Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta
Diplomová práce
Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro
Vedoucí práce:
Vypracoval:
Ing. Břetislav Křižan, Ph.D.
Lednice 2010
Bc. Martina Kudělková
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro vypracovala samostatně a použila jen prameny, které jsem uvedla v seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Lednici, dne:..............
Podpis studenta:.....................................
2
Poděkování
Chtěla bych poděkovat všem, kteří mi pomáhali při zpracování této práce. Zvláštní dík patří vedoucímu práce Ing. Břetislavu Křižanovi, Ph.D., za odborné vedení a ochotu spolupráce a v neposlední řadě děkuji své rodině za podporu po celý čas vysokoškolského studia. 3
OBSAH 1
ÚVOD........................................................................................................................ 6
2
CÍL............................................................................................................................. 8
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ........................................................................................... 9 3.1
Obecná charakteristika česneku ......................................................................... 9
3.1.1
Zařazení dle Konvička (1998); Jelínek, Zicháček (2003)........................... 9
3.1.2
Světové názvy dle Seidemann (2005)......................................................... 9
3.1.3 Dělení česneku s ohledem na vnitřní rytmus druhu Allium sativum, tvorby lodyhy a stavbu cibule dle Konvička (1998) ........................................................... 10 3.1.4
Klasifikace dle Kuzněcova (Kóňa, Kóňová, 2005) .................................. 10
3.1.5
Původ ........................................................................................................ 10
3.1.6
Morfologie česneku .................................................................................. 10
3.1.7
Obsahové látky ......................................................................................... 11
3.1.8
Použití, význam česneku........................................................................... 12
3.1.9
Choroby a škůdci česneku ........................................................................ 13
3.2
Charakteristika virů .......................................................................................... 13
3.3
Charakteristika rostlinných virů (fytovirů) ...................................................... 14
3.4
Významné viry napadající česnek.................................................................... 18
3.4.1
Rod POTYVIRUS...................................................................................... 18
3.4.2
Rod CARLAVIRUS ................................................................................... 25
3.4.3
Rod ALLEXIVIRUS................................................................................... 28
3.4.4
Rod FIJIVIRUS......................................................................................... 29
3.4.5
Ostatní viry, které mohou popřípadě infikovat česnek ............................. 30
3.5
Metody detekce virů......................................................................................... 30
3.5.1
Vizuální metody........................................................................................ 30
3.5.2
Sérologické metody .................................................................................. 30
3.5.3
Molekulárně genetické metody (PCR) ..................................................... 31
3.5.4
Elektronová mikroskopie.......................................................................... 32
3.6
Metody eliminace virů na česneku v podmínkách in vitro .............................. 32
3.6.1
Meristémové kultury (metoda izolace meristému) ................................... 32
3.6.2
Termoterapie............................................................................................. 35
3.6.3
Chemoterapie ............................................................................................ 37
3.6.4
Stem - disc dome culture - metoda stonkových disků .............................. 38
4
3.7
4
5
Multiplikace česneku v podmínkách in vitro ................................................... 39
3.7.1
Meristémové kultury................................................................................. 39
3.7.2
Stem - disc dome culture - metoda stonkových disků .............................. 40
3.7.3
Somatická embryogeneze ......................................................................... 41
METODIKA............................................................................................................ 45 4.1
Laboratoř .......................................................................................................... 45
4.2
Výběr a popis materiálu ................................................................................... 45
4.3
Příprava rostlinného materiálu ......................................................................... 48
4.4
Příprava médií .................................................................................................. 49
4.4.1
Příprava C0 média .................................................................................... 49
4.4.2
Příprava C0 média pro chemoterapii ........................................................ 51
4.4.3
Příprava C1 média .................................................................................... 51
4.5
Založení pokusu ............................................................................................... 51
4.6
Průběh pokusu.................................................................................................. 52
4.7
Úspěšnost kultivace stroužků a meristémů ...................................................... 56
4.8
Elisa – postup ................................................................................................... 57
VÝSLEDKY............................................................................................................ 62 5.1
Eliminace GCLV u jednotlivých odrůd ........................................................... 63
5.2
Eliminace LYSV u jednotlivých odrůd............................................................ 64
5.3
Eliminace OYDV u jednotlivých odrůd........................................................... 65
5.4
Eliminace SLV u jednotlivých odrůd............................................................... 66
5.5
Eliminace všech virů u jednotlivých odrůd...................................................... 67
5.6
Eliminace GCLV jednotlivými metodami ozdravení ...................................... 69
5.7
Eliminace LYSV jednotlivými metodami ozdravení....................................... 70
5.8
Eliminace OYDV jednotlivými metodami ozdravení...................................... 71
5.9
Eliminace SLV jednotlivými metodami ozdravení.......................................... 72
5.10
Eliminace všech virů jednotlivými metodami ozdravení................................. 73
6
DISKUZE ................................................................................................................ 75
7
ZÁVĚR.................................................................................................................... 79
8
ABSTRAKT ............................................................................................................ 81
9
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY..................................................................... 82
10 SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ .......................................................................... 90 11 SEZNAM PŘÍLOH.................................................................................................. 92
5
1
ÚVOD
Česnek kuchyňský (Allium sativum) patří k nejstarším kulturním plodinám, které provází lidstvo již od dávných dob. Je ceněn jako zelenina, koření, ale také jako léčivá rostlina pro své antibiotické účinky. Česnek se řadí do čeledi Alliaceae - česnekovité, ke které řadíme další hospodářsky významné plodiny (především cibuli, pór, nebo pažitku). Pěstování a výnos česneku negativně ovlivňují viry. Viry působí na kvalitu i kvantitu produkce česneku, což může vést i k vysokým ekonomickým ztrátám. Je známo několik patogenních virů, které se vyskytují ve všech oblastech pěstování česneku, z toho ve většině případů je česnek infikován celým komplexem virů. K nejdůležitějším rodům virů napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus, a dále Fijivirus (Garlic dwarf reovirus). Na česneku se mohou vyskytovat i další viry, ty ale nemají ekonomický význam a jsou spíše lokálního charakteru. Vzhledem k tomu, že česnek se množí výhradně vegetativně, jelikož nevytváří semena, jsou virové choroby u této plodiny závažným problémem. Přenos virů pomocí semen je vzácný, hlavní šíření virů se děje právě vegetativní cestou a významnou roli zde má vektor, což jsou především mšice. Komplex těchto hlavních virů se u česneku projevuje převážně mozaikami, proužkovitostí, zakrslostí a celkovým oslabeným vývojem rostlin. Viry mají špatný dopad nejen na jedince, ale i na celý porost a hrají důležitou roli ve výnosu. Jednotlivé viry samy o sobě se ale nemusí projevovat a mohou zůstávat v latentní formě. Je proto vhodné najít účinnou metodu ozdravení česneku od těchto hlavních virů. Jednou z cest je ozdravení česneku v podmínkách in vitro. K těmto metodám patří ozdravení pomocí izolace meristému, z ní vyplvající termoterapie nebo chemoterapie. Někteří autoři se zabývají také metodou stonkových disků („stem - disc dome culture“) jako možnou variantou ozdravení česneku od virů. Metodou izolace meristému a chemoterapií se zabývá tato práce.
6
V podmínkách in vitro lze ozdravený česnek také množit. Multiplikace může probíhat preparací meristémů kultivovaných na různých mediích s odlišnými suplementy, metodou stonkových disků nebo somatickou embryogenezí.
7
2
CÍL
Cílem práce je získat informace o kultivaci, ozdravování a množení česneku v podmínkách in vitro. Tyto informace a znalosti následně prakticky použít za účelem ozdravení pěti odrůd česneku kuchyňského pro uchování metodou kryokonzervace. Práce bude hodnotit metody chemoterapie a izolace meristému. Přítomnost virů (OYDV – Onion yellow dwarf potyvirus, GCLV – Garlic common latent carlavirus, LYSV – Leek yellow stripe potyvirus a SLV – Shallot latent carlavirus) bude stanovována metodou ELISA. Bude zhodnocena účinnost ozdravení jednotlivými metodami.
8
3 3.1
LITERÁRNÍ PŘEHLED Obecná charakteristika česneku
3.1.1 Zařazení dle Konvička (1998); Jelínek, Zicháček (2003)
Druh: Allium sativum (L.), syn. Allium controversum (Bown, 2002), Porrum sativum (L.) RCHB. (Seidemann, 2005) - česnek setý Rod: Allium - česnek Čeled: Alliaceae - česnekovité Řád: Liliales - česnekotvaré Třída: Liliopsida - jednoděložné Oddělení: Magnoliophyta - krytosemenné Podříše: Cormobionta - vyšší rostliny Říše: Plantae - rostliny
3.1.2 Světové názvy dle Seidemann (2005)
anglicky - garlic německy - Knoblauch, Knobloch, Knofel francouzsky - aïl, aïl blanc, ail ordinace italsky - aglio holandsky - knoflook rusky - tschesnoik
9
3.1.3 Dělení česneku s ohledem na vnitřní rytmus druhu Allium sativum, tvorby lodyhy a stavbu cibule dle Konvička (1998)
1. var. Sagittatum (Kuzěncov) = typ H paličák 2. var. Bulhare (Kuzněcov) = typ U širokolistý nepaličák 3. var. Variabilis (Konvička) = typ A úzkolistý nepaličák, kontinentální ekotypy
3.1.4 Klasifikace dle Kuzněcova (Kóňa, Kóňová, 2005)
1. ssp. Sagitatum – česnek paličák s třemi ekotypy – Středoasijský, Kavkazskokarpatský a Východo-středomořský 2. ssp. Vulgare – česnek nepaličák s třemi ekotypy – Kontinentální, Jihomořský a Jihoruský
3.1.5 Původ
Česnek je znám odpradávna. Jeho původ je ve Střední Asii, kde je kulturní plodinou. Planě roste v Kyrgyzstánu, Tádžikistánu, Uzbekistánu a na severním Kavkaze. Roste zde převážně ve vyšších nadmořských výškách nad 500 metrů nad mořem. (Petříková a kol., 2006). Vznikl pravděpodobně z planého druhu Allium longicuspis. (Rabinowitch, Currah 2002). V Číně se pěstoval už od 2. stol. před Kristem, v Mezopotámii a Egytě odnepaměti. Z Egypta se přes Řecko a Řím dostal česnek do celé Evropy. Zde mají zásluhu na rozšíření česneku hlavně benediktínské kláštěry. Česnek byl v Evropě s výjimkou Anglie všeobecně oblíben. (Konvička, 1998). V současné době je česnek pěstován všude kromě tropických oblastí.
3.1.6 Morfologie česneku
Česnek je trvalka, u nás pěstovaný jako jednoletá nebo dvouletá zelenina. Jako u všech zástupců rodu Allium, se i u česneku tvoří svazčitý kořenový systém. Dělená cibule je 10
složena ze stroužků (zdužnatělé pupeny) vyrůstajících z podpučí, které jsou kryty šupinatým obalem (Janča, Zentrich, 1994). U paličáků tvoří cibuli dvě skupiny stroužků, kdežto u nepaličáků je počet skupin 3 – 7. Stroužky jsou zásobními a rozmnožovacími orgány, které se vyvinuly z kolaterálních pupenů. Dužina je tvořena zásobním pletivem dužnatého listu. Stroužky jsou chráněny dvojvrstvou slupkou, která jim dává barvu. U nepaličáků je často slupka ze tří vrstev a je jemnější než u paličáků. Velikost a počet stroužků jsou odrůdový znak. Listy česneku jsou ploché, žlábkovité, tmavě zelené a ojíněné s listovými pochvami. U paličáků je počet listů obalujících lodyhu vyšší (až 15 listů) než u nepaličáků (průměrně 10 listů). Květní lodyha je u paličáků 0,8 – 1 m vysoká, také vyrůstající z podpučí, ukončená lichookolíkem řídce rozložených sterilních kvítků, který je obalen v toulci. Jednotlivé květy se skládájí z 6 okvětních lístků zelenavě bílé až růžové barvy. Podle Kuzněcova plané formy ve své domovině ve střední Asii, v nadmořských výškách 3000 metrů, kvetou a tvoří semena. Kulturní formy ale semena netvoří. U sterilních forem bývají prašníky žlutozelené, smrštěné, matné, v normálním stavu červenofialové, lesklé. Mezi jednotlivými květy se nachází dužnaté vegetativní útvary – pacibulky, které bývají lidově považovány za semena. Mohou sloužit k vegetativnímu množení (Konvička, 1998; Petříková, 2006).
3.1.7 Obsahové látky
Glykosidně vázaná silice, sloučeniny síry, fytoncidy, vitaminy A, C, D, skupiny látek podobné pohlavním hormonům, jod a další minerální látky a stopové prvky jsou hlavní obsahové látky v česneku. Důležitý je obsah až 0,4 % alliinu, který se postupně mění na allicín, látku se silným antibakteriálním a antimykotickým účinkem (Konvička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005). K látce antibiotické povahy nalézající se v česneku patří také garlicin. Allin, alicin, allypropyl a disulphide34, 101 jsou v česneku hlavní obsažené silice (Li, 2000). Dále obsahuje látky insulinových vlastností. Suché cibule obsahují asi 30 40 % sušiny (Konvička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005). Parametry nejdůležitějších látek (průměrné obsahy ve 100 gramech) dle Kóňa, Kóňová (2005) Voda – 61,3 g Bílkoviny – 6,21 g 11
Lipidy – 0,27 g Sacharidy – 25,04 mg Vitamin C – 18,175 mg Minerální látky – 1,39 mg
3.1.8 Použití, význam česneku
Česnek se u nás používá jako zelenina, koření, ale v hojné míře také jako léčivá rostlina. Celkově má velmi pozitivní vliv na lidský organismus. V dobách, kdy ještě nebyly známy léky antibiotického účinku, byl česnek využíván jako přírodní antibiotikum (Konvička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005). Česnek je antioxidant, snižuje cholesterol, vysoký krevní tlak a tvorbu krevních destiček, má protinádorové účinky a působí proti trombóze (Li, 2000). Působí antiskleroticky tím, že rozšiřuje cévy a brání vzniku tukových usazenin na stěnách cév. Snižuje hladinu cholesterolu a urychluje jeho vyplavování z těla (Kovička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005; Janča, Zentrich 1994). Bown (2002) uvádí česnek jako prevenci proti infekcím a chřipce, bronchitidě a černému kašli, podporuje pocení. Byla zjištěna redukce glukózy u diabetiků. Vně lze použít při problémech s akné. Mimořádně ceněnou vlastností česneku jsou jeho antibakteriální a protiplísňové účinky. Například z asi 560 kmenů zlatého stafylokoka jich česnek přes 500 spolehlivě ničí. Dokáže také hubit rozšířené plísně Candida albicans, které bývají příčinou rakovin a jiných vážných onemocnění (Janča, Zentrich, 1994). Celkově blahodárný vliv má na trávicí ústrojí (proti nadýmání, křečím, podporuje trávení a jiné). Jediným negativem může být jeho typický nezaměnitelný zápach, který se po požití vylučuje všemi póry těla a pro většinu lidí je nepříjemný (Kovička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005; Janča, Zentrich 1994).
12
3.1.9 Choroby a škůdci česneku
K chorobám abiotického původu patří sluneční úžeh, zasychání špiček listů a genetická porucha česneku (Rod a kol., 2005). Choroby biotického původu vyskytující se na česneku jsou fusariová hniloba (Fusarium oxysporum), modrá hniloba (rod Penicillium), rzivost cibule (Puccinia alli), bílá hniloba cibule (Sclerotium cepivorum), sazovitost česneku (Helmithosporium allii), plísňovitost cibule (Peronospora destruktor - plíseň cibulová), a fytoplasmová žloutenka aster - aster yellows cytoplasma (Rod a kol., 2005, Šafránková, 2007). Mezi škůdce napadající česnek se řadí hádˇátko zhoubné (Dityenchus dipdsaci), houbomilka česneková (Suillia univittata), vrtalka pórová (Phytomyza gymnostoma), třásněnka zahradní (Thrips tabaci), květilka cibulová (Delia antiqua), vlnovník česnekový (Aceria tulipae), molík česnekový (Acrolepia assectella), larvy (drátovci) kovaříkovitých - Elateridae (Rod a kol., 2005, Šafránková, 2007).
3.2
Charakteristika virů
Viry jsou nebuněčné živé organismy, které se mohou rozmnožovat pouze v hostitelských (metabolicky aktivních) buňkách, jsou to intrabuněční parazité. Patří do říše nebuněční (podbuněční) - Subcellulata a oddělení viry - Vira. Pojem „virus“ byl dlouho synonymem pro jed, „poison“. Až s rozvojem výkonnějších optických mikroskopů (elektronový mikroskop, 1939) se upřesnil pojem virus jako infekční agens menší než bakterie, tzv. filtrovatelné (ultramikroskopické) viry. Viry jsou složeny z nukleové kyseliny (DNA nebo RNA, nikdy ne oběma) a bílkovinného obalu (kapsid). Nukleokapsid je také jiné označení pro tento komplex. Většina živočišných virů má kolem nukleokapsidu ještě lipoproteinový obal., tzv. obalené viry. Viry nemají vlastní aparát pro syntézu bílkovin ani metabolický aparát. Jejich velikost se pohybuje v rozmezí 25 nm - 400 nm a téměř všechny jsou submikroskopické, pozorovatelné pouze v elektronovém mikroskopu. Viry představují velmi heterogenní skupinu mikroorganismů, jak v šíři hostitelů, tak ve struktuře a reprodukci. Jako virion je označena jednotlivá virová částice viru schopna infikovat a množit se v hostitelské buňce (Navrátil, 2010; Rosypal a kol., 2003; Jelínek, Zicháček, 2003, Rosypal, 2002). 13
Viry lze dělit z hlediska jejich hostitelských buněk na bakteriofágy, napadající bakteriální buňky (popř. fágy) a eukaryální viry, které se dále dělí na mykofágy (viry hub), rostlinné a živočišné viry (Rosypal, 2002). Při pozorování v elektronovém mikroskopu byly rozlišeny tyto tvary: izomerický (sférický), baciliformní, tyčkový, vláknitý (flexibilní a fixní), složený, komplexní (Navrátil, 2010) Reprodukce virů má pět fází:
1. adsorpce na buňku
2. penetrace (průnik) do buňky 3. uvolnění a replikace virového geonomu 4. skládání (maturace, zrání) virionů 5. uvolnění nových virionů z buňky (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003)
3.3
Charakteristika rostlinných virů (fytovirů)
Fytoviry jsou vnitrobuněční obligátní parazité, kteří až na výjimky nemají schopnost překonávat celulózové buněčné stěny. Dnes je známo asi 1000 rostlinných virů řadících se do 36 čeledí, z čehož se většina vyskytuje na kulturních plodinách (Rosypal, 2003; Navrátil, 2010). Rostlinné viry se liší od všech rostlinných patogenů velikostí, tvarem, ale i jednoduchostí svého chemického složení, fyzikální strukturou, množením, translokací v hostiteli a symptomy. Fytoviry se skládají z 5-40% z RNA a z 60-95% proteinu. (Agrios, 2005) Proces napadení buňky virem: Vstup viru do rostliny K průniku viru do buňky rostlin dochází pasivním způsobem (na rozdíl od živočišných a bakteriálních virů), zpravidla při mechanickém poškození, poranění. Pokud je ovšem poškození tak velké, že umírá hostitelská buňka, nepřežívá v ní ani vir. Jen zcela
14
ojediněle mohou viry proniknout do rostliny průduchy (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003).
Přenos a šíření virů mezi hostiteli 1. přenos reprodukčním materiálem a) vegetativní přenos - obvykle bývá spojen s činností člověka. Jedná se o přenos virů reprodukčním materiálem při vegetativním množení. A to jak množitelským materiálem, tak kontaminovanými pracovními nástroji. b) generativní přenos (přenos semeny) - v semenech bývají viry vázány na embrya, endosperm a testu. I když je pravděpodobnost přenosu semeny velmi nízká (kolem 0,1%), rostliny z nich vyrůstající mohou mít až epidemiologický význam. c) přenos pylem - je nevýznamný, pouze vzácně vede k nové infekci. (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003) 2. přenos houbami - děje se přes kořeny a přenáší se takto minimálně 30 rostlinných virů. Nejčastěji se jedná o rody Polymyxa, Spongospora, Olpidium (Agrios, 2005). 3. přenos pomocí vektorů - zoochorie Mnohé druhy hmyzu jsou přenašeči jak virů (nejčastěji), tak bakterií a hub. K předání choroby dochází nejčastěji při příjmu potravy. Ale také například pouhým dotykem, nebo kladélkem. Nejčastějšími přenašeči je hmyz, který často střídá hostitele. A dále hmyz s bodavě sacím nebo kousacím ústním ústrojím. Patří k nim nejčastěji mšice, mery a křísi. Mezi vektory dále patří členovci. Epidemiologický význam mají půdní háďátka (třída hlístice, Nematoda). (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003) Z tohoto pohledu můžeme přenos rozdělit na perzistentní a neperzistentní Persistentní - Je potřeba dlouhého sání. Vir se dostává potravou do těla přenašeče, do zažívacího traktu, hemolymfy a slinných žláz. Projde celým tělem vektora a odtud kousacím nebo sacím ústrojím infikuje další rostliny. Vektor si ponechává infekčnost po dlouhou dobu, i celý život. Pokud se vir ve vektoru množí, jedná se o propagativní typ, pokud se nemnoží, hovoříme cirkulativním přenosu. Největší koncetrace perzistentních 15
virů je v cévních svazcích. Zvláštní případ je transovariální přenos u mšic z matky na potomstvo (Šefrová, 2006; Navrátil, 2010). Nepersistentní - K přenosu viru stačí krátká doba sání (asi do minuty). Vektor si infekčnost uchovává jen krátkou dobu (max. několik hodin). Přenos probíhá mechanicky sacím nebo kousacím ústrojím vektora (Šefrová, 2006; Navrátil, 2010). Semiperzistentní - Nastává tehdy, pokud je doba nutná k projití viru tělem vektory kratší než 3 hodiny (Šefrová, 2006; Navrátil, 2010). 3. přenos zoosporami hub (Šefrová, 2006) 4. mechanický přenos - využívá se u testovacích, experimentálních rostlin (Šefrová, 2006) Jeden vir může být přenesen několika způsoby (Šefrová, 2006).
Rozvoj infekce a reakce hostitele Pokud je hostitelská buňka citlivá k infekci (v místě infekce se objevují lokální příznaky), dochází ke změnám v jejím metabolismu a vir se začíná reprodukovat (objevují se systémové příznaky). Výsledkem interakce vir - hostitel je nemoc, choroba.
Symptomy virových chorob Choroba se vyznačuje množením viru, poškozením funkcí rostliny a následným projevem symptomů. Jejich přítomnost se projevuje charakteristickými vizuálními příznaky, jako jsou barevné změny, mozaiky, žloutenky, pruhy, kresby, nekrózy na listech, deformace květů, změny tvaru - deformace, zakrslost (což vede až k odumírání), nižší výnos, zhoršené chuťové vlastnosti a skladovatelnost, a snížení imunity vůči dalším napadením. Příznaky můžeme pozorovat na částech rostlin, nebo na celých rostlinách. Objevují se nejen na úrovni makroskopické, ale také histologické a cytologické. Mohou se vyskytovat jen v některé fázi života rostliny. Řada virů je ovšem latentních a neprojevují žádné viditelné příznaky. V přírodě téměř neexistuje bezvirozní rostlina (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003; Agrios, 2005). 16
Obr. 1. Snížení výnosu vlivem OYDV u česneku kuchyňského (Elnagar, 2009)
Šíření choroby v rostlině Infekce se v rostlině šíří cévními svazky (xylémem a floémem) a z buňky na buňku prostřednictvím plasmodesmat (Navrátil, 2010; Hradilík, 2005).
Reakce rostlin na infekci Dle reakce rostlin na infekci je můžeme rozdělit do několika skupin: > imunní - viry zde nevznikají, nemnoží se, nejsou pozorovány virové příznaky, přítomnost viru není možné dokázat - rostlina není hostitelem viru > rezistentní - rostlina je hostitelem viru, ale brání se jeho replikaci a šíření > tolerantní - vir se v hostiteli množí, ale příznaky choroby nejsou silné a nezpůsobují silné ekonomické ztráty > vnímavá - vir se v hostiteli silně množí, objevují se typické příznaky choroby, jsou zde časté silné ekonomické ztráty (Navrátil, 2010)
17
3.4
Významné viry napadající česnek
Pěstování a výnos česneku je negativně ovlivňováno viry. Viry negativně působí na kvalitu i kvantitu produkce česneku, což vede k vysokým ekonomickým ztrátám. Je známo několik patogenních virů, které se vyskytují ve všech oblastech pěstování česneku, z toho ve většině případů je česnek infikován hned několika viry najednou. K nejdůležitějším rodům virů napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus, a dále rod Fijivirus (Garlic dwarf reovirus) . 3.4.1 Rod POTYVIRUS
Patří do čeledi Potyviridae, která byla objevena a vyhlášena v roce 1959. V roce 1995 popsal Murphy a kol. rody lišící se podle vektorů, které je přenášejí (Khan, Dijkstra, 2002). Tato čeleď je nejpočetnější skupinou rostlinných virů, řadíme k ní přes 150 druhů. Název rodu a jeho základní charakteristika jsou odvozeny od typového člena Y viru bramboru (Potato virus Y, PVY). Virové částice mají rozměry 12 nm x 680-900 nm (Astier a kol., 2007). Genom potyvirů je tvořen jednovláknovou + ssRNA (Agrios, 2005). Do rodu Potyvirus řadíme 126 virů, 28 blíže neurčených virů a další 15 je zatím zkoumáno. Tyto viry jsou přenosné mšicemi, nejvýznamnější jsou rody Aphis, Myzus a Macrosiphium, a to způsobem neperzistentním nebo semiperzistentním. K významným virům tohoto rodu napadajícím česnek patří Onion yellow dwarf virus (OYDV) a Leek yellow stripe virus (LYSV). Oba tyto viry mohou redukovat výnos o 17 - 60% (Caciagli, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Šutić a kol. (1999) uvádí další vir této čeledi napadající česnek - Garlic mosaic (possible) potyvirus (GcMVV).
ONION YELLOW DWARF VIRUS (OYDV) - virus žluté zakrslosti cibule
Vlastnosti virových částic
18
Jedná se o typického zástupce potyvirů, který byl objeven v roce 1960 (Aleksić a kol., 1980 in Šutić a kol., 1999). Virové částice jsou protáhlé, pružné, vláknité a jejich rozměry jsou 750 - 775 nm x 14 – 16 nm. Bod tepelné inaktivace (dále jen TIP) je 60-65 ºC, bod, kdy je vir ještě detekovatelný v naředěné rostlinné šťávě se pohybuje v rozmezí (dále jen DEP) 1x10-2 – 1x10-4 a životnost in vitro (dále jen LIV) je 2-3 dny (Bos, 1976; Tošić and Šutić,1976 in Šutić a kol., 1999). Napadá celý rod Allium (Diekmann, 1997).
Spektrum hostitelů Vir se běžně vyskytuje na cibuli, šalotce a česneku.(Diekmann, 1997). Šutić a kol. (1999) uvádí, že přirození hostitelé jsou cibule, šalotka, A. moly, A. scorodoprasum, A. vineale. Někteří autoři uvádí také česnek (Bos, 1976 in Šutić a kol., 1999) a pór (Tošic´ and Šutic´, 1976 in Šutić a kol., 1999) jako vnímavé k OYDV. Byl pozorován na okrasných druzích Allium a Narcissus. Pro experimentální a izolační účely se využívá Chenopodium amaranticolor, Ch. quinoa (Šutić a kol., 1999) a Ch. murale (Diekmann, 1997). Izolace z různých hostitelů má různou úroveň infekčnosti. Z česneku a narcisu jsou méně infekční pro cibuli než ty z cibule, a jedná se tedy pravděpodobně o zástupce různých virových kmenů (Šutić a kol., 1999).
Geografický výskyt, ekonomický význam OYDV byl popsán všude tam, kde se pěstuje cibule (Šutić a kol., 1999). Vyskytuje se kosmopolitně a největší význam má u semenných porostů (Diekmann, 1997). Podle Klukáčkové a kol. (2007) byl virus žluté zakrslosti cibule přítomen v 75,4% z pěti českých testovaných odrůd česneku (‘Anin’- 82, ‘Anton’- 129, ‘Benátčan´- 78, ‘Bjetin’87, a ‘Vekan’- 87 vzorků) a zároveň nebyl vůbec detekován v česneku ze Španělska (14 vzorků). Jejich výsledky dokazují, že je OYDV je u rodu Potyvirus častějším virem než LYSV. U odrůd ´Anin´ a ´Benátčan´ byl přítomen v 100%. V Řecku a Itálii byl vir detekován 100 % na rostlinách česneku (Dovas a kol., 2001; Dovas and Vovlas, 2003 in Klukáčková a kol., 2007). Na druhou stranu, v Brazílii a Japonsku byla frekvence viru
19
pouze do 40% (Daniels (1999), Fajardo a kol. (2001), and Takaichi a kol.(1998, 2001) in Klukáčková a kol., 2007). U citlivých odrůd může být velice škodlivý speciálně tam, kde se neprovádí ochranná, fytoasanační opatření. Úroveň škod závisí na počtu napadených rostlin. (Šutić a kol., 1999; Diekmann, 1997). Ve většině zemí způsobuje až padesáti procentní ztráty (Diekmann, 1997). Výnosy zeleniny u jednoletých rostlin mohou být redukovány až o 25%, kdežto potencionální výnos semen může být zredukován na 50-75%. Některá místa v bývalé Jugoslávii zaznamenávají až 40% výskyt OYDV na poli (Šutić a kol., 1999).
Přenos V přírodě je asi 60 druhů mšic přenášejících OYDV nepersistentním způsobem. Největší význam přitom mají
Acrythosiphon pisum, Aphis craccivora, A. fabae,
Brachycaudus cardui, Hyalopterus pruni, Myzus ascalonicus, M. cerasi, M. persicae, Rhopalosiphum maidis and R. padi. Mnoho mšic jako vektor hraje hlavní roli ve vzniku epidemií (Šutić a kol., 1999). Vir je také přenášen vegetativním způsobem množení. Přežívá v infikovaných cibulích, v cibulích pro produkci semen (procentuálně zde bývá vyšší výskyt, protože tyto rostliny jsou infekci vystaveny 2 roky), stroužcích, pacibulkách, ve vytrvalých zeleninách, v okrasných a volně rostoucích druzích rodu Allium. Vývoj rostlin z těchto cibulí představuje přirozený zdroj infekce během vegetace (Diekmann, 1997; Šutić a kol., 1999). Přenos prostřednictvím osiva nebyl potvrzen (Šutić a kol., 1999).
Symptomy Vir má podobné příznaky jako při fyziologických poruchách (popálení herbicidy, nedostatek ve výživě, popřípadě poškození mrazem). Proto můžeme OYDV celkem snadno zaměnit s jiným poškozením (Diekmann, 1997; Rod a kol., 2005). Symptomy se objevují nejprve na listech, rostoucích přímo z infikovaných cibulí jako pozoruhodné, četné, krátké žluté proužkování na bázi. Příznaky primární infekce 20
objevující se na listech se později v sezoně ztrácí a listy se jeví jako zdravé. S vývojem nemoci infikovaných listů přichází brzy kompletní chloróza, částečné zploštění a zkroucení a listy nabývají neobvyklého vzhledu. Úzké proužky se objevují také na květních stoncích, které se kroutí. To vedlo k pojmenování choroby onion yellow dwarf. Rostliny infikované OYDV vytváří deformovaná květenství nebo květenství se sterilními květy a netvoří semena (Šutić a kol., 1999). U česneku se symptomy neprojevují tak silně jako u cibule. Prvotní příznaky se objevují na listech. Na česneku se vytvářejí velice slabé chlorotické, světle žluté až žlutozelené podélné pruhy. Mohou přecházet ve žlutou mozaiku. Redukuje se velikost cibulí a růst nadzemní části (Diekmann, 1999). Rozsah napadení závisí na odrůdě a na množství viru. Například ve Francii (Lot a kol., 1998) způsobil OYDV ztráty 39-60%. Pokud se vyskytuje v kombinaci s jinými viry, způsobuje větší poškození a ztráty. Příznaky jsou četnější a výraznější v chladném počasí (Diekmann, 1999). V prvním roce nemusí být pozorovány žádné příznaky. Od dalších let mohou být ale napadány i květní stvoly, které sice neztrácejí turgor jako listy, ale objevují se na nich vizuální projevy (stejné jako u listů). (Diekmann, 1999). Na cibuli a šalotce je hlavním příznakem zpomalený růst a zakrnělost. Listy jsou zploštělé, zkroucené, od báze se na nich objevují nezvyklé žluté proužky, které při silné infekci splývají a celé listy mohou být chloroticky žluté. Působí povadlým dojmem. (Šutić a kol., 1999; Diekmann, 1999). Infikované rostliny mají slabá květenství nebo sterilní květy (Šutić a kol., 1999). Zhoršuje se skladovatelnost, během níž dochází k předčasnému rašení (Diekmann, 1997). U póru nedochází k barevným ani tvarovým změnám, choroba se projevuje poškozením kořenů háďátky (Diekmann, 1997).
Kontrola Produkce zdravého materiálu je hlavní pro produkci nebo snížení výskytu infekce. Během kontroly by měly být zničeny všechny infikované rostliny. Měla by být dodržena prostorová izolace od cibulových rostlin. Šalotka, která představuje pravidelný zdroj přirozené infekce, by neměla být pěstována v blízkosti cibule. Proti mšicím lze
21
použít chemickou kontrolu. Všechny infikované rostliny nebo zbytky rostlin by měly být zlikvidovány, protože slouží jako zdroj infekce po sklizni (Šutić a kol., 1999).
LEEK YELOW STRIPE VIRUS (LYSV) - virus žluté proužkovitosti póru
Vlastnosti virových částic Virové částice jsou přizpůsobivé a dlouhé 815-820 nm, TIP je 50-60°C, DEP je 1x10-2 až 1x10-3, LIV je 3-4 dny (Bos, 1981). Morfologicky a hostitelsky je podobný OYDV, ale sérologicky vzdálený (Bos, 1981 in Šutić a kol., 1999).
Geografické rozlišení a ekonomický význam Jedná se o dalšího významného potyvira, napadajícího výhradně celý rod Allium. Nejvíce je napadán pór a česnek (Diekman, 1997). Vyskytuje se všude, kde je pór pěstován. Je považován za jeden z nejvíce škodlivých virů na póru v několika zemích Evropy (Šutić a kol., 1999). Virus byl poprvé popsán Walkeyem a kol. (1987) v Anglii. Stejně jako OYDV může způsobovat redukci výnosu až o 50% (Diekmann, 1997). Například ve Francii se snížil výnos až o 54 %. Směsná infekce LYSV a OYDV dále redukuje výnos (Lot a kol., 1998). Lunello a kol. (2007) uvádí, že v Argentině snížil LYSV způsobil redukci hmotnosti a obvodu u česneku až o 74 %.
Hostitelé Podle Diekmana (1997) patří k nejvíce napadaným rostlinám pór a česnek. Přirození hostitelé jsou pór, cibule, šalotka. Vůbec neinfikuje A. fistulosum (Šutić a kol., 1999).
Symptomy Jednoduše rozpoznatelné chlorotické skvrny se nejprve objevují na bázi listů a postupně se šíří až k vrcholu. Kratší nebo delší pruhy v mosaikovém intervalu se střídají se
22
zelenými. Během vývoje choroby se tyto žluté pruhy šíří a pokryjí celý list a přichází kompletní chloróza. Čepele listů jsou vrásčité a zkroucené, listy jsou hrubé a více křehké. Rostliny mají pomalý růst, jsou více stresovány a umírají během zimy nebo jara. Stonky infikovaných rostlin jsou tenké, zakrslé a světlejší a podstatně redukované kvality, jsou citlivé na mráz a umírají buď v zimě, nebo v předjaří (Šutić a kol., 1999). Příznaky na česneku se projevují nerovnoměrným, světle zeleným proužkováním na mladých listech, které ve spodních a středních částech přechází do žluté barvy. Vir redukuje průměr stonku, ale významně neovlivňuje výšku rostlin (Diekman, 1997). Na póru se infekce projevuje zřetelným proužkováním listové čepele, které se objevuje od báze postupující nahoru, ojediněle i zcela chlorotické. Napadené rostliny špatně snáší ranní mrazy a tím pádem dochází k předčasnému úhynu (Diekman, 1997). I když k infekci dochází během vegetace, symptomy se objevují jen v říjnu a ozimé plodiny mohou být infikovány 100%. Vir zůstává v infikovaných rostlinách během zimy a na jaře je mšicemi přenášen na zdravé rostliny (Šutić a kol., 1999). Podle Diekmana (1997) a Šutić a kol. (1999) jsou rostliny infikovány LYSV
mšice
neperzistentním způsobem (především Aphis fabae a Myzus persicae) a vegetativním množením (ne generativně). Mšice, jako aktivní skupina vektorů, mohou způsobit vývoj této choroby až do epidemických rozměrů (Šutić a kol., 1999). K izolaci a biologickým testům (například při mechanické inokulaci) se používají Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, Ch. album (Bos, 1981), Ch. murale (Mohamed, Zouny, 1980).
Kontrola Hlavní preventivní opatření spočívá ve zdravém množitelském materiálu a adekvátní prostorové izolaci od jarní cibule, likvidace infikovaného materiálu během vegetace a likvidace posklizňových zbytků. Chemická kontrola mšic u sazenic je vhodná jako ochrana po přesazení rostlin na pole. Pro pór k produkci v čerstvém stavu není chemická ochrana doporučena z důvodu chemických reziduí (Šutić a kol., 1999).
23
GARLIC MOSAIC (POSSIBLE) POTYVIRUS (GcMV)
Vlastnosti virových částic Virové částice jsou protáhlé o rozměrech 640 x 14 nm (Br´cak, 1975 in Šutić a kol., 1999). TIP je 70°C a DEP 1 x 10-4.
Geografické rozlišení a ekonomický význam V bývalé Jugoslávii se vyskytoval všude, kde byl pěstován česnek. Redukuje růst a vitalitu a snižuje výnos o 30-40%. Tyto škody jsou považovány za hlavní příčinu nižších výnosů (Šutić a kol., 1999).
Hostitelé Allium sativum je primární přirozeným hostitelem GcMV, zřídka napadá cibuli a pór může být infikován experimentálně (Šutić a kol., 1999).
Symptomy Příznaky se projevují na prvních listech vyrůstajících z infikovaných stroužků. Objevují se bledé, chlorotické, úzké pruhy nebo pruhované mosaiky. S vývojem nemoci se tyto příznaky postupně rozšiřují z listových bází až na vrcholy a způsobují chlorózy celých listů. Jednotlivé stroužky zůstávají nevyvinuté a zakrslé. Celkově snižuje růst a vitalitu rostliny. Virus se uchovává v infikovaných stroužcích sloužících k propagaci česneku. Přirození vektoři nejsou známí, ale mohlo by se jednat o pavouky a roztoče. Jako ochrana a prevence je nutné použití zdravého, bezvirového množitelského materiálu (Šutić a kol., 1999).
24
3.4.2 Rod CARLAVIRUS
Rod Carlavirus patří do čeledi Flexiviridae (Astier a kol., 2007), podle jiných autorů (Khan, Dijkstra, 2002) do čeledi Tobusviridae. Obsahuje 68 členů, z toho 39 definovaných a 29 zkoumaných (Ryu, Lee, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Název rodu je odvozen od typového člena Carnation latent virus (Khan, Dijkstra, 2002). Virové částice mají rozměry 12 nm x 610-700 nm (Astier a kol., 2007). Genom carlavirů je tvořený jednovláknovou + ssRNA (Agrios, 2005). V některých částech světa (Jižní a Střední Amerika, Indie, Čína, Evropa) byli zástupci r. Carlavirus objeveni i na česneku (Bos, 1999). Symptomy na přirozených hostitelích jsou velmi slabé nebo žádné, pokud se objevují mosaiky, tak pouze v raných stádiích růstu. Tato tendence k mírné nebo latentní infekci přitahuje pozornost virologů a fytopatologů. Mnoho členů rodu bylo objeveno až v posledních desetiletích a většina z nich je spojena s dalšími závažnými virovými onemocněními. Většina je přenášena mšicemi neperzsistentním nebo semiprezistentním způsobem a mechanickým kontaktem (Ryu, Lee, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010, Diekman, 1997). K významným zástupcům napadající rod Allium patří Garlic common latent virus (GarCLV) a Shallot latent virus (SLV), také znám jako Garlic latent virus (Caciagli, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Garlic latent virus (GLV) byl z česneku poprvé izolován v Japonsku (Lee a kol., 1979). Řadí se k SLV, protože sérologicky je od něj nerozeznatelný (Tsuneyoshi a kol., 1998). Další carlavirus, podobný Carnation latent virus, byl ohlášen z Argentiny a podle Mavriče, Ravnikar (2005) označen zkratkou CG (Conci a kol., 1992 in Mavrič, Ravnikar, 2005).
GARLIC COMMON LATENT VIRUS (GarCLV, GCLV)
Popis virových částic Virové částice GarCLV jsou vláknité, přibližně 650 nm dlouhé a nepatrně ohebné (Diekman, 1997). Geografické rozlišení a ekonomický význam GCLV byl detekován ve všech oblastech, kde se pěstuje česnek. Poprvé byl GCLV zjištěn v roce 1981 ve Francii jako Garlic latent virus - GCL (Delecolle, Lot, 1981).
25
Později je v Japonsku GLV přejmenován na GarCLV (van Dijk, 1993). Záznamy o jeho výskytu jsou z Asie, Evropy, Jižní Ameriky (Bellardi a kol., 1995; Fajardo a kol., 2001; Mavrič a kol., 1999;) a ze Severní Ameriky (Pappu a kol., 2005).
Hostitelé Vnímavé hostitelské rostliny se vyskytují v čeledích Alliaceae, Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae (ICTVdB Virus Description, 2002). Běžně se vyskytuje ve zdánlivě zdravých rostlinách (Šutić a kol., 1999). Hlavní způsob přenosu viru je vegetativně množeným materiálem, zejména u česneku. GarCLV je přenášen mechanickou inokulací. Přenos mšicemi je pochybný (van Dijk, 1993; Barg a kol., 1994, 1997). Doposud nebyl zaznamenán přenos tohoto carlaviru semeny. K experimentálním účelům slouží Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, a jiné druhy merlíků, dále Nicotiana occidentalis a především druhy čeledi Alliaceae (van Dijk, 1993).
Symptomy Tento virus je v česneku a póru latentní, to znamená, že většinou v hostitelské rostlině nevyvolává žádné symptomy. V přítomnosti jiných virů (kromě potyvirů) může vyvolat slabé příznaky na česneku a póru. Pokud je ale snížen výnos cibulí, mají na to vliv hlavně ostatní viry přítomny v rostlině Diekmann, 1997). Graichen (1991) zjistil, že přítomnost carlaviru zesiluje symptomy potyvirů. Symptomy na experimentálních rostlinách se projevují jako lokální chlorózy a nekrózy, slabé zelené kroužky nebo chlorotické vyryté poškození (ICTVdB Virus Description, 2002).
SHALLOT LATENT VIRUS - SLV
Vlastnosti virových částic Virové částice jsou mírně zakřivené, dlouhé 650 nm, TIP v syrovém pórku je 80 °C, DEP je 1x10-4 až 1x10-5, LIV při 24 °C je 8-11 dní (Bos, 1982 in Šutić a kol., 1999). Žádné kmeny nebyly pojmenovány. 26
Geografické rozlišení a ekonomický význam SLV je rozšířen v zemích Asie a Evropy (van Dijk, 1993b; Barg a kol., 1994) a záznamy o výskytu jsou i z Mexika (Barg a kol., 1997). Lze ho považovat za celosvětově se vyskytující (Bos, 1982 in Šutić a kol., 1999).
Hostitelé a symptomy Přirození hostitelé viru jsou šalotka, cibule a pór (Šutić a kol., 1999). SLV systematicky infikuje Nicotiana occidentalis a N. hesperis, a dále široký okruh zástupců čeledi Alliaceae. SLV systematicky infikuje Nicotiana occidentalis a N. hesperis, a široký okruh zástupců čeledi Alliaceae, uváděno je až 80 druhů. Symptomy se na hostiteli se projevuje stejným způsobem jako u GarCLV. Pokud se vyskytují slabé symptomy na česneku, cibuli, šalotce a póru, vytváří se světle zelené proužkování na listech (Diekmann, 1997). Šutić a kol. (1999) uvádí, že na šalotce zůstává vir bez příznaků. Jeho výskyt je však spojován se současnou přítomností potyvirů, která intenzitu příznaků potlačuje (Paludan, 1980; Graichen, 1991). V kombinaci s LYSV způsobuje těžkou chlorózu nebo bílé pruhování listů, někdy může dojít až k úhynu. (Paludan, 1980 in Šutić a kol., 1999). U Chenopodium amaranticolor a Ch. quinoa se objevují nekrózy na starších listech a chlorózy na mladších listech. Jsou dobrými testovacími rostlinami (Šutić a kol., 1999). Virus se šíří mechanickým způsobem nebo mšicemi, a to neperzistentní způsobem. K nejčastějším vektorům patří Myzus ascalonicus a Aphis fabae (Bos, 1982 in Šutić a kol., 1999). Přenos SLV mšicemi je méně efektivní než u potyvirů. Vegetativní šíření SLV převažuje u česneku a šalotky (Diekmann, 1997). Virus může být přenášen mechanicky v cibuli, která je bez příznaků. Infikované cibule a mšice jsou hlavní cestou k epidemii. Těmto faktorům by měla být věnována speciální pozornost v ochraně rostlin. Doporučeným opatřením pro kontrolu jiných virů infikujících tuto skupinu rostlin je také efektivní kontrola SLV (Šutić a kol., 1999). Přenos viru semeny nebyl prokázán. Pro experimentální účely se využívají Chenopodium spp., Vicia faba (van Dijk, 1993b). SLV systematicky infikuje Nicotiana occidentalis a N. hesperis, a široký okruh zástupců čeledi Alliaceae.
27
3.4.3 Rod ALLEXIVIRUS
Tento rod se řadí do čeledi Flexiviridae. Do tohoto poměrně nového rodu Allexivirus je řazena skupina blíže nespecifikovaných virů označována souhrnným názvem Miteborne viruses. Druhy jsou svou délkou příbuzné Potyviridae, vývojově jsou mezi potyviry a carlaviry (Béss, 1999). Název rodu je odvozen od typového člena Shallot virus X. Virové částice jsou obvykle flexibilní, vláknité, o délce přiblížen 800 nm a průměru 12 nm (Agrios, 2005). Genom allerxivirů je tvořený jednovláknovou + ssRNA (Agrios, 2005; Boss, 1999). První publikace, ve které se allexivirus objevuje jako člen skupiny rostlinných virů, vyšla v roce 1992 v Moskvě (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Mezi tyto viry se řadí viry česneku (garlic virus) A, B, C, D, E, X (GarVA-E,X), Garlic mite-borne latent virus (GarMbLV), Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV), Shallot virus X (ShVX), Onion and Shallot mite-borne latent virus (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010).
Geografické rozlišení a ekonomický význam Jmenované viry jsou rozšířeny kosmopolitně (Diekmann, 1997) - záznamy o výskytu jsou z Brazílie (Filho a kol., 2004), Argentiny (Conci a kol., 2003), Japonska (Takaichi a kol., 1998), Slovinska (Barg a kol., 1997), Ruska, Holandska, Německa (Navrátil, 2008), Korei, Taiwanu, Thailandu, Francie a Velké Británie (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Allexivirus nezpůsobuje závažná onemocnění rostlin a proto nepřitahuje zvláštní pozornost fytopatologů, ale je zajímavý z hlediska studií taxonomie, struktury genomu a vztahů mezi rody, druhy a poddruhy různých virů (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010).
Hostitelé Hostitelský rozsah se vztahuje na rod Allium (Astier a kol., 2007; Diekmann, 1997). Infikuje především česnek, cibuli, šalotku, pór a divoce rostoucí druhy jako A. ampeloprasum komplex (Diekmann, 1997).
28
Symptomy Příznaky jsou obecně velmi slabé, nebo žádné (od toho název - doslovný překlad zní jako mírně nesený, skrytý vir) (Diekmann, 1997). Symptomy se na hostiteli projevují slabým proužkování, slabou mosaikou nebo mohou také zůstávat latentní, bez příznaků (Yamashita a kol., 1996). Jsou přenášeny pomocí vektora - roztoče Aceria tulipae perzistentním způsobem nebo mechanickým přenosem. Žádný z těchto virů není přenášen mšicemi (van Dijk, 1991, Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Nejsou žádné záznamy o přenosu semeny. Díky snadnému přenosu u vegetativně množených cibulovin a přítomnosti roztočů, je výskyt těchto virů v Evropě a Asii vysoký (hlavně u česneku a šalotky). K experimentálním účelům jsou používány hlavně rostliny rodu Allium, dále Chenopodium murale, C. amaranticolor, C. quinoa a Atriplex hortensis, na kterých se lépe objevují příznaky (Diekmann, 1997).
3.4.4 Rod FIJIVIRUS
Rod Fijivirus patří do čeledi Reoviridae. Dle Astier a kol. (2007) má 8 popsaných druhů. Typový člen je Fiji disease virus (Khan, Dijkstra, 2002, Caciagli, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Genom fijivirů je tvořený dsRNA (Agrios, 2005).
GARLIC DWARF REOVIRUS (GDV)
Virové části jsou ikosahedrické, dvouvrstevné, o průměru 65 - 70
nm. RNA je
dvouřetězcová, segmentovaná. Virus není přenášen mechanicky, ale vektor přenášející tento vir, není znám. Pravděpodobně se jedná o skákající hmyz. Vir je šířen také infikovaným materiálem. Hostitelem viru je česnek. Doposud je na česneku omezená distribuce a nízký výskyt tohoto viru, ale má vysoký potenciál pro zničení úrody česneku. Prvotní příznaky se projevují červenáním konečků bazálních listů. Většina z napadených rostlin neprodělává normální vývoj. Příležitostně může vývoj probíhat normálně, ale později se buď internodia netvoří, nebo jsou velice zkrácená. Rostliny mohou mít vějířovitý vzhled. V některých případech se může zdát, že napadané zakrslé rostliny se znovuobnoví, uzdraví. Ale nové listy se opět objeví se zkrácenými internodii. 29
Většina silně zakrslých listů se zbarvuje do tmavě zelené barvy. Na žilnatině se mohou objevovat zduřeniny, nádorky. Cibule napadených rostlin mají hruškovitý tvar, jsou svraštělé, scvrklé s houbovitou, porézní strukturou. I když některé stroužky mají normální velikost, většina jich je malých. Přítomnost viru byla zatím omezena jen na areál jižní Francie. Virové částice mohou být pozorovány elektronovým mikroskopem. Vir se detekuje pomocí DAS - ELISA testu (Diekmann, 1997).
3.4.5 Ostatní viry, které mohou popřípadě infikovat česnek
Podle Diekmanna (1997) se na česneku mohou vyskytnout ještě další viry, mají však pouze velice malý nebo jen lokální význam. Je to Cucumber mosaic cucumovirus, který byl detekován v Jugoslávii, Lettuce necrotic yellow rhabdovirus v Austrálii, Tobacco mosaic tobamovirus, který se vyskytl v Rusku, Tobacco rattle tobravirus, detekován v Holandsku, Dánsku a Německu (van Dijk, 1993) a nakonec Turnip mosaic potyvirus ve Slovinsku a Izraeli (Ucman a kol., 1997).
3.5
Metody detekce virů
3.5.1 Vizuální metody
Tradičně používané kontroly porostů česneku jsou založeny na vizuálním hodnocení rostlin. Tato metoda je však často nepřesná a nespolehlivá, protože některé rody virů (například carlaviry) nemusí v hostiteli vyvolat žádné symptomy. Naopak některé viry mohou vyvolávat podobné příznaky, a proto může dojít k jejich záměně. Podobné nebo někdy i stejné viry z různých geografických oblastí byly díky tomuto chybně označeny jako podobné druhy (například potyviry). (Rabinowitch, Currah, 2002)
3.5.2 Sérologické metody
Dnes patří k nejpoužívanějším diagnostickým metodám pro detekci rostlinných virů. Jsou velmi citlivé, specifické a přesné. Principem je reakce protilátky s antigenem, 30
jehož výsledkem je barevná reakce (Rabinowitch, Currah, 2002, Eichmeier, 2006). Touto metodou se zjišťuje přítomnost virů, háďátek, houbových patogenů, patogenních bakterií (Eichmeier, 2006) K nejspolehlivějším
a
nejčastěji
používaným
technikám
patří
diagnostická
imunochemická metoda Enzyme - linked immunosorbent assay = ELISA. Vyznačuje se vysokou specifičností a citlivostí, je zde možnost detekce více virů najednou (směsná antiséra). Pomocí testu ELISA lze získat i údaje o sérologické příbuznosti izolátů virů (Rabinowitch, Currah, 2002). Na mikrotitrační destičku se naváže specifická protilátka, na ni se naváže antigen v podobě extraktu zkoumaného vzorku. Přidá se konjugát protilátek s enzymem a substrát a dochází k barevné reakci, která se vyhodnocuje spektrofotometricky. Testování trvá od několika hodin až po dva dny (Žemla, 1995). Při provedení ELISA testu může ovšem docházet k chybám, způsobeným kontaminací vzorků, materiálu, nebo slabou reakcí pozitivních vzorků (Rabinowitch, Currah, 2002, UPOL, 2006 in Eichmeier, 2006). Snížení tohoto rizika umožňuje použití specifických monoklonálních a rekombinačních protilátek (Eichmeier, 2006). V rostlinné virologii se používá varianta DAS – ELISA test (Double antipody sandwich – ELISA), která je založena na dvojité reakci protilátka – antigen (Dovas a kol., 2001; Conci a kol., 1999). One - site - testing: tkáňový otisk ELISA je komerční rychlá metoda pro velké množství vzorků. Testovací sady jsou vhodné zatím jen pro určité viry a bakterie. Citlivost metody je vyšší pro detekci virů než bakterií a je vhodnější pro rostliny, které už vykazují příznaky. Testování trvá několik minut (Eichmeier, 2006).
3.5.3 Molekulárně genetické metody (PCR)
Jsou určeny pro nejškodlivější rostlinné viry a bakterie (Eichmeier, 2006). Polymerázová
řetězová
reakce
=
PCR
(Polymerace
Chain
Reaction)
patří
k nejperspektivnějším metodám spolehlivější a snadnější identifikace. Byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii koncem roku 1983 (Rabinowitch, Currah, 2002).
31
Technika je založena na identifikaci specifických úseků nukleové kyseliny pro daný organismus (Saiki a kol., 1988). Je to jednoduchá metoda, kde stačí velmi malé množství původního vzorku (teoreticky jediná molekula DNA). K detekci RNA virů se používá specifická, vysoce účinná molekulární metoda Reverse Transcription PCR = RT PCR (Takaichi a kol., 1998, 2001; Dovas a kol., 2001 in Rabinowitch, Currah, 2002).
3.5.4 Elektronová mikroskopie
Jedná se o identifikace virů vizualizací izolovaných virionů obarvených protilátkami (Dovas a kol., 2001; Rabinowitch, Currah, 2002). Je to velice citlivá a přesná metoda. Ale velice náročná na vybavení, kvalifikované specialisty a finance (Rabinowitch, Currah, 2002). Používá se jako jeden z hlavních způsobů zkoumání ve virologii (Wikipedie, 2010). Elektronový mikroskop je podobný optickému, kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optické čočky elektromagnetickými. Vynálezcem je německý fyzik Ernst August Friedrich Ruska, který za svůj objev v roce 1986 získal Nobelovu cenu za fyziku (Wikipedie, 2010). Ve virologii se používá transmisní typ el. mikroskopu,
nebo imunoelektronová
mirkorskopie. Potřeba je měděná nebo niklová mřížka potažená vrstvou umělé hmoty. Pro zvýraznění struktur se používají negativní barviva (kyselina fosfowolframová, molybdenan amonný, uranyl acetát). (Wikipedie, 2010)
3.6
Metody eliminace virů na česneku v podmínkách in vitro
3.6.1 Meristémové kultury (metoda izolace meristému)
Po mnoho let byly meristémové kultury využívány celosvětově pro produkci viruprostého materiálu. Tato metoda se poprvé objevuje v pracích Morela - Morel a Martin, 1952, 1955 (Novák, 1990). Meristémové buňky tvoří prostředí, které není vhodné pro množení virů, tudíž jejich koncentrace zde bývá nejnižší (Šebánek, Sladký, 32
1988). Embryonální buňky nejsou v meristémovém pletivu česneku napadeny nebo skoro vůbec napadeny virovými infekcemi, na rozdíl od virem infikovaných stroužků a jiných rostlinných tkání. Z toho důvodu mohou být rostliny pěstované z meristémové kultury viruprosté (Novák, 1990; Ohkoshi, 1991, Wang a kol., 1994, in Rabinowitch, Currah, 2002). I když někteří autoři uvádějí přítomnost virových částic ve vrcholových částech meristémů, v explantátových kulturách je tato metoda nejvíce používaná a nejlépe propracovaná (Novák, 1990). Úspěšnost podílu získávání zdravých rostlin je odrůdově závislá (Rabinowitch, Currah, 2002). Nejlepší období k odebírání meristémů je podle Havránkové, Havránka (1987) prosinec až leden. Meristémových buněk je však málo a jsou těžko oddělitelné od infikovaných buněk (Ma a kol., 1994, in Rabinowitch, Currah, 2002). Pro praxi platí, že čím je primární explantát menší, tím je pravděpodobnější zisk viruprostého jedince. Na druhou stranu čím je izolovaný vrchol menší, tím je nižší jeho životaschopnost (Novák, 1990). Většinou pokusů byl dokázán vysoký počet embryonálních buněk bez virů pomocí kultivace malých vyříznutých špiček. Další snižování velikosti vzorkovaných tkání není proto žádoucí (nemá praktické využití), ačkoli teoreticky je to technicky možné (Rabinowitch, Currah, 2002). Meristématické buňky jsou malé a všechny mají přibližně stejné rozměry (tzv. izodiametrikcé), buněčná stěna je tenká, jádro velké, místo centrální vakuoly mají několik malých, místo chloroplastů mají drobné, nezelené plastidy. Mezi jednotlivými meristematickými buňkami se nenacházejí interceluláry (Procházka a kol., 2003). Některé, ještě nevyvinuté embryonální buňky mohou získat vir od sousedních, mírně vyspělejších, napadených buněk a to prostřednictvím nově vytvořených plasmodesmat (Rabinowitch, Currah, 2002). Odstraněné meristémy jsou složeny z embryonálních kmenových buněk a ze sousedních buněk, které jsou v procesu diferenciace a proplétání mezibuněčně, cytoplasmaticky spojeny pomocí plasmodesmat. V praxi nicméně existují tkáně složené z kmenových i sousedních buněk a mohou obsahovat více či méně virových částic (následně se objevující rostliny mohou být buď viruprosté, nebo infikované). Jsou proto potřebné velice citlivé metody k detekci virů již v brzkých stádiích vegetativní reprodukce (Rabinowitch, Currah, 2002).
33
Malago´n a kol. (2006) uvádí, že léčbu pomocí meristémů přežilo v průměru 41,7% explantátů z Taiwanu a 34,3% z Chilena a z obou těchto kultivarů bylo testováním ELISA průměrně 64% negativních na potyviry. Jako médium přitom bylo zvoleno Gamborgovo B-5 medium se suplementy: 0,5 mg/l 2 - iP, 0,1 mg/l NAA, 0,8% agar, pH
5,8 (jako propagační médium), MS medium (Murashige and Skoog 1962) s
přídavkem 0,5% aktivního uhlí (AC) a 1,2% sacharózy bez růstových regulátorů (médium pro tvorbu cibulí) a MS medium s přídavkem 2 mg/l BA (6benzylaminopurin),, 0,5 mg/l IBA - kyselina Indolyl-3-máselná (médium pro rašení stroužků). Kultivace probíhala v podmínkách 16 hodin světlo, 8 hodin tma, při teplotě 25ºC (±2 ºC). Negativní rostliny byly kultivovány 2 měsíce na médiu pro tvorbu cibulí a po vytvoření mikrocibulí na médiu pro rašení stroužků. Na stejných médiích a ve stejných podmínkách česnek ozdravovala i Bruna, 1997. Senula a kol. (2000) kultivovali česnek in vitro na MS médiu. ELISA testem bylo testováno 631 rostlin. Průměrně bylo ozdraveno 37,7% rostlin první rok a 26,6% rostlin druhý rok. Nejčastěji se vyskytujícím virem u pozitivních vzorků byl GCLV, kolem 50%. Ostatní viry byly eliminovány ve vysoké frekvenci (OYDV se u pozitivních vzorků vyskytoval průměrně 5-13%,
LYSV 7-12%). Pateña a kol. (2005) dosáhli
výsledků, při kterých byla u první preparace většina vzorků pozitivních na viry, kdežto po opakování mikropropagace byla většina ozdravena od hlavních virů. Podařilo se jim ozdravit 75% vzorků od virů OYDV, LYSV, GCLV, SLV, MbFV a virů česneku A, B a C. Ondrušiková a kol.(2009) eliminovali komplex virů u česneku preparací meristémů a zjistili, že nejhorší výsledky jsou u GCLV, který se po ozdravení nejčastěji vyskytoval. Conci a kol. (2005) uvádí 80-90% vyvinutých rostlin po preparaci meristému. Procento ozdravení bylo závislé na viru a na jednotlivých genotypech česneku. Celkově bylo kultivováno 11 odrůd a testováno na viry OYDV, LYSV, GCLV, SLV, a GarMbFV. Nejlépe se dařilo ozdravit česnek od virů OYDV a LYSV a to u většiny odrůd 100%. Naušová a kol. (2008) udávají 85-95% ozdraveného materiálu v případě OYDV a LYSV metodou izolace meristému.
34
3.6.2 Termoterapie
V průběhu termoterapie jsou rostliny podrobeny teplotám 35-40°C a to během několika týdnů (Navrátil, 2010). Při teplotách nad 38 °C je množení virů v rostlinných buňkách redukováno nebo dokonce zcela zastaveno. Zároveň rostlinné meristematické buňky pokračují v dělení a replikaci spíše pomaleji. Následující ošetření vysokými teplotami zpomaluje rozmnožování virů, virové částice jsou dostupné pro pohyb do nově formovaných buněk. V těchto velmi přísných podmínkách mohou být nově vzniklé tkáně viruprosté (Rabinowitch, Currah, 2002). Použitím spojení meristémové kultury s termoterapií se zvyšuje šance na regeneraci a vznik viruprostého materiálu. Efektivita je však genotypově závislá (Rabinowitch, Currah, 2002, Conci a kol., 2005). Termoterapie má ale i negativní stránky, jako například zpomalené nebo latentní projevy u odvozených rostlin, u geneticky méně stabilních jedinců může termoterapie, jako nefyziologické teplotní rozmezí, podporovat zvýšení frekvence somatických mutací (Novák, 1990). Kromě toho intenzita tepelné úpravy je pro každý kultivar rozdílná. Viry česneku jsou termoterapií ovlivněny rozdílně. Termoterapie byla například velmi efektivní v eliminaci u LYSV, ale slabý efekt byl naopak u OYDV. Pro zajištění úspěchu léčby, je proto nutné testování každého viru odděleně (Rabinowitch, Currah, 2002). Bylo zkoušeno i ozdravení česneku horkou vodou (55ºC po dobu 5 minut), avšak tato metoda redukovala životnost o 50% a nebyla dokázána eliminace virů (Senula a kol., 2000). V meristémové kultuře je regenerována jen jedna rostlinka z jednotlivého meristému. Hromadná regenerace výhonků přes meristémové kultury izolovaných z rostlin ozdravených termoterapií může vyprodukovat velké množství zdravých rostlin v co nejkratším čase. Nejsou o tom však žádné poznatky, i když úspěšné rašení z meristémových kultur je známo bez předchozí termoterapie (Ucman a kol., 1997, Rabinowitch, Currah, 2002). Ucman, a kol. (1997) uvádí postup ozdravení takový, že se cibule česneku rozdělí na stroužky a jsou pěstovány ve sterilizované půdě. Následně jsou rostliny ponechány v pěstírenských komorách za udržení pěstebních podmínek: teplota 23 °C (± 2 °C), 16 hodin světla a 8 hodin temné periody, a 70 % relativní vlhkosti. Když jsou rostliny asi 30 cm vysoké, jsou ozdravovány termoterapií - 7 dní při teplotě 30 °C a následujících 35 dní při 36 °C. Životnost rostlin, které prošly termoterapií je 90 - 95 %. Izolované 35
meristémy jsou srovnávány na dvou různých médiích. Po 4 týdnech (velikost výhonů asi 2 - 3 cm) se oddělí meristém. Procento regenerovaných meristémů je přibližně stejné jako na médiu neošetřeném růstovými regulátory, tak na médiu ošetřeném (buď kyselinou indolyl - 3 - octovou = heteroauxin = IAA a benzyladeninem = sk. cytokininů = BA). Procento se ale u obou zvyšuje po ošetření rostlin termoterapií. Xu Peiwen a kol. (1994) udává 95 % regenerovaných rostlinek po ošetření termoterapií. Při teplotě 36 °C po dobu 60 dnů se již procento regenerovaných explantátů snížilo (Conci and Nome, 1991 in Ucman a kol., 1997). Malagón a kol. (2006) u ozdravení dvou odrůd česneku termoterapií využil teploty: první týden 32ºC, dále dva týdny 36 ºC a nakonec tři týdny 38 ºC. ELISA ukázala, že 63% první odrůdy a 70,9% druhé odrůdy, které přežily termoterapii, byly negativní na potyviry. Bruna A. (1997) měla při použití termoterapie 100% úspěšnost při ozdravení česneku od OYDV. První týden vystavila stroužky teplotě 30 ºC a dalších 38 dní byla teplota zvýšena na 38 ºC. Při delším vystavení zvýšené teplotě již docházelo ke snižování životnosti ozdravených rostlinek. Po 48 dnech byla životnost snížena na 95%, po 75 dnech až na 65%. Senula a kol. (2000) volili pro eliminaci virů teplotu 36ºC po dobu 6 týdnů. Tato kombinace neredukovala životnost rostlin a byla příznivá pro eliminaci virů. V kombinaci s ribavirinem byly viry OYDV, LYSV a SLV redukovány úplně, MbFV byl redukován na 12%, a GLCV byl po terapii stále přítomen u 10 % vzorků. Virové infekce před ozdravením byly přítomny ve všech 100 vzorcích, nejčastějším virem byl GCLV, který se nacházel ve více než 90% vzorků. Pateña a kol. (2005) zkoušeli před ozdravením ošetření stroužků chladem (5ºC po dobu 1-4 týdnů) a zároveň při běžné pokojové teplotě. Následovala termoterapie vodou o teplotě 50ºC dvě hodiny. Výsledky ukazují 100% ozdravení u ošetření termoterapií při přípravě jak 4 týdny při teplotách 5ºC, tak 4 týdny při pokojové teplotě. Vzorky byly testovány na OYDV a LYSV. Bertaccini a kol. (2004) ozdravovali česnek pomocí preparace meristémů. Vzorky, které byly negativní, postupně převedli do podmínek in vivo, pozitivní vzorky dále podrobili termoterapii. Polovina vzorků byla prvních 25 dní vystavena teplotě 33ºC, další dny byla teplota zvyšována o 1ºC na výsledných 36ºC. Druhá polovina vzorků byla uchována 20 dní při 36ºC, poté následovala opětovná preparace meristémů a kultivace při 36ºC. Výsledky testování RT-PCR ukázaly 50% úspěšnost v eliminaci mite-borne virů. Conci a kol. (2005) uvádí úspěšnost ozdravení metodou izolace meristému s nebo bez použití termoterapie v závislosti na odrůdě a konkrétním viru. Termoterapie byla uskutečněna při stálém osvětlení, teplotě 36ºC po dobu 30-40 dní. Po termoterapii dosáhli nižší frekvenci 36
vývoje rostlin (55-57%), kdežto při izolaci meristémů bez použití vysokých teplot, byl získán větší počet vyvinutých rostlin (80-90%). Ve většině případů byla termoterapie účinná k získání viruprostých rostlin, nicméně někdy se neprojevily žádné rozdíly oproti metodě izolace meristému. Potyviry (OYDV, LYSV) a carlaviry (GCLV) byly u většiny ozdravovaných kultivarů snadno eliminovatelné. Eliminace allexivirů byla obtížnější. Sidaros a kol. (2004) měli největší procento vyvinutých rostlin při velikosti preparovaných meristémů 5 mm a médiu MS+ 0.5 mg/L BA. Procento viruprostých rostlin se lišilo dle kultivaru, ale nepřesáhlo 50%.
3.6.3 Chemoterapie
Další možností eliminace virů z rostlinných tkání je použití chemikálií, které zasahují do rozmnožování nukleových kyselin a omezují tak množení virů (Rabinowitch, Currah, 2002). Metoda je založena na principu RNA polymeráz pomocí látky ribavirin (Navrátil, 2009). Antivirové látky mohou být použity ve fázi předpůsobení na rostlinu, izolovaný vrchol nebo aplikací do kultivačních médií (Novák, 1990). Podle Rabinowitche, Curraha (2002) je tato metoda méně úspěšná, protože ozdravované tkáně mohou být také poškozeny. Chemoterapie může také způsobovat mutace v kultivovaných tkáních a tudíž změnit zemědělské vlastnosti česneku. Kromě toho chemikálie jako 5 - fluorouracil a 6 - azoquanin jsou toxické a tím nebezpečné pro uživatele a životní prostředí. Použití chemoterapie ke snížení replikace virů proto není doporučováno experimentům prováděným ve volné půdě. Ribavirin (původně známý jako Virazole) 1-((2R,3R,4S,5R) -3, 4 - dihydroxy - 5 - (hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl) - 1H 1,2,4 -triazole - 3 - carboxamide), C8H12N4O5 Jedná se o syntetickou látku, strukturálně podobnou guaninu, nevyskytující se v přírodě. Poprvé byl syntetizován v roce 1970 Josephem T. Witkowskim (Wikipedia, 2009). Inhibuje replikaci širokého spektra RNA a DNA virů, ale mechanismus jeho působení není plně znám. Je snadno rozpustný ve vodě (Wikipedia, 2009, Duchefa, 2006-2008). Jako virostatikum se skladuje při pokojové teplotě. Ribavirin se řadí mezi teratogeny (může poškodit plod v těle matky). (Duchefa, 2006-2008) 37
Napadený česnek může být ozdravován například přidáním Ribosome Inhibiting Proteins - ribosom inhibující bílkoviny - (RIP) PAP - II (Bertaccini a kol., 2004). Po 1-3 měsících byly rostliny testovány. Z celkových 55 rostlin byly jen 3 negativní na miteborne viry. Malagón a kol. (2006) použili pro chemoterapii ribavirin. Aplikovali jej na embrya česnekových stroužků v aseptických podmínkách. Pro obě ozdravované odrůdy byla tato metoda neefektivní (27% a 34,8% viruprostých rostlin). Senula a kol. (2000) použili ribavirin v množství 50 a 100 mg/l a to na médium určené pro vypreparované meristémy - indukční médium (MS s vitamíny a hormony). Na tomto médiu byly meristémy kultivovány 6 týdnů při 25ºC. Ribavirin redukoval regeneraci rostlin, nicméně podporoval eliminaci virů. GCLV a SLV byly významně redukovány. GCLV poklesl z 66,5% k 22,2% a SLV z 23,7% k 2,8%. U OYDV, LYSV a MbFV nebyl pokles viru významný. Aplikace 50mg/l ribavirinu do indukčního média zvýšila počet viruprostých rostlin až o 50%. Použitím 100mg/l ribavirinu bylo dosaženo 100% úspěšnosti v ozdravení, ale u rostlin se objevilo sklovatění a nebyly použitelné. Sidaros a kol. (2004) přidali jako inhibitor virových infekcí ribavirin v množství 50mg/l a toto aplikovali u dvou odrůd. Meristémy byly na tomto médiu kultivovány ve velikosti 1, 3, a 5 mm. Jako nejoptimálnější se jevila varianta 3 mm. Produkce viruprostých rostlin byla 100%.
3.6.4 Stem - disc dome culture - metoda stonkových disků
Podle Ayabe a Sumiho (2001) je to účinná metoda, kdy za pomocí tkáňových kultur je možné eliminovat viry z infikovaných rostlin česneku. Ze spodní části cibulky je vyříznut tenký plátek (disk), který je dále kultivován na médiu a z něho vyrůstá mnoho nových struktur. Mikroskopické pozorování příčného profilu tkání v různých vývojových stádiích (nové struktury, rašící pupeny a výhony) prokázalo vztah mezi eliminací virů a vývojovým stádiem a organizací cévních svazků. Histologické pozorování ukázalo, že vnitřní uspořádání buněk i procesy formování těchto struktur, jsou podobné jako u meristémových kultur z česnekových stroužků. Tyto objevy naznačily, že individuální 38
nová struktura má vlastnosti podobné meristémovým kulturám, včetně vlastnosti být viruprostá. Stem - disc kultura může tedy nahradit meristémovou kulturu pro produkci bezvirózní sadby česneku. Byl srovnáván vzhled vyvíjejících se listů česneku ozdravených metodou stem - disc kultury, s jejich rodiči infikovanými virem. Listy rodičovských rostlin měly znatelné žlutavé mozaiky a pruhy, zatímco česnek ze separované nově vzniklé struktury stem disc kulutry nevykazoval žádné symptomy a naopak listy měly tmavě zelenou barvu. To svědčí o naprosté nebo částečné eliminaci virů v rostlinách česneku pěstovaných in vitro metodou SD - Dome culture (Ayabe, Sumi, 2001).
3.7
Multiplikace česneku v podmínkách in vitro
Protože česnek netvoří semena, rozmnožuje se vegetativně převážně výsadbou stroužků. Pomocí vegetativního reprodukčního materiálu se ale přenášejí virové choroby, které negativně ovlivňují vývoj jedince i celého porostu a tím pádem i výnos. Je proto nutné najít vhodný ozdravovací a rozmnožovací způsob, který přispěje ke zdravé produkci česneku (Kudělková, 2008). K těmto způsobům patří také meristémové kultury samotné, nebo v kombinaci s termoterapií a chemoterapií, „stem - disc dome culture“, dále somatická embryogeneze.
3.7.1 Meristémové kultury
Patří k nejběžnějším způsobům rozmnožování rostlin v explantátových kulturách. Jedinci vzniklí z této kultury mají stejné vlastnosti jako mateřská rostlina a navíc jsou viruprostí (Kincl, Krpeš, 2006). Embryonální buňky totiž nejsou v meristémovém pletivu napadeny nebo skoro vůbec napadeny virovými infekcemi, na rozdíl od jiných, virem infikovaných rostlinných tkání (Novák, 1990). Různí autoři uvádí různá média a jejich složení s použitím hormonů v různých koncentracích, které používají při množení česneku touto metodou. Například Plaper a kol. (1991) uvádí jako podpůrnou látku růstový regulátor kyselinu jasmonovou (jasmonic acid, JA) v různých koncentracích. V koncentraci 0,1 µM 39
stimulovala vývoj izolovaných česnekových cibulí. Naopak v koncentraci 10 µM způsobila jejich retardaci. Kyselinu jasmonovou aplikovali do B5 média ve fázi, kdy byly izolované meristémy narašeny 5-10 mm. Vliv JA na tvorbu kořenů a cibulí byl dále zkoumán. Ucman a kol. (1997) zjistil v průměru nejlepší multiplikační médium s koncentrací JA 5 µM a koncentrací 5 µM isopentenyl-adeninu. JA byla aplikována, jakmile byly izolované meristémy po 4 týdnech přeneseny na multiplikační médium. Byl zjištěn stimulační efekt na tvorbu výhonků u meristémů. Lubraco a kol. (2000) zkoušeli multiplikaci česneku in vitro pomocí mykorhizy. Pro inokulaci byla zvolena Glomus mosseae a byla aplikována na rostlinky izolované z vysterilizovaných česneků. Po 45 dnech bylo mycelium prorostlé v médiu, ale nedošlo k vlastní mykorhize, protože nedošlo k penetraci houby do kořenů.
3.7.2 Stem - disc dome culture - metoda stonkových disků
Podle Ayabe a Sumiho (2001) je to vyvinutá účinná metoda tkáňové kultury eliminující viry v infikovaných česnekových rostlinách. Stonkové disky se jeví jako explantáty s vysokým multiplikačním potenciálem. Více jak 90% výhonků takto vzniklých, formovalo cibulky (Aybe, Sumi, 1998). Ozdravený meristém se pokládá na médium s vysokým obsahem sacharózy. Po čase se vytvoří cibulky. Ze spodní části cibulky je odříznut tenký plátek, asi 2 mm tlustý (disk), uloží se na médium a z něho vyrůstá mnoho nových struktur (Ayabe, Sumi, 2001). 15 z 25 nových struktur, které vytvářely explantáty stem - disc dome kultury z jediného stroužku česneku bylo udržováno na Linsmaierově a Skoogově médiu bez fytohormonů jako běžná kultura. Když tyto nové struktury dosáhly více než 5 cm a zakořenily (po 8 týdnech), byly úspěšně přeneseny do půdy. Následné rostliny nevykázaly na svých listech žádné příznaky virové infekce. A to i přesto, že byly použity stroužky česneku z kultury, kde se objevily symptomy jako mozaika, nebo žlutá pruhovitost na listech. Zkoumání virové infekce ve třech generacích ukázalo, že viry jsou během kultury vyřazeny. Mikroskopické pozorování příčného profilu tkání v různých vývojových stádiích (nové struktury, rašící pupeny a výhony) prokázalo vztah mezi eliminací virů a vývojovým stádiem a organizací cévních svazků. Histologické pozorování ukázalo, že vnitřní uspořádání buněk i formovací procesy těchto struktur, jsou podobné jako u 40
meristémových kultur z česnekových stroužků. Tyto objevy naznačily, že individuální nová struktura má vlastnosti podobné meristémovým kulturám, včetně vlastnosti být viruprostá. Stem - disc kultura může tedy nahradit meristémovou kulturu pro produkci bezvirózní sadby česneku (Ayabe, Sumi, 2001). Metodu aplikovali u dvou odrůd. Nově vzniklé struktury jsou odstraněny ze stem - disc kultury a přeneseny do LS media bez použití fytohormonů a vyvinuté uvnitř in vitro výhonků, asi 1 cm dlouhých (po 2 týdnech). Izolované nové struktury mohou být použity jako explantát pro in vitro kultury. Navíc na tom samém médiu výhonky produkovaly kořeny a tyto kořeny byly následně úspěšně přeneseny do hrnků naplněných zeminou (Ayabe, Sumi, 2001). Na listech česneku infikovaném viry se objevily žlutavé mozaiky a na některých i pruhy, zatímco listy zdravé jsou tmavě zelené barvy s žádnými symptomy. Zdravé rostliny byly tudíž snadno rozlišitelné od infikovaných již svým vzhledem. Byl srovnáván vzhled vyvíjejících se listů česneku ozdravených metodou stem - disc kultury, s jejich rodiči infikovanými virem. Listy rodičovských rostlin měly znatelné žlutavé mozaiky a pruhy, zatímco česnek ze separované nově vzniklé struktury stem disc kulutry nevykazoval žádné symptomy a naopak listy měly tmavě zelenou barvu. To svědčí o naprosté nebo částečné eliminaci virů v rostlinách česneku pěstovaných in vitro metodou SD - Dome culture (Ayabe, Sumi, 2001).
3.7.3 Somatická embryogeneze
Jedná se o metodu explantátových kultur, při které vzniká jedinec nepřímo (je spojena s předchozí tvorbou kalusu), z diploidní somatické buňky - vznik embrya z jiných buněk než zygot (Kincl, Krpeš, 2006; Procházka a kol., 2003). Experimentálně toto zjištění bylo dokázáno Reinertem a Stewardem a kol. v roce 1958 u mrkve (Novák, 2005). Vznik zárodku somatickou embryogenezí není stejný jako proces zygotické embryogeneze, ale má jisté společné rysy: buňky na začátku vývoje obsahují typický protoplast a hustou cytoplazmu, aktivně se dělí a tvoří skupinky embryogenních buněk. Dalším rysem je pak způsob vyvíjecích se zárodků, jak pronikat do zárodečného vaku, ve kterém dochází při vzájemné konkurenci k ukončení vývoje (Procházka a kol., 2003). Explantátové kultury mohou tedy regenerovat přímo na diferencovaných 41
pletivech,
nebo
před
regenerací
orgánů
nebo
embryí
vytvoří
kalus
(z
parenchymatických buněk nebo z prokambia). Přímá regenerace je daleko méně častá a lze k ní řadit například vznik somatických embryí z nucellu nebo pokožky. Kalus vyrůstá na povrchu řezné plochy explantátu. Důležitý je přitom co největší styk média s řeznou plochou, polarita explantátu, roční doba, ve které byly explantáty odebírány, hloubka dormance a kultivační médium. Zde patří k nejdůležitějším parametrům především minerální výživa (hlavě dusík a železo), osmotická hodnota a růstové látky. Na počátku kultivace je nezbytné zařadit látky auxinové povahy. Při vlastní embryogenezi je podmínkou přítomnost cytokininů a na další fáze má pozitivní vliv kyselina abscisová (Procházka a kol., 2003). Gibereliny somatickou embyrogenezi převážně inhibují (Novák, 1990). Explantátem (izolovaná část z celistvého organismu) pro kultivaci in vitro mohou být spóry, semena, vegetativní a generativní orgány, protoplasty, buňky a pletiva (Procházka a kol., 2003; Šebánek, Sladký, 1988). Obecně platí, že mladá pletiva, u kterých probíhá aktivní dělení, jsou pro embryogenezi vhodnější (Novák, 1990). U česneku bývají používány kořenové a listové explantáty (Havránek, 2005). Fereol a kol. (2005a) použil jako explantáty mladé vnitřní listy v bazální části rosliny z desinfikovaných stroužků. Byly vybrány česneky vzniklé izolací meristému. Byly uloženy po dobu 4-5 měsíců při 15°C od sklizně, a převedeny na 3 týdny do 5 °C, aby překonaly dormanci. Listové explantáty vytvářely kalusové kultury a ty poté sloužily pro somatickou embryogenezi. Jak uvádí Fereol a kol. (2005b) a Mukhopadhyay a kol. (2004), pro somatickou embryogenezi je možné použít také tekutá média.
42
Obr. 2. Buňky izolované embryogenezí (A; 0,025mm) a vzniklé embyo (B;0,5mm). (Fereol, 2005)
Haque a kol. (2000) použili jako explantát při multiplikaci kořeny.
Povrchově
desinfikované stroužky byly nejprve kultivovány 15 dní ve zkumavkách na směsi destilované vody a 0,7% agaru. Poté byly odebrány kořenové explantáty a dále kultivovány na MS médiu s růstovými regulátory. Procento explantátů, které vytvořily výhonky, bylo v závislosti na odrůdě v rozmezí 7,9 - 95, 2%. Formování cibulek bylo zjevné u všech odrůd, ale značně se lišily velikostí. Odrůda ´White roppen´, u které se multiplikace dařila nejvíce, byla následně převedena do podmínek ex vitro. Fereol a kol. (2002) použili jako explantáty pro somatickou embryogenezi kořeny i mladé listy. Kalus se produkoval na obou variantách, ale u listů se projevil vyšší potenciál pro embryogenezi. Až 75% vzniklých kalusů diferencovalo somatická embrya. 30% z těchto embryí bylo převedeno do nesterilních podmínek. Rostliny tvořily výhony i kořeny.
43
Obr. 3. Kalus s embrygenetickou kulturou (A) a rostliny vzniklé somatickou embryogenezí (J). (Fereol, 2002)
44
4 4.1
METODIKA Laboratoř
Pokus byl uskutečněn na ZF v Lednici, na ústavu Mendeleum v in vitro laboratoři. Pracuje se zde na ozdravování rostlin in vitro, množení certifikovaných podnoží ovocných dřevin in vitro, převody rostlin do nesterilních podmínek. V laboratoři se nachází běžné vybavení, které je potřeba pro práci in vitro (prostor pro kultivaci in vitro, autokláv, demineralizační soustava pro úpravu vody, profimyčka, skladovací prostory, laboratorní sklo, chladnička, mraznička, sušárna a dále nástroje a laboratorní vybavení, jako např. třepačka, váhy, pH metr, elektronické míchadla s ohřevem, stojany a podobně). Prostor pro kultivaci in vitro (zároveň slouží i jako kultivační místnost) je vybaven regály pro kultivovaný materiál, klimatizací, zářivkami a spínacími hodinami (nastavení fotoperiody) a nezbytným flowboxem (speciální laminární box) pro aseptickou manipulaci. V prostoru flowboxu se nachází stojan pro pinzety a skalpely, nádoba s lihem a sterilační kostka, nastavená na 250ºC, pro sterilaci pracovních nástrojů. Při preparaci meristémů je součástí také binokulární lupa.
4.2
Výběr a popis materiálu
K pokusu byl použitý materiál, který zároveň slouží pro práci na projektu NAZV QH71228 (Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace). Materiál pocházel z oddělení Genové Banky VÚRV v Olomouci. Bylo vybráno pět odrůd a ty byly postupně ozdravovány. Všechny byly napadeny komplexem virů OYDV, LYSV, SLV a GCLV. Odrůdy vybrané pro pokus byly ´Anton´, ´Mako´, ´Tristan´, ´N9A´ a ´ D´Alsace Freres´.
45
Odrůda ´N9A´
Obr. 4. ´N9A´ (Stavělíková, 2010) ´N9A´ je česká krajová odrůda. Patří k odrůdám polovybíhajícím do květu. Pacibulky se nacházejí v různých částech pseudostonku. Je to středně silná rostlina, listy jsou světle zelené, polovzpřímené. Cibule je kulovitá s vystouplým podpučím a smetanovými obalovými suknicemi. Počet stroužků se pohybuje v rozmezí 11 – 15 ks a jsou barvy žluté až světle hnědé, uspořádány pravidelně ve více vějířovitých skupinách (Stavělíková, 2010).
Odrůda ´Tristan´
Obr. 5. ´Tristan´ (Stavělíková, 2010)
´Tristan´ je česká odrůda. Modrý paličák pro podzimní výsadbu vyšlechtěný v roce 1988 a do Státní odrůdové knihy zapsána v roce 1998. Vegetační doba je 265 dnů a sklízí se obvykle v červenci. Odrůda odolná vymrzání a velmi dobře skladovatelná. Výnos z 10 m2 je 5-8 kg cibulí (Tagro s.r.o., 2007).
46
´Anton´
Obr. 6. ´Anton´ (Stavělíková, 2010)
´Anton´ je česká odrůda. Do Státní odrůdové knihy byla zapsána v roce 2000. Jedná se o ozimý širokolistý nepaličák, někdy tvořící krátký stvol. Cibule je středně velká, vnější suknice šedobílá s výraznými fialovými skvrnami. Stroužky jsou středně velké, v cibuli nepravidelné, v počtu 8 – 12 ks. Listy jsou střední až dlouhé, vzpřímené, tmavě zelené. Je to výnosná odrůda s dobrou skladovatelností a sklízí se počátkem července. Velmi vhodná pro sklizeň na zeleno (Kozák, 2009).
´D´Alsace Freres´
Obr. 7. ´D´Alsace Freres´ (Stavělíková, 2010)
Tato odrůda je francouzská. Je to paličák s hodně malými pacibulkami. Rostlina je středně silná a má zelené vzpřímenými listy. Cibule je kulovitá s vystouplým podpučím a béžovými obalovými suknicemi. Stroužky jsou červené, pravidelně uspořádané v počtu 2– 4 ks (Stavělíková, 2010).
47
´Mako´
Obr. 8. ´Mako´ (Stavělíková, 2010)
´Mako´ je maďarská odrůda 60-70 cm vysoká, s hustými zelenými listy. Cibule se skládá z 6-8 stroužků s šedavě bílými suknicemi. Vegetační doba je středně dlouhá. Měl by být vysazen do poloviny října, protože přezimuje s bohatou vegetací a sklizeň probíhá ke konci června. Odrůda je vysoce mrazuodolná. Výnos se pohybuje mezi 1520 t.ha-1.
4.3
Příprava rostlinného materiálu
Pořadí odrůd bylo stanoveno systematicky, podle zdravotního stavu česnekových cibulí. Z cibulí, které vykazovaly vizuálně nejhorší vzhled, byly založeny první pokusy. Cibule byly nejprve rozděleny na jednotlivé stroužky, které byly následně zbaveny obalových šupin. K pokusu byly vybrány jen zdravé, nepoškozené stroužky.
Obr. 9. Stroužky nevhodné pro pokus
48
Naloupané stroužky byly vloženy do nádoby (kádinka) s vlažnou vodou a smáčedlem (saponát), pro lepší účinek desinfekčního činidla. Ostatní činnosti již probíhaly ve sterilním prostředí flowboxu. Byla slita voda se saponátem a následovala povrchová desinfekce. Jako desinfekční činidlo byl zvolen 0,2% chlorid rtuťnatý, který byl nalit do nádoby se stroužky tak, aby byly všechny namočeny. Při této práci bylo nutné dbát zvýšené bezpečnosti, protože se jedná o zdraví nebezpečnou látku, a proto bylo nutné použít gumové rukavice. Doba působení HgCl2 byla u všech odrůd 13 minut. Po uplynutí stanovené doby byl HgCl2 slit do zvláštních nádob a byl poslán ke speciální likvidaci. Stroužky byly poté třikrát promývány, pročišťovány od zbytků HgCl2. K tomuto účelu byla použita destilovaná voda, které byla ještě sterilována v autoklávu. Ve čtvrté dávce této vody byly stroužky ponechány a připraveny k založení pokusu.
4.4
Příprava médií
Pro pokus byly potřeba tři druhy médií. Médium Murashige, Skoog (1962) bez hormonů (pracovní označení C0), které bylo určeno pro založení česnekových in vitro kultur, tzn. médium, na které byly vkládány oloupané, desinfikované stroužky. C0 médium s přidáním dvou různých dávek ribavirinu bylo určené pro chemoterapii a MS médium s přidáním hormonů (pracovní označení C1) použité pro vypreparované meristémy.
4.4.1 Příprava C0 média
V destilované vodě byl na míchadle s ohřevem rozpuštěn agar a postupně přidávány makroelementy, mikroelementy, železo, vitamíny a sacharóza. Na 1000 ml destilované vody (pro uvaření litru média) bylo potřeba 6000 mg agaru. Po jeho rozpuštění byly přidány ostatní jmenované suplementy. 30 000 mg sacharózy bylo rozpuštěno v destilované vodě a vmícháno ke směsi. Médium bylo převařeno a teplota ztlumena. Konečné pH 6 bylo upraveno 5% NaOH. Makroelementy v mg.l-1: NH4NO3 - 1650
49
KNO3 - 1900 MgSO4·7 H2O - 370 KH2PO4 - 170 CaCl2·2 H2O - 440 Mikroelementy v mg.l-1: H3BO3 - 6,2 MnSO4·4 H2O - 22,3 ZnSO4·7 H2O - 8,6 KI - 0,83 Na2MoO4·2 H2O - 0,25 CuSO4·5 H2O - 0,025 CoCl2·6 H2O - 0,025 Železo v mg.l-1: Na2EDTA·2 H2O - 37,3 FeSO4·7 H2O - 27,8 Vitamíny v mg.l-1: kyselina nikotinová - 0,5 pyridoxin - 0,5 thiamin - 0,1 myo-inozitol - 100 Uvařené médium bylo rozléváno do velkých zkumavek automatickým dávkovačem média v množství přibližně 10 ml na zkumavku. Zkumavky byly poté uzavřeny alobalovým víčkem a prošly sterilizací v autoklávu po dobu 20 minut. Po vyjmutí z autoklávu bylo médium zchlazeno při pokojové teplotě uskladněno do temna. 50
4.4.2 Příprava C0 média pro chemoterapii
Médium bylo vařeno stejně jako C0. Hotové médium však před autoklávem nebylo rozléváno do zkumavek, ale bylo sterilizováno přímo v nádobě, v níž bylo vařeno. Po vyjmutí z autoklávu byl do nádoby s médiem pomocí sterilní injekční stříkačky přefiltrován ribavirin, rozpuštěný v troše destilované vody. Pro chemoterapii 1 bylo použito množství 25 mg.l-1, pro chemoterapii 2 množství 50 mg.l-1. Byl použit sterilní filtr Milllipore od firmy MILLEX GP s velikostí pórů 0,22 ųm. Celá filtrace probíhala ve flowboxu. Poté bylo médium promícháno a následovalo rozlévání do zkumavek pomocí automatického dávkovače média v množství asi 10 ml na zkumavku. Zkumavky byly uzavřeny alobalovým víčkem a uskladněny v temnu.
4.4.3 Příprava C1 média
Médium určené pro vypreparované meristémy bylo vařeno stejným způsobem jako C0 médium, ale navíc byly do směsi přimíchány hormony (uvedeno v mg.l-1). Spotřeba média na jednu zkumavku byla asi 3 ml. BA (benzyladenin - cytokinin) - 0,5 NAA (α-naftyloctová kyselina - auxin) - 0,1 GA3 (kyselina giberelová - giberelin) - 0,5 V průběhu kultivace meristémů se objevovaly infekce, a pokud byly slabé nebo v začátku, bylo do média použito antibiotikum. Při vaření C1 média s antibiotikem bylo do množství 1 litru média vmícháno antibiotikum ProClin 200 od firmy SUPELCO, v množství 1 ml.l-1.
4.5
Založení pokusu
Celá práce probíhala ve sterilním prostředí flowboxu. Připravené stroužky byly rozděleny přibližně na tři části. Jedna část byla vkládána do zkumavek s médiem C0, jako meristémové kultury, druhá část byla vložena na médium pro chemoterapii 1 a 51
poslední část sloužila pro chemoterapii 2. Stroužky byly na médium vkládány pomocí pinzety a každý byl do média vtlačen přibližně z jedné třetiny. Takto založené vzorky byly poté kultivovány při teplotě 22-26 °C a fotoperiodě 16 hodin světlo/8 hodin tma. K osvětlení byly použity zářivkové trubice s intenzitou 20,25 µmol.m-2.s-1.
4.6
Průběh pokusu
V průběhu kultivace byly postupně vyřazovány stroužky napadené houbovými nebo bakteriálními infekcemi (Obr. 10a). Nejvíce vyskytujícími se houbovými chorobami byl rod Penicillium (Obr. 10b) a rod Rhizopus (Obr. 10c).
Infekce vzniklé v průběhu kultivace
Obr. 10a
Obr. 10b
Obr. 10c
Kultury během této doby vytvářely množství kořenů. Na médiu bez použití ribavirinu byl kořenový systém značně silnější a hustější, naopak stroužky na médiu s ribavirinem projevovaly rychlejší a intenzivnější růst nadzemní části. Jakmile byla nadzemní část stroužků narostlá minimálně asi 10 cm (Obr. 11), byla započata preparace meristémů. Na médiích s ribavirinem bylo třeba materiál ponechat alespoň 10 dní, aby virostatika zaúčinkovala. Na druhou stranu byly preparovány i stroužky, které po dlouhé době jen mírně narašily, protože z média byly již vyčerpány živiny a dále by tato kultivace neměla smysl. Doba od založení pokusu po první preparaci a následné úkony jsou uvedeny v tabulce 1.
52
Obr. 11. Stroužky vhodné k preparaci
Vlastní preparace meristémů probíhala opět ve sterilním prostředí flowboxu. Meristémy o velikosti přibližně 8 mm byly izolovány pod binokulární lupou skalpelem a pinzetou. Před zahájením izolace byla lupa ponechána minimálně 20 minut ve flowboxu k povrchové desinfekci sterilním vzduchem. Na každý meristém byly použity sterilní nástroje. Postup izolace byl takový, že byly odstraněny horní 2/3 stroužku, kořeny a poté se odstranily vnější části kolem dokola. Zbytek stroužku byl zpracováván pod binokulární lupou tak, že byly postupně odlupovány jednotlivé zdužnatělé listy, až k samotnému meristému. Práci bylo třeba vykonávat opatrně, protože mohlo snadno dojít k poškození meristému rozmáčknutím nebo přeříznutím. Izolovaný meristém byl pomocí skalpelu přenesen na C1 médium a následovala kultivace při teplotě 22-26 °C a fotoperiodě 16 hodin světlo/8 hodin tma. Po 4 týdnech byly meristémy přeneseny na čerstvé C1 médium. Meristémy, později mladé rostlinky, byly přenášeny přibližně každé 4 týdny na nové médium, protože za tuto dobu z něj vyčerpají živiny. Z rostlinek, které narostly alespoň 6 cm, byly poté odebírány vzorky k testování ELISA metodou. Protože minimální počet vzorků pro testování je 50 a rostlinky se nevyvíjely stejně, byly odebrané vzorky postupně uchovávány v mrazáku. Také izolované meristémy byly napadány bakteriálními infekcemi. Nejproblematičtější v tomto směru byla odrůda ´Anton´. Z celkového počtu 83 izolovaných meristémů bylo bakteriózou napadeno 72. Z nich se 65 podařilo zachytit ještě ve slabém stupni vývoje choroby a byly přeneseny na médium s antibiotiky. Na tomto médiu se sice neprojevila infekce, ale meristémy byly již natolik oslabeny, že nebyly schopny prorůstat.
53
Po 4 týdnech kultivace se u některých mladých rostlinek začalo projevovat vodnatění. Je to děj, při kterém ve zkumavce dochází k hyperhydratace (převodnění pletiv). Vodnatění může být způsobeno vysokou vzdušnou vlhkostí, mají na něj vliv osmotické látky (tedy sacharóza) v médiu, koncentrace agaru a cytokininy. U rostlin se projevuje vodnatěním a špatným vývojem pletiv, sklovitým a celkově nezdravým vzhledem světle zelené, někdy až hnědé barvy. Průduchy vodnatěním napadených rostlin ztrácejí svoji funkci (Novák, 1990; Wikipedie, 2010). U rostlin, které byly jen lehce postiženy, byl problém řešen tak, že byly odstraněny zvodnatělé vnější části, rostliny byly lehce zakráceny z horní i spodní části a dále byly kultivovány jako zdravé. Bylo třeba je častěji sledovat, popřípadě častěji přenášet na čerstvé médium. Většina jich poté projevovala normální vývoj. Silně vodnatí jedinci byli vyřazováni a likvidováni.
Obr. 12. Rostlinka vzniklá z izolovaného meristému
Tab. 1 Časový pohled založení a průběhu pokusu jednotlivých odrůd česneku konec
1.
odběr vzorků
odrůda
založení
1. preparace preparace
přenesení
Tristan
30. 9. 2009
2. 11. 2009
21. 12. 2009
18. 1. 2010 17. 2. 2010
Mako
7. 10. 2009
9. 11. 2009
22. 12. 2009
19. 1. 2010 18. 2. 2010
Anton
15. 10. 2009 12. 11. 2010 6. 1. 2010
12. 2. 2010 12. 3. 2010
D´Alsace Freres
17. 12. 2009 26. 1. 2010
31. 1. 2010
5. 3. 2010
8. 4. 2010
N9A
21. 1. 2010
26. 2. 2010
xxx
9. 4. 2010
15. 2. 2010
Tabulka 1 ukazuje, že vzorky odrůdy ´Tristan´ byly preparovány po jednom měsíci od založení a celková preparace všech meristémů trvala 7 týdnů. Prorůstající meristémy byly přenášeny v průměru za 6 týdnů na nové médium a za další 4 týdny proběhl odběr
54
všech vzorků k testování. Při tom byly zároveň mladé rostliny přeneseny na čerstvé médium.
Odrůda ´Mako´ byla preparována celkově po dobu 6 týdnů, přičemž meristémy byly preparovány po měsíci. Za 4 týdny od preparace proběhlo přenesení na nové médium a po dalších 4 týdnech odběr vzorků k testování a přenesení na čerstvé médium.
Stroužky odrůdy ´Anton´ byly preparovány po měsíci. Po týdnu se však objevila rozsáhlá bakteriální infekce. Meristémy, které byly jen slabě infikovány, byly přeneseny na médium s antibiotiky, silné infekce byly vyřazeny. Ani po tomto zákroku se však nepodařilo meristémy zachovat. Infekce se již nevyskytla, ale meristémy nebyly schopny prorůstat. Část stroužků byla ponechána k pozdější izolaci na první lednový týden a meristémy byly ukládány přímo na médium s antibiotiky. Po 5 týdnech byly rostlinky přeneseny na čerstvé médium a za měsíc odebírány vzorky k testování. Po odebrání vzorků bylo ke kultivaci použito médium bez antibiotik.
U ´D´Alsace Freres´ byla izolace počata po 6 týdnech kultivace stroužků. Celková izolace všech meristémů byla provedena během týdne. Po 5 týdnech se rostliny přenesly na čerstvé médium a po dalších 5 týdnech byly schopné odběru k testování.
´N9A´ byla poslední založenou odrůdou. Preparace proběhla po 3 týdnech a byla uskutečněna přibližně během týdne. Po šesti týdnech již byly rostliny dostatečně veliké k odebrání vzorků.
55
4.7
Úspěšnost kultivace stroužků a meristémů
Tab. 2 Úspěšnost kultivace stroužků a meristémů
odrůda
založené (ks)
inf.
inf.
stroužky merisémy (%)
(%)
neprorostlé vodnatění
Σ
mer. (%)
(%)
(%)
Tristan
86
15,1
22,1
5,8
10,5
53,5
Mako
87
25,3
19,5
6,9
8,0
59,8
Anton
131
36,6
5,3
49,6
0,8
92,4
92
19,6
4,3
21,7
6,5
52,2
87
37,9
6,9
29,9
0
74,7
D´Alsace Freres N9A
Tabulka 2 ukazuje průměrnou úspěšnost kultivace. U odrůdy ´Tristan´ tvořily největší podíl ztrát infikované meristémy a oproti ostatním odrůdám zde bylo výrazné procento vodnatých rostlin.
Odrůda ´Mako´ měla největší ztráty ve fázi založení pokusu, kdy byla infikována čtvrtina stroužků houbovými nebo bakteriálními chorobami. Skoro pětina rostlin této odrůdy byla infikována ve fázi izolovaného meristému. Protože byla část meristémů této odrůdy izolována po odrůdě ´Anton´, která měla vysoký podíl infekcí u izolovaných meristémů, je možné, že jsou infekce takto přenesené, protože bylo použito stejné podložní sklíčko v binokulární lupě. Sklíčko mohlo být již značně poškozeno od skalpelu a infekce se mohly usadit uvnitř vzniklých rýh a vyčistění sklíčka lihem nebylo dostačující.
Odrůda ´Anton´ se z pohledu úspěšnosti jevila jako nejproblematičtější. Infekce se zřejmě nacházely uvnitř stroužků (tzv. endogenní infekce), kam nepronikl chlorid rtuťnatý a příznaky se projevily až v izolovaných meristémech. Meristémy byly sice ihned v době zjištění dále kultivovány na médiu s antibiotiky, ale nebyly již schopny
56
prorůstat. Tudíž ztráty spolu s infekcemi stroužků dosáhly přes 90%. Zanedbatelné byly ztráty hyperhydratací.
Odrůda ´D´Alsace Freres´
měla výraznější ztráty v infikovaných stroužcích a
neprorostlých meristémech (po 20%).
Odrůda ´N9A´ měla výraznější ztráty v infikovaných stroužcích a neprorostlých meristémech (průměrně 30%). Nulové ztráty byly v případě hyperhydratace.
4.8
Elisa – postup
Jakmile byly rostliny dostatečně vyvinuté, byly odebírány jejich vzorky a byly testovány na přítomnost virů testem ELISA.
Odběr vzorků
Test ELISA byl proveden na přítomnost čtyř, v našich podmínkách nejzávažnějších, virů. Jedná se o GCLV (Garlic common latent virus), LYSV (Leek yellow stripe virus), OYDV (Onion yellow dwarf virus) a SLV (Shallot latent virus). Jako testovací materiál byly použity mladé listy nových rostlinek, které vyrostly z vypreparovaných meristémů samotných nebo v kombinaci s ošetřením chemoterapií (Ribavirin v množství 25 mg.l-1 nebo 50 mg.l-1). Navážka byla minimálně 0,25 g. Při vzorku menším by mohlo dojít k nedostatečnému vyluhování extraktu a vzorek by tím byl nepoužitelný. Meristémy, které prorostly, dosáhly této velikosti zhruba po měsíci. Což je zároveň i ideální doba pro přenesení nové rostlinky na čerstvé médium. Mladé rostlinky byly vytaženy ze zkumavky, zakráceny na velikost asi 0,5-1 cm. Mírně byla zakrácena i spodní část rostlinek. Pokud již měla rostlinka kořínky, byly zakráceny, pokud ještě ne (většina případů), byl odrkojen tenký plátek spodní části. Odříznuté listy byly pinzetou vloženy do uzavíratelných sáčků, přesně popsány a uloženy do mrazáku, než došlo k testování.
57
Potažení destiček protilátkami
Plastové destičky (Obr. 12), na nichž se testovalo, a byly do nich vkládány vzorky, musí být potaženy potahovacím pufrem. Jedna destička slouží k otestování 10 vzorků na všechny čtyři viry. Pufr byl vyroben tak, že v 1000 ml destilované vody bylo rozpuštěno 1,59 g Na2CO3 + 2,93 g NaHCO3 + 0,2 g NaN3 a jeho pH bylo upraveno na 9,6 (pH se upravuje přídavkem NaOH nebo HCl). Roztok byl namíchán dopředu, protože jej lze uchovávat až jeden týden při teplotě 4°C. Na jednu destičku je potřeba 20 ml tohoto roztoku. IGG ředíme potahovacím pufrem dle návodu dodavatele (ředění 500 – 1000x). Do každé jamky v destičce (i na blanc) pipetujeme 200 ųl. Destičky byly ponechány k inkubaci přes noc při teplotě 4°C.
Obr. 13a. Plastová destička pro testování. Obr. 13b. pomocná destička pro rozlišení 4 virů.
Příprava PBS a promývání V 5 litrech destilované vody bylo rozpuštěno: 40 g
NaCl
14,5 g
Na2HPO4
1g
KH2PO4
58
1g
KCl
1g
NaN3
2,5 ml
Tween 20
pH tohoto pufru bylo upraveno na 7,4 (přídavkem NaOH nebo HCl). V promývačce byly destičky tímto pufrem promývány třikrát po třech minutách. Poté byly destičky vyjmuty a zbytek roztoku byl pořádně vyklepán na filtrační papír. Destičky lze uchovat v mrazáku. PBS lze uchovat týden.
Příprava extrakčního pufru V 500 ml PBS bylo rozpuštěno 1 g polyvinylpyrolidonu (PVP) + 2,5 g albuminu (vaječný, hovězí sérový). Na jednu destičku bylo potřeba 250 ml tohoto pufru. Tento roztok je nutno míchat denně čerstvý.
Příprava vzorků Odebrané vzorky (přibližně 0,25 g) v uzavíratelných sáčcích byly zality 5 ml extrakčního pufru; homogenizovaly se (Obr. 13) a nechaly dvě hodiny stát. Do jednotlivých jamek v destičkách bylo naneseno 200 ųl tohoto roztoku. Byla zařazena pozitivní a negativní kontrola a slepý vzorek (blanc), na který se nanesl pouze extrakční pufr. Takto připravené destičky byly inkubovány při 4°C přes noc.
Obr. 14. Ruční homogenizér (BIOREBA) pro rozmělnění vzorků. 59
Promývání V promývačce byly destičky promývány PBS pufrem třikrát po třech minutách. Poté byly destičky vyjmuty a zbytek roztoku byl pořádně vyklepán na filtrační papír.
Protilátky značené enzymem V 1000 ml PBS bylo rozpuštěno 2 g albuminu + 20 g PVP. Tento roztok se nazývá konjugační pufr a jeho spotřeba na jednu destičku je 20 ml. Pufr musí být připraven denně čerstvý. V konjugačním pufru byl ředěn konjugát dle návodu dodavatele (500 – 1000 x) a pipetován 200 ųl do každé jamky v destičce. Na konjugát musí být zvláštní nádobí nepoužívané na jinou činnost. Inkubace trvala přes noc při 4 °C.
Promývání V promývačce byly destičky promývány PBS pufrem pětkrát po třech minutách. Poté byly destičky vyjmuty a pořádně vyklepány zbytky roztoku na filtrační papír.
Enzymatická reakce V 1000 ml mírně zahřáté destilované vody bylo rozpuštěno 97 ml diethanolaminu + 0,2 g NaN3 a pH upraveno na 9,8 (koncentrovanou HCl). Tento roztok se nazývá substrátový pufr – temperovaný. Na jednu destičku je třeba 20 ml tohoto pufru. Pufr lze uchovávat několik týdnů v tmavé lahvi při teplotě 4°C. Přidáme 0,75 mg pnitrophenylphosphatu na 1 ml substrátového pufru. Pipetujeme 200 ųl do každé jamky. Barevná reakce (Obr. 14) byla vyhodnocována po 60 minutách na spektrofotometru. Reakci je možné zastavit přídavkem 50 ųl 3M roztoku KOH do každé jamky.
60
Obr. 15 Výsledná barevná reakce, žlutá políčka jsou pozitivní
61
5
VÝSLEDKY
Výsledky byly zpracovány v programu Statistika 9. Průkaznost rozdílů byla stanovena statistickou metodou Anova LSD test na úrovni p = 0,05. Ve vyhodnocení byla sledována:
1) eliminace jednotlivých virů (OYDV, LYSV, SLV a GCLV) pro každou jednotlivou odrůdu (´Anton´, ´Tristan´, ´N9A´, ´D´Alsace Freres´, ´Mako´)
2) eliminace celého komplexu virů OYDV, LYSV, SLV a GCLV) pro každou jednotlivou odrůdu (´Anton´, ´Tristan´, ´N9A´, ´D´Alsace Freres´, ´Mako´)
3) celková eliminační schopnost jednotlivých metod (C0, CH1, CH2) pro jednotlivé viry (OYDV, LYSV, SLV a GCLV) za všechny odrůdy dohromady 4) celková eliminační schopnost jednotlivých metod (C0, CH1, CH2) pro jednotlivé viry (OYDV, LYSV, SLV a GCLV) pro celý komplex virů za všechny odrůdy dohromady
Grafy č. 1-5 ukazují zhodnocení eliminace virů ve vztahu k odrůdám
62
5.1
Eliminace GCLV u jednotlivých odrůd
Graf č. 1. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na GCLV po testu ELISA. GCLV 110 100 90 80
GCLV
70 60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 Tristan
Mako
Anton
N9A
D´Alasace Freres
Graf č. 1 ukazuje rozdíly mezi jednotlivými odrůdami v úspěšnosti eliminace GCLV. Graf shrnuje všechny tři varianty eliminace dohromady. Je patrné, že nejvyšší úspěšnost ozdravení byla u odrůdy ´Anton´. Průměr ozdravených jedinců byl v tomto případě přes 90%. Vysoká úspěšnost byla také u odrůdy ´N9A´, kde se podařilo eliminovat v průměru necelých 80%. Výrazný rozdíl nebyl v průměru mezi odrůdami ´D´Alsace Freres´ a ´Tristan´. U odrůdy ´D´Alsace Freres´ byla úspěšnost eliminace mezi 48-65%, u ´Tristan´ se ozdravení pohybovalo mezi 42-75%. Odrůda ´Mako´ byla z pohledu eliminace GCLV nejméně úspěšná. Průměrně bylo ozdraveno 18% jedinců, a maximální hodnota se pohybovala mírně nad 30%.
63
Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v eliminaci GCLV mezi odrůdou ´Mako´ a ostatními odrůdami. Odrůda ´Mako´ se výrazně hůře ozdravuje od GCLV. Odrůda ´Anton´ se ozdravovala prokazatelně lépe než ´Mako´, ´D´Alsace Freres´ a ´Tristan´.
5.2
Eliminace LYSV u jednotlivých odrůd
Graf č. 2. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na LYSV po testu ELISA. LYSV 100 90 80 70
LYSV
60 50 40 30 20 10 0 Tristan
Anton
D´Alasace Freres
Mako
Průměr Průměr±0,95 Int. spolehl.
N9A
Graf č. 2 ukazuje rozdíly mezi jednotlivými odrůdami v úspěšnosti eliminace GCLV. Graf shrnuje všechny tři varianty eliminace dohromady. Graf ukazuje velmi vysokou úspěšnost eliminace LYSV u všech odrůd. Odrůdy ´Tristan´, ´Mako´ a ´Anton´ byly celkově ozdraveny LYSV ve 100% a vir byl
64
kompletně odstraněn. U odrůdy ´N9A´ se ozdravení pohybovalo od 70-100%. Odrůda ´D´Alsace Freres´ byla od LYSV ozdravena nejméně, ale i tak byl podíl ozdravných jedinců velmi vysoký, pohyboval se v rozmezí 63-90%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v eliminaci LYSV mezi odrůdami ´D´Alsace Freres´ a ´Tristan´, ´Mako´ a ´Anton´. Odrůda ´D´Alsace Freres´ se od těchto tří odrůd prokazatelně hůře ozdravovala od LYSV.
5.3
Eliminace OYDV u jednotlivých odrůd
Graf č. 3. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na OYDV po testu ELISA. OYDV 110 100 90 80
OYDV
70 60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 Tristan
Mako
Anton
N9A
D´Alasace Freres
Graf č. 3 ukazuje rozdíly mezi jednotlivými odrůdami v úspěšnosti eliminace OYDV. Graf shrnuje všechny tři varianty eliminace dohromady. Odrůda ´Mako´ byla v elmininaci OYDV nejúspěšnější a ozdravena 100%. Těsně za ní v úspěšnosti ozdravení stojí ´Tristan´, kde se ozdravení pohybovalo mezi 95-100%. 65
´Anton´ byl ozdraven v průměru z 85%,´N9A´ ze 78%, přičemž počet negativních jedinců nikdy neklesl pod 70%. Nejnižší počet negativních jedinců měla v případě OYDV odrůda ´D´Alsace Freres´, která nedosáhla počtu negativních jedinců přes 70%. I přesto byla ale úspěšnost nad 50%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v eliminaci OYDV mezi odrůdami ´D´Alsace Freres´ a ´Tristan´, ´Mako´ a ´Anton´. Odrůda ´D´Alsace Freres´ se od těchto tří odrůd prokazatelně hůře ozdravovala od OYDV.
5.4
Eliminace SLV u jednotlivých odrůd
Graf č. 4. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na SLV po testu ELISA. SLV 100 90 80 70
SLV
60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 Tristan
Mako
Anton
N9A
D´Alasace Freres
Graf č. 4 ukazuje rozdíly mezi jednotlivými odrůdami v úspěšnosti eliminace SLV. Graf shrnuje všechny tři varianty eliminace dohromady. 66
Celkově byla úspěšnost eliminace SLV velmi vysoká. Nejvyšší eliminace SLV bylo dosaženo u odrůdy ´Mako´, kde byl po testování 100% počet negativních jedinců. U odrůd ´Tristan´ a ´Anton´ neklesnul počet negativních jedinců pod 85%. U ´D´Alsace Freres´ byl SLV eliminován průměrně v 80%. Nejnižší procento úspěšnosti dosáhla odrůda ´N9A´. Zde byla úspěšnost v rozmezí 66-83%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v eliminaci SLV mezi odrůdami ´N9A´ a ´Mako´ a ´Tristan´. Odrůda ´N9A´ se prokazatelně hůře ozdravovala od SLV jako odrůdy ´Mako´ a ´Tristan´.
5.5
Eliminace všech virů u jednotlivých odrůd.
Graf č. 5. Procentické zastoupení jednotlivých odrůd celkově negativních na všechny viry po testu ELISA. Viry celkem 100 90 80 70
Prom9
60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 Tristan
Mako
Anton
67
N9A
D´Alasace Freres
Graf č. 5 podává celkový obraz o úspěšnosti odzdravení jednotlivých odrůd od všech virů dohromady, přičemž není brán ohled na metodu ozdravení. Z grafu jasně vyplývá, že nejméně negativních jedinců bylo ozdravených u odrůdy ´Mako´. I když byly od virů LYSV, OYDV a SLV ozdraveny všechny rostliny, u GCLV byla tato úspěšnost jen mezi 11-25%. Protože jako negativní se považuje rostlina neobsahující ani jeden z těchto virů, je procento ozdravených u této odrůdy takto nízké. Největšího úspěchu bylo naopak dosaženo u odrůdy ´Anton´. Úspěšnost ozdravení od celého komplexu virů se zde pohybovala od 65-89%, tedy v průměru 77%. LYSV byl jako jediný eliminován ve 100%. Odrůda ´Tristan´ byla ozdravena od LYSV celá, u OYDV a SLV přesahovala úspěšnost 90%. Jako nejproblematičtější se ale opět jeví GCLV, kde sice úspěšnost přesáhla 50%, ale nedosáhla ani 70%, tudíž se snížilo procento celkově ozdravených jedinců od všech virů na 54%. U ´D´Alsace Freres´ nebyla ozdravena ani od jednoho viru ve 100% a celková úspěšnost byla necelých 40%. Nejvíce byl redukován SLV, od kterého se podařilo ozdravit průměrně 80% jedinců. U ´N9A´ nekleslo dolní rozmezí ani u jednoho viru pod 50%. Kombinace všech virů dohromady ale snížila celkové procento negativních jedinců po ozdravení na 28-47%. Ani u jednoho viru nebylo dosaženo 100% úspěšnosti, pouze u LYSV bylo horní rozmezí těsně pod 100%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v eliminaci celého komplexu virů u odrůdy ´Anton´ a odrůd ´Mako´, ´N9A´ a ´D´Alsace Freres´. Odrůda ´Anton´ byla prokazatelně úspěšněji ozdravena od komplexu virů, než tyto 3 odrůdy. Odrůda ´Mako´ byla prokazatelně hůře ozdravena jak proti odrůdě ´Anton´, tak proti odrůdě ´Tristan´.
68
Grafy 6-7 ukazují zhodnocení virů jednotlivými ozdravovacími metodami
5.6
Eliminace GCLV jednotlivými metodami ozdravení
Graf č. 6. Procentické zastoupení jedinců negativních na GCLV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. GCLV 110 100 90 80
GCLV
70 60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±0,95 Int. spolehl.
0 C0
CH1
CH2
Graf č. 6 vypovídá o úspěšnosti jednotlivých metod v ozdravení od GCLV celkově u všech odrůd. Tento vir byl nejlépe eliminován metodou CH1 a to průměrně v 85% a dolní rozmezí přitom nekleslo pod 70%. Metodou CH2 bylo úspěšně ozdraveno průměrně 55% jedinců a průměrná úspěšnost metody C0 byla jako jediná pod 50%, a to 43%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v úspěšnosti eliminace GCLV mezi metodami CH1 a C0 a mezi metodami CH1 a CH2. Metoda CH1 byla v ozdravení od GCLV prokazatelně úspěšnější než C0 a CH2 69
5.7
Eliminace LYSV jednotlivými metodami ozdravení
Graf č. 7. Procentické zastoupení jedinců negativních na LYSV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. LYSV 110 100 90 80
LYSV
70 60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 C0
CH1
CH2
Graf č. 7 vypovídá o úspěšnosti jednotlivých metod v ozdravení od LYSV celkově u všech odrůd. U tohoto viru bylo dosaženo celkově u všech metod vysokého procenta ozdravení. Průměry všech tří metod se pohybovaly mezi 90-93%. Ani u jedné metody nebylo dosaženo ozdravení ve 100%, ale ani jedna metoda přitom v úspěšnosti neklesla pod 85%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) nebyl zjištěn průkazný rozdíl mezi jednotlivými metodami v ozdravení od LYSV.
70
5.8
Eliminace OYDV jednotlivými metodami ozdravení
Graf č. 8. Procentické zastoupení jedinců negativních na OYDV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. OYDV 100 90 80 70
OYDV
60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 C0
CH1
CH2
Graf č. 8 vypovídá o úspěšnosti jednotlivých metod v ozdravení od OYDV celkově u všech odrůd. Ani jednou metodou nebylo dosazeno eliminace 100%. Graf vyhodnocuje jako nejúčinnější metodu pro eliminaci OYDV metodu C0, kde se průměr negativních jedinců po testování blížil k 92%. Metoda CH2 byla těsně za metodou C0 s průměrnou úspěšností 87%. Metoda CH1 byla v případě eliminace OYDV nejméně účinná, průměr ozdravených dosáhl necelých 68%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v úspěšnosti eliminace OYDV mezi metodami CH1 a C0 a mezi metodami CH1 a CH2. Metoda CH1 byla v úspěšnosti ozdravení od OYDV prokazatelně horší než C0 a CH2.
71
5.9
Eliminace SLV jednotlivými metodami ozdravení
Graf č. 9. Procentické zastoupení jedinců negativních na SLV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. SLV 100 90 80 70
SLV
60 50 40 30 20 10 Průměr Průměr±SmCh
0 C0
CH1
CH2
Graf č. 9 vypovídá o úspěšnosti jednotlivých metod v ozdravení od SLV celkově u všech odrůd. I když žádnou z metod nebylo dosaženo 100% negativních jedinců, byl jejich podíl velmi vysoký. Mezi jednotlivými metodami byl minimální rozdíl. Metodou C0 bylo v průměru ozdraveno téměř 90% jedinců, metodou CH1 88% a metodou CH2 85% jedinců. Dolní rozmezí úspěšnosti nekleslo pod 80%. Statistickou analýzou (Anova - LSD test) nebyl zjištěn průkazný rozdíl mezi jednotlivými metodami v ozdravení od SLV.
72
5.10 Eliminace všech virů jednotlivými metodami ozdravení
Graf č. 10. Procentické zastoupení jedinců negativních na všechny viry (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. Viry celkem 70
60
50
Prom9
40
30
20
10 Průměr Průměr±SmCh
0 C0
CH1
CH2
Graf č. 10 zhodnocuje úspěšnost 3 metod použitých pro ozdravení celého komplexu virů a všechny odrůdy dohromady. Nejvyšší úspěšnosti bylo dosaženo metodou CH1, kterou se průměrně podařilo ozdravit 56% jedinců všech odrůd od celého komplexu virů. Nejhůře byl metodou CH1 ozdraven OYDV a naopak u GCLV byla tato metoda nejúspěšnější. Následuje metoda CH2, kde se průměr celkové úspěšnosti pohyboval okolo 47%. Nejméně účinná byla metoda u eliminace GCLV, u ostatních metod neklesl průměr úspěšnosti pod 85%. U metody C0 byla úspěšnost ozdravení od všech virů jen 31%. Nejméně se přitom podařilo eliminovat GCLV, v průměru 43%, průměr ozdravených jedinců u ostatních virů neklesl pod 90%.
73
Statistickou analýzou (Anova - LSD test) byl zjištěný průkazný rozdíl v úspěšnosti eliminace komplexu virů mezi metodami CH1 a C0. Metoda CH1 byla v eliminaci všech virů prokazatelně úspěšnější než metoda C0.
74
6
DISKUZE
Diplomová práce byla zaměřena na eliminaci virů u odrůd česneku kuchyňského Allium sativum (L.), v podmínkách in vitro. Česnek patří k nejstarším kulturním plodinám, je ceněný jako zelenina, koření, a jako léčivá rostlina. Pěstování a výnos česneku negativně ovlivňují viry. Viry působí na kvalitu i kvantitu produkce česneku, což může vést i k vysokým ekonomickým ztrátám. K nejdůležitějším
rodům
virů
napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus, a dále Fijivirus (Garlic dwarf reovirus). Ozdravování česneku se zaměřuje na čtyři nejdůležitější viry - OYDV, LYSV, SLV a GCLV. Cílem pokusu byla eliminace právě těchto virů na 5 odrůdách česneku kuchyňského - Allium sativum (L.). Pokus byl prováděn na ZF v Lednici, na ústavu Mendeleum v in vitro laboratoři. K pokusu byl použitý materiál, který zároveň slouží pro práci na projektu NAZV QH71228 (Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace). Materiál pocházel z oddělení Genové Banky VÚRV v Olomouci. Bylo vybráno pět odrůd a ty postupně ozdravovány. Všechny byly napadeny komplexem virů OYDV, LYSV, SLV a GCLV. Odrůdy vybrané pro pokus byly české odrůdy ´Anton´, ´Tristan´, a ´N9A´ , francouzská odrůda ´ D´Alsace Freres´ a maďarská odrůda ´Mako´. Všech pět odrůd bylo kultivováno ve stejných teplotních a světelných podmínkách. Všechny odrůdy byly postupně ozdravovány třemi metodami - metodou izolace meristému (C0), chemoterapií CH1 (25 mg.l-1 ribavirinu) a chemoterapií CH2 (50 mg.l-1 ribavirinu). Pro povrchovou desinfekci byl v průběhu pokusu u rostlinného materiálu používán 0,2% chlorid rtuťnatý, pro média autokláv po dobu 20 minut, sterilační kostka a líh byly používány pro aseptickou práci ve flowboxu. Jako základní médium bylo použito médium Murashige, Skoog (1962). Pro založení pokusu, tzn. pro kultivaci vysterilizovaných česnekových stroužků, neobsahovalo médium růstové hormony (C0). Pro chemoterapii byl do média přidáván ribavirin v koncentraci buď 25 mg.l-1 nebo 50 mg.l-1. MS médium pro izolované meristémy (C1) obsahovalo navíc růstové hormony - 0,25 mg.l-1 BA, 0,1 mg.l-1 NAA a 0,5 mg.l-1 GA3. V průběhu pokusu byly sledovány výpadky způsobené houbovými a bakteriálními infekcemi, vitrifikací a neprorostlým materiálem. 75
Ve vyhodnocení byla sledována eliminace jednotlivých virů i celého komplexu virů (OYDV, LYSV, SLV a GCLV) pro každou jednotlivou odrůdu (´Anton´, ´Tristan´, ´N9A´, ´D´Alsace Freres´, ´Mako´) a dále celková eliminační schopnost jednotlivých metod (C0, CH1, CH2) pro jednotlivé viry i pro celý komplex virů za všechny odrůdy dohromady. Přítomnost virů byla stanovena sérologickou metodou ELISA. Z výsledků vyplývá, že od GCLV se odrůda ´Mako´ výrazně hůře ozdravovala jako ostatní odrůy. Odrůda ´Anton´ se ozdravovala prokazatelně lépe než ´Mako´, ´D´Alsace Freres´ a ´Tristan´. Metoda CH1 byla v ozdravení od GCLV prokazatelně úspěšnější než C0 a CH2. Průměrně jí bylo ozdraveno 85% jedinců, metodou C0 byla úspěšnost průměrně 43% a metodou CH1 průměrně 55%. U viru LYSV byly odrůdy ´Tristan´, ´Mako´ a ´Anton´ ozdraveny 100%. Mezi těmito odrůdami a odrůdou ´D´Alsace Freres´ . Odrůda ´D´Alsace Freres´ se od těchto tří odrůd prokazatelně hůře ozdravovala od LYSV a to v průměru v 78%. U viru LYSV nebyl zjištěn průkazný rozdíl v úspěšnosti mezi jednotlivými ozdravovacími metodami. Výsledky ukazují průkazný rozdíl v eliminaci OYDV mezi odrůdami ´D´Alsace Freres´ a ´Tristan´, ´Mako´ a ´Anton´. Odrůda ´D´Alsace Freres´ se od těchto tří odrůd prokazatelně hůře ozdravovala od OYDV. Metoda CH1 byla v úspěšnosti ozdravení od OYDV prokazatelně horší než C0 a CH2. U eliminace SLV byla úspěšnost celkově velmi vysoká, u odrůdy ´Mako´ byl po testování 100% počet negativních jedinců. Odrůda ´N9A´ se prokazatelně hůře ozdravovala od SLV jako odrůdy ´Mako´ a ´Tristan´. U viru SLV nebyl zjištěn průkazný rozdíl v úspěšnosti mezi jednotlivými ozdravovacími metodami. Z výsledků je patrné, že nejméně úspěšnou odrůdou v eliminaci celého virového komplexu byla odrůda ´Mako´. Od všech virů bylo ozdraveno pouze necelých18% rostlin. Největšího úspěchu naopak dosáhla odrůda ´Anton´, kde se úspěšnost ozdravení vyšplhala až k 77%. Výsledky ukazují, že metoda CH1 byla v eliminaci všech virů prokazatelně úspěšnější než metoda C0 a byla nejefektivnější ze všech tří metod. Průměrně se u ní podařilo ozdravit 56% jedinců od celého komplexu virů.
76
Metodou C0 bylo dle výsledků ozdraveno průměrně 43% jedinců od GCLV, 93% jedinců od LYSV, 91% jedinců od OYDV a téměř 90% jedinců od SLV. Malago´n a kol. (2006) uvádí léčbou izolace meristémů 64% úspěšnost u OYDV a LYSV. Rozdíl v úspěšnosti mohl být způsobem použitím různých médií. Použili zde B-5 médium (Gamborg a kol. 1968) s 0,5 mg.l-1 izopentenyladeninu (2-iP) a 0,1 mg.l-1 NAA, a dále nižší pH a větší koncentraci agaru. Senula a kol. (2000) ozdravili touto metodou celkově 37,7% rostlin první rok a 26,6% rostlin druhý rok. Nejčastěji se vyskytujícím virem u pozitivních vzorků byl GCLV, kolem 50%, OYDV se u pozitivních vzorků vyskytoval průměrně 5-13%,
LYSV 7-12%. Pateña a kol. (2005) provedli izolaci
meristému dvakrát u jednoho jedince. Po první preparaci byla většina jedinců pozitivních na viry, po druhé preparaci se jim podařilo ozdravit 75% vzorků od virů OYDV, LYSV, GCLV, SLV. Pro izolované meristémy použili médium Shenck & Hildebrandt’s (SH) s vyšší dávkou agaru, vyšší koncentraci sacharózy a 0,5 mg.l-1 2-iP. Vysoká úspěšnost mohla být způsobena dvojitou preparací jednoho meristému. Conci a kol. (2005) ozdravovali různé odrůdy pomocí této metody. Nejlépe se dařilo ozdravit česnek od virů OYDV a LYSV a to u většiny odrůd 100%. Naušová a kol. (2008) udávají 85-95% ozdraveného materiálu v případě OYDV a LYSV. Metoda chemoterapie byla rozdělena do dvou částí. Léčebná látka ribavirin byla aplikována do média C0, před preparací meristémů. CH1 byla metoda s dávkou ribavirinu 25 mg.l-1. GCLV byl touto metodou eliminován u jedinců všech odrůd průměrně v 85%. U LYSV dosahovala úspěšnost metody 91%, OYDV se touto metodou dařilo ozdravit nejméně, úspěšnost byla průměrně 68%. Vysokého procenta ozdravení bylo dosaženo opět u SLV a to v 88%. Na celý komplex virů byla tato metoda nejúčinnější a podařilo se jí dosáhnout úspěšnosti průměrně 56%. Metodou CH2 bylo získáno průměrně 55% jedinců bez GCLV, 90% jedinců bez LYSV, 87% jedinců bez OYDV a 85% jedinců bez SLV. Ani u jednoho viru nebyla metoda CH2 nejúspěšnější. Celkově se podařilo metodou CH2 ozdravit 47% jedinců od celého komplexu virů. Malagón a kol. (2006) zhodnotili použití ribavirinu, který aplikovali na izolované meristémy, jako neefektivní, u dvou odrůd dosáhli úspěšnosti pouze 27% a 34,8% . Mohlo to být způsobeno právě aplikací až na vypreparované meristémy. Senula a kol. (2000) použili ribavirin v množství 50 a 100 mg.l-1 a to také na médium určené pro vypreparované meristémy. Použitím 100 mg.l-1 ribavirinu se dosáhlo 100% úspěšnosti v ozdravení, ale u rostlin se objevila hyperhydricita a nebyly použitelné. Při 50 mg.l-1 ribavirinu GCLV poklesl z 66,5% k 22,2% a SLV z 23,7% k 2,8% pozitivních 77
jedinců, u OYDV, LYSV nebyl pokles pozitivních jedinců významný. Sidaros a kol. (2004) přidali jako inhibitor virových infekcí ribavirin v množství 50 mg.l-1 a toto aplikovali u dvou odrůd. Meristémy byly na tomto médiu kultivovány ve velikosti 1, 3, a 5 mm. Jako nejoptimálnější se jevila varianta 3 mm. Produkce viruprostých rostlin byla 100%. Vysoké eliminace mohli dosáhnout menší velikostí izolovaných meristémů, než která byly použity v této práci.
78
7
ZÁVĚR
Diplomová práce byla zpracována na téma Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro. V literární části je zpracována všeobecná charakteristika česneku kuchyňského (Allium sativum L.) se zaměřením na botanické členění, původ, morfologii, obsahové látky, a jeho význam. Obecná část je zaměřena také na základní charakteristiku virů a fytovirů. Dále jsou zde shrnuty poznatky o konkrétních virech infikujících česnek, jejich zařazení, popis, škodlivost a symptomy na česneku. K nejdůležitějším rodům virů napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus, a dále Fijivirus (Garlic dwarf reovirus). Další část rešerše je zaměřena na získání znalostí o možnostech ozdravení česneku v podmínkách in vitro. K těmto metodám patří izolace meristému, chemoterapie, termoterapie a podle některých autorů také metoda stonkových disků („stem - disc dome culture“). Na tyto informace navazuje shrnutí poznatků o množení česneku v podmínkách in vitro. K těmto způsobům patří také izolace meristému (i v kombinaci s termoterapií a chemoterapií), „stem - disc dome culture“, dále somatická embryogeneze. V praktické části se realizovalo ozdravení česneku pomocí izolace meristému (C0) a chemoterapie se dvěma různými dávkami ribavirinu (CH1, CH2). Tyto metody byly aplikovány na pět odrůd česneku kuchyňského. Jako základní médium pro pokus zvoleno médium Murashige, Skoog (1962). Odrůdy vybrané pro pokus byly ´Anton´, ´Mako´, ´Tristan´, ´N9A´ a ´ D´Alsace Freres´. Ozdravení bylo zaměřeno na čtyři hlavní viry Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV), Garlic common latent virus (GCLV) a Shallot latent virus (SLV). Úspěšnost ozdravení jednotlivých rostlin byla testována metodou ELISA. Ve vyhodnocení byla sledována eliminace virů pro každou odrůdu a dále celková eliminační schopnost jednotlivých metod ozdravení.
Z výsledků vyplývá, že nejméně úspěšnou odrůdou v eliminaci celého virového komplexu byla odrůda ´Mako´. Podařilo se zde ozdravit pouze 18% rostlin. Nejlépe se
79
naopak podařilo ozdravit odrůdu ´Anton´, kde se úspěšnost ozdravení vyšplhala až k 77%. Výsledky ukazují, že metoda CH1 byla v eliminaci všech virů prokazatelně úspěšnější než metoda C0 a byla nejefektivnější ze všech tří metod. Průměrně se u ní podařilo ozdravit 56% jedinců od celého komplexu virů. Nejméně úspěšná byla tato metoda v eliminaci u OYDV, kdy se dosáhlo úspěšnosti 68%, u všech ostatních virů byla úspěšnost nad 85%. Metodou CH2 se podařilo celkově ozdravit průměrně 47% jedinců od všech virů. Nejméně eliminován byl vir GCLV a to z 55%. Ostatní viry byly ve vzorcích negativní v průměru alespoň z 85%. U metody C0 byla úspěšnost ozdravení rostlin od všech virů jen 31%. Nejméně se přitom podařilo eliminovat GCLV, v průměru 43%, průměr ozdravených jedinců u ostatních virů neklesl pod 90%.
80
8
ABSTRAKT
Diplomová práce byla zpracována na téma Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro. Pokus byl prováděn na ZF v Lednici, na ústavu Mendeleum v in vitro laboratoři. Cílem práce bylo získat informace o kultivaci, ozdravování a množení česneku v podmínkách in vitro. Tyto informace a znalosti byly následně prakticky využity za účelem ozdravení pěti odrůd česneku kuchyňského pro uchování metodou kryokonzervace. Byly zvoleny odrůdy ´Anton´, ´Mako´, ´Tristan´, ´N9A´ a ´ D´Alsace Freres´. Práce hodnotila metody chemoterapie a izolace meristému. Přítomnost virů (OYDV – Onion yellow dwarf potyvirus, GCLV – Garlic common latent carlavirus, LYSV – Leek yellow stripe potyvirus a SLV – Shallot latent carlavirus) byla stanovována metodou ELISA. Hodnotila se účinnost ozdravení jednotlivými metodami.
Final thesis was worked out on theme Elimination of viruses in the garlic varieties in vitro. Experiment was conducted on Mendeleum - Institute of Genetics and Plant Breeding, Faculty of Horticulture in Lednice. The aim of this thesis was to obtain information on cultivation, recovery and multiplication of garlic in vitro. Those information were used in practice for recovery of five varieties of garlic for cryopreservation. Varieties ´Anton´, ´Mako´, ´Tristan´, ´N9A´ and ´ D´Alsace Freres´ were chosen. This method of chemotherapy and meristem tip culture was evaluated. Presence of virus (OYDV – Onion yellow dwarf potvirus, GCLV – Garlic common latent carlavirus, LYSV – Leek yellow stripe potyvirus and SLV – Shallot latent carlavirus) was determined by test ELISA. The effect of recovery of individual methods was evaluated in this work.
81
9
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
1. AGRIOS G. N. (2005), Plant Pathology, Fifth Edition, Elsevirer. Academic Press, ISBN 0-12-044565-4 2. ASTIER S., ALBOUY J., MAURY Y., ROBAGLIA C., LECOQ H. (2007): Principles of Plant Virology. Genome, Pathogenicity, Virus Ecology, Science Publishers, ISBN 2-7380-0937-9. 3. AYABE M., SUMI S. (1998): Establishment of a novel tissue culture method, stem-disc culture, and its practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Reports (1998) 17: 773–779 s. 4. AYABE M., SUMI S. (2001): A novel efficient tissue culture method - “stem disc dome culture“ - for producing virus - free garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep (2001) 20:503 - 507 s. 5. BARG E., LESEMANN D. E.,VETTEN H. J., GREEN S. K. (1994): Identification, partial characterization and distribution of viruses infecting Allium crops in South and South-eat Asian countries. Acta horticulturae, 358: 251-258 s. 6. BARG E., LESEMANN D. E.,VETTEN H. J., GREEN S. K. (1997): Viruses of alliums and their distribution in different Allium crops and geographical regions. Acta Horticulturae, 433: 607-616 s. 7. BELLARDI M. G., MARANI F., BETTI L., RABITI, A. L. (1995): Detection of Garlic common latent virus (GCLV) in Alium sativum L. in Italy. Phytopathologia Mediterranea, 34: 58-61 s. 8. BERTACCINI A., BOTTI S., TABANELLI D., DRADI G., FOGHER C., PREVIATI A., DA RE F. (2004): Micropropagation and Establishment of Mite Borne Virus - Free Garlic (Allium sativum), Acta horticulturae 631: 201-206 s., ISHS 2004. 9. Biochemicals Plant Cell and Tissue Culture Phytopathology. Cataloque 200062008, Duchefa Biochemie. 10. BOS L. (1981): Leek yellow stripe virus, AAB Description of Plant viruses, No. 240. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK. 11. BOS L. (1999): Plant viruses, unique and intriguing pathogens. Backhuys Publishers, Leiden. ISBN 90-5782-012-9.
82
12. BOWN D. (2002): The Royal Horticultural Society. New Encyclopedia Herbs a Their Uses, 2. vydání, London: Dorling Kindersley, ISBN 0-7513-3386-7. 13. BRUNA A. (1997): Effect of thermotherapy and meristem-tip culture on production of virus-free garlic in Chille, Acta Horticulturae 433: 631-634 s. A. C., EIRAS M., RESENDE R.deO. (2004): Detection of three Allexivirus species infecting garlic in Brasil. Pesq. agropec. brasil, Brasília, 39(3): 735-740 s. 14. CONCI V. C., CANAVELL A., LUNELLO P., DI RIENZO J., NOME S. F., ZUMELZU G., ITALIA R. (2003): Yield losses associated with virus infected garlic plants during five successive years. Plant Disease, 87: 1411-1415 s. 15. CONCI V. C., PEROTTO M. C., CARFUNE E., LUNELLO P. (2005): Program for Intensive Production of Virus-Free Garlic Plants, Acta Horticulturae 677: 195-200 s. 16. DELECOLLE, B. & LOT, H. (1981): Identification of three viruses infected garlic by immunoelectronmicroscopy. Agronomie, 1: 763-770. 17. DIEKMANN M. (1997): Allium spp. FAO/IPGRI, no. 18, 59p. ISBN 92-9043346-9. 18. DOVAS C. I., HATZILOUKAS E., SALOMON R., BARG E., SHIBOLETH Y., KATIS N. I. (2001): Comparison of methods for virus detection in Allium spp. Journal of Phytopathology, 149: 731-737 s. 19. FAJARDO T. V. M., NISHIJIMA M., BUSO, J. A. TORRES, A.C. AVILA A.C., RESENDE R.O. (2001): Garlic viral complex: identification of potyviruses and carlaviruses in Central Brasil. Fitopathologia Brasileira, 26: 619-626 s. 20. FEREOL L., CHOVELON V., CAUSSE S., KALUMVUEZIKO M.
L.,
KAHANE R. (2005b): Embryogenic Cell Suspension Cultures of Garlic (Allium sativum L.) as Method for Mass Propagation and Potential Material for Genetic Improvement, Acta Horticulturae 688: 65-74 s. 21. FEREOL L., CHOVELON V., CAUSSE S., MICHAUX-FERRIERE N., KAHANE R. (2002): Evidence of a somatic embryogenesis process for plant regeneration in garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep 21: 197–203 s.
83
22. FEREOL L., CHOVELON V., CAUSSE S., TRIAIRE D. (2005a): Establishment of embryogenic cell suspension cultures of garlic (Allium sativum L.), plant regeneration and biochemical analyses, Plant Cell Rep (2005) 24: 319325 s. 23. FILHO P.deA.M., NAGATA T., DUSI A. N., BUSO J. A., TORRES GOMBKÖTÔ C., IVÁNCSICS J. (2009): Hungarian and french garlic varieties’ vegetative growing on the country of Hanság. Acta Agronomica Óváriensis Volume 51. Number 1., University of West Hungary, Faculty of Agriculture and Food Sciences Institute of Plant Science Mosonmagyaróvár. 24. GOMBKÖTÔ C., IVÁNCSICS J. (2009): Hungarian and french garlic varieties’ vegetative growing on the country of Hanság, Acta Agronomika, Volume 51: 19-21 s, Number 1, ISSN 1416-647x 25. GRAICHEN K. (1991): Gelbstreifigkeit des Porrees verursacht erhebliche Pflanzenausfalle. Gartenbau, 38: 17-19 s. 26. HAQUE M. S., WADA T., HATTORI K. (2000): Garlic root for micropropagation through in vitro bulbet formativ, Acta Horticulturae 520: 4552 s. 27. HAVRÁNEK P. (1985): Výzkum sadbových oblastí pro viruprostý česnek, C 11 - 329 - 206 - 02 - 02 (b). 28. HAVRÁNEK P. (2005): Redakčně upravená závěrečné správa grantového projektu Ministerstva zemědělství ČR QE 1108. Systém produkce certifikované sadby česneku. 29. HAVRÁNKOVÁ M., HARVRÁNEK P. (1987): Odvození viruporstých klonů československých odrůd česneku, Výzk. a šlecht. úst. Olomouc, 31: 27 - 34 s. 30. HLUŠEK J., RICHTER R., RYANT P. (2002): Výživa a hnojení zahradních plodin, Vydáno redakcí odborných časopisů, Praha, 1, vydání, ISBN 80 902413 - 5 - 2. 31. HRADILÍK J. (2005), Rostlinné explantáty, 1. vydání, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, ISBN 80-7157-915-7. 32. JANČA J, ZENTRICH J. A. (1994): Herbář léčivých rostlin, 1. díl, EMINENT, Praha, 1. vydání, ISBN 80 - 85876 - 02 - 7. 33. JELÍNEK J., ZICHÁČEK V. (2003): Biologie pro gymnázia, Olomouc s. r. o., 6. rozšířené vydání, ISBN 80 - 7182 - 159 - 4.
84
34. KHAN J. A., DIJKSTRA J. (2002): Plant Viruses As Molecular Pathogens, 2002, Food Product Press, ISBN 1-56022-895-4. 35. KINCL., M, KRPEŠ, V. (2006): Základy fyziologie rostlin, Ostravská univerzita, 3. vydání, ISBN 80-239-8375-X. 36. KLUKÁČKOVÁ, J., NAVRÁTIL, M., DUCHOSLAV, M. (2007): Natural infection of garlic (Allium sativum L.) by viruses in the Czech Republic. Journal of Plant Disease and Protection, 114 (3): 97-100 s. 37. KÓŇA J., KÓŇOVÁ E. (2005): Cibul’ové zeleniny, Garmond Nitra, 1. vydání, ISBN 80 - 89148 - 21 - 2. 38. KONVIČKA O. (1998): Česnek (Allium sativum), Olomouc, ISBN 80 - 238 1928 -3. 39. LEE Y. W., YAMAZAKI S., OSAKI T, INOUYE T. (1979): Two elongated viruses in garlic, garlic latent virus and garlic mosaic virus. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 45: 727-734 s. 40. LI
T.
S.
C.
(2000):
Medicinal
plants:
culture,
utilization,
and
phytopharmacology, Technomic Pub. Co, ISBN 1-56676-903-5. 41. LOT H., CHOVELON V. SAUCHE, S. DELECOLLE, B. (1998): Effect of onion yellow dwarf virus and leek yellow stripe virus on symptomatology and yield loss of three French garlic cultivars. Plant Disease, 82: 1381-1385 s. 42. LUBRACO G., SHUBERT A., PREVIATY A. (2000): Micropropagation and mycorrhization of Allium sativum, Acta Horticulturae 530: 339-334 s. 43. LUNELLO P., DI RIENZO J., CONCI V. C. (2007): Yield loss in garlic caused by Leek yellow stripe virus Argentinean isolate. Plant Disease, 91: 153-158 s. 44. MAHY B. V. J., VAN REGENMORTEL M. H. V. (2010): Desk Encyklopedia of Plant And Fungal Virology, Academic press, ISBN 978-0-12-375148-5. 45. MALAGÓN R. R., MORENO L. P., BORODANENKO A., SALINASGONZÁLEZ G. J., OCHOA-ALEJO N. (2006): Differential organ infection studies, potyvirus elimination, and field performance of virus-free garlic plants produced by tissue culture, Plant Cell Tiss Organ Cult (2006) 86:103–110 s. 46. MAVRIČ I., MIRKOVIČ V. RAVNIKAR, M. (1999): Virus infection of Alliums. Sborník abstraktů, Ljubljana 3. - 4. 3. 1999- Društvo za varstvo rastlin Slovenije, 45-50.
85
47. MAVRIČ I., RAVNIKAR M. (2005): A carlavirus serologically closely related to Carnation latent virus in Slovenian garlic, Acta agriculturae Slovenica, 85 - 2, ISSN: 1581-9175. 48. MUKHOPADHYAY M. J., SENGUPTA P., MUKHOPADHYAY S., SEN S. (2004): In vitro stable regeneration of onion and garlic from suspension culture and chromosomal instability in solid callus culture, Scienta Horticulturae 104: 19 s. 49. NAUŠOVÁ O., KUČEROVÁ Z., ONDRUŠIKOVÁ O., KŘIŽAN B., WASSERBAUEROVÁ L., SOUKUPOVÁ J., KARLOVÁ K., 50. NOVÁK F. J. (1990): Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin, Academia Praha, ISBN 80-200-0344-4. 51. ONDRUŠIKOVÁ E., SASKOVÁ H., ČECHOVÁ J., KŘIŽAN B. (2009): The effect of genotype on sanitation of garlic plants (Allium sativum L.). In New developments in green gene technology. 1. vyd. Szeged, Hungary: Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences 52. PALUDAN N. (1980): Virus attack on leek survey, diagnosis, tolerance of varieties and winter hardiness. Tidsskrift Planteav, 84: 371-385 s. 53. PAPPU H. R., HELLIER B. C., DUGAN F. M. (2005): First report Onion yellow dwarf virus, Leek yellow stripe virus, and Garlic common latent virus in garlic in Washington State. Plant Disease, 89: 205 s. 54. PATEÑA L. F., DOLORES L. M., BARIRING A. L., ALCACHUPAS A. L., LAUDE N. P., BARG E., GREEN S. K., BARBA R. C. (2005): Improved Technique for Virus Elimination in and Production of Certified Planting Materials of Garlic (Allium sativum L.), Acta Horticulturae 694: 271-276 s. 55. PATEÑA L. F., RASCO-GAUNT S. M. (1998): Seed production and in vitro conservation systems for garlic and shallot, Acta Horticulturae 461: 503-513 s. 56. PEIWEN X., HUISHENG S., RUIJIE S., YUANJUN Y. (2004): Strategy of the use virus-free seed garlic in field production, Acta Horticulturae 358: 307-311 s. 57. PETŘÍKOVÁ K., 2006, Zelenina: pěstování, ekonomika, prodej, Profi Press, Praha, 1. vydání, ISBN 80 - 86726 - 20 - 7. 58. PLAPER I., RAVNIKAR M., ŽEL J. (1991): Jasmonic acid and tissue culture of garlic
monocotyledons, Acta Horticulturae 289: 257-258 s.
59. PROCHÁZKA S., MACHÁČKOVÁ I., KREKULE J., ŠEBÁNEK A KOLEKTIV (2003): Fyziologie rostlin, Academia Praha, ISBN 80-200-0586-2. 86
60. RABINOWITCH H. D. & CURRAH L. [eds] (2002): Allium crop science: Recent Advantages. – CAB International, Wallingford. 61. ROD J., HLUCHÝ M., ZAVADIL K., PRÁŠIL J., SOMSSICH I., ZACHARDA M. (2005): Obrazový atlas chorob a škůdců zeleniny střední Evropy. Ochrana zeleniny v integrované produkci včetně prostředků biologické ochrany rostlin, Biocont Laboratory, spol. s. r. o., Brno, ISBN 80-901874-3-9. 62. ROSYPAL S. a kolektiv autorů (2003): Nový přehled biologie, Scienta Praha, 1. vydání, ISBN 80 - 7183 - 268 - 5. 63.
ROSYPAL S., Úvod do molekulární biologie. Díl třetí, 3. vydání, Rosypal S., 2002, ISBN 80-902562-2-8.
64. SAIKI R. K., GELFAND D. H., STOFFEL S., SCHARF S. J., HIGUCHI R., HORN G. T., MULLIS K. B., ERLICH H. A. (1988): Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase. Science, 239: 487491 s. 65. SEIDMANN J. (2006): World Spice Plants, Springer - Verlag Berlin Heidelberg, ISBN 3-540-222790 66. SENULA A., KELLER E. R. J., LESEMAN D. E. (2000): Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment of an in vitro collection of garlic (Allium sativum), Acta Horticulturae 530: 121-128 s. 67. SIDAROS S. A., OMAR R. A., EL-KEWEY S. A., EL-KHALIK S. A. (2004): Virus Elimination from Infected Garlic Plants Using Different Techniques, Egyptian J. Virol. 1, 333-341 s. 68. STAVĚLÍKOVÁ (2009), ústní sdělení. STAVĚLÍKOVÁ H., DUŠEK K. (2008): Zhodnocení účinnosti metody izolace meristému při ozdravování 20 odrůd česneku. 69. ŠAFRÁNKOVÁ I. (2007): ústní sdělení 70. ŠEBÁNEK J., SLADKÝ Z. (1988): Biotechnologie rostlinných explantátů, Vysoká škola zemědělská v Brně. 71. ŠEFROVÁ H. (2006): Rostlinolékařská entomologie, KONVOJ, spol. s. r. o., Brno, 1. vydání, ISBN 80 - 7302 - 086 - 6. 72. ŠUTIC´ D. D., FORD R. E., TOŠIC´ M. T. (1999): Handbook Of Plant Viruses Diseases, CRC Press LLC, ISBN 0-8493-2302-9.
87
73. TAKAICHI M., NAGAKUBO T., OEDA K. (2001): Mixed virus infection of garlic determined by a multivalent polyclonal antiserum and virus effects on disease symptoms. Plant Disease, 85: 71 –75 s. 74. TAKAICHI M., YAMAMOTO M., NAGAKUBO T., OEDA K. (1998): Four garlic viruses identified by Reverse transcription–Polymerase chain reaction and their regional distribution in Northern Japan. Plant Disease, 82: 694-698 s. 75. TSUNEYOSHI T., MATSUMI T., DENG T. C., SAKO I., SUMI S. (1998): Differentiation of Allium carlaviruses isolated from different parts of the world based on the viral coat protein sequence. Archives of Virology, 143: 1093-1107 s. 76. UCMAN R., ŽEL J., RAVNIKAR M. (1997): Thermotherapy in virus elimination from garlic: influences on shoot multiplication from meristems and bulb formation in vitro, Scientia Horticulturae 73 (1998) 193 - 202 s. 77. VAN DIJK P. (1991): Mite- borne virus isolates from cultivated Allium species and their classification into two new rymoviruses in the family Potyviridae. Netherlands Journal of Plant Pathology, 97: 381-399 s. 78. VAN DIJK P. (1993): Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Plant Pathology, 99: 233-257 s. 79. WALKEY D. G. A., WEBB M. J. W., BOLLAND C. J., MILLER A. (1987): Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. ascolonicum L.) by meristem-tip culture. In: Journal of Horticultural Science, 62: 211-220 s. 80. YAMASHITA K., SAKAI J., HANADA K. (1996): Characterization of new virus from garlic (Allium sativum L.), garlic mite-borne mosaic virus. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 62: 483-489 s.
Internetové zdroje 1. ICTVdB VIRUS DESCRIPTION [online]. 2002 [cit. 2010-03-07]. Garlic common
latent
virus.
Dostupné
z
WWW:
2. KOZAK J., K-ČESNEK [online]. 2009 [cit. 2010-04-28]. Odrůdy česneku. Dostupné z WWW: .
88
3. NAVRÁTIL M., Katedra buněčné biologie a genetiky: Základy virologie [online].
2010
[cit.
2010-03-20].
Dostupný
z
WWW:
. 4. SK GREEN. WORLD VEGETABLE CENTER [online]. 2000 [cit. 2010-0416].
Off-season
onion
and
garlic.
Dostupné
z
WWW:
. 5. TAGRO S.R.O. [online]. 2007 [cit. 2010-04-06]. Zelenina. Dostupné z WWW: . 6. WIKIPEDIE [online]. 2010 [cit. 2010-02-13]. Elektronová mikroskopie. Dostupné z WWW: http://cs.wikipedia.org/wiki/Elektronová_mikroskopie 7. WIKIPEDIE [online]. 2010 [cit. 2010-03-05]. Vitrifiakace (biologie). Dostupné z WWW: http://cs.wikipedia.org/wiki/Vitrifikace_(biologie)
89
10 SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ Obr. 1 Snížení výnosu vlivem OYDV u česneku kuchyňského Obr. 2 Buňky izolované embryogenezí (A; 0,025mm) a vzniklé embyo (B;0,5mm) Obr. 3 Kalus s embrygenetickou kulturou (A) a rostliny vzniklé somatickou embryogenezí (J) Obr. 4 ´N9A´ Obr. 5 ´Tristan´ Obr. 6 ´Anton´ Obr. 7 ´D´Alsace Freres´ Obr. 8 ´Mako´ Obr. 9 Stroužky nevhodné pro pokus Obr. 10 Infekce vzniklé v průběhu kultivace Obr. 11 Stroužky vhodné k preparaci Obr. 12 Rostlinka vzniklá z izolovaného meristému
Graf č. 1. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na GCLV po testu ELISA. Graf č. 2. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na LYSV po testu ELISA. Graf č. 3. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na OYDV po testu ELISA. Graf č. 4. Procentické zastoupení negativních rostlin jednotlivých odrůd na SLV po testu ELISA Graf č. 5. Procentické zastoupení jednotlivých odrůd celkově negativních na všechny viry po testu ELISA 90
Graf č. 6. Procentické zastoupení jedinců negativních na GCLV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami Graf č. 7. Procentické zastoupení jedinců negativních na LYSV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami Graf č. 8. Procentické zastoupení jedinců negativních na OYDV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. Graf č. 9. Procentické zastoupení jedinců negativních na SLV (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami. Graf č. 10. Procentické zastoupení jedinců negativních na všechny viry (dle testu ELISA) ozdravených jednotlivými metodami.
91
11
SEZNAM PŘÍLOH
Tabulka dat č. 1. LSD test, GCLV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 2. LSD test, LYSV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 3. LSD test, OYDV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 4. LSD test, SLV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 5. LSD test, všechny viry. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 6. LSD test, GCLV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 7. LSD test, LYSV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 8. LSD test, OYDV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 9. LSD test, SLV. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05 Tabulka dat č. 10. LSD test, všechny viry. Označené rozdíly jsou významné na hlad. p < 0,05
92
