MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ ZAHRADNICKÁ FAKULTA V LEDNICI

Ověření úspěšnosti genetických transformací podnožových odrůd révy vinné za účelem navození jejich rezistence vůči viru GFLV Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce

Vypracovala

Mgr. Miroslav Baránek, Ph.D.

Bc. Zuzana Mynarzová Lednice 2013

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci „Ověření úspěšnosti genetických transformací podnožových odrůd révy vinné za účelem navození jejich rezistence vůči viru GFLV“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby byla práce uložena v knihovně Zahradnické fakulty v Lednici Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici dne ............................................... Podpis .............................................................

Na tomto místě bych chtěla poděkovat svému vedoucímu, Mgr. Miroslavu Baránkovi, PhD., za trpělivé vedení práce a veškerou pomoc, kterou mi při jejím vypracování poskytl. Díky patří také personálu laboratoře na ústavu Mendeleum, mé rodině a přátelům.

Obsah 1. ÚVOD.....................................................................................................................................................7 2. CÍL PRÁCE...........................................................................................................................................9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED..................................................................................................................10 3.1 Princip transformací.............................................................................................................10 3.2 Metody transformací.............................................................................................................11 3.2.1 Biolistická inokulace....................................................................................................11 3.2.2 Transformace prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens.....................13 3.2.3 Další transformační metody.....................................................................................17 3.2 Popis viru GFLV.......................................................................................................................18 3.3 Trendy transformací u révy...............................................................................................21 3.3.1 Vývoj transformací u rostlin.....................................................................................21 3.3.2 Příklady metod introdukce žádoucích vlastností u révy...............................23 4. MATERIÁL A METODY.................................................................................................................29 4.1 Použitý rostlinný materiál..................................................................................................29 4.2 Metodika....................................................................................................................................31 4.2.1 Transformace révy vinné...........................................................................................31 4.2.2 Odběr vzorků..................................................................................................................32 4.2.3 Protokoly využité k extrakci rostlinné DNA.......................................................32 4.2.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR)...................................................................35 4.2.5 Elektroforetické vyhodnocení..................................................................................37 5. VÝSLEDKY........................................................................................................................................39 5.1 Analýza první sady potenciálních transformantů.....................................................39 5.2 Analýza druhé sady potenciálních transformantů....................................................40 5.3 Optimalizace testů prostřednictvím zavedení „rychlé“ izolace DNA.................42 5.4 Testování třetí sady potenciálních transformantů....................................................43 6. DISKUZE............................................................................................................................................48 7. ZÁVĚR.................................................................................................................................................52 8. SOUHRN............................................................................................................................................53 9. RESUME.............................................................................................................................................54 10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...........................................................................................55

6

1. ÚVOD Réva vinná je plodina s velkou ekonomickou a výživovou hodnotou, ceněná především pro své mnohostranné upotřebení jako čerstvé ovoce a také jako surovina pro mnoho dalších produktů. Prospěšnost révy pro zdraví člověka je poměrně dobře zdokumentovaná. Vitamíny a antioxidanty nacházející se v hroznech a následně také v produktech z nich vyrobených pomáhají předcházet rakovině a srdečním chorobám. Tyto atributy přispěly k tomu, že je réva světově nejpěstovanější ovocnou dřevinou, která v Evropě pokrývá 3,3% z celkové výměry orné půdy (Muthmann 2007). Díky globalizaci a vyrovnávání ekonomických úrovní zemí s tradiční vinařskou kulturou se i u těch států, kde víno dříve pěstováno nebylo, dá očekávat zvýšení spotřeby vína podmíněné tímto růstem (Bisson et al. 2002). S rozšiřováním vinařství mimo jeho stávající regiony však přicházejí také nové problémy, které nejsou vždy jsou řešitelné stejnými metodami jako u tradičních vinic. Nejvýraznější změnou jsou odlišné klimatické podmínky. Ostatně problém změny klimatu se týká i regionů, kde se víno pěstovalo i dříve. Nové problémy v kombinaci se stávajícími, jako jsou virové, houbové či bakteriální choroby, které se navíc často stávají ještě náročnějšími na zvládnutí kvůli jejich rezistentním formám, představují velkou překážku pro komerční pěstitele (Gadoury et al. 2012). Kromě vyhnutí se nákladům spojeným s ochranou révy před patogeny existuje velká poptávka po vylepšených odrůdách révy, které by produkovaly chutnější a zdravější plody – například pomocí zvýšení obsahu antioxidantů (Vivier a Pretorius 2002). Zlepšení révy jako plodiny lze dosáhnout pomocí klonové selekce spontánních mutací a cíleným šlechtěním. Nicméně zůstává faktem, že výběr pomocí náhodných klonových mutací je velmi neefektivní a konvenční šlechtění má pouze omezené použití kvůli vysoké heterozygotnosti révového genomu. Zvláště u již zavedených révových odrůd, které jsou ceněny pro své enologické vlastnosti, je introdukce nových znaků tak, aby nebyl původní fenotyp pozměněn, téměř nemožná. Dlouhá juvenilní fáze révy pak činí takovéto šlechtění ještě náročnějším 7

(Alleweldt a Possingham 1988). Genetické transformace zahrnují introdukci sekvence DNA do rostlinné buňky a její následnou integraci do hostitelského genomu. Rostlinné transformace představují hodnotný nástroj pro studium genové exprese a funkce těchto genů. Nezbytnými předpoklady pro transformaci révy vinné jsou dostupnost cílového rostlinného pletiva, spolehlivá metoda introdukce DNA do hostitelského genomu a dobře zvolená metodika při selekci a regeneraci transformantů (Birch 1997). Díky transformacím je také možné vnést nový znak do již zavedené odrůdy bez narušení jejího fenotypu a učinit jí tak například odolnější vůči patogenům (Dandekar et al. 2011).

8

2. CÍL PRÁCE Práce si klade za cíl popsat nejpoužívanější metody genetických transformací u révy vinné s jejich možnými riziky a výhodami. Je nastíněno také využití těchto transformačních metod v praxi; dále jsou uvedeny konkrétní studie, které těchto metod využívají a jejich úspěšnost a přidané hodnota vzniklých transformantů. Součástí je zhodnocení součastných trendů a metod využívaných k introdukci nových znaků a vlastností do rostlin révy. Experimentální část představuje přetestování již dříve transformovaných rostlin podnožových odrůd révy, do kterých byl vnesen gen odolnosti vůči GFLV – viru roncetu u révy. Cílem testování bylo určit úspěšnost transformací a potvrdit či vyvrátit přítomnost transformantů mezi testovanými rostlinami. Současně byl vyvinut nový protokol pro izolaci DNA, který toto přetestování značně usnadnil, jak co se týče času, tak z hlediska finančního.

9

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Princip transformací Existují

dva

základní

druhy

transformací

rostlin

–

transformace

explantátových kultur a transformace in planta. In planta metody jsou založené na přímé transformaci rostliny a tím pádem získání transformantů až v následující generaci. Tyto metody zatím byly úspěšné pouze u dvou druhů rostlin – Arabis thaliana a Medicago truncatula (Feldmann a Marks 1987; Chang et al. 1994). Proto se tato práce soustředí především na transformace explantátových kultur. Transformace explantátových kultur vyžadují rostlinný materiál pěstovaný v umělých podmínkách in vitro laboratoře. Příkladem takovýchto kultur jsou listové disky (Horsch et al. 1989), suspenzní kultury (Koroleva et al. 2005) a meristémové masy - „Meristematic bulks“ (Mezzetti et al. 2002). Transformace rostlin je v mnoha ohledech jednodušší než transformace živočichů. Pro usnadnění přenosu genů do cílové rostliny lze využít přirozený proces (využití Agrobacteria). Tato půdní bakterie umí infikovat poškozenou část rostliny, přičemž součástí procesu infikace je přenos velkého Ti-plazmidu do buňky hostitele, kde se jeho část integruje do rostlinného genomu. Integrovaná část obsahuje geny pro bakteriální výživu a produkci speciálních fytohormonů (Grimsley et al. 1986). Většina rostlin také poměrně snadno regeneruje. Výjimkou jsou některé druhy jednoděložných rostlin, u nichž bývá problém s regenerací. Tento problém byl však částečně vyřešen použitím speciálních promotorů a vhodných konstruktů (Sood et al. 2011). Další velmi důležitou vlastností pomáhající při genetické transformaci rostlinných buněk je jejich totipotence. Tímto slovem se označuje jev, kdy každá rostlinná buňka může vytvářet všechny diferencované buňky dospělé rostliny. To znamená, že mnoho takto již diferencovaných buněk může znovu dediferencovat do embryonálního stádia a následně se rediferencovat na nový typ buňky. To představuje obrovskou výhodu, neboť je možné, aby rostlina regenerovala 10

z jednotlivých modifikovaných somatických buněk, u kterých byla transformace úspěšná (Snustad a Simmons 2009). U révy rozvoj genetického inženýrství umožnil využití nových postupů, například ochranu produkčních porostů

pomocí transformace jejích podnoží

s cílem vytvořit GFLV rezistentní podnože (Laimer et al. 2009). První transgenní podnože proto byly získány v první polovině 90. let (Mauro et al. 1995). Zhodnocení transgenních podnoží v polních podmínkách bylo prováděno například v Champagne (1996-1999). Pokus byl tříletý, ovšem po dobu svého průběhu se setkal s velkým veřejným odporem a nakonec musel být ukončen. Nicméně rané výsledky naznačují, že tři linie transgenních podnoží vykazovaly vyšší odolnost vůči napadení GFLV (Vigne et al. 2004).

3.2 Metody transformací 3.2.1 Biolistická inokulace Tato metoda byla původně vyvinuta v 80. letech, kdy byly buňky cibule s úspěchem inokulovány RNA či DNA viru za použití malých wolframových částic (mikroprojektilů), které dokázaly projít buněčnou stěnou buňky bez jejího poškození. K přenesení nukleových kyseliny (NA) do buněk se používá tzv.„genová puška“, pomocí které jsou částice kovu obalené nukleovými kyselinami vstřeleny do buňky. Proto se tato metoda někdy označuje také jako „bombardování“. Vnesená NA se pak v buňce exprimovala (Klein et al. 1987). Původně byly používány biolistické pušky využívající střelného prachu, následkem čehož však docházelo k poškození buněk způsobené plynovým výbuchem a akustickým šokem. Proto se dnes používají pušky využívající plynů za vysokého tlaku, například hélia nebo CO 2. Místo wolframu se také využívají částice zlata; wolfram totiž v určitých případech může být pro buněčné kultury toxický (Russel et al. 1992). Úspěšnost bombardování buněk je silně závislá na fyzických vlastnostech použitých částic a také na podmínkách nástřelu. Studie provedená u Vitis vinifera 'Chardonnay', kdy odrůda byla zvolena na základě své celosvětové rozšířenosti a citlivosti k GFLV, analyzovala úspěšnost přenosu z hlediska vlivu tlaku střelby, 11

průměru částic a vzdálenosti při nástřelu. Z pokusů vyplynulo, že nejlepší podmínky pro úspěšnou expresi viru v buňkách révy představuje kombinace tlaku 2.04 MPa, průměru zlatých částic 0,6 μm a vzdálenosti 0 mm. Dalším důležitým faktorem se ukázala být kvalita použitých mikroprojektilů, především jejich rovnoměrné pokrytí NA. Rizikem použití biolistické metody u révy je vysoký obsah sacharidů a především polyfenolických látek, které se v révě extenzivně uvolňují při stresu. Velké množství těchto vysokomolekulárních látek pak může vést ke ztížení detekce GFLV (při použití RT-PCR a ELISA) či inhibici replikace viru (Valat et al. 2003).

Obr. 1: Genová puška na principu stlačeného hélia. Převzato z Westhoff (2005). Rozdíl v úspěšnosti tranformace také představuje struktura použité NA. Zhruba by se dalo říct, že dimerické a oligomerické molekuly se v buňce šíří lépe, zatímco monomerní lineární molekuly jsou méně úspěšné, ale za určitých podmínek stále použitelné (Matoušek et al. 2004). 12

Mezi výhody využití biolistické transformace buněk patří velké spektrum explantátů, které mohou být pro transformaci použity. Tímto způsobem mohou být inokulována specifická pletiva, která by nemohla být inokulována metodami konvenčními (např. kořenové vlášení u brambor; viz Matoušek et al. 2004). Tato metoda je také velmi rychlá a poměrně jednoduchá. K přenosu NA do buněk není potřeba vektor a zároveň tato metoda představuje spolehlivou cestu k transformaci organel (Newman et al. 1990; Sanford 1990). V dnešní době se biolistické bombardování buněk stává rovnocennou alternativou k transformaci pomocí Agrobacteria.

3.2.2 Transformace prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens je půdní gramnegativní tyčinkovitá pohyblivá bakterie, která je patogenem dvouděložných rostlin. Způsobuje tvorbu krčkových tumorů, například u vinné révy, ořešáků, jabloní a růží. Agrobacterium infikuje poraněná nebo poškozená místa rostliny (Blažíčková 2010).

Obr. 2: Přenos T-DNA. Převzato z Griffiths et al. (1999). Proces transformace rostlin pomocí Agrobacterium tumefaciens využívá mechanismu přirozeného genového inženýrství, který se v této bakterii vyvinul; obsahuje totiž segment DNA, který je přenášen z bakterie do rostlinné buňky. Tento 13

segment je součástí Ti-plazmidu (tumor-indukujícího), který má velikost od 200 do 800 kilobází. Agrobacterium má schopnost přenášet část svého Ti-plazmidu zvanou T-DNA do jádra infikovaných buněk, kde se stabilně integruje do genomu. Přenos žádoucí genetické informace je tedy možno provést pomocí sekvence T-DNA, na kterou je umístěn genový konstrukt, který má být přenesen na cílovou rostlinu (Grimsley et al. 1986). Tato metoda byla původně vyvinuta na základě potřeby nahrazení nespolehlivých hmyzích vektorů, díky kterým se vir dostává do rostliny in vivo. Uchovávání hmyzích vektorů a následná kontrola přenosu byla velmi komplikovaná. I když bylo možné viry studovat pomocí naklonování

jejich

genomu,

nebyl k dispozici žádný způsob jak pomocí virové NA uměle buňku infikovat (Grimsley et al. 1986). Obr. 3: Ti-plazmid. Převzato z Blažíčková (2010).

Agrobacterium tumefaciens primárně

způsobuje

u infikovaných dvouděložných rostlin nádorovitost kořenového krčku. Patogen se do rostliny z půdy dostává pomocí drobných poranění, způsobených třením o půdu nebo drobných prasklin za silného větru. Tento druh přenosu je nejčastější, i když nádory se mohou vytvářet v jakémkoli poraněném místě. Schopnost vyvolávat v rostlině nádory je u bakterie kódovaná na Tiplazmidu. Primární funkcí T-DNA je kódování genetické informace bakterie, která je vyštěpena a následně integrována rostlinnou buňkou. T-DNA nese geny pro fytohormony auxin a cytokinin a speciální druh proteinů zvané opiny (Blažíčková 2010). Opinů existuje více druhů, z nichž nejběžnější jsou nopalin a oktopin. Určitý kmen bakterie syntetizuje vždy jeden konkrétní opin; na druhu opinu je pak závislá podoba sekvence DNA, která je zodpovědná za přenos bakteriální informace do 14

buňky. Syntéza je možná díky schopnosti patogenu přesměrovat metabolické zdroje hostitelské buňky (Dessaux et al. 1993; Westhoff 2005) . Po infikaci se spouštějí dva základní mechanizmy – proliferace rostlinných buněk, podporovaná auxiny a cytokininy, vedoucí ke vzniku nádoru a začátek syntézy opinu. Tento amin patří mezi deriváty argininu, a následně pak slouží infikujícím bakteriím jako zdroj energie. Součástí sekvence plazmidu je i tzv. oblast vir (virulence), která obsahuje geny nezbytné pro přenos T-DNA. V této oblasti jsou kódovány enzymy nutné pro vyštěpení, přenos a začlenění T-DNA během procesu transformace (Snustad a Simmons 2009). Rostlinné exudáty, produkované rostlinou v poškozeném místě, pak slouží jako iniciátor exprese genů z této virulentní oblasti. Nejúčinnějšími spouštěči exprese jsou fenolické látky (př. acetosyringon); kyselé prostředí a cukry obsažené v roztoku reakci amplifikují (Zupan et al. 2000). Oblast T-DNA nativních Ti-plazmidů je dlouhá 10-30 kilobází. Některé Tiplazmidy obsahují jednu T-oblast, jiné několik T-oblastí. T-complex se skládá z jednovláknové kopie T-DNA a jedné molekuly vir proteinu VirD2, kovalentně vázané na 5' konci. Po celé délce ji pak pokrývá VirE2, protein vázající jednovláknovou DNA; tato vazba není závislá na charakteru sekvence. Komplex VirE2:ssDNA je rezistentní vůči 3' nebo 5' exonukleázám i endonukleázám (Citovsky et al. 1989). Vir systém zpracuje a následně exprimuje jakoukoli sekvenci nacházející se mezi jeho hraničními sekvencemi, které jsou tvořeny přímými nedokonalými repeticemi o délce 25 bp (Zupan et al. 2000). Integrace genu obsaženého v T-komplexu je závislá na jeho vnesení do buňky hostitelské rostliny. Tento proces je však přísně regulován a jakýkoliv protein větší než 40-60kDa musí obsahovat jaderný lokalizační signál (NLS – Nuclear Localization Signal) aby byl schopen projít pórem v jaderné membráně (Pollard a Earnshaw 2007). Tento motiv se pravděpodobně nachází v proteinech VirD2 a VirE2, které tuto pro prokaryotické proteiny netypickou schopnost získaly v průběhu evoluce v závislosti na nutnosti dostat se do organismu eukaryotického (Zambrynski, 1992). K její integraci dochází v různých místech chromozomů; někdy může docházet i k začlenění vícenásobnému. Místo, kam se T-DNA v 15

rostlinné buňce začlení, je zcela náhodné (Francis a Spiker 2005). Podobný komplex proteinu a DNA jako T-complex mohou také využívat rostlinné viry, u kterých se vždy předpokládalo, že se po rostlině šíří pomocí plasmodesmat (Esau, 1948). Průměr plasmodesmat (0,9-1.0 nm) je však výrazně menší než velikost celé virové částice (12-80 nm). Pro jejich pohyb rostlinou je tedy potřeba určitý prostředník, jehož roli zastávají právě různorodé DNA:SSB (Single Strand Binding protein) částice (Zupan et al. 2000).

Obr. 4: Transformace rostlin pomocí Agrobacterium tumefaciens. Převzato z Griffiths et al. (1999). Problémem u přenosu žádoucího genu uvnitř T-plazmidu Agrobacteria však byla okolnost, že transformované buňky ztrácejí normální kontrolu buněčného dělení a vytvářejí nádory. Tato překážka však byla překonána pomocí nalezení genů v T-DNA, které zodpovídají za vznik nádorů. Delecí jednoho nebo více genů získáme plazmid, který nádorovitost nezpůsobuje. Tím však byla značně ztížena indentifikace buněk, u kterých byla transformace úspěšná – proto je nutné mít dobře zvolený markerový gen lokalizovaný v T-DNA oblasti „odzbrojeného“ plazmidu. Tuto funkci často zastává gen rezistence vůči určité látce, díky kterému jsou pak transformanti vyselektováni. Nejrozšířenějším mezi takovýmito činidly je antibiotikum kanamycin (Snustad, Simmons. 2009). Pokud je Agrobacterium použito pro transformace révy, existuje několik

16

specifických modifikací transformačního protokolu. Jedním z rozdílů je využití filtračního papíru pro kultivaci somatických embryí révy s Agrobacterieum – takto transformované buňky měly menší tendenci hnědnout a také transientní exprese GFP a GUS genů byla výrazně vyšší než u buněk kokultivovaných na médiu agarozovém. Tyto buňky byly pak promyty v tekutém médiu obsahujícím antibiotikum cefotaxim a carbenicillin a následně vystaveny i působení kanamycinu v dalším médiu. Po této selekci vykazovaly buňky kokultivované na filtračním papíře vyšší míru stabilní transformace (Li et al. 2008). I když je tato metoda transformace primárně určena pro rostliny dvouděložné, pomocí změny virulence patogena bylo spektrum druhů, které je možno transformovat, rozšířeno o některé jednoděložné a nahosemenné (Blažíčková 2010).

3.2.3 Další transformační metody Virová transformace (transdukce) představuje metodu transformace rostlin, kdy je žádoucí genová sekvence vnesena do vhodného rostlinného viru a tento modifikovaný vir poté rostlinu infikuje. Pokud je vneseným materiálem DNA, mohou se chromozomy rekombinovat a vytvořit tak transgenní buňku. Protože ale nositelkou genetické informace je u většiny rostlinných virů RNA, které se replikuje v cytoplasmě napadené buňky, vnesené geny se nikdy nedostanou do jádra, a tudíž nemají šanci se rekombinovat. V takovém případě k transformaci nedojde a potomstvo těchto rostlin obsahuje originální genetickou informaci (Scholthof et al. 1996). Další metodou použitelnou při transformaci rostlin je elektroporace, kdy je DNA vnášeno do buňky pomocí krátkých elektrických výbojů (Snustad a Simmons 2009). Elektrický výboj je použit pro proražení samoregenerujících otvorů v protoplastu; exogenní DNA se pak do rostliny dostává pomocí těchto děr. Velmi často ovšem bývá obtížné regenerovat fertilní rostliny z protoplastu, a to především u cereálií, i když v průběhu let byl učiněn velký pokrok pro překonání tohoto problému. Byly vytvořeny i transgenní stromy, například v případě 17

introdukce obalového proteinu PPV do meruněk. Transgenní stromy vykazovaly výrazně nižší náchylnost k napadení (da Câmara Machado et al. 1992). Tato metoda není příliš rozšířená, a to především díky velmi úzkému spektru kultivarů, u kterých byla transformace úspěšná a její náročnosti na provedení a vybavení laboratoře (Snustad a Simmons 2009).

Obr. 5: Princip elektroporace. Převzato z BTX The Electroporation Experts (2013). Upraveno.

3.2 Popis viru GFLV GFLV (Grapevine Fanleaf Virus), česky roncet, představuje obecně rozšířený typ viru napadající vinnou révu. Taxonomicky lze tento virus zařadit do rodu Nepovirus, patřící do čeledi Comoviridae. Nejčastěji bývá přenášen ektoparazitickou hlísticí Xiphinema index nebo z infikovaného materiálu. Od roku 1950, kdy byl tento parazit identifikován jako vektor (Hewitt et al. 1958) a následně od identifikace GFLV jako agenta zodpovědného za vějířovitost listů révy (Hewitt et al. 1962), bylo shromážděno

množství

informací

ohledně

přenosu,

biologické

povaze,

sérologických vlastnostech, a také o struktuře a expresi virového genomu. Virová částice má tvar mnohostěnu s průměrem 28 nm a skládá se ze tří sérologicky nerozlišitelných složek, nazvývaných vrchol (top – T), střed (middle – M) a spodní část (bottom – B). Část T je dutá; část M obsahuje molekulu RNA2 a 18

část B zahrnuje jak RNA1, tak i RNA2. Genom GFLV se skládá ze dvou pozitivních jednovláknových samostatně kódovaných RNA o molekulární váze 2.4 .106 a 1.4 . 106 respektive. K tomu, aby mohl vir úspěšně infikovat rostlinu je zapotřebí obou těchto RNA. RNA nesou kovalentně vázaný protein (VPg) na jejich 5' konci a jsou polyadenylovány na 3' konci. RNA1 je téměř dvojnásobně delší (7342 bp) než RNA2 (3774 bp). Obě dvě kódují polyprotein, nazývaný P1 a P2 respektive. In vitro komplementární DNA ku RNA1 a RNA2 (vytvořená pomocí reverzní transkripce) je plně schopná nakazit rostlinu in vivo (Viry et al. 1993). Tyto biologicky aktivní transkripty mohou sloužit jako užitečná pomůcka při studiu proteinů kódovaných GFLV a interakcí mezi GFLV a jeho vektorem. Objev jakýchkoli dominantních nebo recesivních genů rezistence vůči GFLV není u genotypů z okruhu Vitis L. znám (Hemmer et al. 2009). Roncet představuje pro pěstitele révy závažný problém, protože napadené rostliny vykazují markantní pokles plodnosti, snížení kvality zbylých plodů a také je příčinou krátké životnosti vinohradu, pohybující se okolo 15-20 let. Ztráta plodnosti se pohybuje okolo 80%, v závislosti na odrůdě, virulenci konkrétního izolátu a enviromentálních podmínkách (Andret-Link et al. 2004). GFLV také snižuje množství titrovatelných kyselin a obsah cukrů v hroznech. Přítomnost viru působí negativně na srůstání roubovanců, ať už je nakažený roub, nebo podnož. Spíše než-li plošně se však GFLV ve vinohradech vyskytuje ohniskově, což je způsobeno stylem přenosu. Z jedné infikované rostliny se pak patogen pomocí hlístic šíří do svého okolí. V současnosti používané metody ochrany rostlin spočívají ve speciální agrotechnice a desinfekci půdy pomocí nematocidů. Tyto opatření jsou však málo účinná; nematocidy jsou navíc výjimečně toxické látky s negativním dopadem na životní prostředí (Ntalli a Caboni 2012). GFLV se u révy projevuje velkou škálou příznaků, které jsou pro uspokojivou produkci více či méně významné. Listy se asymetricky deformují, jejich okraje jsou zubaté, listová nervatura bývá zmnožená a listový výkrojek se stává široce otevřeným. Často se také vyskytuje chloróza listů, žlutá mozaika na listech, která může pokrývat celou čepel, nebo jen částečně. Okolo žil se vyskytují světle zelené až žlutavé skvrny. Typické listové příznaky dohromady vytvářejí list deformovaný 19

do tvaru vějíře, proto bývá tato choroba označována jako vějířovitost. Dalším častým symptomem bývá také fasciace výhonů, zkracování a zmnožování internodií. Listové příznaky se objevují brzy na jaře a jsou pozorovatelné v průběhu celé vegetační sezóny; stonkové příznaky se mohou, ale nemusí projevit.

Obr. 6: A - Ohniskovitý výskyt rostlin infikovaných GFLV. B - Srovnání produkce zdravé (vlevo) a infikované rostliny révy (vpravo). Převzato z Andret-Link et al. (2004). Typické pro GFLV jsou endocelulární tubulární útvary, které se skládají z pektinového jádra obklopeného celulózovým obalem. Tento obal je zpevněný ligninem, suberinem nebo kutinem v závislosti na druhu pletiva. Jelikož jsou tyto útvary velmi dobře rozpoznatelné ve zdřevnatělých výhonech a bazálních internodiích, jejich přítomnost je dobrým indikátorem napadení GFLV (AndretLink et al. 2004). I když bylo v posledních letech dosaženo poměrně významného úspěchu při 20

omezení šíření tohoto viru díky důslednému sledování a certifikaci množitelského materiálu, možnosti regulace výskytu této choroby přímo ve vinohradech jsou stále omezené. V závislosti na poptávce po lepší ochraně révy před GFLV bylo vypracováno množství studií, zabývajících se funkcí proteinů tohoto viru; především těch podílejících se na replikaci virové RNA, zkoumajících pohyb viru rostlinou a mechanismus přenosu z jeho vektoru, X. index. Tento pokrok v poznání umožnil další rozvoj obranných strategií proti tomuto hospodářsky významnému viru.

3.3 Trendy transformací u révy 3.3.1 Vývoj transformací u rostlin Klasický šlechtitelský postup zakomponování žádoucích znaků do genomu révy je u této rostliny brzděn několika faktory, mezi které patří dlouhé období juvenility, vysoce heterozygotní charakter existujících kultivarů a v neposlední řadě tradiční vztah veřejnosti k jednotlivým vinným varietám. Vysoká heterozygotnost navíc při hybridizaci může způsobit inbrední depresi, kdy dochází k projevu nepříznivé recesivní alely v homozygotní sestavě (Dhnekney et al. 2009). Biotechnologie nabízí možnost zlepšení vlastností existujících variet bez pozměnění vnějších znaků zažitých odrůd (De la Torre et al. 2012). K dosažení těchto změn je potřeba spolehlivého transformačního protokolu. Genetické transformace na révě byly prováděny jak pomocí využití přirozené biologické dráhy představující adici žádoucí sekvence pomocí půdní bakterie Agrobacterium, tak pomocí fyzického vnesení sekvence metodou biolistickou. Navzdory velkému úsilí a množství studií zabývajících se transformacemi u révy vinné bylo úspěšně transformováno pouze malé procento rostlin. Překážky, se kterými se výzkum potýká, jsou nízký embryogenní potenciál somatických pletiv révy, velká rozdílnost protokolů nutných pro transformaci jednotlivých odrůd a jejich rozdílné odezvy po introdukci žádoucího genu. Pokud jsou rostliny transformovány pomocí Agrobacterium, riziko představuje také vysoká míra 21

nekróz embryonálních kultur po jejich kokultivaci s tímto vektorem. Míra regenerace rostlin z transformovaných somatických embryí je také poměrně nízká (Dhekney et al. 2009). Výzkum transformací u révy

přinesl úspěch v podobě optimalizace

protokolů pro přenos genů u Vitis vinifera L. a Vitis rotundifolia Michx. Vyšší míry úspěšnosti bylo dosaženo pomocí redukce pokultivační nekrózy buněk, zvýšením transientní a stabilní exprese introdukovaného genu u transformantů a zlepšením jejich regenerace (Li et al. 2006, Li et al. 2008, Dhekney et al. 2008). Tyto protokoly byly pak zhodnoceny pro využití u Vitis champinii Planch., Vitis riparia Michx., Vitis rupestris Scheele., Vitis vinifera L. a interspecifických hybridů (Dhnekney et al. 2009). Vysoký nárůst publikací zabývajících se transformacemi u rostlin nastal v 80. letech, kdy byly vytvořeny první transgenní rostliny, a to buď pomocí přímé inokulace DNA do buňky (Paszkowski et al. 1984) nebo s využitím odzbrojených sekundárních vektorů (Zambryski et al. 1983). Počet publikací na toto téma pak ustáleně rostl až do roku 1992, kdy se tento vzestupný trend zastavil (Chi-Ham et al. 2012; Vain 2006). V současné době jsou velmi populární modifikace vlastností révy pomocí regulace exprese určitých proteinů díky RNAi (např. Kurth et al. 2012; Jelly et al. 2012). Takto pozměněné rostliny nejsou dědičné, nevyvolávají u spotřebitelů negativní reakce tak jako geneticky modifikované rostliny (DeFrancesco 2008; Travis 2008). Věda zabývající se transformacemi má tři hlavní cíle – 1, Vývoj nových technologií; 2, Aplikace těchto technologií bez vytvoření GMO plodin a 3, GMO. Druhou skupinou se zabývá asi 70% ze všech studií pojednávajících o transformacích u rostlin. V průběhu času přirozeně ubývalo článků zabývajících se vývojem nových technologií v této oblasti a naopak přibývalo těch, které těchto poznatků využívají. Vedoucí pozici v transformační vědě si drží severní Amerika, která je následována západní Evropou a Asií, především Indií, Čínou a Japonskem. Počet studií zabývajících se transformacemi v západní Evropě klesá od roku 1999, což je pravděpodobně zapříčiněno ujednáním Evropské unie o GMO z téhož roku. Výzkum v této oblasti tak přestal být pro evropské vědce do určité míry atraktivní 22

(Vain 2006).

3.3.2 Příklady metod introdukce žádoucích vlastností u révy • Využití malých genových kazet (minimal gene casettes) Jako malá genová kazeta se označuje sekvence lineární DNA, která obsahuje promotor, otevřený čtecí vzorec a terminátor exprese. Tato lineární molekula DNA je do rostliny vpravena biolisticky. Díky jejímu velmi jednoduchému složení nedochází k introdukci nežádoucích sekvencí do rostliny. U některých pokusů, které k transformaci révy využívaly T-plazmid půdní baterie Agrobacterium, byla totiž zaznamenána integrace nežádoucích sekvencí plazmidu do genotypu révy. Tyto sekvence pak měly negativní dopad na vlastní transformaci, jako například umlčení vneseného transgenu, nežádoucí rekombinace genomu a přeskupování transgenu (Kohli et al. 1999; Muller et al. 1999, Kim et al. 2003). I když se pro transformace biolistickou metodou povětšinou používá celý cirkulární plazmid, nabízí tento přístup možnost jak minimalizovat negativní dopad způsobený vnesením nežádoucích aditivních sekvencí nahrazením cirkulárního plazmidu malou genovou kazetou (Agrawal et al. 2005). Úspěšnost takovéhoto přenosu však velice záleží na typu cílové rostliny. Réva vinná je považována za rostlinu těžko transformovatelnou; u rostlin vzdorujících transformacím byla v již proběhlých výzkumech zjištěna vysoká aktivita nukleáz (Barandiaran et al. 1998). Následující práce (Sanjurjo et al. 2012) se zabývá vlivem ochrany 3' a 5' konců transformované malé genové kazety a vlivu této ochrany na úspěšnost transformací u révy. Jako materiál pro transformaci byly použity kalusové buňky podnože 110 Richter (Vitis berlandieri Planch. × Vitis rupestris) pěstované v suspenzní kultuře. Výchozím materiálem pro stavbu malé genové kazety byl vektor pBI221 (Clontech®, Mountain View, CA, USA). Bylo provedeno buďto jednorázové nebo dvojnásobné naštípání tohoto vektoru pomocí restrikčních enzymů EcoRI, HindIII, NdeI a LguI za účelem získání lineárního plazmidu nebo malých genových kazet. Pro amplifikaci těchto genových kazet byla pak použita Expand High Fidelity PCR 23

metoda (Roche®). DNA pak byla zakoncentrována etanolovou precipitací. Při testování jednotlivých malých genových kazet byl objeven zásadní faktor, který má vliv na úspěšnost transformace ochrana 3' konce DNA molekuly a terminační sekvence zde umístěné. Pokud byl pro linearizaci na 3' konci terminátoru použit enzym EcoRI, množství buněk vykazující transientní expresi transgenu se výrazně snížilo. Tato hypotéza byla testována pomocí dalších DNA konstruktů vzniklých enzymatickým působením enzymy LguI (SapI) a NdeI na pBI221, a to jednotlivě; i zároveň. Tyto enzymy produkují ochranu promotoru (LguI) či terminátoru (NdeI). Úspěšnost transformací provedených pomocí malé genové kazety vzniklé linearizací plazmidu enzymem NdeI byla dvojnásobná než u kazet vniklých díky EcoRI. Při srovnání kazet vzniklých naštípáním pomocí kombinací HindIII-EcoRI a HindIII-NdeI byl rozdíl ještě výraznější; ochrana 3' terminátorové sekvence zaručila osminásobně lepší transformační výsledky. Ochrana 5' promotoru překvapivě žádný významný dopad neměla. Po 30 dnech byla vyhodnocována stabilní exprese transgenu u transformovaných buněk, které výsledky získané pomocí transientní exprese podpořila. Tato hypotéza byla dále testována na rostlinných buňkách odrůdy 'Albariño', kde malé genové kazety opatřené 3' ochranou terminátoru proti nukleázám stabilně vykazovaly vyšší úspěšnost transformací (Sanjurjo et al. 2012).

• Zlepšení odolnosti révy k plísni révy (Plasmopara viticola) Plíseň révy – peronospora je jedním z nejnebezpečnějších patogenů všech evropských oblastí pěstování révy vinné. Tento patogen napadá všechny vegetativní orgány révy, jako jsou listy, vegetační vrcholy, květy, hrozny a letorosty. Popisovaná práce (Nookaraju a Agarwal 2012) se zabývá transformací stolní odrůdy révy 'Crimson Seedless'. Zlepšení odolnosti bylo dosaženo přenesením genu pro chitinázu a β-1,3-glukanázu z pšenice do rostlin révy. Oba tyto enzymy se podílí na ochraně rostliny před houbovým patogenem díky své schopnosti štěpit základní komponenty buněk patogena – chitinu a β-glukanu v buněčné stěně. Tohoto principu bylo u révy využito už dříve, a to konkrétně u odrůd 'Merlot' a 'Chardonnay' (Kikkert et al. 2000), 'Dornfelder' (Yamamoto et al. 2000) a mnoha 24

dalších. K přenosu bylo využito metody přenosu pomocí Agrobacterium tumefaciens. Pokus byl proveden na embryonálních kulturách vypracovaných z in vitro pěstovaných listů odrůdy 'Crimson Seedless'. Sonikace somatických embryí kokultivovaných v bateriální suspenzi A. tumefaciens výrazně napomohla míře úspěšnosti transformací, zvláště byly-li do suspenze přidány také antioxidační látky zabraňující nekrózám. Častým problémem transformací prováděných pomocí kokultivace A. tumefaciens a rostlinných buněk totiž bývá vysoká míra úmrtnosti buněk a hypersenzitivní reakce k reaktivním formám kyslíku (ROS – Reactive Oxygen Species). Tyto mrtvé buňky pak vytvářejí bariéru, která pak brání přenosu T-DNA do přeživších rostlinných buněk (Gustavo et al. 1998). Rostliny vykazující vyšší expresi genů zabraňujících šíření houbové infekce zároveň vykazovaly vyšší obsah chitinázových a β-1,3-glukanázových transkriptů i jejich vyšší enzymatickou aktivitu (Nookaraju a Agarwal 2012).

• Rezistence révy vinné k Piercově chorobě – nový protokol pro podnožové odrůdy Současné metody ochrany proti Piercově chorobě u révy (způsobené bakteriálním agentem Xylella fastidiosa) jsou založeny na transformacích podnoží, které pak přenášejí ochranné látky i do netransgenního roubu. Většina existujících studií se však zabývá komerčně méně využitelnými druhy podnožových odrůd. Původní výzkum transformací u révy byl prováděn u odrůdy 'Thompson Seedless' (Aguero et al. 2006) a protokol, který byl vyvinut v rámci této studie, využívá k transformacím embryonální kalus vzniklý z mladých prašníků, což je pletivo dostupné po velmi krátký úsek vegetační sezóny. Poté je potřeba počkat zhruba 6-8 měsíců pro vznik somatických embryí, které navíc nejsou pro některé komerční podnožové odrůdy k dispozici. Výzkum, který provedl Dandekar et al. (2011) byl proto zaměřen na vytvoření protokolu transformací buněk vrcholového stonkového meristemu, který je jako výchozí materiál dostupnější. Byl vyvinut protokol pro podnože '101-14' a '1103-P', jako kontrola byla použita odrůda 'Thompson Seedless'. Při proliferaci 25

byly použity zveřejněné protokoly pro kultivaci apikálního meristému výhonů a indukci MB - „meristematic bulks“ (Mezetti et al. 2002). Použité fytohormony pro regulaci růstu MB jsou benzyladenin (BA), kyselina dichlofenoxyoctová (2,4-D) a naftyloctová kyselina (NAA). Studie provedená u Arabidopsis také nastiňuje možnou ovladatelnost vývoje buněk vrcholového stonkového meristému pomocí fytohormonů (Galinha et al. 2009). Zvolený materiál pro transformaci tak může mnohonásobně usnadnit transformaci podnožových révových odrůd s cílem zvýšení jejich odolnosti vůči Piercově chorobě (Dandekar et al. 2011). • Geneticky transformované rostliny pro zvýšení odolnosti vůči padlí révovému Popisovaná studie (Le Henanff et al. 2011) se zabývá zkoumáním přirozených odezvových drah révového metabolismu na napadení patogenem. Znalost těchto mechanismů je klíčová pro možný vývin umělých ochranných systémů, které mohou být pak vneseny do révy. Díky výzkumu provedenému u Arabidopsis bylo zjištěno, že látky jako kyselina salicylová, kyselina jasmonová a ethylen jsou klíčové při ochraně rostliny před patogeny (Pieterse et al. 2009). Révové listy předem ošetřené látkami uvolňujícími ethylen vykazovaly zvýšenou toleranci k padlí spolu se zvýšenou úrovní exprese proteinů zapojených do ochrany rostliny (Belhadj et al. 2008). AtNPR je gen kódující protein obsahující dva typy domén, které jsou známé pro svoji schopnost zprostředkovávat meziproteinové interakce. AtNPR a jeho šest dalších typů jsou součástí genomu Arabidopsis a považují se za významnou skupinu podílející se na signalizaci obranných odezev rostliny (Liu et al. 2005). Další výkum odhalil, že jejich aktivita je ovládána pomocí buněčných redoxních změn způsobených kyselinou salicylovou. Rostliny révy – přesněji jejich embryonální kalus – byly transformovány pomocí Agrobacterium tumefaciens. Do plasmidové DNA byly uměle introdukovány sekvence AtNPR a jeho potenciální homology, VvNPR1.1 a VvNPR1.2. Pokus potvrdil, že vysoká míra exprese VvNPR1.1 u rostlin révy podmiňuje 26

spontánní zvýšenou expresi proteinů podílejících se na ochraně rostliny před patogeny. Zvýšený výskyt těchto proteinů u transformantů byl potvrzen pomocí kvantitativní RT-PCR. Na rozdíl od VvNPR1.1, VvNPR1.2 žádný výrazný vliv na transformanty neměl. Vzrostlé rostliny, kultivované nejméně čtyři týdny v půdě, byly pak infikovány konidiemi Erysiphe nectator. Ty byly aplikovány na jejich izolované listy, které byly předtím desinfikovány a umístěny na médium. Po 11 dnech bylo množství konidií na listech vyhodnoceno; hustota konidií byla hodnocena na 10 listech ze čtyř individuálních rostlin. Množství konidií u listů rostlin s vysokou mírou exprese ochranných proteinů bylo výrazně nižší (Le Henanff et al. 2011).

• Alternativa ke genovým transformacím – Nedědičná exprese genových konstruktů pomocí virového vektoru Tato metoda je založena na použití funkčního viru jako vektoru pro vnesení žádoucích vlastností do révy díky expresi specifického proteinu, nebo naopak umlčení exprese nežádoucího genu prostřednictvím RNAi. Díky tomu, že vektor použitý k přenosu je založen na RNA a při jeho introdukci do rostliny nevznikají žádné dědičné změny genomu, představuje tato metoda velmi vhodnou alternativu ke geneticky modifikovaným rostlinám révy, které jsou mezi pěstiteli i spotřebiteli stále nepopulární (DeFrancesco 2008; Travis 2008). Jako virový vektor byl použit virový kmen GLRaV-2, který je poměrně neškodným členem virového rodu Closterviridae rozšířeným ve vinařských regionech celosvětově. Tento vektor pak na principu vzdáleně připomínajícím vakcinaci reguluje expresi případného virového patogena. RNA byla izolována z infikované rostliny odrůdy 'Rulandské modré' (syn. 'Pinot noir'). Virově specifické oligonukeotidy pro PCR amplifikaci byly navrženy podle dříve publikované GLRaV-2 sekvence izolátu (Liu et al. 2009) a amplifikovány metodou RT-PCR. PCR produkty byly pak sekvencovány pro získání celistvé sekvence přírodního GLRaV-2 izolátu. 27

Vytvořená genová kazeta obsahovala gen pro GFP (Green Fluorescent Protien – Zelený fluorescenční protein) a otevřený čtecí vzorec dle Liu et al. (2009). Virová sekvence byla introdukována do Agrobacterium tumefaciens (jako sekundárního vektoru) za použití elektroporace. Dvou- až čtyřměsíční rostliny byly pak pomocí takto pozměněných bakteriálních buněk infikovány. Pomocí PCR analýzy bylo zjištěno, že během čtyř měsíců pěstování rostlin nedošlo k integraci plasmidové DNA použité k vyvolání virové infekce neškodným kmenem viru a veškerá exprese genů podmíněná přítomností virové sekvence se odehrála pouze na RNA úrovni. Rostliny infikované vektorem nesoucí genovou kazetu vykazovaly expresi GFP, nicméně nedošlo k systemickému rozšíření exprese. Předpokládaným důvodem pro tento jev je vysoká míra adaptability, kterou RNA viry vykazují u nového hostitele. Srovnáním genové sekvence virového vektoru s originálním GLRaV-2 bylo zjištěno 75 bodových mutací rozložených v rámci celého genomu. Autoři předpokládají, že tyto mutace – nebo alespoň jejich část – jsou zodpovědné za tento neúspěch (Kurth et al. 2012).

28

4. MATERIÁL A METODY 4.1 Použitý rostlinný materiál Testovány byly rostliny révy, do kterých bylo v rámci předcházejícího projektu (projekt NAZV QH91214) snahou vnést virový konstrukt s cílem navození jejich rezistence vůči GFLV. Transformace byly prováděny u podnožových odrůd SO4, CR2, T5C, 5BB a 125AA. Regenerace byly však pozorována pouze u 3 z nich – SO4 (klonová selekce Teleki 4), CR2 (Craciunel 2 – klonová selekce Kober 5BB) a T5C (Telekci 5C – V. × berlandieri PLANCH. × V. riparia MCHX.). Pro transformaci byly použity tzv . meristematic bulks, vzniklé pomocí regenerace a organogeneze apikálních vrcholků (Mezetti et al. 2002). Samotná transformace rostlin probíhala v rámci BC AV ČR, ÚMBR v Českých Budějovicích. Na základě sekvencí izolátů viru GFLV shromážděných z různých oblastní jižní Moravy byly sestaveny vektory nesoucí syntetické geny pro obalový protein PCB3819 (gen pro coat protein, celý), pCB3920 (gen pro coat protein, deletovaný na C-konci), pCB3821 (gen prot coat protein, deletovaný na N-konci), pro RNA polymerázu a helikázu. Transformace podnožových odrůd s expresními kazetami nesoucími gen pro RNA polymerázu nebyly úspěšné, v případě syntetického genu pro helikázu nebylo z časových důvodů v rámci řešení projektu možné transformované Agrobacterium s genem pro helikázu připravit. V rámci předcházejícího projektu transformace rostlin byly sestaveny i další konstrukty pro RNA polymerázu a helikázu, ale jejich přítomnost nebyla při pozdějším testování jejich transientní exprese plně doložena. Z časových důvodů v rámci řešení projektu nebylo možné transformované Agrobacterium s genem pro helikázu připravit. Při transformaci révy v rámci výše uvedeného projektu bylo původně zamýšleno využití také biolistické metody. Takto transformované rostliny byly testovány ke zjištění transientní exprese genu gus; tato exprese však byla velmi slabá. Rostliny s takto vnešeným genem následně během kultivace postupně odumíraly a drtivá většina rostoucích kalusů na selekčním médiu s obsahem

29

kanamycinu odumřela. Vzhledem k negativním výsledkům nebyla v rámci řešení bioloistická metoda dále používána (Pidra et al. 2011). V této práci testované rostliny jsou produktem transformace pomocí sekundárního vektoru, půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens – 35SGUSint, který nese dobře detekovatelný gen gusA a gen nptII, navozující rezistenci ke kanamycinu. Účninost exprese transgenů v rostlinných buňkách byla ověřována v protoplastech Solanum tuberosum cv. Bintje pomocí RT-PCR i ELISA testem. Rostliny vykazovaly transientní expresi specifické mRNA pro všechny použité transgeny. Do rostlin révy byl pak vnášen celý gen cp MEnd, gen cp MEnd bez C konce a gen cp MEnd bez N konce, vše s helpery

LBA

4404

a

EHA105.

Transformované rostliny k testování byly z

BC

AV

Budějovicích

ČR,

ÚMBR

v

postupně

Českých zasílány

na ústav Mendeleum, kde byly testovány na přítomnost virového konstruktu. Tyto transformace

probíhaly

v

několika

vlnách. V rámci jedné z prvních vln byla u transformovaných rostlin prokázána Obr. 7: Explantátová kultura transformantů. Foto autorka.

přítomnost syntetických genů, odběr listů však pravděpodobně znamenal pro

mladé prýty příliš velkou zátěž a rostliny poté uhynuly. Kvůli ohrožení jejich životnosti další rostliny transformované v následných vlnách testovány nebyly; místo toho byly zaslány přímo na ústav Mendeleum po projití procesu transformace a selekcí na médiích s různým obsahem kanamycinu. Potvrzení či vyvrácení exprese příslušných transgenů v těchto následujících sadách rostlin je předmětem této diplomové práce.

30

Obr. 8: Odběr vzorků pro izolaci DNA. Foto autorka.

4.2 Metodika 4.2.1 Transformace révy vinné Předmětem testování byly rostliny s vneseným genem pro rekombinantní obalový protein, odvozeného z lokálních moravských izolátů viru GFLV. Protein kódovaný genem se liší ve více než deseti aminokyselinách od jiných popsaných kapsidových proteinů tohoto nepoviru (Eichmeier et al. 2010). Dá se tedy předpokládat jeho lepší schopnost vázat genomovou RNA lokálních virů pokoušejících se transgenní rostlinu infikovat, než kdyby byly pro transformace použity pouze sekvence z databází. Případné sekvenční odchylky totiž mohou mít za následek nižší úspěšnost kapsidových proteinů při jejich vázání na virovou RNA; mohou tak značně snižovat enkapsidační účinek produkovaného proteinu. Proto byla za základ genu pro navození rezistence k nepovirům zvolena typická místní sekvence kapsidového proteinu. Právě na tomto principu popsaném u Abel et al. (1986) byla založena hypotéza navození rezistence transformantů. Problém případné slabé exprese v révě byl dále řešen výběrem vhodných kodonů genu pro kapsidový protein a odstraněním destabilizačních sekvencí v jeho mRNA (Pidra et al. 2011). 31

4.2.2 Odběr vzorků V průběhu pokusu byly testovány transformované rostliny révy, které byly průběžně zasílány z BC AV ČR, ÚMBR v Českých Budějovicích. Rostliny byly přechovávány v kultuře in vitro v laboratoři se standardním světelným a teplotním režimem. Jako médium se nejlépe osvědčilo DKW médium (Driver a Kuniyuki 1984), na kterém rostliny lépe prospívaly a průměrný počet nových výhonků na explantát byl dvakrát vyšší než při použití jiných médií pro in vitro pěstování (Křižan et al. 2012). DNA byla izolována z mladých listů (případně jejich segmentů), které byly odebírány tak, aby nedošlo ohrožení životnosti explantátů. Odběr rostlinného materiálu probíhal vždy v boxu s laminárním prouděním pro zajištění sterility a ochraně transgenních rostlin před škodlivými činiteli. Po odběru byl rostlinný materiál popsán a přímo v třecí misce zamražen na -80°C.

4.2.3 Protokoly využité k extrakci rostlinné DNA Komerční kit firmy Quiagen (DNaesy Plant Mini Kit) Tato metoda izolace DNA je založena na použití separačních kolon, z nichž jedna plní funkci mechanického filtru, který má za úkol zachytit rozrušené buněčné zbytky a vysrážené vysokomolekulární látky, jako jsou proteiny a sacharidy. Druhá kolona pak slouží k navázání izolované DNA, přičemž jakákoliv zbytková kontaminace je odstraněna díky vymývacímu pufru, který je aplikován ve dvou krocích. Posledním krokem je eluce DNA z kolony za použití dalšího pufru. Takto získaná DNA je připravena k dalšímu použití. Průměrný zisk DNA touto metodou je cca 3-30 μg. Celá procedura trvá asi 120 min a cena jedné izolace je okolo 90 Kč. Postup Prvním krokem je zapnutí termobloku, který se předehřeje na 65°C. Do termobloku je pak umístěna zkumavka s odpipetovaným AE pufrem, kterého by 32

mělo být dvousetnásobné množství μl, než je počet izolovaných vzorků. Před začátek izolace je důležité připravení a popsání dvou druhů kolon (fialové a bílé) a dvojnásobného počtu mikrozkumavek (1,5 ml), než kolik bude při izolaci rostlinných vzorků. Do poloviny z nich, které tvoří první sadu, se napipetuje 400 μl prvního pufru, označeného jako AP1 a 4 μl RNázy A. Postup pokračuje rozdrcením zmraženého rostlinného materiálu v třecí misce. Laboratorní lžičkou je pak odebráno asi 100 mg rostlinného pletiva a převedeno do mikrozkumavky. Obsah je pak intenzivně protřepán v ruce, případně i na třepačce, aby v mikrozkumavce nezůstaly žádné nerozmíchané kusy rostlinné hmoty a nevznikaly sraženiny. Směs je inkubována při 65°C po dobu deseti minut. Působením vyšší teploty tak dochází k lyzi buněk. Jednotlivé vzorky je potřeba během inkubace dvakrát nebo třikrát protřepat. Po vyndání z termobloku je k lyzátu přidáno 150 μl pufru označeného jako AP2. Po promíchání je směs inkubována na ledu po dobu pěti minut. Pomocí pufru dochází k vysrážení proteinů a polysacharidů. Lyzát je následně přelit do fialové kolony umístěné v 2 μl zkumavce a dvě minuty odstřeďován při maximálních otáčkách (16 000 rpm). Fáze prošlá kolonou je po centrifugaci převedena do nové mikrozkumavky mikropipetou tak, aby usazenina, vzniklá na dně při centrifugaci, zůstala ve zkumavce předchozí. K této fázi je přidán 650 μl pufru AP3 a obsah je promíchán protřepáním. Následně je fáze přelita na bílou kolonu tak, aby ji naplnila až po vrch. Vzorek je pak zcentrifugován při 8000 rpm. Fáze prošlá kolonou obsahuje eluované nežádoucí vysokomolekulární látky – fáze je vylita. Na kolonu je přidáno zbylé množství vzorku a opakujeme centrifugaci a posléze vylití prošlého roztoku. Bílá kolona je pak umístěna do nové 2 μl zkumavky, je přidáno 500 μl pufru AW; následuje centrifugace při 8000 rpm po dobu jedné minuty. Prošlá fáze je odstraněna. Poté je přidáno opět 500 μl AW pufru a tentokrát centrifugace probíhá po dobu dvou minut při maximálních otáčkách. Prošlá fáze je vylita, suchá kolona se zachycenou DNA je umístěna do nové 1,5 μl zkumavky. Na kolonu je přidáno 100 μl předehřátého pufru AE (případně 50 μl pro

33

získání více koncentrované DNA). Kolona s pufrem se nechá inkubovat při pokojové teplotě pět minut. Díky tomuto pufru je DNA vyvázána z membrány a přechází do kapalné fáze ve zkumavce pod kolonou. Po uplynutí inkubační doby je mikrozkumavka s kolonou zcentrifugována při 8000 rpm po dobu jedné minuty. Postup se ještě jednou opakuje přidáním stejného množství AE pufru s následnou inkubací a centrifugací.

„Rychlá“ izolace DNA Izolovaná DNA pochází z okrajových buněk rostliny, které byly poškozeny při řezu, působením vyšších teplot a chemickou lýzí. DNA je pak pomocí střídání teplot a působením chemických látek upravena do takové podoby, aby mohla být použita pro polymerázovou řetězovou reakci. Cena jedné izolace se pohybuje okolo 6 Kč, mírně vyšší jsou pak nároky na amplifikaci takto získaných vzorků, jelikož k jejímu správnému proběhnutí je obvykle potřeba kvalitní a dražší polymerázy. Postup Izolace byly prováděny z čerstvého rostlinného materiálu. Víčkem mikrozkumavky je vystřihnut listový segment maximální velikosti okolo 4x4 mm. Do mikrozkumavky je připipetováno 80 μl 0,25 M NaOH. Důležité je, aby rostlinný materiál byl v hydroxidu plně ponořený. Mikrozkumavky jsou následně umístěny na 30 sekund do termobloku, který byl předehřán na 105 °C. Poté jsou zkumavky ihned přeneseny na led. Před dalším krokem je namíchán roztok pufru s látkou rozkládající buněčné membrány ( 20 μl 0,5M Trizma® Base pH 8,0 s 0,25% Nonidet™ P-40). Tento roztok slouží k solubilizaci rostlinných proteinů. Do ochlazené mikrozkumavky je připipetováno 40 μl 0,25 M HCl a předem namíchaná směs Trizma® Base a Nonidet™ P-40. Směs v mikrozkumavce je potřeba ihned dobře promíchat. Poté je obsah mikrozkumavky opět povařen po dobu 2 minut v termobloku nastaveném na 105°C a následně prudce zchlazen na ledu. Takto připravené vzorky lze buďto ihned použít, nebo je možno je 34

přechovávat zamražené. Zamražené vzorky je potřeba před každým použitím dvě minuty povařit.

4.2.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Přítomnost transformantů mezi rostlinami zaslanými z BC AV ČR, ÚMBR v Českých Budějovicích byla vyhodnocována pomocí polymerázové řetězové reakce. Metoda PCR slouží k amplifikaci určitého úseku molekuly DNA, což se děje pomocí exponenciálního zmnožování vytipovaného úseku v několika cyklech (Saiki et al. 1988). Jako primery pro PCR byly použity dvě sady. Nejprve byly rostliny testovány pomocí primerů VV1 a VV2, které amplifikují genomovou DNA révy nacházející se na chromozomu č. 13 (kontrolní amplifikace svědčící o úspěšné izolaci DNA). VV1

5'-ATCGACATGGCTAGAACAGAG-3'

VV2

5'-TCTAACCATGGAATCGTATCG-3'

Tabulka 1: Révové primery.

Druhá sada primerů byla odvozena ze sekvence expresní kazety, která byla do genomu révy v rámci transformací nově zařazována. CP3

5'-TAAGTTGGGAACATTCTCTTGC-3'

CP4

5'-ACAATCTCATCGATCTGCACC-3'

Tabulka 2: Primery pro sekvenci kapsidového proteinu.

35

Při využití izolované DNA pomocí komerčního kitu byl použit tento protokol: Master mix (1x) [μl] deionizovaná voda

17,8

pufr

2,5

primer 1

1

primer 2

1

polymeráza

0,5

dNTPs

0,2

Tabulka 3: Protokol PCR pro DNA izolovanou pomocí komerčního kitu.

Enzymem použitým pro amplifikaci rostlinné DNA v produkci byly buďto DyNAzyme II DNA polymeráza (Finnzymes), či One Taq DNA polymerase (New England Biolab). Master mix je poté rozpipetován do 0,2 ml mikrozkumavek, do každé mikrozkumavky po 23 μl. Množství přidané vyizolované templátové DNA je 2 μl, jedna zkumavka obsahuje plazmidovou DNA se zaklonovaným úsekem jakožto pozitivní kontrola. Celkové množství roztoku v jedné mikrozkumavce je 25 μl. Při využití izolované DNA pomocí rychlé izolace byl použit tento protokol: Master mix (1x) [μl] deionizovaná voda

12,65

primer 1

0,5

primer 2

0,5

PVP

2,5

BSA

0,25

pufr

5

polymeráza

0,4

dNTPs

0,2

MgCl2

2

Tabulka 4: Protokol PCR pro DNA izolovanou pomocí rychlé izolační metody. Při amplifikaci DNA vyizolované pomocí rychlé izolační metody byla na 36

základě výsledků testu na vhodnost skupiny polymeráz (viz níže) používána polymeráza Go-Taq Hot Start od firmy Promega. Master mix je poté rozpipetován do 0,2 ml mikrozkumavek, do každé zkumavky po 24 μl. Množství přidané vyizolované templátové DNA je 1μl. Množství templátové DNA je v tomto případě menší kvůli snížení rizika zanesení příliš velkého množství inhibitorů, které by pak mohly interferovat s PCR. PVP a BSA jsou pak v mixu obsaženy kvůli jejich pufrovacím účinkům na inhibitory reakce. Stejně jako u předchozího protokolu, plazmidová DNA je použita jako pozitivní kontrola. Takto připravené vzorky byly vloženy do termocykleru, kde za předem daných podmínek proběhne zmnožení požadovaného úseku označeného primery. První teplotní krok je delší než u standardních PCR protokolů kvůli aktivizaci GoTaq Hot Start polymerázy. Podmínky použitého programu jsou uvedeny v následující tabulce. teplota [°C]

čas

1. krok

94,0

3 min

2. fáze

94,0

45 s

54,0

30 s

4. fáze

72,0

2 min

chlazení

4,0

1 hod

3. fáze

35x

Tabulka 5: Podmínky polymerázové řetězové reakce.

Délka celého procesu amplifikace je 3 hodiny a 22 minut. Po uplynutí této doby začíná být vzorek v termocykleru chlazen na 4°C.

4.2.5 Elektroforetické vyhodnocení

Vzorky

jsou

po

PCR

amplifikaci

vyhodnocovány

na přítomnost

požadovaného amplikonu pomocí gelové eklektroforézy. Prvním krokem je uvaření agarózového gelu. Pro většinu vyhodnocení bylo použito 150 ml genu o koncentraci 1,5%. Smícháním 150 ml pufru TAE (1x) s 2,25 g agarózy vznikne základní roztok, 37

který je pomocí mikrovlnné trouby uvařen tak, aby byl roztok průhledný. Teplý gel s magnetickým míchadlem je umístěn na chladič, kde zůstává dokud nedosáhne teploty kolem 45°C. Poté je přímo do gelu mikropipetou přidáno 7,5 μl fluorescenčního

interkalačního

barviva

GelRed.

Následně

je

gel

přelit

do připravené formy s jedním nebo dvěma hřebínky, dle potřebného počtu jamek. Po

ztuhnutí

gelu

je

hřebínek

opatrně

vytažen

a

gel

umístěn

do elektroforetické jednotky tak, aby byl celý ponořen v pufru TAE (1x). Do mikrozkumavek obsahující amplifikovanou DNA je přidáno 6 μl dávkovacího pufru, který obsahuje glycerol a barvivo Orange G. Dávkovací pufr se se vzorkem promísí pomocí mikropipety a následně nanese na gel. Do poslední nebo první jamky je aplikován velikostní DNA standard s velikostí fragmentů do velikosti 1 kb (4 μl). Na elektrody elektroforetické jednotky je zapojen zdroj napětí, který je nastaven na cca. 100 V. Pro zjištění přítomnosti transgenní sekvence ve vzorku je dostačující gel ponechat v elektroforéze po dobu půl hodiny. Přítomnost DNA se zjišťuje pomocí prosvícení gelu UV zářením.

38

5. VÝSLEDKY 5.1 Analýza první sady potenciálních transformantů

Nejprve byla testována první sada rostlin pomocí primerů VV1 a VV2, které amplifikují sekvenci na chromozomu 13 révy. Použitým protokolem pro izolaci DNA byl komerční kit DNaesy Plant Mini Kit od firmy Quiagen (viz Obr. 10). Po potvrzení úspěšnosti izolace byly testovány zaslané vzorky plazmidové DNA, které měly sloužit při pokusu jako pozitivní kontrola (viz. Obr. 9). Porovnáním obou vzorků byl pro další testování vybrán vzorek označený jako pozA, který na gelu poskytoval optimální signál. U první sady regenerantů testovaných

Obr. 9: Testování plazmidové DNA jako pozitivní kontroly.

na přítomnost transformantů se jejich výskyt neprokázal (viz Obr. 11).

Obr. 10: Výsledky testování první sady vzorků (VV). 39

Obr. 11: Výsledky testování první sady vzorků (CP).

Označení vzorku

Typ vzorku

VV1 + VV2

CP3 + CP4

1

CR2/9

+

-

2

CR2/10

+

-

3

CR2/16

+

-

4

CR2/16

+

-

5

CR2/14

+

-

6

CR2/7

+

-

7

CR2/6

+

-

8

CR2/9

+

-

9

AA/5

+

-

10

CR2/15

+

-

11

CR2/10

+

-

12

CR2/13

+

-

Tabulka 6: Výsledky testování první sady vzorků (VV+CP).

5.2 Analýza druhé sady potenciálních transformantů Při testování druhé sady potenciálních transformantů zaslaných z BC AV ČR, ÚMBR v Českých Budějovicích byl využit stejný postup jako u testování sady první. Nejprve byly vzorky zkontrolovány pomocí použití primerů VV1 a VV2 pro amplifikaci dané genomové sekvence na chromozomu č. 13. Poté byly vzorky testovány na přítomnost vloženého transgenu s využitím primerů CP3 a CP4. 40

Přítomnost transgenu se neprokázala u žádného z testovaných vzorků (viz. Obr. 12).

Obr. 12: Výsledky testování druhé sady vzorků (VV+CP). Označení vzorku

Typ vzorku

VV1 + VV2

CP3 + CP4

13

AA/1

-

-

14

AA/3

+

-

15

SO4/1

+

-

16

CR2/2

+

-

17

CR2/3

+

-

18

CR2/4

+

-

19

CR2/6

+

-

20

CR2/8

+

-

21

CR2/11

+

-

22

SO4/1

+

-

23

SO4/1

+

-

24

AA/1

+

-

Tabulka 7: Výsledky testování druhé sady vzorků (VV+CP).

41

5.3 Optimalizace testů prostřednictvím zavedení „rychlé“ izolace DNA Práce s komerčním kitem Qiagen je relativně časově náročná a také cena jedné izolace je poměrně vysoká. Pro snížení těchto negativních faktorů bylo rozhodnuto vyzkoušet protokol pro rychlou izolaci DNA, k němuž byly podklady zaslány z BC AV ČR, ÚMBR v Českých Budějovicích. Při zavádění protokolu pro rychlou izolaci DNA byly nejdříve testovány čtyři druhy polymeráz z hlediska kvantity amplikonu požadované velikosti a výskytu nežádoucích ko-amplikonů. Použitými polymerázami byly DyNAzyme II DNA polymerase (Finnzymes), One Taq DNA polymerase (New England Biolab), Go-Taq Hot Start polymeráza (Promega) a Taq DNA polymeráza (New England Biolab). Pro účely testování byly nejdříve jako primery použity VV1 a VV2. Při použití polymerázy Finnzyme nebyl získán jednolitý amplikon, u téměř všech vzorků signál na gelu tvořil jednu souvislou šmouhu. Jak NEB-One Taq polymeráza tak i Taq-DNA polymeráza měly také problém s amplifikací cílového místa při DNA izolaci touto metodou. Z šesti vzorků byly za použití NEB-One Taq polymerázy úspěšně amplifikované pouze tři. V případě Taq-DNA polymerázy byl na gelu vidět pouze jeden celistvý vzorek, přičemž u druhého došlo k nespecifické amplifikaci větších DNA fragmentů. Jako nejspolehlivšjší polymeráza pro tento druh rychlé izolace tak byla jednoznačně vyhodnocena Go-Taq Hot Start polymeráza. Při jejím použití byly všechny vzorky na gelu jasně viditelné (viz Obr. 13).

42

Obr. 13: Testování polymeráz. DyNAzyme II DNA pol. (Finnzymes)

One Taq DNA pol. (NEB)

Go-Taq Hot Start pol. (Promega)

Taq DNA pol. (NEB)

1

x

+

+

-

2

x

-

+

-

3

x

+

+

+

4

+

-

+

-

5

x

-

+

x

6

-

+

+

-

Tabulka 8: Testování polymeráz.

5.4 Testování třetí sady potenciálních transformantů Poslední sadu rostlin tvořila skupina explantátů poznože T5C (Vitis berlandieri Planch. × Vitis riparia Michx). Při postupném testování nově příchozích vzorků bylo na základě pozitivních výsledků testování použito protokolu rychlé izolace DNA. Úspěšnost izolace DNA byla nejdříve testována na základě použití primerů VV1 a VV2 (cílová oblast v genomové DNA révy). Testováno bylo 22 vzorků, z nichž byl u drtivá většiny získán očekávaný amplikon. Při přetestování stejné sady vzorků na přítomnost transformantů byl výskyt 43

transgenu potvrzen u jedenácti z nich (viz Obr. 14). Prokazatelnost výskytu byla potvrzena srovnáním velikostí amplikonů s amplikonem pozitivní kontroly, skládající se z plazmidové DNA. V obou případech byly na gelu jasně viditelné amplikony o stejné délce. Po opětovném testování daných rostlin prostřednictvím nově vyizolovaných vzorků byly některé dříve transgenní rostliny shledány jako netransgenní a naopak některé rostliny, které se dříve jevily jako negativní na výskyt transgenu se na gelu ukázaly jako transgenní (viz Obr. 15). Možné příčiny tohoto jevu jsou rozebrány v diskuzi.

Obr. 14: Výsledky testování třetí sady vzorků (VV).

Obr. 15: Výsledky testování třetí sady vzorků (CP). 44

Označení vzorku

Typ vzorku

VV1+VV2

CP3+CP4

1

T5C

+

-

2

T5C

-

-

3

T5C

-

+

4

T5C

+

-

5

T5C

+

-

6

T5C

+

-

8

T5C

+

+

10

T5C

+

-

13

T5C

+

+

14

T5C

+

+

17

T5C

+

+

19

T5C

+

+

20

T5C

+

+

22

T5C

+

-

25

T5C

+

+

26

T5C

+

-

27

T5C

+

-

28

T5C

+

-

29

T5C

+

+

30

T5C

+

+

31

T5C

+

-

32

T5C

+

+

Tabulka 9: Výsledky testování třetí sady vzorků (VV+CP).

45

Obr. 16: Výsledky přetestování třetí sady vzorků (CP).

46

Označení vzorku

Typ vzorku

1

T5C

-

3

T5C

-

6

T5C

-

8

T5C

-

9

T5C

-

10

T5C

-

13

T5C

-

16

T5C

+

17

T5C

+

19

T5C

+

20

T5C

+

22

T5C

-

24

T5C

-

25

T5C

+

26

T5C

-

27

T5C

-

28

T5C

-

29

T5C

+

30

T5C

-

31

T5C

-

32

T5C

-

Tabulka 10: Výsledky přetestování třetí sady vzorků (CP).

47

CP3+CP4

6. DISKUZE Dříve

provedené

studie

prokazují,

že

laboratorní

přetestování

transformovaných rostlin s vloženým genem pro obalový protein poskytuje celkem uspokojivé výsledky z hlediska jejich rezistence vůči GFLV (Valat et al. 2006; Hemmer et al. 2009). Díky tomu, že GFLV je virem ekonomicky poměrně významným, bylo provedeno relativně mnoho studíí zabývajících se navozováním rezistence k tomuto viru u révy (např. Gölles et al. 2000; Krastanova et al. 2005; Spielmann et al. 2000). Cílem těchto studií bylo vyprodukovat nejen rostliny odolné k napadení, ale i pečlivé zvážení enviromentálních dopadů pěstování takto modifikovaných rostlin. Kapsidový protein, který se u použitých kontrolních rostlin z virového genu obvykle dobře vytváří, bývá u transformovaných rostlin révy hůře zachytitelný. V převážné části výsledků byla prokázána jen virová mRNA, žádný protein detekován nebyl. Pro vyhodnocení takto navozené rezistence v polních podmínkách existuje prozatím malý počet studií, nicméně vesměs se shodují v tom, že klony rezistentní k viru v laboratorních podmínkách vykazují velmi různý stupeň rezistence v podmínkách polních (Hemmer et al. 2009). Jak uvádí Gambino et al. (2005) i Maghuly et al. (2006), většina transgenních rostlin révy exprimuje poměrně malé množství proteinu kódovaného vloženým genem; nedostatečná přítomnost transgenního proteinu je obvykle limitující pro využití imunologických metod (jako je například DAS ELISA) při ověřování úspěšnosti transformace. Krastanova et al. (1995) uvádí, že při vyhodnocování exprese transgenu u rostlin révy byl tento protein zachycen pomocí metody ELISA pouze u jedné rostliny ze šesti. Proto bylo pro potvrzení přítomnosti transgenu využito pouze metod molekulárních. Důvodů nízké exprese transgenu v révě může být několik: chimérismus, modifikace vložené DNA pomocí metylace nebo inzerce transgenu do nekódujících oblasti genomu, která bývá také označována jako „tichá“. V takovém případě by pak nedošlo k expresi transgenu. Transgeny inkorporované do rostlinného genomu byly často vystaveny 48

epigenetickému umlčení pomocí krátkých RNA, a to buďto během transkripce, nebo jako post-transkripční mechanismus (Vaistij et al. 2002 ;Weber et al. 1990). Nejasný závěr testování potenciálních transformantů by mohl být vysvětlen výskytem chimér, kdy je vložený gen pro kapsidový protein exprimován pouze v určité části rostliny. Jelikož se při rychlé izolaci DNA využívá jako zdroj genetické informace pouze část jednoho listu rostliny, byl by výskyt takovýchto chimér možný. DNA z poslední testované sady rostlin byla izolována v květnu roku 2012 a březnu 2013. Rozdílné výsledky na přítomnost transformantů mohou být ovlivněny také pasážováním rostlin uchovávaných in vitro, kdy mohla být chimerická část určitého vzorku oddělena do jiné sklenice. Tím pádem by bylo logické, že určitý podíl takto získaných explantátů by mohl mít rozdílné výsledky, i když by stále šlo o jeden a tentýž vzorek. Případný neúspěch u dalších, zcela negativně se jevících transformantů může být způsoben několika odlišnými faktory. Mimo výskytu chimér u transformantů se mohou rostliny jevit netransgenní kvůli špatné inkorporaci TDNA a tudíž nepřesnému zkopírování sekvence transgenu. T-DNA se mohla do rostlinné DNA začlenit pouze částečně, přičemž by na koncových regionech transgenu došlo k deleci sekvence nukleotidů. Taková sekvence by pak nebyla primery zachycena, a tudíž by se produkt neamplifikoval, stejně jako u studie provedené s révovým kultivarem 'Nebbiolo', kde byl tento jev potvrzen pomocí Southernova přenosu (Gambino et al. 2005). V minulosti bylo provedeno mnoho studií, které stejně jako tento pokus poskytly chimérické transgenní rostliny (např. Gölles et al. 2000; Krastanova et al. 1995). Jednou z příčin vzniku chimér u révy je krátká kokultivace s buňkami Agrobacterium tumefaciens při transformaci rostlinných buněk touto metodou (Gambino et al. 2005). Výskyt chimér je u transformantů poměrně běžný, jelikož jsou rostliny po transformaci regenerovány pomocí organogeneze z původně mnohobuněčného organismu (Snustad a Simmons 2009). Co se týče rezistentosti transformantů na vir, jehož gen pro obalový protein

49

byl vložen do rostlinného genomu, nejsou výsledky zcela jasné. Transgenní rostliny exprimující kapsidový protein viru GFLV byly v minulosti testovány pomocí použití infekčního roubu u transformantů pěstovaných v květináčích,

in vitro

mikroroubování a infekcí rostliny pomocí sekundárních vektorů, hlístic Xiphinema index. Takto testovaní transformanti vykazovali různou míru tolerance vůči napadení GFLV, ale žádný z nich nebyl zcela rezistentní (Barbier et al. 1997). Na druhou stranu transgenní rostliny révy vinné pěstované v květináčích a posléze infikované pomocí Xiphinema index u Tsvetkov et al. (2003) byly shledány bezvirózní i po uplynutí doby tří měsíců od iniciace infekce. Vigne et al. (2004) dosáhli úspěchu u transformantů, když na transgenní podnože exprimující GFLV obalový protein byly naroubovány netransgenní rouby komerčních odrůd a tyto roubovance pak byly vysazeny ve vinohradě. Dle tohoto pokusu se zdá, že množství exprimovaného kapsidového proteinu nemá na míru rezistence rostliny vliv a dokonce může mít i pozitivní důsledky, jelikož se při menší míře exprese proteinu také snižuje možnost samovolného vzniku kapsidových částic tak, jak to bylo popsáno u Bertioli et al. (1991). Možná interakce mezi virovým transgenem a infekčním patogenem byla v rámci zkoumání enviromentálních rizik takto modifikovaných rostlin předmětem několika vědeckých studií (Robinson 1996; Tepfer 2002; Vigne et al. 2004). Tyto interakce zahrnují případný virový synergismus, heteroenkapsidace a virové rekombinace. U transgenní rostliny může dojít k rekombinaci genomu patogena způsobenou účastí transgenních RNA templátů při replikaci viru. Výsledkem takovéto replikace je pak chimerická virová RNA, která se v několika vlastnostech může od své rodičovské linie lišit a způsobovat tak problémy ve vinohradě. Takovýmito negativními změnami jsou například rozšíření spektra vektorů i hostitelských rostlin a zvýšená patogenita. Dříve proběhlé laboratorní studie potvrzují závažnost tohoto jevu, nicméně v polních podmínkách takovéto virové rekombinanty detekovány nebyly (Vigne et al. 2004). Heteroenkapsidace není virology považována za problém, protože tento jev se vyskytuje pouze ojediněle. Navíc lze tvorbu prázdných kapsidů vzniklých expresí 50

transgenu omezit pomocí použití tzv. zkrácené sekvence („truncated sequence“). Z takovýchto sekvencí vzniká pak protein s menšími podjednotkami, u kterého se předpokládá snížená schopnost vázání s dalšími proteiny a také snížená schopnost potlačovat expresi proteinu kvůli jeho antisense konstruktům (Maghuly et al. 2006). V minulosti proběhlých studiích nebyl mezi transgenní podnoží a netransgenním roubem prokázán žádný přenos produktů vzniklých expresí transgenu. Toto bylo potvrzeno díky dlouhodobým polním pokusům (Hemmer et al. 2009; Vigne et al. 2004). I když je vzhledem k evropské legislativě využití transgenních rostlin značně omezené (ES 2001), toto zjištění by mohlo ovlivniti případné budoucí novelizace GMO směrnic a otevřít tak nové možnosti pro evropský výzkum. Možnosti využití transgenní révy pěstiteli budou teď závislé na aktivním dialogu mezi výzkumníky a komerčními vinohradníky, který by ulehčil přechod transformantů z laboratoří do polních podmínek pomocí odborného zhodnocení výhod i nevýhod použití GMO při pěstování i jejich dopad na životní prostředí. K dosažení tohoto cíle je potřeba aktivně rozvíjet příležitosti, které umožňují jak nezávislé posouzení těchto nových technologií vědeckou komunitou, tak i přetlumočení srozumitelných a věrohodných informací týkající se těchto transformantů pěstitelům a spotřebitelům.

51

7. ZÁVĚR Základem této práce bylo testování sady rostlin podnožových odrůd révy, které byly transformovány za účelem navození sekundární (získané) rezistence vůči viru GFLV. Tohoto mělo být dosaženo pomocí začlenění genu pro virový kapsidový protein do genomu rostliny. Na základě principu popsaného u Abel et al. (1986) se předpokládá, že se gen poté v rostlině exprimuje a vzniklý obalový protein je pak schopen vázat genomovou RNA patogena při pokusu infikovat transgenní rostlinu. V této práci bylo testováno několik sad rostlin révových podnoží, z nichž u některých se přítomnost transgenní sekvence potvrdila. Všechny transgenní rostliny pocházely z poslední testované sady, šlo tedy o podnože typu Teleki 5C (T5C). V průběhu testování, které probíhalo od zimy 2012 do jara 2013 se vyskytly rozdíly ve výsledcích přítomnosti transgenní sekvence. Navrhovaným vysvětlením pro tento jev je výskyt chimér, u kterých se transgenní sekvence vyskytovala pouze v určitých částech rostliny. Pro tuto hypotézu mluví i fakt, že rostliny dlouhodobě pěstované a přemnožované v in vitro podmínkách vykazovaly rozdílné výsledky i pro klony, které byly dříve shledány jako pozitivní na výskyt, ale po jejich přepasážování existovaly mezi jednotlivými částmi rozdíly ve výskytu transgenní sekvence. Testování transformantů v nesterilních podmínkách skleníku bohužel z časových důvodů nebylo uskutečněno.

52

8. SOUHRN Genetické transformace jsou jednou z cest, jak pěstované plodiny přizpůsobit požadavkům, které na ně pěstitelé a spotřebitelé kladou. Díky začlenění genu pro určitý znak lze pozměnit jak genotyp, tak fenotyp transformované rostliny. Réva vinná je ekonomicky vysoce hodnotná plodina, která má nejen dlouhou tradici pěstování ve svých tradičních regionech, ale stále častěji se začíná s jejím pěstováním i v místech, kde předtím nikdy pěstována nebyla. Pomocí introdukce genu pro obalový protein viru roncetu (GFLV) do podnožových odrůd révy je možno dosáhnout určité míry odolnosti rostliny vůči tomuto patogenu na základě principu, kdy obalový protein vzniklý transkripcí vnesené sekvence je schopen enkapsidovat nukleové kyseliny patogenního viru. Transformace byla úspěšná u skupiny rostlin typu T5C (Teleki 5C), kdy se podařilo doložit výskyt transgenu u větší části transformantů. Další pokusy naznačují, že k zabudování sekvence pro obalový protein došlo pouze v určité části rostliny a tedy ke vzniku chiméry.

Klíčová slova: Transformace – Geneticky modifikované organismy – Virová sekvence – Obalový protein - Chimérismus – GFLV - Introdukce znaku- Enviromentální bezpečnost

53

9. RESUME Genetic transformations present one of the approaches how to shape the crops to the requirements placed on them by grower's and consumer's demand. With introduction of the gene for a particular trait it is possible to modify both the genotype and phenotype of the transformed plant. Grapevine is highly valued crop economically, which not only has a long tradition of cultivation in its estabilished regions, but also now more than ever the grapevine cultivation begins to expand to other places where it had never been grown before. By insertion of the GFLV viral coat protein gene to the rootstock varieties some degree of resistance to this pathogen can be achieved based on the principle where the coat protein produced by transcription of the inserted sequence is capable of encapsidation of the pathogenic virus nucleic acid. The transformation was successful in a group of T5C (Teleki 5C) plants, where the presence of the transgene was confirmed in a greater proportion of transformants. Further experiments suggest that the coat protein sequence was incorporated only in certain parts of the plant thus marking these plants as chimeras.

Key Words: Transformations - Genetically Modified Organisms - Viral Sequence - Coat Protein Chimerism - GFLV - Trait Introduction - Enviromental Safety

54

10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ABEL, P. P.; NELSON, R. S.; HOFFMANN, N.; ROGERS, S. G.; FRALEY, R. T.; BEACHY, R. N. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science. 1986, 232(4751), 738-743. ISSN 0036-8075. AGRAWAL, P. K.; AJAY, K.; TWYMAN, R. M.; CHRISTOU, P. Transformation of plants with multiple cassettes generates simple transgene integration patterns and high expression levels. Molecular Breeding. 2005, 16, 247–260. ISSN 1572-9788. AGUERO, C. B.; MEREDITH, C. P.; DANDEKAR, A. M. Genetic transformation of Vitis vinifera L. cvs Thompson Seedless and Chardonnay with the pear PGIP and GFP encoding genes. Vitis. 2006, 45, 1-8. ISSN 0042-7500. ALLEWELDT, G.; POSSINGHAM, J. V. Progress in Grapevine breeding. Theoretical and Applied Genetics. 1988, 75, 669-673. ISSN 1432-2242. ANDRET-LINK, P.; LAPORTE, C.; VALAT, L.; LAVAL, V.; RITZENTHALER, C.; DEMANGEAT, G.; VIGNE, E.; PFEIFFER, P.; STUSSI-GARAUD, C.; FUCHS, M. Grapevine fanleaf virus: Still a major threat to the grapevine industry. Journal of Plant Pathology. 2004, 86, 183-195. ISSN 1125-4653. BARANDIARAN, X.; DI PIETRO, A.; MARTÍN, J. Biolistic transfer and expression of a uidA reporter gene indifferenttissues of Allium sativum L. Plant Cell Reports. 1998, 17, 737–741. ISSN 1432-203X. BARBIER, P.; DEMANGEAT, G.; PERRIN, M.; COBANOV, P.; JACQUET, C.; WALTER, B. Grapevine genetically transformed with the coat protein gene of grapevine fanleaf virus: an analysis of transformants. Extended Abstracts of the 12th ICVG Meeting, Lisbon (P). 1997, 131. BELHADJ, A.; TELEF, N.; CLUZET, S.; BOUSCAUT, J.; CORIO-COSTET, M. F.; MERILLON, J. M. Ethephon elicits protection against Erysiphe necator in grapevine. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008, 56, 5781-5787. ISSN 0021-8561. BERTIOLI, D. J.; HARRIS, D. R.; EDWARDS, M. L.; COOPER, J. I.; HAWES, W. S. Transgenic plants and insect cells expressing the coat protein of Arabis mosaic virus produce empty virus-like particles. Journal of General Virology. 1991, 72, 1801-1809. ISSN 1465-2099. BIRCH, R. G. Plant transformation: Problems and strategies for practical applications. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1997, 48, 297-326. ISSN 1040-2519.

55

BISSON, L. F.; WATERHOUSE, A. L.; EBELER, S. E.; WALKER, M. A.; LAPSLEY, J. T. The present and future of the international wine industry. Nature. 2002, 418, 696-699. ISSN 1476-4687. BLAŽÍČKOVÁ, J. Optimalizace systému pro studium proteinových komplexů. Brno, 2010, 62 s. Diplomová práce. Masarykova univerzita. Přírodovědecká fakulta. Ústav experimentální biologie. Oddělení funkční genomiky a proteomiky. BTX The Electroporation Experts. Frequently Asked Questions [online]. Harvard Apparatus Inc. © 2013. [cit. 6.4. 2013]. Dostupné z WWW: http://www.btxonline.com/pages/FAQ.html. CITOVSKI V.; WONG, M. L.; ZAMBRYSKI, P. Cooperative interaction of Agrobacterium VirE2 protein with single stranded DNA; implications for the T-DNA transfer process. Proceedings of National Academy of Sciences. 1989, 86, 1193-1197. ISSN 1091-6490. DA CÂMARA MACHADO, M. L.; DA CÂMARA MACHADO, A.; HANZER, V.; WEISS, H.; REGNER, F.; STEINKELLNER, H.; MATTANOVICH, D.; PLAIL, R.; KNAPP, E.; KALHOFF, B.; KATIGER, H. Regeneration of transgenic plants Prunus armeniaca containing the coat protein gene of Plum Pox Virus. Plant Cell Reports. 1992, 11(1), 25-29. ISSN 1432-203X. DANDEKAR, A. M.; WALKER, A.; IBÁÑEZ, A. M.; URATSU, S.; VAHDATI, K.; TRICOLI, D.; AGUERO, C. Engineeringmulti-component resistance to Pierce's disease in California grapevine rootstocks. Proceedings of the Pierce's Disease Research Symposium, California Department of Food and Agriculture. 2011. 107-110. DEFRANCESKO, L. Vintage genetic engineering. Nature. 2008, 26, 261-263. ISSN 0028-0836. DE LA TORRE, F.; FERNÁNDEZ, L.; SAPORTA, L.; SANJURJO, L.; SEGURA, A.; VIDAL, J. R. Relationship among curve, nutrient consumption and genetic transformation efficency of 'Albariño' (Vitis vinifera) cell suspensions. Vitis. 2012, 51, 73-78. ISSN 0042-7500. DESSAUX, Y.; PETIT, A.; TEMPE, J. Chemistry and biochemistry of opines, chemical mediators of parasitism. Phytochemistry. 1993, 34, 31-38. ISSN 0031-9422. DHENKNEY, S. A.; LI, Z. T.; DUTT, M.; GRAY, D. J. Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cultures and regeneration of transgenic plants in Vitis rotundifolia Michx. (muscadine grape). Plant Cell Reports. 2008, 27, 865-871. ISSN 1432-203X. DHEKNEY, S. A.; LI, Z. T.; ZIMMERMAN, T. W.; GRAY, D. J. Factors influencing genetic transformation and plant regeneration of Vitis. American journal of enology and viticulture. 2009, 60(3), 285-292. ISSN 0002-9254. 56

DRIVER, J. A.; KUNIYUKI, A. H. In vitro propagation of paradox walnut rootstocks. HortScience. 1984, 19(4), 507-509. ISSN 0018-5345. EICHMEIER, A.; BARÁNEK, M.; PIDRA, M. Analysis of Genetic Diversity and Phylogeny of Partial Coat Protein Domain in Czech and Italian GFLV Isolates. Plant Protection Science. 2010, 46(4), 145-148. ISSN 1212-2580. ES (2001). SMĚRNICE EVROPSKÉHO PARLAMENTU A RADY 2001/18/ES ze dne 12. března 2001 o záměrném uvolňování geneticky modifikovaných organismů do životního prostředí a o zrušení směrnice Rady 90/220/EHS. In: Úřední věstník Evropských Společenství. 17. 4. 2001. ISSN 1977-0626. Dostupné také z WWW: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do? uri=DD:15:06:32001L0018:CS:PDF. ESAU, K. Some anatomical aspects of plant virus disease problems. Botanical Gazette. 1948, 14, 413-449. ISSN 0006-8071. FELDMANN, K. A.; MARKS, M. D. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana: a non tissue culture approach. Molecular Genetics a Genomics. 1987, 213, 15-20. ISSN 1617-4615. FRANCIS, K. E.; SPIKER, S. Identification of Arabidopsis thaliana transformants without selection reveals a high occurrence of silenced T-DNA integrations. Plant Journal. 2005, 41(3), 464-477. ISSN 1365-313X. GADOURY, D. M.; CRADDLE-DAVIDSON, L.; WILCOX, W. F.; DRY, I. B.; SEEM, R. C.; MILGROOM, M. G. Grapevine powdery mildew (Erysiphe necator): a fascinating system for the study of the biology, ecology and epidemiology of an obligate biotroph. Molecular Plant Pathology. 2012, 13(1), 1-16. ISSN: 1364-3703. Dostupné z doi: 10.1111/j.1364-3703.2011.00728.x. GALINHA, C. G.; BILSBOROUGH, TSIANTIS, M. Hormonal input in plant meristems: a balancing act. Seminars & Cell Development Biology. 2009, 20, 1149-1156. ISSN 1084-9521. GAMBINO, G.; GRIBAUDO, I.; LEOPOLD, S.; SCHARTL, A.; LAIMER, M. Molecular characterization of grapevine plants transformed with GFLV resistance genes: I. Plant Cell Reports. 2005, 24(11), 655-662. ISSN 1432-203X. GÖLLES, R.; DA CÂMARA MACHADO, A.; MINAFRA, A.; SAVINO, V.; SALDARELLI, G.; MARTELLI G. P.; PÜHRINGER, KATINGER, H.; LAIMER DA CÂMARA MACHADO, M. Transgenic grapevines expressing coat protein gene sequences of grapevine fanleaf virus, arabis mosaic virus, grapevine virus A and grapevine virus B. Acta Horticulturae. 2000, 528, 305-311. ISSN 0567-7572. GRIFFITHS, A. J. F.; GELBART, W. M.; MILLER, J. H.; LEWONTIN, R. C. 1999. Modern 57

Genetic Analysis. New York : W. H. Freeman. ISBN-10: 0-7167-3118-5. GRIMSLEY, N.; HOHN, B.; HOHN, B.; WALDEN, R. „Agroinfection“, an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of National Academy of Sciences. 1986, 83, 3282-3286. ISSN 1091-6490. GUSTAVO, A. R.; GONZALEZ-CABRERA, J.; VAZQUEZ-PADRON, R.; AYRA-PADRO, C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Electronic Journal of Biotechnology. 1998, 1, 1–15. ISSN 0717-3458. HEMMER, C.; , E.; GOLDSCHMIDT, V.; KOMAR, V.; MARMONIER, A.; VALAT, L.; DEMANGEAT, G.; VIGNERON, S.; MASSON, J. E.; LEMAIRE, O. Transgenic rootstciks expressing GFLV coat protein gene in a three years field trial; resistance assessment, impact on GFLV diversity and exchange between rootstock and scion. Progrès Agricole et Viticole. Hors Série – Extended abstracts 16th Meeting of ICVG, Dijon, France, 31 Aug – 4 Sept 2009. HEWITT, W. B.; RASKI, D. J.; GOHEEN, A. C. Nematode vectro of soil-borne fanleaf virus of grapevines. Phytopathology. 1958, 48, 586-595. ISSN 0031-949X. HEWITT, W. B.; GOHEEN, A. C.; RASKI, D. J.; GOODING, G. V. Studies on the virus diseases on the grapevine in California. Vitis. 1962, 3, 57-83. ISSN 0042-7500. HORSCH, R. B.; FRY, J.; HOFFMANN, N.; NIEDERMEYER, J.; ROGERS, S. G.; FRALEY, R. T. Leaf Disc Transformation. Plant Molecular Biology Manual. 1989, 63-71. CHANG, S. S.; PARK, S. K.; KIM, B. C.; KANG, B. J.; KIM, D. U.; NAM, H. G. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta. Plant Journal. 1994, 5(4), 551-558. ISSN 1365-313X. CHI-HAM, C. L.; BOETTIGER, S.; FIGUEROA-BALDERAS, R.; BIRD, S.; GEOOLA, J. N.; ZAMORA, P.; ALANDETE-SAEZ, M.; BENNET, A. B. An intelectual property sharinginitiative in agricultural biotechnology: development of broadly accessible technologies of plant transformation. Plant Biotechnology Journal. 2012, 10, 201-210. ISSN 1467-7652. JELLY, N. S.; SCHELLENBAUM, P.; WALTER, B.; MAILLOT, P. Transient expression of artificial microRNAs targeting Grapevine fanleaf virus and evidence for RNA silencing in grapevine somatic embryos. Transgenic Research. 2012, 21(6), 1319-1327. ISSN 1573-9368. KIKKERT, J. K.; ALI, G. S.; WALLACE, P. G.; REUSTLE, G. M.REISCH, B. Expression of fungal chitinase in Vitis vinifera L. 'Merlot' and 'Chardonnay' plants produced by biolistic transformation. Acta Horticulturae. 2000, 528, 297-303. ISSN 0567-7572. KIM, S. R.; LEE, J.; JUN, S. H.; PARK, S.; KANG, H. G.; KWON, S.; AN, G. Transgene structures in T-DNA-inserted rice plants. Plant Molecular Biology. 2003, 52, 761– 58

773. ISSN 1573-5028. KLEIN, T. M.; WOLF, E. D.; WU, R.; SANFORD, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 1987, 327, 70-73. ISSN 1476-4687. KOHLI, A.; GRIFFITHS, S.; PALACIOS, N.; TWYMAN, R.; VAIN, P.; LAURIE, D.; CHRISTOU, P. Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspotin the CaMV35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination. Plant Journal. 1999, 17, 591–601. ISSN 1365-313X. KOROLEVA, O.; TOMLINSON, M.; LEADER, D.; SHAW, P.; DOONAN, J. Highthroughput protein localization in Arabidopsis using Agrobacterium-mediated genetic transient expression of GFP- ORF fusions. Plant Journal. 2005, 41, 162-174. ISSN 1365-313X. KRASTANOVA, S.; PERRIN, M.; BARBIER, P.; DEMANGEAT, G.; CORNUET, P.; BARDONNET, N; OTTEN, L.; PINCK, L.; WALTER, B. Transformation of grapevine rootstocks with the coat protein gene of grapevine fanleaf nepovirus. Plant Cell Reports. 1995, 14(9), 550-554. ISSN 1432-203X. KŘIŽAN, B.; ONDRUŠIKOVÁ, E.; MOUDRÁ, J. The effect of media composition on multiplication of grape rootstocks in vitro. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis. 2012, 60(8), 141-144. ISSN 0524-7403. KURTH, E. G.; PEREMYSLOV, V. V.; PROKHNEVSKI, A.I.; KASSCHAU, K. D.; MILLER, M.; CARRINGTON, J. C.; DOLJA, V. V. Virus-Derived Gene Expression and RNA Interference Vector for Grapevine. Journal of Virology. 2012, 86(11), 6002-6009. ISSN 1098-5514. LAIMER, M.; LEMAIRE, O.; HERBACH, E.; GOLDSCHMIDT, V.; MINAFRA, A.; BIANCO, P.; WETZEL, T. Resistance to viruses, phytoplasmas and their vectors in grapevine in Europe: a review. Journal of Plant Pathology. 2009, 91, 7-23. ISSN 1125-4653. LE HENANFF, G.; FARINE, S.; KIEFFER-MAZET, F.; MICLOT, A-S.; HEITZ, T.; MESTRE, P.; BERTSCH, CH.; CHONG, J. Vitis vinifera VvNPR1.1 is the functional ortholog of AtNPR1 and its overexpression in grapevine triggers constitutive activation of PR genes and enhanced resistance to powdery mildew. Planta. 2011, 234, 405-417. ISSN 1432-2048. Dostupné z doi: 10.1007/s00425-011-1412-1. LI, Z. T.; DHEKNEY, S. A.; DUTT, M.; VAN AMAN, M.; TATTERSALL, J.; KELLEY, K. T.; GRAY, D. J. Optimizing Agrobacterium-mediated transformation of grapevine. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Plant. 2006, 42, 220-227. ISSN 1054-5476. LI, Z. T.; DHEKNEY, S. A.; DUTT, M.; GRAY, D. J. An improved protocol for Agrobacterium-mediated transformation of grapevine. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2008, 93, 311-321. ISSN 1573-5044. 59

LIU, G.; HOLUB, E. B.; ALONSO, J. M.; ECKER, J. R.; FOBERT, P. R. An Arabidopsis NPR1-like gene, NPR4, is required for disease resistance. The Plant Journal. 2005, 41, 304-318. ISSN 1365-313X. LIU, Y-P.; PEREMYSLOV, V. V.; MEDINA, V.; DOLJA, V. V. Tandem leader proteases of grapevine leafroll-associated virus-2: host-specific functions in the infection cycle. Virology. 2009, 383,291–299. ISSN 0042-6822. MATOUŠEK, J.; ORCTOVÁ, L.; STEGER, G.; RIESNER, D. Biolistic inoculation of plants with viroid nucleic acids. Journal of Virological Methods. 2004, 122, 153-164. ISSN 0166-0934. MAURO, M. C.; TOUTAIN, S.; WALDER, B.; PINCK, L.; OTTEN, L.; COUTOSTHEVENOT, P.; DELOIRE, A.; BARBIER, P. Hight efficency regeneration of grapevine plants transformed with the GFLV coat protein gene. Plant Science. 1995, 112, 97-106. ISSN 0168-9452. MEZZETTI, B.; PANDOLFINI, T.; NAVACCHI, O.; LANDI, L. Genetic transformation of Vitis vinifera via organogenesis. BMC Biotechnology. 2002, 2(18). ISSN: 1472-6750. Dostupné z doi: 10.1186/1472-6750-2-18. MULLER, A.; KAMISUGI, Y.; GUNEBERG, R.; NIEDENHOF, I.; HOROLD, R.; MEYER, P. Palindromic sequences and A+T- rich DNA elements promote illegitimate recombination in Nicotiana tabacum. Journal of Molecular Biology. 1999, 291, 29– 46. ISSN 0022-2836. MUTHMANN, R. 2007. The use of plant protection products in the European Union. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities. ISBN: 92-79-03890-7. Dostupné také z WWW: http://epp.eurostat.ec.europa.eu/cache/ITY_OFFPUB/KS-76-06-669/EN/KS-76-0 6-669-EN.PDF. NEWMAN, S. M.; BOYNTON, J. E.; GILLHAM, N. W.; RANDOLPH-ANDERSON, B. L.; JOHNSON, A. M.; HARRIS, E. H. Transformation of Chloroplast Ribosomal RNA Genes in Chlamydomonas: Molecular and Genetic Characterization of Integration Events. Genetics. 1990, 126, 875-888. ISSN 1943-2631. NOOKARAJU, A.; AGARWAL, D. C. Enhanced tolerance of transgenic grapevines expressing chitinase and β-1,3-glucanase genes to downy mildew. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2012, 111(1), 15-28. ISSN 1573-5044. NTALLI, N. G.; CABONI, P. Botanical Nematicides: A Review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2012, 60(40), 9929-9940. ISSN 1520-5118. Dostupné z doi: 10.1021/jf303107j. PASZKOWSKI, J.; SHILLITO, R. D; SAUL, M.; MANDÁK, V.; HOHN, T.; HOHN, B.; 60

POTRYKUS, I. Direct gene transfer to plants. The EMBO Journal. 1984, 3(12), 2717-2722. ISSN 1460-2075. PIDRA, M.; VEJSADOVÁ, H.; PAVINGEROVÁ, D. Nové biotechnologické postupy pro navození rezistence podnoží révy vinné proti nepovirům. Redakčně upravená závěrečná zpráva. Projekt NAZV: QH 91214. Lednice: Mendelova univerzita, Zahradnická fakulta, 2011. PIETERSE, C. M.; LEON-REYES, A.; VAN DER ENT, S.; VAN WEES, S. C. Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology. 2009, 5, 308-316. ISSN 1552-4469. POLLARD, T. D.; EARNSHAW, W. C., 2007. Cell Biology. Saunders: Elsevier. ISBN 1416022554. ROBINSON, D. J. Environmental risk assessment of releases of transgenic plants containing virus-derived inserts. Transgenic Research. 1996, 5, 359-362. ISSN 1573-9368. RUSSEL, J. A.; ROY, M. K.; SANFORD, J. C. Physical Trauma and Tungsten Toxicity Reduce the Efficiency of Biolistic Transformation. Plant Physiology. 1992, 98, 1050-1056. ISSN 1532-2548. SAIKI, R. K.; GELFAND, D. H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S. J.; HIGUCHI, R.; HORN, G. T.; MULLIS, K. B.; ERLICH, H. A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988, 239(4839), 487-491. ISSN 1095-9203. SANFORD, J. C. Biolistic Plant Tranformation. Physiologia Plantarum. 1990, 79(1), 206-209. ISSN 1399-3054. SCHOLTHOF, H. B.; SCHOLTHOF, K. G.; JACKSON, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 1996, 34, 299-323. ISSN 0066-4286. SANJURJO, L;.VIDAL, J. R.; SEGURA, A.; DE LA TORRE, F. Genetic transformation of grapevine cells using the minimal cassette technology: The need of 3'-end protection. Journal of Biotechnology. 2012, 163, 386-390. ISSN 1860-7314. SNUSTAD, D. P; SIMMONS, M. J., 2009. Genetika. Brno: Masarykova univerzita. ISBN 978-80-210-4852-2. SPIELMANN, A.; DOUET-ORHANT, V.; KRASTANOVA, S.; GUGERLI, P. Resistance to Nepoviruses in grapevine and Nicotiana benthamiana: expression of several putative resistance genes in transgenic plants. Acta Horticulturae. 2000, 528, 373-378. ISSN 0567-7572.

61

SOOD, P.; BHATTACHARYA, A.; SOOD, A. Problems and possibilities of monocot transformation. Biologia Plantarum [online]. 2011, 55(1), [cit. 9.3.2013]. ISSN 1573-8264. Dostupné z doi: http://dx.doi.org/10.1007/s10535-011-0001-2. TEPFER, M. Risk assessment of virus resistant transgenic plants. Annual Review of Phytopathology. 2002, 40, 467-491. ISSN 0066-4286. TRAVIS, J. Uncorking the grape genome. Science. 2008, 320, 475-477. ISSN 1095-9203. TSVETKOV, I.; CHOLEVA, B.; YANKULOVA, M.; MINCHEV, N.; COLOVA, V.; ATANASSOV, A. Evaluation of transgenic grape tolerance toward Grapevine Fanleaf Virus. In: Extended Abstracts of 14th ICVG Conference. 2003. 231–232. VAIN, P. Global trends in plant transgenic science and technology (1973-2003). Trends in Biotechnology. 2006, 24(5), 206-211. ISSN 0167-7799. VAISTIJ, F. E.; JONES, L.; BAULCOMBE, D. C. Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase. The Plant Cell. 2002, 14(4), 857-867. ISSN 1532-298X. VALAT, L.; FUCHS, M.; BURRUS, M. Transgenic grapevine rootstock clones expressing the coat protein or movement protein genes of Grapevine fanleaf virus: Characterization and reaction to virus infection upon protoplast electroporation. Plant Science. 2006, 170(4), 739-747. ISSN 0168-9452. VALAT, L.; MODE, F.; MAURO, M. C.; BURRUS, M. Preliminary attempts to biolistic inoculation of grapevine fanleaf virus. Journal of Virological Methods. 2003, 108, 29-40. ISSN 0166-0934. VIGNE, E.; KOMAR, V.; FUCHS, M. Field safety assessment of recombination in trangenic grapevine expressing the coat protein gene of Grapevine Fanleaf Virus. Transgenic research. 2004, 22, 4673-4680. ISSN 1573-9368. VIRY, M.; SERGHINI, M.A.; HANS, F.; RITZENTHALER, C.; PINCK, M.; PINCK, L. Biologically active transcripts from cloned cDNA of genomic grapevine fanleaf nepovirus RNAs. Journal of General Virology. 1993, 74, 169-174. ISSN 1465-2099. VIVIER, M. A.; PRETORIUS, I. S. Genetically tailored grapevines for the wine industry. Trends in Biotechnology. 2002, 20, 472-478. ISSN 0167-7799: WEBER, H.; ZIECHMANN, C.; GRAESSMAN, A. In vitro DNA methylation inhibits gene expression in transgenic tobacco. The EMBO Journal. 1990, 9, 4409-4415. ISSN 1460-2075. WESTHOFF, P. Transformation von Pflanzen – Agrobacterium tumefaciens. Výukový

materiál pro kurz „Genetik und Molekularbiologie für Pflanzen“. 2005. Dostupné z WWW : http://www.uni-duesseldorf.de/WWW/MathNat/botiv/molbiol/website/ pdf/pdf_A-Vorlesung/Agrobacterium_05.pdf. YAMAMOTO, T.; IKETANI, H.; IEKI, H.; NISHIZAWA, Y.; NOTSUKA, K.; HIBI, T.; HAYASHI, T.; MATSUTA, N. Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogens. Plant Cell Reports. 2000, 19, 639-646. ISSN 1432-203X. ZAMBRYNSKI, P. C.; JOOS, H.; GENETELLO, C.; LEEMANS, J.; VAN MONTAGU, M.; SCHELL, J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. The EMBO Journal. 1983, 2(12), 2143-2150. ISSN 1460-2075. ZAMBRYNSKI, P. C. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story. Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biolgy. 1992, 43, 4645-4690. ISSN 1040-2519. ZUPAN, J.; MUTH, T. J.; DRAPER, O.; ZAMBRYSKI, P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: A feast of fundamental insights. The Plant Journal. 2000, 23(1), 11-28. ISSN 1365-313X.