Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výţivy rostlin
Mikroflóra kontaminující vybrané zeleninové a ovocné nápoje Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.
Bc. Eva Dojčarová, DiS.
Brno 2012
Zde bude vloţeno zadání
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma „Mikroflóra kontaminující vybrané zeleninové a ovocné nápoje“ vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU v Brně. dne ………………………………………………….. podpis autora …………............................................
PODĚKOVÁNÍ
Tímto způsobem bych chtěla poděkovat Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení při zpracování této diplomové práci, za cenné připomínky a rady. V neposlední řadě pak za ochotu ke konzultacím a trpělivost po celou dobu.
V Brně dne ………………………
…………............................... (podpis autora)
Abstrakt Dojčarová E. Mikroflóra kontaminující vybrané zeleninové a ovocné nápoje. Diplomová práce. Brno 2012 Předmětem diplomové práce je mikroflóra kontaminující ovocné a zeleninové nápoje. Teoretická část práce popisuje technologie výroby ovocných a zeleninových nápojů a nejčastější způsoby konzervace. Další část práce je tvořena charakteristikou zdrojů mikrobiální kontaminace (bakterie, kvasinky, patogenní plísně a mykotoxiny). V experimentální
části
se
tato
práce
zabývá
stanovením
různých
skupin
mikroorganismů ve třech skupinách ovocných a zeleninových šťáv dle způsobu ošetření a dle příchutě. V závěru bylo zjištěno, ţe všechny zkoumané šťávy byly z mikrobiálního hlediska zdravotně nezávadné.
Klíčová slova mikroorganismy, mikrobiální kontaminace, plísně, kvasinky, mykotoxiny, celkový počet mikroorganismů
Abstract Dojčarová E. Contaminating microflora selected vegetable and fruit drinks. Diploma thesis. Brno 2012 The subject of this thesis is microflora which contaminates fruit and vegetable drinks. The theoretical part describes the production technology of fruit and vegetable drinks and the most common methods of preservation. The following section is made up of characteristic sources of microbial contamination (bacteria, yeasts, pathogenic fungi and mycotoxins). This work deals with determination of different groups of microorganisms in three groups of fruit and vegetable juice as a method of treatment and according flavors in the experimental part. Conclusion informs it was found that all analyzed juices are healthy in terms of microbial.
Keywords microorganisms, microbial contamination, fungi, yeasts, mycotoxins, total bacterial count
OBSAH 1 ÚVOD………………………………………………………………………………....8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED ……………………………………………………………..9 2.1 Ovocné a zeleninové nápoje a jejich nutriční význam …………………………..9 2.2 Základní suroviny 100% ovocných a zeleninových nápojů a poţadavky na ně ….………………………………………………………………………………….... 10 2.3 Technologie výroby ovocných a zeleninových nápojů.………….......................12 2.3.1 Získávání šťáv lisováním ……………………………………………….…12 2.3.2 Získávání šťáv vyluhováním – macerací ……………………………….....15 2.3.3 Získávání šťáv rekonstitucí šťávních koncentrátů ……………………….. 16 2.3.4 Nové technologie ……………………………………………………….....18 2.4 Konzervace ovocných a zeleninových nápojů …………………………...........19 2.4.1 Vylučování mikroorganismů z prostředí…………………………………..20 2.4.2 Přímá inaktivace mikroorganismů (abióza) …………………………….....20 2.4.2.1 Ošetření šťáva za pouţití vysokého hydrostatického tlaku paskalizací………………………………………………………………………...........23 2.4.3 Nepřímá inaktivace mikroorganismů (anabióza) ………………………….25 2.5 Moţné zdroje mikrobiální kontaminace
…………………………........…..26
2.5.1 Kaţení ....…………………………………………………………………..29 2.5.2 Koliformní bakterie …………………………………………………….....30 2.5.3 Bakterie octového kvašení ………………………………………………...31 2.5.4 Bakterie mléčného kvašení …………………………………………….….32 2.5.5 Plísně ………………………………………………………………………32 2.5.6 Kvasinky ……………………………………………………………..........35 2.6 Mykotoxiny ……………………………………………………………………36 2.6.1 Aflatoxiny …………………………………………………………………37 2.6.2 Patulin ……………………………………………………………………..39 2.6.3 Další mykotoxiny v ovocných a zeleninových nápojích ………………….41 2.7 Faktory ovlivňující výskyt a rozvoj mikroorganismů …………………………43 2.7.1 Vnitřní faktory ………………………………………………………….…43 2.7.2 Vnější faktory ……………………………………………………………..46 3 CÍL PRÁCE ………………………………………………………………………...48
4 MATERIÁL A METODIKA ……………………………………………………….49 4.1 Charakteristika výrobku …………………………………………………….....49 4.2 Příprava laboratorních pomůcek ………………………………………………51 4.3 Zpracování vzorku ……………………………………………………….........52 4.4 Stanovení mikroorganismů …………………………………………………....52 4.5 Sloţení a příprava pouţitých ţivných půd ………………………………….....53 4.6 Vyjádření výsledků …………………………………………………………....53 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE ………………………………………………..54 6 ZÁVĚR ……………………………………………………………………………..59 7 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ……………………………………………...60 8 SEZNAM SCHÉMAT A TABULEK ……………………………………………...69
1 ÚVOD V dnešní době se stále více prosazuje ve zdravé výţivě čerstvá zelenina a ovoce, a to alespoň 5 x denně dle doporučení světové zdravotnické organizace. Ovoce a zelenina jsou zdrojem vitaminů, minerálních látek a vlákniny. Konzumují se zejména v syrovém stavu, ale některé jsou, pro lepší vyuţitelnost ţivin, konzumovány po tepelné úpravě. Současným trendem je pít ovocné a zeleninové nápoje v podobě dţusů, nektarů a různých šťáv, ideálně 100%, bez přídavku cukru, bez konzervantů a umělých barviv, eventuálně fortifikované vitaminy a minerálními látkami. Neméně důleţité je zachovat nutriční a senzorickou hodnotu díky šetrným způsobům konzervace s cílem zabránění neţádoucím mikrobiálním změnám. Nejpouţívanějším způsobem konzervace je šetrná pasterace spolu s aseptickým plněním a balením. Díky vysokému podílu vody jsou ovocné a zeleninové nápoje vhodným prostředím pro výskyt a rozmnoţování mikroorganismů i pro jejich činnost. Mikroorganismy se do nápojů mohou dostat dvojím způsobem. Primárně mohou kontaminovat ovoce a zeleninu jako surovinu pro výrobu nápojů. Většinou jde o běţnou mikroflóru ovoce a zeleniny. Nejnáchylnější na kontaminaci mikroorganismy je kořenová zelenina, kterou kontaminují půdní mikroorganismy. Sekundárně pak můţe dojít ke kontaminaci během výroby, balení, distribuce, přepravy nebo skladování. Činnost mikroorganismů v nápojích
vede
k negativním
změnám,
zejména
senzorickým,
které
vedou
k nepoţivatelnosti. Do senzorických změn se řadí změny barvy, vůně, chuti konzistence. Tyto změny mohou vést k nutričním změnám nápojů. Senzorické změny ale nepředstavují zdravotní riziko. Vedle senzorických změn jsou závaţnější z hlediska zdravotní nezávadnosti změny mikrobiální, kdy dojde k přemnoţení mikroorganismů, které vedou k alimentárním nákazám, nebo jejich činnosti vznikají toxické metabolity. Tyto toxické metabolity mohou být příčinou akutních otrav, které mohou vést aţ ke smrti, nebo se kumulují v lidském organismu a vyvolávají poté chronické otravy nebo mají karcinogenní účinky.
8
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED Ovocné a zeleninové nápoje a jejich nutriční význam
2.1
Ovocné a zeleninové nápoje patří do skupiny nealkoholických nápojů, jejichţ definice jsou uvedeny ve Vyhlášce č. 335/1997 Sb. ve znění Vyhlášky č. 289/2004 Sb. Mezi nealkoholické nápoje patří zejména ovocné a zeleninové šťávy, různé koncentráty, nektary, ovocné a zeleninové nápoje, limonády a další. Přehled těchto nealkoholických nápojů je definován v příloze 1, v tabulce 13. Walker (1993) definuje šťávy jako tekuté potraviny, které obsahují čistou, organickou vodu nejlepší kvality. Podle Vyhlášky 289/2004 Sb. jsou nealkoholické nápoje členěny na:
ovocné a zeleninové šťávy
nektary
nealkoholické nápoje ochucené (ovocné nebo zeleninové nápoje, limonáda, minerální voda ochucená a pramenitá voda ochucená)
balené vody (přírodní minerální voda, pramenitá voda, kojenecká voda, pitná voda).
Ovocné a zeleninové nápoje jsou sloţeny zejména z vody (průměrně 85 aţ 92 %) a malého obsahu sušiny (8 aţ 15 %). Sušina je tvořena především cukry (glukosa, fruktosa, v menším mnoţství i sacharosa. Zanedbatelný je obsah bílkovin a tuku. Z výţivového hlediska jsou ovocné a zeleninové nápoje výborným doplňkem běţného jídelníčku pro svůj obsah vitaminů a minerálních látek. EU financovaný integrovaný výzkumný projekt ISAFRUIT zjistil, ţe konzumace dvou jablek denně můţe napomáhat sníţení cholesterolu aţ o 10 % (ANONYM 1). Proto je výhodné konzumovat jablka i v nápojích, nejlépe ve formě 100% dţusu. Ovocné a zeleninové šťávy se pouţívají jako lék jiţ od 19. století. Při jejich výrobě dochází k oddělení zdraví prospěšných látek a vody od vlákniny, která podle ZACKER (2003) zatěţuje zaţívací ústrojí více neţ konzumace ovoce a zeleniny vcelku, a tím šetří organismus. Čerstvá šťáva, obsahující vitaminy a minerální látky, je strávena, na rozdíl od celého plodu, během několika minut (SOUKUPOVÁ & VANÍČKOVÁ, 2008). Ovocné a zeleninové šťávy tak poskytují více koncentrovaných ţivin neţ celé ovoce a zelenina. Ţivotně důleţité látky, jako jsou vitaminy a enzymy, se rychleji dostanou do krve a jsou zavedeny do míst, kde jsou následně vyuţity (ZACKER, 2003). 9
„Téměř okamţitě tedy dobíjí naše tělo energií, čistí a detoxikují náš organismu, podporují trávení, sniţují nadváhu, odstraňují únavu a dodávají našemu tělu energii a vitalitu.“ (SOUKUPOVÁ & VANÍČKOVÁ, 2008). Často se vede diskuze, kolik můţe člověk vypít šťáv za den. Podle WALKER (1993) se mohou 100% ovocné a zeleninové šťávy pít v neomezeném mnoţství. Naopak ZACKER (2003) povaţuje tyto šťávy za léčivo, tudíţ jako doplněk „normální stravy“. Obecně výţivový poradci i lékaři doporučují 2 dcl 100% šťávy denně. Jedna sklenice šťávy nahradí jednu porci ovoce či zeleniny. Podle SZO (Světové zdravotnické organizace) by měl kaţdý člověk zkonzumovat či vypít denně 400-600 g ovoce a zeleniny. Nejlépe rozdělených do pěti porcí, a to 200 g ovoce a 400 g zeleniny.
2.2
Základní suroviny 100% ovocných a zeleninových nápojů
a poţadavky na ně Základní surovinami pro výrobu 100% šťáv jsou ovoce a zelenina. Z ovoce se nejčastěji pouţívají zahradní a jiţní ovoce. Ze zahradních druhů se vyuţívají víceméně jádrové druhy (jablka, hrušky) a bobulové druhy ovoce (jahody a maliny s výlisností 74 %, borůvky a ostruţiny s výlisností 70 %). Z peckového ovoce jsou vhodné pravé višně. Ale meruňky, broskve a švestky se na výrobu šťáv pouţívají omezeně, neboť mají omezenou schopnost lisování. Jiţní ovoce se ale u nás nezpracovává v čerstvém stavu, ale nejčastěji se dováţí v podobě polotovarů (koncentrátů, sukusů). Nejvýznamnější skupinou jiţního ovoce jsou citrusové plody – citrony, pomeranče, mandarinky a grapefruity. Pro výrobu šťáv se vyuţívá duţnina (ROP & HRABĚ, 2009). Co se týče zpracování zeleniny na výrobu 100% šťáv, tak se nejčastěji pouţívají tyto druhy zeleniny: mrkev, rajče, červená řepa. Na trhu se objevují i míchané zelenino-ovocné šťávy s příměsí brokolice nebo bílého zelí. Vedlejší surovinou je voda, která se pouţívá k rekonstituci ovocného koncentrátu. Musí vyhovovat hygienickým poţadavkům na pitnou vodu dle Vyhlášky č. 252/2004 Sb. Vodu z vlastního zdroje je třeba denně mikrobiologicky kontrolovat. Vyhláška udává, ţe pitná voda nesmí obsahovat mikroorganismy, parazity a látky jakéhokoliv druhu v počtu nebo koncentraci, která by mohla ohrozit veřejné zdraví. 10
Do některých šťáv se přidávají přírodní sladidla, vitaminy a minerální látky. Podle Vyhlášky č. 335/1997 Sb. pro ovocné a zeleninové šťávy, ovocné a zeleninové šťávy z koncentrátů, koncentrované ovocné a zeleninové šťávy a sušené ovocné a zeleninové šťávy, s výjimkou hroznové a hruškové šťávy, je povolen přídavek přírodních sladidel, s výjimkou cukru moučka, cukrových homolí a kandysu, pro úpravu kyselé chuti, který nesmí překročit mnoţství 15 g . l-1 šťávy, vyjádřeno v sušině; přídavek přírodních sladidel, s výjimkou cukru moučka, cukrových homolí a kandysu, pro doslazení, který nesmí překročit mnoţství 150 g . l-1 šťávy, vyjádřeno v sušině; vitamínů a minerálních látek. U ovocných a zeleninových nápojů se běţně přidává sypký nebo tekutý cukr. Cukr musí být prostý kvasinek a plísní a nesmí obsahovat slizotvornou mikroflóru (Leuconostoc mesenteroides) a ani koliformní mikroorganismy (HRUBÝ, 1984). Kvalitu ovocných a zeleninových nápojů ovlivňuje zejména pouţitá technologie výroby a kvalita pouţitých druhů ovoce a zeleniny. Je třeba, aby ovoce a zelenina byla vţdy čerstvá, zdravotně nezávadná a mechanicky nepoškozená. Ovoce a zelenina musí být vhodnými technologiemi očištěna, aby se sníţila moţnost kontaminace budoucích nápojů nejen mikroorganismy, ale i rezidui pesticidů a hnojiv, dále se mohou kontaminovat mechanicky, například půdou nebo drobnými kamínky. Pokud nelze čerstvé ovoce či zeleninu ihned zpracovat, musí být za vhodných podmínek skladovány, aby nedošlo například k zaplísnění a vzniku hnilobných procesů. Obecné poţadavky na kvalitu ovocných nápojů řešila Směrnice Rady 93/77/EHS pro ovoce a některé výrobky stejného typu, která byla v roce 2003 zrušena a nahrazena Směrnicí Rady 2001/112/ES o ovocných šťávách a některých podobných produktech určených k lidské spotřebě. Asociace výrobců ovocných šťáv a nektarů (AIJN) pro EU sestavila všeobecně platné analytické vlastnosti pro jablečnou, grapefruitovou, pomerančovou šťávu a šťávu z vinných hroznů a označila je jako referenční směrnici Code of Practice (ANONYM 2).
11
2.3
Technologie výroby ovocných a zeleninových nápojů
Ovocné a zeleninové nápoje se vyrábějí jako tzv. přímé šťávy, které se získávají lisováním a poté následují úpravy (čiření, filtrace nebo homogenizace), plnění a pasterace nebo jiný způsob konzervace se srovnatelným účinkem. Častější je však výroba šťáv získaná rekonstitucí z koncentrátů, kdy dochází k naředění koncentrátů vodou. Ovocné a zeleninové šťávy se mohou prakticky vyrábět ze všech druhů ovoce a zeleniny lisováním čisté suroviny. Výjimkou je karotka, která se musí nejdříve blanţírovat a pak se pasíruje přes síto. Čiré šťávy se zbavují zbytků duţiny odstřeďováním, čeřením a filtrací, dřeňové šťávy se homogenizují. Mohou se získávat jak za syrova, tak za tepla. Získávání šťáv za tepla patří k tradičnímu způsobu odšťavování. Ovoce se vloţí do hrnce s trochou vody a vaří se tak dlouho, aţ ovoce popraská (rybíz) nebo změkne (jablka). Šťáva se pak oddělí od ovoce přefiltrováním přes tkaninu. Získaná šťáva se svaří s cukrem, a ještě horká se plní do lahví, které se ihned uzavřou. Někdy je nutné se zbavit pěny před vychladnutím (BAYER, 2002). Podle trţního druhu se získané šťávy různě upravují. Například se mohou ředit pitnou vodou nebo se ochucují a aromatizují. Po zhotovení finálního výrobku se musí konzervovat pasterací, aby se dosáhlo delší trvanlivosti (KOMÁR, 2005).
2.3.1 Získávání šťáv lisováním Základní operace při technologickém postupu jsou: skladování ovoce před lisováním, praní a třídění, drcení a úprava drtě před lisováním, vlastní lisování, odkalení šťávy a konzervace šťávy. Tímto způsobem lze získat čiré šťávy nebo dřeňové kalné šťávy. Na schématu 1 je uveden postup výroby čiré šťávy. Postup výroby čerstvé a pasterizované jablečné šťávy je uveden v příloze 2 schématu 3 (VOLDŘICH, 2009).
12
Zásady při lisování: při lisování se nechá odtékat maximální mnoţství samotoku, lisuje se přerušovaným tlakem, aby šťáva (prakticky nestlačitelná), mohla snadněji odtékat, měrný tlak v ovocné drti nemá být vyšší neţ 1,6 MPa, nesmí se lisovat rychleji, neţ stačí odtékat šťáva, drť se musí plnit do komory lisu rovnoměrně, celé zařízení musí být udrţováno v čistotě. Po vlastním lisování jsou získané šťávy kalné, proto musí následovat odkalování šťáv, aby se tento kal odstranil. Existují tři způsoby odkalování: prostá sedimentace nečistot – nejjednodušší způsob. Po dobu 12 h. se nechá šťáva odstát. Pomocí čiřidly je moţné zvýšit účinnost. V praxi se pouţívá 10-50 g ţelatiny na 100 l a 5-25 g taninu, filtrace, odstřeďování. Po vylisování a odkalování následuje konzervace. Konzervovat je moţné pasterací, chemickými konzervanty (ROP & HRABĚ, 2009). V příloze 1, v tab. 16 je uveden seznam základních polotovarů.
13
Schéma 1: Výroba lisované šťávy (VOLDŘICH, 2009) Přísun ovoce (plavení)
Výroba
↓
šťávních
Praní
koncentrátů
↓ Uloţení Inspekce
Lisování
Filtrace/
konzervované
↓
II
odstředění
šťávy v tancích
Drcení + přídavek pektolytického enzymu ↓ Pektolýza drti
↑ Extrakce výlisků ↑ Lisování
Filtrace/
I
odstředění
Konzervace Čiření
(pasterace, SO2, CO2)
Vedle čirých šťáv začíná rozvoj výroby šťáv s obsahem jemně macerované ovocné duţniny bez hrubých nepoţivatelných částí. Výhody těchto šťáv spočívají v dokonalejším zachování nutriční hodnoty, v dobrých předpokladech pro zachování labilních sloţek v důsledku účinné inaktivace enzymů a odvzdušnění materiálu během macerace, čímţ jsou vytvořeny dobré předpoklady pro další fortifikaci těchto šťáv, a tím i dobrou stravitelnost. Na schématu 2 je zobrazen postup výroby. Základním poţadavkem je, ţe suroviny by měly být během výroby zpracovány do 20 minut pokud nebude aplikována enzymová macerace (VOLDŘICH, 2009).
14
Schéma 2: Výroba dřeňové kalné šťávy (VOLDŘICH, 2009) Přísun suroviny ↓
Praní ↓
Homogenizace
Dearace
↓
↑
Chuťové úpravy ↑
Plnění do obalů
Tepelná
← cukr
sterilace
← kyselina
v obalu
mimo obal ↓ Aseptické plnění do obalů ↓
přepravní Pasírování
↓
↑
Kontrola
Odpeckování
hermetičnosti,
↓
posterilační
Loupání
sterilizace
Etiketace,
Odstopkování ↓
Tepelná
Rozváření
úpravy – sušení
(+
obalů
balení
expedice
enzymový macerace)
BIO šťávy musí být lisovány z čerstvého ovoce a zeleniny, pocházející z ekologického zemědělství. Trvanlivost šťáv není zajištěna chemicky, ale jiţ samotným procesem při stáčení a plnění, kdy dochází ke krátkému rychlému zahřátí na 80 °C a následnému ochlazení na cca 20 °C (ANONYM 3).
2.3.2 Získávání šťáv vyluhováním – macerací Tento způsob získávání šťáv se vyuţívá u těch druhů ovoce, u kterých je nízký obsah vody a nedají se lisovat - šípky, jeřabiny, trnky, dřínky (ROP & HRABĚ, 2009). Dále se macerace vyuţívá při výrobě dřeňových kalných šťáv.
15
Macerované ovoce a zelenina jsou tekuté výrobky, obsahující velký podíl rostlinného pletiva – výrobky charakteru velmi jemných protlaků - označované jako dřeňové, kalné šťávy. Obsahují tedy včetně vlastní šťávy i jemně macerovanou ovocnou duţninu bez hrubých nepoţivatelných částí (VOLDŘICH, 2009). Macerace probíhá v modřínových kádích nebo nádobách z nerezové oceli. Plody se vyluhují celé či drcené. Macerace se provádí dvakrát a poměr vody k plodům je při kaţdé maceraci 2:1. Plody se vyluhují ve dvoudenních intervalech. Oba výluhy se pak smíchají. Výsledná směs obsahuje minimálně 6 % RS. Díky vysokému obsahu tříslovin bývají výluhy trpké (ROP & HRABĚ, 2009).
2.3.3 Získávání šťáv rekonstitucí šťávních koncentrátů Šťáva z koncentrátu se získá vrácením odpařené vody z ovocného koncentrátu, který vzniká odpařením části vody z původní 100% šťávy. Tato technologie se vyuţívá u šťáv či nektarů z jiţních plodů (citrusy – pomeranč; ananas) Princip výroby je zahuštění ovocné šťávy aţ na koncentraci rozpustné sušiny 65-70 %, kdy je výrobek prakticky samoúdrţný v důsledku dostatečné nízké aktivity vody a nízkého pH. Na schématu 3 je vidět postup výroby. V příloze 2 se nachází schéma 5, které uvádí podobný postup výroby koncentrátů. Výroba začíná lisováním surové šťávy, která je následně zbavena hrubých kalů. Z této šťávy se v první části odparky (jímač aroma) odpaří při teplotě blízké 100 °C okolo 10-30 % vody. Při tomto procesu se oddělí i větší část aromatických látek typických pro daný typ ovoce. V další fázi dochází k pektolýze pomocí směsí enzymů. Pektolýza probíhá při 50-52 °C po dobu několika hodin. Tento proces umoţňuje rozklad nejen pektinu, ale i škrobu a hemiceluloz. Důleţitým procesem je čiření, které zabraňuje tvorbě pektinového rosolu během zahušťování a chrání vyrobený koncentrát před zakalením během skladování. Ve fázi čiření se odstraní prekurzory kalů (sloţky koloidního či pravého roztoku). Podobný účinek má ultrafiltrace, která slouţí k odstranění vysokomolekulárních sloţek včetně kalů. Dalším způsobem vyloučení kalů je přídavek látek tvořící ve šťávě sraţeninu, do níţ se kaly strhávají (přídavek taninu a ţelatiny) nebo nerozpustných sorbentů
16
poutajících kaly na svůj povrch (bentonit, křemičitý gel). Vyloučelé sraţeniny a kaly se pak oddělí pomocí filtrace nebo odstředivek. Vlastní zahušťování probíhá na tří aţ čtyřčlenných odparkách nejrůznější konstrukce při teplotách okolo 50 °C. Výsledný obsah rozpustné sušiny ovocného koncentrátu je okolo 65 %. Běţná trvanlivost těchto koncentrátů bývá asi 10 měsíců (VOLDŘICH, 2009). Schéma 3: Výroba ovocných koncentrátů (VOLDŘICH, 2009) Koncentrát aroma Odlisovaná
Plnění
šťáva
Chlazení
zbavená
↑
hrubých kalů
→
do
Uloţení
nádob
v tancích
+
↑
uloţení 10-30% ↓
páry +
Jímač aroma
aroma
Chlazení
Rektifikace
↑
↓ Šťáva Chlazení
Ultrafiltrace Pektolýza
Čiření
Filtrace
Zahuštění v odparce
Šťávní koncentrát Výroba šťáv z ovoce z jiţních zemí se provádí způsobem koncentrátů ze 100 % šťáv. V těchto zemích se z vylisovaných šťáv, například z pomerančů, odpaří voda v poměru 7:1, tím vznikne koncentrát, který se doveze do České republiky ve zmrazeném stavu. Koncentrátu se vrátí odebraná voda ve stejném poměru - tzv. poţadovaná refrakce, která je dle HRUDKOVÉ (1989) minimálně 65 %. Tímto vznikne opět 100 % šťáva v tekutém stavu a plní se do příslušných obalů a podstoupí pasterizaci. Nejčastější způsob je několikavteřinové zahřátí při teplotě pod 100 °C. Jakostnější koncentrát 17
se získá vymrazováním. Principem je postupné sniţování bodu tuhnutí kapaliny obsahující rozpustné látky. K tomu se pouţívají krystalizátory - nepřímo chlazené nebo přímo chlazené (HRUDKOVÁ, 1989). Z čerstvě vylisované ovocné šťávy se obvykle v zemi výroby zpracování odstraní voda. Koncentrát se pak uchovává mraţený nebo tekutý, většina typů nepodléhá kvašení ani při běţných teplotách. Výhodou je, ţe se významně sníţí náklady na přepravu, které jsou zvláště u exotického ovoce poměrně významnou poloţkou. U 100% dţusů vyrobených z koncentrátu je pak při výrobě vráceno zpět stejné mnoţství vody, které bylo při koncentraci odebráno (ANONYM 4).
Obr. 1: Výroba pomerančového džusu (ANONYM 4)
2.3.4 Nové technologie Enzymové preparáty a směšovací zařízení určené speciálně pro výrobu ovocných šťáv. Dlouholetý
partner
společnosti
Novozymes
(celosvětově
známý
výrobce
technologických enzymů) podnik Begerow z německého Langenlonsheimu, distribuuje enzymové preparáty pod značkou Panzym, které jsou vhodné pro výrobu ovocných šťáv. Očekává se, ţe i nadále budou vyvíjeny další enzymy, které se uplatní v této oblasti nápojářského průmyslu. Jedním z nich, určený pro zpracování barevného bobulového ovoce, je prostředek Panzym Pro Color. Díky tomuto enzymu nemá vylisovaná ovocná šťáva téměř ţádné pektiny. Tento výrobek usnadňuje i uvolňování barviv. Pozitivně ovlivňuje stabilitu extrahované barvy díky sníţení neţádoucích vedlejších aktivit. Tak je nepřímo ochráněna barva konečného nápoje.
18
Kromě výše uvedených preparátů na bázi enzymů se při výrobě ovocných šťáv uplatní
i
nově
vyvinutá
strojní
zařízení.
Například
strojírenský
podnik
H. FALTERBAUM FAMIX z německého Pulheimu, doporučuje pouţít k výrobě nápojů
jejich zařízení FAMIX TurboDigi, které odráţí nejnovější stav techniky. Tento mixer můţe podle poptávky zpracovávat dvě nebo více sloţek. Ty jsou přesně charakterizovány pomocí digitální regulace poměru jejich mnoţství prostřednictvím měření jejich průtoku. Kompaktní zařízení má nad běţný rámec vybavení poloautomatickou řídící jednotku, která zajišťuje i pro spodní hranici rozmezí výkonu vysoký
stupeň
automatizace
a
absolutní
mikrobiologickou
bezpečnost
(HVÍZDALOVÁ, 2010). V Německu testovali kvalitu jablečného moštu s přírodním zákalem a ostruţinového nektaru po stáčení za horka do Bag-in-Box a skla. Při stáčení nápojů do Bag-in-Box se pouţívá sáček z fólie z různých plastových materiálů, které jsou spojeny s plastovými kohoutky. Obaly jsou kombinovány s kartonem, který zajišťuje mechanickou stabilitu obalu. Malé podniky vyuţívají většinou 3 litrové nebo 5 litrové nádoby, které jsou plněné poloautomaticky nebo ručně zahřáté a následně plněné. V rámci pokusů byly porovnány vzorky jablečného moštu a ostruţinového nektaru v Bag-in-Box a ve skle. Tyto vzorky byly sterilizovány a za horka plněny (při teplotě 85 °C), kdy jsou enzymy (pektináza, polyfenoloxidáza) a vegetativní formy mikroorganismů vystaveny uvedené teplotě. Téměř ve všech sledovaných případech nedocházelo následně k ţádnému aktivnímu zpětnému zchlazení nádoby, při dlouhodobém skladování v běţném prostředí nedošlo k ţádnému váţnému riziku. V rámci studie byl tento stav simulován, přičemţ byly sledovány vlivy na klíčové analytické parametry. Vedle mikrobiologické kvality byly sledovány i senzorické znaky, u kterých však nebyly zaznamenány ţádné výkyvy (HVIZDALOVÁ, 2012).
2.4
Konzervace ovocných a zeleninových nápojů
Pro zvýšení biologické stability a prodlouţení trvanlivosti ovocných a zeleninových šťáv se pouţívají různé druhy konzervace. Konzervace slouţí i jako obrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů. Pod pojmem konzervace se rozumí kaţdý úmyslný technologický proces s cílem prodlouţit údrţnost potravin déle, neţ je její přirozenost. 19
Cílem konzervace je i zachování hygienické a zdravotní nezávadnosti potravin (ROP et al., 2005). Rozlišují se tři typy konzervací, a to vylučování mikroorganismů z prostředí, přímá inaktivace mikrobů a nepřímá inaktivace mikrobů.
2.4.1 Vylučování mikroorganismů z prostředí Základní postup při získávání šťáv je praní ovoce a zeleniny před dalším zpracováním. Díky praní se odstraní nejen mechanické nečistoty, ale i část mikrobiálních nečistot. Získané ovocné a zeleninové šťávy mohou být filtrovány celulosovými nebo kaolinovými filtry. Tyto filtry spolehlivě zachytí mikroorganismy i spory. Před filtrací se musí šťávy odkalit a zbavit makromolekulárních koloidně rozpuštěných látek, zejména pektinu a vlákniny. Po filtraci postupují šťávy asepticky do sterilních nádob bez moţnosti jejich rekontaminace (INGR, 2007). Další moţný způsob vylučování mikroorganismů z prostředí je tzv. baktofugace. Jedná se o odstředivou separaci mikroorganismů zvláštní centrifugou, baktofugou. Princip je zaloţen na rozdílu hustoty kapaliny a hustoty mikrobiálních spor obsaţených v dané kapalině a jejich rychlé kontinuální vyloučení odstředivou silou. Mikrobiální filtrací můţe předcházet úprava šťáv odkalením, čiřením a klasickou filtrací. Nevýhodami těchto dvou metod konzervace je aktivita přítomných enzymů a ochuzování o nutričně cenné látky v odfiltrovaných nebo odstředěných kalech z ovocných šťáv. Obecně se baktofugace pouţívá při zpracování mléka v kombinaci s bleskovou sterilizací (PELIKÁN, 2001; HORČIN, 2004a; INGR, 2007).
2.4.2 Přímá inaktivace mikroorganismů (abióza) Principem přímé inaktivace mikroorganismů je intenzivní působení teplota, chladu, záření nebo chemických látek. Mikroorganismy nejprve omezí svoji virulenci a poté hynou (nejdříve vegetativní organismy a potom spory). Enzymy se mohou ireverzibilně i reverzibilně inaktivovat (HORČIN, 2004a). K tomuto způsobu konzervace se řadí různé fyzikální a chemické metody. Nejpouţívanější fyzikální metoda pro konzervaci ovocných a zeleninových šťáv je 20
termosterilace neboli konzervace zahříváním. Tímto způsobem můţe být u šťáv dosaţeno pasteračního nebo sterilačního účinku. Pasterační účinek vede k inaktivaci pouze vegetativní stádia mikroorganismů, spory však přeţívají. Sterilačním účinkem dochází k inaktivaci všech mikroorganismů včetně spor. Výsledný produkt je teoreticky neomezeně trvanlivý (HORČIN, 2004a; INGR, 2007). Termosterilace je vhodná pro výrazně kyselé produkty s pH pod 4 (ovoce, okyselená zelenina), stačí niţší pasterační teploty 70-100 °C po dobu několika minut (PELIKÁN, 2001). Dalším způsob konzervace je záhřev odporovými topením. Ve šťávě mezi elektrodami proudí proud o vysokém odporu se schopností zahřát tekutinu na sterilační teplotu 75 °C po dobu 15 minut. Tento způsob v praxi se nerozšířil, na rozdíl od kontinuálního způsobu odporového ohřevu, kdy šťáva nebo nálev s kusovým ovocem protéká trubicí, kde jsou umístěny v určitých vzdálenostech elektrody, kde se protékající kapalina steriluje proudem o frekvenci 50 Hz při teplotě do 95 °C za normálního tlaku nebo přetlaku teplotami aţ do 140 °C (PELIKÁN, 2001). Nejčastěji se pouţívá pasterace UHT (ultra - high temperature processing). Jedná se o několikavteřinové zahřátí při teplotě pod 100 °C. K tomuto účelu se pouţívá vlhké teplo, které slouţí jak k pasteraci, tak i ke konzervaci kyselých potravin (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). V praxi se vyuţívá šetrná pasterace, tedy pouţití teplot okolo 70 °C po dobu několika minut. Alternativou tepelné pasterace je pouţití VF technologie (vysokofrekvenční technologie). V tomto případě se jedná o vyuţití radiových vln ke zvýšení bezpečnosti/nezávadnosti ovocných a zeleninových šťáv. K tomu slouţí technologie RFEF (vysokofrekvenční elektrické pole), která úspěšně inaktivuje bakterie zejména v ovocných šťávách bez pouţití tepla (ANONYM 5). Šetrnou netermální metodou konzervace tekutých potravin je vyuţití pulzního elektrického pole (PEF), které vede k usmrcování mikroorganismů v potravinách, zatímco chuť, vůně, barva a nutriční hodnota potravin zůstávají zachovány. V porovnání s tepelným opracováním způsobuje PEF niţší denaturaci bílkovin, více se zachovává vitamin C v pomerančové šťávě, chuťové a vonné sloţky (ANONYM 7). Dále se můţe vyuţívat ke konzervaci ionizující záření gama, maximálně 10 kGy (PIECKOVÁ, 1998). Existuje i moţnost sterilace odporovým ohřevem. Tato sterilace probíhá v elektrosterilátoru. Jedná se o přenosný přístroj se 2 aţ 3 uhlíkovými elektrodami, které 21
se zavěsí blízko dna nádoby (nevodivá, termorezistentní a hermeticky uzavíratelná). Odporová sterilizace vyuţívá tepelnou energii vyvinutou příchodem elektrického proudu přes sterilizovaný materiál. Sterilizují se ovocné šťávy střídavým proudem s frekvencí 50 Hz a napětí 380 V. Šťáva, která se předem zhruba odkalí a zfiltruje, se při průchodu střídavého proudu (stejnosměrný proud vede k rozkladu šťáv) mezi elektrodami zahřívá, stoupá vzhůru, čímţ se samovolně promíchává. Šťáva se většinou ukládá v sudech nebo menších jímkách, které jsou hermeticky uzavíratelné. Za výhodné lze povaţovat, ţe enzymy se prakticky nepoškodí. Nevýhodou je působení teplot 30 aţ 60 °C na oxidační enzymy šťáv, které jsou při této teplotě nejaktivnější, a proto mohou vyvolat různé senzorické i nutriční změny. Působením této teploty hrozí i nebezpečí přehřátí šťávy (HORČIN 2004a; INGR, 2007). Při průtokové sterilaci ovocných šťáv by mohla být pouţita sterilace ultrazvukem. Rozumí se tím vystavení potraviny působení ultrazvuku, který vede k usmrcení přítomných mikroorganismů (ANONYM 7). Jako ultrazvuk se označuje zvuk s frekvencí nad 20 kHz, tj. nad prahem lidského vjemu (> 16 kHz). Ultrazvuk rozrušuje biologické struktury, a kdyţ se aplikuje s dostatečnou intenzitou, má schopnost usmrcovat buňky. Baktericidní účinek ultrazvuku se přisuzuje intracelulární kavitaci, tedy mikromechanickým šokům, které rozrušují buněčné strukturální a funkční sloţky aţ do stádia úplné dezintegrace a rozpadu buněk. Ultrazvuk dokáţe měnit (fyzikálně nebo chemicky) vlastnosti potravin: ničí buňky, podporuje chemické reakce, inhibuje enzymy, rozmělňuje maso (tenderizace) nebo modifikuje krystalizační procesy. Ukazuje se však, ţe účinek samotného ultrazvuku není dostatečný, a proto se ultrazvuk pouţívá ve spojení s dalšími metodami konzervace potravin (např. teplem a tlakem), coţ umoţňuje širší
vyuţití
ultrazvuku v průmyslové praxi
při
výrobě potravin
(ANONYM 8). Destruktivní účinky ultrazvuku na mikroorganismy jsou v kapalném prostředí vyvolány tzv. kavitací, kdy se jedná o porušení soudrţnosti molekul kapalného prostředí mikroorganismů. Vliv elementárních částic prostředí a plynu rozpuštěných v kapalině se podílí na mechanické destrukci mikroorganismů. Nevýhodou tohoto způsobu sterilace je působení ultrazvuku na enzymy, čímţ můţe dojít k nutričním a senzorickým změnám sterilovaného produktu (INGR, 2007; ANONYM 7). Nejnovější způsob konzervace ovocných a zeleninových šťáv je konzervace vysokým hydrostatickým tlakem. Jedná se o metodu ošetření spočívající ve vystavení potraviny účinku vysokého tlaku (aţ 10000 atm) po dobu několika minut, při kterém dojde 22
k usmrcení mikroorganismů (HORČIN, 2004a; ANONYM 7). Tento způsob konzervace dobře působí na bakterie E.coli.
2.4.2.1 Ošetření šťáv za použití vysokého hydrostatického tlaku – paskalizací Tepelné zpracování – pasterizace byla dlouho uznávána jako tradiční a nejběţnější efektivní metoda eliminace patogenních vegetativních buněk a zabránění mikrobiálního kaţení tekutých potravin, jako jsou ovocné a zeleninové šťávy. Nicméně tento způsob vede i k neţádoucím účinkům ve šťávách, zejména ztrátě nutričních látek, změně vůně a chuti (DIELS et al., 2003; GUENES et al., 2005). Moderním
a efektivním
způsobem
získávání
šťáv je pouţití vysokého
hydrostatického tlaku, který slouţí zároveň jako konzervační metoda. Jedná se o sterilaci izostatickým tlakem, tzv. paskalizací - ošetření potravin vysokým tlakem (INGR, 2007). Pouţití vysokotlaké pasterizace za účelem mikrobiální dezinfekce bylo původně inspirováno biotechnologii, kde výzkumní pracovníci prokázali schopnost homogenizace při vysokém tlaku rozbít buňky a poté uvolnit jejích intracelulární obsah (DIEHL et al., 2005). Tato technologie je známa více neţ 100 let a nese název technologie nového typu nebo technologie 3. tisíciletí. Touto technologií jsou získány potraviny nového typu (HOUŠKA, 2007). Principem této technologie je, ţe se potravina zabalí do flexibilního obalu. Obal s potravinou se umístí do tlakové komory vysokotlakého lisu. Vše se zalije pitnou vodou nebo jinou tlakovací kapalinou. Po uzavření komory se čerpá kapalina k docílení tlaku od 4 000 do 6 000 i více barů. Reálná doba výdrţe tlaku se pohybuje v rozmezí od 2 do 15 minut. Poté nebo v té době dochází k řízenému poklesu tlaku (HOUŠKA, 2007). Potravina můţe být buď v přímém kontaktu s tlakovým médiem, nebo hermeticky uzavřená v obalu, který přenáší tlak (VOLDŘICH, 2000). Potraviny, které jsou jiţ zabalené, se umístí do vysokotlaké nádoby, která je naplněna médiem přenášející tlak, většinou vodou. V této nádobě je krátkodobě vynaloţen tlak o 100 aţ 1 000 MPa. Působením vysokého tlaku dochází k inaktivaci enzymů, vegetativních forem mikroorganismů. Ovšem endospory jsou schopné přeţít i vyšší tlaky neţ 1 000 MPa (INGR, 2007). 23
Významným faktorem, který ovlivňuje účinnost vysokého tlaku, je teplota. Se zvyšováním teploty od záporných hodnot odolnost mikroorganismů nejprve vzrůstá, aţ dosáhne maxima. Ale s dalším zvyšováním teploty jejich odolnost klesá. V kombinaci s vyššími teplotami umoţňuje inaktivovat i bakteriální spory. DONS´I et al. (2010), po provedení experimentální studie s jablečným a pomerančovým dţusem naočkované E. coli a L. innocua, zdůrazňuje, ţe účinnost pulzního vysokého tlaku závisí na kombinaci pulsního čísla, tlaku a teploty. Pouţitím této technologie zůstávají šťávy stabilní beze změn minimálně 21 dní. Mnoţení MO probíhá většinou za atmosférického tlaku. Při zvýšeném tlaku na 10-20 MPa se mnoţení většinou zpomaluje nebo ustává při tlaku 40 MPa. Pro úplné usmrcení MO je nutné pouţít několikaminutové aţ několikahodinové působení tlaku okolo 600 aţ 700 MPa. Spory bakterií rodu Bacillus přeţívají i několikahodinové působení tlaku 1 700 MPa. Krátkodobé zvýšení tlaku na několik desítek MPA indukuje klíčení spor, které lze následně snadno devitalizovat působením teplot okolo 60 °C (VLKOVÁ, 2009). PATHANIBUL et al. (2009) zkoumali účinnost vysokotlaké pasterace s přídavkem nebo bez nisinu k desinfekci jablečné a mrkvové šťávy, které byly naočkovány E. coli K12 a L. innocua, jako náhrada za alimentární patogeny E. coli O157:H7 a L. monocytogenes. S rostoucím tlakem se trvale sniţoval obsah naočkovaných mikroorganismů. Vzhledem k tomu, ţe jablka a mrkev se liší svoji barvou, kyselostí, sušinou a hustotou, neměly tyto vlastnosti ţádný vliv na inaktivaci E. coli
K12
vysokotlakou homogenizací. Počet přeţívajících bakterií nebyl výrazně odlišný mezi šťávami, ani mezi šťávami doplněnými o nisin. L. innocua ukázala větší odolnost proti vysokému tlaku homogenizace neţ E. coli K12. PALGAN et al. (2011) provedli výzkum s technologií pulzního světla na jablečné a pomerančové šťávě, kdy byly tyto šťávy naočkovány E. coli a L. innocua. Principem pulzního světla je působení světelných pulsů (záblesků) v oblasti UV a IČ spektra po dobu několika set mikrosekund na potravinu za cílem mikrobiální inaktivace (DUNN, 1996). TAKESHITA et al. (2003) zjistili, ţe pulsní světlo můţe poškozovat membrány, proteiny a jiné makromolekuly v mikroorganismech, čímţ se zvyšuje účinnost mikrobiální inaktivace. Smrtící účinek na mikroorganismy je většinou přičítán fotochemické akci části UV spektra vyzařovaného z výbojky. Mikrobiální DNA absorbuje UV záření, které vyvolává chemickou modifikaci jeho struktury, coţ má 24
za následek poškození genetické informace, postiţené replikací a transkripcí genů aţ nakonec smrt buňky (MCDONALD et al., 2000). PALGAN et al. (2011) zjistili, ţe v jablečném dţusu došlo ke sníţení E. coli o 4 řády, kdeţto v pomerančovém dţusu jen o 1 řád. Velký vliv na účinnost pulsního světla má právě transparentnost kapaliny. Elektrický ultrazvuk je povaţován za další potenciální metodu pro inkativaci mikroorganismů v ovocných a zeleninových šťávách.
ADEKUNTE et al. (2010)
pouţili elektrický ultrazvuk na rajčatovou šťávu a sledovali odolnost kvasinek Pichia fermentans. Podle této studie se naznačuje moţné pouţití ultrazvuku při výrobě ovocných šťáv. Tímto způsobem se můţe dosáhnout sníţení počtu kvasinek aţ o 5 řádů.
2.4.3 Nepřímá inaktivace mikroorganismů (anabióza) Anabiotické metody většinou neusmrcují mikroorganismy a ani ireverzibilně neinaktivují enzymy, ale pouze upravují prostředí tak, aby se jejich virulence blíţila k nulovým hodnotám (HORČIN, 2004a). Patří sem fyzikální, chemické a biologické metody. Pro konzervaci ovocných a zeleninových šťáv se pouţívají jen fyzikální metody. K fyzikálním metodám patří uchování čerstvých šťáv při nízké teplotě, dále sníţení aktivity vody v surovinách sušením nebo odpařováním, zejména u koncentrátů při výrobě pomerančových dţusů (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Princip odnímání vlhkosti spočívá v odstranění takového mnoţství vody z potraviny, jejíţ zbytek jiţ neumoţňuje rozvoj mikroorganismů. Typická je konzervace zahušťováním odpařováním vody ovocné šťávy na vakuových odparkách za sníţeného tlaku, kde se bod varu pohybuje mezi 40 aţ 70 °C (INGR, 2007). Sušení pomocí neredukujícího disacharidu trehalosy se můţe pouţít u koncentrátu pomerančové šťávy obsahující 7,5 % hmotnostních pevných pomerančových částic. Do tohoto koncentrátu se přidá 15 % hmotností trehalózy a suší se rozprašováním. Teplota vzduchu na přívodu 170 °C, teplota vzduchu u vývodu 80 aţ 84 °C a rychlost rozprašování 40 000 otáček za minutu (ANONYM 9). Vůči aromatickým sloţkám šetrná metoda konzervace je kryokoncentrace. Tento způsob se pouţívá u ovocných šťáv, které se koncentrují pozvolným zmrazováním, při
25
kterém voda vymrzá ve formě velkých ledových krystalů. Tyto ledové krystaly se oddělí od matečného roztoku centrifugací. Šťávy lze koncentrovat i membránovými procesy. Tato koncentrace je zaloţena na vyrovnání koncentrace látek mezi dvěma roztoky oddělenými navzájem semipermeabilní (polopropustnou) membránou. Voda se postupně dostává z méně koncentrovaného roztokou do koncentrovanějšího, dokud se koncentrace v obou roztocích nevyrovnají (INGR, 2007). Mezi účinnou koncentraci membránovými filtry patří ultrafiltrace ovocných šťáv, která je účinná zejména na termorezistentní mikromycety. Jedná o separační metodu, kde jsou 2 membrány, a to semipermeabilní polymerní (acetát celulosy) a anorganická (keramika). Membrány jsou schopny zadrţet částice o velikosti 2 - 200 nm. Tlak působící během ultrafiltrace je od 0,1 do 2 MPa. K ultrafiltraci se pouţívají deskové, spirálovité nebo tubulární moduly (ANONYM 10).
2.5
Moţné zdroje mikrobiální kontaminace
Mikrobní změny u ovocných a zeleninových šťáv spočívají zejména v procesu rozkladu nebo kvašení. Příčinou mikrobních změn nejsou jen mikroorganismy, ale i enzymy, které jsou mikroorganismy vylučovány. Jedná se zejména o bakterie, plísně a kvasinky. Plísně a kvasinky potřebují ke svému ţivotu kyslík (PELIKÁN, 2001). Mikrobiální činitelé se uplatňují v nejrůznější formě a mohou způsobovat zejména hnití, kvašení a plesnivění. Co se týče plodů ovoce jako suroviny, mohou být primárně napadeny parazitickými mikroorganismy jiţ před sklizní nebo během skladování. Z infikovaných částí se nákaza (nejčastěji původce hniloby) šíří na zdravé části vzduchem nebo kontaktem, čímţ můţe dojít k znehodnocení surovin (ROP & HRABĚ, 2005). Existují dva způsoby kontaminace, které se mohou vzájemně prolínat. V prvním případě se jedná o primární kontaminaci, tedy o kontaminaci surovin, jako jsou voda, cukr, čerstvé ovoce a zelenina. V druhém případě dochází k sekundární kontaminaci, tedy ke kontaminaci v průběhu výrobního procesu, a to z prostředí, z rukou pracovníků, ze strojů a zařízení (KOMPRDA, 2000). Hlavní zdroj bakteriální kontaminace můţe být i voda pouţívaná při výrobě nápojů z koncentrátů. V potravinářském průmyslu se pouţívá voda s výbornou jakostí jak 26
po stránce mikrobiologické, tak po stránce chemické. Vţdy musí být splněny poţadavky na pitnou vodu, i kdyţ se v některých případech pouţívá jako voda uţitková. Pitná voda musí splňovat poţadavky dle novely č. 187/2005 Sb., kterou se stanoví hygienické poţadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody v znění pozdějších předpisů a dále poţadavky dle Vyhlášky ministerstva zdravotnictví č. 409/2005 Sb. o hygienických poţadavcích na výrobky přicházející do přímého styku s vodou a na úpravu vody. K obávaným kontaminantům pitné vody se řadí bakterie čeledi Enterobacteriaceae, zejména pak bakterie E. coli, a to sérovar O157. E. coli je gramnegativní aerobní bakterie osídlující střevní trakt člověka a zvířat, vyskytuje se tedy i ve výkalech. Její přítomnost ve vodě a v potravinách je ukazatelem fekálního znečištění. Stejným způsobem se mohou dostat do vody či do potravin i rody Salmonella nebo Shigella (HAMPL, 1956; ŠROUBKOVÁ, 1996). Je nutné počítat s tím, ţe i vzduch můţe být zdrojem mikrobiální kontaminace, neboť se vzduchem přicházejí do styku suroviny, meziprodukty ale i hotové výrobky. Vzduch není prostý bakterií, kvasinek ani spor plísní. Do vzduchu jsou mikroorganismy zaneseny
s prachem,
který
se
pohybem
vzduchu
víří
(KOCKOVÁ
–
KRATOCHVÍLOVÁ, 1980). Kontaminované mohou být i vlastní plody ovoce a zeleniny. Zejména u zeleniny, která většinou roste v půdě, kde mohou přeţívat spory některých bakterií (Clostridium, Bacillus), je větší pozornost upřena na čištění a mytí. Je třeba počítat s tím, ţe i čerstvá dobře vypadající zelenina můţe obsahovat mikroorganismy. Velké mnoţství bakterií, kvasinek a spor plísní se vyskytuje na povrchu zeleniny a samozřejmě také v půdě, která ulpívá na hlízách a kořenech. Obsah mikrobů dosahuje hodnot 107. g-1 i více, a je závislý na době a způsobu sklizně, dopravy a skladování. Mytím je moţno odstranit aţ 90 % mikroflóry. Pro hygienické posouzení zdravotní nezávadnosti se stanovuje počet E. coli a nepřítomnost bakterie Salmonella (HRUBÝ, 1984). Vědci zjistili, ţe mohou u některého ovoce (jablka, broskve) sníţit moniliózu aţ o 80 % a odstranit bakterie E. coli a Salmonella díky namáčení ovoce v horké vodě při určité teplotě - při 60 °C po dobu 20 sekund pro broskve, při 50-52 °C po dobu 40 sekund pro jablka (VONDRÁŠKOVÁ, 2010). Ke kontaminaci můţe dojít i díky mechanickému poškození ovoce a zeleniny během sklizně a během dopravy. Následkem mechanického poškození se sníţí odolnost zdravého ovoce a zeleniny, a tím se zvýší riziko průniku a následné pomnoţení různých 27
mikroorganismů. Posklizňový rozvoj povrchové mikroflóry je závislý na stupni mechanického poškození, na specifické odolnosti plodů a dále na skladovací teplotě. Rozsah mikrobiální kontaminace závisí na způsobu skladování ovoce a zeleniny. Při větší vlhkosti a vyšší teplotě se pomnoţují zejména plísně, které dobře pronikají do pletiv, i kdyţ jsou poměrně kyselá. Některé plísně jsou schopny tvořit sekundární metabolity – mykotoxiny. Ty jsou velmi nebezpečné pro zdraví člověka, neboť většina z nich má karcinogenní účinek (DOJČAROVÁ, 2009). Během skladování můţe být ovoce napadeno šedou hnilobou, jejímţ původcem je plíseň Botrytis cynerea. Napadá hlavně jahody a hroznové víno. Dále můţe být ovoce napadeno hnědou hnilobou, která vzniká působením plísně Gleosporium album. U peckového ovoce (švestky, třešně) se můţe objevit monilia-hniloba (sclerotiniahniloba). Tento druh hniloby způsobují druhy rodu Sclerotinia, zejména S. frutigena (konidiová forma Monilia frutigena) a S. laxa (Monilia cinerea). U jádrového ovoce (především u jablek) vzniká působením plísně Penicillium expansum zelenou a modrou hnilobu (penicilinová hniloba). U citrusových plodů způsobují tuto hnilobu P. digatitum a P. italicum. Plíseň rodu Venturia (konidiová forma Fusicladium) vyvolávají skladovou prašivinu. Na kaţení ovoce se mohou podílet další plísně rodu Phytophtora, Aspergillus, Rhizopus a mnoho dalších. U zeleniny se mohou vyskytovat fytopatogenní druhy bakterie rodu Erwina
a
Xanthomonas. Na kaţení zeleniny během skladování se podílí nejčastěji bakterie Enterobacter carotovora, která způsobuje bílou hnilobu, z plísní pak rod Botrytis (B. cinerea a B. allii), rod Sclerotinia (původce bílé hniloby), rod Alternaria (původce černé hniloby) (GÖRNER & VALÍK, 2004). Vlastní ovocná a zeleninová šťáva je výborným růstovým prostředím pro plísně a kvasinky a některé druhy bakterií. Proto se musí dodrţovat přísná sanitace obalových materiálů a nástrojů a přístrojů (plnící přístroj, plnící jehla, zavírač). Z obalových materiálů se nejčastěji pouţívají speciální papírové krabice, které se skládají z několika vrstev, Tetra pack. Tyto obaly chrání před UV zářením a před mikrobiální kontaminací díky hliníkové vrstvě. Aseptičnost při plnění do těchto papírových obalů je zajištěna díky pouţitému peroxidu vodíku, který se potom vypaří. Méně pouţívané obaly jsou plastové a skleněné lahve. U skleněných vratných lahví je ale vyšší riziko kontaminace
28
zbytky sanitačních prostředků nebo láhve nemusí být dostatečně umyty a sterilní, a proto můţe dojít k pomnoţení přítomných mikroorganismů. Asi
nejzávaţnějšími
kontaminanty
ovocných
a
zeleninových
šťáv
jsou
mikroorganismy, které mohou způsobovat kaţení nebo vyvolávat alimentární onemocnění. Kaţení ovocných a zeleninových šťáv je výsledkem mikrobiální aktivity různých druhů mikroorganismů. Je závislé na vnitřních charakteristikách šťáv (aktivita, vody, pH, redox potenciál, přítomnost antimikrobních látek a přítomnost ţivin potřebných pro rozvoj různých mikroorganismů) a vnějších podmínkách (teplota, vlhkost, sloţení atmosférického vzduchu, přístup světla, obalový materiál). Dalšími faktory ovlivňující kaţení potravin jsou způsoby zpracování a konzervace ovocných a zeleninových šťáv (KOMPRDA, 2000). Mezi nejčastější mikroorganismy způsobující kontaminaci šťáv patří plísně rodu Aspergillus, Penicillium, Mucor, Cladosporium a Byssochlamys. Kvasinky a plísně jsou původci kaţení ovocných a zeleninových šťáv. To se projevuje produkcí slizových látek, kyselin (fermentace sacharidů), plynu, alkoholu, změnami chutě, vůně a barvy. Některé plísně jsou producenty toxických metabolitů (mykotoxinů), které jsou hygienicky a zdravotně závadné. K bakteriální kontaminaci přispívají koliformní bakterie z čeledi Enterobacteriaceae, které jsou ukazatelem fekálního znečištění. Další bakterie, které mohou kontaminovat ovocné a zeleninové šťávy jsou bakterie octového kvašení rodu Acetobacter, které vedou k oxidaci etanolu na kyselinu octovou. V zahuštěných ovocných šťávách se můţou pomnoţit bakterie mléčného kvašení rodu Leuconostoc a Lactobacillus, dále Pseudomonas a Salmonella. Zvláštní druh teplomilné bakterie je Alicyclobacillus, která se do šťáv dostává s ovocem kontaminovaným při kontaktu s půdou, způsobující kaţení projevující se nepříjemným pachem a chutí, která ale není zdravotně závadná (KOPÁČOVÁ, 2007).
2.5.1 Kaţení Kaţení ovoce a zeleniny můţe mít mikrobiologické, ale i nemikrobiologické příčiny. Z mikrobiologického hlediska jsou ovoce a zelenina chráněny přírodními obrannými 29
mechanismy a faktory, které jsou druhově specifické a chrání po různě dlouhý čas. Významnou roli mají přitom povrchová pletiva a tvorba antimikrobních látek, které můţou ve významné míře zabránit mikrobiální infekci a jejímu šíření. Organické kyseliny jako kyselina citronová a jablečná sniţují pH ovocných plodů a můţou působit mikrobistaticky (hrušky – pH 4,6-3,8; citrony – pH 2,4-2.2). Kyselina benzoová v brusinkách, kyselina salicylová v hroznu, éterické oleje v citrusových plodech nebo třísloviny v nezralých plodech, mají přímý mikrobicidní účinek.
Vnitřek ovoce je
zpravidla bez mikroorganismů. Ve výjimečných případech můţe dojít ke kontaminaci uţ při oplodnění semena přes pylový otvor. Kdyţ se touto cestou dostanou spory do semeníků jablek nebo hrušek, můţe během skladování vzniknout plesnivění jádřince (GÖRNER & VALÍK, 2004).
2.5.2 Koliformní bakterie Koliformní bakterie se řadí k bakteriím fekálního znečištění a špatné hygieny. Významný výskyt je zejména v půdě a ve vodě. Jako zdroje kontaminace vody při výrobě ovocných a zeleninových šťáv se počítá s čeledí Enterobacteriaceae, zahrnující gramnegativní fakultativně anaerobní střevní tyčinky. K nim se řadí rody Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Schigella a Enterobacter (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). LEWIS et al. (2006) tvrdí, ţe koliformní bakterie se mohou do šťáv dostat nejen z kontaminované vody, ale zdrojem mohou být také mouchy domácí a prach. Zkoumané šťávy ukázaly, ţe jsou potenciálními zdroji E.coli 0157:H7, rody Salmonella, Shigella a Staphylococcus aureus. BAGCI & TERNIZ (2011) zkoumaly mikrobiologickou kvalitu čerstvě vymačkané pomerančové šťávy a zjistili výskyt aerobních a koliformních mikroorganismů v rozsahu 3 aţ 5 log/KTJ . ml-1, respektive deset vzorků z šedesáti obsahovaly různé úrovně počtu E.coli, ale sérovar 0157:H7 a Salmonella nebyly zjištěny v ţádném vzorku. Američtí výzkumníci se zaměřili na zkoumání bezpečnosti pomocí zvyšování kyselosti, kdyţ se vyskytlo onemocnění způsobené E. coli z nepasterované jablečné šťávy (a další způsobené salmonelou z pomerančové šťávy). Do té doby 30
se předpokládalo, ţe pH pod 4,6 k ochraně stačí. Důvodem přítomnosti E. coli ve šťávě zřejmě byla kontaminace ţivočišným trusem, poté, co ovoce spadlo ze stromu. Pro bezpečnou praxi je třeba zpracovávat jen čisté česané ovoce. Šťáva z citrusů je bezpečná, pokud se před extrakcí zdravé zralé plody po načesání omyjí (ANONYM 11). V Indii zkoumala skupina vědců čerstvé ovocné šťávy, které byly prodávány volně na trhu. Z koliformních bakterií izolovaly čtyři různé druhy, tedy Klebsiella pneumonia, Citrobacter
freundii,
Enterobacter
aerogens
and
Escherichia
coli.
Tyto
mikroorganismy jsou vysoce patogenní a mohou způsobovat váţná onemocnění u člověka. Například Klebsiella pneumoniie je původcem infekcí močového traktu (REDDY et al., 2009). Citrobacter freundii pak vyvolává průjmy (ANONYM 12).
2.5.3 Bakterie octového kvašení Z bakterií octového kvašení jsou významné druhy Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti subsp. liquefaciens a Acetobacter pasteurianus. Jedná se o gramnegativní, aerobní tyčinky. Striktně aerobní rod Acetobacter dovede oxidovat ethanol na kyselinu octovou, toho se vyuţívá při výrobě octa. Acetobacter aceti oxiduje i řadu cukrů (glukosu, manosu, galaktosu a některé pentosy) na příslušné kyseliny s karboxylovou skupinou na prvním uhlíku. Tyto bakterie neohroţují lidské zdraví, ale mohou být přítomny v kazícím se ovoci a zelenině (ŠROUBKOVÁ, 1996; KLABAN, 1999). V thajském městě Bangkok sledovali SEEARUNRUANGCHA et al. (2004) výskyt bakterií octového kvašení u různých druhů ovoce (banány, jablka, hrušky, mango, jahody, pomeranče a další). Z bakterií octového kvašení identifikovali pomocí hybridizace DNA tyto druhy: Acetobacter pasteurians, Acetobacter aceti, Acetobacter orientalis,
dále
Gluconobacter
liquefaciens
a
Gluconobacter
hansenii.
Rod
Gluconobacter nemá vliv na lidské zdraví, ale jako kontaminanty ohroţují kvalitu alkoholických i nealkoholických nápojů. Tento rod můţe být původce kaţení jablek a hrušek (VAŘEJKA, 1990; ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
31
2.5.4 Bakterie mléčného kvašení Z těchto bakterií je nejvýznamnějším kontaminantem nealkoholických nápojů Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides patřící k tzv. bakteriím „viskózního“ kvašení. Charakterizuje se tvorbou dextranového slizu. Pokud rostou tyto bakterie v prostředí s fruktosou, produkují sliz sloţený z levulanu. Kontaminuje sirupy a ovocné šťávy, které byly doslazovány kontaminovaným cukrem. Rod Leuconostoc patří do čeledi Lactobacillaceae a řadí se mezi grampozitivní koky sférického nebo ovoidního tvaru seskupené do dvojic nebo řetízků. Buňky se slizovým pouzdrem jsou relativně termostabilní, snáší zahřátí aţ na 80 – 85 °C po dobu 30 minut (VAŘEJKA, 1990; KLABAN, 1999). Bakterie rodu Leuconostoc mohou způsobovat anaerobní odkyselení šťáv, kdy dochází ke štěpení organických kyselin, nejen jablečné, ale i citronové nebo vinné (HORČIN, 2004 b). V praxi se ale vyuţívají bakterie mléčného kvašení jako probiotikum. YOON et al. (2005) ověřovali, zda je zelí vhodnou surovinou pro výrobu probiotické zelné šťávy. Zelná šťáva byla naočkována těmito bakteriemi mléčného kvašení: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei
a Lactobacillus delbruckeii. Obsah všech bakterií
mléčného kvašení po 48 h. inkubaci při 30 °C dosahoval řádu 108 KTJ . ml-1. Po 4 týdnech skladování při teplotě 4 °C byly ţivotaschopné L. plantarum a L. delbruckeii v řádu 107 KTJ . ml-1, ale L. casei nepřeţil nízké pH zelné šťávy.
2.5.5 Plísně Obecná charakteristika byla uvedena dříve v bakalářské práci. Plísně se vyskytují nejen na povrchu potraviny, ale mohou prorůstat i do celé potraviny, v případě ovocných a zeleninových šťáv je to prorůstání pod hladinu. Plísně jsou charakterizovány tvorbou bělavých povlaků, které časem mění barvu na šedozelenou aţ černou a jsou provázeny typickým zápachem. Někdy je vidět plíseň jen na povrchu potraviny, tady je důleţité vědět, ţe po odstranění viditelné části plísně je moţný výskyt plísní i v hlubší vrstvě potraviny nebo nápoje. Typické je to u marmelád a kompotů. Opakovaná konzumace zaplísněných potravin můţe mít karcinogenní účinek.
32
Potravinářsky významné plísně lze rozdělit do čtyř tříd, a to do třídy Ascomycetes, Zygomycetes, Deuteromycetes (Fungi imperfecti) a Basidiomycetes. Nejpočetnějším rodem třídy Ascomycetes je rod Penicillium, který zahrnuje asi 150 druhů. Tvoří kolonie s velkým mnoţstvím ţlutozelených aţ modrozelených konidií, které jsou na různých potravinách a jiném materiálu patrné jako zelené, sametové aţ moučené povlaky. Nejdůleţitější plísní je Penicillium
expansum (dříve Coremium
glaucum nebo Coremium vulgare), která je hlavní příčinou ztrát při skladování ovoce (jablek, hrušek, hroznů, třešní) a jejich zelené hniloby. Poškozené plody vykazují zápach, duţina ovoce měkne a přechází ve světlehnědou aţ šedohnědou slizkou hmotu. Někdy můţe dojít aţ ke svraštění povrchu ovoce, který je pokryt zelenomodrými výtrusovými polštářky. U přezrálých nebo nedozrálých plodů jsou napadeny vnitřní části jádřincovou chorobou, která znehodnocuje ovoce jak chuťově, tak pachově. Jsou schopny produkovat celulolytické enzymy podporující destruktivní činnost této plísně. Kolonie jsou buď zrnité, nebo vytvářejí zřetelné drobné svazky konidioforů (POLSTER, 1971; MÜLLER, 1983; ŠROUBKOVÁ, 1996; KLABAN, 1999). Ve vzorcích pomerančové šťávy byly z rodu Penicillium identifikovány tyto druhy: P. citrinum, P. digitatum a P. italicum (WYATT et al., 1995). Skladované ovoce a zelenina (jablka, hrušky, vinná réva, rajčata) mohou být napadeny plísní Penicillium aurantiogriseum a Penicillium brevicompactum. Mezi kontaminanty citrusových a ovocných dţusů patří Penicillium crustosum a Penicillium italicum (MALÍŘ, 2003). Dalším početným rodem třídy Ascomycetes je rod Aspergillus Nejznámější je Aspergillus niger, která se můţe nalézt jako kontaminant jablek, hrušek, broskví, jahod ale i citrusů nebo čerstvé zeleniny. Aspergillus flavus je schopný produkovat mykotoxiny a můţe se objevit na čerstvém ovoci, rajčatech, citrusech a ananasu. Z rodu Aspergillus se můţe vyskytovat v pasterovaném ovocném dţusu, v sirupu i v čerstvém ovoci (jahody) Neosartorya fischeri. Rajčata mohou být napadena plísní Aspergillus aculeatus.
Zelenina
můţe
být
kontaminována
plísní
Aspergillus
fumigatus
(ŠROUBKOVÁ, 1996; KLABAN, 1999; MALÍŘ, 2003). Z řádu Eurotiales je neméně významný rod Byssochlamys, jehoţ kmeny jsou obzvláště odolné tepelným změnám a často přeţijí i proces pasterace, tím způsobují kaţení kompotů. Zvláště askospory Byssochlamys fulva jsou rezistentní vůči teplu i oxidu siřičitému (SO2). Vědci z Brazílie potvrdili pomocí HPLC, ţe Bysochlamys fulva je schopna tvořit patulin (SANT´ANA et al., 2010). 33
Plíseň Talaromyces bacillisporus můţe kontaminovat pasterovaný dţus. Podobným kontaminantem tepelně ošetřených dţusů je Talaromyces macrosporus. Plíseň Talaromyces flavus se objevila v různých ovocných šťávách, ale i v syrovém ovoci těsně po sběru. Talaromyces avellaneus byla izolována z jahodových kompotů (POLSTER, 1971; PIECKOVÁ, 1998; MALÍŘ, 2003). Talaromyces avellaneus je termorezistentní. VOLDŘICH et al. (2004) zkoumali vliv ošetření vysokým tlakem na přeţití vegetativních buněk T. avellaneus. Vegetativní buňky byly velmi citlivé na vysoký tlak. Stačilo ošetření tlakem 200 MPa při 17 °C po dobu 60 min, aby došlo ke sníţení o šest řádů. V jablečné šťávě byly askospory T. avellaneus relativně odolné vůči vysokému tlaku. Zjistilo se, ţe ke sníţení o šest řádů je potřeba pouţít tlak 600 MPa při 60 °C po dobu 60 min. Z třídy Deuteromycetes (houby nedokonalé) se můţe objevit v ovocných dţusech rod Fusarium, který způsobuje i kaţení ovoce (jablka, banány, ananas, citrusy). Například F. acuminatum, F. equiseti, F. oxysporum, F. semitectum nebo F. moniliforme (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; MALÍŘ, 2003). U jablečného dţusu a kyselých produktů z ovoce (jablka, višně) se můţe vyskytnout Cladosporium herbarum, u které ale není doloţena produkce mykotoxinů. Zejména u jablek způsobuje tzv. melanózu (čerň), tím je znehodnocuje i jako materiál pro výrobu moštů (JESENSKÁ, 1993; KLABAN, 1999; MALÍŘ, 2003). Nepočetnější skupinou třídy Zygomycetes je řád Mucorales. Tento řád má asi 39 rodů, z nichţ rod Mucor zahrnuje přes 100 druhů. Na ovoci a zelenině tvoří vláknitý, většinou bělavý povlak s kulovitými našedlými nebo nahnědlými sporangii. V hyfách tvoří tmavě zbarvené (do zelena) chlamydospory. Zejména M. piriformis a M. plumbeus se mohou vyskytnout v jablečném dţusu, dále na jahodách a hruškách. M. piriformis je původcem červené hniloby u jablek a hrušek. M. mucedo jsou schopny růst na zralém měkkém ovoci v relativně širokém rozmezí teplot, a to od 0 do 25 °C. M. racemosus byl nalezen na měkkém ovoci a v ovocných šťávách.
Kaţení ovoce a jiných potravin
způsobují rod Rhizopus (R. stolonifer = R. nigricans, R. oryzae). Tento rod tvoří některé druhy mykotoxinů (ANONYM 13; ANONYM 14, MÜLLER, 1983; JESENSKÁ, 1993; ŠROUBKOVÁ, 1996). Američtí vědci provedli rozbor 65 vzorků nepasterované ovocné a zeleninové šťávy (jablko, mrkev, grep, pomeranč, hroznová šťáva, jablečný mošt a sojové mléko) na plísňovou a kvasinkovou kontaminaci. 22 % vzorků šťáv bylo kontaminováno plísněmi. 34
Nejvíce kontaminovaná byla pomerančová šťáva, naopak nejméně byla jablečná a
hroznová
šťáva.
Z plísní
byly
izolovány
rod
Penicillium,
Fusarium
(1,70 a 1,60 log 10 KTJ . ml-1) a Geotrichum v grapefruitové šťávě. Kromě plísní převládaly ve šťávách kvasinky v rozsahu od <1,0 do 6,83 log10 KTJ . ml-1. Z kvasinek se zde vyskytovaly Candida lambica, Candida saké a Rhodoturula rubra. Příčina kontaminace můţe být v nedostatečné pasteraci nebo v důsledku kontaminace po pasteraci během chlazení, skladování nebo stáčení. Proto by se mělo dbát na důkladnou pasteraci a balení těchto šťáv za přísných aseptických podmínek (TOURNAS et al., 2006).
2.5.6 Kvasinky Kvasinky se řadí mezi heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náleţící mezi houby (Fungi). Vyznačují se schopností zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý. Patří mezi saprofytické organismy, které se vyskytují často na cukerných substrátech, na ovoci (KLABAN, 1999; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Dle způsobu rozmnoţování se kvasinky člení do třech hlavních skupin. První skupinu zahrnují rody tvořící askospory, které se řadí mezi Ascomycotina. Sem patří nejvýznamnější kontaminant ovocných a zeleninových šťáv způsobující jejich kaţení rod Saccharomyces, který zkvašuje cukry. Tento rod nikdy nevyuţívá laktózu jako zdroj uhlíku ani dusičnany jako zdroj dusíku. Tvoří většinou elipsoidní nebo protáhlé buňky. Nejdůleţitější je Saccharomyces cerevisiae uplatňující se jako pekařská, lihovarská, vinařská nebo tzv. „svrchní“ pivovarská kvasinka. Zkvašuje glukosu, sacharosu, maltosu a galaktosu. Ovocné mošty zkvašují Sacch. vini a Sacch. pomorum (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990, ŠROUBKOVÁ, 1996). V pomerančové šťávě byly nalezeny Sacch. cerevisiae a Sacch. unisporus (LAS HERAS-VACQUEZ et al., 2003). V koncentrovaných šťávách se můţe vyskytnout Sacch. bailii var. osmophilus, která roste v prostředí s 60 % sacharózy. V koncentrovaných ovocných šťávách s vysokým obsahem cukru mnohé kvasinky nerostou. Ale zředěné šťávy s obsahem cukru 30 % mohou rychle zkvasit a vytvořit 10 aţ 13 obj. % alkoholu. Proto je dobré tyto šťávy co nejdříve zpracovat (KOCKOVÁ – KRATOCHVÍLOVÁ, 1980). Vedle rodu 35
Saccharomyces byly identifikovány v nealkoholických nápojích i rody Endomycopsis a Debaryomyces (JESENSKÁ, 1993). Do této skupiny patří i rod Pichia, má nízké kvasné schopnosti, neboť jeho druhy zkvašují, buď jen glukosu, nebo nezkvašují ţádný cukr. Tvoří křís (křehkou vzlínavou blanku na povrchu kapaliny, proto patří mezi křísovité druhy. Mezi tyto druhy se řadí i rod Hansenula, který na rozdíl od rodu Pichia vyuţívá dusičnany jako zdroj dusíku. (Šilhánková, 2002) Z tohoto rodu byly izolovány v pomerančové šťávě P. anomala a P. fermentans (LAS HERAS-VACQUEZ et al., 2003). Kvasinka Schizosaccharomyces acidovoratus způsobuje štěpení kyseliny jablečné v ovocných šťávách při teplotě okolo 15 °C za účasti kyslíku. Optimální pH odpovídá pH ovocných šťáv – kromě hruškové (HORČIN, 2004 b). Do druhé skupiny kvasinek patří rody tvořící bazidiospory neboli bazidiomycetní kvasinky, spadající mezi Basidiomycotina. Zástupci rodu Rhodoturola nevykazují ţádné kvasné schopnost (JESENSKÁ, 1993). Rhodoturula mucilaginosa se můţe nacházet v pomerančové šťávě, dále Rhodoturola rubra byla izolována v jablečné šťávě (LAS HERAS-VACQUEZ et al., 2003; BRUGNONI et al., 2007). Třetí skupinu uzavírají rody, u nichţ není známá tvorba pohlavních spor. Řadí se mezi Deuteromycotina. Hlavní zástupce této skupiny je rod Candida, jenţ se taxonomicky řadí mezi ascomycety. Počáteční spontánní mikroflóru moštu tvoří Kloeckera apiculata (nesporulující forma rodu Hanseniospora), jehoţ význam spočívá v rychlém rozkvašení samovolně kvasících moštů. Rod Kloeckera snáší velmi kyselé prostředí, tudíţ se vyskytuje na nezralých hroznech (KLABAN, 1999). Další kvasinky, které byly izolovány v nealkoholických nápojích, jsou rody Trichosporon, Rhodotorula a Bretanomyces (JESENSKÁ, 1993). V jablečné šťávě byly izolovány Kluyveromyces marxianus, Candida krusei, Zygosaccharomyces sp. (BRUGNONI et al., 2007). Z pomerančové šťávy byly identifikovány pomocí technik PCR (polymerázové řetězové reakce) tyto kvasinky: Candida tropicalis, Clavispora Lusitaniaea, Hansenispora uvarum a Trichosporonasahii (LAS HERAS-VACQUEZ et al., 2003).
2.6
Mykotoxiny
Mykotoxiny jako nízkomolekulární sekundární metabolity mikromycetů (vláknitých hub, plísní) nebílkovinné povahy, patří mezi významné naturální (přírodní) toxiny 36
v potravinách a jsou původci mykotoxikóz. Jedná se o organické sloučeniny bez přímé role v hlavních metabolických drahách (nemají přímý vliv na růst, vývoj a rozmnoţování organismu) V současné době existuje přes 400 mykotoxinů, které produkuje asi 150 druhů hub. Neustále jsou objevovány a chemicky charakterizovány další a další mykotoxiny (POUZAR, 2012). Dle výskytu se mohou dělit na exomykotoxiny (většina mykotoxinů, které pronikají do potraviny a zůstávají v ní i po odstranění myceliální části plísně) a endomykotoxiny. (zůstávají přímo v plísni nebo v jejich sporách. Častější rozdělení je dle toxicity k cílovým
orgánům
-
hepatotoxiny,
nefrotoxiny,
toxiny
GIT,
neurotoxiny,
dermatotoxiny, estrogeny, imunotoxiny, hematotoxiny, genotoxiny. V potravinách se mohou mykotoxiny vyskytnout během kaţení potravin plísněmi, které jsou producenty mykotoxinů. Dále se do potravin mohou dostat zpracováním surovin obsahující mykotoxiny (VLKOVÁ, 2009). Přítomnost plísní však nezaručuje produkci mykotoxinů. Naopak mykotoxiny mohou zůstávat v potravině i po odstranění plísní. Optimální teplota pro produkci mykotoxinů se pohybuje mezi 4 aţ 40 °C, optimální pH je 5 aţ 7. Neméně důleţitá pro produkci mykotoxinů je aktivita vody (a w), která se pohybuje mezi 0,8 aţ 0,85. Důleţitá je vlhkost substrátu (minimálně 14 %) a vlhkost vzduchu (minimálně 65 %) Na produkci mykotoxinů má vliv i obsah soli (do 14 %) a obsah cukru v potravině (do 50 % sacharosy – platí pro Aspergillu flavus). Inhibiční účinky na produkci mykotoxinů mají i některé sloţky koření (eugenol, tymol, anetol). Mykotoxiny často odolávají vyšším teplotám a kuchyňským úpravám (MALÍŘ, 2003). Růst plísní je moţný redukovat přídavkem organických kyselin, zejména kyseliny propionové (VLKOVÁ 2009). „Zelenina sklízená ke krmným a nutričním účelům vţdy obsahuje spóry toxikogenních plísní, ale nízká vodní aktivita těchto produktů naštěstí zabraňuje jejich rozvoji“ (VLKOVÁ, 2009).
2.6.1 Aflatoxiny Aflatoxiny patří k nejnebezpečnějším a nejjedovatějším druhům mykotoxinů, které se nejčastěji vyskytují v surovinách dováţených z tropických oblastí, kde jsou optimální podmínky pro růst plísní a produkci těchto mykotoxinů (vyšší teplota, vyšší vlhkost, 37
nedostatečná hygiena). Aflatoxiny jsou produkované toxigenními kmeny Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G), A. argeninicus a A. nomius (ANONYM 15). Aflatoxiny jsou produkovány i dalšími příslušníky rodu Aspergillus: A. clavatus, A. fumigatus, A. mangini, A.niger, A. ochrancens, A. ostianus, A. ruber, A. wentii. Z přibliţně 20 druhů aflatoxinů jen čtyři byly objeveny v potravinách (B1, B2, G1 a G2). Aflatoxiny byly nalezeny i u celé řady plísní rodu Penicillium (P. expansum, P. frequentans, P. puberulum, P. variabile), dokonce i u rodu Rhizopus a Mucor (POLSTER, 1971; KLABAN, 1999). Aflatoxiny
jsou
termorezistentní,
částečně
inaktivované
působením
teplot
100-120 °C, při sterilaci a mraţení potravin. Nejsou původci akutních otrav, ale vykazují značnou karcinogenitu, zejména v játrech (cirhózy a fibrózy), dále mohou vykazovat i teratogenní účinky (VLKOVÁ, 2009). Nejtoxičtější aflatoxin je G2, jehoţ LD50 je 3,45 mg . kg-1. K nejméně toxickým aflatoxinům patří B1, G1.. Avšak aflatoxin B1 je nesilnější známý přírodní karcinogen (hepatokarcinogen), který se vyskytuje zejména v arašídech, kukuřici, v různých druzích ořechů nebo v česneku. Jako LD50 (letální dávka) se uvádí hodnoty od 0,3 – 0,9 mg . kg-1, která vedou do tří dnů aţ ke smrti. Aflatoxiny se hromadí v játrech, kde jsou ukládány nebo jsou vylučovány močí a stolicí (POLSTER, 1971, MALÍŘ, 2003). Legislativně je sledován pouze B1 (VLKOVÁ, 2009). Nejčastější výskyt aflatoxinů je u obilnin a výrobků z nich, z ostatních semen (ořechů) a výrobků z nich, a v ostatních produktech (brambory, víno, koření, marmelády). Mimo to byly aflatoxiny nalezeny v uměle infikovaných potravinách, a to v ovocných šťávách, rajské šťávě a protlaku. Aflatoxin G2 byl identifikován v pomerančích a citronech (POLSTER, 1971; MALÍŘ, 2003). V Ázerbájdţánu byla nalezena velká mnoţství aflatoxinů v ovocných šťávách a dţemech (SEYIDOVA, 2008). U nás je díky dodrţování hygieny málo pravděpodobné, ţe by se aflatoxiny vyskytovaly v ovocných a zeleninových nápojích.
38
2.6.2 Patulin Patulin (PAT) je mykotoxin, který produkuje více neţ 60 druhů plísní patřících do 30 rodů. Hlavními producenty PAT jsou plísně Penicillium expansum, Penicillium griseofulvum (dále i P. claviforme, P. patulum), Aspergillus clavatus a Byssochlamys nivea i Byssochlamys fulva. Patulin jsou schopné produkovat i některé kmeny Paecilomyces varioti. Představují tak závaţné riziko pro zdraví člověka. Plísně produkující PAT nejvíce napadají jádrové ovoce a peckoviny a to zejména po sklizni. První izolace patulinu (dříve clavatin, expansin) proběhla ve 40. letech 20 století. V této době se začal patulin pouţívat jako antibiotikum. Později se ale zjistily toxické vlivy nejen na bakterie, ale také na rostliny a zvířata (ŠIMŮNEK, 2004; MODRÁ, 2009; VLKOVÁ, 2009). Dle WHO (1996) jsou hlavními projevy krátkodobého působení patulinu zejména křeče, dušnost, plicní edém, poškození trávicího traktu, zvracení. Patulin má imunosupresivní účinky a po opakovaném příjmu organismem můţe vyvolat poškození jater a sleziny. Dále byly popsány neurotoxické a mutagenní účinky. Působí karcinogenně (zejména růst fibrosarkomů – zhoubných nádorů z vazivové tkáněú, vyvolává gastrointestinální poruchy, otoky a krvácení různých orgánů. Dále byly zjištěna neurotoxicita, imunotoxicita, genotoxicita a teratogenita (KLABAN, 1999; MALÍŘ, 2003; MODRÁ, 2009; VLKOVÁ, 2009). U jablečné šťávy byl zjištěn obsah patulinu 150 µg . kg-1 při skladování při teplotě 21 °C a 220 µg . kg-1 při 30 °C, jehoţ producenti byly Byssochlamys fulva a nivea (SANT´ANA et al., 2010). Vitamin C v ovoci zamezuje rozkladu patulinu při tepelném opracování kompotů, dření a moštů, přičemţ čistý patulin se rozkládá při 80 °C. Patulin je jeden z mála dobře detoxikovatelných mykotoxinů. Podstatou detoxikace je reakce patulinu s -SH skupinami (například thioglykolát). Rozklad patulinu je moţný i během alkoholového kvašení (KUBÁŇ, 2007). Často se patulin vyskytuje v jablečném pyré z nahnilých jablek. Při teplotě 120 °C po dobu 20 minut se sníţil obsah patulinu o 93 % v kontaminovaném pyré (MODRÁ, 2009). Stanovení patulinu je zaloţeno na extrakci kapalina-kapaliny nebo extrakci na pevné fázi. Jako extrakční činidlo se můţe pouţít ethylacetát. V extraktu se pak patulin stanoví HPLC s UV detekcí, protoţe molekula patulinu má výrazné absorpční spektrum.
39
Selekčně detekční metoda vhodná pro stanovení patulinu je hmotnostní spektrometire, MS (KUBÁŇ, 2007). Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC) zařadila PAT do skupiny 3, mezi látky “neklasifikovatelné z hlediska karcinogenních účinků na člověka”. Evropská komise stanovila limity pro patulin v potravinách v nařízení (ES) 1881/2006 (viz tabulka 1).
Tab. 1: Maximální limity pro patulin v potravinách (dle Nařízení ES 1881/2006)
Maximální limity
Potraviny
(µg . kg -1) Ovocné šťávy, rekonstituované koncentrované ovocné šťávy a
50
ovocné nektary Lihoviny, jablečné víno a jiné fermentované nápoje získané z
50
jablek nebo obsahujících jablečnou šťávu Pevné výrobky z jablek, včetně jablečného kompotu a jableč-
25
ného pyré určené k přímé lidské spotřebě Jablečná šťáva a pevné výrobky z jablek, včetně jablečného
10
kompotu a jablečného pyré, pro kojence a malé děti, takto označené a prodávané
Patulin je odolný vůči teplu, a proto vykazuje rezistenci k procesům pouţívaným při průmyslové výrobě ovocných výrobků. Přítomnost PAT v komerčních ovocných šťávách se povaţuje za parametr, který ukazuje na kvalitu pouţité suroviny. V Itálii provedli studii, v rámci které se sledovala přítomnost patulinu v ovocných šťávách a posuzovalo se riziko z PAT pro všechny skupiny populace. Celkem bylo analyzováno 35 jablečných šťáv, 35 šťáv ze směsi ovoce a 35 hruškových šťáv vyrobených různými italskými a evropskými firmami. Obsah PAT v těchto šťávách ukazuje tabulka č. 2.
40
Tab. 2: Obsah patulinu ve šťávách (Kvasničková, 2010) Obsah patulinu ((µg . l-1)
Průměrný obsah patulinu (µg . l-1)
Jablečná
6 – 30
18
Směs ovoce
1 – 45
23
Hrušková
5 – 92
43
Šťáva
U hruškové šťávy přesáhlo 14 vzorků z 35 testovaných šťáv limit 50 µg . l-1 stanovený Evropskou komisí v nařízení 1881/2006. Limit 50 µg . l-1 pro PAT v ovocných šťávách uvedený v nařízení 1881/2006 se týká dospělých osob (o hmotnosti 70 kg). Niţší limity PAT ve výrobcích pro děti jsou stanoveny pouze pro jablečnou šťávu, jablečný kompot a jablečné pyré. Pro šťávy z ostatních druhů ovoce, které děti rovněţ konzumují, jsou limity kontaminantů v potravinách stejné jako pro dospělé osoby. Nebere se do úvahy fakt, ţe dětští spotřebitelé ještě nedosáhli hmotnosti 70 kg a ţe metabolismus dětí není schopný zajišťovat odpovídající detoxikaci organismu (KVASNIČKOVÁ, 2010). Byly zkoušeny metody deoxifikace patulinu na méně toxickou kyselinu desoxypatulinovou za aerobních podmínek pomocí kvasinek kmene Rhotosporidium kratochvilovae LS11 (NEHASILOVÁ, 2012).
2.6.3 Další mykotoxiny v ovocných a zeleninových nápojích V jablečném moštu a rajčatovém protlaku byly prokázány poměrně vysoké koncentrace alternárivých mykotoxinů (produkce plísní rodu Alternaria) - alternariolu, alternariolu etyléteru a kyseliny tenuazonové. V jablkách byla zjištěna během růstu přirozená kontaminace alternariolem ve výši 5,88 mg na 100 g (JESENSKÁ, 1993; MALÍŘ, 2003). Dále se tyto mykotoxiny mohou vyskytovat v citrusových plodech (mandarinky, pomeranč, citrón), melounech a jahodách. Alternariol se vyskytoval dále v hroznové šťávě, brusinkovém a švestkovém nektaru, malinovém dţusu. (OSTRÝ et al., 2008) Skupina vědců sledovala výskyt kyseliny tenuazonové v 50 vzorcích ovocných šťáv pomocí stabilního izotopu ředící metodou (SIDA) a zjistili pozitivní vzorky v 86 % (ASAM et al., 2012). 41
V zelenině se vyskytuje hlavně ochratoxin A, který je produkován určitými kmeny plísní Aspergillus ochraceus, také i vzácnějšími druhy Aspergillus melleus a Aspergillus sulphureus. Tento mykotoxin jsou schopny produkovat i plísně Penicillium variabile a Penicillium viridicatum. Výskyt ochratoxinu A byl potvrzen v grepové šťávě (ARPAI, 1977; KLABAN, 1999; MALÍŘ, 2003). V citrusových plodech byl nalezen ochratoxin A, který je produkován P. viridicatum, P. cyclopium, P. variable a dalšími druhy (VLKOVÁ, 2009). Ochratoxin se můţe vyskytnout i v hroznech vinné révy či ve vínu jako takovém. Rod Aspergillus je schopen produkce při relativně vysoké teplotě (15-37 °C). Naopak Penicillium viridicatum produkuje ochratoxiny při chladničkové teplotě, kolem 4 °C (MODRÁ, 2009). V hroznech byly izovolány následující plísně, které produkovaly ochratoxin: A. ochraceus, A. carbnarius, A. section, A. niger, A. tubingensis, A.steynii (AMÉZQUETA et al., 2012). Hořkou chuť jablek můţe způsobovat mykotoxin trichothecin a jiné mykotoxiny, které produkuje Trichothecium roseum (JESENSKÁ, 1993). V hroznovém a grepovém moštu byl nalezen mykotoxin sterigmatocystin, který je meziproduktem biosyntézy aflatoxinu B1. Jeho toxické účinky jsou stejné, ale méně akutně toxické. Sterigmatocystin vykazuje hepatotoxický, nefrotoxický, karcinogenní, mutagenní a teratogenní účinek (MALÍŘ, 2003).
42
2.7
Faktory ovlivňující výskyt a rozvoj mikroorganismů
Ovoce a zelenina a z ní získané šťávy jsou velmi dobrým prostředím pro růst a mnoţení mikroorganismů. Proti průniku mikroorganismů slouţí různé obranné mechanismy. Pokud dojde k jejímu průniku do ovoce a zeleniny a následně do jejich šťáv, je jejich rozvoj ovlivňován řadou faktorů. Rozlišujeme vnitřní faktory, kde patří pH, aw, Eh, ale i sloţení a enzymová aktivita potravin, a vnější faktory, kam patří, v rámci technologie výroby, balení, distribuce a skladování šťáv, teplota, relativní vlhkost prostředí, přítomnost a koncentrace plynů a přítomnost a aktivita mikroorganismů (VLKOVÁ, 2009).
2.7.1 Vnitřní faktory Mezi vnitřní faktory, které mohou ovlivňovat výskyt a rozvoj mikroorganismů patří: aktivita vody (aw) Míra vyuţitelnosti vody pro mikroorganismy se vyjadřuje jako vodní aktivita (aw) nebo dostupná voda. Vodní aktivita roztoku se rovná poměru tlaku vodní páry nad roztokem ku tlaku vodních par nad destilovanou vodou za stejných podmínek. Optimální hodnoty vodní aktivity pro růst bakterií se pohybují v rozmezí 0,99 aţ 0,91, přičemţ gram negativní jsou na vlhkost náročnější neţ bakterie gram pozitivní. Halofilní bakterie jsou ty, které rostou i při hodnotách okolo 0,75 %. Plísně a kvasinky snášejí niţší vlhkost prostředí neţ bakterie. Optimální hodnota pro mnoţení kvasinek v potravinách se pohybuje mezi 0,91 aţ 0,88, pro plísně v rozmezí 0,85 aţ 0,61. Vysoký obsah vody umoţnuje rychlé pomnoţení přítomné mikroflóry, která můţe vést ke kaţení. V rámci ovocných a zeleninových nápojů by se mohlo jednat zejména o pomnoţení kvasinek s následným alkoholovým kvašením (ROP & HRABĚ., 2005; VLKOVÁ, 2009). Sniţování aktivity vody je vhodný způsob konzervace pro sníţení počtu mikroorganismů. Toho lze dosáhnout dvěma způsoby, a to odstraněním vody sušením nebo odpařením či zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí přídavkem vhodných látek, například sacharóza, chlorid sodný (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
43
pH Aktivní kyselost neboli pH se rozumí záporně vzatý dekadický logaritmus koncentrace H+ iontů. Ionty OH- způsobují alkalitu prostředí. Jsou-li obojí ionty přítomny ve stejné koncentraci, je prostředí neutrální. U šťáv se pH pohybuje v rozmezí 2,6 – 3,8, tímto pH spadá z technologického hlediska do kategorie technologicky kyselých potravin. Hodnota pH ovlivňuje mikroorganismy dvěma způsoby, a to ovlivněním funkce mikrobiálních enzymů a transportem ţivin do buňky. Nekyselá zelenina je lepší hostitelem bakterií neţ kyselé ovoce, na kterém se spíše udrţují plísně a kvasinky (KYZLINK, 1988). Většina bakterií a kvasinek roste v rozmezí hodnot pH poměrně úzkém, pro mikromycety je naopak široké. Mikromycety jsou schopné růstu i za velmi extrémních podmínek. Většina bakterií roste při neutrálním nebo slabě kyselém pH. Pro růst kvasinek je optimální mírně kyselé prostředí (optimu pH kolísá mezi 4,2 a 5,5), naopak ve slabě zásaditém pH (okolo 7,5) je jejich aktivita značně omezena nebo je inhibován růst. Optimální pH pro růst plísní je neutrální, ale plísně jsou schopné růst i v rozmezí pH 1,2 aţ 11,0. V kyselém prostředí se dobře rozmnoţují plísně produkující organické kyseliny - rod Penicillium, Aspergillus (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; ROP & HRABĚ, 2005; VLKOVÁ, 2009). oxidačně – redukční potenciál (Eh) Oxidačně – redukční (redoxní) potenciál potravin je dán sloţením a hodnotou pH, hodnotu atmosférického tlaku a přístupem vzduchu k potravině. Ţivé organismy mají jasný řád přenosu elektronů a vodíku v elektrotransportním řetězci. Schopnost přijímat nebo darovat elektrony, to je oxidovat nebo redukovat je vyjádřena redoxpotenciálem Eh (ANONYM 16). Definuje se jako záporný logaritmus tlaku vodíku, jímţ by musela být nasycena platinová elektroda, aby byla stejně redukčně účinná jako zkoumané prostředí. Vliv prostředí je dán přítomností oxidačních (kyslík, peroxidy, dusičnany, ţelezité ionty) a redukčních činidel (ţeleznaté iony a vodík). Redoxní potenciál je měřen v mV jako rozdíl potenciálu mezi platinovou elektrodou umístěnou do měřeného prostředí a standardní vodíkovou elektrodou. Například čerstvé ovoce a zelenina má hodnotu redoxního potenciálu + 350 mV. Aeorbní mikroorganismy rostou optimálně při hodnotách Eh od + 100 do + 500. Fakultativně anaerobní mikroorganismy tolerují pozitivní i negativní redoxní potenciál. (Staphylococcus aureus se mnoţí při Eh od – 200 do + 200). Anaerobní mikroorganismy rostou při Eh okolo – 300 a kyslík je většinou pro 44
ně toxický. Nepřímý vliv na potlačení růstu kvasinek má dostatečný přídavek kyseliny askorbové, která váţe přítomný kyslík v nápoji. Cílem je minimalizovat přístup kyslíku při plnění, proto se provozuje aseptické plnění a balení (HRUDKOVÁ, 1989; ŠILHÁNKOVÁ 2002; VLKOVÁ 2009). obsah ţivin Koncentrace klíčových ţivin můţe do určité míry ovlivnit rychlost růstu mikroorganismů. Vztah mezi rychlostí růstu a koncentrací ţiviny určuje Monodova rovnice, která odráţí závislost mikrobiálního růstu na rychlost limitující enzymové reakci. Mikroorganismy potřebují ke svému růstu zejména vodu, zdroj energie (cukry, alkoholy, aminokyseliny), zdroj dusíku (aminokyseliny), vitaminy (skupiny B) a růstové faktory a minerální látky - anorganické soli (ANONYM 16; CEMPÍRKOVÁ et al, 1997). přítomnost antimikrobiálních látek v ovoci a zelenině Přirozený výskyt antimikrobiálních látek v ovoci a zelenině vede ke zvýšení odolnosti vůči neţádoucí činnosti mikroorganismů. Rozlišujeme látky mikrobistatické, které pouze
zastavují
rozmnoţování
mikroorganismů
a
látky
mikrobicidní,
které
mikroorganismy přímo usmrcují. Mezi látky s antimikrobiální aktivitou patří například fenolové sloučeniny, terpenoidní látky, dusíkaté heterocyklické sloučeny. V některé zelenině (kapusta, brokolice) se nacházejí glukosinoláty, které způsobují mechanické poškození buněk. Hroznové víno obsahuje resveratrol. Přítomnost antimikrobiálních látek se vyuţívá zejména v koření. (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997; VLKOVÁ, 2009). biologická struktura ovoce a zeleniny Ovoce a zelenina jsou chráněny proti pronikání mikroorganismů díky svým přirozeným obalům. Jedná se o mechanické bariéry, například slupky ovoce. Ovoce a zelenina s porušenou slupkou podléhá kaţení mnohem rychleji neţ s neporušenou slupkou. Zachované buněčné struktury také slouţí k ochraně před pronikáním mykotoxinů produkovaných plísněmi, které se mohou mnoţit na povrchu ovoce a zeleniny. Tkáně ovoce a zeleniny bývají sterilní, ale někdy mohou mikroorganismy pronikat cestou cévních svazků do lodyh, listů a plodů. Je třeba počítat s tím, ţe i čerstvá dobře vyhlíţející zelenina obsahuje mikroorganismy. Velké mnoţství bakterií, kvasinek a spor
45
plísní je na povrchu zeleniny a samozřejmě v půdě, která ulpívá na hlízách a kořenech (ANONYM 17; VLKOVÁ, 2009).
2.7.2 Vnější faktory K vnějším faktorům ovlivňující výskyt a rozvoj mikroorganismů se řadí: teplota Největší význam z vnějších faktorů na růst mikroorganismů má právě teplota, zvláště pak teplota skladování. Mikroorganismy mají pro svůj růst různé teplotní optimum. Proto se podle teploty potřebné k růstu dělí mikroorganismy na psychrofilní, psychrotrofní, mezofilní a termofilní. Jejich teplotní nároky jsou uvedeny v tabulce 3. Některé plísně mohou růst i při teplotách – 10 °C díky vnitrobuněčném osmotickému tlaku. Podle toho lze nastavit správnou teplotu při výrobě nebo skladování potravin. Například pro skladování ovoce a zeleniny se většinou vyţaduje skladovací teplota v rozmezí 10 aţ 17 °C (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; VLKOVÁ, 2002). Zvýšené teploty (pasterace do 100 °C, sterilace nad 100 °C), které vedou k usmrcení většiny mikroorganismů nebo k inaktivaci jejich enzymů, nebo naopak chladírenské teploty či mraţení, které spíše činnost mikroorganismů potlačují, se vyuţívá v potravinářství za účelem prodlouţení trvanlivosti. Tab. 3: Rozdělení mikroorganismů dle jejich teplotních nároků (VLKOVÁ, 2009) Skupina mikroorganismů
Teplota (°C) Minimum
Optimum
Maximum
Psychrofilní
0 a méně
10 aţ 15
20
Psychrotrofní
0 aţ + 7
20 aţ 30
35
Mezofilní
20
30 aţ 40
45
Termofilní
45
55 aţ 65
90
relativní vlhkost prostředí (R. V.) Relativní vlhkost prostředí (R. V.) má význam jak z hlediska aktivity vody uvnitř potraviny, tak i z hlediska růstu mikroorganismů na jejím povrchu. Čím vyšší je teplota, 46
tím niţší musí být relativní vlhkost a naopak. Vysoká R. V. spolu s vysokou teplotou je ideální prostředí pro rozvoj plísní a následné tvorby sekundárních metabolitů (mykotoxinů). Ideální by bylo vhodné skladovat potravinu s aw = 0,6 při R. V. = 60, aby nedocházelo ke zvýšení aktivity vody, a tím k intenzivnímu pomnoţení mikroorganismů. Pokud je vyţadováno prostředí s nízkou R. V., je nutná řízená atmosféra (VLKOVÁ, 2009). přítomnost a koncentrace plynů Nejčastěji se z plynů vyuţívá pro řízenou atmosféru kombinace CO2, O2 nebo N2. Řízená atmosféra s nejvhodnějším sloţením plynů pro danou potravinu se pouţívá proti rozvoji mikroorganismů na povrchu potravin, v našem případě na povrchu ovoce a zeleniny. Prostředí řízené atmosféry tak brání růstu zejména aerobních bakterií, plísní a kvasinek. K prodlouţení trvanlivosti se pouţívá také vakuové balení. Pro skladování ovoce a zeleniny je účinná zvýšená koncentrace CO2 proti plísním (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997; VLKOVÁ, 2009). Pro mikrobiální stabilitu a zdravotní nezávadnost je rozhodující komplexní působení jak vnějších, tak i vnitřních faktorů. Tím dochází k sumačnímu efektu nadlimitních donor faktorů. Podle tohoto principu se tyto faktory mohou nastavit tak, aby vedl ke vzniku stabilního výrobku (CEMPÍRKOVÁ, et al., 1997).
47
3 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo experimentálně stanovit různé skupiny mikroorganismů u vybraných výrobků a zjistit, zda jsou z mikrobiálního hlediska zdravotně nezávadné s ohledem na pouţitou technologii výroby a konzervační metodu. Získaná data pak zpracovat, porovnat s údaji v literatuře a výsledky shrnout v závěru.
48
4 MATERIÁL A METODIKA 4.1
Charakteristika výrobku
Práce se zaměřuje na bio šťávy ošetřené pasterací, dále na šťávy vyrobené technologií odšťavováním vysokým tlakem bez pasterace a na šťávy lisované za studena ošetřené šetrnou pasterací. Byly vybrány tři druhy šťáv z červené řepy, tři druhy mrkvové šťávy a tři druhy jablečné šťávy. Vzorky byly analyzovány v době nákupu před uplynutím data minimální trvanlivosti (DMT) nebo data spotřeby (DS). Od značky RIO FRESH byly analyzovány vzorky šťáv skladované v lednici nebo při pokojové teplotě před uplynutím data minimální trvanlivosti a těsně po uplynutí data minimální spotřeby (viz tabulka 5). Seznam analyzovaných šťáv je uveden v tabulce 4. Analyzované šťávy jsou podrobně popsány a vyfotografovány v příloze 3.
49
5
4
3
2
1
Vzorek
Healthy Living šťáva z červené řepy
Šťáva z červené řepy BIO
100% šťáva z čerstvě lisovaných mrkví
Healthy Living mrkvová šťáva
Healthy Living mrkvová šťáva
Mrkvová šťáva BIO
Typ šťávy
šetrná pasterace
lisování za studena vysokým tlakem
pasterace
šetrná pasterace
lisování za studena vysokým tlakem
lisování za studena vysokým tlakem
pasterace
Způsob ošetření
29.11.2011 29.11.2011 15.10.2012
21.11.2011 22.11.2011 22.11.2011
21.11.2011 22.11.2011 30.11.2012
21.11.2011 22.11.2011 24.11.2011
7.11.2011
7.11.2011
nákupu
Datum
15.11.2011 10.11.2011**
15,11.2011 18.4.2012*
rozboru
Datum
Přehled zkoumaných šťáv.
6
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek a červené řepy
pasterace
28.11.2011 29.11.2011 1.12.2011***
Tab. 4:
7
Jablečná šťáva BIO
lisování za studena vysokým tlakem
28.11.2011 29.11.2011 18.2.2012
21.11.2011 29.11.2011
25.1.2012
16.1.2012
DMT/DS
8
Healthy Living jablečno zelná šťáva
šetrná pasterace
15.11.2011
9
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek
7.11.2011
10
Poznámky: * rozbor po uplynutí doby spotřeby ** po otevření silné uvolňování CO2
*** sleva, 2. jakost
50
Tab. 5: Přehled zkoumaných šťáv značky RIO FRESH po určité době skladování v lednici nebo při pokojové teplotě Vzorek Typ šťávy
Datum
Datum
nákupu
rozboru
DMT
1
100% šťáva z čerstvě lisovaných mrkví 0,2 l 28.11.2011 28.2.2012 15.2.2012*
2
100% šťáva z čerstvě lisovaných mrkví 0,2 l 28.11.2011 28.2.2012 15.2.2012** 100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek
3
a červené řepy 100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek
4
a červené řepy 100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek
5
a červené řepy 100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek
6
a červené řepy
0,2 l 28.11.2011 14.2.2012 18.2.2012*
0,2 l 28.11.2011 28.2.2012 18.2.2012*
0,2 l 28.11.2011 14.2.2012 18.2.2012**
0,2 l 28.11.2011 28.2.2012 18.2.2012**
7
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek 0,2 l 28.11.2011 14.2.2012 18.2.2012*
8
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek 0,2 l 28.11.2011 21.2.2012 18.2.2012*
9
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek 0,2 l 28.11.2011 14.2.2012 18.2.2012**
10
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek 0,2 l 28.11.2011 28.2.2012 18.2.2012**
Poznámky: * skladování v lednici ** skladování při pokojové teplotě – cca 3 měsíce Rozbor: před uplynutí DMT – 3,5,7,9 po uplynutí DMT – 1,2,4,6,8,10
4.2
Příprava laboratorních pomůcek
Veškeré potřebné laboratorní sklo bylo sterilizováno.
Skleněné pipety byly
zavatovány a vysterilizovány při 160 °C po dobu 60 minut v horkovzdušném sterilizátoru.
51
Zkumavky se naplnily 9 ml destilované vody a uzavřely. V plastové kádince zabalené pod alobalem se naplněné i prázdné zkumavky nechaly vysterilizovat při 121 °C po dobu 20 minut v parním sterilizátoru. K mikrobiologické analýze byly pouţity následující pomůcky:
4.3
1
Petriho misky
7
stojan na zkumavky
2
zkumavky
8
alobal
3
skleněné pipety
9
mikrobiální půdy
4
vata
10 sterilizátor
5
kádinka
11 termostat
6
uzávěry
Zpracování vzorku Většina vzorků byla ředěna desetinným ředění do 10-1. Pouze mrkvová šťáva
Tesco, která byla analyzována po uplynutí doby spotřeby (DS) nebo byla viditelně znehodnocená, se ředila aţ do 10-3. 1 ml vzorku eventuálně jejího desetinného ředění byl inokulován do sterilních Petriho misek a zalit rozehřátým a na 45-50 °C zchlazeným ţivným médiem. Misky po ztuhnutí se umístily do termostatu, kde proběhla inkubace za daných podmínek.
4.4
Stanovení mikroorganismů
Ve všech vzorcích byly stanoveny tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM) – inkubace na ţivné půdě PCA v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin sporulující bakterie (SP) – inkubace na ţivné půdě PCA v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin (po pasteraci 10 min. při 80 – 85 °C) plísně a kvasinky (PL/KV) – inkubace na ţivné půdě CGA v termostatu při teplotě 25 °C po dobu 72 – 120 hodin
52
4.5
Sloţení a příprava pouţitých ţivných půd
PCA (Plate-Count-Agar) – caseinpepton-glucose-hefeextrakt-agar = agar pro CPM (firma: Biokar Diagnostics, Francie) Sloţení (g/l): Trypton 5 Kvasničný extrakt 2,5 Glukosa 1 Agar 12 Příprava: 20,5 g prášku se rozpustí v 1 l destilované nebo deionizované vody, poté se pomalu přivede k varu za stálého míchání aţ do úplného rozpuštění. Následuje sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min. pH – 7,0 ± 0,2 při 25 °C CGA – chloramphenicol glucose agar = agar pro plísně a kvasinky (firma: Biokar Diagnostics, Francie) Sloţení (g/l): Kvasničný extrakt 5 Glukosa 20 Chloramphenicol 0,1 Agar 15 Příprava: 40,1 g prášku se rozpustí v 1 l destilované nebo deionizované vody, poté se pomalu přivede k varu za stálého míchání aţ do úplného rozpuštění. Následuje sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min. pH – 6,6 ± 0,2 při 25 °C
4.6
Vyjádření výsledků
Po uplynutí doby, která byla potřebná k inkubaci, byl z Petriho misek odečten počet jednotlivých skupin mikroorganismů. Zjištěné hodnoty byly dosazeny do níţe uvedeného vzorce a vypočítané hodnoty byly vyjádřeny v KTJ . ml-1.
53
N
c V * d * n1 0,1n2
∑c ………….. součet kolonií spočítaných na Petriho miskách V …………… objem inokula d ……………. faktor prvního pouţitého ředění n1 …………… počet Petriho misek pro první ředění n2 …………… počet Petriho misek pro druhé ředění
5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Ve vzorcích mrkvové šťávy, šťávy z červené řepy a jablečné šťávy zakoupené v obchodní síti byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM), sporulující bakterie (SP) a plísně a kvasinky (PL/KV). Výsledky analýz jsou uvedeny v tabulce 6 a 7. Tab. 6: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro pasterované šťávy RIO FRESH Vzorek
1
Typ šťávy 100% šťáva z čerstvě lisovaných mrkví
Datum
CPM
SP
KV/PL
5
20
0
15.11.11
3
0
0/1
22.11.11
2
1
0
29.11.11
rozboru
100% šťáva 2
z čerstvě lisovaných jablek a červené řepy
3
100% šťáva z čerstvě lisovaných jablek
54
Tab. 7: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro pasterované šťávy BIO Datum
Vzorek
Typ šťávy
CPM
SP
KV/PL
1
Mrkvová šťáva BIO
7
2
0
15.11.11
2
Šťáva z červené řepy BIO
8
0
0
22.11.11
3
Jablečná šťáva BIO
1
3
0
29.11.11
rozboru
Z tabulek 6 a 7 vyplývá, ţe všechny šťávy v době rozboru byly podle mikrobiologického hlediska zdravotně nezávadné. Tyto
zkoumané
šťávy
byly
pasterované, nebyla u nich tedy předpokládána vysoká kontaminace. Šťávy značky RIO FRESH garantují navíc aseptické balení, tím se ještě víc eliminuje mikrobiální kontaminace. BAGDE & TUMANE (2011) zkoumali celkový počet mikroorganismů v jablečném a ananasovém dţusu na agaru kolonie tvořících jednotek po inkubaci při 37 °C po dobu 24 hod. Celkový počet mikroorganismů v jablečném dţusu se pohyboval od 20 . 105 do 1 . 105 CFU . ml-1, v ananasovém dţusu mezi 15 . 105 na 1 . 105 CFU . ml-1. Tyto dţusy však pocházeli z místního trhu ve městě Nagpur (Indie). Autoři neuvádí, zda se jednalo o pasterované nebo tepelně neošetřené dţusy. Zkoumané šťávy nevykazovaly zvýšení počtu sporulujících mikroorganismů. Náchylné na výskyt sporotvorných mikroorganismů jsou ovocné šťávy tepelně neošetřené nebo pasterované (ale ne UHT) bez konzervačních přísad (PETTIPHER et al., 1997). Hlavním zástupcem sporulujících mikroorganismů způsobující kaţení šťáv je Alicyclobacillus acidoterrestris, který byl identifikován jako původce kaţení šťáv ve Velké Británii, Německu a USA (SPLITTSTOESSER et al, 1998; PETTIPHER et al, 1997). Zdrojem A. acidoterrestris mohou být zahradní a lesní půda nebo nemyté či špatně umyté ovoce, dalším zdrojem můţe být i pouţitá voda při získávání šťáv z koncentrátu (MCINTYRE et al., 1995; DEINHARD et al., 1987). KOMITOPOULOU et al. (1999) potvrdili, ţe v ovocných šťávách (jablko, pomeranč a grapefruit), které byly pasterované při teplotách okolo 95 °C po dobu 2 minut, přeţily spory A. acidoterrestris. Dále zjistili, ţe přídavek nisinu (antimikrobní látky) před pasterizací 100 IU . ml -1 zcela brání růstu této bakterie. Podle metody kultivace vzorku na ţivném médiu CGA nebyly identifikovány kvasinky ani plísně. MIZRACH et al. (2007) vyvinuli rychlou a spolehlivou metodu na 55
detekci kvasinek (Saccharomyces cerevisiae spp.) v kapce pasterované jablečné šťávy na podloţním skle pomocí Ramanovy spektroskopie. Nejlepší detekci (100 %) zjistili při koncentraci 10 CFU . ml-1. Přesná on-line detekce kvasinek v případě nulové tolerance kvasinek na 10 CFU . ml-1. DEAK et al. (1993) zjišťovali počty kvasinek v koncentrátech ovocných šťáv (jablko, pomeranč, ananas hroznové víno, třešně) zředěné 1:4. Celkové počty kvasinek se pohybovaly v rozmezí od log10 < 1,00 – 5,42 CFU . ml-1, jejichţ počet se zvýšil na 2,42-7,34 KTJ . ml-1 po 24 hodinách inkubace při 25 °C. Nejčastěji byly izolovány druhy Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata a Zygosacharomyces rouxii. Tab. 8: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro nepasterované šťávy Vzorek
1
2
3
4
Typ šťávy Healthy Living mrkvová šťáva Healthy Living mrkvová šťáva Healthy Living šťáva z červené řepy Healthy Living jablečno zelná šťáva maximální limit
Datum
CPM
SP
KV
PL
5,2 . 102
1
0
1
15.11.2011
1,5 . 103
3
0
1
22.11.2011
5,4 . 102
96
0
1
22.11.2011
10
1
0
1
29.11.2011
106
-
5 . 104
rozboru
12
Z tabulky 8 vyplývá, ţe všechny šťávy značky Healthy Living jsou i přes vyšší počet CPM zdravotně nezávadné. U Healthy Living mrkvových šťáv bylo zjištěno ze senzorického hlediska, ţe jsou zkaţené. Šťáva 1 byla zkoumaná po ukončení data spotřeby (DS) a šťáva 2 před datem spotřeby. Otázkou je, co způsobilo její předčasné zkaţení ještě před ukončení data spotřeby. V rámci obchodního řetězce byla šťáva 2 prodávána jako II. jakost. Na kaţení šťáv se mohou podílet enzymy, zejména oxidoreduktázy. Pokud dojde narušení pletiv mechanicky nebo mikrobiologicky, některé enzymy z redoxních systémů zintenzivní svoji činnost nebo se reverzibilně inaktivují (HORČIN, 2004b). V tomto případě lze uvaţovat, ţe došlo k mechanickému
56
narušení pletiv mrkve vlivem vysokého hydrostatického tlaku, a tím ke změnám aktivity enzymů. Firma Beskyd Fryčovice, a.s. u svých nepasterizovaných šťáv, ošetřených vysokým tlakem tzv. pascalizací, sledují CPM. E.coli a kvasinky a plísně, dále průkaz bakterií Salmonella, Listeria monocytogenes. Jelikoţ nedisponují vybavenou laboratoří, nechávají si tyto druhy šťáv vyšetřit akreditovanou laboratoří (LAŠTŮVKOVÁ, 2011). Nařízení komise (ES) č. 1441/2007 udává pro nepasterizované ovocné a zeleninové šťávy (určené k přímé spotřebě) limit pro E.coli 100 KTJ . g-1 (m) a 1 000 KTJ . g-1 (M), a to ve 2 vzorcích z pěti (analytická referenční metoda (ISO 16649-1 nebo 2), dále limit pro salmonely, které nesmí být přítomny v 5 zkoumaných vzorcích o objemu 25 g (analytická referenční metoda EN/ISO 6579). O toto nařízení se opírá i Slovensko a Německo. ČSN 56 9609 02/2008 udává hodnoty pro CPM v ovocných a zeleninových šťávách hodnoty 107 u 5 zkoumaných vzorků (respektive 5.107 u 2 z pěti vzorků). Podle této normy se salmonely nesmí vyskytovat v ţádném z 5 vzorků o objemu 25 ml. E. coli můţe dosahovat hodnot v 5 vzorcích 102 (respektive 103 ve 2 z pěti vzorků) U šťáv značky RIO FRESH se sledoval nárůst mikroorganismů po dlouhodobém skladování v lednici a při pokojové teplotě před a těsně po uplynutí data minimální spotřeby. Doba skladování od nákupu byla tři měsíce. Výsledky analýz lze vidět v následujících tabulkách 9, 10 a 11. Tab. 9: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro mrkvovou šťávu Maximální
1 Mrkev
limit lednice 106
SP PL KV
pokojová teplota po uplynutí DMT
MO CPM
2
5 . 10
4
1
0
0
0
0
1
0
1
57
Tab. 10: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro šťávu z jablek a červené řepy 3
4
5
6
Jablko a červená řepa lednice
pokojová teplota
před a po uplynutí DMT
před a po uplynutí DMT
CPM
0
10
3
23
SP
0
1
0
0
PL
0
1
0
1
KV
1
0
0
1
Tab. 11: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro jablečnou šťávu 7
8
9
10
Jablko lednice
pokojová teplota
před a po uplynutí DMT
před a po uplynutí DMT
CPM
0
10
10
30
SP
1
0
0
0
PL
0
0
4
2
KV
0
1
5
0
Podle vyhlášky č. 132/2004 Sb., o mikrobiologických poţadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení, je dáno, ţe v čerstvých ovocných a zeleninových šťávách (tepelně neošetřených, bez konzervačních látek) je moţné maximální přípustné mnoţství celkového počtu mikroorganismů (CPM) ve výši 106. Počet kvasinek můţe dosáhnout maximálně 5. 104. Tato vyhláška byla zrušena Vyhláškou č 467/2006 Sb. a nahrazena Nařízením komise (ES) č.1441/2007, která mění nařízení (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Česká legislativa ani EU neřeší mikrobiologii pasterizovaných ovocných a zeleninových nápojů. Ze všech tří výše uvedených tabulek vyplývá, ţe i po ukončení data minimální trvanlivosti (DMT) při skladování při pokojové teplotě (po dobu cca 3 měsíců) byly šťávy z mikrobiálního hlediska zdravotně nezávadné. I ze senzorického hlediska nevykazovaly ţádné známky kaţení. To poukazuje na to, jak je účinná šetrná pasterace spolu s aseptickým balením. 58
6 ZÁVĚR Díky svému vysokému obsahu vody patří ovocné a zeleninové nápoje k vhodnému ţivnému prostředí pro výskyt a rozvoj mikroorganismů. Ovoce a zelenina, jakoţto suroviny pro získávání nápojů jsou téţ vhodným prostředí pro rozvoj mikroorganismů. Proto je důleţitý správný výběr zdravých surovin bez známek kaţení, aby nedošlo k následné kontaminaci při získávání ovocných a zeleninových nápojů. Získané nápoje však mohou být kontaminovány nejen během jejich získávání, způsobu ošetření, ale i během distribuce a skladování. Z mikrobiální kontaminace hrozí nejčastěji kvasinky, plísně a jejich sekundární metabolity – mykotoxiny (zejména patulin). Z hlediska alimentárních nákaz se bere ohled na salmonelózy vyvolané rodem Salmonella a bakterie E.coli, které způsobují různé zaţívací potíţe. Nařízení ES č. 1441/2007 uvádí, ţe Salmonella musí být negativní v 25 ml nepasterované ovocné a zeleninové šťávy. Legislativa neřeší mikrobiologii pasterovaných ovocných a zeleninových šťáv zřejmě proto, ţe je legislativně dána definice pasterace jako účinný prostředek k eliminaci mikroorganismů. V rámci experimentálního stanovení byly zkoumány různé skupiny mikroorganismů ve třech vzorcích mrkvové šťávy, ve třech vzorcích jablečné šťávy a ve 3 vzorcích šťávy z červené řepy. U ţádné ze šťáv nebyly zjištěny vyšší počty mikroorganismů, neţ uvádí Nařízení ES č. 1441/2007 do potravinářské mikrobiologie v ČR a ČSN 56 9609 02/2008. Všechny zkoumané vzorky šťáv lze tedy povaţovat z mikrobiologického hlediska za zdravotně nezávadné.
59
7 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY [1]
ADEKUNTE A, TIWARI B. K., SCANNELL A., CULLEN P. J., O'DONNELL C.,2010: Modelling of yeast inactivation in sonicated tomato juice. International Journal of Food Microbiology, 137: 116–120.
[2]
ARPAI J., 1977: Potravinárska mikrobiólogia. SNTL, Praha, 280 s.
[3]
AMÉZQUETA S. ET AL., 2012: OTA-producing fungi in foodstuffs. Food Control, 26, 259-268.
[4]
ASAM S., LICHTENEGGER M., LIU Y., RYCHLIK M., 2012: Kontent of the Alternaria mycotoxin tenuazonic acid in food commodities determined by a stable isotope dilution assay. Mycotoxin Research, 28 (1): 9-15.
[5]
BAGCI U.,TEMIZ A., 2011: Microbiological quality of fresh-squeezed orange juice and efficacy of fruit surface decontamination methods in microbiological qiality. Journal of food protection, 74 (8): 1238-44.
[6]
BAGDE N. I.; TUMANE P. M., 2011: Studies on microbial flora of fruit juices and cold drinks Asiatic Journal of Biotechnology Resources, 2(04): 454-460.
[7]
BAYER C., 2002: Domácí výroba sirupů a šťáv. Víkend, Český Těšín, 96 s., ISBN 80-7222-273-2
[8]
BRUGNONI L. I.; LOZANO J. E., CUBITTO M. A., 2007: Potential of yeast isolated from apple juice to adhere to stainless steel surfaces in the apple juice processing industry. Food Research International, 40: 332-340.
[9]
CEMPÍRKOVÁ R., HEJLOVÁ Š., LUKÁŠOVÁ J., 1997: Mikrobiologie potravin. 1. vydání, Jihočeská univerzita, České Budějovice, 165 s., ISBN 807040-254-7
[10] DIELS A. M., WUYTACK E.Y, MICHIELS C. W., 2003: Modelling inactivation of Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica by high-pressure homogenisation at different temperatures. International Journal of Food Microbiology, 87: 55-62. [11] DEAK T.; BEUCHAT L. R., 1993: Yeasts associated with fruit juice concentrates. Journal of food protection. 56 (9): 777-782. [12] DEINHARD G., BLANZ P., PORALLA K., ALTAN E., 1987: Bacillus acidoterrestris sp. nov., a new thermotolerant acidophile isolated from different soils. Systematic and Applied Microbiology, 10: 47 53.
60
[13] DIEHL A. M., CALLEWAERT L.,WUYTACK E. Y., MASSCHALCK B.,MICHIELS C. W., 2005: Inactivation of E. coli by high-pressure homogenization is influenced by fluid viscosity but not by water activity and product composition. International Journal of Food Mikrobiology, 101: 281–291. [14] DOJČAROVÁ E., 2009: Mikroorganismy jako kontaminanty zeleninových a ovocných šťáv. Bakalářská práce, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 61 s. [15] DONS`I G., FERRARI G., SCA P., 2010:
Food Engineering and Physical
Properties Pasteurization of Fruit Juices by Means of a Pulsed High Pressure Process. Journal of food science, 75 (3): 169-177. [16] DUNN J., 1996: Pulsed light and pulsed electric field for foods and eggs. Poult Science. 75 (9): 1133-1136. [17] GÖRNER F.; VALÍK L., 2004: Aplikovaná mikrobiológia poživatin. 1. vydanie, Malé centrum, Bratislava, 528 s., ISBN 80-967064-9-7 [18] GREENWOOD D. et al, 1999:
Lékařská mikrobiologie. Grada Publisching,
Praha, 690 s., ISBN 80-7169-365-0 [19] GUENES G., BLUM L. K., HOTCHKISS J. H., 2005: Inactivation of yeasts in grape juice using a continuous dense phase carbon dioxide processing system. Journal of Science Food Agriculture 85: 2362–2368. [20] HAMPL B., 1956: Mirobiologická zkoumání potravin. VŠCHT, Praha, 104 s. [21] HORČIN
V.,
2004a:
Konzervovanie
potravín.
1.
vydání,
Slovenská
pol„nohospodárska univerzita v Nitre, Nitra, 161 s., ISBN 80-8069-341-2 [22] HORČIN V., 2004b: Technológia spracovania ovocia a zeleniny. 1. vydání, Slovenská pol„nohospodárska univerzita v Nitre, Nitra, 142 s., ISBN 80-8069399-4 [23] HOUŠKA M., 2007: Ošetření potravin vysokým tlakem. AVC ČVUT Praha. Databáze
online
[cit.04-07-2011]
Dostupné
na:
cvut.cz/avc.php?id=4323> [24] HRABĚ J., ROP O., HOZA I., 2005: Technologie výroby potravin rostlinného původu: bakalářský stupeň. 1. vydání, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Zlín, 178 s., ISBN 80-7318-372-2 [25] HRUBÝ S. ET AL., 1984: Mikrobiologie v hygieně výživy. Avicenum, Praha, 208 s., ISBN 08-083-84
61
[26] HRUDKOVÁ A., MARKVART J., ET AL., 1989: Nealkoholické nápoje. 1 vydání, SNP, Praha, 560 s. ISBN 80-200-1024-6 [27] HVÍZDALOVÁ I., 2012: Stáčení ovocných šťáv za horka do "bag in box" Databáze online [cit.19-3-2012] Dostupný na:
[28] HVÍZDALOVÁ I., 2010: Nové technologie pro nápojářský průmysl. Databáze online [cit. 2011-02-10]. Dostupné na: [29] INGR I., 2007: Základy konzervace potravin. 3. vydání, Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 137 s., ISBN 978.80-7375-110-4 [30] JESENSKÁ Z., 1993: Micromycetes in foodstuffs and feedstuffs. Elsevier, Amsterdam, ISBN 0-444-98684-7 [31] KLABAN V., 1999: Svět mikrobů – Malý mikrobiologický slovník. 1. vydání, Gaudeamus, Hradec Králové, 303 s., ISBN 80-7041-639-4 [32] KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ A., 1980: Biologická kontrola výroby piva a nealkoholických nápojov, 1 vydání, Alfa, Bratislava, 336 s., [33] KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ
A.,
1990:
Taxónomia
kvasiniek
a
kvasinkovitých mikroorganizmov. Alfa, Bratislava, 699 s., ISBN 80-05-00644-6 [34] KOMÁR A. et al, 2005: Technologie, zbožíznalství a hygiena potravin IV. část. Univerzita Obrany, Brno, 142 s, ISBN 80-7231-032-1 [35] KOMITOPOULOU E., BOZIARIS I., DAVIES E. A., DELVES-BROUGHTON J., ADAMS M. R., 1999: Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices and its control by nisin. International Journal of Food Science & Technology, 34 (1): 81– 85. [36] KOMPRDA T., 2000: Hygiena potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 180 s., ISBN 80-7157-276-4 [37] KOPÁČOVÁ O., 2007: Bakteriální test pro ovocné a zeleninové šťávy, Ústav zemědělské ekonomiky a informací. Databáze online [cit.29-11-2008] Dostupný
na:
http://www.agronavigator.cz/default.asp?ids=150&ch=13&typ=
1&val=60146 [38] KUBÁŇ V., KUBÁŇ P., 2007: Analýza potravin. 1. vydání, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 203 s., ISBN 978-80-7375-036-7 [39] KVASNIČKOVÁ A., 2010: Patulin v ovocných šťávách. Agronavigátor. Databáze online [cit. 2011-02-10]. Dostupné na:
62
[40] KYZLINK V., 1990: Principles of food preservativ. Elsevier, Amsterdam, 598 s., ISBN 0-444-98844-0 [41] LAŠTŮVKOVÁ K., 2011: Beskyd Fryčovice, a.s., ústní sdělení [42] LAS HERAS-VAZQUEZ F. J. et al., 2003: Identification of yeast species from orange fruit and juice byRFLP and sequence analysis of the 5.8S rRNA gene and the two internal transcibed spacers. FEMS Yeast Research, 3: 3-9. [43] LEWIS J. E., et al., 2006: Human bacteria in street vended fruit juices: A case study of Visakhapatnam city, India. Journal of Food Safety, 8: 35 – 38. [44] MALÍŘ F., OSTRÝ V. et al, 2003: Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. 1. vydání, Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů, Brno, 349 s., ISBN 80-7013-395-3 [45] MCDONALD K. F., CURRY R. D., CLEVENGER T. E., UNKLESBAY K., EISENSTARK A., GOLDEN J., MORGAN R. D., 2000: A comparison of pulsed and continuous ultraviolet light sources for the decontamination of surfaces. IEEE Transactions on Plasma Science, 28: 1581-1587. [46] MCINTYRE S., IKAWA, J. Y., PARKINSON, N., HAGLUND, J., LEE, J., 1995: Characteristics of an acidophilic Bacillus strain isolated from shelf-stable juices. Journal of Food Protection, 58: 319 321. [47] MIZRACH A., SCHMILOVITCH Z., KOROTIC R., SHAPIRA R., 2007:
IRUDAYARAJ
J.,
Yeast detection in apple juice using Raman spectroscopy
and chemometric methods. Transactions of the asabe, 50 (6): 2143-2149. [48] MÜLLER G., 1983: Grundlagen der Lebensmittelmikrobiologie. 5. vydání, Fachbuchverlag, Liepzig, 332 s. [49] MODRÁ H. et al, 2009: Speciální veterinární toxikologie, 1. vydání, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 165 s., ISBN 978-80-7399-882[50] NEHASILOVÁ D., 2012: Detoxifikace patulinu. Databáze online [cit.19-3-2012] Dostupný na: http://www.bezpecnostpotravin.cz/detoxifikace-patulinu.aspx [51] OSTRÝ V., RUPRICH J., MALÍŘ F., 2008: Alternáriové mykotoxiny: toxikologické informace a výskyt v potravinách. Databáze online [cit.27-02-2009] Dostupné na:
63
[52] PALGAN I., CAMINITI I. M., MUÑOZ A., NOCI F., WHYTE P., MORGAN D. J., CRONIN D. A., LYNG J. G., 2011: Effectiveness of High Intensity Light Pulses (HILP) treatments for the kontrol of Escherichia coli and Listeria innocua in apple juice, orange juice and milk. Food Microbiology, 28: 14-20. [53] PATHANIBUL P. TAYLOR T. M., DAVIDSON P. M., HARTE F., 2009: Inactivation of Escherichia coli and Listeria innocua in apple and carrot juices using high pressure homogenization and nisin. International Journal of Food Microbiology, 129: 316–320. [54] PELIKÁN M., SÁKOVÁ L., 2001: Jakost a zpracování rostlinných produktů, 1. vydání, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, České Budějovice, 235 s., ISBN 80-7040-502-3 [55] PETTIPHER G. L., OSMUNDSON M. E., MURPHY J. M., 1997: Methods for the
detection
and
enumeration
of
Alicyclobacillus
acidoterrestris
and
investigations of growth and taint in fruit juice and fruit-containing drinks. Letters in Applied Microbiology, 24, 185 189. [56] PIECKOVÁ E. 1998: Termorezistentní mikromycety a poživatiny. Databáze online [cit.23-02-2009] Dostupné na: [57] POLSTER M., 1971: Toxigenní plísně a mykotoxiny v potravinách, Brno [58] POUZAR M., 2012: Přednášky speciální toxikologie, mykotoxiny. Datbáze online [cit.19-3-2012] Dostupné na: [59] PRUGAR J., 2008: Kvalita rostlinných produktů na prahu 3. tisíciletí. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský ve spolupráci s Komisí jakosti rostlinných produktů ČAZV, Praha, 327 s., ISBN 978-80-86576-28-2 [60] REDDY U. B. et al., 2009: Isolation and characterization of faecal coliforms int street Vended fruit juices and its safety evaluation: A case study of Bellary City, India. Journal of Food Safety,11: 35-43. [61] ROP O.; HRABĚ J., 2009: Nealkoholické a alkoholické nápoje. 1. vydání, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Zlín, 129 s., ISBN 978-80-7318-748-4 [62] ROP O.; VALÁŠEK P.; HOZA I.: 2005: Teoretické principy konzervace potravin I. Hlavní konzervárenské suroviny. 1. vydání, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Zlín, ISBN 80-7318-339-0
64
[63] SANT´ANA A. S. et al., 2010: Influence of package, type of apple juice and temperature on the production of patulin by Byssochlamys nivea and Byssochlamys fulva. International Journal of Food Microbiology, 142: 156-163. [64] SEEARUNRUANGCHA A, 2004: Identification of acetic acid bacteria isolated from fruits collected in Thailan. Journal of General and Applied Microbiology, 50: 47-53 [65] SEYIDOVA G. M., 2008: Aflatoxins in fruit juices and jams produced in Azerbaijan. Azerbaijan Medical Journal, 3: 129-130. [66] SOUKUPOVÁ J.; VANÍČKOVÁ M., 2008: Člověk a výživa, Manuál pro vedení přírodovědného kroužku. 1. vydání, Univerzita Palackého v Olomouci, Olomouc, 86 s., ISBN 978-80-244-2244-2 [67] SPLITTSTOESSER D. F., LEE C. Y., CHUREY J. J., 1998: Control of Alicyclobacillus in the juice industry. Food and Environmental Sanitation. 18: 585 587. [68] ŠILHÁNKOVÁ L., 2002: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vydání, Academia, Praha, 363 s., ISBN 80-200-1024-6 [69] ŠIMŮNEK J., 2004: Plísně a mykotoxiny. Databáze online [cit.27-02-2009] Dostupné na: [70] ŠROUBKOVÁ E., 1996: Technická mikrobiologie. 1. vydání, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 150 s., ISBN 80-7157-226-8 [71] TAKESHITA K., SHIBATO J., SAMESHIMA T., FUKUNAGA S., ISOBE S., ARIHARA K., ITOH M., 2003: Damage of yeast cells induced by pulsed light irradiation. International Journal of Food Microbiology 85: 151-158. [72] TOURNAS V. H., HEERES J., BURGESS L., 2006: Moulds and yeasts in fruit salads and fruit juices. Food Microbiology, 23: 684-688. [73] VAŘEJKA F., 1990: Mikrobiologie pro veterinární hygieniky. 1. vydání, SPN, Praha, 232 s., ISBN 80-85114-02-X [74] VLKOVÁ E.; RADA V.; KILLER J., 2009: Potravinářská mikrobiologie. 2. vydání, Česká zemědělská univerzita v Praze, Praha, 168 s., ISBN 978-80-2131988-2 [75] VOLDŘICH M., 2009: Výroba nealkoholických nápojů, s. 151-160. In: KADLEC P. (ed.), Co byste měli vědět o výrobě potravin? 1. vydání, KEY Publishing s r. o., Ostrava, 536 s., ISBN 978-80-7418-051-4
65
[76] VOLDŘICH M., DOBIÁŠ J., TICHÁ L., ČEŘOVSKÝ M., KRÁTKÁ J., 2004: Resistance of vegetative cells and ascospores of heat resistant mouldTalaromyces avellaneus to the high pressure treatment in apple juice. Journal of Food Engineering, 61: 541-543. [77] VOLDŘICH M., 2000: Použití vysokých tlaků v potravinářské technologii. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha [78] VONDRÁŠKOVÁ Š., 2010: Vliv konzumace jablek na snižování hladiny cholesterolu. Databáze online [cit. 2011-02-05]. Dostupné na: [79] YOON Y. K. et al., 2005: Production of probiotic cabbage juice by lactic acid bacteria. Biorsource Technology, 97: 1427-1430. [80] WALKER N., 1993: Čerstvé ovocné a zeleninové šťávy. 1. vydání, Fin, Olomouc, 174 s., ISBN 80-85572-63-X [81] WYATT M. K., PARISH M. E., WIDMER W. W., KIMBROUGH J. K., 1995: Characterization of mould growth in orange juice. Food Microbiology, 12: 347355. [82] ZACKER CH., 2003: Domácí výroba sirupů a šťáv. 1. vydání, Víkend, Líbeznice, 96 s., ISBN 80-7222-273-2 ANONYM 1. Horticulture week Databáze online [cit.20-3-2012] Dostupné na: ANONYM 2. AIJN Databáze online [cit.2-2-2012] Dostupné na: ANONYM 3. PROBIO, výrobce biopotravin Databáze online [cit.2-2-2012] Dostupné na: ANONYM 4. Bez konzervantů. Databáze online [cit.19-3-2012] Dostupné na: ANONYM 5. Ústav zemědělské ekonomiky a informací Databáze online [cit.29-032012] Dostupné na:
66
ANONYM 6. Ústav zemědělské ekonomiky a informací Databáze online [cit.29-032012] Dostupné na: ANONYM 7. VŠCHT, Přehled metod úchovy (konzervace) potravin. Databáze online [cit.15-03-2012] Dostupné na: ANONYM 8. Ústav zemědělské ekonomiky a informací, A-Z slovník pro spotřebitele Databáze online [cit.15-03-2012] Dostupné na: ANONYM 9. Úřad průmyslového vlastnictví, Patentový spis: Způsob sušení vodu obsahujících potravin nebo nápojů. Databáze online [cit.03-03-2012] Dostupné na: ANONYM 10. Univerzita Pardubice, katedra analytické chemie: Konzervárenství. Databáze online [cit.02-03-2012] Dostupné na: ANONYM 11. Bezpečnostpotravin. Databáze online [cit.28-3-2012] Dostupné na ANONYM 12. Neoficiální dokumentový server MZLU . Databáze online [cit.26-012012] Dostupné na: ANONYM 13. Thermo scientific. Databáze online [cit.02-02-2012] Dostupné na: ANONYM 14. Thermo scientifi. Databáze online [cit.02-02-2012] Dostupné na: ANONYM 15. Toxikon. Databáze online [cit.26-01-2012] Dostupné na: http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/aflatox.php ANONYM 16. VŠCHT , Ústav biochemie a mikrobiologie. Databáze online [cit.26-012012] Dostupné na: ANONYM 17. Phytosanitary. Mikrobiologická charakteristika ovoce a zeleniny. Databáze online [cit.15-03-2012] Dostupné na:
67
Legislativní zdroje Vyhláška Mze č. 332/1997 Sb., pro čerstvé ovoce a čerstvou zeleninu, zpracované ovoce a zpracovanou zeleninu, suché skořápkové plody, houby, brambory a výrobky z nich. Vyhláška MZe č. 335/1997 Sb. pro nealkoholické nápoje, ovocná vína, ostatní vína a medovinu, pivo, konzumní líh, lihoviny, ostatní alkoholické nápoje, kvasný ocet a droţdí, ve znění vyhlášky 289/2004 Sb. Vyhláška Mze č. 45/2000 Sb. kterou se mění vyhláška MZe č. 335/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. A), d), h), i), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů pro nealkoholické nápoje a koncentráty k přípravě nealkoholických nápojů, ovocná vína, ostatní vína a medovinu, pivo, konzumní líh, lihoviny a ostatní alkoholické nápoje, kvasný ocet a droţdí účinnost 1. 4. 2000, vybraná ustanovení Vyhláška MZd č. 53/2002 Sb. kterou se stanoví chemické poţadavky na zdravotní nezávadnost jednotlivých druhů potravin a potravinových surovin, podmínky pouţití látek přídatných, pomocných a potravních doplňků Vyhláška MZd č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických poţadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení Vyhláška MZd č. 252/2004 Sb., kterou se stanoví hygienické poţadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody Vyhláška MZd č. 409/2005 Sb. o hygienických poţadavcích na výrobky přicházející do přímého styku s vodou a na úpravu vody Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách Nařízení Komise (ES) o mikrobiologických kritériích pro potraviny č.2073/2005 Nařízení komise č.1441/2007 do potravinářské mikrobiologie v ČR Směrnice Rady 2001/112/ES o ovocných šťávách a některých podobných produktech určených k lidské spotřebě ČSN ISO 4833 Všeobecné pokyny pro stanovení celkového počtu mikroorganismů ČSN ISO 7954 Všeobecné pokyny pro stanovení počtu kvasinek a plísní ČSN 56 9609 02/2008 Pravidla správné hygienické praxe a výrobní praxe Mikrobiologická kritéria pro potraviny. Principy stanoveni a aplikace
68
8 SEZNAM SCHÉMAT A TABULEK Schéma 1: Výroba lisované šťávy (VOLDŘICH, 2009) Schéma 2: Výroba dřeňové kalné šťávy (VOLDŘICH, 2009) Schéma 3: Výroba ovocných koncentrátů (VOLDŘICH, 2009) Schéma 4: Blokové schéma výroby jablečné šťávy (HORČIN, 2004b) – viz příloha 2 Schéma 5: Výroba ovocného koncentrátu (HORČIN, 2004b) – viz příloha 2 Tab. 1: Maximální limity pro patulin v potravinách (dle Nařízení ES 1881/2006) Tab. 2: Obsah patulinu ve šťávách (KVASNIČKOVÁ, 2010) Tab. 3: Rozdělení mikroorganismů dle jejich teplotních nároků (VLKOVÁ, 2009) Tab. 4: Přehled zkoumaných šťáv Tab. 5: Přehled zkoumaných šťáv značky RIO FRESH Tab. 6: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro pasterované šťávy RIO FRESH Tab. 7: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro pasterované šťávy BIO Tab. 8: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro nepasterované šťávy Tab. 9: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro mrkvovou šťávu Tab. 10: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro šťávu z jablek a červené řepy Tab. 11: Přepočet mikroorganismů na 1 ml pro jablečnou šťávu Tab. 12: Základní pojmy nealkoholických nápojů a koncentrátů k přípravě nealkoholických nápojů (Vyhláška č. 335/1997) – viz příloha 1 Tab. 13: Členění nealkoholických nápojů a koncentrátů k přípravě nealkoholických nápojů na skupiny a podskupiny a požadavky na jejich jakost (Vyhláška č. 335/1997) - viz příloha 1 Tab. 14: Přehled činidel podle účinku (upraveno podle ROP & HRABĚ, 2009) - viz příloha 1 Tab. 15: Přehled základních konzervovaných ovocných polotovarů (upraveno podle ROP & HRABĚ, 2009) - viz příloha 1
69
