docela nízké úrovni, kdy se pohybovaly hodnoty do 2 mg/L u jednotlivých BA. Při sledování vlivu napadení hroznů houbovými chorobami na obsah BA a srovnání množství BA u botrytických výběrů a nižších kategoriích vína nebyl výrazný rozdíl mezi zdravými bobulemi hroznu a napadenými bobulemi hroznu. U vín, která byla vyrobena z hroznů napadených Botrytis cinerea, v kategorii výběr z cibéb se zvýšil obsah tyraminu. Nejvíce se zvyšuje obsah BA v průběhu jablečnomléčného kvašení. V tomto případě jde zejména o putrescin, který se zvýšil až na hodnoty desítek mg na litr. Jsou rozdíly mezi jednotlivými kmeny bakterií Oenococcus oeni, nejmenší hodnotu putrescinu, ale i ostatních BA měl kmen (DSM 7008) Oenococcus oeni - VINIFLORA® OENOS. Za zajímavé považuji možnosti eliminace BA ve víně, zejména při výrobě bílých vín s použitím čiřících přípravky na bentonitové bázi, které mají dobrou absorpční schopnost na bílkoviné látky a potažmo i na BA. U dávky 200 g bentonitu byl pokles u histaminu na 40 %, putrescinu na 63 %, kadaverinu na 56 %, spermidinu na 6 % a sperminu na nulovou koncentraci. Tyramin nebyl prakticky eliminován ani vysokými dávkami bentonitu. I když dávka bentonitu 200 g/hl vína je dost vysoká, tak v posledních letech při regulaci sklizně a vyšším teplotám v průběhu zrání a dozrávání hroznů se zvyšuje obsah bílkovin a tím i dávky bentonitu do moštu a vína. Pokud by se uplatnilo použití bentonitu v technologii červených

79

vín, mohlo by to vést ke snížení BA ve víně, v současné době se na trhu objevují bentonitové preparáty, které jsou určeny pro čiření červených vín. Většinou se většině případů potvrdily poznatky odborníků ze zahraničí, které publikovali ve svých článcích a monografiích.

80

10. Doporučení pro praxi a další výzkum Vzhledem k velkému rozvoji vinařství v posledních několika desetiletí a velkému zájmu spotřebitelů o tento kulturní nápoj, stoupá i informovanost veřejnosti o kvalitativní znaky vína. V poslední době se velmi zintenzívnila kontrola všech potrvin a média přináší každý den informace o falšování či zjištění zdravotní závadnosti potravin. Proto musí být snahou výrobců zvést taková opatření, která tyto negativa eliminují. Co se týká biogenních aminů, jsou řazeny mezi alergeny jako oxid siřičitý, který je limitujícím prvkem v hygienických limitech vína. Ktomu aby víno nemělo příliš vysoké koncentrace BA je třeba důsledně dodržovat čistotu a hygienu při výrobě vína. Také při zpracování použít pouze zdravou surovinu. Lze doporučit zachovat hrozen po odtžení ve zdravém stavu, zabránit kontaminaci mikrobiálním znečištěním. Sklízet pouze zdravé hrozny, nekontaminované plísněmi. Pokud nevyrábí vinař kategorie vína, které Botrytis cinerea na hroznech vyžadují, jako jsou botrytické výběry, či cibéby v tokajské oblasti. Při zpracování hroznů je třeba také dbát na dodržení hygienických požadavků na výrobu, čistotu technologického zařízení a zabránění kontaminace mikroby. Na vlastní alkoholové či jablečnomléčné kvašení použít ty kmeny mikroorganismů, které produkují co nejmenší množství BA a zabránit možné kontaminaci jinými druhy kvasinek či bakterií. Bylo by vhodné požívat ve větší míře specielní bentonity při výrobě červeného vína, kde se běžně v praxi nepoužívají. Už v současné době existují bentonity, které splňují podmínky použití při čiření, tak aby se co nejméně snižovala barevnost červených vín. V rámci výzkumných možností by bylo zjaímavé vyprodukovat hlavně jablečno mléčné baterie, které mají co nejmenší produkci BA. Například by bylo možné provést genové manipulace u bakterií, i když se veřejnost obavá pozdějších komplikací při použití těchto metod.

81

11. Seznam tabulek, obrázků a grafů Tabulky Tab. 1: Obsah aminů v evropských a českých pivech…………………………………….. 10 Tab. 2: Biogení aminy, jejich prekursory, transformace a biologický

13

význam…………………… Tab. 3: Významné bakterie produkující biogenní aminy…………………………………. 15 Tab. 4: Biogenní aminy, jejich prekurzory, produkty transformace a biologický význam.. 29 Tab. 5: Obsahy putrescinu, spermidinu a sperminu v některých potravinách…………….

33

Tab. 6: Obsah biogenních aminů u některých vín………………………………………… 41 Tab. 7: Obsah biogenních aminů u některých potravin…………………………………...

41

Tab. 8: Odchylky biogenních aminů v koncentracích (mg/L) ve vínech v závislosti na různém vinifikačním procesu……………………………………………………………...

43

Tab. 9: Srovnání účinku bentonitu a vyziny při snížení biogenních aminů ve víně ……..

45

Tab. 10: Koncentrace biogenních aminù (mg/L) po alkoholovém kvašení v růžovém víně………………………………………………………………………………………...

48

Tab. 11: Druhy mléčných bakterií schopné produkovat biogenní aminy……………….

50

Tab. 12: Odebrané vzorky při alkoholovém kvašení……………………………………..

59

Tab. 13: Označení vzorků pro zjištění vlivu napadení hroznů patogeny…………………

59

Tab. 14: Složení (g) sodnocitrátotvého pufru v 1000 ml…………………………….……

61

Tab. 15: Výsledky BA v moravských vínech……………………………………………..

63

Tab. 16: Hodnoty BA v průběhu alkoholového kvašení………………………………….

68

Tab. 17: Hodnoty BA zdravých a napadených hroznů……………………………………

70

Tab. 18: Hodnoty BA u botrytických výběrů a nižších kategorií vína……………………

72

Tab. 19: Hodnoty BA po prokvašení u tří kmenů JMK bakterií………………………….. 74 Tab. 20: Hodnoty BA po aplikaci čiřících přípravků……………………………………... 75

82

Grafy Graf 1: Změny biogenních aminů během zrání ve francouzských sudech………………

55

Graf 2: Záznam detektoru standartu BA…………………………………………………

62

Graf 3: Obsahy BA v průběhu a těsně po alkoholovém kvašení vína…………………...

69

Graf 4: Hodnoty BA zdravých a napadených hroznů……………………………………

71

Graf 5: Hodnoty BA u botrytických výběrů a nižších kategorií vína……………………

73

Graf 6: Hodnoty BA po prokvašení u tří kmenů JMK bakterií………………………….

74

Graf 7: Hodnoty BA po aplikaci čiřících přípravků……………………………………..

76

Graf 8. Vyhodnocení jakostních kategorií u jednotlivých podoblastí monitoringu BA – putrescin……………………………………………………………………………….

77

Graf 9. Vyhodnocení jakostních kategorií u jednotlivých podoblastí monitoringu BA – tyramin………………………………………………………………………………...

78

Graf 10. Vyhodnocení jakostních kategorií u jednotlivých podoblastí monitoringu BA – spermidin………………………………………………………………………………

79

Graf 11. Změny BA v průběhu alkoholového kvašení – putrescin……………………….

80

Graf 12. Změny BA v průběhu alkoholového kvašení – spermidin……………………...

80

Graf 13 až 18. Změny BA při aplikaci čiřících přípravků do vína………………………

81

Obrázky Obr. 1: Tvorba biogenních aminů………………………...…………………………………...

14

Obr. 2: Bakterie JMK: izolované z vína pod rastrovacím elektronovým mikroskopem...

26

Obr. 3: Syntéza argininu…………………………………………………………………

27

Obr. 4: Schéma kapalinové chromatografie……………………………………………..

36

Obr. 5: Schéma kapalinového chromatografu…………………………………………...

38

83

Seznam zkratek: BA

biogenní aminy

MM

Muškát moravský

PUT

putrescin

MO

Muškát Othonel

KAD kadaverin

MP

Modrý Portugal

SPM spermidin

MT

Müller Thurgau

AGM agmatin

NG

Neuburské

HI

histamin

PA

Palava

TY

tyramin

RB

Rulandské bílé

FEA

fenyletylamin

RM

Rulandské modré

ND

Hodnota byla od detekčním limitem

RR

Ryzlink rýnský

RŠ

Rulandské šedé

měření SD

Směrodatná odchylka

RV

Ryzlink vlašský

CV

Variační koeficient

SG

Sauvignon

Mean Aritmetický průměr

SV

Svatovavřinecké

JMK Jablečnomléčné kvašení

TČ

Tramín červený

AU

Aurelius

VČR Veltlínské červené rané

CS

Cabernet Sauvignon

VZ

Veltlínské zelené

FR

Frankovka

ZW

Zweigeltrebe

84

12. Použitá literatura 1.

(Anonym 1, 2010). Dostupné na

2.

(Anonym 2, 2010). Dostupné na http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html

3.

Abe, K., Ohnishi, F., Yagi, K., Nakajima, T., Higuchi, T., Sano, M., Machida, M., Sarder, R. I., and Maloney, P. C. (2002). Plasmid-encoded as operon confers a proton motive metabolic cycle catalyzed by an aspartate-alanine exchange reaction. J. Bacterid, 184:2906-2913.

4.

Aerny, J. (1985). Origene de l'histamine dans les vins. Connaissances actuales. Bull. O.I.V., 656-657:1016-1019.

5.

Aerny, J. (1990). Presence d'histamine et d'autres amines biogenes dans les vins. Off. Int. Vigne Vin, 656-657:1017-1020.

6.

Amorim, C.G.., Souza, R.C., Araújo, A.N., Montenegro, M.C.B.S.M., Silva, V.L. 2010: SI lab-on-valve analysis oh histamine using potentiometric detection for food quality kontrol. Food Chemistry 122, s. 871-876

7.

Ancín, C., Torrea, D., Fraile, P., and Garde, T. (2004). Amino acids and volatiles compounds in the fermentation of inoculated musts: biogenic amines in the wines. In: Shahidi, F., and Weerasinghe, D. K. Eds. Nutraceutical Beverages.

8.

Ancín-Azpilicueta Carmen; González-Marco Ana; Jiménez -Moreno Nerea Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1549-7852, Volume 48, Issue 3, 2008, Pages 257 – 275

9.

Askar, A. and Treptow, H. (1986) Biogene amine in Lebensmitteln. Vorkommen, Bedeutung und Bestimmung, Eugen Ulmer GmbH and Co, Stuttgart, Germany.

10.

Arena, M. E., and Manca de Nadra, M. C. (2001). Biogenic amine production by Lactobacillus. J. Appl. Microbiol., 90:158–162.

11.

Ayensa Aguirre, M.G. (1993) Estudio de la evolución del proceso de anchoado de sardina (Sardina pilchardus, Walb) Aliment. 248, 71-85.

12.

Baranowski, J.D., Brust, P.A. and Frank, H.A. (1985) Growth of Klebsiella pneumoniae UH-2 and properties of its histidine decarboxylase system in resting cells. J. Food Biochem. 9, 349-360.

13.

Bardócz, S. (1989) Polyamines in tissue regeneration. In: U. Barhrach and Y.M. Heimer (Eds.), Physiology of Polyamines. Vol. 1, C.R.C. Press, Boca Ratón, FL, U.S.A, pp. 96106.

92

14.

Bardócz, S., Grant, G., Brow, D.S., Ralph, A. and Pusztai, A. (1993) Polyamines in food - implications for growth and health. J. Nutr. Biochem. 4, 66-71.

15.

Barwell, C.J. (1994) Pharmacologically-active amines in some marine algae and algal food products. J. Home Consum. Hort. 1, 72-82.

16.

Bauza, T., Blaise, A., Teissedre, P. L., Mestres, J. P., Daumas, F., and Cabanis, J. C. (1995). Evolution des teneurs en amines biogenes des mouts et des vins au cours de la vinification. Sci. Aliments., 15:559-570.

17.

Bertrand, A., Ingargiola, M. C., and Delas, J. (1991). Effects of nitrogen fertilization and grafting on the composition of must and wine from merlot grapes, particularly on the presence of ethyl carbamate. Internat. Symp. Nitrogen in Grapes and Wine, 215220.

18.

Besancon, X., Smet, C, Chabalier, C, Rinemale, M., Reverbel., J.P., Ratomehenina, R. and Galzy, P. (1992) Study of surface yeast flora of Roquefort cheese. Int. J. Food Microbiol. 17, 9-18.

19.

Bouchereau, A., Aziz, A., Larher, F., and Martin-Tanguy, J. (1999). Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Sci, 140:103-125.

20.

Boulton, R. B., Singleton, V. L., Bisson, L. F., and Kunkee, R. E. (1996). The fining and clarification of wines. In: Boulton, R. B., Singleton, V. L., Bisson, L. F., and Kunkee, R. E. Eds. Principles and Practices of Winemaking.NEW York: Chapman & Hall, 279-319.

21.

Bover-Cid, S., and Holzapfel, W. H. (1999). Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol., 53:33-41.

22.

Bover-Cid, S., Izquierdo-Pulido, M., Marine-Font, A., and Vidal-Carou, M. C. (2006). Biogenic mono-, di- and polyamine contents in Spanish wines and influence of a limited irrigation. Food Chem., 96:43-47.

23.

Bravo, F., Burdaspal, P., Suárez, J.A. and Iñigo, B. (1983) Histaminogénesis en vinos. III. Fermentaciones de mosto de uva por asociaciones binarias levadura-bacteria, Aliment. 148, 31-34.

24.

Brink, B. ten, Damink, C, Joosten H.M.L.J. and Huis in't Veld, J.H.J. (1990) Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food Microbiol. 11, 73-84.

25.

Broquedis, M., Dumery, B., and Boucard, J. (1989). Miss en evidence de polyamines (putrescine, cadaverine, nor-spermidine, spermidine et spermine) dans les feuilles et les grappes de Vitis vinifera L. Conn. Vigne Vin, 23:16. 93

26.

Buteau, C, Duitschaever, C.L. and Ashton, G.C. (1984) A study of the biogenesis of amines in a Villard noir wine. Am. J. Enol. Vitic. 35, 228-236.

27.

Buteau, C., Duitschaever, C. L., and Ashton, G. C. (1984). High performance liquid chromatographic detection and quantitation of amines inmust and wine. J. Chromatogr., 284:201-210.

28.

Candela, M., Maccaferri, S., Turroni, S., Carnevali, p., Brigidi, P. 2010: Functional intestinal microbiome, new frontiers in prebiotic design. International Journal of Food Microbiology xxx, s.xxx-xxx

29.

Caruso, M., Fiore, C., Contursi, M., Salzano, G., Paparella, A., and Romano, P. (2002). Formation of biogenic amines as criteria for the selection of wine yeasts. World J. Microbiol. Biotechnol., 18:159-163.

30.

Celano, G.V., Cafarchia, C, Buja, F. and Tiecco, G. (1992) Ricerca di amine biogene in alcuni formaggi. Ind. Aliment. 31, 764-768.

31.

Chen, C.Y., Chen, S.C., Fingas, M., Kao, CM., 2010: Biodegradation of propionitrile by Klebsiella oxytoca immobilized in alginate and cellulose triacetate gel. Journal of Hazardous Materials 177, s. 856-863

32.

Choudhury, N., Hansen, W., Engesser, D., Hammes, H. P., and Holzapfel, W. H. (1990). Formation of histamine and tyramine by lactic acid bacteria in decarboxylase assay medium. Lett. Appl. Microbiol., 11:278-281.

33.

Clifford, M.N., Walker, R., Ijomah, P., Wright, J., Murray, C.K. and Hardy, R. (1991a) Is there a role for amines other than histamine in the aetiology of scombrotoxicosis? Food Addit. Contam. 8, 641-652.

34.

Clifford, M.N., Walker, R., Wright, J., Ijomah, P., Hardy, R., Murray, C.K. and Rainsford, K.D. (1991b) Evidence of histamine being the causative toxin in scombroidfish poisoning. N. Engl. J. Med. 325, 515-516.

35.

Constantini, A., Cersosimo, M., del Prete, V., and García-Moruno, E. (2006). Production of biogenic amines by lactic acid bacteria: screening by PCR, thin-layer chromatography, and High-Performance Liquid Chromatography of strains isolated from wine and must. J. Food Prot., 69:391-396.

36.

Coton, E., Rollan, G. C., and Lonvaud-Funel, A. (1998). Histidine decarboxy-lase of Leuconostoc oenos 9204: purification, kinetic properties, cloning and nucleotide sequence of the hdc gene. J. Appl. Microbiol., 84:143-151.

94

37.

Coton, E., Rollan, G., Bertrand, A., and Lonvaud-Funel, A. (1998). Histamineproducing lactic acid bacteria in wines: early detection, frequency, and distribution. Am. J. Enol. Vitic., 49:199-204.

38.

Coton, E., Torlois, S., Bertrand, A., and Lonvaud-Funel, A. (1999). Biogenic amines and wine lactic acid bacteria. Bull. O.I.V., 72:22-34.

39.

Cwiková, O. 2009: Bakterie podílející se na produkci biogenních aminů ve vybraných fermentovaných potravinách. Dis.P, MZLU v Brně

40.

de Araújo Vergara, Ch., Honorato, C.M, Lopes, T.M., Arraes, G., Sueli, R.2010: Prebiotic effect of fermented cashew apple (Anacardium occidentale L) juice. LWTFood Science and Technology 43, s. 141-145

41.

Delfini, C. (1989). Ability of wine malolactic bacteria to produce histamine. Sci. Aliments, 9:413-116.

42.

Dicks, L. M., Dellaglio, F., and Collins, M. G. (1995). Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 45:395-397.

43.

Drosinos, E.H., Mataragas, M., Xiraphi, N., Moschonas, G., Gaitis, F., Metaxopoulos, J. 2005: Characterization of the microbial flora from a traditional Greek fermented sausage. Meat Science 69, s. 307-317

44.

Dumont, E., De Geeter, H. and Huyghebaert, A. (1992) Presence and formation of biogenic amines in local Belgian beers. Med. Fac. Landbauww. Univ. Gent. 57, 423427.

45.

Eerola, S., Hikkanen, R., Lidfors, E., Hirvit, T. 1993: Liquid Chromatografic Determination of Biogenic Amines in Dry Sausages. Journal of AOAC International Vol. 76, No. 3

46.

Enes-Dapkevicius, M. L. N., Nout, M. J. R., Rombouts, F. M., Houben, J. H., and Wymenga, W. (2000). Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms. Int. J. Food Microbiol., 57:107114.

47.

Fernández, M., Linares, D.M., del Río, B., Ladero, V. and Alvarez, M.A. 2007: HPLC quantification of biogenic amines in cheeses: correlation with PCR-detection of tyramine-producing microorganisms. J. Dairy Res. 74, s. 276282

48.

Franz, Charles, M.A.P., Stiles, Michael, E., Schleifer, Karl, Heinz, Kolzapfel, Wilhelm, H., 2003: Enterococci in foods - a conundrum for food safety. International Journal of Food Microbiology 88, s. 105-122

95

49.

Fugelsang, K. C.; Edwards, Charles G. Wine microbiology: practical applications and procedures. 2. vyd. New York, NY: Springer, 2007. 393 s. ISBN 978-0-387-33341-0.

50.

Gale, E. F. (1946). The bacterial amino acid decarboxylases. Adv. Enzym., 6:132.

51.

Gardini, F., Zaccarelli, A., Belletti, N., Faustini, F., Cavazza, A., Martuscelli, M., Mastracola, D., and Suzzi, G. (2005). Factors influencing biogenic amine production by a strain of Oenococcus oeni in a model system. Food Control, 16:609-616.

52.

Gerbaux, V., and Monamy, C. (2000). Biogenic amines in Burgundy wines. Contents and origin in wines. Rev. Fr. Oenol., 183:25-28.

53.

Gerbaux, V., Villa, A., Monamy, C., and Bertrand, A. (1997). Use of lysozime to inhibit malolactic fermentation and to stabilize wine after malolactic fermentation. Am. J. Enol. Vitic, 48:49-54.

54.

Gloria, M. B. A., Watson, B. T., Simon-Sarkardi, L., and Daeschel, M. A. (1998). A survey of biogenic amines in Oregon Pinot noir and Cabernet sauvignon wines. Am. J. Enol. Vitic., 49:279-282.

55.

Gonzalez-Marco, A., Jimenéz-Moreno, N., and Ancín-Azpilicueta, C. (2006). Influence of addition of yeast autolysate on the formation of amines in wine. J. Sci. Food Agric., 86:2221-2227.

56.

Górner, F., ValÍk, L. 2004: Aplikovaná mikrobiólogia poživatin. MALÉ CENTRUM, Bratislava, 528 s, ISBN: 80967064-9-7

57.

Guerrini, S., Mangani, S., Granchi, L., and Vincenzini, M. (2002). Biogenic amine production by Oenococcus oeni. Curr. Microbiol., 44:374-378. Guitart, A., HernandezOrte, P., and Cacho, J. (1997). Effects of maceration on

58.

Hajos, G., Sass-Kiss, A., Szerdahelyi, E., and Bardocz, S. (2000). Changes in biogenic amine content of Tokaj grapes, wines and Aszii-wines. J. Food Sci, 65:1142-1144.

59.

Halász, A., Baráth, A., Simon-Sarkadi, L. and Holzapfel, W. (1994) Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends Food Sci. Technol. 5, 42-48.

60.

Hanna. P., Glover, V. and Sandler, M. (1988) Tyramine in wine and beer. Lancet 1, 879.

61.

Herbert, P., Cabrita, M. J., Ratola, N., Laureano, O., and Alves, A. (2005). Free amino acids and biogenic amines in wines and musts from the Alen-tejo region. Evolution of amines during alcoholic fermentation and relationship with variety, sub-region and vintage. J. Food Eng., 66:315322.

96

62.

Huang, Yu-Ru, Liu, Kuan-Ju, Hsieh, Hung-Sheng, Hsieh, Cheng-Hong, Hwang, DengFwu, Tsai, Yung-Hsiang 2010: Histamine level and histamine-forming bacteria in dried fisch products sold in Penghu Island of Taiwan. Food Control 21, s. 1234-1239

63.

Huang, Z., and Ough, C. S. (1989). Effect of vineyard locations, varieties and rootstocks on the juice amino acid composition of several cultivars. Am. J. Enol.Vitic., 40:135-139.

64.

Hutkins, Robert W; Microbiology and technology of fermented foods. 1. vyd. Oxford: Blackwell, 2006. 473 s. IFT Press series. ISBN 978-0-813-80018-9

65.

Ibe, H., Saito, K., Nakazuto, M., Kikuchi, Y., Fujinuma, K. and Nishima, T. (1991) Quantitative determination of amines in wine by liquid chromatography. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74, 695-698.

66.

Iñigo, B., and Bravo, F. (1980). Histaminogenesis en vinos. I. Estudio de vinos de diversas regiones espafiolas. Aliment, 117:57-63.

67.

Iñigo, B., Martín, D., Barneto, R., Quintana, M.A., Garrido, M.P., Burdaspal, P. and Bravo, F. (1986) Histaminogénesis en quesos. I. Cambios en la microflora y en el contenido en histamina durante la maduración. Aliment. 177, 33, 35-38.

68.

Jiménez-Moreno, N., Torrea-Goni, D., and Ancín-Azpilicueta, C. (2003). Changes in amine concentrations during aging of red wine in oak barrels. J. Agric. Food Chem., 51:5732-5737.

69.

Jones, S.M., Dang, Tammy, T., Martinuzzi, R. 2009: Use of quorum sensing antagonists to deter the formation of crystalline Proteus mirabilis biofilms. International Journal of Antimicrobial Agens 34, s. 360-364

70.

Kasimoglu-Dogru, Aylin, Gencay, Y., Emre, Ayaz, N., Deniz, 2010: Prevalence and antibiotik resistence profile sof Enterococcus species in chicken at slaughter in chicken at slaughter level; absence of vanA and vanB genes in E. faecalic and E. faecium. Research in Veterinary Science xxx

71.

Kiss, J., and Sass-Kiss, A. (2005). Protection of originality of Tokaji Aszu amines and organic acids in botrytized wines by high-performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem, 53:10042-10050.

72.

Klouda, P., 2003: Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 132 s., ISBN 80-86369-07-2

73.

Komprda, T., Neznalová, J., Standara, S., Bover-Cid, S. 2001: Effect of starter culture and storage temperature on the content of biogenic amines in dry fermented sausage poličan. Meat Science, 59, s. 267-276.

97

74.

Konnings, W. N., Lolkema, J. S., Bolhuis, H., van Veen, H. W., Poolman, B., and Driessen, A. J. M. (1997). The role of transport processes in survival of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 71:117-128.

75.

Krieger, S.A., W.P. Hammes, and T. Henick-Kling. 1993. How to use malolactic starter cultures in the winery. Wine Ind. J. (May): 153–160.

76.

Křížek, K., Kalač, P. 1998: Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě, přehled. Czech Journal of Food Science 16, 4, s. 151-159.

77.

Kruger, L., Pickerell, A. T. W., and Axcell, B. (1992). The sensitivity of different brewing yeast strain to carbon dioxide inhibition: Fermentation and production of flavour-active volatile compounds. J. Inst. Brew, 98:133-138.

78.

Landete, J. M., Ferrer, S., and Pardo, I. (2005a). Which lactic acid bacteria are responsible for histamine production in wine? J. Appl. Microbiol., 99:580-586.

79.

Landete, J. M., Ferrer, S., Polo, L., and Pardo, I. (2005b). Biogenic amines in wines from three Spanish regions. J. Agric. Food Chem., 53:1119-1124.

80.

Lavanchy, P. and Sieber, R. (1993) Proteolysis in different hard and semihard cheeses. II. Amines. Schweiz Milchwirtsch. Forsch. 22, 65-68.

81.

Lehtonen,P. (1996). Determination of amines and amino acids in wine. A review. Am. J. Enol. Vitic, 47:127-133.

82.

Lehtonen,P.,Saarinen,M., Vesanto, M.,and Riekkola,M. L. (1992). Determination of wine amines by HPLC using automated precolumn derivatisation with o-phtahaldehyde and fluorescence detection. Z. Lebensm. Unters. Forsch, 194:434-437.

83.

Leuschner, R. G., Heidel, M., and Hammes, W. P. (1998). Histamine and tyramine degradation by food fermenting microorganisms. Int. J. Food Microbiol, 39:1-10.

84.

Leuschner, R.G.K., Hammes, W.P. 1998: Tyramine Degradation by Micrococci During Ripening of Fermented Sausage. Meat Science, Vol. 49, No. 3, s. 289-296.

85.

Littlewood, J.T., Gibbs, C, Glover, V., Sandler, M„ Davies, P.T.G. and Rose, F. (1988) Red wine as a cause of migraine. Lancet 1, 558-559.

86.

Liu, CH., Lu, J., Lu, L., Liu, Y., Wang, F., Xiao, M. 2010: Isolation, structural characterization and immunological aktivity of an exopolysaccharide produced by Bacillus licheniformis 8-37-0-1. Bioresource Technology 101, s. 5528-5533

87.

Liu, S. Q., Pritchard, G. G., Hardman, M. J., and Pilone, G. J. (1996). Arginine catabolism in wine lactic acid bacteria: is it via the arginine deiminase pathway or the arginase-urease pathway? J. Appl. Bacteriol., 81:486-492.

98

88.

Lonvaud-Funel, A. (2001). Biogenic amines in wines: role of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Lett, 199:9-13.

89.

Lonvaud-Funel, A., and Joyeux, A. (1994). Histamine production by wine lactic acid bacteria. Isolation of ahistamine-producing strain of Leuconostocoenos. J. Appl. Bacteriol., 77:401-407.

90.

Lonvaud-Funel, A., Joyeux, A., and Ledoux, O. (1991). Specific enumeration of lactic acid bacteria in fermenting grape must and wine by colony hybridization with nonisotopic DNA probes. J. Appl. Bacteriol., 71:501-508.

91.

Lucas, P., and Lonvaud-Funel, A. (2002). Purification and partial gene sequence of the tyrosine decarboxylase of Lactobacillus brevis IOEB 9809. FEMS Microbiol. Lett, 211:85-89.

92.

Lucas, P., Landete, J., Coton, M., Coton, E., and Lonvaud-Funel, A. (2003). The tyrosine decarboxylase operon of Lactobacillus brevis IOEB 9809: characterization and conservation in tyramine-producing bacteria. FEMS Microbiol Lett , 229:65-71.

93.

Mah, J.H., Hwang, H.J., 2009: Inhibition of biogenic amine formation in a salted and fermented anchovy by Staphylococcus xylosus as a protective culture. Food Control 20, s. 796-801

94.

Malakar, P.K., Barker, G.C., Peck, M.W. 2010: Quantitative risk assessment for hazards that arise from non-proteolytic Clostridium botulinum in minimally processed chilled dairy-based foods. Food Microbiology, s. 1-10.

95.

Mangani, S., Guerrini, S., Granchi, L., and Vincenzini, M. (2005). Putrescine accumulation in wine: role of Oenococcus oeni. Curr. Microbiol., 51:6-10.

96.

Marcobal, A., de las Rivas, B., Moreno-Arribas, M. V., and Muñoz, R. (2004). Identification of the ornithine decarboxylase gene in the putrescine-producer Oenococcus oeni BIFI-83. FEMS Microbiol. Lett, 239:213-220.

97.

Marcobal, A., Martin-Alvarez, P. J., Polo, M. C., Muñoz, R., and Moreno-Arribas, M. V. (2006). Formation ofbiogenic amines throughoutthe industrial manufacture of red wine. J. Food Prot., 69:397-404.

98.

Marcobal, Ángela, de las Ri vas, Blanca, García-Moruno, Emilia and Muñoz, Rosario, 2004: The tyrosine decarboxylation test does not differentiate Enterococcus faecalis from Enterococcus faecium. System. Appl. Microbiol. 27

99.

Marcora, M. S., Cejas, S., Gonzales, N.S., Carrillo, C., Algranati, I.D. 2010: Polyamine biosynthesis in Phytomonas: Biochemical characterisation of a very unstable ornithine decarboxylase. International Journal for Parasitology xxx 99

100. Martín- Álvarez, P. J., Marcobal, A., Polo. C., and Moreno-Arribas, M. V. (2006). Influence of technological practices on biogenic amine contents in red wines. Eur. Food Res. Technol, 222:420-424. 101. Martín-Platero, A.m., Valdiva, E.M.M., Martínez-Bueno, M. 2009: Charakterization and safety evaluation of enterococcii solated from Spanish goats'milk cheeses. International Journal of FoodMikrobiology 132, s. 24-32 102. Maxa, E. and Brandes, W. (1993) Biogene Amine in Fruchtsäften. Mitt. Klosterneuburg 43, 101-106. 103. Merk, K., Borelli, C., Korting, h.ch. 2005: Lactobacilli - bacteria - host interactions with special regard to the urogenital tract. international journal of Medical Microbiology 295, s. 9-18 104. Mizutani, T., Kimizuka, A„ Ruddle, K. and Ishige, N. (1992) Chemical components of fermented fish products. J. Food Comps. Anal. 5, 152-159. 105. Molenaar, D., Bosscher, J. S., ten Brink, B., Driessen, A. J. M., and Konings, W. N. (1993). Generation of a proton motive force by histidine decarboxylation and electrogenic histidine/histamine antiport in Lactobacillus buchneri. J. Bacteriol., 175:2864-2870. 106. Monteiro, F., and Bisson, L. F. (1991). Amino acid utilization and urea formation during vinification fermentations. Am. J. Enol. Vitic, 42:199-208. 107. Moreno, M.R., Foulquié, Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vuyst, L. 2006: The role and application enterococci in food and health. International Journal o Food Microbiology 106, s. 1-24 108. Moreno-Arribas, M. V.,Polo, M. C., Jorganes, F., and Munoz,R. (2003). Screening of biogenic amine production by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine. Int. J. Food Microbiol., 84:117-123. 109. Moreno-Arribas, V., and Lonvaud-Funel, A. (2001). Purification and characterization of tyrosine decarboxylase of Lactobacillus brevis IOEB 9809 isolated from wine. FEMS Microbiol. Lett, 195:103-107. 110. Moreno-Arribas, V., Torlois, S., Joyeux, A., Bertrand, A., and Lonvaud-Funel, A. (2000). Isolation, properties and behaviour of tyramine-producing lactic acid bacteria from wine. J Appl Microbiol , 88:584-593. 111. Moret, S., Bortolomeazzi, R. and Lercker, G. (1992b) Improvement of extraction procedure for biogenic amines in foods and their high-performance liquid chromatographic determination. J. Chromat. 591, 175-180. 100

112. Moret, S., Bortolomeazzi, R., Feruglio, M. and Lercker, G. (1992a) Determination of biogenic amines in Italian Cheeses. Sei. Teen. Latt. Casearia 43, 187-198. 113. Morris-Downes, M., Smyth, E. G., Moore, J., Thomas, T., Fitzpatrik, F., Walsh, J., Caffrey, V., Morris, A., Foley, S., Humphereys, H., 2010: Surveillance and endemic vancomycin-resistant enterococci: some success in control is possible. Journal of Hospital Infection, 1-6 114. Németh-Szerdahelyi, E„ Freudenreich, P. and Fischer, K. (1993) Studies on biogenic amine contents in pork. Fleischwirtsch. 73, 189-190. 115. Nieto-Lozano, J.C., Reguera-Useros, J. I., Peláez-Martínez, M. del C., Sacristán-PérezMina, G., Gutiérrez-Fernández, Á., J., Hardisson de la Torre, A. 2010: The effect of the pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens in Spanish dry-fermented sausages and frankfurters. Food Control 21, s. 679-685 116. Nout, M.J.R., Ruikes, M.M.W., Bouwmeester, H.M. and Beljaars, P.R. (1993) Effect of processing conditions on the formation of biogenic amines and ethyl carbamate in soybean Tempeh. J. Food Safety 13, 293-303. 117. Önal, A. 2007: A review: Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods. Food Chemistry 103, s.1475-1486 118. Ough, C. S. (1971). Measurement of histamine in California wines. J. Agric. Food Chem, 19:241-244. 119. Ough, C. S., and Crowell, E. A. (1980). Nitrate determinationin Californiamusts and wines. Am J Enol Vitic , 31:344:346. 120. Ough, C. S., and Daudt, C. E. (1981). Quantitative determination of volatile amines in grapes and wines. I. Effect offermentation and storage temperature on amine concentrations. Am J Enol Vitic , 32:185-188. 121. Ough, C. S., Crowell, E. A., Kunkee, R. E., Vilas, M. R., and Lagier, S. (1987). A study of histamine production by various wine bacteria in model solutions and in wine. J. Food Proc. Pres., 12:63-70. 122. Ough, C. S., Daudt, C. E., and Crowell, E. A. (1981). Identification of new volatile amines in grapes and wines. J. Agric. Food Chem., 29:938-941. 123. Park, J., S., Lee, CH.H.E., Kwon, E.Y., Lee, H.J., Kim, J.Y., Kim, S.H. 2010: Monitoring the contents of biogenic amines in fish and fish products consumed in Korea. Food Control 21, s. 1219-1226

101

124. Peñas, E., Frías, J., Sidro, B., Vidal-Valverde, C. 2010: Impact of fermentation conditions and refrigerated storage on microbial quality and biogenic amine kontent of sauerkraut. Food Chemistry 125. Pensione, E., Mazzoli, R., Giuffrida, M., Gabriela, L.K., García-Moruno, E., Barello, C., Conti, A., and Guinea, C. 2005: A proteomic approach to studying biogenic amine producting lactic acid bakteria. Proteomics 5, s. 687 - 698 126. Pfundstein, B., Tricker. A.R., Theobald, E., Spiegelharder. B. and Preussmann. R. (1991) Mean daily intake of primary and secondary amines from foods and beverages in West Germany in 1989-1990. Fd. Chem. Toxic. 29, 733-739. 127. Pintado, Ana, I.e., Pinho, Olívia , Ferreira, Isabel, M.P.L.V.O., Pintado, M. Manuela, E., Gomes, Ana , M.P., Malcata, F.X. 2008: Microbial, biochemical and biogenic amine profile of Terrincho cheese manufactured in several dairy farms. International Dairy Journal 18, s. 631 - 640 128. Pogorzelski. E. (1992) Studies on the formation of histamine in must and wines from elderberry fruit. J. Sci. Agrie. 60, 239-244. 129. Radler, F., and Fath, K. P. (1991). Histamine and others amines in wines. In: Rantz, J. Ed. Proceedings of the international symposium on nitrogen in grapes and wine. Davis, CA: American Society for Enology and Viticulture, 185-195. 130. Raimond,G., W., M. 2010: A probiotics trial on trial: the problem of timely detection of adverse advents in therapeutic trials. Journal of Clinical Epidemiology 63, s. 347-349 131. Raphael, Brian, H., Joseph, Lavin, a., McCroskey, Loretta, M., Lúquez, Carolina, Maslanka, Susan, E. 2010: Detection and differentiation of Clostridium botulinum type A strains using a focused DNA microarray. Molecular and Cellular Probes 24, s. 146153 132. Raymond, B., Johnston, P.R., Nielsen-LeRoux, Ch., Lereclus, D. and Crickmore, N. 2010: Bacillus thuringiensis: an impotent pathogen? Trends in Microbiology 5, s. 189194 133. Ribéreau-Gayon, P., Traduction, Aquitrad et al. Handbook of enology : The chemistry of wine stabilization and treatments. Volume 2. 2. vyd. Chichester: John Wiley & Sons, 2005. 441 s. ISBN 0-470-01037-1 134. Rollan, G. C., Coton, E., and Lonvaud-Funel, A. (1995). Histidine decarboxylase activity of Leuconostos oenos 9204. Food Microbiol., 12:455-461. 135. Romain, N., Dandrifosse, G., Jensette, F. and Forget. P. (1992) Polyamine concentration in rat milk and food, human milk, and infant formulas. Pediatric Res. 32, 58-63. 102

136. Saccani, G., Tanzi, E., Pastore, P., Cavalli, S., Rey, M. 2005: Determination of biogenic amines in fresh and processed meat by suppressed ion chromatography-mass spectrometry using a cation-exchange column. Journal of Chromatography A, 1082, s. 43-50 137. Santos. C, Jalón, M. and Mariné, A. (1985) Contenido de tiramina en alimentos de origen animal. I. carne. derivados cárnicos y productos relacionados. Rev. Agroquim. Tecnol. Aliment. 25, 362-368. 138. Santos. C, Mariné, A. and Rivas, J.C. (1986) Changes of tyramine during storage and spoilage of anchovies. J. Food Sci. 51, 512-513, 515. 139. Sass-Kiss, A., Szerdahelyi, E., and Hajos, G. (2000). Study of biologically active amines in grapes and wines by HPLC. Chromatrogr. Suppl. , 51: 316-320. 140. Schelp, E., Worley, S., Monzingo, A. F., Ernst, S., and Robertus, J. D. (2001). pHinduced structural changes regulate histidine decarboxylase activity in Lactobacillus 30a. J. Mol. Biol, 306: 727-732. 141. Schiller, D., Kruse, D., Kneifel, H., Kramer, R., and Burkovski, A. (2000). Polyamine transport and role of potE in response to osmotic stress in Escherichia coli. J. Bacteriol., 182:6247-6249. 142. Selickman, J., Paxos, M., File Jr., T.M., Seltzer, R., Bonilla, H. 2010: Performance measure of urinary antigen in patients with Streptococcus pneumoniae bacteremia. Diagnostic Microbiologx and Infectious Disease 67, s. 129-133 143. Shalaby, A. R. (1996). Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Res. Int., 29:675-690. 144. Šilhánková, L. 2008: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha, 363 s., ISBN 978-80-2001703-1 španová, A., Rittich, B., Kšicová, K., Dráb, V. 2009: Identifikace bakterií mléčného kvašení (významných v mlékárenském průmyslu) pomocí polymerasové řetězové reakce. Mlékařské listy116, s. 12-16. 145. Silla-Santos, M. H. (1996). Biogenic amines: their importance in foods. Int. J. Food Microbiol., 29:213-231. 146. Sims. G.G., Farn, G. and York, R.K. (1992) Quality indices for canned Skipjack tuna: correlation of sensory attributes with chemical indices. J. Food Sci. 57, 1112-1115. 147. Slaughter, J. C., Flint, P. W. N., and Kular, K. S. (1987). The effect of CO2 on the absorption of amino acids from malt extract medium by Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Lett. 40:239-243.

103

148. Soufleros, E., Barrios, M. L., and Bertrand, A. (1996). Correlations entre les amines biogenes et d'autres constituants du vin adaptation d'une methode HPLC au dosage des acides amines. Oenologie 95: 5e Symposium International d'Oenologie/ coord par Aline Lonvaud-Funel. 665669. 149. Soufleros, E., Barrios, M. L., and Bertrand, A. (1998). Correlation between the content of biogenic amines and other wine compounds. Am. J. Enol. Vitic., 49:266-278. 150. Stratton, J.E., Hutkins, R.V. & Taylor, S.L. 1991: Biogenic amines in cheese and other fermented foods. A review. Journal of Food Protection 54, s. 460-470. 151. Sturgill, G., and Rather, P. N. (2004). Evidence that putrescine acts as an extracellular signal required for swarming in Proteus mirabilis. Mol. Microbiol., 51:437-446. 152. Sumner, S.S., Speckhard, H.W., Somers, E.B. and Taylor, S.L. (1985) Isolation of histamine-producing Lactobacillus buchneri from Swiss cheese implicated in a food poisoning outbreak. Appl. Environ. Microbiol. 50, 1094-1096. 153. Tabor, C. W., and Tabor, H. (1985). Polyamines in microorganisms. Microbiol. Rev., 49:81–99. 154. Taylor, S.L., Leatherwood, M. and Lieber, E.R. (1978) Histamine in sauerkraut. J. Food Sci. 43, 1030-1032. 155. ten Brink, B., Damink, C., Joosten, H. M. L. J., and Huis in 't Veld, J. H. J. (1990). Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int J. Food. Microbiol, 11:73-84. 156. Teodorovic, V., Buncic, S. and Smiljanic, D. (1994) A study of factors influencing histamine production in meat. Fleischwirtsch. 74, 170-172. 157. Til, H.P., Falke, H.E., Prinsen, M.K. & Willems, M.I. 1997: Acute and subacute toxicity of tyramine, spermidine, putrescine and cadaverine in rats. Food and Chemical Toxicology 35, s. 337-348. 158. Tkachenko, A., Nesterova, L., and Pshenichnov, M. (2001). The role of the natural polyamine putrescine in defense against oxidative stress in Escherichia coli. Arch. Microbiol, 176:155-157. 159. Topcu, A., Bulat, T., Wishah, R., Boyac, I. 2010: Detoxification of aflatoxin Bj and patulin by Enterococcus faecium strains. International Journal of Food Microbiology 139, s. 202-205 160. Torrea, D., and Ancín C. (2002). Content of biogenic amines in a Chardonnay wine obtained through spontaneous and inoculated fermentations. J Agric Food Chem , 50:4895-4899. 104

161. Torrea-Goñi, D., and Ancín-Azpilicueta, C. (2001). Influence of yeast strain on biogenic amines content in wines: relationship with the utilization of amino acids during fermentation. Am J Enol Vitic., 52:185190. 162. Tsai, Y.H., Kung, H.F., Chen, H.CH., Chang, S.CH., Hsu, H.H., Wei, CHI. 2007: Determination of histamine and histamine-forming bacteria in dried milkfish (Chanos chanos) implicated in a food-borne poisoning. Food Chemistry 105, s. 1289-1296 163. van de Guchte, M., Serror, P., Chervaux, C., Smokvina, T., Ehrlich, S. D., and Maguin, E. (2002). Stress responses in lactic acid bacteria. Antonie van Leewenhoek, 82:187-216. 164. Veciana, M.T., Vidal, M.C. and Mariné, A. (1989) Histamine and tyramine during storage and spoilage of anchovies Engraulis encrasicholus: relationships with other fish spoilage indicators. J. Food Sci. 55, 1192-1195. 165. Velíšek, J. Chemie potravin 3. 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 343 s. ISBN 80-86659-038. 166. Veverka, J., Buňka, F., Hajdučík, J., Kačmar, M. Content and elimination of biogenic amines in wine. In HORNA, A. Vitamins, Nutrition, Diagnostic 2009, The Abstract Book. 1. vyd. Pardubice: Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 2009, s. 94. ISBN 978-807318-809-2. 167. Vidal, M.C, Izquierdo, M.L., Martín, M.C. and Mariné, A. (1990) Histamine and tyramine in meat products: relationship with meat spoilage. Food Chem. 37. 239-249. 168. Vidal-Carou, M. C., Ambatle-Espunyes, A., Ulla-Ulla, M. C., and Marine-Font, A. (1990). Histamine and tyramine in Spanish wines: their formation during the winemaking process. Am. J. Enol. Vitic, 41:160-167. 169. Vidal-Carou, M. C., and Marine-Font, A. (1985). Histamina en vinos. Rev.Agro-quim. Tecnol. Aliment, 25:58-78. 170. Vidal-Carou, M. C., Codony-Salcedo, R., and Marine-Font, A. (1990). Histamine and tyramine in Spanish wines relationships with total sulfur dioxide level, volatile acidity and malolactic fermentation intensity. Food Chem., 35:217-227. 171. Vidal-Carou, M. C., Codony-Salcedo, R., and Marine-Font, A. (1991). Changes in the concentration of histamine and tyramine during wine spoilage at various temperatures. Am. J. Enol. Vitic., 42:145-149. 172. Vidal-Carou, M. C.; Izquierdo-Pulido, M. L. and Mariné-Font, A. (1990), Histamine and tyramine in ish wines: their formation during the wine making process. Am. J. Enol. Vitic., 41, 160-167.

105

173. Vidaud, Z.E., Chaviano, J., Gonzáles, E. and García Roché, M.O. (1987) Tyramine content of some Cuban cheeses. Die Nahrung 31, 221-224. 174. Vivas, J., Padilla, D., Real, F., Bravo, J., Grasso, V., Acosta, F. 2008: Influence of environmental conditions on biofilm formation by Hafnia alvei strains. Veterinary Microbiology 129, s. 150-155 175. Voigt, M.N. and Eitenmiller, R.R. (1978) Role of histidine and tyrosine decarboxylases and mono and diamine oxidases in amine build-up in cheese. J. Food Prot. 41, 182-186. 176. Votava, M. a kolektiv 2006: Lékařská mikrobiologie speciální, 495 s, NEPTUN, Březová 18, 637 00 Brno, ISBN 80-902896-6-5 177. Vyhláška č. 264/ 2003 Sb., kterou se mění vyhláška č. 326/2001., kterou se provádí § 18 písm. a), d), g), h), i), a j) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů, pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich. 178. Vyhláška č. 326/2001 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), g), h), i) a j) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich. změna vyhláškou 264/2003 Sb. a zákonem 169/2009 Sb. 179. Vyhláška č. 331/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), h), i), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro koření, jednou sůl, dehydratované výrobky a ochucovadla a hořčici. Změna vyhláškou 419/2000 Sb. 180. Vyhláška Ministerstva Zemědělství č. 331/97 Sb., kterou se provádí 18 písm. A), d), h), i), j), a k), zákona č. 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně některých souvisejících zákonů pro koření, jedlou sůl, dehydratované výrobky a ochucovadla a hořčici. 181. Wheatley. A.M. and Tinton, K.F. (1987) Determination of tyramine in alcoholic and nonalcoholic beers by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Food Biochem. 1 1, 133-142. 182. Wichienchot, S., Jatupornpipat, M., Rastall, R.A. 2010: Oligosaccharides of pitaya (dragon fruit) flesh and their prebiotic propriets. Food Chemistry 120, s. 850-857 183. Wilson, I. G., McAffe, G. G. 2002: Vancomycin-resistant enterococci in shellfish, unchlorinated waters, and chicken. International Journal of Food Microbiology 79, s. 143-151 106

184. Yankah, V.V., Ohshima, T. and Koizumi, C. (1993) Effects of processing and storage on some chemical characteristics and lipid composition of a Ghanaian fermented fish product. J. Sci. Food Agric. 63, 227-235. 185. Yanshun, Xu., Wenshui, Xia., Fang, Yang., Jin, Moon, Kim., Xiaohua, Nie 2010: Effect of fermentation temperature on the microbial and physicochemical properties of silver carp sausages inoculated with Pediococcus pentosaceus. Food Chemistry 118, s. 512518 186. Zee, J. A., Simard, R. E., Heureux, L. L., and Tremblay, J. (1983). Biogenic amines in wines. Am. J. Enol. Vitic., 34:6-9.

107