Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici
VLIV MALOLAKTICKÉ FERMENTACE NA ACIDOBAZICKÉ VLASTNOSTI VÍNA
Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce
Vypracoval
Ing. Michal Kumšta
Jiří Bednář
Lednice 2013
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma vliv malolaktické fermentace na acidobazické vlastnosti vína vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Lednici, dne 3. května 2013 Podpis diplomanta
Poděkování Děkuji Ing. Michalu Kumštovi, vedoucímu bakalářské práce, za inspirativní námět a odborné rady, Ing. Radku Skotalovi za prostor a čas, rodině za trpělivost a mnohým dalším, zde nejmenovaným.
Věnováno Josefu Kluchovi in memoriam.
Obsah 1 Úvod .............................................................................................................................. 6 2 Mikrobiologická podstata malolaktická fermentace ................................................ 7 2.1 Od minulosti po současnost .................................................................................... 8 2.2 Bakterie mléčného kvašení ..................................................................................... 9 2.2.1 Bakteriální buňka............................................................................................. 9 2.2.2 Rozmnožování bakterií .................................................................................. 10 2.2.3 Zařazení bakterií do systému ......................................................................... 10 2.2.4 Oenococcus oeni ............................................................................................ 12 2.2.5 Metabolismus LAB........................................................................................ 13 3 Cesta k malolaktické fermentaci .............................................................................. 14 3.1 Vliv pH na malolaktickou fermentaci................................................................... 15 3.2 Vliv teploty na malolaktickou fermentaci ............................................................ 16 3.3 Vliv macerace na malolaktickou fermentaci ........................................................ 16 3.4 Vliv SO2 na malolaktickou fermentaci ................................................................. 17 3.5 Vliv ethanolu na malolaktickou fermentaci.......................................................... 17 4 Kvalitativní změny během malolaktické fermentace ............................................. 18 4.1 Metabolismus cukrů.............................................................................................. 19 4.1.1 Metabolismus hexós ...................................................................................... 19 4.1.2 Metabolismus pentós ..................................................................................... 20 4.1.3 Metabolismus polysacharidů ......................................................................... 20 4.2 Metabolismus aminokyselin ................................................................................. 20 4.3 Degradace glycerolu ............................................................................................. 22 4.4 Syntéza polysacharidů .......................................................................................... 23 5 Organické kyseliny .................................................................................................... 24 5.1 Kyselina vinná ...................................................................................................... 25 5.1.1 Degradace kyseliny vinné.............................................................................. 26 5.2 Kyselina jablečná.................................................................................................. 28 5.2.1 Přeměna kyseliny jablečné – malolaktická fermentace ................................. 29 5.2.2 Snížení obsahu kyseliny jablečné bez MLF .................................................. 29 5.3 Kyselina citrónová ................................................................................................ 30 5.3.1 Degradace kyseliny citrónové........................................................................ 30 5.4 Kyselina jantarová ................................................................................................ 31 5.5 Kyselina mléčná.................................................................................................... 32 5.6 Kyselina pyrohroznová ......................................................................................... 32 5.7 Kyselina octová..................................................................................................... 33 6 Stanovení organických kyselin ve víně..................................................................... 34 6.1 Spektrofotometrické metody................................................................................. 34 6.2 Enzymatické metody............................................................................................. 34 6.3 Chromatografické metody .................................................................................... 35 6.3.1 Plynová chromatografie ................................................................................. 35 6.3.2 Kapalinová chromatografie............................................................................ 36 6.4 Elektromigrační metody ....................................................................................... 36 6.4.1 Elektroforéza.................................................................................................. 37 6.5 Acidobazické titrace, měření pH-metrem ............................................................. 37 6.5.1 Alkalimetrie ................................................................................................... 37 7 Závěr ........................................................................................................................... 38 8 Souhrn......................................................................................................................... 39 Resume........................................................................................................................... 40 5
1 Úvod Dosažení vysoké kvality vína je již po mnoho let pro většinu výrobců zásadní hnací silou, dávno nahrazující cílenou maximální produkci odnepaměti opěvovaného a ceněného nápoje. Je zřejmé, že nezanedbatelný vliv na tuto ušlechtilou snahu vinařů, má nutnost čelit neustále rostoucí konkurenci zahraničních i domácích vín. Ovšem vidět za všemi počiny, směřujícími ke zvyšování kvality vína jen tržní mechanismy, je, na štěstí, také již překonaná teorie. Stále se zvyšující počet výrobců vín z integrované produkce, či dokonce biovín, je toho důkazem, nemluvě o přibývajících „tradicionalistech“. U všech jmenovaných skupin se totiž projevuje stále sílící snaha o ochranu půdy, lidského zdraví a životního prostředí vůbec. Výroba vín pod taktovkou takovýchto zásad však od vinařů vyžaduje také hlubší poznání všech procesů s ní spojených, a tedy potřebu sebevzdělávání, a to ruku v ruce s využíváním stále se zdokonalujících zařízení a výrobních technologií. Jedním z procesů, se kterými se při výrobě vína potkáváme je také tak zvaná malolaktická fermentace. Za rozpoznáním podstaty, příčin i následků tohoto jevu nacházíme také technologický pokrok, a to již od pokusů s optikou, po využití dnešních nejmodernějších přístrojů a technologických postupů. Proto se i zde historicky setkáváme nejprve s rozpoznáváním mikroorganismů, jejichž role je tu zásadní, směřujícím k jejich zušlechťování a cílenému používání, až k výrobě specifických látek mikroorganismy produkovaných, díky nalezení genů, které tuto produkci řídí. Nyní nás tedy čeká nesmělé nahlédnutí za oponu, jež nám zakrývá taje výroby vína, tedy nápoje, bez kterého by člověk snad ani nebyl člověkem. Uvolněme se, děj malolaktická fermentace začíná.
6
2 Mikrobiologická podstata malolaktická fermentace Je to kyselina jablečná (malic acid), a produkt její dekarboxylace kyselina mléčná (lactic acid), které daly jméno zde popisované jablečno-mléčné fermentaci (malolactic fermentation – MLF; setkáme se i s dalším názvem, tím je biologické odbourávání kyselin – BOK či prosté jablečno-mléčné kvašení). Za tuto transformaci jsou zodpovědné bakterie mléčného kvašení (lactic acid bacteria – LAB). Její průběh je možné vyjádřit poměrně jednoduchou rovnicí: kyselina jablečná
kyselina mléčná + CO2,
z níž krom jiného plyne, že probíhá bez meziproduktů. Jelikož se však jedná o kyseliny organické, je třeba brát v úvahu důležitou vlastnost organických látek, a totiž, že se mohou vyskytovat v isomerních formách. V případě malolaktické fermentace se tak jedná o transformaci kyseliny L-jablečné na kyselinu L-mléčnou. Přičemž bakterie Oenococcus oeni je schopna produkovat také kyselinu D-mléčnou z glukósy (a to pouze tuto, na rozdíl například od rodů Lactobacillus a Pediococcus, které jsou schopny z glukósy formovat i kyselinu L-mléčnou). Zde se jedná o isomery optické. S přihlédnutím k informacím výše uvedeným můžeme rovnici zapsat i takto (viz níže, v závorkách hrubý nástin hmotnostních poměrů, v reakci zúčastněných látek). COOH COOH
OH
C
H
H
C
H
C
H
+
CO2
CH3
COOH L-jablečná kyselina (1g)
OH
L-mléčná kyselina (0,67 g)
oxid uhličitý (0,33 g)
Obr. 1 Přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou během jablečnomléčné fermentace
Výzkumy vedené k objasnění principu této transformace vedly až ke zjištění enzymatické podpory, provázející zmíněnou reakci. U bakterií mléčného kvašení způsobující malolaktickou fermentaci tak byl objeven tzv. malolaktický enzym, poprvé izolovaný z bakterie Lactobacillus plantarum (LONVAUD, 1975; SCHÜTZ and RADLER, 1974). Tento proces významně ovlivňuje kvalitu vína především snížením pH, tedy i vnímané kyselosti. Ale začněme tempem poněkud volnějším.
7
2.1 Od minulosti po současnost Při pouti proti proudu času, poté co se prodereme záplavou neustále přibývajících nových objevů, mineme, v atmosféře již poklidnější, několik velikánů právě se rodících vědních oborů a disciplín. Zvolna zastavujeme v 17. století u člověka vznešeného jména, jímž je Antony van Leeuwenhoek (1632-1723). Zručný chlapík, který sám vybrousil několik čoček a sestrojil první mikroskop, díky němuž sledoval jakási drobounká stvoření. Pro nás tímto nastává čas k cestě zpět do současnosti. Aby nebyl návrat příliš prudký, dopřejeme si několik zastávek. Carl von Linné (1707–1778), zakladatel systematiky dodnes používané, zařadil van Leeuwenhoekem pozorovaná stvoření, společně s mnoha dalšími jim „podobnými“, do jednoho rodu, kterému dal název „chaos“ (a měl pravdu, pozn. autora). Další zastávka, jsme v 19. století a francouzský chemik Louis Pasteur (1822–1895) dává svými objevy a postuláty základ vědnímu oboru mikrobiologie. Byl to právě on, kdo navrhl tomuto oboru i název (mikros–malý, bios–život, logos–věda). Poznatky a praktické pokusy tohoto významného vědce vedly také k základům imunologie (ZÁHORA, 2010). A bylo to roce 1873, tedy zhruba deset let od pokusů L. Pasteura s mléčným kvašením, kdy J. Lister získal první čistou kulturu bakterií, toto kvašení způsobujících. Následně pak v roce 1890 zavedeno cílené použití zmíněných bakteriálních kultur ke zpracování (fermentaci) některých potravin (KÖNIG H. et al., 2009), kteréžto dnes vzletně označujeme inokulací, týkající se však použití i jiných, avšak vždy selektovaných „ušlechtilých“ kmenů mikroorganismů, a to například i kvasinek. Nebyl by člověk člověkem, aby nevyužil ke svému prospěchu nejmodernějších technologií a nejnovějších poznatků. Proto i sem patří zmínka o možnostech genetických zásahů,
které jsou a budou
využívány pro úpravu vlastností
mikroorganismů. Zde však vyvstávají otázky na etické a filosofické úrovni. Je však všeobecně známo, že fermentované potraviny či poživatiny provázejí člověka od úsvitu civilizací. Dnes naprosto běžné potraviny, jako jogurt, kefír, ušlechtilé sýry, kysané zelí či jiná zelenina jsou toho jasným důkazem. Mléčné bakterie, bakterie mléčného kvašení, které se těchto fermentací účastní, budou v následujícím textu dominantní skupinou.
8
2.2 Bakterie mléčného kvašení 2.2.1 Bakteriální buňka Obecně se jedná o prokaryotické organismy, jejichž specifikem je rozměr v řádu desetin µm, nepřítomnost jaderné membrány (z obvyklého cytologicko–morfologického
hlediska nemají jádro), stavba buněčné stěny (složená z peptidoglykanů). Bakterie se vyskytují ve formě tyčinek (nás se týká skupina nesporulujících, tj. Bacterium) či koků (diplokoky, tetrakoky, sarciny, streptokoky atd.). Enzymatické procesy často probíhají v tzv. periplasmatickém prostoru mezi cytoplasmatickou membránou, obalující protoplast, a buněčnou stěnou. Buněčná stěna je důležitá i pro základní rozdělení na Gram–negativní (G-) bakterie (též Gracilicutes) a Gram–pozitivní (G+) bakterie (též Firmicutes). Toto rozdělení známe již z 19. století, kdy v roce 1884 Christian Gram při pokusech s barvením buněčných stěn a následným udržením barviva buněčnou stěnou, která též podmiňuje tvar buňky, odlišil již zmíněné dvě skupiny bakterií (TŮMA, 2010). A právě skupina Gram-pozitivních bude středem našeho zájmu, neboť ve víně a moštu nalezneme právě tyto bakterie.
1
2
3
4
Obr. 2 Ukázka forem některých LAB nalezených ve víně: 1. Oenococcus oeni; 2. Lactobacillus casei; 3. Lactobacillus brevis; 4. Pediococcus cerevisiae (zdroj RADLER, 1972 in JACKSON, 2008)
9
2.2.2 Rozmnožování bakterií Mezi nejdůležitější projevy živých organismů patří rozmnožování, na němž je závislé pokračování jakéhokoliv druhu. Bakterie mléčného kvašení nejsou, a ani nemohou být, v tomto směru od ostatních organismů odlišné. Čím se však od některých organismů liší, je způsob jejich rozmnožování, byť mezi mikroorganismy způsob vcelku běžný. V případě bakterií se jedná o dělení, kdy z jedné mateřské buňky vznikají dvě buňky dceřinné. Vlastnímu dělení mateřské buňky předchází zdvojení kruhové bakteriální DNA, její přesun do míst budoucích dceřiných buněk, společně s přesunem dalších subcelulárních struktur. Současně probíhá syntéza látek ze kterých se skládá buněčná stěna. Buňka se zhruba v polovině zužuje a vytváří se přepážka, po jejím dokončení se dceřinné buňky oddělují (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Velmi stručné, leč informativní účel naplňující. 2.2.3 Zařazení bakterií do systému Rozdělení všech organismů na Zemi do uceleného sytému prošlo mnoha fázemi a bude se jistě stále vyvíjet. Základní rozdělení, dnes stále aktuálně používané, navrhl Norman Pace v roce 1997, jedná se o tzv. Trojdoménový strom. Ten rozděluje všechny živé organismy do tří hlavních skupin: Archaea, Bacteria a Eucarya (ZÁHORA, 2010). Je zřejmé, kam bakterie mléčného kvašení patří. Bakterie mléčného kvašení nalezneme jak v moštu tak i ve víně. Samozřejmě se zde neobjevuje pouze jediný druh těchto bakterií, z čehož plyne potřeba posoudit, které konkrétní zástupce ve zkoumané materii nalézáme. K jejich rozlišení se používají morfologické, dnes moderně genetické, ale i biochemické vlastnosti typické pro ten který rod či druh. Důmyslnější systematické členění směřující k bakteriím mléčného kvašení navrhuje například KÖNIG (2009): LAB jsou zde systematicky zařazeny do jednoho řádu, 6 čeledí a 32 rodů, přičemž ve víně či moštu nalezneme pouze 22 druhů rozdělených do pěti rodů (viz Tab. 1). Pohled jiného autora: bakterie zodpovědné za průběh malolaktické fermentace je možné dále rozlišit do tří skupin: striktně homofermentativní, které nebyly ve víně dosud zaznamenány, striktně heterofermentativní a fakultativně heterofermentativní.
10
Ze systematického hlediska pocházejí bakterie mléčného kvašení, na které se zaměřujeme, ze dvou čeledí, a to Lactobacillaceae (rody Lactobacillus a Pediococcus) a Leuconostocaceae (rody Leuconostoc a Oenococcus) (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). I když různí autoři uvádějí ne zcela shodné taxony či jejich zástupce, což je ovšem běžný systematický symptom, právě výše zmíněné čtyři rody a druhy v nich zastoupené se u mnoha autorů zabývajících se malolaktickou fermentací objevují shodně téměř bezvýhradně. Důmyslnější rozlišení LAB již není cílem této práce.
Tab. 1 Nástin rozdělení LAB do systému (zdroj KÖNIG, 2009)
Řád
Čeleď
Nejběžnější rody
Příklad druhu nalezeného v moštu či ve víně
Lactobacillales
Lactobacillaceae
Lactobacillus
Lb. plantarum
Pediococcus
P. damnosus
Aerococcaceae
Aerococcus
Carnobacteriaceae
Carnobacterium
Enterococcaceae
Enterococcus Tetragenococcus Vagococcus
Leuconostocacea
Streptococcaceae
Leuconostoc
Lc. mesenteroides
Oenococcus
O. oeni
Weissella
W. paramesenteroides
Streptococcus Lactococcus
V kategorii druhů nalezených v moštu či ve víně nalezneme druh zvláště vhodný k účelům, jimiž se v této práci zaobíráme. Je to již zmíněný druh Oenococcus oeni, patřící dříve do rodu Leuconostoc, který DICKS at al., 1995 navrhli zařadit do vlastního rodu Oenococcus, a to právě pro specifické vlastnosti, odlišující jej od ostatních druhů bakterií mléčného kvašení.
11
2.2.4 Oenococcus oeni Podrobnější popis si však zasluhuje pro průběh malolaktické fermentace zjevně nejlépe uzpůsobený druh Oenococcus oeni, dříve označovaný jako Leuconostoc oenos. Dalším a doposud posledním zástupcem téhož rodu je uváděn druh Oenococcus kitaharae (ENDO and OKADA, 2006 in KÖNIG H. et al., 2009), který se neprojevuje vlastnostmi vhodnými pro MLF.
Obr. 3 Oenococcus oeni, měřítko 5µm v levém horním rohu snímku (zdroj CARRASCOSA et al., 2011)
Jak již bylo zmíněno, O. oeni patří do skupiny Gram-pozitivních bakterií. Z rodového názvu plyne, že se vyskytuje v kokální formě, buňky mají čočkovitý či kulovitý tvar a tvoří páry nebo kratší řetízky (přičemž někteří autoři uvádějí i formu tyčinkovou, někteří i výskyt samostatných buněk). Průměr buněčného těla je 0,5-0,7µm a délka 0,7-1,2µm (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Dokáže se přizpůsobit prostředí s pH nižším než 3,5 (JACKSON, 2008) při optimu pH 4,8. Teplotní optimum pro růst O. oeni se nachází v rozmezí 20-30 °C (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006), přičemž se dokáže vyrovnat i s 10% obsahem alkoholu (MORENO-ARRIBAS et al., 2009). Z hlediska metabolismu se jedná o druh heterofermentativní, mikroaerofilní, produktem fermentace glukósy je kyselina mléčná, CO2, kyselina octová a ethanol; přítomnou kyselinu jablečnou O. oeni mění na kyselinu mléčnou a opět CO2 (MORENOARRIBAS et al., 2009).
12
2.2.5 Metabolismus LAB Metabolismus, další z projevů živých soustav, je zodpovědný za obstarávání látek, bez kterých se konkrétní organismus neobejde. První variantou zmíněného je degradace, rozklad látek složitějších na jednodušší, k čemuž slouží a napomáhá řada enzymů. Jedná se o procesy katabolické, provázené ziskem energie. Opačným případem jsou procesy anabolické, kdy naopak dochází k syntézám látek složitějších z jednodušších, přítomných přímo v prostředí, či se vyskytujících jako meziprodukty biochemických reakcí. Jelikož bakterie mléčného kvašení jsou organismy chemoorganotrofní, získávají energii díky oxidaci přítomných látek, a ta bývá doprovázena uvolňováním jak elektronegativních tak elektropozitivních částic. Tyto částice jsou pak v rozbíhajícím se řetězci oxidavně-redukčních reakcí přijímány specifickými akceptory. Spoluúčast kyslíku v těchto reakcích nám, krom jiného, dává další možnost k detailnějšímu rozlišení bakterií mléčného kvašení, a to na striktně anaerobní, fakultativně anaerobní, mikroaerofilní a aerotolerantní. Jelikož předmětem našeho zájmu je malolaktická fermentace, je na tomto místě třeba poukázat na její anaerobní charakter (RIBÉREAUGAYON et al., 2006; JACKSON, 2008; MORENO-ARRIBAS et al., 2009; KÖNIG, 2009).
Tab. 2: Příklad substrátů a jejich postfermentační produktů při metabolismu LAB (zdroj JACSKON, 2008)
Výchozí látka Organická kyselina
Produkt Citrónová
K. mléčná, k. octová, CO2, acetoin, diacetyl
L-jablečná
K. mléčná, CO2, k. jantarová, k. octová
Vinná
K. mléčná, k. octová, CO2, k. jantarová
Glukósa
K. mléčná, ethanol, k. octová, CO2
Fruktósa
K. mléčná, ethanol, k. octová, CO2, mannitol
Arabinósa
K. mléčná, k. octová
Aminokyselina
Histidin
Histamin, CO2
Polyol
Glycerol
1,3-propandiol
Cukr
13
3 Cesta k malolaktické fermentaci Na povrchu hroznů během sběru a následně v moštu se bakterií nevyskytuje velké množství. Ke zvyšování počtu bakterií dochází během prvních dní fermentace, a to až k úrovni 104⋅ml-1 buněčných těl. O. oeni se však nevyskytuje na povrchu hroznů v takové míře jako zástupci rodů Lactobacillus, Pediococcus a Leuconostoc (COSTELO et al., 1983 in JACKSON 2008). To, že s postupujícím alkoholovým kvašením počet bakterií klesá až na úroveň 102⋅ml-1, může souviset například s vyšší citlivostí některých kmenů bakterií na přítomnost ethanolu a nízké pH. Po přechodné - lag fázi, která koresponduje s doznívajícím primárním (alkoholovým) kvašením, se počet buněčných těl LAB zvyšuje až na 106-108⋅ml-1, tedy do okamžiku, kdy začíná vlastní malolaktická fermentace (MORENO-ARRIBAS et al., 2009). Malolaktická
fermentace
však
nemusí
být
způsobena
pouze
bakteriemi
pocházejícími z hroznů. Může být způsobena i kontaminací moštu bakteriemi vyskytujícími se na zařízeních a vybavení vinařského sklepa. Odpovědi, nakolik je coby zdroj LAB důležitá surovina - hrozny, či kontaminace ze zařízení a vybavení sklepa, se můžeme v brzké době dočkat (JACKSON, 2008). Pro vinaře, kteří malolaktickou fermentaci ve svých vínech vyžadují, se místo očekávaní odpovědi na výše zmíněnou otázku nabízí, dnes již běžné řešení, a to selektované kmeny LAB zakoupit a do vznikajícího vína přidat. Mimochodem počet vinařů s touto praxí přibývá, a netýká se jen výrobců vín červených. Začátek, průběh a zdárné ukončení malolaktické fermentace tedy ovlivňují konkrétní kmeny LAB, ať již spontánně přítomné či dodané (inokulace), ale taktéž faktory související s kvalitou suroviny tj.: pH, celková acidita, obsah kyseliny jablečné, napadení plísněmi atd. Dalšími důležitými podmínkami jsou odpovídající teplota, množství SO2 a doba, po kterou jsou matoliny v kontaktu s vínem (JACKSON, 2008).
14
3.1 Vliv pH na malolaktickou fermentaci Počáteční pH ovlivňuje nejen okamžik započetí malolaktické fermentace, ale také druh LAB, který bude v tomto procesu vůdčím. V případě, že bude pH nižší než 3,5, se této role ujme Oenococcus oeni, zatímco při hodnotě pH nad zmíněnou hranici, budou dominovat spíše druhy rodů Lactobacillus a Pediococcus (COSTELO et al., 1983 in JACKSON, 2008). Je však zajímavé, že v některých případech, při nízkém obsahu SO2 a ve spojení s alkoholovým kvašením, může iniciovat MLF O. oeni (můžeme uvažovat, že jedním z faktorů, umožňujícím v takové situaci bakterii druhu O. oeni spustit MLF, je její výraznější tolerance vůči zvýšené hladině ethanolu). Zvolna končící primární fermentace je provázena lag–fází růstu populace bakterií mléčného kvašení; je to fáze „klidová“ (obdobnou fází prochází i populační křivka kvasinek Saccharomyces cerevisiae při alkoholovém kvašení) po které následuje až exponenciální populační růst. Ovšem lag–fáze MLF může mít různé trvání, někdy až v řádu měsíců, kterýžto fakt souvisí také se způsobem, jímž je malolaktická fermentace započata, tedy je-li spontánní, či je iniciována inokulací ušlechtilými kmeny bakterií mléčného kvašení. Vliv pH na průběh malolaktické fermentace byl již nastíněn. Existují však další důsledky související s tímto faktorem. Některé se jeví spíše jako nepřímé, což může být zvyšující se sensitivita buněčných membrán na alkohol při pH nižším a podobně i ovlivnění skladby mastných kyselin v buněčných membránách (DRICI-CACHON et al., 1996 in JACKSON, 2008). Také pro dekarboxylaci kyseliny jablečné je příznivější pH pod 3,5. Naopak při vyšší úrovni pH, dochází u bakterií mléčného kvašení ke zefektivnění metabolismu cukrů, nebo též ke zvýšení produkce kyseliny octové. Takové podmínky jsou také spoluodpovědné za možnou degradaci kyseliny vinné (jsme tak opět u preference vyššího pH jinými druhy LAB, zde tedy např. z rodu Lactobacillus) a následného výrazného vzestupu pH vína a jeho sklonu ke „zvrhnutí“.
15
3.2 Vliv teploty na malolaktickou fermentaci Jelikož prakticky každý proces v biosféře má svá teplotní optima (potažmo minima a maxima), není malolaktická fermentace rozhodně výjimkou. Platí tedy, že dalším důležitým faktorem MLF ovlivňujícím je teplota. A jakéže je optimální teplotní rozmezí pro, řekněme zdárný průběh malolaktické fermentace? Je třeba začít s konstatováním, že teplota přímo ovlivňuje bakteriální procesy. Co se týče dekarboxylace kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou, je za teplotní optimum považováno rozmezí 20-30 °C. Pokud materie nabývá hodnot mimo tento rámec, průběh malolaktické fermentace zaznamenatelně slábne a při teplotě pod 10 °C ustává (pokud však již malolaktická fermentace nastala, může probíhat i při takto snížené teplotě, samozřejmě s vyššími nároky na dobu průběhu MLF). Je-li teplota naopak vyšší výrazně slábne populace druhu Oenococcus oeni, ovšem hrozí, že bude nahrazena do té doby méně aktivnímy druhy rodů Lactobacillus a Pediococcus. Jak je všeobecně známo další snižování či zvyšování teploty není pro běžné organismy slučitelné se životem (praskání buněčných membrán i stěn v důsledku tvorby ledových krystalů při teplotách blížících se bodu mrazu, nebo naopak denaturace bílkovin při teplotách nad 40 °C, s přihlédnutím k výjimkám, které se však netýkají bakteriálních procesů zde zmiňovaných). Bakterie mléčného kvašení se z tohoto ranku nevymykají, proto i malolaktická fermentace při běžných podmínkách nebude mimo výše specifikované teplotní rozmezí probíhat.
3.3 Vliv macerace na malolaktickou fermentaci Nepatrnou zmínkou jsme zavadili i o dobu macerace, tedy délku kontaktu matolin s rodícím se vínem. Delší naležení zvyšuje časnost i rychlost malolaktické fermentace. Údajně je za tímto jevem možné hledat účinek fenolických látek, což by v souvislosti s obecně vyšším pH a dalšími faktory vysvětlovalo, proč se malolaktická fermentace objevuje a snadněji probíhá ve vínech červených (JACKSON, 2008).
16
3.4 Vliv SO2 na malolaktickou fermentaci Dalším z faktorů limitujících průběh malolaktické fermentace je přítomnost SO2 s přihlédnutím k již zmiňovanému pH, kdy nižší pH zesiluje účinek SO2. Ve víně se oxid siřičitý vyskytuje ve volné či vázané formě, a to ve vzájemné korelaci, přičemž účinnost vykazuje molekulární forma volného SO2. U vázané formy existuje v závislosti na disociační konstantě možnost vyvázání. Nejsilněji je SO2 vázán na acetaldehyd (ethanal), který představuje hlavní složku SO2 ve vázané podobě (BAROŇ, 2011). Kromě účinků atioxidačních fungicidních, má SO2 také bakteriostatické až baktericidní schopnosti. Poslední dva z účinků se tak přímo týkají malolaktické fermentace. Principem baktericidního účinku je difúze molekulárního SO2 skrze cytoplasmatickou membránu do buňky, kde při obecně vyšším pH cytoplasmy disociuje a reaguje s biologicky aktivními sloučeninami (enzymy, vitamíny atd.), následkem čehož buňka zastavuje růst a odumírá (ROMANO and SUZZI, 1992 in RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Protože bakterie mléčného kvašení nás provázejí prakticky všemi kapitolami této práce a máme již představu o jejich různorodosti, stojí za zmínku výsledky zjištění Lafon-Lafourcada a Peynauda z roku 1974, že kokální formy LAB jsou vůči SO2 méně odolné než laktobacily (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006), což znevýhodňuje ceněný O. oeni.
3.5 Vliv ethanolu na malolaktickou fermentaci Bakterie mléčného kvašení jsou obecně na přítomnost ethanolu citlivé, kterýžto fakt je opět podmíněn konkrétním druhem bakterie, podobně, jako tomu je u sensitivity LAB na přítomnost SO2 (viz kapitolu 3.4). Ethanol inhibuje bakterie při 8-10 obj.%. Má se za to, že bakterie kultivované v laboratorních podmínkách jsou méně odolné vůči obsahu alkoholu, než ve víně se přirozeně vyvíjející, které se podmínkám svého životního prostředí přizpůsobují (například zvýšenou syntézou fosfolipidů a jejich inkorporací do plasmatické membrány (TEIXEIRA et al., 2002 in JACKSON, 2008)). Zajímavostí je, že i z vín fortifikovaných, kde obsah alkoholu činí 16-20 %, byly isolovány kmeny bakterií Lactobacillus fructivorans, L. brevis a L. hilgardii. Čili ani vína s vyšším obsahem alkoholu než je běžné nejsou plně chráněna před LAB.
17
4 Kvalitativní změny během malolaktické fermentace Po mnoha letech výzkumů začala být MLF vnímána s menšími rozpaky. Spory se týkaly ovlivnění kvality vína, ať již z pozitivního či negativního hlediska. Pro doplnění lze též uvézt, že vína, pro která by MLF znamenala kvalitativní zlepšení jsou ta vína, kde je její výskyt komplikovaný a podmínky ve vínech pro malolaktickou fermentaci vhodné se vesměs nacházejí ve vínech, kde je MLF víceméně nežádoucí. Vyvstává tedy otázka co vlastně a jak MLF ovlivňuje. Nejdůležitějším se jeví zvýšení pH a tím pádem snížení vnímatelné kyselosti vín. K tomuto efektu dochází díky odbourání v chuti drsné dikarboxylové kyseliny jablečné na monokarboxylovou kyselinu mléčnou, jejíž chuťový dojem je příjemnější a méně agresivní. I zde se ovšem názory vinařů na pozitivní vliv tohoto procesu liší, a to nejen pro subjektivní posuzování toho kterého vína, ale také vzhledem k oblasti, kde byla výchozí surovina pro výrobu vína vyprodukována. V severnějších oblastech je produkována réva, s mnohdy výrazně vyšším obsahem organických kyselin, než je tomu v oblastech jižních, z čehož je zřejmé, s přihlédnutím k vlivu MLF na kvalitu vína, kde nalezneme více zastánců či odpůrců biologického odbourávání organických kyselin, zvláště pak u vín červených. Jak uvádí KNOLL (2011), ze zmíněného také vyplývá, že v oblastech s teplejším klimatem bude u MLF více oceňováno příznivé ovlivnění chuti vína, nežli zvyšování pH, jako je tomu v regionech chladnějších. Kvalitativní změny vína během malolaktické fermentace jsou provázeny degradací, metabolismem jedněch složek za vzniku jiných, enologicky odlišně účinkujících látek, které mohou být vínu ku prospěchu či mu mohou uškodit. Je třeba upozornit, že na kvalitu vína má vliv nejen samotná přeměna látek, ale i míra koncentrace produktů touto přeměnou vzniklých. Vracíme se tak znovu k bakteriím mléčného kvašení a k jejich metabolismu, stručně popsanému v kapitole 2.2.5. Metabolické přeměny organických kyselin budou vzhledem k zásadnímu významu pro malolaktickou fermentaci popsány v kapitole 5 Organické kyseliny.
18
4.1 Metabolismus cukrů Zdrojem energie pro bakterie mléčného kvašení je metabolismus cukrů. Odlišnosti, které nalezneme při těchto procesech poukazují na další rozdíly mezi bakteriemi mléčného kvašení: zde homofermentativní vs. heterofermentativní. 4.1.1 Metabolismus hexós Bakterie mléčného kvašení zařazené do skupiny homofermentativních bakterií získávají energii díky transformaci cukrů (hexós), nejčastěji glukósy (tzv. Embden-Meyerhof pathway - EMP). Metabolická dráha (glykolýza) začíná u hexósy a prochází přes několik meziproduktů až ke kyselině pyrohroznové (pyruvát), odkud v případě organismů aerobních nastupuje fáze Krebsova (citrátového) cyklu, v případě bakterií mléčného kvašení (anaerobní organismy) dochází k redukci pyruvátu na výslednou kyselinu mléčnou (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Na rozdíl od homofermentativních bakterií, heterofermentativní bakterie získávají energii (stále mluvíme o metabolismus hexós) díky jinému metabolickému schématu, na jehož dráze se objevují pentósy a výsledným produktem je sice kyselina mléčná, jako u homofermentativních, ale i ethanol, kyselina octová (acetát) a CO2 (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Zásadním okamžikem na této metabolické dráze je rozštěpení xyluloso 5-fosfátu na glyceraldehyd-3-fosfát (odtud jako u homofermentativních vede cesta ke kyselině mléčné) a acetylfosfát, po kterém následují s přihlédnutím ke konkrétním podmínkám dvě možnosti. Může následovat jeho redukce na ethanal a následná na ethanol, nebo v aerobních podmínkách přeměna na kyselinu octovou (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Posledně zmiňované variantě se všichni vinaři snaží předejít, neboť kyselina octová, která je především produktem acetobakterií (např. rodu Acetobacter), je volatilní a její zvýšený obsah ve víně je nežádoucí (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006).
19
4.1.2 Metabolismus pentós Jelikož se v prostředí (moštu, víně), ve kterém bakterie mléčného kvašení žijí, vyskytují i pětiuhlíkaté cukry (pentósy, například arabinósa, ribósa, xylósa), jsou i tyto bakteriemi, ať již homofermentativními či heterofermentativními, metabolisovány. Pentósy jsou v prvé řadě fosforylovány a přes několik meziproduktů se na této metabolické dráze objevuje nám již známá látka xyluloso 5-fosfát. Od tohoto meziproduktu
je
metabolická
dráha
totožná
s metabolismem
hexós
heterofermentativními bakteriemi (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). 4.1.3 Metabolismus polysacharidů Bakterie mléčného kvašení jsou též schopny hydrolyzovat některé polysacharidy objevující se ve víně po proběhnuvší alkoholové fermentaci, coby pozůstatek činnosti kvasinek. K tomuto účelu jsou vybaveny α- a β- glukosidásami, β. Polysacharidy tak slouží jako zdroj uhlíku (GUILLOUX-BENATIER et al., 2000 in . MORENO-ARRIBAS et al., 2009; GUILLOUX-BENATIER et al., 1993 in JACKSON, 2008).
4.2 Metabolismus aminokyselin Bakterie mléčného kvašení produkují také aminy, a to dekarboxylací aminokyselin. Mnohé biogenní aminy mají nežádoucí účinky na lidský organismus, zvláště pak u lidí se zvýšenou citlivostí. Tak je tomu například u histidinu (viz Obr. xxxxx), který ačkoli málo toxický, doplňuje toxicitu ostatních aminů (tyramin, putrescin, aj.) (RIBÉREAUGAYON et al., 2006). Bylo zjištěno, že enzym (histidin dekarboxylása) účastnící dekarboxylace histidinu, zůstává ve víně mnohem déle než životaschopné bakterie, což vede ke zvyšování hladiny vzniklého histaminu (COTON et al., 1998 in JACKSON, 2008), který má vasokonstrikční účinky, i po malolaktické fermentaci. Hladina biogenních amninů ve víně však nebývá natolik vysoká in (RADLER and FÄTH, 1991 in JACKSON, 2008). Přesto se ve víně biogenní aminy objevují po malolaktické fermentaci velmi často, kterýžto fakt napovídá, že v červených vínech se aminy vyskytují více, než ve vínech bílých. Nutno také podotknout, že na produkci aminů má vliv konkrétní bakteriální kmen.
20
Metabolismus některých aminokyselin, může mít také negativní vliv na vůni vína. Bylo zjištěno, že produkce látek způsobujících tzv. myšinu, je úzce spjata s metabolismem aminokyselin, specielně ornitinu a lysinu (COSTELLO et al., 2001; SWIEGERS et al., 2005 in LERM, 2010). Také metabolismus cysteinu a methioninu může být cestou k negativnímu ovlivnění vůně vína. Při této reakci vznikají látky obsahující síru, např. methanthiol, který je typický vůní vařené kapusty či až fekálním zápachem. Podobným principem jako methanthiol z methioninu, vznikají mnohé látky detekované ve víně, které díky prahu vnímatelnosti významně ovlivňují aroma a chuť vína (MORENO-ARRIBAS et al., 2009). Další z látek vznikajících při metabolismu methioninu, konkrétně 3-(methylsulfanyl) propionová kyselina bývá oceňována pro svou komplexotvornost a čokoládové aroma (PRIPIS-NICOLAU et al., 2004 in KNOLL, 2011). Pro zajímavost uveďme na závěr metabolismus argininu, kterého jsou schopné i komerčně užívané kmeny LAB. Na této metabolické dráze se spoluúčastní tři enzymy, dochází k zisku energie, ale meziprodukty(citrulin a karbamylfosfát) mohou při reakci s ethanolem vytvářet ethylkarbamát, který je karcinogenem (LIU et al., 1994, 1995; ARENA & MANCA DE NADRA, 2002; VOLSCHENK et al., 2006; ARAQUE et al., 2009 in LERM, 2010).
histidin
histidin dekarboxylása
histamin
Obr. 4 Přeměna histidinu na histamin během malolaktické fermentace (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
21
4.3 Degradace glycerolu Glycerol je jednou z nejdůležitějších složek vína, a to vzhledem k běžnému obsahu (tj. 5-7 g⋅l-1), a také pro svůj významný vliv na organoleptické vlastnosti vína. Je tak zřejmé, že degradace glycerolu bude mít negativní dopad na kvalitu vína, jak z výše uvedeného plyne snížením jeho obsahu a dále díky látkám během tohoto procesu vznikajícím. Účinkem glyceroldehydratásy je při tomto procesu glycerol přeměněn na β-hydroxypropionaldehyd, který prekurzorem akroleinu. Vzájemnou reakcí akroleinu, či jeho prekurzoru s taniny, nabývá víno na hořkosti. Další možností degradace glycerolu je spojeným účinkem glyceroldehydratásy a dihydroxyacetonkinásy vznikající dihydroxyacetonfosfát, přeměněný na glyceraldehyd-3-fosfát, následně na pyruvát a odtud až kyselina octová a látky na bázi acetoinu. Kyselina mléčná vzniká z pyruvátu pokud je k dispozici koenzym NADH. Znehodnocení vína degradací glycerolu nepatří, podobně jako nemoc tourne (zvrhnutí vína), k příliš rozšířeným (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006).
GLYCEROL
glycerol dehydratása dihydroxyaceton kinása
glycerol dehydratasa NAD hydroxy-3-propionaldehyd propan-1,3-diol-dehydrogenása
dihydroxyaceton-P NADH, H+
Akrolein glyceraldehyd-3P NAD
NADH, H+ propan-1,3-diol NAD
NADH, H+ kyselina pyrohroznová NADH, H+ NAD kyselina mléčná
Obr. 5 Možnosti degradace glycerolu během MLF (zdroj RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
22
4.4 Syntéza polysacharidů Dalším zajímavým projevem metabolismu bakterií mléčného kvašení je syntéza exocelulárních (mimobuněčných) polysacharidů. Známé jsou například homopolymery glukósy (dextran, glukan) či fruktósy (levan). Dochází-li k produkci těchto polysacharidů, zvyšuje se viskosita a víno „vláčkovatí“. Bylo zjištěno, že ve víně se zvyšující se viskositou vzrůstá symbiosa mezi LAB produkujícími polysacharidy a acetobakteriemi (LUHTI, 1957 in RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Díky výzkumům, které probíhaly po 80. letech minulého století, kdy byla tato nemoc na vzestupu, bylo zjištěno, že významnou roli na zde hraje bakterie Pediococcus damnosus, aniž by však byl vyloučen vliv i jiných druhů bakterií. Pokud se tato nemoc objeví, je nutné veškerá zařízení desinfikovat, a to i přesto, že se organolepticky jinak neprojevuje (RIBÉREAUGAYON et al., 2006). Výčet dalších organických látek, které ovlivňují kvalitu vína, poznamenaných činností bakterií mléčného kvašení by byl velmi dlouhý. Zůstaňme však u poznání, že LAB jsou schopny vlastnosti vína významně ovlivnit ať již pozitivně či negativně.
23
5 Organické kyseliny Organismy, nejinak bakterie mléčného kvašení, pro svůj život nezbytně potřebují konkrétní chemické látky, jejichž obsah (v našem případě v moštu či víně) je tím pádem dalším zásadním předpokladem pro průběh všech procesů způsobených a ovlivněných mikroorganismy, mezi které patří především alkoholového kvašení a samozřejmě i hlavní předmět našeho zájmu, tím je znovu zmíněná malolaktická fermentace. Které konkrétní chemické látky budou bakteriemi mléčného kvašení během procesu malolaktické fermentace využity, záleží i na konkrétním životaschopném kmeni, fermentace se účastnících bakterií, ne nepodobně, jako při konkrétních teplotách či pH fermentované materie (moštu, vína). Název pro druhotnou malolaktickou (jablečnomléčnou) fermentaci, nenechá nikoho na pochybách o tom, které z organických kyselin zde hrají zásadní roli, první coby látka fermentovaná (dekarboxylovaná), druhá pak jako výsledný produkt. Jsou tu však i další organické kyseliny, které mohou být bakteriemi mléčného kvašení využity. Stejně jako anorganické jsou i organické kyseliny charakteristické svojí schopností (větší u silnějších kyselin, menší u slabších kyselin) v roztoku disociovat, tj. rozložit se na částice záporně nabité a na volné, kladně nabité vodíkové ionty. Jelikož organické kyseliny tvoří karboxylová skupina (—COOH) a uhlovodíkový zbytek (—R), lze reaktivní charakter organických kyselin vyjádřit následujícím vztahem:
R
COOH
R
karboxylová kyselina
COO-
karboxylový anion
H+
+
vodíkový iont .
Obr. 6 Reaktivní povaha karboxylové skupiny organických kyselin (zdroj VELÍŠEK, 2009)
Mluvíme-li o organických kyselinách obsažených ve vínech, musíme zdůraznit, že obrovskou měrou přispívají k jejich stabilitě a organoleptickým vlastnostem, zvláště pak u bílých vín, u kterých je vyšší obsah organických kyselin predispozicí k dlouhověkosti, současně také zvyšují i stabilitu mikrobiální. Červená vína jsou stabilní při vyšším pH, a to díky obsahu fenolických látek, které se podílejí jak na stabilitě, tak i na podpoře dlouhověkého potenciálu těchto vín (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006).
24
Významnou měrou organické kyseliny ovlivňují kvalitu budoucího vína; jejich obsah a vzájemný poměr v moštu je také vodítkem pro aplikaci konkrétních postupů při jeho výrobě. O množství jednotlivých organických kyselin v hroznech (následně v moštu) spolurozhodují i klimatické podmínky, specielně pak teplota, v době dozrávání. Dlouhá období sucha či naopak vysoká vlhkost mají za následek nižší obsah kyselin v hroznech (PAVLOUŠEK, 2011). Blíže tedy k nejdůležitějším mono-, di- až tri- karboxylovým organickým kyselinám vyskytujícím se v moštu a víně. Na prvním místě je třeba zmínit kyselinu vinnou pro její význam i název samotný.
5.1 Kyselina vinná Kyselina vinná (angl. tartaric acid) není v přírodě natolik rozšířená, je však specifická svojí přítomností v hroznech révy vinné (moštu, víně), odtud také získala své české jméno. Jedná se o kyselinu dikarboxylovou (kyselina 2,3-dihydroxybutandiová) se dvěma asymetrickými uhlíky, díky nimž může vytvářet několik isomerních forem. Pro výrobu vína má kyselina vinná zásadní význam. V moštech z hroznů produkovaných v severních vinařských oblastech dosahuje její koncentrace až 6 g⋅l-1, běžná koncentrace kyseliny vinné v moštu je zhruba v rozmezí 0,6-2,5 g⋅l-1. Z organických kyselin obsažených v moštu a víně je kyselinou nejsilnější (pKa 3,01) (REGMI et al., 2011). Přírodní kyselina vinná je používána také v dalších sférách lidské činnosti, a to například v potravinářství, farmacii, ale i v průmyslu.
COOH OH
C
H
H
C
OH
COOH L (+)-vinná kyselina Obr. 7 Kyselina vinná (zdroj VELÍŠEK, 2009)
25
Kyselina vinná bývá syntetizována listy i nezralými zelenými plody révy. TOMÁŠEK (2005) píše: „Kyselina vinná se vytváří z glukosy, která při této reakci přechází na kyselinu keto-5-glukonovou a na aldehyd kyseliny vinné, který pak oxiduje na kyselinu vinnou a glykolovou (DITTRICH, 1977).“. Změna jejího obsahu bývá nevelká, je však ovlivněna dostupností draslíku, jehož vysoký příjem snižuje obsah kyseliny vinné; nízký příjem draslíku naopak její obsah zvyšuje za snižování pH (PAVLOUŠEK, 2011). Část množství kyseliny vinné je vázána s draslíkem (viz výše) a vápníkem (při vysokých teplotách v době dozrávání) ve formě vinanů. V moštech dobře vyzrálých ročníků může být zastoupení kyseliny vinné 65-70 % všech titrovatelných kyselin, ve slabších ročnících klesá její podíl ke 35-40 %. Při velmi vysokém obsahu kyselin (nad 12 g⋅l-1) může být k jeho snížení použito odkyselování, při kterém část kyseliny vinné vypadne pomocí uhličitanu vápenatého (CaCO3) ve formě vinanu vápenatého, což ovšem přináší i jistá rizika. Pozor na zákonná ustanovení, která při odkyselování již hotového vína povoluje snížení obsahu kyselin pouze o 1 g⋅l-1. (STEIDL, 2010). 5.1.1 Degradace kyseliny vinné Bakterie mléčného kvašení jsou schopny metabolizovat i kyselinu vinnou. Není to příliš častý jev (specielně v našich podmínkách), ale jeho následky na kvalitu vína jsou fatální. Jde totiž ztrátu nejdůležitější kyseliny ve víně a s tím spojený rapidní nárůst pH a celkové acidity (snížení koncentrace kyseliny vinné) za zvýšení volatilní acidity (koncentrace kyseliny octové), resp. kyseliny mléčné. Dokonce již Pasteur (viz kapitolu 2.1) tento problém popsal a věren svým kvalitám mu dává i jméno: nemoc tourne; u nás zvrhnutí vína. Zodpovědnost za tuto nemoc připisují vědci některým kmenům druhu Lactobacillu brevis a L. plantarum. Radler a Yanissis (1972) sestrojili pro každý ze zmíněných druhů bakterií vlastní metabolickou dráhu (viz Obr. 8), na jedné z nich jsou výsledným produktem kyselina mléčná s kyselinou octovou a CO2, produkty druhé jsou kyselina jantarová, opět kyselina octová a CO2. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006).
26
Varianta I
2x kyselina vinná H 2O 2x kyselina oxaloctová 2x CO2 2x kyselina pyrohroznová NAD
NADH2
NADH2 H 2O
1x kyselina octová + 1x CO2
NAD
1x kyselina mléčná
Varianta II
3x kyselina vinná
H 2O 2x kyselina pyrohroznová H 2O 2x CO2
3x kyselina oxaloctová NADH2
NAD NADH2
NAD 2x CO2 1x kyselina jablečná
2x kyselina octová
H 2O 1x kyselina fumarová NADH2 NAD 1x kyselina jantarová
Obr. 8 Varianty degradace kyseliny vinné (zdroj RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
27
5.2 Kyselina jablečná Kyselina jablečná (angl. malic acid) je, na rozdíl od předchozí, v přírodě z organických kyselin vůbec nejrozšířenější. Je odpovědná například za kyselou chuť nezralých jablek (odtud název) a jiného ovoce. Opět se jedná o kyselinu dikarboxylovou (kyselina hydroxybutandiová) s jedním asymetrickým uhlíkem (L a D forma optických isomerů). Z kyselin obsažených v moštu a víně má také zásadní význam. V nezralých hroznech může sice dosahovat koncentrace až 25 g⋅l-1, ale během zaměkání a vybarvování klesá úroveň až na polovinu a pokles pokračuje do okamžiku sběru (s přihlédnutím k průběhu počasí v konkrétním roce), a to na jedné straně z důvodu zvětšování objemu bobulí révy vinné, na straně druhé díky jejím spotřebě coby zdroje energie (na rozdíl od jiných rostlin schopných vytvářet škrob, réva vinná ukládá energii právě do kyseliny jablečné). Proto tedy průměrná koncentrace kyseliny jablečné v moštu dosahuje 2-5 g⋅l-1. Klimatické podmínky mají samozřejmě vliv i na vzájemný poměr mezi kyselinou jablečnou a kyselinou vinnou (dnes důležitý ukazatel). Společně s kyselinou vinnou tvoří až 90 % celkových kyselin v moštu a víně, a patří také ke kyselinám silným (pKa 3,46; REGMI et al., 2011).
COOH OH
C
H
H
C
H
COOH L-jablečná kyselina Obr. 9 Kyselina jablečná (zdroj VELÍŠEK, 2009)
Již zmíněný pokles obsahu kyselin během zrání hroznů je provázen oxidací kyseliny jablečné. Ta se mění na fruktósu a glukósu využívané coby zdroj energie (viz výše). Tyto monosacharidy se však v bobulích neukládají a nezvyšují tak cukernatost. Kyselina jablečná je tedy, jak plyne z popisovaných změn jejího obsahu, nejdynamyčtěji se měnící organickou kyselinou (PAVLOUŠEK, 2011).
28
O kyselině jablečné TOMÁŠEK (2005) píše: „Podle Navary, Minárika (1986) Rodolupo zjistil, že v hroznech jsou účinné enzymy malát-dehydrogenáza, které se podílejí na přeměnách dikarboxylových kyselin, které jsou přítomny při přeměnách uhlohydrátů, bílkovin a tuků. Autor uvádí, že kyselina jablečná může vznikat také v glyoxalovém cyklu. Při tomto procesu, probíhajícím při dozrávání hroznů, se kyselina isocitrónová štěpí na kyselinu jantarovou a glyoxalovou, která se potom za přítomnosti CoA mění na kyselinu jablečnou.“. Zabýváme se odbouráváním kyseliny jablečné díky metabolismu bakterií, ale připomeňme si, že i kvasinky zpracovávají kyselinu jablečnou, a to za vzniku alkoholu, nikoliv kyseliny mléčné, jako při malolaktické fermentaci (STEIDL, 2010). 5.2.1 Přeměna kyseliny jablečné – malolaktická fermentace Zásadní reakce pro malolaktickou fermentaci, biologické odbourávání kyselin a jablečnomléčné kvašení dohromady! Mnohokrát již zmíněná, popsaná i znázorněná metabolická přeměna kyseliny jablečné (malát) na kyselinu mléčnou (laktát) a CO2. Podíl na této přeměně má tzv. malolaktický enzym (L-malát: NAD+ karboxylása) s kofaktory Mn2+ a NAD+ (MORENO-ARRIBAS et al., 2009; RIBÉREAU-GAYON et al., 2006; KNOLL 2011). Při této přeměně tak dochází ke snížení koncentrace kyseliny jablečné ve prospěch zvyšující se koncentrace kyseliny mléčné při uvolňování oxidu uhličitého. Víno ztrácí ostrou, škrablavou kyselost a nabývá jemnosti a hladkosti. 5.2.2 Snížení obsahu kyseliny jablečné bez MLF Ke snížení obsahu kyseliny jablečné dochází také při maceraci oxidem uhličitým (CO2), díky kterému je z kvasné nádoby vytlačen vzduch a procesy zde probíhající mají anaerobní charakter, při kterých ke kvašení dochází v bobulích. Kyselina jablečná není při tomto procesu přeměněna na kyselinu mléčnou, jako při malolaktické fermentaci, ale na kyselinu jantarovou a nevýznamné množství dalších kyselin. Snížit obsah kyseliny jablečné můžeme podobně jako u kyseliny vinné i odkyselováním, zde však podvojným či jeho zdokonalenou variantou (STEIDL, 2010).
29
5.3 Kyselina citrónová Kyselina citrónová (angl. citric acid) je také velmi rozšířenou kyselinou, kterou můžeme očekávat, jak její název napovídá, v citrusových plodech, ale nejen tam. Na rozdíl od dvou předchozích organických kyselin, se jedná o trikarboxylovou kyselinu (2-hydroxy1,2,3-propantrikarboxylová kyselina), která hraje velmi důležitou biochemickou roli v Krebsově (citrátovém) cyklu. Její využívání je časté v potravinářství k ochucování nápojů, ale i v mnoha dalších odvětvích například ve farmacii. Koncentrace v moštu a víně ve srovnání s předchozími kyselinami není vysoká, v případě kyseliny citrónové se jedná zhruba o 0,5 g⋅l-1. Opět patří mezi silné organické kyseliny (pKa 3,09) (REGMI et al., 2011).
COOH H
C
H
OH
C
COOH
H
C
H
COOH citrónová kyselina Obr. 10 Kyselina citrónová (zdroj VELÍŠEK, 2009)
5.3.1 Degradace kyseliny citrónové Bez ohledu na nevelkou koncentraci ve srovnání s hlavními dvěma kyselinami ve víně, má kyselina citrónová svůj velký význam, neboť při metabolických přeměnách této kyseliny se vytváří kyselina octová (zodpovědná za zvýšení volatility, v extremních případech nepoživatelnosti vína), ale také diacetyl, který při koncentracích do 5 mg⋅l-1 podporuje komplexnost vína a přináší mu lehce oříškové až karamelové aroma. Při vyšších koncentracích však vínu dodává až máselné aroma čímž víno poškozuje. Nutno podotknout, že k degradaci kyseliny citrónové dochází také po spotřebování kyseliny jablečné.
30
kyselina citrónová kyselina octová kyselina pyrohroznová kyselina acetomléčná kyselina mléčná ethanal TPP
acetoin diacetyl
ethanol acetyl-CoA
2,3-butandiol lipidy
kyselina octová
Obr. 11 Degradace kyseliny citrónové, zjednodušená verze (zdroj RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
5.4 Kyselina jantarová Kyselina jantarová (angl. succinic acid) se na rozdíl od předchozích objevuje až coby fermentační produkt kvasinek. Je tedy pravidelně se objevujícím vedlejším produktem alkoholového kvašení (STEIDL, 2010). Tato kyselina je dikarboxylová (1-4-butandiová kyselina), je produkována všemi živými organismy a je součástí například Krebsova cyklu, či metabolismu lipidů. Její koncentrace ve víně je kolem 1 g⋅l-1 a patří také k silným organickým kyselinám (pKa 4,18; viz REGMI et al., 2011). Kyselina jantarová se podílí mimo jiné i na zintenzivnění aroma vín (PEYNAUD and BLOUIN, 1996 in RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). COOH H
C
H
H
C
H
COOH jantarová kyselina Obr. 12 Kyselina jantarová (zdroj VELÍŠEK, 2009)
31
5.5 Kyselina mléčná Kyselina mléčná (angl. lactic acid), jak již víme, se víně objevuje jako produkt malolaktické fermentace (ve své L-formě), jako produkt anaerobního metabolismu glukósy (D-forma), nebo degradace glycerolu. Zde jde o kyselinu monokarboxylovou (2-hydroxypropanová kyselina). Patří mezi silné organické kyseliny (pKa 3,81; viz (REGMI et al., 2011), je však samozřejmě slabší kyselinou než kyselina jablečná. COOH H
C
OH
CH3 L-mléčná kyselina Obr. 13 Kyselina mléčná (zdroj VELÍŠEK, 2009)
Narůstající obsah kyseliny mléčné po malolaktické fermentaci zvyšuje plnost vína. Její obsah může být zvýšen i činností kvasinek, i když jen nepatrně. Kvasinky jsou totiž v omezené míře schopné metabolizovat kyselinu pyrohroznovou (pyruvát) právě na kyselinu mléčnou (laktát).
5.6 Kyselina pyrohroznová Kyselina pyrohroznová (angl. pyruvic acid) se v materii objevuje až během metabolických přeměn, stejně jako kyselina jantarová a kyselina mléčná. Její obsah ve víně je však malý až zanedbatelný. Patří mezi nejdůležitější meziprodukt a také křižovatku
na
metabolických
drahách.
Je
kyselinou
monokarboxylovou
(2-
oxopropanová kyselina). Pokud nám zrak lehce povyskočí na výše zmiňovanou kyselinu jablečnou, uzříme, že tyto dvě kyseliny jsou si nápadně podobné. Redukcí kyseliny pyrohroznové totiž opravdu vznikají oba stereoisomery kyseliny mléčné, a jak uvádí RIBÉREAU-GAYON et al., (2006) L-forma je převážně původu bakteriálního, zatímco D-forma vzniká převážně činností kvasinek. Její enzymatickou dekarboxylací během alkoholového kvašení vzniká ethanal, který je následně redukován na ethanol. Oxidací kyseliny pyrohroznové vzniká kyselina octová.
32
COOH C
O
CH3 pyrohroznová kyselina Obr. 14 Kyselina pyrohroznová (zdroj VELÍŠEK, 2009)
5.7 Kyselina octová Kyselina octová (angl. acetic acid) patří opět ke kyselinám, které jsou součástí metabolických drah nebo jejich výsledným produktem. Ve víně se objevuje, ale je nežádoucí. Patří mezi těkavé (volatilní) kyseliny, je kyselinou monokarboxylovou (kyselina ethanová). Příčinou vzniku může být činnost některých acetobakterií, a to nejčastěji za přístupu vzduchu (pKa 4,73; viz REGMI et al., 2011). COOH CH3 octová kyselina Obr. 15 Kyselina octová (zdroj VELÍŠEK, 2009)
Také kvasinky vytvářejí kyselinu octovou, jako vedlejší produkt metabolismu. Divoké-apikulátní (název pochází z druhového jména jednoho z hlavních zástupců těchto kvasinek Kloeckera apiculata) kvasinky jsou přitom schopné vytvořit až 0,5 g⋅l-1 kyseliny octové (acetát), tedy až desitinásobné množství oproti ušlechtilým kmenům Saccharomyces cerevisiae. Obsah kyseliny octové nad 0,6 g⋅l-1 je považován za znamení bakteriální aktivity. Mohl by následovat výčet dalších organických kyselin, se kterými se setkáváme v hroznech, moštu a víně. Zmiňme alespoň názvy některých z nich: kyselina kumarová, šťavelová, hydroxyskořicové kyseliny, aminokyseliny, anorganická kyselina fosforečná a další. Poznámka: degradace kyseliny sorbové (užívané jako konzervant) je příčinou tónu po pelargóniích (EDER et al., 2006).
33
6 Stanovení organických kyselin ve víně Organické kyseliny a zásadní význam jejich obsahu v moštu a ve víně nás doprovázejí prakticky ve všech výše uvedených kapitolách. Je tedy nasnadě snaha o přesné zjištění přítomnosti jednotlivých kyselin a také jejich koncentrací. Připomeňme si, že nízkomolekulární organické kyseliny (viz kapitolu 5) obsažené v moštu a ve víně mají vliv na organoleptické vlastnosti (chuť, vůni, barvu), mikrobiální stabilitu a díky detekování jejich obsahu můžeme pozitivně ovlivnit procesy směřující ke kvalitnímu vínu (alkoholická fermentace, malolaktická fermentace a zrání vína). Nyní tedy, jako završení již popsaného, krátce k některým dnes dostupným metodám analýzy organických kyselin.
6.1 Spektrofotometrické metody Metoda založená na postižení barevných změn při absorbci světla viditelného (VIS) či ultrafialového (UV) procházejícího zkoumanou materií. Metoda byla zpracována pro detekci kyseliny jablečné, vinné a mléčné (REBELEIN, 1961 in MATO et al., 2004), je však zdlouhavá a nedostává se dat pro určení dalších důležitých kyselin (citrónové, jantarové a octové) (MATO et al., 2004). Pro spektrofotometrii je třeba zdroje spojitého záření (deuteriová výbojka pro UV spektrum, běžná žárovka pro viditelné spektrum), monochromátor (lámavý hranol, mřížkový monochromátor), absorpční prostředí (tvořené kyvetou s roztokem), detektory a záznamové a vyhodnocovací zařízení.
6.2 Enzymatické metody Tyto metody jsou použitelné především pro zjištění kyselin jablečné, mléčné a citrónové obsažených ve víně a moštu, ale je možné je použít i pro ověření přítomnosti kyselin vinné, octové, jantarové a dalších. V případě posouzení obsahu kyseliny citrónové ve víně se jedná o zásadní metodu asociace AOAC (Association of Official Analytical Chemists, 2000 in MATO et al., 2004).
34
Princip je založen na zvyšování či snižování absorpce koenzymu NADH (redukovaný nikotinamid adenin-dinukleotit) či NADPH (redukovaný nikotiamid adenin-dinukletid fosfát), které jsou schopny pohlcovat tzv. vzdálenou oblast vlnové délky. Příkladem budiž určení kyseliny octové (acetát). Za přítomnosti ATP je kyselina octová pomocí acetátkinásy transformována na acetylfosfát, ATP se tak mění na ADP, které se reakcí s fosfoenolpyruvátem, katalyzované pyruvátkinásou vrací na ATP a vzniká pyruvát. Dalším krokem je za přítomnosti laktátdehydrogenásy redukce pyruvátu na laktát při oxidaci NADH na NAD+a vzniku molekuly vody. Množství zoxidovaného NADH je určeno pomocí měření absorbance při vlnové délce 340 nm, a toto množství úměrně odpovídá koncentraci kyseliny octové ve víně (MORENO-ARRIBAS et al., 2009). Velkým přínosem této metody je možnost rozlišit L- a D-formu konkrétní organické kyseliny. Nevýhodou se jeví možnost určení pouze jedné konkrétní kyseliny během měření, a také časová náročnost. Metoda bývá užívána pro ověření výsledků při měření jinými metodami (HPLC, IC, aj.) (FRAYNE, 1986; KUPINA, POHl, & GANNOTTI, 1991; POLO, BARAHONA, & CACERES, 1986 in MATO et al., 2004).
6.3 Chromatografické metody Chromatografické metody patří mezi separační (dělící) metody, ve kterých je za přispění
různých
fyzikálních,
fyzikálně-chemických
a
chemických
vlastností
jednotlivých složek zkoumané materie, dosaženo rozdělení minimálně na dva separáty odlišného složení. Využívají dělení látek na mobilní fázi (kapalina, plyn) a stacionární fázi – sorbent (tenká vrstva na pevných částicích, částečky tuhé látky aj.). Rozdělení chromatografických metod vyplívá z povahy zkoumaných fází (plynová a kapalinová), z uspořádání fází (kolonová a plošná), ale také z probíhajícího děje (adsorpční, rozdělovací iontově výměnná, gelová) (JANČÁŘOVÁ&JANČÁŘ, 2003). 6.3.1 Plynová chromatografie Metoda GC (gas chromatography) je rozdělena podle fáze sorbentu na plynovou adsorpční chromatografi – GSC (gas-solid chromatography), kde je sorbent v pevné fázi a plynovou rozdělovací chromatografii – GLC (gas-liquid chromatography), ve které je sorbent ve fázi kapalné, přičemž GLC je praktičtější.
35
Plynová chromatografie je využitelná nejen pro stanovení organických látek (např. kyselin) v potravinářství, ale i při stanovování reziduí PCB (polychlorované bifenyly), herbicidů a dalších látek (JANČÁŘOVÁ&JANČÁŘ, 2003). Byť je plynová chromatografie metodou velmi citlivou, pro organické kyseliny, jimiž se zde zabýváme, není příliš vhodná, protože většina těchto kyselin není volatilní a jsou nutné další kroky k tomu, aby bylo možné tuto metodu použít. Přesto pro některé (jablečná, mléčná, octová) je dnes již možné použít plynovou chromatografii přímo (MATO et al., 2004). 6.3.2 Kapalinová chromatografie Na rozdíl od výše zmíněné je u metody LC (liquid chromatography) je mobilní fází vždy kapalina. Sorbent je umístěn plošně v tenké vrstvě nebo v koloně (event. sloupci). V případě plošného umístění sorbetu jde o variantu tenkovrstvé chromatografie – TLC (thin-layer chromatography), kdy pevný sorbent je na inertní podložce a o variantu papírové chromatografie – PC (paper chromatography), zde je sorbentem filtrační papír specifických vlastností. Je-li sorbent v koloně mluvíme o vysokoúčinné kapalinové chromatografii – HPLC (high performance liquid chromatography). Jedná se soubor metod jejichž společným znakem je použití kapalné mobilní fáze, vysokotlaké techniky a účinných kolon. Důležitou roli v kapalinové chromatografii hraje detektor, který může být optický (spektrofotometrický, fluorimetrický,…) nebo elektrochemický (vodivostní). Metoda je využitelná pro stanovení mnoha organických látek např. v potravinářství a farmacii. Dnes je možné setkat se i s vysokoúčinnou tenkovrstvou kapalinovou chromatografií – HPTLC (JANČÁŘOVÁ&JANČÁŘ, 2003). Kapalinová chromatografie patří mezi nejdokonalejší analytické metody pro určování obsahů organických kyselin v moštu a ve víně.
6.4 Elektromigrační metody Princip těchto metod se vztahuje k různé pohyblivosti nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Izotachoforéza pracuje s částicemi při konstantní rychlosti, ale při různých hodnotách elektrického pole. Druhá metoda je zmíněna podrobněji.
36
6.4.1 Elektroforéza Zde je využita různá rychlost částic v konstantním elektrickém poli. Systém je složen ze dvou elektrod vodivě propojených např. filtračním papírem napuštěným elektrolytem, inertní deska s vrstvou celulósy, atd. Tzv. kapilární elektroforéza je založena na obdobném principu, přičemž vodivé propojení elektrod zajišťuje křemenná kapilára s tlumivým roztokem (JANČÁŘOVÁ&JANČÁŘ, 2003). Kapilární elektroforéza – CE (capillary electrophoresis) dnes velmi často nahrazuje dosud nejdůmyslnější kapalinovou chromatografii. Důvodů k využití kapilární elektroforézy je více. Patří mezi ně jasné výsledky, jednoduchost, krátký čas vlastní analýzy a malá spotřeba reagentů i zkoumaných vzorků. Pro účely analýzy organických kyselin v moštu či ve víně pomocí kapilární elektroforézy, bylo během několika let vytvořeno vícero metod.
6.5 Acidobazické titrace, měření pH-metrem Tyto reakce jsou založeny na principu neutralizace:
H+ + OH-
H2O.
Dle použitého titračního činidla rozdělujeme acidobazické titrace na alkalimetrii (zde je titračním činidlem roztok zásad (např. KOH, NaOH), a acidimetrii (zde je naopak titračním činidlem roztok kyselin) (JANČÁŘOVÁ&JANČÁŘ, 2003). 6.5.1 Alkalimetrie Pro naše účely zcela evidentně platí použití metod alkalimetrie. Jelikož se při hodnocení kyselin v moštu uvádí celkové nebo také titrovatelné kyseliny (RIBÉREAUGAYON et al., 2006), je možné metodu použít pro hrubý odhad obsahu kyselin. Titrovatelné kyseliny představují (včetně obsažený anorganických kyselin) zastupují zhruba 70-80 % celkových kyselin v hroznech (PAVLOUŠEK, 2011). Veškerými titrovatelnými kyselinami se rozumí souhrn volných těkavých a netěkavých kyselin ve víně i kyselých solí, které je možno zneutralizovat titrací NaOH nebo KOH (o známé normalitě). Počet ml spotřebovaného hydroxidu přímo odpovídá počtu g⋅l-1 veškerých kyselin ve víně (TOMÁŠEK, 2005). Přenosný pH-metr patří k základnímu vybavení každého vinařství (KUMŠTA, 2013).
37
7 Závěr Z předchozího textu zabývajícího se malolaktickou fermentací a jejím vlivem na na acidobazické vlastnosti vína nad ostatní vystupuje několik zásadních sdělení. Mezi ně patří elementární vliv bakterií mléčného kvašení na celý tento proces a především na objektivní zvýšení pH vína, skrze odbourání v chuti drsné kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou, která je ve vínech vítána pro své příznivé zjemňující účinky. Poznání zásadního postavení (nejen výše zmíněných) organických kyselin při procesu výroby vína nás dovedl k nutnosti sledovat jejich koncentrace nejen v rodícím se víně, ale již v hroznech potažmo v moštu. Potřeba diagnostikovat koncentrace organických kyselina a jejich změny je tedy dalším důležitým faktem, zjištěným při snaze o hlubší porozumění malolaktické fermentaci. Prakticky všemi kapitolami nás provázejí bakterie mléčného kvašení, bez kterých není celý proces vůbec možný. Ne každý druh, či dokonce kmen bakterií, však vykazuje vlastnosti vhodné pro zdárný průběh malolaktické fermentace. Dalším výrazným poznatkem pro nás tedy je důležitost nejen výběru kvalitních bakterií (v případě inokulace), ale také dodržení podmínek odpovídajících jejich požadavkům, jelikož se jedná o živé organismy s konkrétními nároky. Zde je nutné připomenout, že nedodržení některých podmínek může mít na víno devastující dopad. A i když bakterie shledáváme původci některých nemocí vína, zmiňme alespoň v závěru, že i bakterie samotné mohou trpět nemocemi. Za nemocemi bakterií nacházíme bakteriofágy (bakteriální viry), které mohou malolaktickou fermentaci i zcela znemožnit. Dalším významným, i když v podstatě paradoxním zjištěním je, že přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou v celém komplexu vlivů malolaktické fermentace jaksi ustupuje do pozadí, byť je opravdu význačná. Stále více, při konfrontaci s neustále přibývajícími výzkumy na poli výroby vína, jsme nuceni přisuzovat malolaktické fermentaci širokospektrální charakter. Jelikož se jedná o celek zahrnující mnoho biochemických reakcí, podléhajících mnoha vlivům, nelze opomenout již zmíněná rizika. Zásadním se tedy také jeví rozhodnutí, zdali rizika podstupovat, či malolaktickou fermentaci raději eliminovat.
38
8 Souhrn Podstatou malolaktické fermentace jsou přeměny látek na mnoha různých metabolických drahách, a to díky činnosti bakterií mléčného kvašení. Významný dopad na vlastnosti vína má především přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou za zvýšení pH vína. Kvalitu však ovlivňují mnohé další procesy, a to nejen ty související se změnou koncentrace organických kyselin, jako například metabolismus cukrů, aminokyselin, degradace glycerolu apod. Samy tyto děje také podléhají mnoha vlivům: teplotě, pH, obsahu oxidu siřičitého, ethanolu a dalším. Výsledné změny však mohou být kvalitu vína snižující, proto je třeba dodržovat ověřené postupy. Mezi nejdůležitější zásady patří kontrola obsahu kyselin před malolaktickou fermentací i během ní, dodržování teplotních rozmezí a hygienických pravidel.
39
Resume Metabolism on many different metabolic courses is the principle of malolactic fermentation, due to activity of lactic acid bacteria. Significant impact on the properties of the wine has the conversion of malic acid to lactic acid by raising the pH of wine. However, quality is affected by many other processes, not only those related to the change of concentration of organic acids such as metabolism of sugars, amino acids and the degradation of glycerol etc. These happenings are also subject to many influences: temperature, pH, carbon dioxide, ethanol and others. The resulting changes may reduce the quality of the wine so it is necessary to follow best procedures. The most important principles are the check of the acidity before and during malolactic fermentation, the respect for the temperature range and hygiene rules.
40
Zdroje: BAROŇ, Mojmír Základy vinařství, přednášky pro II. ročník K-VIN-ústní podání, Lednice 2011. CARRASCOSA SANTIAGO, Alfonso V, Rosario MUÑOZ a Ramón GONZÁLEZ GARCIA. Molecular wine microbiology. 1st. ed. Boston: Academic Press, 2011, vii, 363 p. ISBN 01-237-5021-0. EDER, Reinhard. Vady vína: moderní vinohradnictví. Vyd. 1. Valtice: Národní vinařské centrum, 2006, 263 s. ISBN 80-903-2016-3. JACKSON, Ronald S. Wine science: principles and applications. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier/Academic Press, 2008. ISBN 978-012-3736-468. JANČÁŘOVÁ, Irena a Luděk JANČÁŘ. Analytická chemie. Vyd. 1. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003, 195 s. ISBN 978-80-7157-647-12008. KNOLL, Caroline Evaluating the influence of stress parameters on Oenococcus oeni and the subsequent volatile aroma composition of white wine. Faculty of Agricultural Sciences, Nutritional Science and Environmental Management Justus-Liebig-University Gießen, Germany and Department of Microbiology and Biochemistry Geisenheim Research Center, Germany, Hamburg 2011. KÖNIG, Helmut, Gottfried UNDEN a Jürgen FRÖHLICH. Biology of microorganisms on grapes, in must and in wine. Berlin: Springer, c2009, xviii, 522 p. ISBN 978-3540854-630. KUMŠTA, Michal Vinařská chemie a biochemie, přednášky pro III. ročník K-VINústní podání, Lednice 2013. LERM, E., L. ENGELBRECHT and M. DU TOIT. Malolactic Fermentation: The ABC’s of MLF, Department of Viticulture and Oenology, Stellenbosch University, Private Bag X1, Matieland (Stellenbosch), South Africa, 2010. MATO, Inés, Silvia SUÁREZ-LUQUE a José F. HUIDOBRO. A review of the analytical methods to determine organic acids in grape juices and wines. Food Research International. roč. 38, č. 10, s. 1175-1188. ISSN 09639969. DOI: 10.1016/j.foodres.2005.04.007. MATO, Inés, Silvia SUÁREZ-LUQUE a José F. HUIDOBRO. Simple determination of main organic acids in grape juice and wine by using capillary zone electrophoresis with direct UV detection. Food Chemistry. roč. 102, č. 1, s. 104-112. ISSN 03088146. MORENO-ARRIBAS, M a M POLO. Wine chemistry and biochemistry. New York: Springer, c2009, xv, 735 p. PAVLOUŠEK, Pavel. Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví. Praha: Grada, c2011, 333 s. ISBN 978-80-247-3314-2.
41
REGMI, U., M. PALMA a C.G. BARROSO. Direct determination of organic acids in wine and wine-derived products by Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and chemometric techniques. Analytica Chimica Acta. roč. 732, s. 137-144. ISSN 00032670. DOI: 10.1016/j.aca.2011.11.009. RIBÉREAU-GAYON, Pascal, Denis DUBOURDIEU a Bernard DONÈCHE. Handbook of enology. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, c2006-, 2 v. ISBN 04-7001037-1. STEIDL, Robert. Sklepní hospodářství. V českém jazyce vyd. 2., aktualiz. Překlad Jiří Sedlo. Valtice: Národní vinařské centrum, 2010, 309 s. ISBN 978-80-903201-9-2. TOMÁŠEK, Ivo. Organické kyseliny a jejich změny v hroznech, moštech a ve víně, diplomová práce, Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta v Lednici, 2005. TŮMA, Ivan Mikrobiologie, přednášky I. ročník K-VIN-ústní podání, Lednice 2010 VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin. Rozš. a přeprac. 3. vyd. Tábor: OSSIS, 2009, xx, 623 s. ISBN 978-80-86659-17-6. ZÁHORA, Jaroslav Mikrobiologie, přednášky pro I. ročník K-VIN-ústní podání, Lednice 2010
42
