Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta
Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Mikroorganismy v technologii sýrů Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.
Gabriela Opatřilová
Brno 2010
Zadání BP
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Mikroorganismy v technologii sýrů“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím s tím, aby moje práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna jako studijní materiál.
Dne
21. dubna 2010
Podpis ……………………………
PODĚKOVÁNÍ Chci poděkovat vedoucímu této bakalářské práce Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace, výpomoc a připomínky při vypracování závěrečné práce. Dále bych ráda poděkovala svým rodičům a prarodičům, kteří mě, hlavně finančně, podporují ve studiu na Mendelově univerzitě. V neposlední řadě děkuji RNDr. Lence Adlerové, učitelce chemie na Gymnáziu Blansko, která mě výborně připravila na studium chemie v mém oboru.
ABSTRAKT V bakalářské práci jsou experimentálně stanoveny celkové počty mikroorganismů, počty bakterií mléčného kysání, koliformních bakterií, kvasinek a plísní ve vzorcích čerstvého kozího a termizovaného ovčího sýra, které byly zakoupeny v řetězci prodejen Billa. Výsledky jsou srovnány s limity Nařízení EP a Rady (ES) č. 2073/2005 a ČSN 56 9609.
Klíčová slova: kolonie, kultury, mikroorganismy, sýr
ABSTRACT Total number of microbes, numbers of lactic fermentation bacteria, coliform bacteria, yeasts and moulds are experimentally ascertained in this bachelor’s work. This microbes are watched in samples of cheeses made from goat and sheep milk, which were bought in Billa supermarket. Results are compared with limits in Regulation EP and Council (ES) No. 2073/2005 and ČSN 56 9609.
Keywords: colonies, cultures, microbes, cheese
OBSAH
1
ÚVOD ………………………………………………………………. 8
2
CÍL PRÁCE ………………………………………………………... 9
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ………………………………………… 10 3.1 Kozí a ovčí mléko surovinami pro výrobu sýrů ………………… 10 3.1.1 Složení mléka …………………………………………………………11 3.1.1.1 Sušina …………………………………………………………… 12 3.1.1.2 Tuk ……………………………………………………………… 12 3.1.1.3 Bílkoviny ………………………………………………………… 13 3.1.1.4 Laktóza ………………………………………………………….. 14 3.1.2 Hygienické požadavky na mléko …………………………………… 14 3.1.2.1 Celkový počet mikroorganismů (CPM) ………………………… 14 3.1.2.2 Koliformní bakterie (KB) ……………………………………….. 15 3.1.2.3 Psychrotrofní mikroorganismy ………………………………….. 15 3.1.2.4 Termorezistentní mikroorganismy ……………………………… 16 3.1.2.5 Somatické buňky (SB) …………………………………………… 17 3.1.2.6 Rezidua inhibičních látek (RIL) ………………………………… 17 3.1.3 Technologické požadavky na mléko ………………………………… 18 3.1.3.1 Aktivní kyselost (pH) …………………………………………… 18 3.1.3.2 Titrační kyselost ………………………………………………… 19 3.1.3.3 Syřitelnost ……………………………………………………… 19 3.1.3.4 Bod mrznutí (BMM) ……………………………………………. 20 3.1.3.5 Kysací schopnost ……………………………………………….. 20 3.1.3.6 Tepelná stabilita ………………………………………………… 21 3.1.3.7 Měrná hmotnost ………………………………………………… 21
3.2 Výroba sýrů ………………………………………………………. 22 3.2.1 Fáze výrobní …………………………………………………………. 22 3.2.1.1 Příprava suroviny před sýřením ………………………………… 22 3.2.1.2 Sýření …………………………………………………………… 23 3.2.1.3 Zpracování sýřeniny ……………………………………………. 24 3.2.1.4 Solení sýrů ……………………………………………………… 25 3.2.2 Fáze zrání ……………………………………………………………. 26
3.2.2.1 Předběžné zrání ………………………………………………… 26 3.2.2.2 Vlastní zrání …………………………………………………….. 26
3.3 Mikroorganismy ve výrobě sýrů ………………………………… 27 3.3.1 Prospěšné mikroorganismy …………………………………………. 28 3.3.1.1 Zákysové bakterie ……………………………………………… 28 3.3.1.2 Nezákysové bakterie …………………………………………….. 29 3.3.1.3 Mazové kultury ………………………………………………….. 29 3.3.1.4 Ušlechtilé plísně ………………………………………………… 30 3.3.1.5 Propionové bakterie …………………………………………….. 31 3.3.1.6 Kvasinky ………………………………………………………… 32 3.3.2 Mikroorganismy způsobující vady sýrů ……………………………. 32 3.3.2.1 Koliformní bakterie …………………………………………….. 32 3.3.2.2 Klostridia ……………………………………………………….. 33
4
MATERIÁL A METODIKA ……………………….…………… 35 4.1 Charakteristika analyzovaných vzorků ………………………… 35 4.1.1 Termizovaná bryndza plnotučná ……………………………………. 35 4.1.2 Soignon Chévre a Tartiner ………………………………………….. 35
4.2 Charakteristika živných médií …………………………………… 36 4.2.1 PCA agar se sušeným odtučněným mlékem ………………………… 36 4.2.2 MRS agar …………………………………………………………… 37 4.2.3 YGC agar …………………………………………………………… 37 4.2.4 Petrifilm …………………………………………………………….. 37
4.3 Stanovované mikroorganismy …………………………………… 38 4.4 Příprava a inkubace vzorků ……………………………………... 38
5
VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE ..…………………………… 40
6
ZÁVĚR ……………………………………………………………. 42
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ………………………………. 43
1
ÚVOD
Mléko je biologická tekutina, je to sekret mléčné žlázy samic savců primárně určený k výživě mláďat. Je jednou z nejdůležitějších a nenahraditelných složek lidské výživy, především proto, že obsahuje dostatek biologicky významných látek v optimálním poměru, které jsou důležité pro plnohodnotnou výživu lidí. Dle GAJDŮŠKA (2003) je mléko dobrým živným prostředím pro velké množství mikroorganismů. Proto je jakost a trvanlivost mléka a výrobků z něj významně závislá na mikrobiální čistotě syrového mléka. Základní dělení mlék je na mléka kaseinová a mléka albuminová. Mléka kaseinová produkují přežvýkavci a z celkového obsahu bílkovin mají více než 75 % kaseinu. Mléka albuminová produkují masožravci, všežravci i býložravci s jednoduchým žaludkem a v celkovém zastoupení bílkovin představuje kasein méně než 75 %. Kozí, ovčí a kravské mléko patří mezi mléka kaseinová.
Sýr a jeho výroba jsou neoddělitelně spojeny s lidskými dějinami. Sýr se vyrábí z mléka, a to od okamžiku, kdy člověk před mnoha tisíci lety začal chovat první kozy, ovce, hovězí dobytek a koně. Tento produkt nás tedy spojuje s dobou dávno minulou, kdy člověk ještě vedl kočovný život. Sýr se vyrábí téměř na celém světě a v některých zemích je dokonce považován za nejdůležitější potravinu (CALLEC, 2003). Sýr je mléčný výrobek, vyrobený srážením mléčné bílkoviny syřidlem nebo kyselinou. Principem je převedení mléka na pevný materiál, na sýřeninu. Po vysíření syřidlem vznikají dvě složky, sýřenina a syrovátka. Sýřeninu tvoří voda, kasein a tuk, do syrovátky přechází z mléka laktóza, soli a syrovátkové bílkoviny. Při výrobě sýrů se používá řada mikrobiálních kultur, které vytvářejí typické vlastnosti výsledného sýra. Tyto kultury mikroorganismů se přidávají buď do mléka po pasteraci nebo do sýřeniny nebo se jimi očkují sýry až ve zracím sklepě. Jsou to především zákysové kultury, dále kultury propionových bakterií pro sýry s tvorbou ok v těstě, zelené a bílé plísňové kultury, mazové kultury pro sýry zrající pod mazem a doplňkové kvasinkové kultury pro sýry zrající pod mazem a sýry s plísní v těstě.
8
2
CÍL PRÁCE
Cílem
bakalářské
práce
bylo
zpracovat
literární
rešerši
pojednávající
o mikroorganismech v technologii sýrů se zaměřením na sýry z kozího a ovčího mléka. Charakterizovat mikroorganismy používané ve výrobě sýrů a mikroorganismy působící kažení sýrů a opatření, kterými lze jejich výskytu zamezit. V praktické části experimentálně stanovit celkové počty mikroorganismů, koliformních bakterií, bakterií mléčného kysání a kvasinek a plísní ve vzorku kozího a ovčího sýra a výsledky srovnat s legislativními požadavky.
9
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Kozí a ovčí mléko surovinami pro výrobu sýrů
HORÁK (2004) charakterizuje ovčí mléko jako vodnatou tekutinu bílé nebo nažloutlé barvy, typické vůně a příjemné nasládlé chuti. Je bohaté především na vitamíny A, B1, B2, B12 a C, význam se přikládá také vysokému obsahu kyseliny orotové, které se připisují protirakovinné účinky. Celkově má ovčí mléko třikrát víc vitamínů než kravské, obsahuje více železa a zinku, více tuku i kaseinu a má tedy podstatně vyšší nutriční hodnotu než mléko kravské. Jelikož jsou kapénky mléčného tuku větší, je obtížné z něj ztlouct máslo, máslo je navíc měkké a mnohdy má nepříjemnou chuť. Mléko se obtížně zasyřuje, proto je třeba použít na vytvoření sýřeniny více syřidla, ale výsledná výtěžnost sýra je vyšší než u mléka kravského, 18 - 20 kg na 100 kg mléka. Jak uvádí ŠUSTOVÁ (2005), je v Evropě nejproduktivnějším plemenem východofriská ovce. Laktace u ovcí trvá 120 - 150 dní a průměrná produkce mléka za laktaci je 800 - 1000 litrů mléka.
Kozí mléko je bílé barvy, protože neobsahuje barviva karoteny. Organismus kozy totiž neumí vstřebat a následně do mléka vyloučit β-karoten. Díky trojnásobně vyššímu obsahu kyseliny kaprinové (oproti kravskému) mívá mléko typický pach. Mléko je lépe stravitelné, protože obsahuje velmi málo αS1-kaseinu a je v něm méně β-laktoglobulinu. Obsahuje vitamíny A, B (hlavně riboflavin) a niacin, ale menší množství vitamínů B6, B12, C a D. Je bohaté na fosfor, vápník, draslík, hořčík a chlór, má však méně sodíku, síry, zinku a molybdenu (www.kozinka.com, 2010). Tukové kapénky jsou menší, a protože je v mléce víc β-kaseinu v podobě malých micel, sráží se kasein dvakrát rychleji než kasein kravského mléka, sýření je proto snazší. Laktace koz trvá 6 - 10 měsíců, produkce mléka za laktaci je přibližně stejná jako u ovcí, tedy 800 - 1000 litrů. Z hlediska produkce mléka na výrobu sýrů jsou podle CALLECA (2003) nejvíce ceněnými plemeny koza sánská a hnědé alpské plemeno.
10
Nejlepší pro výrobu sýrů je mléko z horských pastvin, zejména z horských údolí a luk s porostem ušlechtilých travin. Nejméně vhodné je mléko od dojnic krmených siláží, kde hrozí riziko výskytu bakterií máselného kvašení. Je proto nutné při výrobě siláží postupovat tak, aby se ihned vytvářelo kyselé prostředí, které zabraňuje činnosti sporotvorných bakterií. Zhoršené podmínky výroby sýrů nastávají často i v létě. Výsledná jakost nadojeného mléka je ovšem vždy v rukou zemědělců a závisí na správné zootechnické praxi (ŠUSTOVÁ, 2008). Jedním z rozhodujících činitelů je při výrobě sýrů biologická jakost mléka. Dříve se při zrání sýrů využívalo přirozené mikroflóry mléka, zastoupení jednotlivých druhů mikroorganismů mělo tedy velký vliv na kvalitu hotového uzrálého sýra. Kvalitní mléko pro výrobu sýra by mělo obsahovat mikroorganismy užitečné v procesu zrání, některé mikroorganismy, zejména plynotvorné, jsou v mléce pro výrobu sýra nežádoucí. Zastoupení bakterií v mléce závisí hlavně na druhu krmiva a na podnebí. Krmivo může způsobovat mnoho vad sýrů, podle GAJDŮŠKA (2003) jsou rizikovými krmivy především řepný chrást, řízky, nekvalitní siláže a okopaniny. Mléko z různých krajů mívá kvůli rozdílnému klimatu a složení půdy odlišnou mikrobiální činnost. Je to následkem toho, že se podle krajiny daří rozdílným mikroorganismům, různým bakteriím a tím i různým druhům sýrů. Například výroba ementálu se daří nejlépe ve švýcarských oblastech nebo ve Finsku, měkké sýry v předhůří Alp (ŠUSTOVÁ, 2008). Jakost mléka je dána třemi faktory – složením mléka, hygienickými požadavky a technologickými požadavky.
3.1.1 Složení mléka
GAJDŮŠEK (2003) uvádí, že zastoupení jednotlivých složek v mléce je dáno geneticky. Další faktory, které ovlivňují složení mléka, jsou například stadium laktace, zdravotní stav dojnic, denní doba, roční období nebo intervaly dojení. Průměrné zastoupení složek kozího mléka (OCHODNICKÝ, 1996) a ovčího mléka (GAJDOŠÍK, 1984) v procentech v porovnání s mlékem kravským (ŠUSTOVÁ, 2005) je uvedeno v Tab. 1.
11
Tab. 1 Průměrné zastoupení složek mléka
sušina tuk bílkoviny laktóza popel
kozí
ovčí
kravské
13,24 4,25 3,38 4,78 0,71
18,5 7 5,6 5 0,91
12,7 3,9 3,25 4,6 0,65
3.1.1.1 Sušina
Sušinu mléka tvoří především lipidy, dusíkaté látky, laktóza a látky minerální. Celková sušina mléka je zbytek po vysušení při teplotě 102 ± 2 °C. Podle požadované přesnosti se potom obsah sušiny stanovuje vážkově nebo výpočtem. Vážkové stanovení je rozhodčí metodou a provádí se buď s pískem, bez použití písku, nebo zjednodušenou rychlometodou bez písku. Tukuprostá sušina (TPS) je beztuký podíl mléčné sušiny. Vypočte se z obsahu celkové sušiny a obsahu tuku v mléce. Vyjadřuje se v procentech. Tuk v sušině (TVS) je podíl tuku z celkové sušiny mléka vyjádřený v procentech. Zjistí se výpočtem z obsahu sušiny a obsahu tuku (ŠUSTOVÁ, 2005).
3.1.1.2 Tuk
Tuk je energeticky nejbohatší složkou mléka. V syrovém mléce je obsažen ve formě tukových kapének, jedná se tedy o disperzi mléčného tuku v mléčné plazmě, příp. o emulzi tuku v odstředěném mléce. Jak tvrdí ŠUSTOVÁ (2008), v porovnání s kravským mlékem jsou kapénky tuku v kozím mléce menší, v ovčím mléce větší. Nejvíce zastoupenou složkou mléčného tuku jsou triacylglyceroly, dále látky rozpustné v tucích (lipofilní vitamíny, fosfolipidy, cholesterol, karotenoidy) a volné mastné kyseliny. Mléčný tuk obsahuje hodně nízkomolekulárních nasycených mastných kyselin se sudým počtem uhlíků. Jsou to zejména kyseliny myristová, palmitová a stearová. V menším množství v mléce přežvýkavců nacházíme nenasycené mastné
12
kyseliny olejovou, linolovou, linolenovou a arachidonovou, které se do mléka dostávají s potravou. Obsah tuku v mléce se stanovuje nejčastěji acidobutyrometrickou metodou s využitím Gerberovy kyseliny sírové nebo extrakční metodou dle Rösse-Gottlieba, případně se stanoví měřením v infračervené oblasti na milcoscanech.
3.1.1.3 Bílkoviny
Jsou nejdůležitější složkou mléka z hlediska nutričního (obsahují esenciální aminokyseliny) i technologického (mají vliv na syřitelnost mléka). Z volných aminokyselin jsou bílkoviny syntetizovány v sekrečních buňkách mléčné žlázy, kde dochází ke spojování aminokyselin peptidovou vazbou. Bílkoviny mléka dělíme na syrovátkové a kaseinové. Kasein je nejdůležitější bílkovinou mléka, jeho srážení se uplatňuje při výrobě sýrů. Studiem mléčných bílkovin se zjistilo, že kasein není homogenní bílkovinou, ale komplexem početných kaseinových frakcí spojených fosforečnanem vápenatým (GAJDŮŠEK, 2003). Kasein se dělí na tři základní frakce α, β a κ. Nejvyšší podíl z kaseinových frakcí připadá na α-kasein, což je z chemického hlediska fosfoprotein, který obsahuje nejvíc vázaného fosforu. HORÁK (2004) tvrdí, že oproti kravskému mléku obsahuje ovčí mléko více kaseinu, kozí mléko obsahuje podle ŠUSTOVÉ (2005) více β-kaseinu a neobsahuje téměř žádný αS1-kasein. Zajímavostí je, že kasein kozího mléka se sráží dvakrát rychleji než kasein mléka kravského, proto je sýření kozího mléka snadnější. Syrovátkové bílkoviny zůstávají po vysrážení kaseinu z mléka při pH 4,6 a přecházejí do syrovátky. Na rozdíl od kaseinu je syrovátka plnohodnotná bílkovina, protože obsahuje všechny aminokyseliny, včetně methioninu, který v kaseinu chybí. Nejvýznamnější
syrovátkové
bílkoviny
jsou
α-laktalbumin,
β-laktoglobulin
a imunoglobuliny, které z chemického hlediska řadíme mezi glykoproteidy. Pocházejí z krevního séra a jejich nejvyšší obsah je v mlezivu. Bílkoviny mléka se stanovují Kjeldahlovou metodou, určením dusíku podle Dumase, spektrofotometricky nebo formolovou titrací.
13
3.1.1.4 Laktóza
Vyskytuje se v mléce všech savců, je to disacharid vzniklý kondenzací dvou molekul D-galaktózy a D-glukózy se sladivostí pouze 27 – 37 % sacharózy. Množství laktózy v mléce je oproti ostatním mléčným složkám nejméně ovlivnitelné vnějšími podmínkami. Prekurzorem mléčného cukru je kyselina propionová, pocházející z kvasných procesů v předžaludku. Mléčná žláza je jediným místem v organismu, kde dochází k syntéze tohoto cukru (HORÁK et al., 2004). Při výrobě fermentovaných mléčných výrobků se uplatňuje tzv. mléčné kysání, ke kterému dochází vlivem bakterií mléčného kysání. Při tomto procesu vzniká z laktózy kyselina mléčná. Laktóza
se
stanovuje
polarimetricky,
na
milcoscanu,
kolorimetricky
nebo chromatograficky.
3.1.2 Hygienické požadavky na mléko
3.1.2.1 Celkový počet mikroorganismů (CPM)
Jako CPM označujeme všechny bakterie, kvasinky a plísně, které vyrostou na neselektivní nutričně bohaté půdě za aerobních podmínek při 30 °C za 72 hodin. Pomocí CPM se sleduje hygiena získávání a ošetřování mléka. Zdroje CPM v nadojeném mléce mohou být různé, může to být infikovaná mléčná žláza, případně kontaminované
struky
vemene
nebo
jakýkoliv
styk
mléka
s mikrobiálně
kontaminovaným povrchem při dojení. Hodnota CPM ale nevypovídá nic o případných patogenních mikroorganismech v mléce. Podle Nařízení EP a Rady (ES) 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu, je limit CPM pro syrové ovčí a kozí mléko ≤ 1 500 000 v 1 ml (pro kravské mléko ≤ 100 000 v 1 ml). CWIKOVÁ (2009) uvádí, že CPM se stanoví plotnovou metodou v pevných půdách, kdy se použije metoda zalití inokula do půdy, tedy kolonie rostou uvnitř i na povrchu půdy. 1 ml inokula se nepipetuje na Petriho misku a zalije se teplým agarem, promíchá se a nechá se zatuhnout a inkubovat při teplotě 30 °C po dobu 14
72 hodin za aerobních podmínek. Používá se agar masopeptonový nebo PCA (PlateCount-Agar). Je to agar s glukózou jako zdrojem energie, tryptonem jako zdrojem dusíku a kvasničným extraktem. Následně se CPM vypočte podle vzorce na základě spočítaných kolonií.
3.1.2.2 Koliformní bakterie
Koliformními bakteriemi se rozumí gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky z čeledi Enterobacteriaceae, které zkvašují laktózu za tvorby kyseliny mléčné a plynu. Jsou to indikátory fekálního znečištění potravin. Řadí se sem některé kmeny bakterií Citrobacter, Enterobacter nebo Escherichia coli. Jejich zdroji jsou nejčastěji výkaly, kontaminovaná
voda,
půda
nebo
prach.
Z hygienického
hlediska
je
podle
ŠILHÁNKOVÉ (2002) nejdůležitější rod Escherichia, jehož jednotlivé druhy se přirozeně vyskytují ve střevním traktu různých živočichů. Počet koliformních bakterií nesmí být podle legislativních požadavků vyšší než 103 KTJ v 1 ml mléka. Koliformní bakterie se stanoví obdobně jako CPM, tedy kultivačně, používá se ale jiná půda. Je to agar selektivně diagnostický, obohacený laktózou a solemi žlučových kyselin, které inhibují růst grampozitivních bakterií. Dále agar obsahuje indikátory změny pH krystalovou violeť a neutrální červeň. Agar se nazývá VRBL (Violet-Red-Bail-Lactose-Agar). ŠUSTOVÁ (2005) uvádí, že ke stanovení celkového počtu koliformních bakterií, příp. mezofilních aerobních bakterií, koliformních bakterií s rozlišením bakterií E. coli, selektivní E. coli, stafylokoků, kvasinek a plísní nebo bakterií čeledi Enterobacteriaceae, lze použít také petrifilmy. Skládají se z papírového filmu potaženého polyethylenovou folií, která obsahuje živná média smíchaná s gely rozpustnými ve studené vodě, a z polypropylenového filmu s vrstvou obsahující indikátorové barvivo a taktéž gel rozpustný ve studené vodě.
3.1.2.3 Psychrotrofní mikroorganismy
Psychrotrofní (příp. psychrofilní) mikroorganismy produkují termorezistentní enzymy z řad lipáz a proteáz, které jsou hlavní příčinou kažení UHT mléka v průběhu 15
skladování. GAJDŮŠEK (2003) tvrdí, že i když rostou pomaleji než mezofilní bakterie, jsou přesto schopny účinně rozkládat složky mléka. Optimální teplota je pro ně 20 °C, v případě psychrofilních je to 0 – 7 °C, proto se jim často říká chladničkové mikroorganismy. Řadí se sem zejména rody Pseudomonas, Flavobacterium, některé kmeny rodu Bacillus (Bacillus cereus), dále rody Alcaligenes, Enterobacter, Proteus aj. Mléko se může kontaminovat těmito mikroorganismy různými cestami, nejčastěji je to však umýváním vemene znečištěnou utěrkou. Celkový počet psychrotrofů nesmí překročit 50 000 KTJ v 1 ml mléka.
3.1.2.4 Termorezistentní mikroorganismy
Termorezistentní mikroorganismy jsou schopny přežít i vyšší než optimální teploty, proto v mléce přežívají i po pasteraci, dále se v mléce množí a způsobují senzorické či technologické vady. Patří sem kromě termofilních mikroorganismů především termorezistentní mikroorganismy jak nesporulující bakterie, tak sporulující aerobní bacily (řada z nich je patogenních nebo tvoří toxiny) a anaerobní klostridia (některé tvoří také toxiny a některé se vyznačují výraznou tvorbou plynů – duření sýrů). Proto jsou termorezistentní mikroorganismy vedeny jako doplňkový ukazatel kvality mléka pro větší mlékárny s komplikovanějšími technologiemi (GAJDŮŠEK, 2003). Kromě bacilů a klostridií sem lze zařadit některé bakterie z rodu Micrococcus, Microbacterium, Streptococcus, Enterococcus nebo Lactobacillus. Počet termorezistentních mikroorganismů by neměl překročit 103 KTJ v 1 ml mléka, je to však pouze hodnota doporučená, nikoliv závazná. Sporulující termorezistentní mikroorganismy lze stanovit Weinzirlovým testem. Do sterilní zkumavky se nalije 10 ml mléka k testování a zalije se 2 ml teplého sterilního parafínu. Záhřevem na 85 – 95 °C po dobu 10 min se zničí vegetativní formy mikroorganismů a po vychlazení se zkumavka po 4 dny inkubuje při 37 °C. Přítomnost sporulujících
termorezistentních
mikroorganismů
signalizuje
tvorba
plynu,
který vytlačuje parafínovou zátku, a proteolýza, která se projeví sražením mléka. GAJDŮŠEK (2003) doplňuje další kvalitativní požadavek na mléko - stanovení sporulujících anaerobních bakterií (SPAN) nebo sporulujících aerobních bakterií (SPA), 16
které jsou podskupinami termorezistentních mikroorganismů. SPAN vyvolávají senzorické a technologické vady a mohou také ohrozit zdraví konzumenta kvůli produkci toxinů. Mezi SPAN řadíme především bacily a klostridia a jejich výskyt by měl být negativní v 0,1 ml mléka.
3.1.2.5 Somatické buňky (SB)
Mezi somatické buňky přítomné v mléce se řadí buňky krve a buňky pocházející ze sliznice mléčné žlázy. Z buněk krve to jsou zejména leukocyty, lymfocyty a monocyty. Zvýšené množství leukocytů v mléce signalizuje onemocnění mléčné žlázy, více leukocytů je také v mlezivu. V případě těžkých zánětů mléčné žlázy nebo při poranění vemene se v mléce mohou vyskytovat i erytrocyty. Epiteliální buňky pocházejí z mléčné žlázy a odvozují se od vrstevnatého dlaždicovitého epitelu z povrchu vemene, struku a strukovitého vývodu, a cylindrického epitelu z mlékojemu a mlékovodů (GAJDŮŠEK, 2003). Nařízení EP a Rady (ES) 853/2004 udává, že měsíčně se v mléce SB stanovují alespoň jednou a následně se vypočte geometrický průměr za 3 měsíce. Toto nařízení nestanovuje limity pro SB v kozím a ovčím mléce, ale GAJDŮŠEK (2000) uvádí, že dostačující je mezní hodnota 106 KTJ v 1 ml. Orientačně se SB stanovují např. Mastitis N testem, NK testem, Wisconsin mastitis testem, katalázovou zkouškou, stanovením bovinního sérumalbuminu a jinými metodami. Přímé metody zahrnují počítání pod mikroskopem nebo pomocí elektronických počítačů, průtokovou cytometrii nebo floro-opto-elektronovou metodu.
3.1.2.6 Rezidua inhibičních látek (RIL)
Inhibiční látky mohou poškodit zdraví konzumenta a působit problémy v technologii zpracování mléka a výroby mléčných výrobků zejména proto, že brzdí růst mikroorganismů. Dle KOMPRDY (2007) je třeba u antibiotik podávaných preventivně, k podpoře růstu nebo léčbě nemocí dodržovat předepsané ochranné lhůty podle druhu podávaného 17
léku. Zbytky těchto léčiv mohou působit inhibičně na mikroflóru mléka. Mezi inhibiční látky také patří sanitační prostředky především na bázi jódu nebo chlóru nebo konzervanty, které přechází do mléka z krmiva. Úmyslně se do mléka přidávají i látky s baktericidními účinky, např. kyselina benzoová, acylpyrin nebo formalín. Ke stanovení RIL se používají metody, fungující na principu difúze RIL do agaru, napuštěného mikroorganismem citlivým na danou inhibiční látku. Pozitivním výsledkem je vznik tzv. inhibiční zóny, což je čirá zóna v okolí vzorku, ve které mikroorganismus neroste. CWIKOVÁ (2009) rozlišuje tři základní metody stanovení reziduí inhibičních látek. První využívá vhodné kmeny Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis C953 a slouží ke stanovení β- laktamových antibiotik. Dále je to metoda čtyřplotnová ke stanovení tetracyklinových antibiotik, aminoglykosidových antibiotik, sulfonamidů a makrolidových antibiotik. Ta využívá kmeny Micrococcus luteus pro makrolidová antibiotika a Bacillus subtilis pro zbývající tři skupiny antibiotik. Ke stanovení reziduí dezinfekčních prostředků v mléce nebo v oplachové vodě dojících zařízení se používá kvasinkový test, metoda využívající citlivosti kvasinky Saccharomyces cerevisieae CCM1344 na dezinfekční látky běžně používané v potravinářských provozech.
3.1.3 Technologické požadavky na mléko
3.1.3.1 Aktivní kyselost (pH)
Aktivní kyselost mléka je dána koncentrací vodíkových iontů v mléce a měří se pH metrem. Vyjadřuje se v hodnotách pH (ŠUSTOVÁ, 2005). Je třeba brát v úvahu tlumivou, tzv. pufrační schopnost mléka. Přidáme-li k mléku menší množství kyseliny nebo zásady, hodnota aktuální kyselosti se nezmění. Je to způsobeno přítomností bílkovin, fosfátů a citrátů, takže i přesto, že se vytvoří z laktózy kyselina mléčná, nelze první stadium rozkladu laktózy zachytit.
18
Hodnota pH kravského mléka se pohybuje v rozmezí 6,5 - 6,7, interval hodnot pH kozího mléka je podle GAJDŮŠKA (2000) 6,57 – 7,16 a pH ovčího mléka je v rozmezí 6,3 - 6,8.
3.1.3.2 Titrační kyselost
Titrační kyselost je počet mililitrů 0,25 M roztoku NaOH, spotřebovaných na titraci 100 ml mléka na indikátor fenolftalein. Titruje se do slabě růžového zbarvení srovnávacího roztoku. Stanovení se provádí podle Soxhlet-Henkela a vyjadřuje se ve stupních SH. Použitím hydroxidu sodného se neutralizují kyseliny pocházející z bílkovin, dále kyselina fosforečná vázaná na kasein, kyselina citronová a u čerstvě nadojeného mléka i oxid uhličitý. Standardní titrační kyselost kravského mléka se pohybuje v rozmezí 6,2 – 7,8 SH. Hodnoty pro kozí a ovčí mléko uvádí GAJDŮŠEK (2000): kozí mléko vykazuje hodnoty 3,6 – 7,6 SH, ovčí mléko mívá hodnoty podstatně vyšší, nejčastěji v intervalu 8 – 12,5 SH, a to v důsledku vyššího obsahu bílkovin.
3.1.3.3 Syřitelnost
Syřitelnost mléka je schopnost srážet se syřidlem a tvořit sýřeninu požadovaných vlastností (SIMEONOVOVÁ et al., 2003). Syřitelnost je v prvé řadě podmíněna obsahem vápníku v mléce, zejména jeho ionizované formy, množstvím kaseinu a zastoupením jeho jednotlivých frakcí v kaseinové micele, hodnotou pH apod. (GAJDŮŠEK, 2000). Proces srážení mléka syřidlem lze rozdělit na dvě fáze. Ve fázi primární probíhá limitní proteolýza κ-kaseinu, v sekundární fázi dochází ke koagulaci kaseinových frakcí za přítomnosti vápenatých kationtů. Při stanovování syřitelnosti se porovnává pouze doba srážení různých mlék syřidlem, které má stejnou sýřící aktivitu, za stejných podmínek (často se upravuje pH mlék na stejnou hodnotu).
19
3.1.3.4 Bod mrznutí (BMM)
Bod mrznutí je fyzikální vlastnost mléka, jejíž stanovení se používá k rychlému posouzení neporušenosti především směsného syrového mléka. V ČR je v současné době stanovena mezní hodnota ≤ -0,520 °C pro kravské mléko, u syrového kozího mléka je hodnota přibližně stejná. U ovčího mléka se bod mrznutí pohybuje v intervalu od -0,59 do -0,66 °C, což je podle GAJDŮŠKA (2000) způsobeno vyšším obsahem solí. Přídavek 1 % vody na celkové množství mléka zhorší bod mrznutí asi o 0,005 %. Rozdíl bodu mrznutí mezi vodou a mlékem je způsoben z 50 % obsahem laktózy a asi z 30 % solemi rozpuštěnými v mléce (citráty, chloridy, fosfáty). ŠUSTOVÁ (2005) se shoduje s GAJDŮŠKEM (2003) na faktorech ovlivňujících BMM. Jsou to především sezónní variabilita, výživa, vyšší či nižší užitkovost, zdravotní stav dojnic, plemeno, velikost stáda, pořadí laktace, region, obsah laktózy, močoviny, citrátů nebo vliv kyselosti mléka.
3.1.3.5 Kysací schopnost
Kysací schopnost je rozhodujícím kriteriem, zda v mléce bude zajištěn dobrý růst přidaných čistých mlékařských kultur potřebných pro zdárný průběh všech mikrobiologických procesů (GAJDŮŠEK, 2003). Pro hodnocení kysací schopnosti syrového mléka, uvedené jako základní znak jakosti mléka podle ČSN 57 0529, se používá „Stanovení kysací schopnosti mléka“ ON 57 0534 (ŠUSTOVÁ, 2005). Zkouška se provádí za použití jogurtové kultury RX. 50 ml syrového mléka se na vodní lázni ohřeje na 85 °C s výdrží 5 min, následně se ochladí na 43 °C, zaočkuje se 2 ml očkovací jogurtové kultury a inkubuje se při 43 °C v termostatu. Poté se stanoví titrační kyselost titrací NaOH na fenolftalein. Podle požadavků normy musí syrové mléko dosáhnout minimální hodnoty 20 SH, výběrové mléko min. 30 SH. Nevyhovující hodnoty se mohou objevit v přítomnosti inhibičních látek, příp. může problém způsobit nedostatečně vitální použitá mlékařská kultura.
20
3.1.3.6 Tepelná stabilita
Tepelná stabilita mléka je odolnost mléčných bílkovin proti vysrážení při záhřevu, tedy při krátkodobé, šetrné nebo vysoké pasteraci, při UHT záhřevu nebo sterilaci. Tato vlastnost je ovlivněna především složením mléka, skladbou mléčných bílkovin, zastoupením minerálních látek a také vzájemnými vztahy mezi jednotlivými složkami mléka. Vliv na tepelnou stabilitu má i pH mléka, obsah močoviny, změny mléka při skladování a jiné faktory. K přesnému stanovení tepelné stability mléka se používá olejové lázně a definuje se dobou, jež uplyne od umístění vzorků mléka do olejové lázně o konstantní teplotě do začátku
koagulace,
vyvločkování
nebo
zgelovatění
mléčných
bílkovin
(GAJDŮŠEK, 2003). Používá se teplota vodní lázně nad 120 °C. V souvislosti s tepelnou stabilitou mléka se stanovuje i tzv. alkoholová stabilita, která je dle ŠUSTOVÉ (2005) dána minimální procentuální koncentrací etanolu, který po přídavku k mléku způsobí jeho koagulaci. Mléko, které koaguluje při nižší koncentraci etanolu, je potom méně stabilní i během záhřevu. Stanovuje se alkoholovým testem nebo alkoholovým číslem. V obou metodách se ke koagulaci používá 96 % etanol.
3.1.3.7 Měrná hmotnost
Měrná hmotnost je hustota mléka, vyjadřovaná v tzv. mléčných stupních, neboli stupních laktodenzimetrických (°L20), které vyjadřují tisíciny měrné hmotnosti mléka vyšší než 1 nebo jednotky měrné hmotnosti v g/cm3. ŠUSTOVÁ (2005) zmiňuje hustoměry na mléko, tzv. mlékoměry, které jsou cejchovány na teplotu 20 °C. Aby se vzorek mléka zbavil vzduchových bublin a mléčný tuk se převedl do roztaveného rovnovážného stavu, musí se mléko několik minut zahřívat na vodní lázni na teplotu 40 °C a poté zchladit na 20 °C. Mléko se nalije do odměrného válce tak, aby po vložení mlékoměru přetékalo přes okraj. Jakmile se vloží mlékoměr, musí se teplota mezi mlékem a mlékoměrem nechat asi 2 min ustálit, a potom se na stupnici odečte měrná hmotnost v °L. Pokud je teplota mléka vyšší nebo nižší než 20 °C, musí se provést korekce podle tabulky.
21
3.2 Výroba sýrů
Proces výroby sýrů lze stručně rozdělit na dvě fáze – fázi výrobní a fázi zrání. Fáze výrobní zahrnuje přípravu mléka, následné kyselé či sladké srážení, pokrájení sýřeniny, její formování a lisování, případně solení. Fáze zrání zahrnuje dobu od uložení sýra ve zracím sklepě po dosažení plné zralosti sýra. Doba zrání sýrů je různá, od několika dní po několik let.
3.2.1 Fáze výrobní
3.2.1.1 Příprava suroviny před sýřením
Syrové mléko je nejprve třeba podrobit tepelnému ošetření. Pouze některé sýry mají udělenu výjimku výroby z mléka nepasterovaného, např. u nás Gran Moravia, na Slovensku pravá brynza apod. Používané pasterační teploty se liší podle typu vyráběného sýra. Pro tvrdé sýry s vysokodohřívanou sýřeninou typu ementál je optimální teplota 71 – 72 °C po dobu 15 s, pro sýry s nízkodohřívanou sýřeninou se používá zpravidla teplota 75 – 78 °C, u měkkých sýrů je možné použít i teplotu 85 °C na několik sekund (ŠUSTOVÁ, 2008). Příliš vysoké pasterační teploty mohou ve výsledku vést ke snížení výtěžnosti a zhoršení jakosti sýrů. Po pasteraci následuje standardizace obsahu mléčného tuku podle požadovaného typu sýra a obsahu tuku v sušině. Je také třeba brát v úvahu obsah kaseinu v mléce, aby bylo dosaženo požadované sušiny. Homogenizace mléčného tuku má příznivý vliv na hospodárnost výroby a kvalitu čerstvých a plísňových sýrů především proto, že se sníží množství tuku, které při sýření přechází do syrovátky. Homogenizovat však lze pouze smetanu, protože současně se roztříští i kaseinové micely. Pokud by se homogenizovalo mléko, bylo by sice rychlejší srážení, ale zhoršila by se kvalita sýřeniny a následně i sýra. ŠUSTOVÁ (2008) uvádí dvě látky, které je důležité do mléka přidat. První je vápenatá sůl – mléčnan nebo chlorid vápenatý. Hlavní rolí této rozpustné soli
22
je zlepšení syřitelnosti. Obvykle se přidává 20 – 30 g soli na 100 litrů mléka, vyšší dávky by mohly způsobit nežádoucí hořknutí sýrů. Druhou látkou, přidávanou zejména u tvrdých sýrů, je dusičnan draselný v množství max. 20 g na 100 litrů mléka. U sýrů, které dlouho zrají, zabrání tato chemická látka časnému i pozdnímu duření.
Následně se do mléka přidávají čisté mlékařské kultury, které jsou podmínkou správného průběhu celého následujícího technologického procesu. Optimální kyselost mléka, dosažená po přidání těchto kultur, by měla být v rozmezí pH 6,2 – 6,5 a titrační kyselosti 7,2 – 8,2 SH. Kultury dělí GAJDŮŠEK (2000) na primární (zákysové) a sekundární (nezákysové). Jako primární kultury, zajišťující prokysání mléka a uvolňující enzymy, které se podílí na tvorbě chuti a vůně během zrání sýrů, se uplatňují především bakterie rodů Lactococcus, Streptococcus a Lactobacillus a to buď mezofilní (smetanový zákys) nebo termofilní (u sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou) zejména Lactobacillus helveticus a Streptococcus thermophilus. Sekundární kultury přidávané u tvrdých sýrů jsou hlavně Lbc. helveticus a Lbc. casei. U sýrů ementálského typu se pro tvorbu ok v těstě využívají propionibakterie, zejména Pripionibacterium shermanii a Prop. freudenreichii. Pro sýry s mazem na povrchu, např. romadúr nebo tvarůžky, se používá mazová kultura Brevibacterium linens doprovázená kvasinkovou kulturou Mycoderma. Sýry s plísní na povrchu typu hermelín se vyrábí za pomoci kultur Penicillium camemberti, příp. Penicillium caseicolum a Penicillium candidum, sýry s plísní v těstě se očkují plísňovou kulturou Penicillium roqueforti.
3.2.1.2 Sýření
Srážení mléčných bílkovin se provádí několika způsoby – sladké srážení pomocí syřidla, kyselé srážení kyselinou, tepelná koagulace, koagulace pomocí soli nebo srážení velmi vysokým tlakem. Nejčastěji se v praxi využívá srážení enzymové pomocí syřidla a srážení kyselé. Pomocí syřidla, tedy enzymovým tzv. sladkým srážením, se vyrábí všechny zrající sýry. Syřidlové srážení lze rozdělit na fázi primární, sekundární a terciální. V primární 23
fázi
dochází
k
hydrolýze
molekuly
κ-kaseinu
syřidlem
na
para-κ-kasein
a glykomakropeptid, v sekundární fázi především působením vápenatých iontů vzniká trojrozměrný gel shlukováním micel, terciální fázi už řadíme do fáze zrání sýrů a dochází v ní ke tvorbě nových látek, které tvoří výsledné vlastnosti sýra. Jak uvádí ŠUSTOVÁ (2008), syřidla získáváme často z přírodních zdrojů, nejčastěji ze žaludků sajících telat (chymozin), dospělých vepřů a hovězího dobytka (pepsin) nebo žaludků kuřecích a krocaních, dále to jsou mikrobiální enzymy kultury Rhizomucor miehei nebo geneticky modifikovaný chymozin vyrobený pomocí Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger a E. coli. Tradičním zdrojem jsou také rostliny, které produkují enzymy podobných vlastností jako chymozin, nejčastěji bodlák. Kyselá koagulace mléka se využívá hlavně při výrobě tvarohů a čerstvých sýrů. Děje se tak buď okyselením mléka kyselinou, nebo mléčným kvašením, kdy vzniká z laktózy kyselina mléčná. Při pH izoelektrického bodu 4,6 a teplotě okolo 20 °C se sráží všechny kaseinové frakce. Při srážení se rozpouští CCP (micelární kalcium fosfát) a vytváří se nové částice jiného charakteru než původní micela. Tyto částice agregují a vytvoří se síť trojrozměrného gelu stabilizovaná vodíkovými můstky, hydrofobními interakcemi a van der Waalsovými silami. Po skončení sýření tvoří sýřenina stejnoměrnou, porcelánovitou hmotu, vyplňuje krátce po sražení od povrchu ke dnu celý obsah sýrařské vany a je ve velmi nabobtnalém stavu. Oproti původním vlastnostem mléka vykazuje zvýšenou tuhost, uzavřenost hmoty a ohebnou konzistenci (ŠUSTOVÁ, 2005).
3.2.1.3 Zpracování sýřeniny
Pomocí sýrařských harf se sýřenina rozkrájí. Začne vytékat voda a homogenní obsah vany se rozdělí na fázi tuhou (sýřenina) a fázi tekutou (syrovátka). Sýřenina je tvořena vodou a nerozpustnými mléčnými komponenty tukem a kaseinem, syrovátku tvoří rozpustné komponenty laktóza, soli a syrovátkové bílkoviny. Uvolňování syrovátky lze podpořit snížením pasteračního záhřevu, zvýšením dávky vápenatých solí a syřidla, vyšší teplotou sýření, zpracováním na co nejmenší zrno, mícháním zrna, dohříváním nebo zvýšením počtu obracení sýrů. Podle SIMEONOVOVÉ et al. (2003) se velikost sýrového zrna zvolí podle požadované sušiny hotového sýra. U měkkých a čerstvých sýrů je třeba nižší sušiny, 24
takže kousky sýřeniny jsou větší (možno přirovnat k velikosti ořechu), tvrdé sýry mají vyšší sušinu, takže sýřenina se pomele na malé kousky (např. velikosti obilky). Následně se obsah celé vany zahřeje a syrovátka se odpustí. U tvrdých sýrů se používá i tzv. dohřívání sýřeniny pro podpoření vyloučení syrovátky a tím zvýšení sušiny sýra. U tvrdých sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou probíhá tento proces při teplotě 35 – 40 °C, u sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou při teplotě 53 – 55 °C. Teplota vyšší než 55 °C je už nežádoucí, protože by došlo k devitalizaci bakterií mléčného kysání, které jsou významné v procesu zrání. Pro formování sýrů existuje řada tvořítek (ŠUSTOVÁ, 2008), ať už kovových nebo plastových, s možností odtoku syrovátky. Měkké sýry se slisují vlastní vahou, nutné je pravidelné obracení, tvrdé sýry se lisují do forem a nechá se na ně působit po určitou dobu tlak od 0,005 do 0,03 MPa.
3.2.1.4 Solení sýrů
ŠUSTOVÁ (2008) popisuje několik možností solení sýrů. Nejčastěji probíhá nasolování sýrů ve vodní lázni na principu difúze soli dovnitř sýra. Ze solného roztoku přejde do sýra chlorid sodný, ze sýra do solné lázně uniká syrovátka obsahující kyselinu mléčnou, syrovátkové bílkoviny a soli. pH solné lázně odpovídá pH prokysaného sýra, tedy je nutné dodržet pH 5,2 pro tvrdý sýr a 4,8 – 5 pro měkký sýr. Koncentrace solné lázně je maximálně 20 % NaCl. Teplota solné lázně bývá u nedokysaných sýrů po dobu jejich prokysávání 18 – 20 °C, aby došlo k rozvoji mezofilní kultury, po prokysání se teplota sníží na 10 – 12 °C. Podle typu sýra se potom volí doba pobytu sýra v solné lázni, většinou je to otázkou několika dní. Další možnosti solení jsou přídavek soli rovnou do rozkrájeného sýrového zrna před formováním nebo vtírání soli do pokožky sýra během zrání. Solení sýrů podporuje zpevnění povrchu sýrů a upravuje chuť sýrů tak, aby byla přijatelná pro spotřebitele. GAJDŮŠEK (2000) uvádí, že sůl zlepšuje konzistenci, umožňuje odtok syrovátky, zastavuje nebo zpomaluje mléčné kysání, potlačuje činnost nežádoucí mikroflóry a příznivě ovlivňuje další průběh zrání.
25
3.2.2 Fáze zrání
Zrání sýrů představuje změny sýřeniny způsobené hlavně enzymy použitých kultur a enzymy syřidlovými. Během tohoto procesu dochází k tvorbě nových látek, které spolu navzájem reagují, a nově vzniklé produkty vytvářejí typickou konzistenci, chuť a vůni jednotlivých zrajících sýrů. Největším změnám podléhá laktóza, mléčné bílkoviny a u některých sýrů také tuk. Podle GAJDŮŠKA (2000) lze biochemické procesy v průběhu zrání rozdělit na tři na sebe navazující fáze. V primární fázi bakterie mléčného kysání rozkládají laktózu na kyselinu mléčnou, sekundární fáze spočívá v rozkladu kyseliny mléčné na kyselinu propionovou a v terciární fázi dochází k proteolýze. ŠUSTOVÁ (2008) ale dělí tyto procesy na předběžné a vlastní zrání.
3.2.2.1 Předběžné zrání
Při předběžném zrání dochází k tvorbě kyseliny mléčné z laktózy činností bakterií mléčného kysání. Toto zrání probíhá během úpravy mléka i během sýření, zpracování sýřeniny, formování i lisování a ovlivňuje strukturu, konzistenci i další průběh zrání. Kysání je nejintenzivnější během odkapávání a lisování. Pokud však po lisování není tento proces ještě ukončen, dávají se sýry do speciálních místností k dokysání, kde je nutné během 24 hodin dosáhnout požadované hranice kyselosti, což je podle ŠUSTOVÉ (2008) u tvrdých sýrů pH 5,1 – 5,2 a u měkkých sýrů 4,8 – 5, 0. Někdy se nechávají sýry dokysávat i během solení, je však třeba volit zpočátku vyšší teplotu solné lázně. Zbytky laktózy v sýrech ale zůstávají i po nasolení, poslední stopy vymizí u tvrdých sýrů až v prvních dnech vlastního zrání.
3.2.2.2 Vlastní zrání
V této fázi zrání dochází ke dvěma procesům, nejprve je to snížení kyselosti následkem rozkladu kyseliny mléčné na kyselinu propionovou mikrobiálními enzymy.
26
Jako vedlejší produkty vznikají oxid uhličitý a voda. Podle GAJDŮŠKA (2000) může dojít i k vazbě kyseliny mléčné na rozkladné produkty bílkovin. Následuje proteolýza a částečné štěpení tuků za současné tvorby typických aromatických a chuťových látek. Para-κ-kasein se štěpí na polypeptidy, dipeptidy a aminokyseliny. Z aminokyselin mohou při nevhodném průběhu zrání vznikat nežádoucí škodlivé látky, např. amoniak, močovina, sirovodík, kyselina máselná a jiné těkavé kyseliny, putrescin, kadaverin atd. Struktura sýrů se v procesu zrání stává elastičtější, protože sýrové zrno se rozptyluje v sýrové hmotě, ztrácí se voda a díky aktivitě enzymů mírně roste pH, protože se uvolňují alkalické sloučeniny. Sýr také ztrácí vodu a probíhá tvorba plynu. Podle množství bílkovin rozložených během zrání a podle stupně jejich rozložení rozeznáváme termíny rozsah zrání a hloubka zrání (ŠUSTOVÁ, 2008). Rozsah zrání je poměr dusíku látek rozpustných ve vodě k dusíku všech dusíkatých látek, hloubka zrání je poměr dusíku aminokyselin a amoniaku k dusíku všech dusíkatých látek. Podle typu sýra rozlišuje GAJDŮŠEK (2000) anaerobní a aerobní zrání. Anaerobní zrání probíhá uvnitř těsta v celé hmotě, aerobní je tzv. zrání od povrchu působením mikroflóry na povrchu sýra. Tyto dva typy zrání se u sýrů většinou doplňují. Sýry mohou zrát buď volně, ve zracích obalech, nebo pod ochrannými nátěry. Zrání probíhá ve zracích sklepech bez přístupu slunečního záření za stálé optimální teploty. Měla by být zajištěna ventilace vzduchu a požadovaná vzdušná vlhkost a sýry by měly být dobře chráněny před hmyzem a hlodavci.
3.3 Mikroorganismy ve výrobě sýrů
Do mléka k výrobě sýrů se podle ŠUSTOVÉ (2008) ještě před sýřením nebo až po něm přidávají kultury mikroorganismů za účelem správného průběhu zracího procesu a tvorby typických chuťových a aromatických látek, vytvoření správné textury a jiných vlastností, charakteristických pro dané sýry. Vlivem nedodržení hygienických opatření však může dojít ke styku mléka s prachem a výkaly nebo k rekontaminaci mléka po pasteraci a do mléka se dostávají mikroorganismy nežádoucí, které způsobují vady sýrů a mohou ohrozit i zdraví konzumenta.
27
3.3.1 Prospěšné mikroorganismy
Mikroorganismy, které se účastní zrání a působí pozitivně na tvorbu chuti, vůně, konzistence a jiných vlastností sýrů, rozděluje ŠUSTOVÁ (2008) na zákysové bakterie, nezákysové bakterie, mazové kultury, ušlechtilé kulturní plísně, propionové bakterie a kvasinky.
3.3.1.1 Zákysové bakterie
Patří sem bakterie mléčného kysání mající schopnost vyprodukovat při 30 – 37 °C za 6 hodin z laktózy takové množství kyseliny mléčné, které sníží pH mléka z původní hodnoty asi 6,8 na méně než 5,3. Přidání čistých kultur do mléka je nutné pro zdárný průběh celého procesu výroby sýrů. GAJDŮŠEK (2000) rozděluje zákysové kultury podle druhu vyráběného sýra na mezofilní a termofilní. Mezofilní zákysové kultury jsou používány hlavně při výrobě sýrů s nedohřívanou nebo nízkodohřívanou sýřeninou, zejména to jsou sýry holandského typu eidam nebo gouda, plísňové sýry, čedar, ale i tvarohy nebo čerstvé sýry. Tyto kultury jsou tvořeny druhy rodů
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Enterococcus
a Leuconostoc. Jednotlivé kmeny těchto druhů se od sebe liší mnohými vlastnostmi, např. různou produkcí kyselin nebo různou odolností vůči bakteriofágům. Termofilní zákysové kultury se používají u sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou, jako jsou parmezán, ementál nebo Moravský bochník. Kultury tvoří Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lbc. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lbc. delbrueckii ssp. lactis nebo Lbc. helveticus. Hlavní společnou vlastností zákysových kultur bakterií mléčného kysání je podle ŠILHÁNKOVÉ (2002) produkce kyseliny mléčné z laktózy a jejích složek glukózy a galaktózy, nebo z kyseliny citrónové. Jako vedlejší produkty se tvoří etanol a oxid uhličitý. Pomocí proteolytických enzymů štěpí tyto bakterie bílkoviny a mění vzniklé aminokyseliny na aromatické a chuťové látky.
28
3.3.1.2 Nezákysové bakterie
Pocházejí především ze syrového mléka, ale vyskytují se i v mléce pasterovaném buď jako následek rekontaminace ze zařízení, nebo to jsou bakterie termorezistentní, které přežívají šetrnou pasteraci (ŠUSTOVÁ 2008). Nejčastěji to jsou mezofilní laktobacily a pediokoky, hlavně druhy Lactobacillus casei, Lbc. paracasei, Lbc. plantarum, Lbc. rhamnosus, Pediococcus acidilactici nebo Ped. pentosaceus. Jejich zdrojem je nejčastěji kyselina citronová nebo citrany, příp. uhlíkaté produkty vznikající při autolýze buněk zákysových kultur nebo membrány tukových kapének. Jejich aktivita je různá, většinou však interagují se zákysovými bakteriemi a může probíhat řada rozličných reakcí. Problém může nastat, pokud nezákysové bakterie inhibují aktivitu jiných kultur, zejména při kompetici o živiny.
3.3.1.3 Mazové kultury
Mazová kultura se skládá z proteolytických bakterií Brevibacterium linens (příp. Brevibacterium brevis), mikrokoků a kvasinek, hlavně Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii, Candida nebo Kluyveromyces (ŠUSTOVÁ, 2008). Zpočátku jsou dominantní mikroflórou kvasinky, teprve později začnou převažovat bakterie. Brevibacterium linens je grampozitivní tyčinka, halotolerantní až halofilní s optimem teplot asi 21 °C, snese prostředí s 15 % NaCl a pH 6 – 9,8. V přítomnosti kyslíku vytvoří asi za pět dní červenooranžové pigmenty, které jsou charakteristické pro sýry zrající pod mazem, zejména romadúr nebo tvarůžky. ŠUSTOVÁ (2009) uvádí, že proteolytické bakterie vyžadují neutrální pH, ale mladé sýry mají kyselý charakter, pH je okolo 5, proto je třeba činnosti kvasinek. Hlavní úlohou kvasinek během aerobního zrání je oxidovat více než 90 % přítomné kyseliny mléčné na oxid uhličitý a vodu při teplotě 12 – 16 °C a vysoké vzdušné vlhkosti, tím se pH posunuje do neutrální oblasti. Kromě toho kvasinky deaminují aminokyseliny vzniklé při proteolýze, vytváří z nich příslušné oxokyseliny a uvolňují amoniak, který vnikne do hmoty sýra a sníží jeho kyselost. Především na povrchu se tedy vytvoří vhodné prostředí pro růst proteolytických bakterií.
29
Sýry zrají směrem od povrchu dovnitř a konzistence zralého sýra je vláčná až roztékavá. Charakteristická je pro sýry pod mazem nejen výrazná vůně, ale i pikantní chuť.
3.3.1.4 Ušlechtilé plísně
Plísňové kultury se používají pro dvě skupiny sýrů. Jsou to sýry s plísní na povrchu a sýry s plísní v těstě. Hlavní součástí plísňových kultur jsou plísně rodu Penicillium. Jak uvádí ŠILHÁNKOVÁ (2002), je známo více než 150 druhů tohoto rodu a jsou to tedy
nerozšířenější
plísně
vůbec.
Tvoří
kolonie
s mnoha
žlutozelenými
až modrozelenými konidiemi, které jsou na potravinách patrné jako zelené, sametově bílé až moučné povlaky. Sýry s plísní na povrchu zrají vlivem kultury Penicillium camemberti (příp. Penicillium caseicolum) a podobně jako u sýrů zrajících pod mazem se zde uplatňují i kvasinky, typický je nástřik Geotrichum candidum. Na povrchu sýrů se asi po týdnu zrání vytvoří povlak bílé sametové plísně. S postupem zrání sýřenina měkne a stává se vláčnější, roztíratelnou. To je způsobeno především zvyšováním pH sýrů, štěpením αS1-kaseinu enzymy syřidla a proteolytickými enzymy plísní, které postupně difundují z povrchu sýra dovnitř těsta. Stav zracího procesu se kontroluje na řezu sýrů na základě barvy sýrového těsta. Pokud je střed ještě neprozrálý, zůstává bílý, zatímco zralá vrstva pod povrchem dostává smetanovou barvu. Sýry s plísní na povrchu pocházejí z Francie, za všechny lze jmenovat camembert nebo brie, u nás hermelín. CALLEC (2003) uvádí, že ve Velké Británii se sýry s bílou plísní vyrábí i z kozího mléka (sýry bosworth a tymsboro) nebo mléka ovčího (sýr wigmore). Tyto sýry většinou zrají 3 – 4 týdny a na konci zrání je pro ně typická žampionová příchuť, způsobená kulturními plísněmi.
Sýry s plísní v těstě charakterizuje kultura ušlechtilé zelenomodré plísně Penicillium roqueforti, která se přimíchává ve formě suspenze jejích spór do mléka ještě před srážením, nebo se spóry zapravují rovnou do sýrového zrna. Před uložením sýra do zracího sklepa je nutné sýr propíchat, protože růst plísně i fermentace jsou procesy aerobní. Na povrchu sýra se během zrání tvoří maz, který se musí pravidelně oškrabovat, aby se propíchané kanálky neucpaly. Sýr zraje 30
v celém těstě rovnoměrně a plíseň rozkládá kyselinu mléčnou, bílkoviny i tuk a vznikají tak typické chuťové a aromatické látky. ŠUSTOVÁ (2008) uvádí, že tuk je štěpen i kvasinkami (Torulopsis a Candida) a některými bakteriemi, které pomocí enzymů tvoří z tuku zapáchavé zplodiny, např. kyselinu máselnou, kapronovou nebo ketony. Některé ketony jsou však žádoucí, protože inhibují růst nekulturních plísní a přílišný růst plísní kulturních. Sýry zrají zpočátku deset dnů při teplotách 12 – 14 °C a poté dozrávají až osm týdnů při teplotách 8 – 10 °C. Jsou charakteristické vyšším obsahem tuku, drobivou a mazlavou strukturou a obvykle vyšším obsahem soli. Hlavním zástupcem těchto sýrů je francouzský roquefort původně z ovčího mléka, dále italská gorgonzola, dánský danablu, britský stilton nebo česká niva. Méně známé jsou třeba norský gammelost nebo britský Exmoor Blue a Harbourne Blue, všechny vyráběné z kozího mléka. Sýry z ovčího mléka uvádí FOX (2004), jsou to španělský sýr Gamonedo nebo řecký sýr Kopanisti.
3.3.1.5 Propionové bakterie
Propionibacterium
freudenreichii
a
Prop.
shermanii
jsou
podle
ŠILHÁNKOVÉ (2002) krátké grampozitivní anaerobní až aerotolerantní nesporulující tyčinky, které uvnitř sýra za anaerobních podmínek fermentují zejména mléčnany, ze kterých tvoří kyselinu propionovou, kyselinu octovou, oxid uhličitý a vodu. Hydrolýzou peptidů tvoří prolin, který spolu s vápenatou solí kyseliny propionové tvoří typickou nasládlou chuť sýrů. Oka v sýrech ementálského typu tvoří oxid uhličitý. Pokud je jeho množství tak velké, že už nemůže být rozpuštěn vodou, vylučuje se ve formě plynu většinou tam, kde je těsto méně tuhé. Velikost ok nebo jejich množství je tedy dáno především fyzikálními vlastnostmi sýrového těsta. Ze sýrů s oky je nejznámější švýcarský ementál. Je jemný, nasládlý a chutná po lískových oříšcích. Podle CALLECA (2002) nejlepší ementály voní a chutnají také po čerstvě posečeném senu. U nás se vyrábí primátor nebo moravský bochník.
31
3.3.1.6 Kvasinky
Kvasinky se uplatňují u sýrů zrajících od povrchu dovnitř, tedy sýrů zrajících pod mazem a sýrů s plísní na povrchu. Jsou zatím nejméně prozkoumanou složkou mikroflóry používané u těchto sýrů. Nejvýznamnější z kvasinek izolovaných z těchto sýrů jsou druhy Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Geotrichum candidum, Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hanseni, Cryptococcus catenulata nebo Yarovia lipolytica. Dále se uplatňují rody Candida, Hansenula, Pichia, Rhodotorula a Zygosaccharomyces. Podle ŠILHÁNKOVÉ (2002) se jednotlivé rody liší mírou kvasných schopností. Například rod Pichia má velice nízké kvasné schopnosti, protože zkvašuje pouze glukózu nebo nezkvašuje žádný cukr, naproti tomu kvasinky rodu Saccharomyces mají vysoké kvasné schopnosti, protože zkvašují většinou i více cukrů najednou. Kvasinky jsou podle ŠUSTOVÉ (2008) zpočátku zrání dominantní mikroflórou u sýrů zrajících od povrchu dovnitř a startují aerobní fázi zrání. Pomocí enzymů kvasinek, lipolytických a proteolytických, jsou tvořeny nové látky, které z povrchu difundují dovnitř sýrového těsta. Dochází k asimilaci laktátů a tvorbě alkalických produktů, pomocí kterých se odkyseluje povrch i vnitřek sýra a je tak podpořeno rozmnožování kulturních proteolytických plísní a bakterií. Kvasinky tedy vytvářejí vhodné prostředí pro tyto kulturní mikroorganismy a produkují pro ně potřebné růstové látky, např. hydrofilní vitamíny. Vzniklými metabolity také přispívají k tvorbě chuti a vůně sýrů.
3.3.2 Mikroorganismy způsobující vady sýrů
3.3.2.1 Koliformní bakterie
Koliformní bakterie patří do čeledi Enterobacteriaceae a jsou to dle ŠILHÁNKOVÉ (2002) gramnegativní nesporulující aerobní nebo fakultativně anaerobní mikroorganismy, které zkvašují cukry na kyseliny, plyny a aldehydy. Patří sem Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Citrobacter a Klebsiella.
32
Z hlediska vad, které způsobují u sýrů, jsou nejvýznamnější enterotoxigenní patogenní kmeny Escherichia coli, které zapříčiňují tzv. síťovitost, neboli hnidovitost sýrů. KOMPRDA (2007) uvádí, že rostou v teplotním rozmezí 7 – 46 °C, pH 4,4 – 9 a při vodní aktivitě nad 0,96. Inhibuje je koncentrace soli nad 8,5 % a ničí se pasterací. Escherichia coli zkvašuje laktózu, glukózu, některé alkoholické cukry a pentosany a tvoří z nich kyselinu pyrohroznovou, mléčnou, octovou a mravenčí. Kyselinu mravenčí dále rozkládá na oxid uhličitý a vodík. Do mléka se mohou dostat z výkalů, z půdy nebo z prachu. V mléce mohou zůstat i po neúčinné pasteraci nebo může dojít k rekontaminaci pasterovaného mléka plynotvornými bakteriemi skupiny Coli aerogenes, které způsobují časné duření sýrů. Je to nadouvání sýrů ještě před zráním zapříčiněné silnou tvorbou plynu, ke kterému dochází již v průběhu lisování do bloků nebo nasolování v solné lázni. Ve vyšším množství může dojít u mléčných výrobků k vadám jako je táhlovitost, chuť a vůně po trávě nebo hořknutí. Prevencí Escherichia coli rozumí KOMPRDA (2007) aplikaci systému HACCP, správné provedení pasterace mléka, správnou zootechnickou praxi a vytvoření vhodných hygienických podmínek při výrobě sýrů. U některých potravin je účinná i aplikace ionizujícího záření v dávce přibližně 1,5 kGy.
3.3.2.2 Klostridia
Klostridia charakterizuje ŠILHÁNKOVÁ (2002) jako anaerobní, sporulující, mezofilní, grampozitivní tyčinky, které ze vzduchu fixují dusík a energii získávají máselným kvašením. Produkují kyselinu máselnou a často se používají i k její průmyslové výrobě.
Některé tvoří
toxiny,
nebezpečné pro
zdraví
člověka.
ŠILHÁNKOVÁ (2002) dále uvádí, že při anaerobní oxidaci tvoří klostridia velké množství plynů, hlavně oxid uhličitý a vodík, což se negativně projevuje hlavně v sýrařství. Nejvýznamnějšími bakteriemi máselného kvašení jsou Clostridium butyricum a Cl. tyrobutyricum, které se do mléka mohou dostat hlavně z nekvalitních siláží a problémem je, že se neničí pasterací. Způsobují tzv. pozdní duření tvrdých sýrů. V těstě sýrů se objevují velké dutiny, povrch sýra je vydutý, chuť sýra štiplavá po kyselině máselné a sýr nepříjemně zapáchá po sirovodíku. 33
Hlavními opatřeními proti nadouvání sýrů jsou dle KOMPRDY (2007) dodržování hygienických zásad při manipulaci s mlékem, účinná pasterace a použití přiměřené dávky smetanového zákysu. Účinným opatřením proti množení klostridií je přídavek dusičnanu draselného v množství 20 – 30 gramů na 100 litrů mléka. Někdy se u sýrů může vyskytnout i tzv. bílá hniloba, která je také způsobena klostridii, konkrétně druhem Clostridium sporogenes, který má silné proteolytické schopnosti a uplatňuje se při anaerobním rozkladu bílkovin (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Opatření proti Cl. sporogenes jsou obdobná jako u bakterie Cl. butyricum.
34
4
MATERIÁL A METODIKA
4.1 Charakteristika analyzovaných vzorků
4.1.1 Termizovaná bryndza plnotučná
Plnotučná termizovaná bryndza je vyráběna firmou Liptovská mliekareň, a.s. a distributorem pro Českou republiku je PRIBINA, spol. s.r.o. Pro její výrobu se používá ovčí mléko v kombinaci s mlékem kravským. Hlavními složkami jsou skladovaný ovčí hrudkový sýr, hrudkový sýr mlékárenský, pitná voda a jedlá sůl. Sýr je vhodný pro přípravu jídel ve studené i teplé kuchyni. Informace na obalu udávají celkový obsah sušiny 44 %, tuk 21,5 %, sůl 2,5 %. Energetická hodnota 100 g výrobku je 1130 kJ (270 kcal).
Obr. 1 Termizovaná bryndza plnotučná
4.1.2 Soignon Chévre a Tartiner
Přírodní čerstvý kozí sýr vyráběný firmou Eurial (Nantes, Francie). Podle firmy IMCO, s.r.o., která tento sýr distribuuje v České republice, je to sýr snadno roztíratelný, s lehkou chutí a vůní typickou pro kozí sýry. Výhodou je jeho balení, kdy je sýr hermeticky uzavřen v krabičce a při opakovaném použití ji lze vždy pevně uzavřít, což zaručuje udržení maximální kvality sýru (www.imco.cz, 2010). Podle údaje
35
na obalu jsou hlavními složkami kozí mléko, mlékařské kultury a jedlá sůl. Sýr lze neotevřený v chladničce uchovat déle než půl roku bez zhoršení jeho jakosti. Je určen k přímé spotřebě, pro použití v hlavním menu i jako příloha. Podle dostupných informací o složení má tento sýr celkový obsah sušiny minimálně 27 %, tuk v sušině min. 40 % a energetickou hodnotu 749 kJ (177 kcal) na 100 g výrobku.
Obr. 2 Soignon Chévre a Tartiner
4.2 Charakteristika živných médií
4.2.1
PCA agar se sušeným odtučněným mlékem
PCA se sušeným odtučněným mlékem (Plate-Count-Agar with Skimmed Milk) je agar s glukózou, tryptonem a kvasničným extraktem, proto se pro něj někdy používá česká zkratka GTK. Používá se pro stanovení celkového počtu mikroorganismů. Dle výrobce (Biokar Diagnostics, Francie) je složení půdy: trypton 5,0 g, kvasničný extrakt 2,5 g, glukóza 1,0 g, sušené odtučněné mléko 1,0 g, agar 12,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Příprava agaru spočívá ve smíchání 21,5 g dehydrovaného živného média s destilovanou vodou, ponechá se několik minut stát, pak se za častého míchání zahřívá k varu do úplného rozpuštění. Upraví se pH, aby jeho hodnota po sterilizaci při 121 °C po dobu 15 min činila 7,0 při 25 °C.
36
4.2.2 MRS agar
MRS agar (de Man-Rogosa-Sharpe agar) je selektivně diagnostická živná půda, používaná ke stanovení bakterií mléčného kysání rodu Lactobacillus ve vzorku potraviny. Metoda stanovení je dle normy ČSN ISO 15211:2000. Dle výrobce (Biokar Diagnostics, Francie) je složení půdy: masový extrakt 10,0 g, pepton 10,0 g, kvasničný extrakt 5,0 g, glukóza 20,0 g, tween 80 1,0 g, síran manganatý 0,05 g, agar 15,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Agar se připraví smícháním 70,3 g dehydrovaného živného média s destilovanou vodou a ponechá se několik minut stát, poté se za častého míchání zahřívá k varu do úplného rozpuštění. Upraví se pH, aby jeho hodnota po sterilizaci při 121 °C po dobu 15 min činila 3,7 při 25 °C.
4.2.3
YGC agar
YGC agar (Yeast extract Glucose Chloramphenicol agar) je selektivně diagnostická půda, která se používá ke stanovení kvasinek a plísní podle ČSN ISO 6611. Často ji najdeme pod českou zkratkou GKCh, protože obsahuje glukózu, kvasničný extrakt a chloramfenikol. Dle výrobce (Biokar Diagnostics, Francie) je složení půdy: kvasničný extrakt 5,0 g, glukóza 20,0 g, chloramfenikol 0,1 g, agar 12,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Všechny složky se smíchají s destilovanou vodou a ponechá se několik minut stát, poté se za častého míchání zahřívá k varu do úplného rozpuštění. Upraví se pH, aby jeho hodnota po sterilizaci při 121 °C po dobu 15 min činila 6,6 při 25 °C.
4.2.4 Petrifilm
Petrifilmy jsou přenosné destičky ke stanovení mikrobiologické kvality potravin. Je to médium, které je přímo připraveno k naočkování vzorků. Petrifilm se skládá ze dvou vrstev filmů, které obsahují živná média, gel rozpustný ve studené vodě a indikátor, který zvýrazní narostlé kolonie. Pro usnadnění počítání je natištěna praktická mřížka. 37
Pro stanovení počtu koliformních bakterií se používá Petrifilm™ Rapid coliforms count plate P2000 (P2000 CC).
4.3 Stanovované mikroorganismy
Ve vzorcích sýrů byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: Celkový počet mikroorganismů (CPM) na PCA agaru se sušeným odtučněným mlékem, inkubace při 30 °C po dobu 72 hodin. Bakterie mléčného kysání na MRS agaru, inkubace při 30 °C po dobu 72 hodin. Kvasinky a plísně na YGC agaru, inkubace při 25 °C po dobu 120 hodin. Koliformní bakterie na Petrifilm™ Rapid coliforms count plate P2000 (P2000 CC), inkubace při 37 °C po dobu 24 hodin.
4.4 Příprava a inkubace vzorků
V rozborech byly analyzovány ovčí sýr Termizovaná bryndza plnotučná (s obsahem 48,9 % t. v. s.) a čerstvý kozí sýr Soignon Chévre a Tartiner (40 % t. v. s.). Analýzy
byly
prováděny
v mikrobiologické
laboratoři
Ústavu
agrochemie,
půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin na Mendelově univerzitě v Brně. U vzorků sýrů se stanovoval celkový počet přítomných mikroorganismů, bakterie mléčného kysání, koliformní bakterie a kvasinky a plísně. Ředící roztoky a živné půdy byly sterilizovány při 121 °C po dobu 20 min v parním sterilizátoru, ostatní sklo při 165 °C po dobu 60 min v horkovzdušném sterilizátoru. Z každého sýra byl odebrán reprezentativní vzorek o hmotnosti 10 g, který byl vložen do plastového sáčku a zalit sterilní destilovanou vodou (90 ml). Následně byl vzorek 1 min homogenizován v homogenizátoru typu STOMACHER. Následovala příprava vhodného ředění. Pro vzorek č. 1 (bryndza) se zvolilo pro stanovení celkového počtu mikroorganismů ředění 10-1 a 10-2, pro stanovení bakterií mléčného kysání ředění 10-1 a 10-2, pro koliformní bakterie pouze 10-1, pro kvasinky
38
a plísně 10-1 a 10-2. Pro vzorek č. 2 (kozí sýr) se volilo vyšší ředění pro celkový počet mikroorganismů (10-3 a 10-4) a pro bakterie mléčného kysání (10-2 a 10-3). Pro koliformní bakterie a kvasinky a plísně bylo použito stejné ředění jako u vzorku č. 1. Vzorky byly po 1 ml příslušného ředění očkovány do sterilní Petriho misky a zality živnou půdou zchlazenou na cca 43 – 45 °C. Po uplynutí potřebné doby byly na miskách odečteny vyrostlé kolonie a výsledek byl vyjádřen v KTJ/g. Počty mikroorganismů se spočítaly podle vzorce:
N=
∑C V ⋅ d ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n 2 )
N … KTJ v 1 g vzorku
∑C … součet kolonií vyrostlých ve dvou po sobě jdoucích ředěních V … objem inokula (ml) d … nižší ze dvou k odečtu použitých ředění n1 … počet misek vybraných k odečtu od prvního ředění n2 … počet misek vybraných k odečtu od druhého ředění
39
5
VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE
V praktické
části
této
bakalářské práce byly sledovány celkové počty
mikroorganismů, počty bakterií mléčného kysání, koliformní bakterie a kvasinky a plísně ve vzorcích kozího sýra (čerstvý sýr Soignon Chévre a Tartiner) a ovčího sýra (termizovaná bryndza plnotučná).
U termizované bryndzy byl výpočtem ze vzorce zjištěn celkový počet mikroorganismů 1,0 . 103 KTJ/g sýra, počty bakterií mléčného kysání byly velmi nízké a dosáhly 50 KTJ/g, koliformních bakterií bylo přítomno méně jak 10 KTJ/g a počty kvasinek a plísní byly 10 KTJ/g. Celkový počet mikroorganismů u kozího sýra byl 1,8 . 103 KTJ/g, bakterie mléčného kysání byly přítomny v množství menším jak 100 KTJ/g, koliformních bakterií bylo méně jak 10 KTJ/g a kvasinek a plísní bylo 50 KTJ/g. Výsledky jsou shrnuty v Tab. 2.
Tab. 2 Počty mikroorganismů v KTJ/g CPM
BMK
Koliformní bakterie
Kvasinky a plísně
Bryndza
1 . 103
50
méně jak 10
10
Kozí sýr
1,8 . 103
méně jak 100
méně jak 10
50
Tradiční slovenská bryndza je vyrobena z nepasterovaného ovčího mléka a obsahuje velké množství bakterií. Termizovaná bryndza je ale produkt prostý probiotických vlastností, protože je tepelně upraven termizací. Veškeré mikroorganismy se zničí vysokou termizační teplotou, která se použije těsně před zabalením sýra, proto byl zjištěný počet mikroorganismů nižší než u kozího sýra. Z výživového hlediska je termizovaná bryndza jen obyčejným sýrem zaplňujícím žaludek, chuťově imitující slovenskou bryndzu (www.eastlabs.biz). U kozího sýra je výsledný počet mikroorganismů nižší než by měl být, čerstvý sýr by měl obsahovat podstatně víc mikroorganismů. Koliformních bakterií, kvasinek
40
a plísní bylo zjištěno málo, proto lze předpokládat, že podstatnou část mikroflóry tvořily bakterie mléčného kysání.
Nařízení EP a Rady (ES) 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny ze dne 15. listopadu 2005 nedefinuje limit CPM a bakterií mléčného kysání pro sýry. Dle Nařízení EP a Rady (ES) 2073/2005 je limit pro sýry z tepelně ošetřeného mléka nebo tepelně ošetřené syrovátky maximálně 103 KTJ/g koliformních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Oba dva sledované sýry tedy vyhovují těmto požadavkům. Limit pro kvasinky a plísně v sýrech není Vyhláškou 132/2004 ani Nařízením EP a Rady (ES) 2073/2005, které nahradilo tuto vyhlášku, definován.
41
6
ZÁVĚR
Z výsledků mikrobiologických rozborů termizované plnotučné bryndzy a čerstvého kozího sýra lze vyvodit následující závěr: U termizované bryndzy byly počty mikroorganismů nízké, protože bryndza byla těsně před plněním do kelímků tepelně ošetřena termizací, která podstatně snížila počty přítomné mikroflóry. Rovněž u kozího sýra byly zjištěny nízké počty mikroorganismů, a to i přesto, že sýr nebyl před plněním tepelně ošetřen. Počty koliformních bakterií byly u obou sýrů podstatně nižší, než je maximální limit stanovený Nařízením EP a Rady (ES) 2073/2005. Analyzované vzorky sýrů Termizovaná bryndza plnotučná (výrobce Liptovská mliekareň, a. s.) a Soignon Chévre a Tatiner (výrobce Eurial, Nantes, Francie) vyhovují mikrobiálním požadavkům, stanoveným Nařízením EP a Rady (ES) 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny.
42
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY •
CALLEC, C.: Encyklopedie sýrů. 1. vyd. Čestlice: Rebo Productions, 2003. 256 s. ISBN 80-7234-225-8.
•
CWIKOVÁ, O.: Obecná hygiena potravin – materiály ze cvičení, 2009.
•
FANTOVÁ, M.: Základy chovu koz. 2. vyd. Praha: Institut výchovy a vzdělávání Ministerstva zemědělství ČR, 1997. 49 s. Živočišná výroba. ISBN 80-7105-143-8.
•
FOX, P. F.: Cheese : Volume 1. General Aspects. 2. vyd. London: Chapman & Hall, 1993. 601 s. ISBN 0-412-53500-9.
•
FOX, P. F.: Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology: Volume 2. Major Cheese Groups. 2. vyd. London: Chapman & Hall, 2004. 577 s. ISBN 0-41253510-6.
•
GAJDOŠÍK, M.: Chov oviec. Bratislava: Priroda, 1984. 355 s.
•
GAJDŮŠEK, S.: Laktologie. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003. 78 s. ISBN 80-7157-657-3.
•
GAJDŮŠEK, S.: Mlékařství II. 2. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2000. 142 s. ISBN 80-7157-342-6.
•
GÖRNER, F., VALÍK, L.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín: principy mikrobiológie požívatín, potravinársky významné mikroorganizmy a ich skupiny, mikrobiológia potravinárskych výrob, ochorenia mikrobiálného pôvodu, ktorých zárodky sú prenášané poživatinami. 1. vyd. Bratislava: Malé Centrum, 2004. 528 s. ISBN 80-967064-9-7.
•
HORÁK, F., a kol.: Ovce a jejich chov. 1. vyd. Praha: Brázda, 2004. 303 s. ISBN 80-209-0328-3.
•
HÖKL, J.: Mléko a výrobky z něho jako příčina nemocí. 1. vyd. Praha: Orbis, 1946. 130 s.
•
HÖKL, J., DOBEŠ, M.: Hygiena potravin. 1. vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1953. 197 s. Učební texty vysokých škol.
•
Chov ovcí a koz v předvstupním období do EU. Brno: MZLU, 2000. 107 s. ISBN 80-7157-462-7.
•
KALHOTKA, L.: Potravinářská mikrobiologie I – přednášky, 2008.
•
KOMPRDA, T.: Hygiena potravin. 2. vyd. Brno: MZLU, 2007. 171 s. ISBN 807157-276-4. 43
•
Lexikon sýrů: výroba, původ, druhy, chuť. 1. vyd. Dobřejovice: Rebo Productions, 2004. 301 s. ISBN 80-7234-379-3.
•
LINHART, T.: Výroba sýrů v českých družstevních mlékárnách na Moravě: Příspěvek k moravskému sýrařství. Praha: Ministerstvo zemědělství, 1924. 126 s.
Časové spisky ministerstva zemědělství. •
Mliekarstvo: bulletin pre internú potrebu výrobcov a spracovatel'ov mlieka. Vyd. březen 2008, červen 2008, září 2008. ISSN 1210-3144.
•
MOWLEM, A.: Goat Farming. 2. vyd. Ipswich: Farming Press, 1988. 183 s. ISBN 0-85236-235-8.
•
SIMEONOVOVÁ, J., INGR, I., GAJDŮŠEK, S.: Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003. 122 s. ISBN 978-80-7157-708-9.
•
ŠILHÁNKOVÁ, L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vyd. Praha: Academia, 2002. 363 s. ISBN 978-80-200-1703-1.
•
ŠTOLC, L.: Základy chovu ovcí. 2. vyd. Praha: Institut výchovy a vzdělávání Ministerstva zemědělství ČR, 1999. 40 s. Živočišná výroba. ISBN 80-7105-185-3.
•
ŠUSTOVÁ, K.: Laktologie (návody do cvičení). Brno: MZLU, 2005. 45 s. Oficiálně nevydáno.
•
ŠUSTOVÁ, K.: Mlékárenské technologie (návody do cvičení). Brno: MZLU, 2005. 117 s. Oficiálně nevydáno.
•
ŠUSTOVÁ, K.: Sýrařství. Brno: MZLU, 2008. 72 s. Oficiálně nevydáno.
•
http://koktail.pravda.sk/bryndza-je-biele-zlato-lekari-ju-ospevuju-f19/sk_kzdravie.asp?c=A070513_121159_sk_kzdravie_p20
•
http://www.csnormy.cz
•
http://www.eastlabs.biz/article/1251/SID=cq36s1ujkd6vf327b48fmcuj55
•
http://www.imco.cz/cz/produkt/chevre-a-tartiner/
•
http://www.kozinka.com
Legislativní podklady •
ČSN
56
9609:
Pravidla
správné
hygienické
a
výrobní
praxe
Mikrobiologická kritéria pro potraviny
•
Nařízení EP a Rady (ES) 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny
44
-
•
Nařízení EP a Rady (ES) 852/2004 o hygieně potravin
•
Nařízení EP a Rady (ES) 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu
•
Vyhláška 203/2003 Sb. o veterinárních požadavcích na mléko a mléčné výrobky
•
Zákon 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů
45
