Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Ústav posklizňových technologií

Mikrobní stabilita ovocných a zeleninových surovin a výrobků Bakalářská práce

Vedoucí práce

Vypracovala

prof. Ing. Jan Goliáš, DrSc.

Markéta Šustrová

Lednice 2011

3

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Mikrobní stabilita ovocných a zeleninových surovin a výrobků vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana ZF MU v Brně.

Dne ……………………. Podpis ………………….

4

PODĚKOVÁNÍ Děkuji svému vedoucímu bakalářské práce panu prof. Ing. Jan Goliášovi, DrSc., za velmi odborné a cenné rady a připomínky a propůjčené písemnosti, které mi během zpracování bakalářské práce poskytl. Rovněţ chci touto cestou poděkovat mé rodině, která mně velice podporovala během celého mého studia a také svým přátelům.

5

OBSAH ÚVOD ....................................................................................................................... 6 CÍL PRÁCE .............................................................................................................. 8 LITERÁRNÍ PŘEHLED ......................................................................................... 9 3.1 Mikroorganismy významné v potravinářství ..................................................... 9 3.1.1 Bakterie ....................................................................................................... 9 3.1.1.1 Význam bakterií v potravinářském průmyslu ................................... 11 3.1.1.2 Bakterie mléčného kvašení - BMK ................................................... 11 3.1.1.3 Významné druhy bakterií vyskytujících se na ovocných a zeleninových surovinách..................................................................................... 13 3.1.2 Kvasinky a kvasinkové mikroorganismy .................................................. 17 3.1.2.1 Nejvýznamnější rody kvasinek, které se mohou vyskytovat na ovoci a zelenině 19 3.1.3 Plísně......................................................................................................... 21 3.1.3.1 Nejvýznamnější rody plísní, které se mohou vyskytovat na ovoci a zelenině 23 3.1.4 Mikrobiologie výrobních procesů ............................................................. 27 3.1.4.1 Mikrobiologické zatíţení ................................................................... 28 3.1.4.2 Průtoková cytometrie......................................................................... 29 3.2 Vliv citlivosti MO vůči zvýšeným teplotám a dalším fyzikálním vlivům ....... 30 3.2.1 Teplota ...................................................................................................... 31 3.2.1.1 Tepelné zákroky při konzervaci potravin .......................................... 34 3.2.2 Chlazení a mraţení.................................................................................... 34 3.2.3 Ionizující záření ........................................................................................ 35 3.3 Mykotoxiny ...................................................................................................... 36 3.3.1 Mykotoxiny vyskytující se na ovoci a jejich chemické sloţení................ 40 3.3.2 Technologické úkony, vedoucí ke zvýšenému obsahu mykotoxinů......... 46 3.4 Plísňové choroby skladovaného jádrového ovoce (jablek) .............................. 46 3.4.1 Manipulace při sklizni a skladování ......................................................... 47 3.4.2 Mikrobiologické poruchy jádrové ovoce .................................................. 47 4. METODIKA ........................................................................................................... 56 4.1 Prováděný pokus .............................................................................................. 56 5. VÝSLEDKY A DISKUZE ..................................................................................... 60 5.1 Acidobazická titrace u plodů jablek ................................................................. 60 5.2 Refraktometrické měření sušiny u plodu jablek............................................... 62 5.3 Měření pevnosti duţniny u plodů jablek .......................................................... 64 5.4 Mikrobní napadení plodů jablek ...................................................................... 66 5.5 Stanovení těkavých aromatických látek metodou GC ve zdravém a napadeném jablku ................................................................................................................ 79 6. ZÁVĚR ................................................................................................................... 93 7. SOUHRN – RESUME ............................................................................................ 95 8. SEZNAM LITERTURY ......................................................................................... 97 9. SEZNAM TABULEK, GRAFŮ A OBRÁZKŮ................................................... 100 1. 2. 3.

6

1. ÚVOD Pojem mikroorganismy je vlastně pojmem čistě technickým, neboť zahrnuje systematicky velice rozmanité skupiny ţivých bytostí, od virů přes bakterie, aktinomycety, prvoky, některé řasy aţ k houbám. (KAREL HRUBÝ, 1961). Viry jsou rovněţ zahrnuty, ačkoli nemohou ţít a nemohou se reprodukovat. Viry jsou částice, ne buňky, které se skládají z deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo ribonukleové kyseliny (RNA). Viry napadají ţivé buňky bakterií, řas, hub, prvoků, rostlin a zvířat (včetně člověka) a jejich pouţití je metabolické a genetické. I kdyţ bakterie, aktinomycety, kvasinky a plísně musí být zvětšeny mikroskopem, aby byly vidět, jsou-li kultivovány na pevných médiích, které umoţňují jejich růst a mnoţení, tvoří viditelné kolonie skládající se z milionů buněk. Fosilní mikroby usazené v horninách jsou staré zhruba 3,5 miliardy let a běţný výskyt mikroorganismů se datuje asi do doby před 1,5 miliardy let. Od této doby je jejich hlavním úkolem recyklace organické hmoty v ţivotním prostředí. Z tohoto důvodu se pro nás stávají nezbytnými pomocníky, protoţe jinak by byla planeta Země gigantická skládka. Kontakt s mikroby začíná po narození a pokračuje po celý ţivot, jelikoţ vyhnout se kontaktu s nimi je téměř nemoţné, vyskytují se běţně ve vzduchu, v půdě, ve vodě a na různém rostlinném či ţivočišném materiálu, v jídle. Některé mikroorganismy mohou být parazity našeho těla a stávají se tak jeho přirozenou mikroflórou. Mikroby způsobující onemocnění se nazývají patogenní, jiní mikroby se mohou vyuţít k fermentování potravin, mezi něţ patří alkohol, octy, fermentovaná zelenina, sýry, mléko, sójové omáčky a mnoho dalších potravin. Zkaţení potravin je sloţitý proces a nadměrné mnoţství potravin jsou ztraceny v důsledku mikrobiálního kaţení i přes ošetření moderními konzervačními technikami. Přes různorodost surovin a zpracování, mikroflóra, která se vyvíjí v průběhu skladování a kaţení potravin můţe být předpovídána na základě znalostí o původu potravin a na zachování několika parametrů, jako jsou například teplota, sloţení atmosféry, aktivita vody a pH. Podrobnější smyslové, chemické a mikrobiologické analýzy mohou být provedeny na jednotlivých produktech a určí skutečné konkrétní znehodnocení mikroorganismy. Zatímco chemické a fyzikální parametry jsou hlavními určujícími faktory pro rozdělení mikroorganismů kazících potravin. (GRAM et al, 2002)

7 Ve chvíli, kdy se MO opravdu vyskytují v potravinách, jsou ovlivněny řadou činitelů, které souvisejí jednak se sloţením a enzymatickými pochody v potravinách (vnitřní faktory) a jednak se sloţením a technologickými procesy, balením a skladováním (vnější faktory). Mezi vnitřní faktory ovlivňující růst a mnoţení MO patří především pH potraviny, vodní aktivita, oxidačně-redukční potenciál, obsah ţivin, antimikrobiální látky, biologická struktura a mezi vnější faktory patří zejména teplota skladování, relativní vlhkost prostředí, přítomnost a koncentrace plynů, přítomnost a aktivita mikroorganismů. (CEMPÍRKOVÁ et al, 1997) Kaţení ovoce a zeleniny probíhá obvykle od povrchu. Bývá způsobováno především kvasinkami a plísněmi, protoţe nízké pH brání rozvoji většiny bakterií. Ovoce a zelenina se nejčastěji kontaminují přes půdu, od jiných napadených plodů, ze vzduchu nebo nástrojů a rukou pracovníků. Spory plísní pronikají do plodu přes přirozené otvory či přes poranění, přestoţe jsou chráněny přírodními obrannými mechanismy, jako jsou slupka, skořápka a povrchová pletiva. Rostliny také produkují řadu antimikrobiálních látek (organické kyseliny, éterické oleje), které výrazně zmírňují nebo zabraňují šíření mikrobiální infekce. Rychlost kaţení ovoce během skladování závisí na rozsahu kontaminace a skladovacích podmínkách, proto je nutné skladovat zeleninu a ovoce ve skladech s řízenou atmosférou. (VLKOVÁ et al, 2009) Od počátku civilizace existují druhy mikroorganismů produkujících mykotoxiny, které vyvolávají nepříznivé výsledky v oblasti zdraví. Dnes jsou jiţ dobře známy, ačkoli je jisté, ţe tyto formy samy o sobě mohou být přímo spojeny s konkrétními neţádoucími účinky, existují významné důkazy ukazující na mykotoxiny jako na důleţitou formu kontaminace - fototoxicitu. V posledních letech se zvýšila informovanost veřejnosti o mykotoxikózách a zvýšení prevalence plísní v obytných a komerčních staveních přinesly do popředí moţnou souvislost mezi mykotoxiny a vývojem onemocnění dýchacích cest a také nemoci z povolání, například při zpracování obilovin, které bývají významnými zdroji mykotoxinů. (ANONYM, 2011)

8

2. CÍL PRÁCE

 Prostudovat

literaturu

o

potravinářsky

významných

mikroorganismech

vyskytujících se především na ovoci a zelenině.  Prostudovat literaturu o mykotoxinech vyskytujících se na ovoci a jejich vlastnostech.  Prozkoumat citlivost mikroorganismů vůči zvýšené teplotě a dalším fyzikálním vlivům.  Zaloţit pokus se skladováním jablek vloţených v předchladírně při teplotě 16°C a v chladírně při teplotě 4°C.  Sledovat druhy vyskytujících se mikroorganismů na skladovaných jablkách  Výsledky pokusů zpracovat do grafů a tabulek, statisticky vyhodnotit.

9

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mikroorganismy významné v potravinářství

3.1.1 Bakterie Bakterie jsou jednobuněčné prokaryotické organismy, které nemají jádro oddělené od cytoplazmy jadernou membránou. Buněčná stěna obsahuje vrstvy peptydoglykanů také zvaných mureiny nebo mukopeptidy, proto je stěna buněčná neohebná a velmi pevná. Prokaryotické buňky obsahují ribozomy, ve kterých dochází k syntéze bílkovin. Většina bakterií se rozmnoţuje dělením. Jenom několik rodů bakterií se rozmnoţuje pučením. Uvnitř buněk některých rodů bakterií se na konci fáze růstu, kdy koncentrace ţivin v prostředí klesne pod určitou hladinu, vytvoří válcovité aţ kulovité tělísko, silně lámající světlo, které se vyznačuje vysokou odolností k nepříznivým podmínkám, především k vysokým teplotám a jedům. Toto tělísko se nazývá spora. Spory tohoto typu se tvoří například u Clostridium nebo Bacillus a snesou několikahodinový var. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Nejčastějším tvarem je tyčinkovitý tvar, jednoduché tyčinky představuje rod Bacillus u spolurujících tyčinek a rod Bakterium u nespolurujících tyčinek, zakřivené bakterie se nazývají vibria, spirily, spirochéty, částečně větvené bakterie se nazývají mykobakterie a zcela větvené aktinomycety, dalšími bakteriemi jsou bičíkaté. Méně častý tvar je kulovitý, takto morfologicky tvořené bakterie se nazývají koky, dvojice koků nazýváme diplokoky, skupina osmi koků sarciny, řetízky koků streptokoky a hrozníčkovité uspořádání stafylokoky. U tyčinkovitých bakterií se pouţívají obdobné předpony určující počet či uspořádání (sterptobacill). Základní rozměry buněk se udávají v µm, dle velikosti lze v některých případech vyvodit i rezistenci vůči inhibičním látkám. Průměr koků je zhruba 0,5 aţ 5 µm. Tyčinky mají tloušťku v rozmezí 0,3 – 2,0 µm a délka bývá 1-7 µm. některé druhy bakterií mohou však vykazovat odchylné rozměry, např. spirochety mají tloušťku 0,2 -0,75 µm a délku 5-500 µm. (CEMPÍRKOVÁ et al, 1997) Některé tyčinkovité bakterie mají na svém povrchu jeden nebo více bičíků, jeţ umoţňují jejich pohyb. Bičíky jsou dlouhá tenká vlákna sloţená z bílkovin flagelinu. Podle počtu a umístění bičíků rozdělujeme bakterie na monotricha, lofotricha, peritricha a bakterie netvořící bičíky se nazývají atricha. Dle barvitelnosti jejich buněčné stěny

10 Gramovým bavením dělí na grampozitivní, které zadrţují pouţité barvivo a na gramnegativní po působení rozpouštědel se odbarví. Hlavní sloţkou buněčné stěny grampozitivních bakterií je silná peptidoglykanová vrstva, která je tmelem vyplněna tzv. teichoovou kyselinou. Stěny gramnegativních bakterií teichoovou kyselinu neobsahují. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Bakterie nalezneme v rozličných prostředích jako je půda, voda, ovzduší a jako symbionty také na povrchu a uvnitř mnohobuněčných organismů. Některé druhy jsou schopny snášet extrémní podmínky, kde by jiné mohly přeţívat jen stěţí a je to například vroucí voda v sopečných jezerech, nejvyšší vrstvy atmosféry a také ve vesmíru a vyznačují se jistými charakteristickými vlastnostmi:  Dle způsobu výţivy je dělíme na autotrofní a heterotrofní prokaryota  Podle zdroje energie lze autotrofní a heterotrofní organismy rozdělit na chemo a foto autotrofní či heterotrofní a organotrofní  Dle vztahu ke kyslíku se dělí na obligátně aerobní, obligátně anaerobní, fakultativně anaerobní, mikroaerofilní

Obr. 1. Ukázka tvarů a uspořádání bakterií (ANONYM, 1999)

11

3.1.1.1 Význam bakterií v potravinářském průmyslu V potravinářství se mikroorganismy s pozitivní rolí pouţívají především k dosaţení charakteristických senzorických vlastností jako je chuť, vůně, vzhled a další, ale i ke konzervaci potravin fermentací. „Malé rozměry bakteriálních buněk mají velký specifický povrch, který umoţňuje intenzivní kvantitativní a kvalitativní přeměnu látek podmiňující jejich rychlý růst a rozmnoţování. Za optimálních podmínek mají buňky v potravinářství velmi rozšířených bakterií mléčného kvašení generační čas, například 20 aţ 30 min. Jeden litr dobrého zkyslého mléka obsahuje asi 1012 buněk Lactococcus lactis spp. lactis. Tyto mají spolu hmotnost asi 0,8 g a povrch 4,5m2 . skrz tento povrch uskutečňují buňky přeměnu laktózy na kyselinu mléčnou, získají přitom potřebnou energii a syntetizují protoplazmu.“ (GÖRNER, VALÍK 2004)

3.1.1.2 Bakterie mléčného kvašení - BMK Podle GÖRNER, VALÍK 2004 bakterie mléčného kvašení jsou kokovité a tyčinkovité bakterie zahrnující rody Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus. Bývají nepohyblivé, nesporulující grampozitivní a fermentují sacharidy za fakultativně anaerobních (mikroaerofilních) podmínek a tvoří přitom hlavně kyselinu mléčnou. Bakterie mléčného kvašení najdeme nejen v mléce a mléčných výrobcích, masných výrobcích, fermentované zelenině, ale také na rozkládajících se rostlinách, ve střevech a sliznicích lidí a zvířat. Na zelenině jsou vţdy, i kdyţ v malém mnoţství přítomné, na ţivých rostlinách dominují zástupci rodu Leuconostoc, Lactobacillus plantarum, L. fermentum, L. brevis. Při anaerobní fermentaci rostlinných produktů se obyčejně rychle rozmnoţují a potlačují růst neţádoucí mikroflóry. Jejich metabolismus je fermentativní a produkuje a vytváří látky, které jsou vysoce škodlivé pro ostatní neţádoucí bakterie. Z tohoto důvodu se pouţívají při prodlouţení trvanlivosti potravin, inhibici neţádoucí mikroflóry, tam kde hlavním produktem je kyselina mléčná, při potřebě rychlého sníţení pH (pH 4 a méně), pro sníţení redox potenciálu nebo produkce látek s antimikrobiálním účinkem (nisin, bakteriociny, kyselina mléčná). Při výrobě se pouţívají ve formě čistých mlékařských kultur, startovacích kultur, zákysů apod. Jde o směsné více druhové kultury. Produkty metabolismu dávají potravinám typické

12 senzorické vlastnosti (chuť, vůně, vzhled). Homofermentativní BMK přeměňují sacharidy téměř výhradně na kyselinu mléčnou a patří mezi ně zástupci rodu Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus. Heterofermentativní BMK mění sacharidy na kyselinu mléčnou (> 50%), kyselinu octovou, CO2, etanol, patří zde rod Leuconostoc, Bifidobacterium.

Rod

Lactobacillus

zahrnuje

druhy

homofermentativní

i

heterofermentativní. Probiotické bakteriální kultury se v poslední době začaly hojně vyuţívat jak v potravinářství, tak i v lékařství. Slovo „probiotické“ pochází z řečtiny ze slova „ pro ţivot“. V lékařství jsou pouţívány, jak označil původce tohoto označení FULLER (1986) „aktivní potravinový doplněk, který má pozitivní účinek na organizmus hostitele (člověk nebo zvíře) a tím zlepšuje sloţení a způsobuje rovnováhu v jeho střevní mikroflóře.“

Ţivé mikrobiální doplňky stravy prospěšné pro zdraví organismus

obsaţeny v kysaných mléčných výrobcích a potravinových doplňcích. Probiotika zahrnují rody Lactoccocus, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnonus, L. reuteri, L. lactis Streptococcus, Bifidobacterium. Nežádoucí mikroorganismy se obvykle vyskytují ve velkém počtu. Způsobují změnu vůně, barvy nebo konzistence potravin, vedou ke kaţení, ale nemusí být nutně škodlivé pro člověka. Ke kontaminaci potravin dochází buďto primární kontaminací, v takovém případě jsou mikroorganismy přítomny jiţ v organismu (zvíře před poráţkou), např. mléko při dojení a v průběhu ošetření v zemědělském podniku, maso před poráţkou a během poráţky, rostlina před sklizní a během ní nebo sekundární kontaminací, při níţ dochází v průběhu vlastního procesu výroby nebo kulinární úpravy. Zdrojem kontaminace mohou být různé typy prostředí jako půda, voda, rostliny, zvířata, organické odpady, člověk bacilonosič, stroje a zařízení. Saprofytické mikroorganismy jsou přirozenou mikroflórou rostlin a ţivočichů. Pokud nejsou odstraněny při výrobě, ve finálním výrobku do jisté míry přetrvávají. Mohou se do potravin dostat i jako sekundární kontaminace. Svou aktivitou potravinu kazí a mění její vlastnosti. Jsou to mikroorganismy proteolytické, lipolytické, sacharolytické, pektolytické, dekarboxylující (dekarboxylují aminokyseliny). Při těchto procesech mohou vznikat i toxické produkty. Toxinogenita bakterií znamená v potravinách schopnost produkovat toxiny. Podle vzniku můţeme bakteriální toxiny rozdělit na

13 endotoxiny, mírně termorezistentní lipopolysacharidy, které jsou přirozenou součástí buněčné stěny. Po odumření buněk v ţaludku se uvolňují do prostředí a působí otravy. Vyvolávají uţ v malých koncentracích průjmy, zvýšenou teplotu, sníţení krevního tlaku a podobně.

Exotoxiny

jsou

proteiny většinou

termolabilní

(výjimka toxin

Staphilococcus aureus a E. coli), které se tvoří uţ v potravině nebo aţ v ţaludku člověka. Místem působení jsou střeva odtud název enterotoxiny – většina exotoxinů. Výjimkou je botulotoxin, který patří mezi neurotoxiny. Indikátorové mikroorganismy účelově vytvořená skupina relativně snadno stanovitelná, jejich přítomnost a mnoţství v potravině indikuje expozici této potraviny podmínkám, které mohly umoţnit vnesení nebezpečných

organismů

anebo

pomnoţení

patogenních

a

toxinogenních

mikroorganismů. Indikace fekálního znečištění a tedy moţná přítomnost salmonell, shigel, enteropatogenních E.coli - čeleď Enterobacteriaceae. (KOMPRDA, 1997, VLKOVÁ et al, 2009)

3.1.1.3 Významné druhy bakterií vyskytujících se na ovocných a zeleninových surovinách Rod Acetobacter

(Doména Bacteria, třída Alphaproteobacteria, čeleď Acetobacteraceae, rod Acetobacter) „Původci octového kvašení, které jsou častou sloţkou metabios spontánního rozkladu cukernatých kyselých potravin, k nimţ má přístup vzduch, jsou bakterie z rodu Acetobacter. (KYZLINK, 1980)“. Je to rod gramnegativních, striktně aerobních obrvených paliček vyskytujících se na rostlinách a v půdě. Optimální teplotní růst je okolo 25 aţ 30°C, optimální pH se pohybuje mezi 5,4 aţ 6,3, mají také schopnost růst i při pH 4,3. Tato aerobní bakterie dokáţe oxidovat ethanol na kyselinu octovou, acetát a laktát na CO2 a H2O. Jako zdroj uhlíku vyuţívají glukózu, ale ne laktózu a škrob. (GÖRNER, VALÍK 2004) Podílejí se na kaţení piva a vína, kde způsobují tzv. octovatění. Nachází se v kazícím se ovoci a zelenině, v jablečném moštu, révě vinné, saké, tequile a dalších výrobcích či surovinách. Vyuţívá se při výrobě octu a vitamínu C. Nejrozšířenějším druhem je A. aceti. (VLKOVÁ et al, 2009)

14

Rod Lactobacillus (Doména Bacteria, řád Lactobacillales, čeleď Lactobacillaceae) Rod Lactobacillus je velmi dobře popsanou skupinou mikroorganismů, čítající více neţ 50 druhů, grampozitivních, fakultativně anaerobních krátkých aţ dlouhých nepohyblivých tyčinek. Optimální teplota růstu je 30 aţ 45°C, při 15°C jiţ nerostou vůbec. Rod Lactobacillus se podle fermentace hexóz, pentóz a glukonátů dělí na tři skupiny. (GÖRNER, VALÍK 2004). Hlavním produktem metabolismu sacharidů je kyselina mléčná v případě zkvašování hexóz a v případě rozkladu pentóz i kyselina octová, etanol a CO2. Je všeobecně acidotolerantní aţ acidofilní, obvyklé pH se pohybuje okolo 5,5 - 6,2 pH, ale dokáţe sníţit pH aţ pod 4,0 (3,6 pH je minimum) a tím působí inhibičně aţ mikrobicidně, proto se také vyuţívá ke konzervaci zeleniny jako kysané zelí, okurky, ale také krmiva (siláţe), zde se uplatňuje především fakultativně heterofermentativní druh Lactobacillus plantarum. Řadí se mezi bakterie mléčného kvašení a je to poměrně rozšířený druh, jeho zástupce je moţno nalézt v mléce a mléčných výrobcích, v půdě a na rostlinném materiálu ale i u ţivočichů. (VLKOVÁ et al, 2009) Rod Lactoccocus (Doména Bacteria, oddělení Firmicutes, čeleď Streptococaceae Tento rod se řadí mezi grampozitivní, fakultativně anaerobní koky, ovoidní buňky vyskytující se v párech nebo v řetízcích. Někdy bývají řetízky prodlouţeny a mohou se jevit jako paličky, proto se také dříve zaměňovaly za laktobacily. (GÖRNER, VALÍK 2004) Optimální teplota růstu je 30°C a pH asi 9,0, běţně je řadíme mezi zástupce bakterií mléčného kvašení.

V přírodě jsou hojně rozšířeny, hlavně kde probíhá spontánní

kvašení biologického materiálu. V mlékárenském průmyslu jsou vyuţívány jako mezofilní zákysové kultury při výrobě kysaných produktů. Některé druhy produkují bakteriociny (nisin), které působí proti grampozitivním bakteriím. Nejvýznamnějšími druhy jsou Lc. lactis subsp. cremoris a lactis. (VLKOVÁ et al, 2009)

15 Rod Pediococcus (Doména Bacteria, oddělení Firmicutes, čeleď Lactobacillaceae Tento rod se vyznačuje jako fakultativně anaerobní, grampozitivní, nesporulující homofermentativní koky vyskytující se samostatně, v párech nebo ve dvou rovinách tvořící tetrády. Neredukují dusičnan a dokáţí fermentovat i těţší pentózy (xylóza a arabinóza). Roste při pH 4,2 aţ pH 8, všechny druhy rostou optimálně při 30°C, ale jsou náročné na růstové faktory, jako jsou vitamíny a aminokyseliny. Vyskytují se primárně na rostlinném materiálu, sekundárně na mase a rybách. Pediokoky se vyskytují také v siláţích, nakládané zelenině a mléčných výrobcích. Zástupci: Pc.pentosaceus, Pc. acidilactici (VLKOVÁ et al, 2009) Rod Leuconostoc (Doména Bacteria, oddělení Firmicutes, čeleď Lactobacillaceae Leukonostok obsahuje heterofermentativní, grampozitivní, fakultativně anaerobní nesporulující koky vyskytující se v párech nebo v krátkých či středně dlouhých řetízcích. Většina leukonostoků disimiluje citran za přítomnosti fermentovatelného sacharidu za tvorby acetoinu, diacetylu a 2,3- butylenglykolu. Významný je pouze diacetyl. Druh L. mesenteroides subsp mesenteroides tvoří slizovité dextrany a ucpává difuzéry a další zařízení. Vyskytuje se na povrchu zelených rostlin a na rostlinném materiálu obsahujících sacharidy, na mase, v mléce a mléčných výrobcích. Uplatňuje se při fermentaci potravin jako je zelenina, mléčné výrobky, sladová a obilná whisky, káva, kakao, vanilkové lusky. L. oenos (Oenococcus oeni) odbourává ve víně neţádoucí kyseliny.

V současnosti

obsahuje

Leuconostoc

druhy:

L.

mesenteroides

ssp

mesenteroides, ssp L. mesenteroides dextranicum, L. mesenteroides ssp.cremoris, L. lactis a L. oenos (Oenococcus oeni).(GÖRNER, VALÍK 2004) Rod Bacillus (Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, čeleď Bacillaceae, rod Bacillus) Jedná se o velmi početný rod, který je hojně rozšířený v přírodě. Jeho druhy tvoří většinou grampozitivní, aerobní nebo fakultativně anaerobní sporulující tyčinky. Tvoří

16 spory stejně velké jako je šířka vegetativní buňky. Bakterie rodu Bacillus mají velmi bohatý enzymový aparát, potraviny znehodnocují zejména štěpením škrobu a bílkovin. Velmi velký význam v konzervárenství mají termofilní bacily, jejichţ spory přeţívají sterilaci masových a zeleninových konzerv a při následném skladování způsobují kvašení nekyselých konzerv, které je provázeno tvorbou plynu. (VLKOVÁ et al, 2009) Bacillus coagulans je z konzervárenského hlediska také důleţitý. Jeho optimum růstu je při teplotě 45 aţ 55°C, spory jsou schopny vyklíčit při pH 4,0 aţ 5,0. Rovněţ bývá příčinou plynuprostého kaţení teplem sterilovaných konzerv (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Vyskytují se v půdě, na zelenině, zejména pak kořenové, v potravinách a to hlavně v tepelně upravených a následně nedostatečně zchlazených jídlech. Nejvýznamnější zástupci tohoto rodu jsou druhy Ba. Cereus, Ba. coagulans, Ba. Subtilis, Ba. Stearothermophilus a Ba. Anthracis. (VLKOVÁ et al, 2009) Rod Erwinia (Doména Bacteria, čeleď Enterobacteriaceae) Jedná se o gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky. Na rozdíl od ostatních zástupců této čeledi se rod Erwinia vyskytuje na rostlinách jako epifytická, saprofytická i patogenní mikroflóra. Můţe vyvolávat nekrózy nebo jiná poškození rostlin a bývá příčinou kaţení plodů a zeleniny během skladování. Erwinia často při kultivaci tvoří červený pigment. (ŠTĚTINA, 2006) Kazí rostlinné potraviny štěpením pektinu. Je to rostlinný patogen, který způsobuje blokádu vodního systému. Mezi zástupce řadíme druhy Erwinia carotovora, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola a jiné. (GÖRNER, VALÍK 2004)

Rod Clostridium (Doména Bacteria, čeleď Bacillaceae)

Dle GÖRNER, VALÍK (2004) zahrnuje různé druhy, mezi které řadíme proteolytické (Clostridium butulinum typ A, C. sporogenes, C. hystolyticum a jiné) a sacharolytické (Clostridium butulinum typ E, C. butyricum, C. felsineum, C. pasteurianum a další). Jsou to grampozitivní, anaerobní aţ aerotolerantní sporulující tyčinky. Fermentují

17 sacharidy za vzniku kyseliny máslové, octové, CO2, H2 a proměnlivého mnoţství acetonu a alkoholu. Proteolytické druhy štěpí nativní nebo koagulované bílkoviny za vzniku hnilobných produktů jako jsou H2S, NH3. Rostou optimálně při 30 aţ 37 °C, C. botulinum má růstové optimum okolo 30 aţ 40°C, ale nemají problém i při 25 °C, vhodné pH se pohybuje v rozmezí 6,5 – 7,0. Inhibován je při pH 8,5 a 6,5 % NaCl. C. botulinum produkuje obzvlášť nebezpečné neurotoxiny – botulotoxiny. Toxiny jsou termolabilní, inaktivují se po půl hodině varu. Na ovoci a zelenině se mohou vyskytnout při styku s půdou, kde se běţně vyskytují.

Rod Gluconobacter (Doména Bacteria, třída Alphaproteobacteria, čeleď Acetobacteraceae, rod Gluconobacter) Podle GÖRNER, VALÍK (2004) je rod Gluconobacter gramnegativní striktně aerobní tyčinky, staré kultury slabě grampozitivní. Tvoří elipsoidní aţ tyčinkovité buňky bez bičíků nebo se svazkem bičíků na pólu. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Oxiduje ethanol v kyselinu octovou, z laktátu a acetátu netvoří CO2 (jiţ není dále oxidován). Optimální teplota růstu je 25 aţ 30°C, rozmezí tolerance činí 7 aţ 41°C, jen některé kmeny nerostou při teplotě nad 37°C. Optimální pH je5,5 aţ 6,0, rostou a tvoří kyselinu octovou oři 4,0 aţ 4,5, rostou i v mírně alkoholickém prostředí. Vyskytuje se na ovoci, v nápojích, kazí alkoholické nápoje na sacharidy bohaté, výroba octu. (GÖRNER, VALÍK 2004)

3.1.2 Kvasinky a kvasinkové mikroorganismy Kvasinky a kvasinkovité mikroorganismy jsou v přírodě hojně rozšířeny. Protoţe mají většinou pouze sacharolytické schopnosti, vyskytují se převáţně na materiálech obsahujících cukry, tj. na ovoci, zvláště bobulovém a peckovém na cukernatých potravinách. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotické MO. Botanicky náleţí mezi mikroskopické houby – mikromycety. Zkvašují sacharidy na etanol a oxid uhličitý. Rozmnoţují se pučením a dělením. Tvoří různé typy vláken – pravé a nepravé hyfy. Tvar buněk souvisí

18 se způsobem vegetativního rozmnoţování, nejčastější tvar buněk je vejčitý, elipsoidní nebo kulovitý. Některé rody vytváří dlouze protáhlé buňky, s tvarem citrónovým, válcovitým nebo trojúhelníkovitým. (CEMPÍRKOVÁ et al, 1997). Vytváří kolonie a tvoří askospory, netvoří mycelium. Kvasinky mnoţící se pouze vegetativně se řadí mezi Fungi imperfecti. Kvasinky jsou spíše aerobní organismy a pro svůj růst potřebují vzdušný kyslík. Mohou se ale přizpůsobit i anaerobním podmínkám, tak ţe přemění svůj metabolismus, za těchto podmínek jsou schopny, především je-li omezen růst buněčné hmoty přeměnit svůj metabolismus na fermentační a tím pádem produkovat CO2 a etanol, coţ v případě CO2 vyuţíváme při výrobě některých fermentovaných potravin, nápojů a v pekárenské výrobě. Určité kvasinky mohou dobře růst i při významném sníţení parciálního tlaku vzdušného kyslíku. Rostou v širokém rozmezí hodnot pH (pH 3aţ 11) jako i teplot (0 aţ 45°C). Určité druhy rostou i při 10°C a při hodnotě pH aţ 1,5. Zygosaccharomyces bailii roste i v přítomnosti nejvyšších přípustných limitů chemických konzervačních látek v potravinách. Některé kvasinky, například i Zygosaccharomyces rouxii rostou výlučně v prostředí s vysokým obsahem cukru (zřídka i v prostředí se zvýšeným obsahem soli). Na rozdíl od těchto osmofilních, rostou osmotoleratní optimálně i při niţším obsahu cukru (do 5%), tolerují ale zvýšené koncentrace s jejich sníţenou aktivitou vody. Pro potravinářské technology z hlediska potravinářské mikrobiologie významné rody a druhy se nacházejí v

řádu

Endomycetales, syn. Saccharomycetales (perfektní kvasinky) a Cryptococcacales (imperfektní kvasinky). Z nich je pro potravinářskou praxi významných asi 20 rodů a k nim přináleţející druhy. (GÖRNER, VALÍK 2004)

Obr. 2. Tvar kvasinky, pučící kvasinka, pupeny (ANONYM, 1999)

19

3.1.2.1 Nejvýznamnější rody kvasinek, které se mohou vyskytovat na ovoci a zelenině Saccharomyces Rod Saccharomyces je technologicky nejdůleţitější, přesto obsahuje pouze 7 druhů. Většinou zkvašuje hned několik cukrů a to glukózu, sacharózu, maltózu, galaktózu a částečně nebo úplně rafinózu. Tvoří většinou krátce elipsoidní, vejčité nebo protáhlé buňky. Spájení je izogamní a askospory jsou kulovité aţ elipsoidní a jsou po 1-4 v asku. Vegetativní fáze je většinou diploidní nebo polyploidní. Nejdůleţitějším druhem je Saccharomyces cerevisiae, uplatňuje se hojně v pivovarnictví, vinařství, pekařství a lihovarnictví. Tento druh slouţí také jako modelový pro biochemické a genetické práce a je nejstudovanější kvasinkou. V pivovarnictví se navíc rozdělují na svrchní a spodní pivovarské kvasinky. Spodní kvasinky byly dříve označovány názvem Saccharomyces uvarum, ale ten byl později zrušen, jelikoţ se ukázaly jako příslušníci pouze jednoho rodu a to Saccharomyces cerevisiae. Vzhledem k tomu, ţe tento druh označuje za kvasný typ, převládá také hojně na povrchu měkkého ovoce. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Candida ŠILHÁNKOVÁ, (2005) uvádí, ţe rod Candida obsahuje 160 druhů. Zahrnuje druhy jak nekvasící, tak také druhy se silnými kvasnými schopnostmi. Tvoří pseudomycelium aţ pravé mycelium, převáţně na vhodných půdách. Některé kmeny mohou být podmíněně patogenní. Mnohem nebezpečnější jsou však některé patogenní druhy, převáţně Candida albicans, která způsobuje závaţné onemocnění u lidí, nachází se převáţně v půdě nebo na ovoci a také se objevuje v konzervárenském průmyslu při práci s cukernatými nálevy. Candida tropicalis se rozmnoţuje pučením a tvoří pseudomycelium, dobře zkvašuje maltózu a sacharózu, neasimuluje dusičnan. Asimiluje pentózy, a proto jsou některé druhy vyuţity při výrobě krmného droţdí. Vyskytuje se zejména na ovoci a na polně hospodářských produktech. Izoluje se i z mléka, z mléčných výrobků a piva. (GÖRNER, VALÍK 2004)

20 Saccharomycodes Tento druh se vyznačuje biopolárním pučením. Buňky jsou dlouhé citrónovitého a pantoflíčkového tvaru, v jednom asku se nachází 1 aţ 4 okrouhlé askospory. Má fermentační schopnosti. Druh Saccharomycodes ludwigii fermentuje glukózu, sacharózu a rafinózu. Je rezistentní vůči SO2 a zúčastňuje se při spontánním kvašení moštu na víno i po jeho zasíření, dobře také snáší nízký redox potenciál. Vyskytuje se zejména na některých ovocných druzích. Ve fermentačním průmyslu způsobuje neţádoucí kontaminaci. (GÖRNER, VALÍK 2004) Geotrichum Je to vláknitá houba patřící do Endomycetes, Dipodascaceae. Velmi rozšířený je druh Geotrichum candidum se rozmnoţuje rozpadem hyf na oidie, které mají téměr obdélníkový tvar. Je enzymaticky velmi aktivní, rozkládá sacharidy, tuky a bílkoviny. Roste dobře na půdách i s vyšším pH (do pH 7), je všeobecně rozšířená v půdě, ve vodě, ve vzduchu, papíře, textiliích, na ovoci a ovocných šťávách, kapustě, kukuřici a jiných obilovinách, v mléčných produktech u lidí i zvířat, v chlebě. V mlékárenském průmyslu je hojně rozšířena a říká se jí mléčná plíseň, dále se vyskytuje na sanitačně ošetřených strojích. (GÖRNER, VALÍK 2004) Tab. 1. Přehled kvasinek vyskytujících se na ovoci rod

výskyt

druh

funkce

Schizosaccharomyc es

pombe, octosporus

Marmeláda, melasa, hroznová šťáva

Dextriny

Saccharomycodes

ludwigii

Některé druhy ovoce

Fermentuje glukózu, sacharózu, rafinózu

Hanseniaspora

uvarum

Ovocné šťávy, hroznový mošt

Fermentuje glukózu

21 Fermentuje glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu, rafinózu, zkvašuje hexózy na ethanol a CO2

Saccharomyces

cerevisiae

Pivo, víno, pekárenství, lihovarnictví

Podrod pichia

membranaefaciens

Ovocné šťávy, fermentované nápoje

Fermentuje glukózu, pentózy

Geotrichum

geotrichum

biologický mat, půda, ţivočichové

Biosyntéza tuků, krmné bílkoviny

Candida

tropicalis, utilis, Droţdí, ovoce a jiné Asimiluje pentózy a mesenterica, rostliny dusičnan albicans, candidum

Rhodotorula

glutinis, rubra

Metschnikowia

pulcherrima

Půda, vzduch, voda, Asimiluje dusičnan ovoce Ovocné šťávy, ovoce

Slabě fermentuje

Sestaveno dle (GÖRNER, VALÍK, 2004)

3.1.3 Plísně Termín plíseň představuje nesystematické označení pro skupinu hub, které pokrývají povrch substrátu jemným bílým nebo barevným myceliem sloţené z jednotlivých vláken takzvaných hyf. V potravinářství má význam asi 15-20 druhů plísní. „Plísně mají pravé buněčné jádro a tak je řadíme mezi více buněčná eukaryonta. Jejich vegetační forma (mycelium) je tvořena z více nebo méně větvených vláken (hyf) o rozměrech 5 aţ 10µm. Mycelium niţších hub není dělené (jako myxomycety, chytridiomycety, oomycety a zygomycety), vyšší houby mají vlákna pravidelně přerušované přihrádkami (septum) – askomycety, bazidiomycety včetně deuteromycet. Hyfy plísní rostou převáţně aţ na jejich volném konci, nejvzdálenějších od základu (apikálně). Nové vegetativní orgány mohou vzniknout i z úlomků mycelií. Nejvýznamnější způsob rozmnoţování hub poskytují jejich nepohlavní (asexuální) a pohlavní (sexuální) tvořené

22 spory.“ (GÖRNER, VALÍK 2004). Jsou heterotrofní, proto nevyuţívají fotosyntézu k produkci ţivin. Systematicky je můţeme zařadit do oddělení: Myxomycota, Hytridiomycota, Oomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota a dále Deuteromycetes (Fungi imperfecti, houby s neznámým pohlavním stádiem rozmnoţování). „Plísně jsou mikroorganismy aerobní, proto se vyskytují zejména na povrchu substrátu. Na rozdíl od bakterií jsou schopny snášet extrémnější podmínky, rostou při niţších hodnotách pH, teplotách a snášejí i niţší vlhkost prostředí.“ (VLKOVÁ et al, 2009) Mezi plísně zahrnujeme fykomycety (pravé plísně) s rody Absidia, Mucor (plíseň hlavičková) a Rhizopus, vřeckaté houby (mj. s rody Bysochlamys a Neurospora) a Fungi imperfecti (houby nedokonalé) s rody Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Scopulariopsis, Sporotrichum, Stachobotrys a Trichothecium. Plísně jsou většinou saprofytické, mohou být uţitečné, produkují-li antibiotika, organické kyseliny, příp. enzymy v průmyslovém měřítku nebo také velice škodlivé z hygienického hlediska, působí totiţ například mykózy lidí, zvířat i rostlin, rozkládá potraviny a krmivo, kazí dřevo, kůţi, papír i textilie a tvoří zdraví škodlivé mykotoxiny.

Obr. 3. Plodnice plísně (ANONYM, 1999)

23

3.1.3.1 Nejvýznamnější rody plísní, které se mohou vyskytovat na ovoci a zelenině Rod Penicillium Podle HAMPL, (1968) je rod Penicillium z latin. Penicillus = štěteček, česky plíseň štětičková. Z plísní je nejrozšířenější a nejrozsáhlejší a obsahuje asi 150 druhů. Jeho druhy tvoří kolonie s velkým mnoţstvím ţlutozelených a modrozelených konidií. Působí plesnivění potravin, skladovaného ovoce a zeleniny, na kterých vytvářejí zeleně zbarvené, sametové nebo moučné povlaky. Dělí se do skupin dle uspořádání štětečkovitých konidioforů. I.

Monoverticillata se štětečkem tvořeným svazkem sterigmat čili fialid. Určité druhy produkují značné mnoţství citrónové kyseliny, jiné tvoří látky antibiotické povahy, které jsou však toxické pro člověka.

II.

Biverticillataymmetrica

tvoří

na

konci

konidioforu

symetricky

uspořádaný svazek válcovitých buněk nazvaných metuly. Z kaţdé metuly vyrůstá svazek sterigmat, některé druhy produkují kyseliny a jiné tvoří antibiotické látky. Téměř všechny druhy uvolňují do prostředí ţluté, oranţové nebo červené barvivo. III.

Asymmetrica nejrozšířenější skupina s nesymetricky uspořádaným štětečkem konidioforu. Některé druhy produkují antibiotika. Penicillium notatum a Penicillium produkci antibiotika

chrysogenum jsou penicilinu. Některé

významné druhy

pro

svou

produkují mykotoxiny

Penicillium expansum je hlavním producentem mykotoxinu patulinu, který ohroţuje kvalitu jablečných moštů a jiných jablečných výrobků. IV.

Polyverticillata

s konidioforem

končícím

bohatým,

opakovaně

větveným, symetricky uspořádaným stětečkem. Jde o poměrně malou skupinu druhů. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995). Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Penicilium expansum, P. aurantiogriseum, P. crustosum,P. solitum

24 Rod Alternaria Zahrnuje asi 50 druhů, mají krátké konidiofory, septované, většinou nevětvené, na koncích velké tmavě zbarvené hruškovité nebo kyjovité konidie. Kolonie jsou jako vlněné, hedvábné nebo pavučinové vlákna, z počátku bezbarvé, poté šedé, dále pak tmavě-olivovo zelené aţ černé. Nachází se především na rostlinných produktech jako parazit, na ţivých rostlinách a plodech, často také na obilovinách, jako černá plíseň na vlhkých stěnách potravinářských provozů, vinicích apod. způsobuje kaţení jádrového, peckového a bobulovitého ovoce, zeleniny a luštěnin (černá hniloba) také i citrusových plodů (vlhká hniloba). A. solani způsobuje chorobu brambor, A. brassicae je parazit na kapustě, kedlubnu a příbuzné zelenině. (GÖRNER, VALÍK 2004) Alternaria alternata tvoří mnoţství mykotoxinů, neznámější je alternariol. Ten se v přírodě kontaminuje různé druhy ovoce jako jablka, maliny, mandarinky, dále pak na rajčata, pepři, olivy, melouny a na obilná zrna. Co se týče zpracovaných produktů, vyskytuje se alternariol v jablečných a hroznových dţusech, ve švestkovém nektaru či v tomatových výrobcích. (BARKAI, PASTER, 2008) Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Alternaria alternata, A. solani, A. brassicae Rod Aspergillus Dle GÖRNER, VALÍK (2004) má tento rod asi 200 zástupců, jsou to větvené nebo septované konidiofory dělící se na 2 skupiny: s jednou a dvěma soupravami sterigia. Je všeobecně rozšířený, častý původce kaţení poţivatin a krmiv, ovoce a ovocných produktů, zeleniny a zeleninových produktů, tuků a jedlých olejů a na tuky bohatých surovin. Jako nenáročný saprofyt se vyskytuje na obilí, mlýnských a pekárenských výrobcích. Často způsobují kaţení potravin s vyšším podílem cukru, soli a s nízkou vodní aktivitou. Vyuţívá se v průmyslu k výrobě amyláz, lipáz, pektináz a kyseliny citrónové. Tvoří toxiny (aflatoxiny) a díky odolnosti vůči vysokým teplotám přeţívají proces konzervace ovoce. Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Aspergillus niger, A. flavus, A. nidulans, A. oryzae, A. parasiticus

25 Rod Fusarium Druh Fusarium se vyznačuje především tím, ţe způsobuje kaţení jablek, brambor, rajčat aj., produkuje toxiny vyvolávající hyalohyfomykózy u člověka a také způsobují nemoci

rostlin.

Rozmnoţuje

se

pomocí

vícebuněčných

banánovitých

nebo

rohlíčkovitých konidií. „Konidiální stádium vytváří buď volné jednotlivé konidiofory, na nichţ se vytvářejí konidie, nebo se konidiofory shlukují do makroskopicky viditelných, drobných polštářovitých útvarů, zvaných sporodochia. V některých případech se vytvářejí souvislé konidionosné porosty – pionoty“. Zástupci rodu Fusarium jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Řada druhů se během evoluce přizpůsobila k parazitismu rostlin, část za určitých podmínek můţe být patogenní i pro ţivočichy, včetně člověka. Rod Fusarium náleţí k významným potencionálně toxikogenním „polním“ mikromycetům. Některé druhy rodu Fusarium našly uplatnění v biotechnologiích jako „kulturní kmen“ k výrobě mykoproteinu quornu. (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003) Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: F.oxysporum, F.avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, semitectum, F. equiseti, F. subglutinans

Rod Botrytis Důleţitý

rod

Botrytis,

tvoří

nepravidelně

větvené

konidiofory

obalené

jednobuněčnými konidiemi vyrůstajícími z krátkých výběţků nebo sterigmat. Druh Botrytis cinerea tvoří tzv. ušlechtilou plíseň na vinařských hroznech, neboť poškozením slupky bobulí zvyšuje výpar vody, coţ je ţádoucí pro výrobu tokajských vín. Při vlhkém počasí způsobuje hnilobu jahod a cibule.(ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Bývá všeobecně rozšířená, jsou to saprofytičtí nebo fakultativní paraziti na rostlinách. Způsobují hnilobu jádrového ovoce (hniloba jádra), šedá hniloba bobulovin (šedá plíseň jahod), peckovitého ovoce, zeleniny a části rostlin (šedá hniloba). (GÖRNER, VALÍK 2004) Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Botrytis cinerea

26 Rod Cladosporium Rod Cladosporium tvoří řetízky vícebuněčných spor, které však vznikají pučením, takţe jde o blatospory. Spory i starší mycelium jsou tmavě zbarveny. Často parazituje na rostlinách (chmelu, máku, okurkách, rajčatech). Rozkládá celulózu, pektiny a tuky. Vyvolává také alergii dýchacích cest.(ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Cladosporium je všeobecně rozšířená houba. Stejně jako Botrytis je Cladosporium saprofytické nebo fakultativní a parazitické na rostlinách, nachází se na obilí, ovoci a zelenině, masových produktech na textiliích a podobných organických předmětech. Jsou škůdci peckového ovce, citrusových plodů a zeleniny (zelená hniloba). C. herbarum (tmavé mycelium, „černá hniloba“) roste na vlhkých stěnách a stropech i při velmi nízkých teplotách. Rhinocladiella cellaris se vyskytuje na stěnách vinařských a pivovarských sklepích jako hnědý, pavučinový porost. C. fagi tvoří toxin, kyselinu epikladosporinovou.(GÖRNER, VALÍK 2004) Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Cladosporium herbarum Rod Mucor Podle ŠILHÁNKOVÁ, (1995) zahrnuje rod Mucor přes 100 druhů. Na různých potravinách, jako např. ovoci a zelenině, tvoří vláknitý, většinou bělavý porost s kulovitými nahnědlými sporangii, jejich kolumela má různý tvar. Některé druhy produkují mykotoxiny, jiné jsou navíc ještě patogenní. Mucor javanicus a Mucor rouxii obsahují amylolytické enzymy, tedy zkvašují sacharidy za anaerobních podmínek na ethanol a oxid uhličitý, proto se v Japonsku a Číně vyuţívají pro výrobu alkoholických nápojů ze sóje. Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Mucor racemosus, M. plumbeus Rod Rhizopus Rod Rhizopus je v přírodě také hojně rozšířený, působí kaţení ovoce i jiných potravin. Některé druhy tvoří mykotoxiny, některé jsou patogenní. Tvoří dlouhé vlákna a dlouhé sporangiofory vyrůstají po 2 aţ 3 ze šlahounovitých hyf nebo stolonů

27 v místech, kde vznikají kořínkovité hnědavé útvary zvané rhizoidy. Některé druhy se pouţívají pro zcukřování a zkvašování obilí na alkoholické nápoje (arak, R. oryzae). (ŠILHÁNKOVÁ, 1995) Na mase rostou i při chladírenských teplotách +6 aţ +4 °C. R. stolofiner se nejčastěji vyskytuje na ovoci a zelenině, kde způsobuje „ mokrou hnilobu“ (GÖRNER, VALÍK 2004) Na ovoci a zelenině se vyskytují převážně tyto druhy: Rhizopus stolofiner, R. oryzae Rod Monilia Dle GÖRNER, VALÍK (2004) rod Monilia zahrnuje asi 10 druhů, jsou to jednotlivé nebo větvené oválné konidie vznikající odškrcováním z jedné hyfy. Kolonie jsou kypré, vlasovité, bílé, růţové aţ lososově červené. Způsobuje plesnivění různých potravin, kromě jiného obilí, masových produktů, jádrového a peckového ovoce. Druhy rodu Monilia jsou rostlinní paraziti, kteří obyčejně způsobují měkkou hnilobu ovoce (broskve, meruňky a jiné). Na ovoci se vyskytují převážně tyto druhy: Monilia fructigena

3.1.4 Mikrobiologie výrobních procesů V potravinářském průmyslu, ale i v běţných domácích podmínkách je kaţení potraviny výsledkem činnosti neţádoucích mikroorganismům. Růst a mnoţení, tím pádem zkáza potraviny závisí na mnoha různých faktorech, především pak na vnitřní charakteristice potraviny, způsobu zpracování a skladování, dále pak je neméně důleţitým faktorem potřeba dodrţovat správné hygienické zásady. Kombinace těchto parametrů je důleţitým faktorem ovlivňující koncentraci přítomných patogenů. (KOMPRDA, 1997) Výskyt mikroorganismů v zeleninových surovinách lze očekávat. Aby odráţely hygienickou kvalitu, musí být v době zpracovaní u surových produktů zjištěn počáteční stav napadení mikroorganismy. Ve studii, kdy stav fazolových lusků před zpracováním, konkrétně před blanšírováním ukázal, ţe celkově se počítá v rozmezí od 5,60 log10 do

28 6,00 log10, průzkum byl proveden ve dvou výrobních závodech. Po blanšírování se celkový počet zredukoval na hodnoty okolo 3,00 - 3,60 log10/g . Po absolvování různých fází zpracování a balení se počítá s rozmezím od 4,72 na 5,94 log10/g. V případě francouzského stylu výroby fazole došlo k jednomu z největších nahromadění MO bezprostředně hned po krájení. Tento stejný obecný model byl proveden i u kukuřice a hrachu. Před blanšírovaný hrášek ze tří závodů prokázal, ţe celkový počet MO na gram vychází mezi 4,94 a 5,95 log10/g. Tyto hodnoty byly sníţeny po blanšírování, ale postupně se zase zvyšují při dalších krocích zpracování. V případě kukuřice, počet MO vzrostl ihned po blanšírování, dále převáţně při krájení a těsně před praním. Vzhledem k tomu bezprostředně po blanšírování měl výrobek hodnotu 3,48 log10/g, celková hodnota po zabalení činila 5,94 log10/g. Mezi 40 a 75 % z bakteriálních biot hrachu, fazole a kukuřice bylo prokázáno, ţe se skládají z leukonostoků a streptokoků, zatímco mnohé z grampozitivních a katalázo pozitivních tyčinek se podobá korynobakteriím. Můţeme říci, ţe APC činí přibliţně 6 aţ 7 log10/g cfu/g coţ je na zelenině zcela běţné, a počet koliformních bakterií pohybujících se přibliţně okolo 5 aţ 6 log10 také není nic neobvyklého. Koky mléčného kvašení se často vyskytují při mnoha způsobech zpracování zeleniny. Bylo prokázáno, ţe tyto koky představují 41 aţ 75% z mnoha aerobních MO biot (APC) z mraţeného hrášku, vyloupaných fazolí a kukuřice. Také bylo prokázáno, ţe čerstvý hrášek, kukuřice a fazolové lusky a všechny obsaţené koagulázy jsou pozitivní na stafylokoky převáţně po zpracování. Obecné nahromadění stafylokoků na zelenině došlo při postupných fázích zpracování a hlavním zdrojem kontaminace mikroorganismem jsou ruce zaměstnanců. Ačkoli lze stafylokoka na zelenině nalézt především při zpracování, obecně se jim lépe daří na mléčném substrátu, kde se lépe mnoţí. Koliformní bakterie (ale ne Escherichia coli) a enterokoky byly nalezeny ve většině etap zpracování syrové zeleniny, ale zdá se, ţe nepředstavují ţádné nebezpečí veřejnosti. (JAY et al, 2004)

3.1.4.1 Mikrobiologické zatížení Celková RTU (připravené k pouţití, připravené k jídlu) produkce se v ţádném případě neobejde bez napadení mikroby. Zelenina se obvykle opírá vodou, která obsahuje chlór asi 50 aţ 200 ppm. Po praní následuje krájení a balení. Při mytí se sniţuje počet přítomných mikrobů. Při krájení je velká pravděpodobnost napadení.

29 Protoţe čerstvě nařezaná zelenina poskytuje vyšší úroveň vlhkosti, více jednoduchých ţivin a větší plochy pro růst, všechny tyto vlastnosti dělají výrobek mnohem více náchylný k mikrobiálnímu růstu, neţ původní nenařezaná zelenina. První čísla v den skladování 0 se pohybovala od 4,82 log10/g aţ zhruba 6 log10/g, ale po čtyřech dnech skladování se počet organismů pohyboval mezi 5,45 log10/g aţ necelých 7,0 log10/g. V dřívějších studiích APC ze RTU zeleniny při sklizni byla asi 10 5 - 108 /g. Počet koliformních bakterií byl v rozmezí od 5,1 aţ 7,2 log10/g, ale nebyly nalezeny typy kmenu E. coli. Nejvíce převládajícími organismy byly Pseudomonas a Pantoea. Mezi typy organismů, které byly nalezeny na špenátu skladovaném 12 dní při teplotě 10°C se řadí mezofiloní MO a jejich počet se pohyboval mezi 102 – 1010 /g, dále psychrotropní MO a pseudomonády (gramnegativní, pohyblivé, nesporulující, aerobní nebo příleţitostně anaerobní tyčinky) mezi 106 -1010 /g a počet střevních bakterií se pohybuje mezi 104 -107 /g. (JAY et al, 2004) Podle JAY et al, (2004) se na kaţení zeleniny a ovoce podílí bakterie druhu Erwinia, Pectobacterium a Pantoea. Například Pectobacterium carotovorum způsobuje měkkou hnilobu. Dalšími patogeny zeleniny, ale i ovoce mohou být Xanthomonas, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, Citrobacter, Pseudomonas, Acidovorax, Salmonella a další, z říše hub pak Botrytis cinerea, Rhizopus stolofiner, Penicillium expansum, Geotrichum candidum, Candida sake, Phytophora, Monilia fructigena, Kleibsella, Saccharomycodes a jiné.

3.1.4.2 Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie je fluorescenční označování ţivotaschopných mikroorganismů. V tomto procesu probíhá odečítání označených buněk průtokovým cytometrem s laserem a vyhodnocovacími celami, které se nazývají BactiFlow ALS, Bactiflow, DCount. Zařízení BactiFlows ALS a D-Count spolehlivě rozlišuje mikroorganismy od ostatních částic, je vysoce citlivá a proto je vyuţitelná pro mnohé typy výrobků. Funguje bez nutnosti interpretace dat, okamţitě na displeji zobrazí počet buněk, poskytuje absolutní dohledatelnost dat a snadnou validaci. Metoda Chem ScanRDI x DCount - BactiFlow se v potravinářských podnicích vyuţívá pro testování finálních výrobků během několika hodin, nikoliv dní. Tím pádem je zajištěno rychlé odhalení kontaminace, následné ohlášení problému a jeho případné řešení. Tyto metody minimalizují kontaminační riziko a ztrátu, coţ je důleţité pro dobré jméno firmy.

30 Důvody pro vyuţívání těchto metod jsou čistě ekonomické, zabrání se výrobním ztrátám, dojde k poklesu nákladů na skladování a evidenci, sníţí se spotřeba elektrické energie při pasterizaci a jiném ošetření, přerušení výroby se omezuje na minimální a tím pádem roste flexibilita výroby. (ZÁHRADNÍK, 2011)

3.2 Vliv citlivosti MO vůči zvýšeným teplotám a dalším fyzikálním vlivům Dle GÖRNER, VALÍK (2004) má většina potravin v nativním stavu velmi krátkou trvanlivost. Je moţné ji prodlouţit chlazením při teplotách niţších jak 6°C, nebo teplotní přípravou jako je vaření, dušení, pečení aj., ale tato opatření jsou omezena relativně krátkým časem. Abychom dosáhli středně a dlouhotrvající trvanlivosti, pouţijeme fyzikální, chemické a biologické metody. Mezi fyzikální metody patří záhřev, chlazení, mraţení, sušení, zahušťování, solení, slazení a ionizující záření. Mezi chemické metody patří pouţití chemických látek, lakování a uzení, mezi biologické metody se zahrnuje fermentace za vzniku kyseliny mléčné nebo alkoholu. Adaptivním nebo ochranným reakcím můţe následovat zvýšení tolerance organismu ke stejnému nebo různému typu stresu. Tento fenomén je občas popisován jako adaptivní odpověď, navození tolerance, osídlování, přivykání nebo zastírání stresu. Někdy mikroorganismy cítí stres a poté odpovídají různými způsoby. Bakterie cítí stres, kdyţ se změní membránová fluidita (chladový šok), pozmění strukturu buněčných proteinů nebo naruší ribozomy (teplo), nebo rozruší nukleové kyseliny (γ záření). Na molekulární úrovni stres způsobuje přepis vedoucí k syntéze proteinu na regulační proteiny. Výsledná regulace můţe vést k syntéze i dalších proteinů, které se vyrovnají s uloţeným stresem. Mikrobní reakce na stres můţe vyvolat tyto následky:

• Produkci proteinů, které opravují škody, udrţují buňky, nebo eliminují stresové činitele • Přechodné zvýšení odolnosti nebo tolerance na škodlivé faktory • Transformace buněk do klidového stádia, tj. výtrusové formace nebo ţivotaschopné buňky, ale které se nachází v nečinném stavu • Uniknou z obrany hostitelského organismu

31 • Vzniknou adaptabilní mutanti (YOUSEF, JUNEJA, 2003)

3.2.1 Teplota Mikroorganismy mohou růst pouze v omezeném rozsahu teplot, máme tři základní rozsahy teploty. Minimální teplotu, kdy je daný druh schopen rozmnoţovat se zjistitelnou rychlostí, optimální teplotu, kdy se rozmnoţuje nejrychleji, maximální teplotu, kdy je schopen se ještě rozmnoţovat. Maximální moţný růst buněk nebo teplota, kdy jsou buňky a spory usmrceny a inhibovány, se povaţuje za klíčovou teplotu. Buněčné komponenty jsou zničeny a nemohou být nahrazeny. To se stane v případě stále se zvyšující teploty. Všeobecně se teplota povaţuje za prvotní způsob usmrcení MO, rychlost smrtícího účinku závisí na počtu ţivotaschopných přítomných buněk. Matematicky můţeme účinky teploty vyjádřit: dN / dt = - cN

(1.0)

kde dN /dt je hranice smrti, N je počet ţivotaschopných přítomných buněk a c je proporcionální konstanta. Znaménko mínus znamená, ţe N je klesající, tak získáme informace o počtu buněk přeţívajících různé hodnoty teplot, tato rovnice můţe být jednotná mezi časem nula a času t, kdyţ: loge (N / N0) = - ct

(2.0)

N = N0 e –ct

(3.0)

nebo

kde N a N0 je počet ţivotaschopných přítomných buněk respektive na dobu t a t0. Lze vyvodit jednoduchá rovnice, pokud jde o základní logaritmy 10: log10 (N / N0) = - k kde k = c / log1010 = c / 2,303

(4.0)

32 Z rovnice (4.0) je jasné, ţe podle počtu přeţívajících buněk při dané teplotě za určitý čas by měla přímka s negativním sklonem, kdyţ se zvýší teplota, zvýšit i sklon křivky. Z tohoto vztahu můţeme odvodit míru odolnosti organismu, teplo je tedy uţitečné při výpočtu smrtící (letální) hodnoty tepelných procesů. Hodnoty D nebo desetinné sníţení doby je definována jako čas při dané teplotě, kdy se přeţívající populace sníţí o 1 logaritmický řád, tj. 90% teploty, při které platí hodnota D jako teplotní index. Čím je mikroorganismus odolnější vůči vysoké teplotě, tím vyšší bude, při určité stálé teplotě jeho hodnota D. Hodnota D bude kratší v případě, o kolik vyšší bude teplota působící na MO. Při údajích D hodnot se musí proto vţdy jako index uvádět příslušná teplota, při které je příslušná D hodnota platná. Například, D121,1 =1 pro Clostridium sporogenes znamená, ţe v kultuře testovacího kmene při působení teploty 121,1 °C se za 1 minutu sníţí počet ţivých buněk o 90%. D označující index, např. D65 můţe být získána z buněk, které přeţili log10 v závislosti na čase, kde hodnoty klesají, 1/k (můţe se potvrdit tím, ţe nahrazuje N0 = 10 N a t = D.) Z tohoto vztahu se dá vyvodit: D = ( t2 - t1) / (log N1 – log N2) D

(5.0)

kde N1 a N2 přeţívají v době t1 a t2, příslušnou tepelnou citlivost mikroorganismů. Jedním z důsledků je, ţe z rovnice se nemůţe nikdy s jistotou předpovědět, kolik desetinných sníţení musí pro výrobek, který má být sterilní při tepelném zpracování dosáhnout, jelikoţ se nikde neuvádí, ţe log N2 je N2 = 0. Při počáteční populaci mikrobů je výrobek počítán v šarţi 10n a při tepelném zpracování n se pouţije desetinná redukce (nD), kdyţ bude existovat alespoň jeden přeţívající organismus ve výrobku (log 1 = 0). Pokud se pouţije těţší formy tepelného zpracování, (n+1)D, (n+2)D nebo (n+4)D dá se říci, ţe pak je počet doţívajících 10-1, 10-2 nebo 10-4. (ADAMS, MOSS, 2008) Dle nároků na teplotu prostředí, ve kterém jsou mikroorganismy schopny se rozmnoţovat a metabolizovat se dělí na psychrotrofní, psychrofilní, mezofilní a termofilní organismy. Psychrotrofní rostou bez ohledu na jejich optimální teplotu převáţně při 7°C aţ 5°C a niţších, mohou klesnout i k 0°C, je to rozšířená skupina při skladování. Některé kmeny

33 z rodu Pseudomonas a Clostridium botulinum snáší teploty i pod nulou (-7°C). Extrémní psychrotrofní organismy jsou kvasinky a plísně, které rostou i při -10°C, v některých případech odumírají aţ při vymrznutí vody při teplotách -20°C - 30°C. Mezofilní jejich optimální teplota je 30-40°C, jejich teplotní minimum je mezi 5 – 15°C, patří sem bakterie mléčného kvašení a většina grampozitivních bakterií. Termofilní rostou při teplotě vyšší jak 55°C, mezi termofilní MO patří některé druhy rodu Bacillus a Clostridium. Jejich spóry se vyuţívají při testování sterilizačních postupů a zařízení, jelikoţ jsou jejich spóry vysoce termotolerantní. Psychrofilní nerostou při teplotách vyšších jak 20 °C (GÖRNER, VALÍK 2004) Obecně je známo, ţe psychrotrofní mikroorganismy jsou méně odolné vůči zvýšeným teplotám neţ mezofilní, ale nejodolnější ze všech jsou termofilní MO, a grampozitivní MO jsou odolnější neţ gramnegativní MO. Většina vegetativních buněk je usmrceno okamţitě je-li teplota vyšší jak 100°C. Jejich hodnoty D jsou měřeny, aby následně vyjádřily stupeň teploty vhodné pro pasterizaci. Spóry bakterií jsou obvykle mnohem odolnější neţli vegetativní buňky, termofilní MO produkují více teplotně odolných spor, zatímco psychrotrofové a psychrofilové jsou na vyšší teploty citlivé. Zatímco inaktivace výtrusů je hlavním zájmem při uchování potraviny, jsou vysoké teploty pouţívány při konzervárenských procesem a k měření počtu spor. Kvasinkové askospory D a nepohlavní výtrusy plísní, jsou odolné jen o trochu více neţ jejich vegetativní formy a za normálních okolností je teplota vhodná k usmrcení pod 100°C nebo askospory druhu Byssochlamys fulva a několik dalších askomycetů vykazují značnou tepelnou odolnost a mohou být příleţitostnou příčinou problému při konzervaci ovoce, které se nezahřívají na příliš vysokou teplotu. Teplotní citlivost je také závislá na sloţení teplotního menstrua (rozpouštědlo, které rozpustí tuhou hmotu, nebo vytvoří suspenzi), buňky mají tendenci vykazovat větší teplenou citlivost, kdyţ pH je větší jak 8 nebo sníţená pod 6. Tuk zvyšuje tepelný odpor stejně jako klesající vodní aktivita a w při sušení nebo přidávání rozpustných látek, jako je sacharóza. (ADAMS, MOSS, 2008)

34

3.2.1.1 Tepelné zákroky při konzervaci potravin Blanšírování je tepelná úprava ovoce a zeleniny, která vede k inaktivaci enzymů, k úpravě konzistence a odstranění vzduchu. Tento zákrok předchází dalším způsobům konzervace. Pasterace je záhřev na teploty pod 100°C, který inaktivuje vegetativní formy mikroorganismů, pouţívá se ke konzervaci kyselých potravin, kdy je pH menší či rovno pH 4, 0 nebo se pouţívá při konzervaci nekyselých potravin, kdy je tento zákrok doplněn dalším, a to konzervací sníţenou teplotou. Sterilizace je záhřev na teploty vyšší neţ 100 °C (obvykle 121,1 °C), takto vysokou teplotou inaktivuje vegetativní formy mikroorganismů a hlavně velmi odolné bakteriální spory, a pouţívá se ke konzervaci nekyselých potravin, jejichţ pH je vyšší neţ 4,0. Za frakcionovanou sterilaci (tyndalaci) se povaţuje opakovaný záhřev na teploty do 100 °C, provedený v průběhu jednoho aţ několika dní, který se pouţívá ke konzervaci nekyselých potravin, přičemţ opakovaný záhřev umoţní inaktivaci přítomných bakteriálních spor v době po jejich vyklíčení. (GOLIÁŠ, 2011)

3.2.2 Chlazení a mražení Při rychlém přenesení intenzivně rozmnoţujících se buněk některých druhů bakterií z optimální teploty na teploty blízké 0°C, dochází k tzv. chladovému šoku, který usmrtí velký podíl populace. Chladový šok byl pozorován u grampozitivních sporulujících, gramnegativních a dokonce i psychrofilních bakterií. Citlivost bývá u různých druhů odlišná.

Staphylococcus

aureus

je

vcelku

rezistentní,

zatímco

Bacillus

stearothermophilus patří k nejcitlivějším druhům, jejich ţivotnost se ztrácí při odebrání z 20°C, Clostridium perfringens je tak citlivé, ţe ihned odumře 95% buněk po odebrání z teploty 37°C a předáním do 4°C. Buňky podrobené chladovému šoku jsou také citlivější vůči nepříznivým podmínkám (například ţe nerostou v plném počtu na selektivních půdách pouţitých ke stanovení jejich druhu, i kdyţ na plnohodnotné půdě ještě rostou). Při pomalém zmrazování mikrobiálních buněk na teploty pod 0°C se z vnitrobuněčné i mimobuněčné vody tvoří velké krystaly ledu, které poškozují buňku a usmrcují ji. Velmi citlivé při pomalém zmrazování jsou příslušníci rodu Pseudomonas, zatímco koky a endospory bakterií jsou odolné. Nikdy nejsou usmrceny všechny přítomné buňky mikroorganismů, rychlým zmrazením na teploty -30 aţ -190°C se

35 usmrtí jen malý podíl populace, tvoří se zde totiţ pouze mikrokrystalky ledu, které tolik buňku nepoškodí. Ve zmrazených potravinách, které se skladují v teplotním rozmezí 15 aţ -18°C déle neţ jeden rok, se stále nacházejí přeţívající mikroorganismy, to znamená, ţe při zmrazení potraviny dochází pouze k zastavení jejich činnosti, ale ne k jejich usmrcení. Tkáně masa nebo rostlinná pletiva jsou poškozeny krystalky ledu při zmrazování a tak dochází po roztání k jejich rychlému mikrobiálnímu rozkladu. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995)

3.2.3 Ionizující záření Má frekvenci vyšší neţ 1018 Hz a vykonává dostatek energie k vypuzení elektronů z molekul. V praxi se pouţívají tři různé druhy záření, jsou to β - záření (vysoce energetické elektrony), x- záření a gamma γ - záření. Ionizující záření mohou ovlivňovat molekuly v mikrobiálních buňkách, mohou ovlivnit mikroorganismy přímo nebo nepřímo prostřednictvím inhibičních účinků volných radikálů produkovaných radiolýzou vody. Tyto nepřímé vlivy hrají stále důleţitější roli, neboť v nepřítomnosti vody, jsou dávky záření, aby došlo k usmrcení mikroorganismů 2 – 3 krát vyšší. (ADAMS, MOSS, 2008) Citlivost MO závisí na jejich druhu a jejich kmenové rozdílnosti. Všeobecně jsou grampozitivní bakterie odolnější neţ gramnegativní. Mnohem více jsou rezistentnější kvasinky, plísně a bakteriální endospory. Antimikrobiální účinek záření se vyuţívá pro dekontaminaci pitné vody a sníţení mikrobní kontaminace ovoce a zeleniny. Pouţití této technologie je do jisté míry omezené moţným znehodnocením chuťových a barevných vlastností, nebo i degradací vitamínů, coţ sniţuje biologickou hodnotu poţivatin. (GÖRNER, VALÍK 2004) Ozáření Elektromagnetické záření je způsob, jakým můţe být šířena energie prostřednictvím prostoru. Toto je charakterizováno z hlediska vlnové délky, nebo její frekvenci w, a výsledkem těchto dvou vlastností je rychlost c, která se pohybuje v hodnotách (3 x 108 m sec -1 ve vakuu). (ADAMS, MOSS, 2008)

36

3.3 Mykotoxiny Mykotoxiny jsou definovány jako nízkomolekulární sekundárně metabolické produkty houbových organismů, toxické pro rostliny i teplokrevné ţivočichy včetně člověka,

vyskytují

se

převáţně

v rostlinných

materiálech.

Mykotoxiny jsou

produkovány přibliţně 150 druhy mikroskopických hub, z nichţ většina producentů patří do skupiny Fungi imperfecti. „Představují heterogenní skupinu nepolárních nízkomolekulárních sloučenin poskytujících jejich producentům určité výhody v soutěţi o substrát s jinými organismy podobné ekologické konstituce. Vláknité houby se vyskytují v různých ţivotních formách – v nepohlavní (konidiové) označované jako anamorfa, v pohlavní (askogenní) formě – teleomorfa či proţívají celý ţivotní cyklus – holomorfa. Jejich biosyntetický potenciál a toxicita produktů jsou značně různorodé. Je třeba si uvědomit, ţe ne všechny mikromyceta tvoří mykotoxiny, velmi závisí na teplotě, vlhkosti a typu substrátu.“ (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003) Potraviny bývají nejčastěji kontaminovány v průběhu skladování a jiţ na poli. Převáţně se nacházejí v obilovinách, ale běţné jsou i v ovoci a zelenině, koření, olejnatých ořechách a samozřejmě i surovinách ţivočišného původu. “Některé mykotoxiny se uvolňují z houbového vlákna a kontaminují substrát (potraviny, krmivo), ve kterém pak nemusí být houbový organismus vůbec prokázán. Houbové enzymy uvolňované do prostředí mohou štěpit makromolekuly substrátu a vytvářet další jedovaté látky, zvláštním případem jsou fytoalexiny – látky produkované rostlinami jako obrana proti mikrobní kontaminaci.“ ( HRDINA et al, 2004) Mykotoxiny se do potraviny dostávají působením plísní, při zpracování polotovarů a meziproduktů

s obsahem

mykotoxinů,

při

krmení

hospodářských

zvířat

kontaminovanými krmivy, dále se dostávají mykotoxiny do mléka a také do masa zvířete, nebo jsou obsaţeny v některých fermentovaných potravinách, jako jsou sýry a salámy. Z hlediska historické posloupnosti poznávání účinku těchto látek lze mykotoxiny zařadit do několika hlavních skupin:  alkaloidy produkované houbou Claviceps purpurea, kumarinové aflatoxiny, ochratoxiny, trichothecény (nivalenol) a fumonisiny.  Dosud nejintenzivněji studovanými mykotoxiny byly toxické metabolity produkované rody Aspergillus a Penicillium.

37 Tab. 2. Přehled vybraných významných vláknitých mikromycetů vyskytujících se na ovoci (podle MALÍŘ, OSTRÝ, 2003)

Rod

Druh

Aspergillus spp.

flavus, niger, carneus

Penicillium spp.

citrinin, brevicompactum, expansum, verrucosum

Fusarium spp.

oxysporum, avenace, umequiseti, moniliformae, culmorum, subglutinans

Cladosporium spp.

cladosporioides, herbarum, sphaerospermum

Alternaria spp.

alternata

Řád Mucorales Mucor spp.

Absidia corymbifera = mycocladus corymbifer Mucor piriformis, circinelloides, racemosus stolofiner

Rhizopus spp.

Tab. 3. Přehled mykotoxinů, které produkuje rod Aspergillus (upraveno dle MALÍŘ, OSTRÝ, 2003 viz tabulka 3-4)

Plíseň

Mykotoxin

Aspergillus spp. A. carneus

citrinin

A. clavanus

patulin

A. flavus

alfatoxiny B1 a B2

A. oryzae

cyklopiazonová kyselina

38 A. ochraceus

ochratoxiny

A. parasiticus

alfatoxiny B1, B2, G1 a G2

A. tereus

patulin, citrinin

A. versicolor

sterigmatocystin

A. niger

Ochratoxin A

Tab. 4. Přehled mykotoxinů, které produkuje rod Penicillium (upraveno DLE MALÍŘ, OSTRÝ, 2003, viz tabulka 3-9)

Plíseň

Mykotoxiny

Penicillium spp.

Alternariové mykotoxiny

P. citrinum

citrinin

P.brevicompactum

cyklopiazonová kyselina

P. expansum

patulin, citrinin

P. verrucosum

citrinin, ochratoxin A, cyklopiazonová kyselina

P. chrysogenum

Roquefortin C, cyklopiazonová kyselina

P. roqueforti

Roquefortin C, mykofenolová kyselina, patulin, peniciliová kyselina

39 Tab. 5. Přehled mykotoxinů, které produkuje rod Fusarium (upraveno dle MALÍŘ, OSTRÝ, 2003, viz tabulka 3-14)

Plíseň

Mykotoxin

Fusarium spp. F. oxysporum

fusarin C, fusarenon X, moniliformin, T-2 toxin, sambutoxin

F. avenaceum fusarin C, moniliformin, T-2 toxin F. equiseti equisetin, diacetoxyscirpenol, zearalenon T-2 toxin F.moniliformae fumonisiny, fusarin C, A, E, D, F F. semitectum T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, zearalenon, nivalenol F. culmorum 3- acetyl, zearalenon, nivalenol, fusarin C, fusarenon X F. subglutinans Moniliformin, beauvericin, fusaric acid, fumonisiny

Tab. 6. Mykotoxiny podle chemické struktury členíme do následujících skupin (dle MALÍŘ, OSTRÝ, 2003, viz tabulka 4-2)

Chemická struktura

SlMykotoxin

Cyklické dipeptidy

Brevianamidy, fumitremorgen, gliotoxin, roquefortin, sporidesminy, verukulogeny atd.

Epoxytrichothecen

Deoxynivalelol, diacetoxyscirpenol, fusarenony, nivalenol, roridiny, satratoxiny, T-2 toxin, verukariny atd.

Furanofurany

Aflatoxiny, sterigmatocystin, versikolorin atd.

Griseofulviny

Griseofulvin

40

Nenasycené laktony

Arternariol, citreoviridin, kyselina mykofenolová, kyselina penicilová, ochratoxiny, patulin, psoralen, rubratoxin B atd.

Polycyklické substituované indolové deriváty

Kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy atd.

Substituované chinony

Luteoskyrin, rubratoxin, viridikatumtoxin, xanthomegnin atd.

Substituované pyreny a hydroxypyreny

Kyselina kojová, sekalonové kyseliny atd.

Mykotoxiny s jinou chemickou strukturou

Citrinin, curvularin, kyselina β-nitropropionová, PRtoxin, zearelenon atd.

3.3.1 Mykotoxiny vyskytující se na ovoci a jejich chemické složení Aflatoxin Jsou vysoce termorezistentní a inaktivace trvá delší dobu. „Aflatoxiny jsou mykotoxiny

odvozené

od

difuranokumarinového

skeletu.

Jsou

produkovány

toxigenními kmeny Aspergilus flavus (asi 35% kmenů produkuje aflatoxiny řady B) A. parasiticus (téměř 100% kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G) a A. nomius (rod Aspergillus je konidiové stadium – anamorfa vřeckovýtrusné houby rodu Eurotium z čeledi Eurotiaceae, řádu Eurotiales). Tyto látky působí jako hepatotoxiny a hepatokarcinogeny.“ (HRDINA et al, 2004) Aflatoxiny jsou polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny. Byly identifikovány 4 přirozeně se vyskytující typy aflatoxinů a to AFB1, AFB1, AFG1 a AFG2, celkově existuje 20 identifikovaných typů aflatoxinů. Za určitých podmínek (vlhkost, teplota) A. flavus a A. parasiticus jsou schopny růst a tvořit aflatoxiny na téměř kaţdém organickém substrátu (včetně všech zemědělských komodit). Na ovoci a to zejména na citrónu a na mangu se vyskytuje aflatoxin G2. (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003)

41 Aflatoxin B1: Název

podle

Chemical

Abstarcts:

Cyclopenta(c)furo(3´2´:4,5)furo(2,3-

h)(1)benzopyran-1,11-dione,2,3,6a,9a-tetrahydro-4-methoxy-,(6aR-cis)Sumární vzorec: C17 H12 O6 Molekulová hmotnost: 312 g.mol-1 Strukturní vzorec:

Obr. 4. Aflatoxin B1 (ŠIMŮNEK, 2003)

Patulin Metabolit produkován velkým mnoţstvím hub několika rodů, včetně Penicillium, Aspergillus a druhu Paecilomyces. Patulin byl nalezen na různých druzích ovoce, jako jsou hrušky, jablka, meruňky, broskve, hrozny a olivy. Patulin byl popsán, ţe se stabilně vyskytuje na suchých obilovinách, jablkách a hroznové šťávě.(BARKAI, PASTER 2008) Chemicky je patulin nenasycený lakton. Patří mezi polyketidové sekundární metabolity a jeho biosyntetická dráha platí mezi nejlépe prozkoumané dráhy sekundárního metabolismu hub. Prvním meziproduktem patulinové dráhy je kyselina 6methylsalicylová, která vzniká kondenzací acetylkoenzymu A s třemi malonátovými jednotkami. (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003) Název podle Chemical Abstarcts: 4 – hydroxy – 4 H-furo [3, 2 - c] pyran - 2(6H) one

42 Jiný název: Clairformin, Claviform, Expansine, Clavacin, Clavatin, Expansin, Gigantin, Leucopin, Patuline Sumární vzorec: C7 H6 O4 Molekulová hmotnost: 154.12 g.mol-1 Strukturní vzorec:

Obr. 5. Patulin (ŠIMŮNEK, 2003) Ochratoxin A V tropických oblastech je OTA produkován mikromycety rodu Aspergillus. Optimální teplota pro jeho produkci plísní Aspergillus ochraceus se pohybuje okolo 28°C, i kdyţ můţe být touto plísní produkován v teplotním rozsahu 15-37°C. V chladných oblastech je OTA produkován spíše vláknitými mikromycety rodu Penicillium. Mikromycety rodu Penicillium jsou schopny produkovat OTA jiţ od teploty 30°C při 22% relativní vlhkosti. OTA z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi pentaketidy. OTA je dominantní ve skupině ochratoxinů. Ty lze obecně charakterizovat jako deriváty 7izokumarinů vázané na aminoskupinu L-β- fenylalaninu. (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003). Dále se vedle ochratoxinu A vyskytuje také ochratoxin B. Vyskytuje se na sušeném ovoci, jako jsou fíky, rozinky a pak v grepové šťávě. Název podle Chemical Abstarcts: N-{[(3R)-5-chloro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-3,4dihydro-1H-isochromen-7-yl]carbonyl}-L-phenylalanine Sumární vzorec: C20H18ClNO6

43 Molekulová hmotnost: 403.81 g.mol-1 Strukturní vzorec:

Obr. 6. Ochratoxin A (ŠIMŮNEK, 2003)

Fumonisin Tato skupina mykotoxinů je produkována především rody Fusarium spp., přitom tento rod je velmi polymorfní a produkuje spoustu dalších významných mykotoxinů, jako například zearalenon, trichoteceny, monilioforminy a další. Mezi fumonisiny patří fumonisin B1, B2, B3. Nachází se především na kukuřici, pšenici a obilovinách, ale také na ovoci a zelenině.Fuminisiny je moţno chemicky charakterizovat jako sloţité alifatické sloučeniny. Jedná se odiestery propan-1,2,3- trikarboxylové kyseliny a 2acetylamino- nebo2-amino-12, 16- dimetyl -3, 5, 10, 14, 15-penta - hydroxy - ecoisan nebo jejich C-10 deoxy analogy. Z hlediska způsobů biosyntézy patří fumonisiny mezi nonaketidy. (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003).

Fumonisin B1 Název podle Chemical Abstarcts: 2 S , 2 ' S ) -2,2'-{[( 5 S , 6 R , 7 R , 9 R , 11 S, 16 R, 18 S , 19 S )-19-amino-11, 16, 18trihydroxy-5,9-dimethylicosane-6 ,7-diyl] bis [oxy (2-oxoethane-2 ,1-diyl)]} disuccinic kyseliny Jiný název: Macrofusine Sumární vzorec: C 34 H 59 NO 15 Molekulová hmotnost: 721.83 g.mol-1

44 Strukturní vzorec:

Obr. 7. Fumonisin (ANONYM, 1999)

Alternariol Alternariol je toxický metabolit produkovaný vláknitými mikromycety rodu Alternaria. Nejznámějším producentem je Alternaria alternata. Suroviny jsou často infikovány v předsklizňovém stádiu úrody. Kontaminace alternariolem, je obvykle spojena se zeleninou, ovocem a olejninami viditelně infikovanými hnilobou Alternaria, nejvíce se vyskytuje na rajčatech, olivách, mandarinkách, paprikách a jablkách.

Výskyt rodu

Alternaria a jejich mykotoxinů v olejnatých semenech byl zaznamenán při práci zaměstnanců ve zpracujících podnicích (např. změna barvy pekanových ořechů, slunečnicových semen, jedlých slunečnicových semen a olejnatých semen řepky). Mykotoxiny produkované spp. Alternaria se vyskytují také v cigaretovém tabáku. (http://www.micotoxinas.com.br) Název podle Chemical Abstarcts: 3,7,9 - trihydroxy-1-methyl-6H –benzo [ c ] chromen-6-jeden Sumární vzorec: C14H10O5 Molekulová hmotnost: 258.226 g.mol-1 Strukturní vzorec:

Obr. 8. Alternariol (ANONYM, 1999)

45 Zearalenon

Produkují ho toxigenní kmeny druhu Fusarium. Hlavním producentem Zearalenonu je Fusarium graminearum (nepohlavní forma Gibberella zeae), tato plíseň silně infikuje krmivářské a potravinářské obilí, produkuje zearalenon ve vysokých koncentracích. Pro tvorbu ZEA jsou potřebné teploty v rozsahu 12-14°C, ale mohou růst i při niţších teplotách, dokonce i pod 0°C. Z ovocných druhů se vyskytuje zejména v banánech. Zearalenon je chemicky charakterizován jako lakton kyseliny β- resorcylové. V organismu je metabolizován na 7α a 7β- zearalenol. Kromě toho existuje dalších asi 13 derivátů zearalenonu (např. zeranol a teranol). (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003) Název podle Chemical Abstarcts: (3S,11E ) -14,16- dihydroxy-3- methyl-3-,4,5,6,9,10 hexahydro-1 H -2-benzoxacyclotetradecine -1,7(8H)-dion Jiný název: F-2 toxin, ZEA, ZON Sumární vzorec: C18H22O5 Molekulová hmotnost:318 g.mol-1 Strukturní vzorec:

Obr. 9. Zearalenon (ŠIMŮNEK, 2003)

46

3.3.2 Technologické úkony, vedoucí ke zvýšenému obsahu mykotoxinů Je několik způsobů, jak zabránit moţnosti výskytu mykotoxinů v potravinách. Opačné chování má za následek kritické a převáţně zdravotně velmi závadné mnoţství mykotoxinů vyprodukovaných plísněmi. Dle MALÍŘ, OSTRÝ, (2003) je velmi důleţité zachování správné zemědělské a technologické praxe a aplikovat preventivní a sanitační opatření. Jiţ při sklizni, převáţně obilovin, musíme velmi dbát na to, abychom ho nesklízeli vlhké, ale i u ostatních sklízených surovin je dobré neprovádět technologické operace při vysoké teplotě a vlhkosti vzduchu. Dalším velice důleţitým faktorem je způsob skladování, na nějţ má největší vliv dodrţování optimální teploty a relativní vlhkosti vzduchu, coţ je moţno efektivně řešit skladováním v řízené atmosféře, jelikoţ softwarové vybavení takového skladovacího prostoru umoţní nastavit skladovací reţim pro různé typy surovin. Dále pak dodrţujeme podmínky při následném zpracování surovin, je vhodné zavést systém HACCP (hazard analisys and critical control point = analýza nebezpečí a identifikace kritických kontrolních bodů) a provádět důsledné kontroly, které se zaměřují na detekování mykotoxinů a toxigenních vláknitých mikromycet. Neméně důleţitá jsou také hygienická pravidla. Pokud v průběhu kontrolování nebo koupi potraviny nalezneme potravinu jiţ napadenou plísněmi, je ţádoucí okamţitě ji selektovat od ostatních a v ţádném případě ji jiţ nepouţívat pro další zpracování či k přímé konzumaci a nezkrmovat jimi hospodářská nebo domácí zvířata, je totiţ známo, ţe i po odstranění napadených nebo nahnilých částí se nevylučuje přítomnost toxických mykotoxinů, totéţ platí i pro konzervované a sterilizované potraviny jako konzervy, kompoty, zavařeniny a mošty. Dále bychom se měli vyvarovat sekundární kontaminaci, mezi ně patří především kontaminace z rukou, dále z ovzduší, různých předmětů pouţívaných při výrobě či v expedičních skladech, strojů a zařízení nacházejících se ve výrobě.

3.4 Plísňové choroby skladovaného jádrového ovoce (jablek) Na jablkách se během skladování můţe rozšířit řada houbových chorob. Důleţitá je především čistota prostředí a hygiena skladování. Teplotní podmínky v klasických chlazených skladech se pohybují v rozmezí 1 aţ 3 °C a vzdušná vlhkost bývá vyšší neţ 85 %.

47

3.4.1 Manipulace při sklizni a skladování Sklizeň by měla být dokončena během nejchladnějšího období dne, coţ je obvykle v brzkých ranních hodinách, a sklizené plodiny by měly být uchovávány ve stínu. Plodiny určené pro skladování by měly být pokud moţno bez porušení slupky, bez otlačenin, skvrn, hniloby, a jiných poškození. Modřiny a jiné mechanické poškození nejen ovlivňuje vzhled, ale přes poranění běţně vstupují mikroorganismy, které potravinu zkazí. Posklizňové hnití více převládá v ovoci a zelenině, které jsou otlačené nebo jinak poškozené. Mechanické poškození také zvyšuje moţnost ztráty vlhkosti. Míra ztráty vlhkosti můţe být zvýšena aţ o 400% připadající na jednu špatnou část ovoce či zeleniny. Poškození se dá předejít tím, ţe se při sklizni zachází s plodinami jemně, sklízí se v řádné době; sklízí se za suchého počasí kdykoli je to moţné, nesmí se manipulovat s kaţdým ovocem nebo zeleninou více neţ je nutné, vhodné je také nainstalovat

čalounění

v bednách

určených

k přepravě.

Teplota

je

jedním

z nejdůleţitějších faktorů pro udrţení kvality po sklizni, chladírenské skladování zpomaluje proces kaţení plodin kvůli invazi bakterií, plísní a kvasinek.

3.4.2 Mikrobiologické poruchy jádrové ovoce Podle GÖRNER,VALÍK, (2004) “Ovoce obsahuje velmi mnoho vody a cukrů a je proto velmi dobrým médiem pro mikroorganismy. Vysoký obsah organických kyselin sniţuje hodnotu pH duţiny na takovou míru, která brání růstu většině bakterií, ale toleruje růst plísní a kvasinek. Rezistence ovoce a zeleniny se po dobu jejich skladování stále sniţuje, proto nejdříve vystupuje jako škůdce a také mikroorganismy, vůči kterým je rostoucí plod relativně rezistentní. Jsou to například příslušníci rodů Botrytis a Rhizopus“. I přes vysokou vodní aktivitu většiny ovoce vede nízké pH k jeho znehodnocení houbami, kvasinky, ale speciálně plísněmi. Svědčí o tom mnoho druhů plísní, které kazí sklizené plody nebo domácí ovocné mísy. Penicillium italicum ukazuje značné specificika pro citrusové

plody,

přičemţ

modrou plísní a zelenou plísní napadá nejvíce pomeranče, citróny a další z citrusových plodů. Penicillium expansum způsobuje měkkou hnilobu jablek. Kolonie konidiospor

48 jsou uspořádány v kruhu. Dále tento druh způsobuje modrou plíseň jablek. Jiné obyčejné choroby jablek a hrušek vypadají jako černá místa či strupy, způsobené askomycety. Strupovitost kazí vzhled ovoce a určitě sniţuje jeho komerční hodnotu, ale nezpůsobuje rozsáhlé tlející tkáně. (ADAMS, MOSS, 2008)

Gloeosporiová hniloba •

Původce: Gloeosporium album, G. perennans = Pezicula alba, P.malicorticis,

Produkují pomalu rostoucí kruhové hnědě hniloby, které za vlhkých podmínek vytvoří bílou plíseň a voskovou hmotu, ve středové části léze jsou naţloutlé kolonie s tmavě ohraničeným okrajem. V obou případech v místě četných zranění se můţe Gloeosporiová hniloba vyvinout na jednom druhu ovoce, protoţe variabilita příznaků se liší u obou druhů Peziculy, je třeba výtrusy prozkoumat mikroskopicky. Tyto houby mohou zaútočit na květ, ale obvyklé bývá, ţe se nákaza rozšíří při rozvoji plodu přes lenticely a následně zůstávají klidnými a projeví se aţ v posklizňovém období. Infekce na ovoci je výsledkem klíčení asexuálních výtrusů (konidie vyprodukované pyknidií) při rakovině nemocných listů. Pyknidium je dutá plodnice hub, na jejíţ vnitřní straně se tvoří nepohlavní spory, tedy konidie (konkrétně někdy pyknidiospory) a objeví se kdykoli během vegetačního období, kdy je počasí vlhké, sexuální stádium (askospory produkují, které produkují apothecia) byla zaznamenána u obou druhů hub, ale jen zřídka je lze najít a nejsou významnými patogeny. Velmi hojný druh, častý na rozmanitých kazících se potravinách, zvláště jablkách a hruškách. (SNOWDON, 1990)

Obr. 10., Fotografie jablka uloženého v předchladírně (VLASTNÍ ZDROJ)

49 Moniliová hniloba- hnědá hniloba •

Původce: Monilia fructigena ( kloubnatička ovocná)

Prvními příznaky jsou nemoci ovoce po uskladnění je rozvoj ostře ohraničených kruhových hnědých skvrn na povrchu napadených jablek. Za vlhkých podmínek trsy bílé plísně proniknou slupkou, často tvoří soustředěné kruhy kolem místa infekce. Za přítomnosti světla se na místě infekce hojně vyskytují šedohnědé výtrusy. Občas infikované plody jsou černé a lesklé a za nepřítomnosti světla spory plísně tvoří neoformace (novotvorba). Houba se běţně šíří do sousedního zdravého ovoce, ale přesto v pokročilém stádiu hniloby zůstávají plody pevné a suché. Plody infikované v rané fázi vegetačního období shnijí na stromě, stanou se z nich „ scvrklé mumie“, v takovém stavu jsou stále připojeny ke stromu nebo spadnou na zem. Houba tak přeţije zimu, a kdyţ se environmentální podmínky stanou příznivými, výtrusy jsou rozšiřovány po celém sadu. Mladé výhonky a květy nebo ovoce v rozvojové fázi růstu jsou napadeny osvobozením askospór, starší plody jsou infikovány konidiemi, které jsou rozptýleny do vzduchu, také jsou roznášeny hmyzem nebo stříkající vodou a poraněné ovoce je tak následně infikováno. (SNOWDON, 1990) Monilia fructigena je producent mykotoxinu patulinu, citrininu, chaetoglobosinu C, roquefortinu C. Častý kontaminát potravin, patogen jablek. Je nejrozšířenějším původcem hniloby jádrového ovoce

Obr. 11, 12. Fotografie 1. - jablko uložené v chladírně, Fotografie 2. – jablko uložené v předchladírně (VLASTNÍ ZDROJ)

50 Hořká hniloba

•

Původce: Gloeosporium fructigena

Prvními příznaky jsou malé světlé hnědé skvrny, které jsou později lehce propadlé. Po krátké době utvoří tmavé struktury (acervuli) nebo léze v soustředěných kruzích. Acervuli jsou drobné polštářkové nebo puchýřkovité struktury produkované některými plísněmi na rostlinném hostiteli a skládající se z mnoţství hyf, asexuálně produkovaných výtrusů. Za vlhkých podmínek protrhne kůţi a masy spór se začnou extrudovat a utváří lososově-růţové aţ tmavě hnědé kolonie. Jablko má nahořklou chuť a hniloba je charakteristicky tvarovaná jako dovnitř obrácený kuţel. Některé kmeny této houby produkují obě sexuální fáze (perithecia, které vedly ke konidiím) a obě stádia jsou důleţité k infekci. Existují i jiné kmeny, které se rozmnoţují pouze asexuálně. Výtrusy vytvoří vředy na stromě, askospory vypustí během dešťových přeháněk a následně se šíří v proudu vzduchu, zatímco konidie jsou rozptýleny v dešti. Ačkoli je nemoc často spojována s ranou fází zrání plodů, bylo zjištěno, ţe jablka jsou náchylné k infekcím jejich vývoje. Houby jsou schopné nepřímého průniku neporušenou kůţí. Optimální teplota pro infekci je přibliţně 26°C a epidemie jsou spojeny s mokrým vegetačním obdobím. Plody mohou zcela shnít jiţ na stromě, zůstat v mumifikovaném stavu a tak přeţijí zimu a spolu s vředy působí jako zdroj spór v následujícím roce. Sklizené plody mohou nakazit zdravé přes zranění při manipulaci a dopravě. (SNOWDON, 1990)

Obr. 13. Jablko napadené houbou rodu Gloeosporium (SNOWDON, 1990)

51 Šedá hniloba •

Původce: Botrytis cinerea

Šedá hniloba je způsobená plísní Botrytis cinerea, která napadá převáţně jablka, hrušky a hrozny. Plíseň proniká do plodu drobnými poškozeními, často v místě po odtrţení stopky. Hniloba způsobuje v místě infekce hnědé nebo světle hnědé skvrny, které se postupně od středu rozšiřují do celého plodu. V aktivním stádiu vývoje choroby se rozvíjí při vysoké relativní vlhkosti prostředí na povrchu plodu šedé vatovité podhoubí, které se rozšiřuje na okolní plody. Tím vznikají „ hnízda“, ve kterých bývá 8 aţ 10 plodů. Při dalším rozvoji choroby mohou napadené tkáně měknout natolik, ţe se z nich můţe uvolňovat šťáva. Botrytis cinerea napadá plody, dokud ještě visí na stromě. Vyvíjí se ve starých částech stromů nebo částech rostlin, kde vytváří velké mnoţství spór a ty jsou následně roznášeny větrem. Plody přicházející do styku s půdou nebo rostlinami meziřadové kultury, by neměly být uţívány pro skladování, jelikoţ jsou velmi silně infikovány. (GODKOVSKIJ, 1984)

Obr. 14 Fotografie jablek uložených v předchladírně (VLASTNÍ ZDROJ) Modrá hniloba •

původce: Penicillium expansum

První příznaky jsou měkké, slabě hnědé skvrny, které se při teplotách 20 aţ 25°C rychle rozšiřují, záleţí také na rozpětí mezi měkkým shnilým tělem nebo pevnou zdravou tkání. Za vlhkých podmínek tvoří mohutné modrozelené konidiofory formou povrchové léze. Tato houba se můţe šířit do sousedních zdravých plodů, tvoří hnízda hnilob. P. expansum je obecně povaţována za parazita, který infikuje plody přes různá zranění,

52 například při hrubé manipulaci a mytí po sklizni. Díky modré plísni mají usnadněný vstup také rody Gloeosporium, Mucor, Phytospora, vypustí asexuální výtrusy konidie, které se do ovoce dostane skrz lenticely. Podle stupně odporu lenticely, pevnosti plodu, ošetřením hnojivy a intenzitou světla se dá určit, jak velmi je citlivé jablko, buďto je-li zralé nebo dlouho uloţené, zejména při pohmoţdění a propíchnutí. (SNOWDON, 1990)

Obr. 15. Jablko napadené Penicillium (RODL, 2007) Fusariová hniloba •

Původce: houba rodu Fusarium spp.

Plody jsou měkké, vodnaté, šíří se i ve skladu. Při periferní hnilobě infekce vniká do duţniny poškozenou slupkou především u stopky plodů. Druhým typem je jádřincová hniloba, kde se nekróza šíří z jádřince. U tohoto typu vnikly zárodky houby do plodu jiţ za vegetace. Ve skladu se houba rozrůstá z jádřince centrifugálně do plodu. Zhnědlá duţnina není hořká, měkne, ale nekašovatí. Z nekrotického plodu lze snadno stáhnout slupku. (SNOWDON, 1990)

Obr. 16. Fotografie jablka uloženého v předchladírně (VLASTNÍ ZDROJ)

53 Alternaria

•

Původce: houba rodu Alternaria spp

Vyznačuje se různými symptomy. Tmavě šedá hniloba kolonizující dutinu jádra a způsobuje hnití okolní svaloviny. Tkáň, která utrpěla fyzické či fyziologické zranění je často napadána, coţ má za následek tvorbu malých černých hnijících skvrn ve slupce, v případě takového postiţení se trţní cena ovoce sníţí. Tyto houby mohou přeţít v půdě v inaktivované formě (mikrosklerotia), a také ve formě výtrusů (chlamydospory). Za příznivých podmínek jsou konidie ve velkém mnoţství rozptylovány větrem a deštěm na listy trosek stromů v ovocných sadech. Často také uváznou na částech umírajícího květu, a v teplých vlhkých podmínkách můţe způsobit infekci, která se později projeví uvnitř plodu. Některé kultivary asijských hrušek jsou obzvláště náchylné k infekci druhu A. kikuchiana, který můţe napadnout i zdravé mladé plody přes přírodní otvory (stomata a lenticely), kde následně způsobuje četné černé skvrny. Houba můţe napadnout plod také přes rány či přes punkce způsobené hmyzem, vytváří hořké, měkké prohlubně a léze. (SNOWDON, 1990)

Obr. 17. Fotografie jablka uloženého v chladírně (VLASTNÍ ZDROJ) Black rot and white rot  Původce: houba rodu Sphaeropsis malorum a Dothiorella gregaria Sacc. První příznaky obou nemocí jsou často mírně propadlé skvrny na povrchu slupky ovoce, plod. Bílá hniloba se vyznačuje měknutím plodu, vzhled slupky se podobá odbarvení

54 nebo vaření, s kapky tekutiny v oblasti hniloby. Při teplotách kolem 23°C, můţe ovoce úplně shnít do 10 dnů, niţší teploty jsou méně příznivé, a mají tendenci vykazovat různé symptomy, například při 13°C se hniloba vyznačuje koţovitou, pevnou a hnědou lézí, která je běţná při infikaci černou hnilobou. Vzhledem k variabilitě symptomů produkovaných těmito druhy, vyţaduje identifikace hub porovnání spór mikroskopicky. Kaţdá houba můţe produkovat jak sexuální, tak asexuální fáze. Výtrusy se nacházejí po celý rok v odumřelé větvi a v mumifikovaných plodech, rozšíření výtrusů je způsobeno stříkajícím deštěm. Konidie jsou běţně roznášeny vodou, zatímco askospóry mohou být rozptýleny na větší vzdálenost ve vzdušných proudech. Plody se infikují přes zranění lenticely, mechanicky od bodnutí hmyzem nebo také přes kalich, stejně jak je tomu u hniloby jádřince. Mladé plody se stávají náchylnými k hnilobě v období zrání, v tomto případě je hniloba znát jiţ na stromě, ale ovoce infikované těsně před sklizní vypadá zdravě, i kdyţ jsou jiţ plody umístěné v obchodě. Oba typy hub jsou při skladování při teplotách kolem 0°C vcelku nečinné, ale hnití pokračuje aţ při teplotách kolem 10°C. Hniloba není obvykle šířena z ovoce na ovoce. (SNOWDON, 1990)

Obr. 18. Fotografie jablka uloženého v chladírně (VLASTNÍ ZDROJ)

Strupovitost Tato choroba je primárním problémem sadů protoţe v pozdním období můţe vést k rozvoji strupovitosti. Vytváří na plodu tmavě hnědé nebo černé skvrny, které se s postupem času stanou korkové a někdy podporují růst plísní na okraji léze. Vyskytují se obvykle nejpočetněji kolem kališních lístků, a pokud infekce proběhla, zatímco se ovoce vyvíjí, můţe být jablko ve výsledku znetvořené. Houba přezimuje v napadlém

55 jablečném listí, kde se sexuální stádium vyvíjí. Výtrusy vypuštěny během období dešťů, na začátku jara a teplého vlhkého počasí mají nejvhodnější podmínky pro infikování plodů. Asexuální výtrusy (konidie) mnoţící se v infikovaných tkáních plodu bývají rozptýleny rozstřikovaným deštěm. Neustálé vlhké počasí můţe vést k těţké infekci zralých plodů. Ačkoli se houba nešíří do zdravého ovoce, v obchodě se mírné strupy při teplotách blíţících se 0°C budou nadále zhoršovat, léze se tak zvětšují do šířky i procentuálně. (SNOWDON, 1990) Strupovitost kazí vzhled ovoce a určitě sniţuje jeho komerční hodnotu, ale nezpůsobuje rozsáhlé tlející tkáně. (ADAMS, MOSS, 2008)

Obr. 19. Fotografie skladovaných jablek se strupovitostí (VLASTNÍ ZDROJ) Kruhová hnědá hniloba Je působená nejčastěji vřeckatými houbami rodu Pezicula a Glomerella , jejichţ konidiová stadia jsou řazena do rodu Gloeosporium. Choroba se vyskytuje většinou aţ v druhé polovině skladovacího období. Vyvolává na plodech ostře ohraničené okrouhlé hnědé skvrny o průměru 0,5 aţ 3 cm, jejichţ povrch se miskovitě prohýbá. Napadané plody se rychle kazí, s dobou uskladňování se zvyšuje také náchylnost k této chorobě. Podle SNOWDON, (1990) se na ovoci se mohou vyskytnout další různé typy nemocí, jsou to například: Jádrová hniloba, hniloba způsobená rodem Cylindrocarpon, růţová plísňová hniloba, hniloba způsobená rodem Cladosporium, hniloba způsobená rodem Aspergillus,

56

4. METODIKA 4.1 Prováděný pokus Cílem pokusu bylo sledovat druhy mikroorganismů, které se mohou vyskytovat na jablkách během skladování v navzájem se lišících teplotních podmínkách. Pro pokus byly vybrány odrůdy jablek tak, aby z nichţ část nebyla ošetřená chemickými postřiky a další část byla ošetřená chemickými postřiky. Mezi nimi se pak porovnávalo, která část vykazuje větší odolnost a rezistenci proti mikroorganismům. Odrůdy jablek, které byly chemicky ošetřeny, pocházejí ze sadu Mendelovy univerzity v Lednici. Odrůdy jablek bez chemického ošetření pocházejí z různých lokalit jiţní Moravy, odrůda Royal Gala byla zakoupena v obchodním řetězci Tesco pod označením BIO jablka. Odrůdy byly rozděleny do 4 kategorií: 1. 3 odrůdy chemicky ošetřených jablek, uloţeny při teplotě 16°C 2. 3 odrůdy chemicky neošetřených jablek, uloţeny při teplotě 16°C 3. 3 odrůdy chemicky ošetřených jablek, uloţeny při teplotě 4°C 4. 2 odrůdy chemicky neošetřených jablek, uloţeny při 4°C

Jablka byly nejprve rozděleny a uloţeny do přepravek, označeny názvem a počtem kusů, byly ponechány volně, nepřikryté a takto se ukládaly do předchladírny a do chladírny. Pokus byl zaloţen 30. 9. 2010 a ukončen 30. 2. 2011. Během této doby se sledoval stupeň mikrobního napadení plodů, byly stanoveny těkavé aromatické látky nacházející se v plodu zdravém a plodu jiţ nezdravém (Gloeosporium). Dále byla stanovena pouze ze zdravých jablek na začátku skladování pevnost slupky plodů, titrační kyseliny a rozpustná sušina. Výsledky jsou interpretovány pomocí tabulek a grafů zpracované v programu Microsoft Excel, pro výpočty byly pouţity aritmetické průměry a směrodatné odchylky.

57 Tab. 7. Odrůdy jablek ošetřené chemickými postřiky

Teplota skladování

4°C

16°C

Odrůda

Počet ks

Koločava

30

Ribston

27

Carevič

30

Florina

30

Zlatava

27

Quinte

30

Tab. 8. Odrůdy jablek neošetřené chemickými postřiky

Teplota skladování

4°C

16°C

Odrůda

Počet ks

Royal Gala

27

Jonagold

19

Kožená reneta

20

Ontario

19

Jeptiška

16

Stanovení obsahu veškerých titračních kyselin Obsah kyselin byl stanoven acidobazickou titrací, kde se vyuţívá barevných indikátorů, které reagují s přebytečnou stanovovanou látkou nebo s přebytečným titračním činidlem a forma zreagovaná a nezreagovaná mají různé formy. V našem

58 případě byl pouţit fenolftalein, kyselý indikátor, jehoţ funkční oblast je při pH 8,0 aţ 9,8. V kyselém prostředí je bezbarví a v bazickém prostředí se zbarví fialově. Byla pouţita šťáva z rozmixovaných a přes jemnou tkaninu přecezených jablek. Subjektivní vyhodnocení, ve chvíli kdy se projeví bod ekvivalence při pouţití barevného indikátoru, stanovíme pomocí vizuální indikace. Do kádinky bylo odměřeno 2 ml šťávy, byly přidány 3 kapky 1% fenolftaleinu a vše bylo dostatečně zředěno destilovanou vodou. Vzorek se za stálého míchání titruje 0,1 N roztokem NaOH o faktoru 0, 9569 a faktoru 0,9523. Ze stupnice na byretě se odečte mnoţství spotřebovaného NaOH, provede se výpočet. Obsah titračních kyselin se vyjádří na převládající organickou kyselinu, která v titrovaném vzorku převládá. U jablek se jedná o kyselinu jablečnou (1 ml 0,1mol.1-1 NaOH odpovídá 0,0067g kyseliny jablečné) % obsah veškerých kyselin = a * f * 0,0067 * 100 / n a - spotřeba 0,1mol.1-1 NaOH při titraci[ ml ] n - mnoţství vzorku vyuţitého při titraci[ g ] f – zřeďovací faktor 0,1mol.1-1 NaOH

Stanovení rozpustné sušiny refraktometricky Refraktometrie je optická metoda zaloţená na měření indexu lomu světla. Nejběţněji se při měření uţívá Abbeův refraktometr, nazývaný také suchý. Plody jablek byly homogenizovány a šťáva filtrována přes jemnou tkaninu do kádinky. Za pomocí kapátka se nanese jen tenká vrstva homogenátu mezi dva hranoly refraktometru. Okulárem se pozoruje rozhraní, které se zaostří pomocí šroubu. V pravém okuláru se nachází nitkový kříţ, na jehoţ střed se zaměřilo světelné rozhraní. V levém okuláru protíná ryska stupnici. Na stupnici se pak odčítá hodnota indexu lomu měřeného vzorku, obsah takzvané refraktometrické sušiny. Výsledky měření jsou zaznamenány pomocí grafů a tabulek.

59

Stanovení pevnosti dužniny jablek Pevnost slupky byla stanovena pomocí ručního penetrometru od firmy Turoni, s průměrem válcovitého razidla 5mm a digitálním displejem. Penetrometrem se vyvíjí tlak na plod zvyšující se silou, dokud razidlo není zatlačeno asi 0, 5 cm (po rysku). Ze stupnice se odečte síla N potřebná k protlačení duţniny razidlem do poţadované hloubky. Měření bylo provedeno na dvou místech plodu. Z naměřených hodnot bylo penetrační napětí duţniny vypočítáno podle vzorce:

σpd = F

d/

A

Fd – síla potřebná k penetraci duţniny A – plocha, na kterou síla působí Stupeň mikrobního napadení Stupeň mikrobního napadení byl vyhodnocován vizuálně a k jednotlivým stavům byl přiřazen příslušný stupeň mikrobního napadení uvedený ve stupnici. Některé plody vykazovaly viditelné napadení mikroorganismy, při pokusu se popisovaly i jednotlivé druhy, které byly zjištěny vizuálně a porovnáním příznaků dle odborné literatury. Stupně mikrobního napadení jsou vyhodnoceny v tabulkách a grafech. Stupnice mikrobního napadení: 1. plody neporušené, zcela zdravé 2. plody nenahnilé, neotlačené, bez vadnutí, schopné prodeje 3. malé skvrny z hnědnutí, mírně zvadlé 4. skvrny z vadnutí, otlačené, měkké, intenzivně zvadlé 5. nahnilé, velmi měkké, výrazně zvadlé 6. hniloba

60

5. VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Acidobazická titrace u plodů jablek Z následujících tabulek a grafů vyplívá, ţe obsah titračních kyselin u jednotlivých odrůd je zcela odlišný. Nejvíce titračních kyselin obsahovala odrůda chemicky ošetřených jablek Koločava, dále Carevič a nejméně titračních kyselin obsahovala odrůda Ribston. U chemicky neošetřených jablek obsahovala nejvíce titračních kyselin odrůda Jeptiška, nejméně odrůda Bio jablek Royal Gala. U naměřených hodnot je uvedena směrodatná odchylka. Tab. 9. Obsah titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky ošetřených

odrůda Zlatava Quinte Florina Carevič Koločava Ribston

% 0,512 ± 0,115 0,438 ±0,148 0,373 ± 0,092 0,908 ± 0,092 0,950 ± 0,240 0,203 ± 0,203

Graf 1. Množství titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky ošetřených

61 Obsah titračních kyselin u chemicky ošetřených jablek byl u odrůdy Koločava 0,950 %, skladovaná při 16°C. Vysoký obsah kyselin vykazovala při měření také odrůda Carevič 0, 908 % skladovaná při 4°C a nejméně titračních kyselin obsahovala odrůda Ribston 0,203 % skladovaná při 4°C. Výsledky jsou patrny z tabulky č. 9 a grafu č. 1. Tab. 10. Obsah titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky neošetřených

odrůda Jonagold Royal gala Ontario K.Reneta Jeptiška

% 0,577 ± 0,064 0,270 ± 0,018 0,438 ± 0,066 0,854 ± 0,048 0,512 ± 0,064

Graf 2. Množství titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky neošetřených

Obsah titračních kyselin u chemicky neošetřených jablek byl vysoký u odrůdy Koţená reneta 0,854 %, skladovaná při 16°C. Vysoký obsah kyselin vykazovala při měření také odrůda Jonagold 0,577 % skladovaná při 4°C a nejméně titračních kyselin obsahovala odrůda Royal Gala 0,270 %, skladovaná při 4°C. Výsledky jsou patrny z tabulky č. 10 a grafu č. 2.

62

5.2 Refraktometrické měření sušiny u plodu jablek Z tabulek a grafů je jasné, která odrůda obsahuje nejvíce naměřené refraktometrické sušiny. Nejvíce obsahovala odrůda Jeptiška, dále Koločava a nejméně odrůda Quinte. U kaţdé naměřené hodnoty je uvedena směrodatná odchylka. Obsah sušiny můţe být dobrým vodítkem k posouzení látkové změny. Tato stanovení pouţil STOLL (1968) k souhrnné charakteristice zásobních látek v jablku, jak během vegetačního období, tak i skladování. Tab. 11. Obsah refraktometrické sušiny (Rf) odrůd jablek chemicky ošetřených odrůda Zlatava Quinte Florina Carevič Koločava Ribston

°Rf 12,23 ± 1,956 9,66 ±0,235 11,16 ± 0,235 12,26 ± 1,037 12,76 ± 0,654 12,66 ± 1,178

Graf 3. Obsah refraktometrické sušiny (Rf) odrůd jablek chemicky ošetřených

63 Z tabulky č. 11 a grafu č. 3 vyplívá, ţe při měření u chemicky ošetřených jablek obsahovala nejvíce refraktometrické sušiny odrůda Koločava 12,76°Rf, skladovaná při 4°C, dále Ribston 12,66 °Rf skladovaná při 16°C. Nejméně refraktometrické sušiny měla odrůda Quinte 9,66° °Rf skladovaná při 16 °C Tab. 12. Obsah refraktometrické sušiny (Rf) u odrůd jablek chemicky neošetřených odrůda Jonagold Royal gala Ontario Reneta Jeptiška

°Rf 0,524 ± 11,23 0,817 ± 12,13 0,124 ± 11,43 0,249 ± 12,26 0,124 ± 13,13

Graf 4. Obsah refraktometrické sušiny (Rf) odrůd jablek chemicky neošetřených

Z tabulky č. 12 a grafu č. 4 vyplívá, ţe při měření u chemicky neošetřených jablek obsahovala nejvíce refraktometrické sušiny odrůda Jeptiška 13,13°RS, skladovaná při 16°C, dále Koţená reneta obsahovala 12,26 °RS skladovaná při 16°C. Nejméně refraktometrické sušiny vykazovala odrůda Royal Gala 12,13 °RS skladovaný při 4°C.

64

5.3 Měření pevnosti dužniny u plodů jablek Tab. 13. Pevnost dužniny (MPa) u odrůd jablek chemicky ošetřených odrůda Zlatava Quinte Florina Carevič Koločava Ribston

kPa 3646 ± 367,815 2592 ± 184,147 2864 ± 114,499 6446 ± 447,499 5580 ± 553,805 5731 ± 627,120

Graf 5. Pevnost dužniny (kPa) u odrůd jablek chemicky ošetřených

Pevnost duţniny byla naměřena u chemicky ošetřených jablek nejvíce u odrůdy Carevič 6446 kPa skladované při teplotě 4°C a dále byla naměřena vysoká pevnost duţniny u odrůdy Ribston 5731 kPa skladované při teplotě 16°C. Nejmenší naměřenou hodnotu pevnosti duţniny vykazovala odrůda Quinte 2592 kPa, skladovaná při teplotě 16°C. Výsledky jsou patrné z tabulky č. 13 a grafu č. 5.

65 Tab. 14. Pevnost dužniny (kPa) u odrůd jablek chemicky neošetřených odrůda Jonagold Royal gala Ontario Reneta Jeptiška

kPa 5563 ± 491,618 4985 ± 421,772 5941 ± 429,468 7708 ± 444,426 6159 ± 308,204

Graf 6. Pevnost dužniny (MPa) u odrůd jablek chemicky neošetřených

Pevnost duţniny byla naměřena u chemicky neošetřených jablek nejvíce u odrůdy Koţená reneta 7708 kPa skladované při teplotě 16°C a dále byla naměřena vysoká pevnost duţniny u odrůdy Jeptiška 6159 kPa skladované při teplotě 16°C. Nejmenší naměřenou hodnotu pevnosti duţniny vykazuje odrůda Royal Gala 4985 kPa skladované při teplotě 4°C. Výsledky jsou patrné z tabulky č. 14 a grafu č. 6.

66

5.4 Mikrobní napadení plodů jablek Z tabulek a grafů je jasné, kolik kusů od jednotlivé odrůdy bylo neporušeno či napadeno mikroorganismy za určité období 5 měsíců. Plody byly neporušené, nenahnilé, s malými skvrnami, se skvrnami z vadnutí, výrazně zvadlé a shnilé. Navíc byly plody rozděleny na odrůdy ošetřené chemickými postřiky a uloţeny při teplotách 4°C a 16°C. Podle těchto parametrů se odvíjel stupeň mikrobního napadení. Tab. 15. Mikrobní napadení plodů odrůdy Kolčava

Koločava 30 kusů (4 °C) Stav plodů Plody neporušené

Datum 20.10.2010

20.11.2010

20.12.2010

30

30

30

Plody nenahnilé Malé skvrny Skvrny z vadnutí Výrazné vadnutí Hniloba Graf 7. Mikrobní napadení plodů odrůdy Kolčava

20.1.2011

20.2.2011

30

30

67 Tab. 16. Mikrobní napadení plodů odrůdy Zlatava

Zlatava 27 kusů (16°C) Stav plodů Plody neporušené

Datum 20.10.2010

20.11.2010

23

21

20.12.2010

20.1.2011

20.2.2011

18

18

18

Plody nenahnilé Malé skvrny

3

1

Skvrny z vadnutí

1

2

3

3

6

Výrazné vadnutí Hniloba

Graf 8. Mikrobní napadení plodů odrůdy Zlatava

6 3

9

68 Tab. 17. Mikrobní napadení plodů odrůdy Ribston

Ribston 30 kusů (4°C) Stav plodů Plody neporušené Plody nenahnilé

Datum 20.10.2010

20.11.2010

20.12.2010

20.1.2011

20.2.2011

30

22

22

22

8

5

30

Malé skvrny Skvrny z vadnutí Výrazné vadnutí Hniloba Graf 9. Mikrobní napadení plodů odrůdy Ribston

3

8

69 Tab. 18. Mikrobní napadení plodů odrůdy Carevič

Carevič 30 kusů (4 °C) Stav plodů Plody neporušené

Datum 20.10.2010

20.11.2010

30

29

Plody nenahnilé Malé skvrny Skvrny z vadnutí

1

20.12.2010

20.1.2011

20.2.2011

27

25

25

2

2

1

2

2

1

2

Výrazné vadnutí Hniloba

Graf 10. Mikrobní napadení plodů odrůdy Carevič

1

70 Tab. 19. Mikrobní napadení plodů odrůdy Royal Gala

Royal Gala 27 kusů (4 °C) Stav plodů

Datum 20.12.2010

20.1.2011

20.2.2011

Plody nenahnilé

26

26

25

Malé skvrny

1

1

Plody neporušené

20.10.2010

20.11.2010

27

27

Skvrny z vadnutí

1

Výrazné vadnutí Hniloba

Graf 11. Mikrobní napadení plodů odrůdy Royal Gala

1

71 Tab. 20. Mikrobní napadení plodů odrůdy Jonagold

Jonagold 19 kusů (4 °C) Stav plodů

Datum 20.11.2010

20.12.2010

20.1.2011

Plody nenahnilé

18

16

15

Malé skvrny

1

3

3

13

1

1

Plody neporušené

20.10.2010

20.2.2011

19

Skvrny z vadnutí Výrazné vadnutí

4

Hniloba

1

Graf 12. Mikrobní napadení plodů odrůdy Jonagold

72 Tab. 21. Mikrobní napadení plodů odrůdy Quinte

Quinte 30 kusů (16°C) Stav plodů Plody neporušené

Datum 20.10.2010

20.11.2010

20.12.2010

18

10

20.1.2011

26

Plody nenahnilé Malé skvrny

2

Skvrny z vadnutí

1

3

3

Výrazné vadnutí

1

5

5

6

5

8

24

Hniloba

20.2.2011

4

Graf 13. Mikrobní napadení plodů odrůdy Quinte

30

73 Tab. 22. Mikrobní napadení plodů odrůdy Jeptiška

Jeptiška 16 kusů (16°C) Stav plodů Plody neporušené

Datum 20.10.2010

20.11.2010

20.12.2010

14

11

20.1.2011

15

Plody nenahnilé Malé skvrny

3

Skvrny z vadnutí

2

Výrazné vadnutí

1

9

2

4

Hniloba

20.2.2011

1

2

Graf 14. Mikrobní napadení plodů odrůdy Jeptiška

19

74 Tab. 23. Mikrobní napadení plodů odrůdy Ontario

Ontario 19 kusů (16°C) Stav plodů Plody neporušené

Datum 20.10.2010

20.11.2010

20.12.2010

15

3

20.1.2011

20.2.2011

15

Plody nenahnilé Malé skvrny

10

Skvrny z vadnutí

1

Výrazné vadnutí

1

Hniloba

2

10 2

4

2

2

4

5

Graf 15. Mikrobní napadení plodů odrůdy Ontario

19

75 Tab. 24. Mikrobní napadení plodů odrůdy Kožená Reneta

Kožená reneta 20 kusů (16°C) Stav plodů

Datum 20.11.2010

20.12.2010

17

16

1

1

Skvrny z vadnutí

1

1

14

Výrazné vadnutí

1

1

3

1

3

Plody neporušené

20.10.2010

Hniloba

20.2.2011

19

Plody nenahnilé Malé skvrny

20.1.2011

1

Graf 16. Mikrobní napadení plodů odrůdy Kožená Reneta

20

76 Tab. 25. Mikrobní napadení plodů odrůdy Florina

Florina 30 kusů (4 °C) Stav plodů

Datum 20.1.2011

20.2.2011

22

20

Skvrny z vadnutí

1

3

Výrazné vadnutí

3

Plody neporušené Plody nenahnilé Malé skvrny

Hniloba

20.10.2010 20.11.2010

20.12.2010

27 26

23

1

3

1

Graf 17. Mikrobní napadení plodů odrůdy Florina

1

4

77 Některé plody nevykazovaly během skladování ţádné mikrobní napadení, nejvíce zdravé plody si udrţela odrůda Koločava ošetřená chemickými postřiky, která byla i po 5 měsících skladování vizuálně ohodnocena jako schopná prodeje, plody tedy byly nenahnilé, nejevily známky vadnutí, coţ vyplívá z tabulky č. 15 a grafu č. 7. Jablka byla uloţena při 4°C. Odrůda Ribston ošetřená chemickými postřiky také při pokusu nebyla napadena ţádným mikroorganismem, pouze se začaly objevovat znaky stárnutí plodu, jablka byla o něco méně odolná, neţ u odrůdy Koločava, jiţ ve 4. měsíci skladování jevilo 8 plodů známky intenzivního vadnutí, ale ostatních 22 plodů, bylo schopných prodeje, odrůda byla uloţena při 4°C. Výsledky jsou patrné z tabulky č. 16. a grafu č. 8. U odrůd Royal Gala, Jonagold neošetřené chemickými postřiky a odrůda Florina ošetřená chemickými postřiky byl 1 plod, který byl jiţ zařazen do kategorie jablka shnilého a napadeného mikrobiálně, napadení bylo viditelné v 5. měsíci skladování. Odrůda Royal Gala byla napadena houbou Monilia fructigena, viz obrázek č. 12, plod odrůdy Jonagold byl napaden bílou hnilobou způsobenou houbou Dothiorella gregaria Sacc., viz obrázek č. 19 a plod odrůdy Florina byl napaden houbou rodu Alternaria, viz obrázek č. 18. Ostatní plody vykazovaly pouze malé a velké skvrny z vadnutí. Odrůdy Royal Gala, Jonagold i Florina byly uloţeny při 4°C. Postup vadnutí či hniloby je uveden u odrůdy Royal Gala v tabulce č. 19 grafu č. 11, u odrůdy Jonagold v tabulce č. 20 grafu č. 12 a u odrůdy Florina v tabulce č. 25 grafu č. 17 Odrůda Carevič ošetřena chemickými postřiky uloţena při 4°C měla 1 plod také zařazen do kategorie „hniloba“, ale nebyla viditelně napadená mikroorganismy, plod se pouze rozloţil vlivem stárnutí. Výsledky postupu vadnutí plodů jsou patrny z tabulky č. 19 a grafu č. 10. Nejhůře napadené byly odrůdy Quinte a Zlatava. Tyto odrůdy byly uloţeny v předchladírně při 16°C. Z tabulky č 21. a grafu č 13. je jasné, jak rychle postupovala hniloba u odrůdy Quinte. V 1. měsíci bylo 26 kusů neporušených, 2 kusy malé skvrny, 1 kus měl skvrny z vadnutí, ve 2. měsíci 18 kusů bylo nenahnilých, 3 kusy měly skvrny z vadnutí, 5 kusů vykazovaly výrazné vadnutí a 4 kusy byly jiţ shnilé. Ve 3. měsíci bylo 10 kusů nenahnilých, 4 kusy měly malé skvrny, 3 kusy měly skvrny z vadnutí, 5 kusů vykazovalo výrazné vadnutí a 8 kusů bylo jiţ hnilobných, ve 4. měsíci vykazovalo 6 kusů výrazné vadnutí a 24 kusů hnilobu, v 5. měsíci bylo jiţ všech 30 kusů shnilých.

78 Z 30 shnilých plodů bylo 24 kusů napadeno různými druhy mikroorganismů, nejvíce se však projevovala Gloeosporiová hniloba způsobená houbou rodu Gloeosporium album viz obrázek 10, 11., dále se zde vyskytovala modrá hniloba způsobená plísní Penicillium expansum, šedá hniloba způsobená houbou rodu Botritys cinerea viz obrázek č. 15 a Moniliová hniloba viz obrázek č. 13. Z tabulky č. 16 a grafu č. 8 je patrné jak postupuje stav plodů u odrůdy Zlatava. V 5. měsíci bylo 18 plodů stále nenahnilých a schopných prodeje, ale 9 plodů rychle shnilo působením houby rodu Fusarium spp. viz obrázek 17. Další odrůdy uloţené při 16°C nevykazovaly viditelné napadení mikroorganismy v průběhu skladování, všechny ale postupem času uhnily na následky zestárnutí a špatných skladovacích podmínek. Pouze odrůdy Koţená Reneta a Ontario vykazovaly jasné známky nemoci Strupovitosti, viz obrázek č. 20. Z pokusů jednoznačně vyplívá, ţe odrůdy skladované při 16 °C byly mnohem méně odolné, neţli odrůdy skladované při 4°C, vlivem špatných skladovacích podmínek měly, teplota a relativní vzdušná vlhkost, mají mikroorganismy usnadněný vývoj a růst. Z pokusu není ale zcela jasné, zda vliv toho, jestli jablka byly ošetřeny či neošetřeny chemickými postřiky, hrál v napadení mikroorganismů zásadní roli, vzhledem k tomu, ţe nejvíce byly napadené jablka, která byla uloţena v předchladírně při 16°C i přestoţe zde byly umístěny odrůdy jak ošetřené, tak i neošetřené chemickými postřiky. Odrůda Ontario byla neošetřena chemickými postřiky a odrůda Zlatava byla ošetřena chemickými postřiky, obě dvě odrůdy byly uskladněné v předchladírně v 16°C a silně napadeny mikroorganismy.

79

5.5 Stanovení těkavých aromatických látek metodou GC ve zdravém a napadeném jablku Těkavé aromatické látky byly stanoveny metodou GC a analýza proběhla u plodu zdravého a u plodu napadeného houbou rodu Gloeosporium odrůdy Florina. U zdravého plodu jablka bylo při analýze naměřeno 61 aromatických látek z toho 17 alkoholů, 12 esterů, 10 aldehydů, 9 terpenů, 5 acetátů, 3 laktony, 2 ketony, 2 fenoly a 1 kyselina. Významně zde byly zastoupeny alkoholy, aldehydy a estery. Z alkoholů byl nejvíce zastoupen n-butan-1-ol 2296,32 µg.l-1 , dále Trans-2-hexenol (837,7 µg.l-1), 2- methyl butan-1-ol (479,47 µg.l-1), n - hexanol (432,51 µg.l-1). Všechny tyto alkoholy tvoří důleţitou sloţku jablečného aróma. Mezi estery ve vysokých koncentracích patří Ethyl butyrate 707,7 µg.l-1, Ethyl trans3-hexenoate (6,55 µg.l-1) Penthyl butyrate (3,09 µg.l-1). Z aldehydů byl analyzován jako nejvýznamnější n-hexanal 622,02 µg.l-1, Trans-2hexenal (454,94 µg.l-1),3- methyl butanol, kterého bylo naměřeno (58,79 µg.l-1)2methylbutanol (26,54 µg.l-1) n-octanal v koncentraci (13,82 µg.l-1). Při analýze byly zaznamenány také 2 ketony Β-ionone (0,4 µg.l-1) a Acetophenone (4,33 µg.l-1), 1 fenol Phenol (15,91 µg.l-1), 1 kyselina 2- ethylhexanoic acid (0,05 µg.l-1) a látka P-cymene (0,19 µg.l-1) Látkou zastoupenou v nejvyšší koncentraci je acetát 2- methylbutylacetate 93318,17 µg.l-1 , tento ester tvoří významnou sloţku jablečného aroma, ostatní acetáty byly zaznamenány ve velmi nízkých koncentracích, dále je významně zastoupenou sloţka alkohol n-butan-1-ol 2296,32 µg.l-1. Z laktonů u zdravého jablka byly naměřeny Decalactone (2,18 µg.l-1), G-octalactone (0,44 µg.l-1) a v nejvýznamnější koncentraci se při analýze vyskytoval G-caprolactone (42,43 µg.l-1). U napadeného plodu jablka bylo při analýze naměřeno 55 aromatických látek z toho 18 alkoholů, 9 esterů, 10 aldehydů, 8 terpenů, 4 acetáty, 4 laktony, 2 ketony, 1 fenoly a 2 kyseliny a P- cymene. Nejvýznamněji byly zastoupeny alkoholy, aldehydy a estery. Z alkoholů byl nejvíce zastoupen Ethanol 1517,97 µg.l-1 , dále n-butan-1-ol (1312,35 µg.l-1), 3- methylbutan-1-ol (800,74 µg.l-1), 2- methylbutan-1-ol (1077,72 µg.l-1). V napadeném jablku jsou přítomny mikroorganismy a díky jejich enzymům probíhá fermentace rostlinných polysacharidů, které jsou přeměňovány na ethanol a oxid uhličitý za vzniku tepla a energie.

80 Mezi estery ve vysokých koncentracích patří Ethyl trans-3-hexenoate 204,76 µg.l-1, Ethyl t- 3-hexenoate (85,63µg.l-1) Iso-amyl-isovalerate (24,18 µg.l-1). Zajímavé je, ţe Ethyl butyrate se v napadeném jablku vůbec nebyl naměřen, přitom ve zdravém jablku se vyskytoval v poměrně vysokých koncentracích (707,7 µg.l-1). Z aldehydů byl analyzován jako nejvýznamnější Trans-2-hexenal 84,78 µg.l-1,3 – methyl butanal, kterého bylo naměřeno (53,78µg.l-1) n-hexanal (17,71 µg.l-1) n – nonanal v koncentraci (9,34 µg.l-1), n- hexanal byl u zdravého jablka zaznamenán ve vysoké koncentraci a u napadeného plodu činí pouze 17,71 µg.l-1. Při analýze byly zaznamenány také 2 ketony Β-ionone (0,24 µg.l-1) a Acetophenone (10,06 µg.l-1), 1 fenol Phenol (25,04 µg.l-1), 2 kyseliny, kyselina jantarová (Butanedioic acid - 7,94 µg.l-1) 2- ethylhexanoic acid (0,22 µg.l-1) a látka P-cymene (0,03 µg.l-1) Látkou zastoupenou v nejvyšší koncentraci je alkohol Ethanol 1517,97 µg.l-1 a alkohol n-butan-1-ol 1312,35 µg.l-1, z jiných látek neţ alkoholů, které zastupují nejvyšší hodnoty měření, je acetát Butyl acetate (875,3 µg.l-1) a 2- methylbutylacetát (709,9 µg.l-1), ostatní acetáty byly zaznamenány ve velmi nízkých koncentracích, dále je významně zastoupenou sloţkou Limonene (431, 03 µg.l-1). Z laktonů u nemocného jablka byly naměřeny G - caprolactone (87,22 µg.l-1), Decalactone (2,88 µg.l-1), a G - nonalactone (1,3 µg.l-1), G- octalactone (0,99 µg.l-1). Pro srovnání můţeme říci, ţe v obou plodech se největších koncentracích vyskytovaly alkoholy, aldehydy a estery, přičemţ u napadeného jablka se zvýšil počet alkoholů a sníţil počet esterů, u napadeného jablka byla naměřena navíc kyselina jantarová (Butanedioic acid) a lakton G- nonalactone. Výsledky měření jsou zaznamenány v následujících tabulkách č. 26 -32 a grafech č. 18-28.

81 Tab. 26. Estery vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Zdravá

ESTERY

Zdravé koncentrace µg.l-1

Napadené koncentrace µg.l-1

1

Ethyl undecanoate

1,45

0

2

Ethyl benzoate

0,1

0,15

3

Ethyl decanoate

25,79

0

4

Tr-methyl-2-octenoate

0,74

0,23

5

Methyl heptanoate

13,94

6,95

6

Butyl-2-methylbutyrate

29,02

12,31

7

n-hexyl butanoate

28,21

19,96

8

Iso-amyl-isovalerate

40,71

24,18

9

Ethyl butyrate

707,7

0

10

Penthyl butyrate

43,09

9,24

11

Ethyl-3-hexenoate

31,76

85,63

12

Ethyl trans-3-hexenoate

56,55

204,76

82 Graf 18. Množství esterů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Graf. 19 Množství esterů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

83 Tab. 27. Laktony vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu

Sloupec1

LAKTONY

koncentrace µg.l-1

koncentrace µg. l-1

1

Decalactone

2,18

2,88

2

G-octalactone

0,44

0,99

3

G- nonanolactone

0

1,3

4

G-caprolactone

42,43

87,22

Graf 20. Množství laktonů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

84 Tab. 28. Terpeny vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu

Sloupec1

TERPENY

Zdravé jablko koncentrace µg.l-1

Napadené jablko koncentrace µg.l-1

1

A-terpineol

12,25

5,72

2

Citronellol

19,12

2,13

3

Limonene

1827,16

431,03

4

Farnesene

44,3

13,44

5

A-linalool

2,9

0

6

Cis-linalol oxide

3,56

2,4

7

(R) - (+)-a-citronellol

0,33

0,1

8

Nerol

0,18

0,22

9

Cis -geraniol

3,92

8,19

85 Graf 21. Množství terpenů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Graf 22. Množství terpenů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

86 Tab. 29. Aldehydy vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Sloupec1

ALDEHYDY

koncentrace µg.l-1

koncentrace µg.l-1

1

Phenylacetaldehyde

6,14

6,57

2

Β-cyclocitral

0,02

0,03

3

n-nonanal

3,38

9,34

4

(E)-2-octen-1-al

0,12

0,1

5

Trans-2-decenal

0,37

1,2

6

n-octanal

13,82

6,3

7

2-methyl butanal

26,54

2,13

8

3-methyl butanal

58,79

53,78

9

Trans-2-hexenal

454,94

84,78

10

n-hexanal

622,02

17,71

Graf 23. Množství aldehydů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

87

Graf 24. Množství aldehydů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Tab. 30. Alkoholy vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu

Sloupec1

ALKOHOLY

koncentrace µg.l-1

koncentrace µg.l2

2296,32

1312,35

1

n-butan-1-ol

2

3-methyl butan-1-ol

1,47

800,74

3

2-methyl butan-1-ol

479,47

1077,72

4

n-hexanol

432,51

310,16

5

Ethanol

25,34

1517,97

6

Trans-2-hexenol

837,7

201

7

2-methylbutanol

192,92

101,19

88 8

3-methyl-2-butenol

132,46

324,98

9

2-methyl-1-penthanol

78,88

114,3

10

3-methyl-1-penthanol

168,86

248,41

11

4-methyl-1-penthanol

193,4

160,04

12

n-pentan-1-ol

53,05

17,27

13

Ethylhexan-1-ol

8,45

26,24

14

2-octanol

4,08

2,28

15

3-methyl-2-buten-1-ol

11,06

5,53

16

Eugenol

0

8,28

17

Cis-3-octen-1-ol

0,21

0,05

18

2-heptanol

1,17

9,26

89 Graf 25. Množství alkoholů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Graf 26. Množství alkoholů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

90 Graf 27. Množství alkoholů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Tab. 31. Acetáty vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu

Sloupec1

ACETÁTY

koncentrace µg.l-1

koncentrace µg.

1

Ethyl acetate

4,52

0,89

2

Phenetyl acetate

116,3

0

3

(2Z) -2- hexenyl acetate

26,29

12,25

4

Butyl acetate

922,84

875,3

5

2- methylbutylacetate

93318,17

709,9

91 Graf 28. Množství acetátů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Tab. 32. Ostatní látky vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu

Sloupec1

OSTATNÍ LÁTKY

koncentrace µg.l-1

koncentrace µg.

1

Β-ionone

0,4

0,24

2

Acetophenone

4,33

10,06

3

P-cymene

0,19

0,03

4

Phenol

15,91

25,04

5

2- ethylhexanoic acid

0,05

0,22

6

Butanedioic acid

0

7,94

92 Graf 29. Množství ostatních látek vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu

Aromatické látky jsou přirozenou směsí těkavých organických látek potravinářských výrobků a surovin, které jim dávají charakteristické aroma, je zprostředkováno čichovými orgány a stanovují se plynovou chromatografií. Typické aroma je integrující odezva širokého spektra sloţek, přičemţ kaţdá sloţka sama o sobě nevyvaţuje dané aroma (GOLIÁŠ, 1980)

93

6. ZÁVĚR Byly sledovány změny a mikrobní napadení plodů, které probíhají u skladovaných jablek chemicky ošetřených a neošetřených s určenou dobou uloţení. V uskladněném plodu ovoce probíhají sloţité biochemické a chemické děje, které jsou vyvolány enzymy a obsaţenými přímo v ovoci a také enzymy mnohých mikroorganismů, které se nacházejí na povrchu ovoce. Zhoršení kvality jablek po sklizni se děje především kvůli metabolickým změnám, mechanickým poškozením, fyziologickými poruchami, ztrátou pevnosti duţniny a následným hnitím plodů. Dynamické změny v dozrávajícím ovoci jsou příkladem velmi rychlých průběhů některých látkových sloţek, které ovlivňují kvalitu plodů. Cílem pokusu bylo sledovat druhy mikroorganismů, které se mohou vyskytovat na jablkách. Pro pokus byly vybrány odrůdy jablek tak, aby z nichţ část nebyla ošetřená chemickými postřiky a další část byla ošetřená chemickými postřiky. Mezi nimi se pak porovnávalo, která část vykazuje větší odolnost a rezistenci proti mikroorganismům. Důleţitým parametrem byla i teplota, v níţ byly plody uskladněny. Jablka byly nejprve rozděleny, byly ponechány volně, nepřikryté a takto se ukládaly do předchladírny při teplotě 16°C a do chladírny při teplotě 4°C. Pokus byl zaloţen 30. 9. 2010 a ukončen 30. 2. 2011. Během této doby se sledoval stupeň mikrobního napadení plodů, byly stanoveny těkavé aromatické látky nacházející se v plodu zdravém a plodu jiţ nezdravém (Gloeosporium). Dále byla stanovena pouze ze zdravých jablek na začátku skladování pevnost slupky plodů, titrační kyseliny a rozpustná sušina. U zdravého plodu jablka byly stanoveny těkavé aromatické látky, pro stanovení byla pouţita plynová chromatografie (GC) a při analýze bylo naměřeno 61 aromatických látek z toho 17 alkoholů, 12 esterů, 10 aldehydů, 9 terpenů, 5 acetátů, 3 laktony, 2 ketony, 2 fenoly a 1 kyselina. Významně zde byly zastoupeny alkoholy, aldehydy a estery. Látkou, která dosahovala nejvyšší koncentrace, byl acetát 2methylbutylacetate v mnoţství 93318,17 µg.l-1,z alkoholů byl nejvíce zastoupen nbutan-1-ol 2296,32 µg.l-1 U napadeného plodu jablka bylo při analýze naměřeno 55 aromatických látek z toho 18 alkoholů, 9 esterů, 10 aldehydů, 8 terpenů, 4 acetáty, 4 laktony, 2 ketony, 1 fenoly a 2 kyseliny a P- cymene. Nejvýznamněji byly zastoupeny alkoholy, aldehydy a estery. Látkou zastoupenou v nejvyšší koncentraci je alkohol Ethanol 1517,97 µg.l-1 a alkohol

94 n-butan-1-ol 1312,35 µg.l-1, z jiných látek neţ alkoholů, které zastupují nejvyšší hodnoty měření, je acetát Butyl acetát (875,3 µg.l-1) a 2- methylbutylacetát (709,9 µg.l1

), dále je významně zastoupenou sloţkou Limonene (431, 03 µg.l-1). Pro srovnání můţeme říci, ţe v obou plodech se největších koncentracích

vyskytovaly alkoholy, aldehydy a estery, přičemţ u napadeného jablka se zvýšil počet alkoholů a sníţil počet esterů, u napadeného jablka byla naměřena navíc kyselina jantarová (Butanedioic acid) a lakton G- nonalactone. Z výsledků sledování mikrobního napadení u plodů jablek je vyplívá, ţe odrůdy skladované při 16 °C byly mnohem méně odolné, neţli odrůdy skladované při 4°C, vlivem špatných skladovacích podmínek měly, teplota a relativní vzdušná vlhkost, mají mikroorganismy usnadněný vývoj a růst. Z pokusu není ale zcela jasné, zda vliv toho, jestli jablka byly ošetřeny či neošetřeny chemickými postřiky, hrál v napadení mikroorganismů zásadní roli, vzhledem k tomu, ţe nejvíce byly napadené jablka, která byla uloţena v předchladírně při 16°C i přestoţe zde byly umístěny odrůdy jak ošetřené, tak i neošetřené chemickými postřiky. Odrůda Ontario byla neošetřena chemickými postřiky a odrůda Zlatava byla ošetřena chemickými postřiky, obě dvě odrůdy byly uskladněné v předchladírně v 16°C a silně napadeny mikroorganismy. Z 30 shnilých plodů bylo 24 kusů napadeno různými druhy mikroorganismů, nejvíce se však projevovala Gloeosporiová hniloba způsobená houbou rodu Gloeosporium album, dále se zde vyskytovala modrá hniloba způsobená plísní Penicillium expansum, šedá hniloba způsobená houbou rodu Botritys cinerea a Moniliová hniloba. Stav plodů u odrůdy Zlatava v 5. měsíci bylo 18 plodů stále nenahnilých a schopných prodeje, ale 9 plodů rychle shnilo působením houby rodu Fusarium spp.. Další odrůdy uloţené při 16°C nevykazovaly viditelné napadení mikroorganismy v průběhu skladování, všechny ale postupem času uhnily. Odrůdy Koţená Reneta a Ontario vykazovaly jasné známky nemoci Strupovitosti. Napadeny mikroorganismy a většina plodů schopná prodeje byly pouze u odrůdy Koločava, Royal Gala, částečně Ribston a Carevič.

95

7. SOUHRN – RESUME

Tato bakalářská práce s názvem „ Mikrobní stabilita ovocných a zeleninových surovin“ se zabývá mikroorganismy významné z potravinářského hlediska. Také se zabývá problematikou výrobního procesu a jeho mikrobiologií. Charakterizuje především mikroorganismy, jako jsou bakterie, plísně a kvasinky vyskytující se na ovoci a zelenině, přímo uvádí jejich jednotlivé druhy a popisuje chemické sloţení produktů jejich metabolismu a jaké úkony vedou k jejich zvýšenému obsahu. Uvádí, jak mohou být mikroorganismy citlivé vůči teplotám a dalším fyzikálním vlivům jako jsou chlazení, mraţení či různé typy záření. Závěr této práce popisuje experimentální stanovení mikroorganismů napadajících ovoce během skladování, popisuje také jednotlivé druhy. Dále popisuje, které těkavé aromatické látky se nachází ve zdravém plodu jablka a v mikroby napadeném plodu jablka.

Klíčová slova: bakterie plísně, kvasinky vyskytující se na ovoci, mikrobiologie procesů, citlivost

mikroorganismů,

produkty

metabolismu,

mikroorganismy

skladované ovoce, aromatické těkavé látky ve zdravém a hnilobném jablku.

napadající

96

Resume

This thesis entlited“ Microbial stability of fruit and vegetable raw materials“ addresses important microorganisms from the food perspective. It also deals with manufacturing proces, and ouers mikrobiology. Characterized in particular microorganisms such as bacteria, fungi and yeasts occuring in fruits and vegetables, right shows the different kinds and describes the chemical composition of the products of their metabolism and what actions lead to their increased content. It states how microorganisms can be sensitive to temperature and other physical factors such as schilling, freezing or various types of radiation. The conclusion of this paper describes an experimental determination of the invading microorganisms fruit during storage, also describes the different species. Furthermore describes the volatile aromatic substances found in apples and a healthy fetus microbes contested apple fruit.

Key words: bactera, fungi, yeasts occuring on the fruit, process mikrobiology, susceptibility, metabolic products, fruit stored invading microorganisms, volatile substances in healthy and rotting apples.

97

8. SEZNAM LITERTURY 1. ADAMS, MOOS, Food Microbiology, Published by Royal Society of Chemistry, 2008, ISBN 978-0-85404-284-5 (hbk.) 2. BARKAI-GOLAN, PASTER, Mycotoxins in Fruits and Vegetables,2008, Vyd. ACADEMIC Press, ISBN 978-0-12-374126-4 3. BAMFORTH Charles W., Food fermentation, and micro-organisms, Oxford; Ames, Iowa: Blackwell Science, c2005, ISBN 978-0-632-05987-4 4. CEMPÍRKOVÁ, LUKÁŠOVÁ, HEJLOVÁ, mikrobiologie potravin, JU ZP České Budějovice, 1997.10 s. ISBN 80-7040-254-7 5. GOLIÁŠ JAN, Skladování a zpracování: Základy chladírenství. I. 1. vyd. Brno: Vysoká škola zemědělská, 1980. 158 s. ISBN 80-7157-229-2 6. GÖRNER, Fridrich; VALÍK, L\'ubomír. Aplikovaná mikrobiológia požívatín : principy mikrobiológie požívatín, potravinársky významné mikroorganizmy a ich skupiny, mikrobiológia potravinárskych výrob, ochorenia mikrobiálného pôvodu, ktorých zárodky sú prenášané poživatinami. Vyd. 1. Bratislava: Malé Centrum, 2004. 528 s. ISBN 80-967-0649-7 7. HRDINA, Vratislav. Přírodní toxiny a jedy. Praha: Galén, 2004. 302 s. ISBN 80-726-2256-0. 8. GRAM, L., GROSSART H., SCHLINGLOFF A. and T. KIØRBOE (2002). Possible quorum Sensing in Marine Snow Bacteria: Production of Acylated Homoserine Lactones by Roseobacter Strains Isolated from Marine Snow. Applied and Environmental Microbiology 8 (68):4111-4116. 9. HRUBÝ K., Genetika, 1961, vyd. Nakladatelství Československé akademie věd, 649 s 10. JAY James, LOESSNER Martin, GOLDEN David, Modern Food Microbiology Springer -Verlag, 2005, ISBN 0387231803 11. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ Anna, Kvasinky mikroorganizmy, Bratislava: Alfa, 1982, 483 s.: il

a

kvasinkovité

12. KOMPRDA, Hygiena Potravin, vyd. MZLU v Brně, 1997. 245 s. ISBN 807157-276-4, 13. KYZLINK, V. Základy konzervace potravin. Praha: SNTL -- Nakladatelství technické literatury, 1980. 516 s. 14. MALÍŘ, OSTRÝ et al., Vláknité mikromycety (plísně) mykotoxiny a zdraví člověka, 2003 ISBN 80-7013-395-3

98 15. MEAD G. C., Food safety control in the poultry industry, Boca Raton: CRC Press, 2005, ISBN 1-85573-954-2 16. POLSTER, Toxigenní plísně a mykotoxiny v potravinách, 1971, Brno, 649 s 17. STOLL, K. 1968, Prognoses des pfluctzeitpunktes der Apfelfrucht anhand morphologisher Entwicklungstadien. „Schw. Z. Obst und Weinbau“, 104, 25:641- 645 18. SNOWDON ANNA L., A colour Atlas of Post-Harvest Diseases and Disorders of

Fruits and Vegetables : Volume 1: General Introduction and Fruits ,

Cambridge, 1990, ISBN 0-7234-0931-5 19. ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Vyd. 3., opr. a dopl., V nakl. Academia 1. vyd. Praha: Academia, 2002. 363 s. ISBN 80-200-1024-6. 20. VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin 2. Vyd. 2., upr. Tábor: OSSIS, 2002. 303 s. ISBN 80-866-5901-1 21. VELÍŠEK, J. Chemie potravin 1. 1. vyd. Tábor: OSSIS, 1999. 12 s. ISBN 80902391-3-7 22. VELÍŠEK, J. Chemie potravin 3. 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 343 s. ISBN 8086659-02-X 23. VLKOVÁ, RADA, KILLER, Potravinářská mikrobiologie, ČZU v Praze, 2009. s. ISBN 978-80-213-1988-2 24. YOUSEF, A. E., JUNEJA, V. K. 2003. Microbial stress adaptation and food safety. CRC Press, Boca Raton, FL

99 INTERNETOVÉ ZDROJE 1. www.agromanual.cz/cz/atlas/choroby/choroba/modra-peniciliova-hnilobajablek.html 2. http://www.caes.uga.edu 3. http://www.encyclopedia.com/topic/microorganisms.aspx#1 4. http://www.hazmatmag.com 5. http://www.sci.muni.cz 6. http://en.wikipedia.org/wiki/Fumonisin_B1 7. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Alternariol.svg 8. http://www.med.muni.cz/prelek/MYKOTW/mtpr_idx.htm 9. http://www.attra.org/attra-pub/postharvest.html

100

9. SEZNAM TABULEK, GRAFŮ A OBRÁZKŮ SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1.: Ukázka tvarů a uspořádání bakterií Obr. 2.: Tvar kvasinky, pučící kvasinka, pupeny Obr. 3.: Plodnice plísně Obr. 4.: Aflatoxin B1 Obr. 5.: Patulin Obr. 6.: Ochratoxin A Obr. 7.: Fumonisin Obr. 8.: Alternariol Obr. 9.: Zearalenon Obr. 10.: Jablka uloţených v předchladírně Obr. 11.: Jablko uloţené v chladírně Obr. 12.: jablko uloţené v předchladírně Obr. 13.: Jablko napadené houbou rodu Gloeosporium Obr. 14.: Fotografie jablek uloţených v předchladírně Obr. 15.: Jablko napadené Penicillium Obr. 16.: Fotografie jablka uloţeného v předchladírně Obr. 17.: Jablko napadené houbou rodu Alternaria Obr. 18.: Fotografie jablka uloţeného v chladírně Obr. 19.: Fotografie skladovaných jablek - strupovitost

101 SEZNAM TABULEK Tab. 1.: Přehled kvasinek vyskytujících se na ovoci Tab. 2.: Přehled vybraných významných vláknitých mikromycetů na ovoci Tab. 3.: Přehled mykotoxinů, které produkuje rod Aspergillus Tab. 4.: Přehled mykotoxinů, které produkuje rod Penicillium Tab. 5.: Přehled mykotoxinů, které produkuje rod Fusarium Tab. 6.: Mykotoxiny podle chemické struktury členíme do následujících skupin Tab. 7.: Odrůdy jablek ošetřené chemickými postřiky Tab. 8.: Odrůdy jablek neošetřené chemickými postřiky Tab. 9.: Obsah titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky ošetřených Tab. 10.: Obsah titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky neošetřených Tab. 11.: Obsah refraktometrické sušiny (Rf) odrůd jablek chemicky ošetřených Tab. 12.: Obsah refraktometrické sušiny (Rf) u odrůd jablek chemicky neošetřených Tab. 13.: Pevnost duţniny (MPa) u odrůd jablek chemicky ošetřených Tab. 14.: Pevnost duţniny (MPa) u odrůd jablek chemicky neošetřených Tab. 15.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Koločava Tab. 16.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Zlatava Tab. 17.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Ribston Tab. 18.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Carevič Tab. 19.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Royal Gala Tab. 20.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Jonagold Tab. 21.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Quinte Tab. 22.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Jeptiška Tab. 23.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Ontario Tab. 24.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Koţená reneta

102 Tab. 25.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Florina Tab. 26.: Estery vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Tab. 27.: Laktony vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Tab. 28.: Terpeny vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Tab. 29.: Aldehydy vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Tab. 30.: Alkoholy vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Tab. 31.: Acetáty vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu Tab. 32.: Ostatní látky vyskytující se ve zdravém a napadeném plodu SEZNAM GRAFŮ Graf 1.: Mnoţství titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky ošetřených Graf 2.: Mnoţství titračních kyselin (%) u odrůd jablek chemicky neošetřených Graf 3.: Obsah refraktometrické sušiny (RS) odrůd jablek chemicky ošetřených Graf 4.: Obsah refraktometrické sušiny (RS) odrůd jablek chemicky neošetřených Graf 5.: Pevnost duţniny (MPa) u odrůd jablek chemicky ošetřených Graf 6.: Pevnost duţniny (MPa) u odrůd jablek chemicky neošetřených Graf 7.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Koločava Graf 8.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Zlatava Graf 9.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Ribston Graf 10.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Carevič Graf 11.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Royal Gala Graf 12.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Jonagold Graf 13.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Quinte Graf 14.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Jeptiška Graf 15.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Ontario

103 Graf 16.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Koţená reneta Graf 17.: Mikrobní napadení plodů odrůdy Florina Graf 18.: Mnoţství esterů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 19.: Mnoţství esterů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 20.: Mnoţství laktonů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 21.: Mnoţství terpenů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 22.: Mnoţství terpenů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 23.: Mnoţství aldehydů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 24.: Mnoţství aldehydů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 25.: Mnoţství alkoholů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 26.: Mnoţství alkoholů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 27.: Mnoţství alkoholů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 28.: Mnoţství acetátů vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu Graf 29.: Mnoţství ostatních látek vyskytujících se ve zdravém a napadeném plodu