MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DISERTAČNÍ PRÁCE
BRNO 2015
Ing. LUKÁŠ NEJDL
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Chemie a Biochemie
Použití spektroskopických technik pro studium interakcí platinových komplexů a nanočástic s nukleovými kyselinami Disertační práce Studijní obor:4106V017 Zemědělská chemie
Vedoucí práce: Doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Školitel specialista: Dr. Ing. Branislav Ruttkay-Nedecký
Brno 2015
Vypracoval: Ing. Lukáš Nejdl
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe disertační práce na téma „Pouţití spektroskopických technik pro studium interakcí platinových komplexů a nanočástic s nukleovými kyselinami“ je samostatným autorským dílem podle Autorského zákona. Nositelem majetkového autorského práva je pracoviště a univerzita. Výsledky práce shrnuté v této závěrečné práci byly financovány z veřejných prostředků z Evropských fondů a státního rozpočtu České republiky. Vzniklé dílo jako celek je chráněno autorským zákonem. Užití tohoto díla pro další šíření a využívání je vázáno na uzavřenou výhradní licenční smlouvu. Podle § 12 autorského zákona platí, že autorské dílo lze užít jen se svolením autora. Základní informace o práci jsou přístupné všem žadatelům a jsou plně k dispozici (abstrakt). V případě zájmu o využití díla pro další užití (výuka, prezentace, konference, komerční účely) je zapotřebí se řídit licenčními podmínkami. Licenční podmínky jsou dány licenční smlouvou, kde na jedné straně je pracoviště vzniku díla a děkana nebo rektora univerzity (nositel majetkového autorského práva) a na druhé straně je žadatel o využití výsledku. Realizátor závěrečné práce podléhá licenčním podmínkám, pokud jeho práci chce použít pro jiné účely než ukončení studia. Užití § 29 zákona užití pro osobní potřebu citace není dotčeno. Disertační práce a výsledky v ní prezentované jsou dílem vypracovaným v Laboratoři metalomiky a nanotechnologií působící na půdě Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a mohou být pouţity k dalšímu prezentování případně ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana. V opačném případě se jedná o porušení zákona.
dne ………………………………………. podpis…………………………………….
Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/02.0068 z Evropského fondu regionálního rozvoje.
PODĚKOVÁNÍ Na prvním místě děkuji Renému Kizekovi za příleţitost studovat a pracovat v Laboratoři metalomiky a nanotechnologií, za cenné rady, připomínky a čas, který věnoval mně a mojí práci. Dále děkuji Branislavu Ruttkay-Nedeckému za pomoc s překladem odborného textu do angličtiny a za revizi publikací a Vojtěchu Adamovi za odborné vedení mé práce. Také děkuji všem spoluautorům, zejména Markétě Vaculovičové, Davidu Hynkovi, Pavlu Kopelovi a Soni Kříţkové za pomoc při experimentální práci, konzultacích výsledků a přípravě publikací, které jsou podkladem této práce.
Speciální poděkování patří Dagmar Chudobové a Zbyňku Hegerovi za pomoc při studiu a korekci této práce.
5
Anotace Schopnost iontů kovů tvořit kovalentní vazbu s nukleovými kyselinami (DNA anebo RNA) je rozhodující pro jejich strukturní vlastnosti a funkce. V 60. letech minulého století byl odhalen potenciál platinových komplexů v protinádorové terapii. Úspěšnost těchto komplexů v protinádorové léčbě je dána jejich schopností vázat se k bázím DNA za tvorby různých typů koordinačních vazeb. Vznik těchto vazeb má za následek ovlivnění sekundární struktury DNA, a tím blokaci důleţitých buněčných procesů jako je replikace či transkripce. Předkládaná disertační práce zkoumá schopnost iontů kovů (polokovů) (Zn(II), As(III) a As(V)), nanočástic platiny (PtNPs) a kvantových teček na bázi kadmia (CdS-QDs) ovlivnit sekundární strukturu DNA. V této práci byly nejdříve zkoumány interakce iontů kovů s DNA z důvodu zavedení a ověření instrumentálních metod. Výsledky těchto studií poslouţili jako základ pro navazující experimenty zabývající se působením nanočástic na eukaryotickou buňku se zřetelem na poškození DNA. V této práci se podařilo prokázat, ţe PtNPs mají vyšší afinitu k DNA polymerázám neţ k samotné DNA. Z tohoto důvodu mohou PtNPs zastavit buněčný cyklus a spustit apoptózu. O míře afinity s jakou se nanočástice váţí do struktury DNA, rozhoduje i její velikost, jak bylo prokázáno v experimentech s různě velikými CdS-QDs. Klíčová slova: poškození DNA, arsen, zinek, nanoplatina, kvantové tečky, spektroskopie, karcinom
6
Annotation
The ability of the metal ions to form a covalent bond with the nucleic acids (DNA or RNA) is critical for their structural properties and functions. In the 60s of the last century the potential of platinum complexes in anticancer therapy was revealed. The success of these complexes in anticancer treatment is given by their ability to bind to the DNA bases to form different types of coordination covalent bonds. The formation of these bonds results in an interference of the DNA secondary structure and thereby blocking of important cellular processes such as replication or transcription. Presented thesis examines the ability of metal and semimetal ions (Zn(II), As(III) and As(V)), platinum nanoparticles (PtNPs) and cadmium-based quantum dots (QDs-CdS) to influence the DNA secondary structure. In this work the interactions of metal ions with DNA were firstly investigated due to the implementation and verification of instrumental methods. Results of these studies served as the basis for subsequent experiments dealing with the effects of nanoparticles on eukaryotic cells with regard to DNA damage. In this work we demonstrated that PtNPs show higher affinity for DNA polymerases than to DNA. For this reason, PtNPs can arrest the cell cycle and trigger apoptosis. The affinity rate of nanoparticle binding to DNA is determined by its size, as was shown by the experiments with variously sized CdS-QDs.
KEY WORDS: DNA damage, arsenic, zinc, nanoplatin, quantum dots, spectroscopy, carcinoma
7
OBSAH 1 2 3
ÚVOD .......................................................................................................................... 10 CÍLE PRÁCE ............................................................................................................... 12 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 13 3.1 Struktura DNA ...................................................................................................... 13 3.2
Moderní instrumentální metody pro sledování struktur a interakcí biomolekul ... 15
3.2.1
Spektrofotometrické a fluorescenční metody ................................................ 15
3.2.2
Cirkulární dichroismus (CD) ......................................................................... 16
3.2.3
Nukleární magnetická rezonance (NMR) ...................................................... 16
3.2.4
Rentgenová krystalografie ............................................................................. 16
3.2.5
Ramanova spektrometrie ............................................................................... 17
3.2.6
Infračervená spektroskopie ............................................................................ 17
3.2.7
Elektrochemie ................................................................................................ 17
3.2.8
Mikroskopie atomárních sil (AFM) ............................................................... 18
3.3
Biologická aktivita zinku a arsenu ........................................................................ 19
3.3.1
Zinek .............................................................................................................. 19
3.3.2
Arsen .............................................................................................................. 21
3.4
Nanočástice a jejich pouţití .................................................................................. 22
3.4.1 Mechanismus příjmu a interakce platinových cytostatik s eukaryotickou buňkou (přehledový článek) ........................................................................................ 25 4
MATERIÁL A METODIKA....................................................................................... 42 4.1 Chemikálie ............................................................................................................ 42 4.2
5
Metody .................................................................................................................. 42
4.2.1
Automatický analyzátor BS 400 .................................................................... 42
4.2.2
UV/Vis spektrofotometrie.............................................................................. 42
4.2.3
Fluorescenční analýza .................................................................................... 42
4.2.4
Elektrochemická analýza ............................................................................... 43
4.2.5
Experion systém ............................................................................................. 43
4.2.6
Kometový test ................................................................................................ 43
4.2.7
Polymerázová řetězová reakce (PCR) ........................................................... 43
4.2.8
Agarózová gelová elektroforéza .................................................................... 44
4.2.9
Kultivace Staphylococcus aureus .................................................................. 44
4.2.10
Stanovení růstových křivek ........................................................................... 44
4.2.11
Rentgenová fluorescenční analýza (XRF) ..................................................... 45
VÝSLEDKY A DISKUZE .......................................................................................... 46 5.1 Interakce zinkových iontů s DNA ......................................................................... 46 5.1.1
Vědecký článek I ........................................................................................... 46
5.2 Interakční studie arsenových iontů (III a V) s fragmentem metalothioneinu (MT2A) ............................................................................................................................ 54 5.2.1
Vědecký článek II .......................................................................................... 54 8
5.3 Interakce E6 genu lidského papiloma viru 16 (HPV – 16) s CdS kvantovými tečkami ............................................................................................................................. 62 5.3.1 5.4
Platinové nanočástice indukují poškození DNA a inhibici Taq DNA polymerázy ..............................................................................................................................70
5.4.1 6 7 8 9
Vědecký článek III ......................................................................................... 62
Vědecký článek IV......................................................................................... 70
ZÁVĚR ........................................................................................................................ 98 LITERATURA ............................................................................................................ 99 SEZNAM OBRÁZKŮ ............................................................................................... 112 SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................... 113
9
1 ÚVOD Platinové kovy se přirozeně vyskytují v prostředí jen ve velmi nízkých koncentracích [1]. Byly dlouhou dobu povaţovány za inertní, a tím i minimálně dostupné pro ţivé organismy. Jedno z nejvýznamnějších vyuţití nacházejí v automobilových katalyzátorech [2], elektrotechnickém průmyslu [3] a medicíně [4]. Ve farmaceutickém průmyslu jsou komplexní sloučeniny na bázi platiny základem velmi účinných cytostatik [5-8]. První biologické působení platinového komplexu objevil v roce 1965 Barnett Rosenberg [9]. Zjistil, ţe rozpustný komplex platiny inhiboval dělení Escherichia coli v G2 fázi [9]. Během následujících let byly syntetizovány a testovány stovky platnatých a platičitých komplexů jako moţná protinádorová léčiva, ale jen malé procento z nich se dostalo do fáze klinického testování. Úspěšnost komplexů platiny (cisplatina, oxaliplatina a karboplatina) v protinádorové terapii je dána jejich schopností tvořit kovalentní koordinační vazbu s bázemi DNA [10, 11]. Schopnost iontů kovů vytvořit kovalentní vazbu s nukleovou kyselinou (DNA anebo RNA) je rozhodující pro její strukturní vlastnosti a funkce. Rozhodující roli hrají ionty kovů (Zn2+, Mn2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, K+, Na+) také jako kofaktory metaloproteinů a metaloenzymů [12]. Z fyziologického hlediska lze biologicky aktivní kovy rozdělit do dvou skupin. Esenciální kovy, které jsou pro organismy v přirozených biologických a biochemických procesech nejdůleţitější a toxické kovy, které jsou pro organismus škodlivé. Mezi esenciální kovy se zpravidla řadí kobalt, měď, ţelezo, mangan, molybden, nikl, selen, vanad, vápník, wolfram a zinek. Esenciální kovy jsou významné zejména svou rolí při strukturní regulaci bílkovin [13]. Funkčnost aţ jedné třetiny všech proteinů je velmi úzce spjata s vazbou kovu. Zinek je důleţitou součástí více neţ tří set enzymů a stabilizuje také strukturu DNA, stejně tak jako ovlivňuje regulaci genové exprese [14]. Ţelezo je důleţité pro přenos kyslíku v bílkovině hemoglobinu podobně jako měď u korýšů a členovců [15]. Měď je také důleţitá v metabolismu sacharidů u savců [16]. Selen je součástí aminokyseliny selenocysteinu a selenomethioninu, jenţ mají své místo v enzymech, které hrají klíčovou roli v antioxidační ochraně organismu [17]. Toxicky působí zejména kovy, které lze definovat jako všechny d-prvky periodické soustavy mimo 3. skupinu a transuranů, a všechny p-prvky s vlastnostmi kovů mimo výše zmíněné esenciální kovy. Míra toxicity pro organismus závisí na dávce látky, velikosti organismu, na způsobu vstupu do organismu, délce expozice a metabolismu [18]. Za toxické těţké kovy (polokovy) jsou pro člověka nejčastěji označovány arsen, kadmium, olovo a rtuť [19]. V poslední době je také stále více diskutován vliv platinových těţkých kovů (platina, 10
paladium a rhodium) a jejich nanočástic, zejména z důvodu jejich intenzivního vyuţívání v automobilovém průmyslu jako součástí katalyzátorů [2]. Tyto nové technologie sebou přinášejí i nová potenciální rizika pro lidské zdraví, o kterých není dostatek informací. I přesto, ţe jsou některé těţké kovy pro člověka toxické, mohou být vyuţity pro léčbu řady nemocí. Dobrým příkladem je oxid arsenitý (As2O3), který je jednoznačně doporučován pro indukční i konsolidační léčbu relapsu akutní myeloidní leukémie [20, 21]. Nanočástice těţkých kovů, konkétně nanoplatiny (PtNPs) mohou být pouţity pro celou řadu medicínských aplikací [22-24]. Potenciál prokazují PtNPs zejména ve smyslu alternativy cytostatických léčiv, coţ bylo prokázáno i v této práci.
11
2 CÍLE PRÁCE
Literární rešerše (review) týkající se platinových komplexů a nanočástic (kapitola 3.4.1 „Mechanisms of Uptake and Interaction of Platinum Based Drugs in Eukaryotic Cells“)
Vývoj technik a postupů pro studium kovalentních a nekovalentních interakcí nukleových kyselin s ionty kovů (kapitola 5.1 a 5.2 „DNA interaction with zinc(II) ions“ a „Interaction study of arsenic (III and V) ions with metallothionein gene (MT2A) fragment“)
Studium kovalentních a nekovalentních interakcí nukleových kyselin s nanočásticemi (kapitola 5.3 „Interaction of E6 Gene from Human Papilloma Virus 16 (HPV16) with CdS Quantum Dots“
Sledování vlivů platinových nanočástic na eukaryotické a prokaryotické buňky (kapitola 5.4 „New platinum drug – platinum nanoparticles induces DNA damage and inhibition of Taq DNA polymerase“)
12
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Struktura DNA Dvoušroubovici deoxyribonukleové kyseliny (DNA) tvoří navzájem spletené řetězce nukleotidů, které jsou sloţeny z cukru deoxyribózy, fosfátové skupiny a jedné ze čtyř nukleových bází (adeninu - A, guaninu- G, cytosinu - C a thyminu - T), mezi kterými se vytváří vodíková vazba [25]. DNA je schopna přijmout mnoho různých konformací, které jsou ovlivněny prostředím, zejména hydratací, iontovou silou a primární strukturou (sekvencí bází) [26]. Biologicky aktivní helikální struktury DNA můţeme rozdělit do tří forem, a to A-DNA, B-DNA a Z-DNA [27]. Nejčastější formou dvoušroubovice je B-DNA (Watson-Crickovská pravotočivá dvoušroubovice). Tato forma DNA za normálních podmínek v buňkách převaţuje. Dvoušroubovice B-DNA je pravotočivá, na jednu otáčku připadá 10 párů bází. Průměr dvoušroubovice je 2 nm. Dalším typem helikální formy DNA je A-DNA. S B-DNA ji spojuje pravotočivé uspořádání, naopak se liší širším a více plochým tvarem. Vyznačuje se tím, ţe v jednom závitu je 11 bází, přičemţ svírají s rovinou dvoušroubovice úhel 20 stupňů. Uvnitř dvoušroubovice vzniká poměrně výrazná axiální dutina. Průměr dvoušroubovice je 2,3 nm. Z-DNA je levotočivá, na jednu otáčku připadá 12 párů bází [28]. Její struktura se opakuje vţdy po dvou základních párech . Průměr dvoušroubovice je 1,8 nm. DNA se můţe větvit a vytvořit tak třívláknová spojení. Trojhelikální komplexy mohou potlačit transkripci především tím, ţe blokují přeměnu promotorové DNA na iniciační komplexy spíše neţ zabráněním navázání Spl [29]. V některých případech dvoušroubovicová DNA na jednom svém konci lokálně denaturuje a na uvolněné konce se připojí třetí řetězec. V prostředí buňky by tato struktura mohla vznikat při crossing-overu [30]. V minulosti byly také popsány další helikální formy DNA označené jako D-DNA [31] a C-DNA [32]. DNA se začleněným dvojmocným iontem (například zinkem) se označuje jako M-DNA. Tato struktura byla poprvé pojmenována MDNA (metal DNA) v roce 1993 [33]. Od této doby byla publikována řada prací, kde je tento komplex charakterizován [136-147]. Diskutována je například moţnost vyuţití kovového komplexu pro nanotechnologické aplikace, kdy lze M-DNA pouţít jako nanovodič pro přenos elektronů [34, 35]. Další neobvyklé útvary s kovovým iontem (ligandem) tvoří G-kvartety (kvadruplexy) [36]. G-kvartet je jednou z alternativních sekundárních struktur DNA, jeţ se vyskytují v buňkách. G-kvartet je rovinný systém čtyř guaninových bází, navzájem pootočených o 90° a pospojovaných vodíkovými vazbami. Patří mezi nekanonické (neobvyklé) typy sekundární struktury nukleových kyselin. G-kvartety se nacházejí v GC-bohatých oblastech RNA, ale i v DNA (především 13
v promotorových oblastech některých genů, na koncích telomer) a v některých oblastech genů pro těţké řetězce imunoglobulinů [36, 37]. Vyskytuje-li se nad sebou několik Gkvartetů, útvar se označuje jako G-kvadruplex. Pro vznik G-kvartetů nebo trojvlákové DNA
(tripl-helixu)
je
zásadní
existence
tzv. hoogsteenovského
párování
[38]. Klasické párování bází by neumoţnilo vznik této neobvyklé struktury. G-kvadruplexy mohou být vyuţity jako biosenzory, které lze jednoduchým způsobem stanovit spektrofotometricky [39]. Za určitých podmínek lze z DNA vytvářet origami (čtvercové plochy, obdélníky, disky, trojúhelníky, hvězdy a různé kombinace) [40], Borromeanovy krouţky [41], tří- a čtyřsměrné křiţovatky [42, 43] a mnoho dalších útvarů [44]. Novým přístupem k modelování a vyuţití DNA je Based Computing, který vyuţívá struktury DNA jako výpočetního a záznamového média. Tato metoda byla vyvinuta v roce 1994 Leonardem
Adlemanem
z kalifornské
univerzity.
V roce
2002
byl
představen
programovatelný molekulární výpočetní stroj sloţený z enzymů a DNA namísto křemíkových mikročipů. V lednu 2013 se podařilo uloţit fotografii, text a audio soubor do struktury DNA [45].
Obr. 1: Různé struktury DNA, převzato z [26] a doplněno o [41, 42] 14
3.2 Moderní instrumentální metody pro sledování struktur a interakcí biomolekul 3.2.1 Spektrofotometrické a fluorescenční metody Spektrofotometrie zkoumá vlastnosti látek na základě pohlcování (absorpce) světla. Molekuly mají schopnost pohlcovat elektromagnetické záření pouze určitých vlnových délek. Je to dáno tím, ţe mohou existovat v určitých kvantových stavech, které se liší obsahem energie. Jestliţe má molekula přejít ze stavu s niţší energií do stavu s energií vyšší, musí absorbovat záření o frekvenci, která odpovídá rozdílu energií mezi energetickými hladinami obou kvantových stavů podle Bohrovy frekvenční podmínky. Těţiště aplikací absorpční spektrofotometrie je v kvantitativní analýze. Tato analýza je zaloţena na Lambert-Beerově zákoně, podle kterého je hodnota absorbance (A) při vlnové délce (λ) přímo úměrná látkové koncentraci c (mM). Znalost přesné koncentrace DNA je podmínkou transformace,
úspěšného
provedení
transfekce,
řady
enzymové
molekulárně
reakce
s
DNA
biologických při
štěpení
metod,
jako
restrikčními
endonukleázami, klonování, mapování a sekvencování. Spektrofotometrické stanovení je zaloţeno na poznatku, ţe roztoky DNA pohlcují UV záření (λ = 260 nm). Při stanovení koncentrace DNA platí, ţe absorbance 1 AU (λ = 260 nm) odpovídá 50 μg.ml-1 dsDNA anebo 33 μg.ml-1 ssDNA. Změny struktury nukleových kyselin lze studovat na základě teploty tání (hyperchromní efekt), kdy vlivem interakce elektronů v komplementárních bázích roztoky dvouřetězcové DNA (dsDNA) absorbují UV záření (λ = 260 nm) méně, neţ stejná koncentrace bází v mononukleotidech nebo v jednořetězcové DNA. Zahřívá–li se roztok dsDNA, pak při teplotě odpovídající teplotě tání absorbance náhle stoupne [46, 47]. Také neobvyklé struktury DNA (například G-kvadruplexy) mohou být studovány na základě změn absorbance chemických sloučenin (ABTS) v kombinaci s navázaným heminem, které indikují jejich DNA enzymovou aktivitu [39]. Na základě změny absorpčního spektra (UV/Vis) lze také sledovat interakce mezi různými typy látek a biomolekul (teplotní a časová stabilita, vzájemná afinita, interkalace, tvorba komplexů atd.) Další spektroskopickou metodou je zaznamenání fluorescence. Jedná se o sekundární záření, které je charakterizováno vyzářením energie ve velmi krátké době (10-9 aţ 106
sekund). Emitované záření je vyzářeno atomem, který energii pohltil. Jedná se o přechod
z prvního singletového stavu (S1) do singletové hladiny (S0). Zaznamenání polarizace fluorescence poskytuje informace o molekulární orientaci, pohyblivosti a procesech, které
15
je modulují, například: fluidita membrán, interakce ligand-receptor, proteolýza, interakce protein-DNA, interkalace a podobně. 3.2.2 Cirkulární dichroismus (CD) Cirkulární dichroismus (CD) je definován jako rozdíl exitačního koeficientu pro levou a pravotočivou sloţku kruhově polarizovaného světla. Stočení roviny polarizovaného světla a charakterizace elipticky polarizovaného světla dává informaci o struktuře molekul v roztoku. Vyuţívá se na určování sekundární struktury biomolekul, stanovení poměrného zastoupení jednotlivých konformací, strukturální přechody (A, B, Z – DNA a Gkvadruplexy) a určování teplotní stability [48]. 3.2.3 Nukleární magnetická rezonance (NMR) Nukleární
magnetická
rezonance
je
fyzikálně-chemická metoda vyuţívající
interakce atomových jader (s nenulovým jaderným spinem) s magnetickým pólem. Zkoumá rozdělení energií jaderného spinu v magnetickém poli a přechody mezi jednotlivými spinovými stavy vyvolané působením radiofrekvenčního záření. Na základě NMR spektroskopie lze určit sloţení a strukturu molekuly DNA [49]. 3.2.4 Rentgenová krystalografie Rentgenová krystalografie je analytická metoda zabývající se studiem interakce krystalických vzorků s rentgenovým zářením, která umoţňuje určit absolutní strukturu molekul, tj. polohy atomů, vazebné délky a úhly v krystalové mříţce. Při průchodu monochromatického rentgenového záření látkou dochází k pruţnému ohybu (difrakci) paprsků. Směr a intenzita difraktujících paprsků závisí na vnitřní struktuře vzorku. V amorfním vzorku jsou atomy rozmístěny nepravidelně a příspěvky k celkové intenzitě difraktovaného záření se často vzájemně vyruší. Naopak vzorek s periodickou strukturou (monokrystal) působí jako difrakční mříţka ve viditelném světle. Příspěvky k celkové intenzitě difraktovaného záření vzájemně interferují a v určitých směrech, specifických pro konkrétní krystalovou strukturu se sčítají, jinak se vyruší. Touto metodou poprvé Rosalinda Franklinová zaznamenala difrakční obraz DNA (Obr. 2), na základě kterého Watson a Crick sestavili trojrozměrný model struktury DNA [50].
16
Obr. 2: Difrakční obraz DNA zaznamenaný Rosalindou Franklinovou [50] 3.2.5 Ramanova spektrometrie Ramanova spektrometrie je metodou vibrační molekulové spektroskopie, která byla pojmenována po indickém fyzikovi Čandrašékharu Venkatau Ramanovi (Nobelova cena 1930). Raman společně s K. S. Krišnanem popsali v roce 1928 jev neelastického optického rozptylu, který je základem metody. Podstatou Ramanova rozptylu je zářivý dvoufotonový přechod mezi dvěma stacionárními vibračními stavy molekuly. Jedná se o metodu vhodnou pro identifikaci látek, při určování jejich sloţení a struktury. Tato metoda je vhodná pro monitorování interakcí kovů s nukleovými kyselinami, jak bylo demonstrováno na příkladu cisplatiny a DNA [51]. 3.2.6 Infračervená spektroskopie Podstatou infračervené spektroskopie je interakce infračerveného záření se studovanou hmotou, kdy v případě pohlcení fotonu studovanou látkou mluvíme o absorpční infračervené spektroskopii a v případě vyzáření fotonu o emisní infračervené spektroskopii. Podle vţité konvence infračervenou spektroskopii z praktických důvodů dělíme podle vlnových délek záření na dalekou, střední a blízkou. Pro identifikaci a určování chemické struktury DNA má největší význam střední infračervená oblast (4000200 cm-1) [52]. 3.2.7 Elektrochemie Díky objevu polarografie, za kterou dostal Jaroslav Heyrovský v roce 1959 Nobelovu cenu, se od 30. let 20. století začaly rozvíjet polarografické metody. Elektrochemie DNA se začala vyvíjet v polovině 50. let 20. století. Na jejím počátku stál Emil Paleček, který 17
prokázal elektrochemické vlastnosti nukleových kyselin (NK) pomocí oscilografické polarografie [53]. Od této doby jsou vlastnosti NK zkoumány polarograficky, voltametricky nebo chronopotenciometricky na základě zaznamenávání proudových nebo jiných signálů vznikajících po jejich interakci s elektricky nabitými povrchy [54]. Díky těmto signálům lze monitorovat různé typy poškození DNA (jednořetězcové či dvouřetězcové zlomy, DNA fragmentaci, uvolnění báze, chemické alterace bází, kovalentní adukty, meziřetězcové kříţení nebo chybné párování bází) [54]. Princip elektrochemie NK spočívá v tom, ţe zkoumaná molekula je schopna přijímat elektrony od pracovní elektrody. Informace o vlastnostech a struktuře NK (a jiných molekul) se získávají v různých prostředích (elektrolytech) a na materiálově odlišných elektrodách. 3.2.8 Mikroskopie atomárních sil (AFM) Mikroskopie atomárních sil (AFM) je mikroskopická technika, která se pouţívá k trojrozměrnému zobrazování povrchů. Poprvé ji pouţili v roce 1986 Binnig, Quate a Gerber. Metoda dosahuje velmi vysokého rozlišení – lze s její pomocí zobrazovat i atomy. Techniku AFM lze pouţít nejen k zobrazování, ale také k tvorbě struktur či zpracování povrchů v nanometrové oblasti. Základem AFM je velmi ostrý hrot, který je upevněn na ohebném nosníku (kantilevru), který se pohybuje nad vzorkem. Díky vývoji nových inovativních skenovacích módů lze zobrazovat vodivé i nevodivé povrchy, a to jak kontaktně tak bezkontaktně. V dnešní době je tato technika pouţívána k zobrazování nejrůznějších struktur, například DNA origami (obr. 3) [40].
18
Obr. 3: Prostorové DNA útvary (origami), sloţeny z více jak 200 krátkých oligonukleotidů. Výsledný útvar má v průměru přibliţně 100 nm, a = čtvercové plochy, b = obdélníky, c = hvězdy, d = emotikony, e a f = různé typy trojúhelníků. Převzato z [40].
3.3 Biologická aktivita zinku a arsenu 3.3.1 Zinek Zinek je biogenní prvek, který má v ţivých soustavách důleţitou úlohu, a to zejména při syntéze proteinů a DNA [28, 55]. Jeho nerovnováha (nedostatek, nebo nadbytek) můţe způsobit celou řadu váţných onemocnění (Obr. 4). Zinek má ve valenční sféře orbital (n1)d kompletně obsazen deseti elektrony, které nevyuţívá k vytváření vazeb [56]. Zinečnaté ionty se do buňky dostávají prostřednictvím zinkových transportérů, zejména ZiP1 [57] a ovlivňují řadu buněčných procesů včetně proliferace, diferenciace a apoptózy [58]. Zn(II) kontroluje procesy látkové výměny a řídí aktivitu více neţ 300 enzymů [59, 60]. Ionty zinku obsaţené v enzymech působí jako kofaktory a hrají důleţitou roli pro správnou funkci ribozomů [61]. Zinečnaté ionty mohou být v biomolekulách nahrazeny i jinými ionty kovů (Mg(II), Co(II), Ni(II), Cu(II)). Výhodou zinku je, ţe má na rozdíl od těchto iontů flexibilní prostorové uspořádání první koordinační vrstvy, která můţe měnit tvar a můţe být tvořena různými ligandy [62]. Zinek je v ţivých organismech druhým nejrozšířenějším přechodným kovem [63]. Zinek se nachází ve všech tělních tkáních a tekutinách v relativně vysokých koncentracích. 85 % zinku se nachází ve svalech a kostech, 11 % v kůţi a játrech a zbývající 4 % ve všech ostatních tkáních. Průměrné 19
mnoţství zinku v těle dospělého člověka je přibliţně 1,4 – 2,3 g [64, 65]. Zvýšené mnoţství Zn(II) se podílí na zvýšení exprese metalothioneinu (MT) prostřednictvím metal regulačního
transkripčního
faktoru
1
(MTF-1)
[66]
a
na
transdukci
signálu
zprostředkované mitogen aktivovanými proteinkinázami (MAPK). Zinečnaté ionty také zvyšují expresi X proteinu asociovaného s protoonkogenem Bax [67] a usnadňují tvorbu Bax pórů na vnější mitochondriální membráně. Vzniklé Bax póry umoţňují eflux cytochromu c do cytoplazmy. Cytochrom c
aktivuje kaskádu kaspáz, která vede
k apoptóze [68]. U mnohobuněčných organismů je veškerý Zn(II) intracelulární, přičemţ 30 – 40 % se jej nachází v jádře, 50 % v cytoplazmě, organelách a specializovaných váčcích (vesicles) a zbytek v buněčné membráně [69]. Zinek se podílí na regulaci genetické stability a genové exprese mnoha způsoby, a to především tím, ţe stabilizuje strukturu chromatinu a ovlivňuje replikaci DNA a transkripci RNA prostředníctvím regulace aktivity transkripčních faktorů a DNA anebo RNA polymeráz [70]. Zinek je také nezbytný pro strukturální stabilitu proteinů s motivem zinkových prstů. Jedná se o sekvenci aminokyselin spojenou zinečnatým iontem za tvorby sekundární struktury ve tvaru prstu [71]. Proteiny s tímto motivem jsou známy vysokou afinitou k DNA, struktura zinkového prstu přímo zprostředkovává interakci proteinu s DNA ve velkém ţlábku [72]. Zinkové komplexy mohou být pouţity jako účinné mikrobiální látky s antioxidačním účinkem [73]. Zinek je úzce spjat se syntézou a sekrecí inzulinu [74]. Díky těmto vlastnostem mohou být zinkové komplexy vyuţity při léčbě cukrovky [75]. Bylo tak například popsáno pouţití mědi a zinku v komplexech s 1,10 –phenanthrolinem(phen), který je univerzálním chelatačním ligandem. Tyto komplexy jsou schopné vázat se do struktury DNA, štěpit ji a vykazovat tak antimikrobiální aktivitu [76]. Podobně Bujacz et al. popsali novou krystalovou strukturu dichloro(L-histidin) měďnatého (II) komplexu [77]. L-histidin (his) je klíčová aminokyselina podílející se na vázání měďnatých iontů v buňkách, enzymech a proteinech [78, 79]. Schopnost Zn(II) začlenit se do struktury DNA je zkoumána a diskutována ve vědeckém článku v kapitole 5.1.
20
Obr. 4: Schematické znázornění působení zinku na lidský organizmus. Převzato z [80] a doplněno o [81].
3.3.2 Arsen Arsen je klasifikován jako globální polutant (toxický prvek) a karcinogen, který se vyskytuje v potravinách, organizmech, vodě, vzduchu a půdě (Obr. 5). Arsen se můţe vyskytovat ve formě anorganických i organických sloučenin ve čtyřech oxidačních stupních +V, +III, 0, -III. Bylo prokázáno, ţe expozice arsenem způsobuje oxidační stres, coţ vede k rozvoji karcinogeneze [82]. Jeho toxicita závisí na oxidačním stavu nebo úrovni methylace během biotransformace v organizmu. Anorganické formy arsenu se objevují ve dvou biologicky významných oxidačních stavech: As(V) (arseničnan) a As(III) (arsenitan). Na rozdíl od většiny těţkých kovů jsou organické sloučeniny arsenu méně toxické neţ jeho sloučeniny anorganické. Methylované formy arsenu jako monomethylarsenitá kyselina (MMA), dimethylarsenitá kyselina (DMA) a tetramethylarsenium (TETRA) jsou méně toxické neţ anorganické formy. Organoarsenité druhy, ke kterým se řadí arsenobetain (AsB) a arsenocholin (AsC), jsou netoxické. Anorganický arsen, který vstupuje do potravinového řetězce, se můţe v organismu transformovat na MMA, DMA, AsB, AsC a arsenocukry 21
[83]. Pro pochopení toxicity arsenu je potřeba se zaměřit na jeho afinitu k proteinům. Toxicita trojmocného arsenu As(III) je pravděpodobně spojena s interakci se sulfhydrylovými skupinami thiolových sloučeninami, jako je glutathion (GSH) a na cystein bohatými proteiny (methalothioneniny) [84]. U As(V) nebyly tyto interakce prokázány [84]. Předpokládá se, ţe anorganický arzeničnan (HASO42-), coţ je molekulární analog fosfátu (HPO42-), můţe soutěţit o fosfátové anionty [85]. Za netoxický bývá povaţován kovový arsen, který je však v organismu přeměňován na své toxické sloučeniny. U lidí, ale i u mnoha druhů savců přechází v plazmě anorganický arsen z pětimocného na trojmocný a následně je v játrech methylován na pětimocné a trojmocné metabolity [86]. Sloučeniny arsenu jsou studovány, jak pro svoji vysokou toxicitu, ale také pro moţné terapeutické aplikace [87-91]. V současné době existuje více neţ 100 klinických studií, které se zabývají anorganickou nebo organickou formou arsenu, jako léčiva na rozličná onkologická onemocnění [92]. Oxid arsenitý je v současné době pouţíván při monoterapii akutní promyelocytární leukémie (PML) [20, 21]. Více informací o arsenu a jeho vlivu na DNA je uvedeno ve vědeckém článku, kapitola 5.2.
Obr. 5: Arsenový cyklus (vlastní návrh) doplněný o [93].
3.4 Nanočástice a jejich použití Nanotechnologie jsou jedním z nejpokrokovějších vědních oborů současnosti. Jednou z hlavních oblastí natonechnologií je syntéza a charakterizace různých typů nanočástic, pro 22
široké spektrum aplikací. Kovové nanočástice o velikosti 1 - 200 nm mohou být modifikovány nejen polymerními látkami [94] díky čemuţ mohou získat nové fyzikální a chemické vlastnosti ve srovnání s původními nemodifikovanými nanočásticemi [95, 96]. O specifickém účinku nanočástic rozhoduje kromě prvkového sloţení také jejich velikost. Bylo zjištěno, ţe nanočástice ze stejného materiálu, ale o různé velikosti v rozsahu 20 aţ 100 nm vykazují rozdílné fyziologické účinky [97]. Nanočástice mohou interagovat s nukleovými kyselinami, ale vykazují také vysokou afinitu k enzymům, jako jsou DNA polymerázy. Stříbrné ionty způsobují inhibici buněčného dělení, interagují s nukleovými kyselinami a thiolovými skupinami aminokyselin a proteinů. Poškození DNA, nebo zablokování polymerázy nanočásticí můţe způsobit apoptózu. Tyto vlastnosti mohou být vyuţity při konstrukci nové generace cytostatických léčiv. Díky svým vlastnostem mají nanočástice v organismu vyšší retenční čas v porovnání s ionty [98]. Například nanočástice stříbra byly testovány pro pouţítí v implantovaných materiálech, které sniţovaly výskyt pooperačních komplikací, ale kvůli toxicitě, která není doposud zcela objaněna bylo od jejich klinického vyuţívání upuštěno [99]. Podobný potenciál vykazují také selenové nanočástice, které byly rovněţ testovány jako potenciální sloţka ortopedických implantátů [100]. Publikované práce týkající se platinových nanočástic (PtNPs) uvádějí, ţe PtNPs vykazují vysoký antioxidační účinek a mají potenciál jako léčivo proti úbytku kostní dřeně [22]. Nanočástice platiny mohou být také pouţity pro zlepšení účinků radioterapie [101]. Díky svému povrchu nacházejí nanočástice uplatnění také jako katalyzátory [102]. Vliv PtNPs na eukaryotické a prokaryotické buňky (zejména na DNA polymerázu) byly studovány ve vědeckém článku, který je součástí této disertační práce, kapitola 5.4. Vstupem do nanosvěta se otevřely nové moţnosti vyuţití kvantových teček - (QDs) a jejich výjimečných vlastností [103]. QDs vynikají širokým spektrem moţností vyuţití, které je dáno jejich variabilitou přípravy a moţnostmi funkcionalizací. QDs si udrţují část vlastností materiálu, z kterého jsou vyrobeny, ale také přejímají nové vlastnosti, které souvisejí s jejich velikostí. Pro biologické aplikace jsou nejvyuţívanější nanokrystaly CdSe a CdSe/ZnS nebo CdTe (Obr. 6) a CdTe/CdS [104-106]. Dále jsou vyvíjeny QDs tvořené méně toxickými materiály, jako je například Zinek (QDs-ZnS) anebo uhlík [38, 107]. Hlavní výhodou uhlíkových kvantovývh teček (CQDs) je jejich nízká toxicita, díky které mohou být pouţity zejména pro in-vivo aplikace [108]. Uhlíkové kvantové tečky (CQDs) jsou biokompatibilní, chemicky interní, vykazují stabilní emisi záření, dobrý kvantový výtěţek, vysokou fotostabilitu a snadnou modifikaci. Nejširší vyuţití mají CQDs ve vývoji biosenzorů pro detekci iontů kovů [109, 110], pH [111], nebo peroxide a glukózy [112]. Neméně významné je vyuţití CQDs pro detekci biomolekul, jakou je DNA či RNA, 23
například pomocí Försterova rezonančního přenosu energie (FRET) mezi CQDs a mnohostěnnými uhlíkovými nanotrubičkami (MWCNT) [113]. Vhodně funkcionalizovaný povrch QDs můţe být spojen s různými typy biomolekul, jako jsou aromatické heterocykly [114], proteiny (metalothionein) [115] nebo DNA [116, 117]. Specifické interakce mezi DNA a QDs jsou zprostředkovány ve velkém ţlábku, ale i mezi jednotlivými bázemi [118120]. Fluorescenční značení DNA pomocí QDs přináší moţnost fluorescenčního DNA monitoringu in vivo nebo in vitro [121].
Obr. 6: CdTe-QDs v ambientním (a) a ultrafialovém (b) světle.
24
3.4.1 Mechanismus příjmu a interakce platinových cytostatik s eukaryotickou buňkou (přehledový článek) NEJDL, L.; KUDR, J.; BLAZKOVA, I.; CHUDOBOVA, D.; SKALICKOVA, S.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; ADAM, V.; KIZEK, R. Platinum Metals in the Environment: Springer, 2015 Celkový podíl autora na práci: Nejdl L.: 39 % Onkologická onemocnění jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtí v rozvinutých zemích [122]. Lečiva na bázi platiny patří mezi nejúčinnější a nejpouţívanější cytostatika. Tato léčiva jsou určena především k paliativní léčbě metastatických tumorů varlat, vaječníků a u pokročilého karcinomu močového měchýře především u pacientů, kteří podstoupili patřičnou chirurgickou léčbu a radioterapii. Lze je pouţít i v monoterapii, častěji však v kombinacích s dalšími chemoterapeutiky. Vstup platinového léčiva do buňky je umoţněn zejména pasivní difúzí, ale existují i důkazy, ţe z části můţe být přenesena také aktivním transportem pomocí transportního systému Ctr1, který kontroluje homeostázi mědi [123126]. Úspěšnost komplexů platiny v protinádorové terapii je dána jejich schopností vázat se koordinační vazbou k bázím DNA [10, 11]. Právě vznik těchto vazeb má za následek ovlivnění sekundární struktury DNA, a tím i blokaci důleţitých buněčných procesů jako je replikace či transkripce [4]. Nejčastěji se vyskytující vazbou, která se v DNA vytváří, je vazba spojující dvě bezprostředně sousedící báze v jednom řetězci DNA, přednostně zbytky
guaninu
[127-129].
Poškození
DNA
vyvolané
cisplatinou
aktivuje
serin/threoninovou kinázu (ATR), která zajištuje spuštění kaskády dalších efektorových molekul. Jeden z cílů ATR kinázy je tumor supresorový protein p53, který je fosforylován ATR kinázou na serinu 15. Tímto způsobem dojde k poklesu afinity proteinu p53 k jeho negativnímu regulátorovi Mdm-2, coţ vede k up-regulaci exprese proteinu p53. Protein p53 iniciuje transkripci genu pro protein p21, který vyvolá inhibici cyklin dependentních kináz Cdk2 a Cdk4, coţ vede k zástavě buněčného cyklu. Protein p53 také indukuje expresi proapoptických členů rodiny Bcl-2, jako jsou Bax, PUMA a NOXA, které zodpovídají za aktivaci mitochondriální apoptotické dráhy. Hlavním determinantem odpovědí na poškození DNA cisplatinou je změna poměru pro- a antiapoptických proteinů. Je li změna poměru ve prospěch pro-apoptických proteinů dojde k uvolnění cytochromu c z mitochondrií a následné aktivaci cysteinových proteáz – kaspáz, selektivně štěpících cílové proteiny. Kaspázy iniciátorové (kaspáza 8, 9 a 10) následně aktivují kaspázy efektorové (kaspáza 3, 6 a 7). Kaspáza 8 je aktivována vnější cestou přes receptory smrti, 25
kdeţto kaspáza 9 vnitřní mitochondriální cestou. Obě následně aktivují především kaspázu 3 zodpovídající za vlastní apoptotický proces [130-132]. Tato léčiva také generují oxidační stres zejména ve zdravých rychle proliferujících buňkách, který je podmíněn aktivací kaskády enzymů Bcl-2, kaspázy 9 a 3, coţ způsobuje ototoxicitu [133]. Oxidační stres je obecně způsoben nerovnováhou mezi antioxidanty a volnými radikály. Vznik nerovnováhy vede k oxidačním změnám v buněčných membránách, nebo intracelulárních molekulách [103-107]. Radikály jsou generovány neustále v těle v důsledku oxidačního metabolismu. Některé choroby, léčiva, kouření, škodlivé látky v ţivotním prostředí, alkohol a ionizující záření podporují jejich vznik [134-142]. Reaktivní formy kyslíku (ROS) a různé formy reaktivního dusíku (RNS) jsou běţně generovány pro fyziologické účely. K ochraně biologických molekul, DNA, lipidů a proteinů je organismus obdařen antioxidačním systémem, včetně enzymatických a neenzymatických komponent. Všechny aerobní organismy mají systémy obrany, které odstraňují, nebo opravují poškozené molekuly [103105]. ROS jsou schopny poškození zásadních biomolekul, jako jsou nukleové kyseliny, tuky, bílkoviny a sacharidy a rovněţ poškození DNA, které můţe vést k mutacím.
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Chemikálie Všechny chemikálie (v ACS čistotě) byly pořízeny od firmy Sigma-Aldrich (USA), pokud není uvedeno jinak.
4.2
Metody
Tato kapitola obsahuje výčet hlavních metod, které byly pouţity v této práci. Metody obsahují pouze obecný popis nastavení parametrů. Přesné nastavení parametrů jednotlivých metod je podrobně popsáno ve vědeckých článcích (kapitola 5 VÝSLEDKY A DISKUSE) 4.2.1 Automatický analyzátor BS 400 Byl pouţit automatický spektrofotometr BS 400 (Mindray, Čína), který byl sloţen z kyvetového prostoru (teplota 37 ± 0.1 °C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (teplota 4 ± 1 °C) a optického detektoru. Jako zdroj záření byla vyuţita halogen-wolframová lampa. Přenos vzorků a reagencí byl zprostředkován pomocí robotického ramena s dávkovací jehlou. Obsah kyvet byl promíchán automaticky ihned po přidání činidla a vzorku o objemu 2 – 45 µl. Pro detekci bylo moţné vyuţít vlnových délek: 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740, 800 nm. Zařízení je kontrolováno softwarem BS400 (Mindray, China). 4.2.2
UV/Vis spektrofotometrie
Pro ruční měření byl pouţit UV/Vis spektrofotometr Specord
210 (Jena Analytic,
Německo). Spektrofotometr byl vybaven pohyblivým karuselem s osmi pozicemi pro vzorky. Byly pouţity kyvety o optické dráze 1 cm. Karusel byl temperován pomocí průtokového termostatu. Všechna měření byla provedena při teplotě 20 - 25 °C. Rozsah vlnových délek pro skenování byl nastaven v rozsahu 200 - 700 nm. Denaturace vzorků byla provedena UV/VIS spektrofotometrem Specord
600 (Jena Analytic, Německo)
s diodovým detektorem. Vzorky o objemu 200 µl byly inkubovány 3 minuty v křemenných kyvetách v rozsahu teplot 20 – 90 °C. Absorbance vzorků byla zaznamenána při λ = 260 nm. 4.2.3 Fluorescenční analýza Fluorescenční spektra byla zaznamenána pomocí fluorescenčního analyzátoru Tecan Infinite 200 PRO (TECAN, Švýcarsko). Excitační a emisní vlnová délka byla nastavena dle poţadavku analýz. Výtěţek detektor byl nastaven na hodnotu 100. Vzorek byl dávkován (50 µl) do Nunc transparentní 96-jamkové mikrotitrační destičky s plochým 42
dnem (Thermo Scientific, Waltham, USA). Všechny analýzy byly prováděny při laboratorní teplotě (25 °C), která byla kontrolována Tecanem Infinite 200 PRO (TECAN, Švýcarsko). 4.2.4 Elektrochemická analýza Elektrochemické stanovení proběhlo pomocí analyzátoru AUTOLAB (EcoChemie, Nizozemí) propojeném s VA Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko), který vyuţívá standardní tříelektrodové zapojení. Jako pracovní elektroda byla pouţita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s povrchem kapky 0,4 mm2. Jako referentní slouţila argentchloridová (Ag/AgCl/3M KCl) elektroda, pomocnou byla platinová elektroda 4.2.5 Experion systém Pro analýzu byly vyuţity DNA čipy spolu s Experion DNA 1K kitem a mikrofluidní automatický systém Experion (Bio-Rad, USA). Protokol sestával z naplnění čipu 9 μl GS (gelem smíchaným s fluorescenčním barvivem) pomocí plnící stanice. Následně bylo do všech jamek na gel naneseno 9 μl GS a do jamek na vzorky a ţebříček bylo napipetováno 5 μl nanášecího pufru. Do jamky na ţebříček byl napipetován 1 μl ţebříčku a do ostatních jamek 1 μl vzorku. Čip byl vizuálně zkontrolován, zda se v něm nenacházejí bublinky. Po vortexování celého čipu byly vzorky analyzovány na elektroforetické stanici Experion. 4.2.6 Kometový test Kometový test byl proveden podle postupu dle Singh et al. [143] s malými úpravami [144, 145]. Po barvení byly vzorky promyty destilovanou vodou a sledovány fluorescenčním mikroskopem Olympus IX 71S8F-3 (Tokyo, Japonsko). Byl pouţit exitační (520 – 550 nm) a emisní (580 nm) filtr a 100 násobné zvětšení. Snímky byly pořízeny fotoaparátem Olympus DP73 a upraveny v programu Stream Basic 1.7 s rozlišením 4800 × 3600 pixelů. Poškození jader bylo hodnoceno podle pěti kategorií. Index poškození jader (ID) byl vypočítán dle vzorce: 0.1 × N0 + 1 × N1 + 2 × N2 + 3 × N3 + 4 × N4 N0 + N1 + N2 + N3 + N4 4.2.7 Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR reakce byla provedena za pouţití mastercycler ep realplex 4 (Eppendorf AG, Germany). Při amplifikaci byl pouţit Taq PCR kit (New England BioLabs, USA). PCR probíhala za těchto podmínek: počáteční denaturace (95 °C/120 s), 30 – 40 cyklů
43
denaturace (95 °C/15 - 30 s), annealing (50 - 64 °C/15 - 30 s), extenze (72 °C/15 - 45 s) a závěrečná extenze (72 °C /5 min). 4.2.8 Agarózová gelová elektroforéza 1-2% agarosový gel (Chemos CZ, s.r.o., Czech Republic) byl připraven pomocí 1×TAE pufru (40 mM Tris, 20 mM kyselina octová a 1 mM ethylenediaminetetraoctová kyselina, Bio-Rad, USA). Po rozpuštění byl gel zchlazen na 60 °C a přidán ethidium bromid (5 μl/100 ml gelu). Následně byl gel přenesen do elektroforetické vany obsahující TAE pufr. Vzorky (5 – 10 μl) byly po smíchání s 5% (v/v) bromofenolovou modří a 3% (v/v) glycerolem naneseny do gelu. Pro monitorování analyzované NK byl pouţit marker velikosti (NewEngland BioLabs, USA). Elektroforéza (Bio-Rad, USA) probíhala při 6 °C. Vizualizace gelů probíhala pomocí transiluminátoru při 312 nm (Vilber-Lourmant, Francie). 4.2.9 Kultivace Staphylococcus aureus S. aureus (NCTC 8511) byl získán z České sbírky mikroorganismů, Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika. Kmeny byly uchovávány jako suspenze spór ve 20% (v/v) glycerolu při teplotě -20 °C. Před jejich pouţitím byly kmeny rozmrazeny a glycerol byl odstraněn promytím destilovanou vodou. Sloţení Luria Bertani média pro kultivaci bakteriální kultury bylo následující: trypton 10 g/l, kvasničný extrakt 5 g/l, NaCl 5 g/l, sterilní MiliQ voda. pH kultivačního média bylo před sterilizací upraveno na 7,4. Sterilizace média byla prováděna při teplotě 121 °C po dobu 30 minut ve sterilizátoru (Tuttnauer 2450EL, Izrael). Připravená kultivační média byla naočkována bakteriální kulturou v Erlenmeyerově baňce do celkového objemu 25 ml. Po inokulaci byly bakteriální kultury kultivovány po dobu 24 hodin na třepačce (Biosan OS-10, Litva) při 600 rpm a teplotě 37 °C. Bakteriální kultura kultivovaná za těchto podmínek byla následně ředěna kultivačním médiem na OD600 = 0.1 pro pouţití v dalších experimentech. 4.2.10
Stanovení růstových křivek
K vyhodnocení antimikrobiálního účinku testovaných sloučenin bylo vyuţito měření absorbance pomocí přístroje Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific, Německo) a následné analýzy ve formě růstových křivek. Kultura (S.aureus) byla naředěna Luria Bertani médiem na spektrofotometru SPECORD 210 (Analytik Jena, Německo) při vlnové délce 600 nm na absorbanci 0,1 AU. V mikrotitrační destičce byla bakteriální kultura smísena s různými koncentracemi testovaných komponent. Celkový objem mikrotitrační destičky byl vţdy 300 µl. Měření bylo prováděno vţdy v čase 0, poté v půlhodinových intervalech po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C a vlnové délce 600 nm. Dosaţené hodnoty 44
byly zobrazeny do grafické podoby růstových křivek pro kaţdou koncentraci testované látky zvlášť 4.2.11
Rentgenová fluorescenční analýza (XRF)
Platinové nanočástice byly analyzovány pomocí X-ray fluorescencčního analyzátoru Spectro Xepos (Spectro Analytical Instruments, Kleve, Germany). Doba měření byla 300 s. Vzorek byl měřen v PE nádobce o průměru 20 mm. Softwary Spectro Xepos a TurboQuant byly pouţity pro vyhodnocení získaných dat.
45
5 VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledková část předkládané disertační práce je přiloţena ve formě publikací v odborných časopisech a dále doplněna o komentáře autora. U kaţdé práce je vyznačen i podíl autora na vytvoření publikace, se kterým souhlasí všichni uvedení spoluautoři.
5.1 Interakce zinkových iontů s DNA 5.1.1 Vědecký článek I NEJDL, L.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; KUDR, J.; KRIZKOVA, S.; SMERKOVA, K.; DOSTALOVA, S.; VACULOVICOVA, M.; KOPEL, P.; ZEHNALEK, J.; TRNKOVA, L.; BABULA, P.; ADAM, V.; KIZEK, R. DNA interaction with zinc(II) ions. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, roč. 64. č., s. 281-287. ISSN 0141-8130. Celkový podíl autora na práci: Nejdl L.: 42 %
V řadě rozvinutých zemí jsou nádory prostaty nejčastějším nádorovým onemocněním muţů. Po karcinomu plic jsou tyto nádory druhou nejčastější s nádorem spojenou příčinou smrti [146]. Prostatické buňky a karcinom prostaty jsou výjimečné svým vztahem k zinečnatým iontům. Významnou charakteristikou prostatické tkáně je schopnost tyto ionty akumulovat; intracelulární koncentrace dosahuje aţ desetinásobné koncentrace v porovnání s jinými typy buněk a tkání. Zinečnaté ionty ovlivňují řadu buněčných procesů včetně proliferace, diferenciace a apoptózy. Lze tedy očekávat, ţe právě zinečnaté ionty se významnou měrou mohou podílet na vzniku onemocnění, na jeho propagaci či na schopnosti metastázovat, a proto je potřeba vyvíjet metody a postupy, kterými lze zkoumat interakce Zn(II) s DNA. V této studii jsme se zaměřili na interakce Zn(II) iontů s DNA. Interakce byly sledovány pomocí UV/Vis spektrofotometrie a gelové elektroforézy. Nejprve byl amplifikován fragment DNA xis genu z bakteriofága lambda o velikosti 498 bp. DNA (15 µM) byla smíchána se Zn(II) v rozsahu koncentrací 0 – 55 µM a ponechána se inkubovat 60 minut při 25 °C. Poté byly vzorky dialyzovány a ihned analyzovány. Interakce Zn(II) s DNA se projevily zejména změnou diferenčního absorpčního spektra (λ = 251 nm) a poklesem teploty tání při denaturaci Zn-DNA. Aplikaci 5,5 µM Zn(II) došlo ke sníţení teploty (Tm) v průměru o 7,5 °C oproti kontrole (75,5 °C). Nejniţší teploty (60,5 °C) bylo dosaţeno při aplikaci 33 µM Zn(II). Po aplikaci 44 a 55 µM Zn(II) se Tm nezměnila. V této práci byly jednoduchými metodami (UV/VIS spektroskopie a gelová elektroforéza) studovány interakce Zn(II) s fragmentem DNA. Podařilo se prokázat, ţe
46
komplex DNA a zinku můţe být vytvořen za fyziologických podmínek. Tato skutečnost můţe mít dopad na biochemické procesy probíhající v eukaryotických buňkách.
47
48
49
50
51
52
53
5.2 Interakční studie arsenových iontů (III a V) s fragmentem metalothioneinu (MT2A) 5.2.1
Vědecký článek II
NEJDL, L.; SKALICKOVA, S.; KUDR, J.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; DOSTALOVA, S.; KREMPLOVA, M.; KENSOVA, R.; MOULICK, A.; KONECNA, M.; ADAM, V.; KIZEK, R. Interaction study of arsenic (III and V) ions with metallothionein gene (MT2A) fragment. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, roč. 72. č., s. 599605. ISSN 0141-8130. Celkový podíl autora na práci: Nejdl L.: 44 %
Sloučeniny arzenu jsou studovány, jak pro svoji vysokou toxicitu, tak pro terapeutické aplikace [87-91]. V současné době existuje více neţ 100 klinických studií, které se zabývají anorganickou nebo organickou formou arsenu, jako léčiva pro onkologická onemocnění [92]. Diskutována je také moţnost substituce arsenu za fosfor v molekule DNA [147-149]. Tento předpoklad nebyl doposud spolehlivě potvrzen, ani vyvrácen. Úkolem této práce bylo studium interakce trojmocných a pětimocných iontů arsenu s fragmentem MT2A. Nejdříve byl izolován a amplifikován metalothioneinový fragment (MT2A) o délce 180 bp. Fragment MT2A o koncentraci 5 µg. mL-1
byl inkubován s
As(III) a As(V) v rozsahu koncentrací 0 - 50 µg.mL-1 po dobu 0 - 60 min při teplotě 25 °C a 0 – 48 hodin při teplotě 7 °C. Interakce mezi arsenitými ionty a fragmentem DNA byly sledovány UV/Vis spektrofotometrií, fluorescenční spektroskopií, atomovou absorpční spektrometrií, elektrochemicky a agarozovou gelovou elektroforézou. Bylo zjištěno, ţe As(III) v niţších koncentracích (0,4 – 6,25 µg. mL-1) můţe vytvořit stabilní strukturu s DNA a ve vyšších koncentracích (As(III) > 6,25 µg.mL-1) naopak strukturu významně narušit. Interakce As(V) iontů s DNA nebyly spektroskopicky prokázány, pouze elektrochemicky byla pozorována významná změna elektrochemického signálu (CA píku) v porovnání s kontrolní DNA. Tato změna CA píku byla v průměru 450 krát menší neţ u As(III). Schopnost As změnit, nebo narušit strukturu DNA můţe být jeden z hlavních mechanismů indukce apoptózy u akutní promyelocytární leukémie.
54
55
56
57
58
59
60
61
5.3 Interakce E6 genu lidského papiloma viru 16 (HPV – 16) s CdS kvantovými tečkami 5.3.1 Vědecký článek III NEJDL, L.; SKALICKOVA, S.; KUDR, J.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; NGUYEN, H. V.; RODRIGO, M. A. M.; KOPEL, P.; KONECNA, M.; ADAM, V.; KIZEK, R. Interaction of E6 Gene from Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) with CdS Quantum Dots. Chromatographia, 2014, roč. 77. č. 21-22, s. 1433-1439. ISSN 0009-5893. Celkový podíl autora na práci: Nejdl L.: 40 %
Fluorescenční značky jsou pro zobrazování DNA hojně pouţívány v mnoha biologických disciplínách [150-153]. Vstupem do nanosvěta se otevřely nové moţnosti vyuţití kvantových teček - nanokrystalů (QDs) a jejich výjimečných vlastností [103]. Vhodně funkcionalizovaný povrch QDs můţe být spojen s různými typy biomolekul, jako jsou aromatické heterocykly [114], proteiny (metalothionein) [115] a DNA [116, 117]. V této práci jsme se zaměřili na zkoumání interakcí ţlutě a modře fluoreskujících CdSQDs s genem kódujícím onkogenní protein E6 lidského papilomaviru 16 (E6 HPV 16). Interakce byly zkoumány čipovou elektroforézou a elektrochemicky (square wave voltammetrií - SWV). Čipovou elektroforézou bylo prokázáno, ţe koncentrace 0,5 mM ţlutě fluoreskujících CdS – QDs způsobila nárůst retenčního času komplexu DNA – CdS QDs o 1,8 minut oproti kontrolní DNA (E6 HPV 16). Stejná koncentrace modře fluoreskujících CdS – QDs způsobila nárůst retenčního času komplexu DNA – CdS - QDs o 0,7 minut oproti kontrolní DNA (E6 HPV 16), coţ je přibliţně o 46 % méně neţ v případě 0,5 mM ţlutě fluoreskujících CdS – QDs. Elektrochemicky (SWV) bylo potvrzeno, ţe ţlutě fluoreskující CdS – QDs vykazují vyšší afinitu k DNA (E6 HPV16) oproti modře fluoreskujícím CdS – QDs. Sledován byl redukční signál cytosinu (C) a adeninu (A) u 2,5 µg.mL-1 DNA (E6 HPV 16) po aplikaci ţlutě a modře fluoreskujících CdS – QDs. Koncentrace 0,03 mM ţlutě fluoreskujících CdS – QDs způsobila přibliţně 89% pokles redukčního CA signálu komplexu DNA – CdS – QDs. Stejná koncentrace modře fluoreskujících CdS – QDs způsobila v průměru 49% pokles redukčního CA signálu komplexu DNA – CdS – QDs, coţ je o 40 % méně neţ v případě ţlutě fluoreskujících CdS – QDs. Čipovou elektroforézou a elektrochemicky (SWV) bylo prokázáno, ţe větší CdS – QDs (ţlutě fluoreskující) vykazují vyšší afinitu k DNA (E6 HPV - 16) v porovnání s menšími modře fluoreskujícími CdS - QDs. Interakce byly sledovány na základě změny retenčních časů (čipová elektroforéza) a změnou elektrochemického redukčního CA signálu
62
komplexu DNA - CdS – QDs. Interakce nanočástic s DNA a proteiny mohou být pouţity v medicíně pro diagnostické a léčebné účely [154].
63
64
65
66
67
68
69
5.4 Platinové nanočástice indukují poškození DNA a inhibici Taq DNA polymerázy 5.4.1 Vědecký článek IV NEJDL, L.; KUDR, J.; CHUDOBOVA, D.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; GUMULEC, J. CIHALOVA, K.; SMERKOVÁ, K.; DOSTALOVA, S.; KRIZKOVA, S.; KONECNA, M.; KOPEL, P.;KIZEK, R.; ADAM, V. Platinum nanoparticles induces DNA damage and inhibition of Taq DNA polymerase. Celkový podíl autora na práci: Nejdl L.: 40 %
Onkologická onemocnění jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtí v rozvinutých zemích [122]. Úspěšnost komplexů platiny v protinádorové terapii je dána jejich schopností vázat se koordinační vazbou k bázím DNA [10, 11]. Právě vznik těchto vazeb má za následek ovlivnění sekundární struktury DNA a tím blokaci důleţitých buněčných procesů jako je replikace či transkripce [4]. Publikované práce týkající se platinových nanočástic (PtNPs) uvádějí, ţe PtNPs vykazují vysoký antioxidační účinek proti reaktivním formám kyslíku (ROS) a mají potenciál jako léčivo proti úbytku kostní dřeně [22]. Nanočástice platiny mohou být také pouţity pro zlepšení účinků radioterapie [101]. Začínají se objevovat zprávy o antimikrobiálních, mutagenních a cytotoxických účincích těchto částic. Cílem této práce bylo syntetizovat PtNPs (4,8 nm) a studovat jejich vliv na fragment DNA (λ bakteriofága), kulturu Staphylococcus aureus (S. aureus), lidské fibroblasty (HFB) a erytrocyty. Účinky PtNPs na studované látky byly vţdy porovnávány s cisplatinou. V této práci se podařilo prokázat pomocí UV/Vis spektrofotometrie, agarozové gelové elektroforézy a sekvenování PtNPs-DNA, ţe PtNPs blokují aktivitu Taq DNA polymerázy, coţ pravděpodobně vede k zastavení buněčného cyklu v S fázi. Přikláníme se k názoru, ţe tento efekt spolu s přechodem PtNPs na Pt2+ v intracelulárním prostředí způsobuje mutagenitu těchto nanočástic. Cytotoxický efekt můţe být zvýšen uzavřením PtNPs do liposomu. Rozdílný mechanismus působení PtNPs a cisplatiny na jádra HFB byl prokázán kometovou mikroelektroforetickou analýzou a Amesovým testem. Růstové křivky HFB a S. aureus potvrdily podobný cytostatický efekt PtNPs jako u cisplatiny. Účinky PtNPs na erytrocyty byly studovány průtokovým hematologickým analyzátorem a kapalinovou chromatografií. Bylo zjištěno, ţe PtNPs vyvolává o 20 % niţší oxidační stres neţ cisplatina. Průtokový hematologický analyzátor neprokázal signifikantní rozdíly v krevním obrazu erytrocytů po aplikaci PtNPs a cisplatiny. Tyto zjištěné vlastnosti PtNPs mohou být vyuţity při konstrukci nové generace cytostatických léčiv.
70
Platinum nanoparticles induces DNA damage and inhibition of Taq DNA polymerase
Lukas Nejdl1, Jiri Kudr1, Dagmar Chudobova1, Branislav Ruttkay-Nedecky1,2, Jaromir Gumulec2,3, Kristyna Cihalova1, Kristyna Smerkova1, Simona Dostalova1, Sona Krizkova1,2, Marie Konecna1,2, Pavel Kope11,2, Rene Kizek1,2, Vojtech Adam1,2* 1
Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in
Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic, European Union 2
Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka
3058/10, CZ-616 00 Brno, Czech Republic, European Union 3
Department of Pathological physiology, Faculty of Medicine, Masaryk university,
Kamenice 5, CZ-625 00 Brno, Czech Republic, European Union *Corresponding author Vojtech Adam, Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic, European Union; E-mail:
[email protected]; phone: +420-5-4513-3350; fax: +420-5-4521-2044
Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, in press.
71
ABSTRACT Less tested group of platinum nanoparticles (PtNPs) may have a comparable effect as complex platinum compounds. The aim of this study was to observe the effect of PtNPs on in vitro amplification of DNA fragment of phage λ, on the bacterial cultures (Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium), human foreskin fibroblasts (HFF) and erythrocytes. In vitro synthesized PtNPs were of brown colour and were characterized by X-ray fluorescence, UV/Vis spectrophotometry and atomic absorption spectrometry. PtNPs inhibited the Taq DNA polymerase and secondary affected DNA structure at higher concentrations, which was confirmed by polymerase chain reaction, DNA sequencing and DNA denaturation experiments. Moreover, the different mechanisms of CisPt and PtNPs action were found by Comet assay, where PtNPs caused higher degree of DNA degradation in comparison to CisPt. The encapsulation of PtNPs into liposomes caused the most intensive DNA degradation effects from all studied drugs and formulations. Mutagenic effects of Pt derivatives were confirmed by Ames test. The encapsulation of PtNPs into liposomes increased their antibacterial, cytostatic and cytotoxic effect as determined by method of growth curves on S. aureus and human foreskin fibroblast (HFF) cells. In addition, both bare and encapsulated PtNPs caused lower oxidative stress in the human erythrocytes compared to bare and encapsulated CisPt as determined via GSH/GSSG ratio. Keywords: Nucleic Acids; Liposome; Nanomedicine; Platinum Based Cytostatics; Platinum Nanoparticles; Spectrophotometry
72
1. INTRODUCTION Platinum-based anticancer drugs are used for treatment of various solid tumours [5-8]. The first anticancer drug cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum(II)) was discovered in 1965 by Rosenberg during his studies on the effects of an electric current on bacterial growth [9]. The binding of the cisplatin to DNA and interactions with non-DNA targets with subsequent triggering of cell death through apoptosis, necrosis or both belong to the most important parameters of cisplatin cytotoxicity [155]. Since then numerous platinum complexes of the second generation (carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin) and third (lobaplatin, heptaplatin) generation have been prepared [156] and evaluated as anticancer agents [5, 8, 157-164]. These side effects can be eliminated by specific molecular interactions of a drug with cancer cells and by selective targeting, which can be done by an encapsulation of platinum drugs in molecules suitable for selective transportation. To the most common transporters functionalized polymers, nanoparticles with conjugated platinum drugs, carbon nanotubes and micelles belong. All the mentioned transporters are utilized to improve the efficacy of platinum-based anticancer drugs and to reduce their side effects. Among them liposomes are very important class of compounds, which consist of a phospholipid bilayer surrounding an aqueous core [165] and their size is within the range of tens to thousands nm [166]. Liposomes have interesting biological activities including effective drug loading, biocompatibility and improved pharmacokinetics. Enzymes, proteins, DNA, drugs and other substances can be transported in the inner cavity of the liposomes [167-174] and protect them from degradation. Liposomal formulations of cisplatin and oxaliplatin (Lipoplatin™ and Lipoxal™) are now widely used to reduce drug toxicity and also improve drug targeting [170, 175]. Experimentally, many nanoparticles consisting of the polymers or copolymers and Ptbased drug have been tested. From these, polyethylene glycol-functionalized polyisobutylene-maleic acid copolymer forms complex with cisplatin. The nanoparticles are internalized into the endolysosomal compartment of cancer cells releasing cisplatin in a pH-dependent manner. These nanoparticles have significantly improved antitumor efficacy, which was confirmed in a 4T1 breast cancer model in vivo with limited nephrotoxicity” [176]. Similarly, polymer glucosamine-functionalized polyisobutylenemaleic acid with the encapsulated cisplatin also exhibited significantly improved antitumor efficacy in terms of tumour growth delay in breast and lung cancers and tumour regression in ovarian cancer model. Furthermore, the nanoparticles treatment resulted in reduced systemic and nephrotoxicity, which was confirmed by decreased biodistribution of 73
platinum to the kidney [177, 178]. Nanoparticles of oxaliplatin and carboplatin with polyisobutylene maleic acid copolymer with glucosamine and albumin-bound paclitaxel, respectively, were also tested [179, 180]. Plenty of studies discuss the effects of halogenated Pt salts and complexes and are reviewed elsewhere [8, 181, 182], whereas the effects PtNPs are not mostly elucidated. PtNPs nanoparticles having anti-oxidant and anti-inflammatory effects have been found. In this case, platinum nanoparticles are able to scavenge superoxide anion radical (O2·-) and hydroxyl radical (·OH) [178, 183, 184] and this ability was also showed for PtNPs within apoferritin [185, 186]. The ability of PtNPs to scavenge the reactive oxygen species (ROS) was studied in the mouse ischemic brain. The treatment with PtNPs significantly improved the motor function and greatly reduced the infarct volume, especially in the cerebral cortex [187, 188]. In mice, pulmonary inflammation induced by acute cigarette smoking was shown to be inhibited by inhaled PtNPs stabilized with polyacrylate [189]. On the contrary, Park et al. found that PtNPs can induce various inflammatory responses and cytokine productions [178]. PtNPs also decreased intracellular level of reduced glutathione (GSH) in HT29 colon carcinoma cells and also impaired DNA integrity probably not by the ROS formation [173]. These effects of PtNPs of sizes less than 20, 100 and more than 100 nm on HT29 have been confirmed and have been found to cause DNA strand breaks in a concentration, time and size-dependent manner, but appears not to translocate into the nucleus or interact with mitochondria [97]. DNA interaction of Pt-attached iron oxide nanoparticles was studied using gel electrophoresis and transmission electron microscopy (TEM). Two types of interactions were suggested. One interaction involved the direct linkage of DNA molecules onto the surface of the nanoparticles, while the second interaction suggested the detachment of small PtNPs from the iron oxide support due to strong DNA interaction [145, 190]. Asharani et al. reports that PtNPs (3-8 nm) induce dose dependent cytotoxicity and genotoxicity in normal (IMR-90) and cancer cells (U251). They suggested that it is caused by Pt2+ release from particles due to reaching the acidic environment of lysosome [190, 191]. On the other hand, PtNPs do not show cytotoxicity in several different cultured cells (TIG-1, MI-38, MRC-5, HeLa, and HepG2) [183]. The contradiction of these studies indicate that the biological effects of PtNPs remains still unclear and seems to be dependent on the particle size and most probably surface properties. Therefore, testing on various cell types is needed. Interaction of different nanoparticles (NP) with bacteria and fungi was studied by Chwalibog and Sawosz et al. [192, 193]. It was found that silver, gold, and PtNPs, with negative zeta potential, had cell damaging properties on Staphylococcus aureus (Gram74
positive bacteria) and Candida albicans (fungi). PtNPs forced both microorganisms to release substances from intracellular to extracellular space due to disintegration the cytoplasmic membrane and cell wall [192]. The analysis of morphological effects of interaction of PtNPs with Listeria monocytogenes (Gram-positive) revealed that PtNPs entered cells of Listeria monocytogenes and were removed from the cells. In the case of Salmonella enteritidis (Gram-negative), PtNPs were detected in bacteria cells probably bound to DNA. After washing and centrifugation, some of the PtNPs-DNA complexes were characterized. The results indicate that the bacteria could be used as a transporter to deliver PtNPs to specific points in the body [173, 193]. In this work we present our results on the preparation of liposome with encapsulated platinum derivatives both PtNPs and CisPt. The aim of this study was to investigate the effect of these PtNPs on in vitro amplification of DNA fragment of phage λ, and on the bacterial cultures (Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium), human foreskin fibroblasts (HFF) and erythrocytes. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1 Chemicals and material Cholesterol,
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)
sodium
salt,
chloroform, cisplatin, PtCl4, polyvinylpyrrolidone (PVP, 40 k), HCl (37%, w/w), NaBH4 and water were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) in ACS purity. Hydrogenated phosphatidylcholine from soybean was a gift from Lipoid GMBH (Ludwigshafen, Germany). The deionised water was prepared using Aqual 25 (Aqual, Brno, Czech Republic) and was further purified using apparatus MiliQ Direct QUV equipped with the UV lamp (Merck Millipore, Merck KgaA, Darmstadt, Germany). The pH of solutions was measured using pH meter WTW inoLab (WTW GmbH, Weilheim, Germany).
2.2. Preparation of Pt nanoparticles (PtNPs) Platinum nanoparticles (PtNPs) were prepared according to [194] with a slight modification. PtNPs were also covered by polyvinylpyrrolidone (PVP), in order to prevent their aggregation [195]. Briefly, PtCl4 (0.034 g) was dissolved in acidic water (5 ml) with 16 µL of 37% HCl. The solution of PtCl4 (5 mL) was added, with stirring, to another solution of 0.135 g PVP in water (45 mL). The mixture was stirred for 1 h at 25ºC. NaBH4 (50 mg) was subsequently added to the mixture and final colour of the solution was black. The mixture was stirred overnight. 75
2.3. X-ray fluorescence analysis (XRF) Platinum nanoparticles were analysed using X-ray fluorescence analysis using Spectro Xepos (Spectro Analytical Instruments, Kleve, Germany). Measurement time was 300 s. For excitation a Mo secondary target was used. The sample was measured through the PE bottle side wall 20 mm above the bottom. The Spectro Xepos software and TurboQuant method were applied for data analysis.
2.4. Preparation of liposome film Modification of published method [196] was used for preparation of liposomes [174]. Briefly, cholesterol (100 mg), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) sodium salt (100 mg) and phosphatidylcholine (100 mg) were dissolved in chloroform (4.5 mL). A lipid film was obtained by rotary evaporation of chloroform. Residual chloroform was removed by nitrogen.
2.5. Preparation of liposome filled with PtNPs (LipoPtNPs) Solution containing 0, 0.015, 0.03131, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 and 1 mL of platinum nanoparticles (PtNPs, 400 µg.mL-1 of Pt) were diluted with water to 1 mL and added to liposome (20 mg). Samples were homogenized for 15 min in ultrasonic bath Sonorex Digital 10P (Bandelin, Berlin, Germany). The homogenized mixtures were then heated and shaken for 15 min at 60 ºC at Thermomixer Comfort (Eppendorf, Germany). The samples were then washed several times with water on Amicon 3k (Merck Millipore, Merck KgaA, Darmstadt, Germany) with a final sample volume 1 mL [174].
2.6. Preparation of liposome filled with cisplatin (LipoCisPt) Solutions containing 0, 0.015, 0.03131, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 and 1 mL of cisplatin (CisPt, 0.4 mg Pt per mL) were diluted with water to 1 ml and added to liposome (20 mg). Samples were prepared in the same manner as mentioned above in paragraph 2.5. 2.7. UV/Vis spectrophotometry Spectra of PtNPs or CisPt (0 - 400 µg.mL-1) and 1 mM polyvinylpyrrolidon (PVP) were recorded within the wavelength range from 200 to 800 nm using quartz cuvettes (1 cm, Hellma, Essex, UK) on a spectrophotometer SPECORD 210 (Analytik Jena, Jena, Germany) at 25°C Julabo (Labortechnik, Wasserburg, Germany). Denaturation of a DNA complex with PtNPs or CisPt in the concentration range 0 - 1 mM were monitored using a 76
spectrophotometer SPECORD S600 with a diode detector (Analytik Jena, Jena, Germany). The sample was incubated for 3 min within the temperature range from 25 to 99 °C and the absorbance was measured within the wavelength range from 200 to 800 nm. Changes in absorbance spectra of complex were recorded and evaluated by WinASPECT (version 2.2.7.0).
2.8. Atomic absorption spectrometry (AAS) Platinum was determined on 280Z Agilent Technologies atomic absorption spectrometer (Agilent, Santa Clara, USA) with electrothermal atomization. As the radiation source, platinum hollow cathode lamp (Agilent) was used. The spectrometer was operated at 265.9 nm resonance line with spectral bandwidth of 0.2 nm and the lamp current of 10 mA. After the turning on the heating time–temperature program the sample volume 20 µl was injected into the tube. The pyrolysis temperature 1000 °C for 8 s and the atomization temperature 2700 °C for 3 s were applied. The argon inert gas flew at a speed 300 mL.min-1. Zeeman background correction was used with field strength of 0.8 Tesla. The absorption signal was evaluated in peak height mode with 7 point smoothing. Each sample was measured in 3 replicates. 2.9. Polymerase chain reaction (PCR) DNA isolated from bacteriophage λ (48 502 bp) and Taq PCR kit were purchased from New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA). Primers for amplification of λ xis gene fragment
were
synthesized
by
CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'
Sigma-Aldrich for
and
forward
their
sequence
primer
was
and
5'5'-
TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3' for reverse primer. The volume of reaction mixture was 25 μl and composed of 2.5 μl of 10× standard Taq reaction buffer, 0.5 μl of 1 mM deoxynucleotide solution, 0.5 μl of each 10 μM primer, 0.125 μl of Taq DNA polymerase; selected volume of water or drugs diluted with water (sterile, ACS purity, Sigma-Aldrich) and 0.5 μl of bacteriophage λ DNA. PCR was performed using Mastercycler ep realplex4 S (Eppendorf, AG, Hamburg, Germany) with the following cycling conditions: initial denaturation for 120 s at 95 °C; 30 cycles of PCR( 15 s at 95 °C, 15 s at 64 °C and 45 s at 72 °C) with a final elongation for 5 min at 72 °C. The obtained DNA fragments (498 bp) were purified by MinElute PCR Purification
Kit
(Qiagen,
Germany).
DNA
spectrophotometrically (Analytic Jena, Germany).
77
concentration
was
determined
2.10. Agarose gel electrophoresis The amplified product was analysed using agarose gel electrophoresis and the working conditions were as follows: 2% agarose gel (High melt/Medium fragment, Mercury, Sand Diego, CA, USA) with 1× TAE buffer, 60 V and 160 min (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The 100 bp DNA ladder (New England Biolabs, Ispwich, MA, USA) was used as a molecule size marker. Bands were visualized using UV transilluminator at 312 nm (VilberLourmat, Marne-la-Vallée Cedex, France). The fluorescence intensity of the ethidium bromide was detected by In-Vivo Xtreme (Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA). The parameters were as follows: Excitation filter: 520 nm, Emission filter: 600 nm, Exposure time: 6 s, Binning: 2 x 2, fStop: 1.1, Field of View: 19.5 x 19.5 cm. The images were processed by Carestream Molecular Software. Fluorescence was quantified using the software and the background was subtracted. The intensity of the fluorescence of ethidium bromide was directly proportional to the concentration of DNA.
2.11. DNA sequencing 2.11.1. PtNPs interactions with DNA Purified DNA fragments (50 μg.mL-1) were mixed with different concentrations of PtNPs (25, 50, 100, 200 and 400 μg.ml-1 Pt) in the ratio 1:1 (v/v). Solutions of DNA with PtNPs were incubated 1 hour at 25 °C (Thermomixer 5355, Eppendorf, Germany). To remove the excess of PtNPs the dialysis by 0.025 μm membrane filter (Millipore, Ireland) against ACS water for 12 hours at 6 °C was performed.
2.11.2. CisPt interactions with DNA DNA fragments solution (50 μg.mL-1) was mixed with different concentrations of cisplatin (25, 50, 100, 200 and 400 μg.mL-1 Pt) in the rate 1:1 (v/v) in the environment of 10 mM NaClO4. Solutions of DNA with drugs were incubated 24 hours at 37 °C. To remove the excess of platinum-based drug the dialysis through0.025 μm membrane filter (Millipore, Ireland) for 24 hours at 6 °C was used.
2.11.3. Sequencing of platinized DNA For sequencing reaction the DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) was used. The conditions of 30 cycle sequencing reaction were as follows: 96 °C for 20 s; 50 °C for 20 s and 60 °C for 4 min. A fluorescence-labelled DNA fragments were purified by using magnetic particles CleanSEQ (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). DNA 78
sequencing was performed using Genetic Analysis System CEQ 8000 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). After denaturation at 90 °C for 2 min, the fluorescence-labelled DNA fragments were separated in 33 cm capillary with 75 μm i.d. (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), which was filled with a linear polyacrylamide denaturing gel Beckman Coulter, Brea, CA, USA). The separation runs at capillary at temperature of 50 °C and voltage of 4.2 kV for 85 min. 2.12. Cultivation of Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (NCTC 8511) was obtained from the Czech Collection of Microorganisms, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic. Strains were stored as a spore suspension in 20% (v/v) glycerol at −20 °C according to the conditions mentioned in [197, 198]. Briefly, prior to use in this study, the strains were thawed and the glycerol was removed by washing with distilled water. The cultivation medium contained: meat peptone (5 g.L-1), NaCl (5 g.L-1), bovine extract (1.5 g.L-1), yeast extract (1.5 g.L-1) (HIMEDIA, Mumbai, India), and sterilized MilliQ water with 18 MΩ. Before sterilization, pH of the cultivation medium was adjusted at 7.4and media were sterilized at 121 °C for 30 min. in sterilizer (Tuttnauer 2450EL, Israel). The prepared cultivation media were inoculated with bacterial culture into 25 mL Erlenmeyer flasks and subsequently bacterial cultures were cultivated for 24 hours on a shaker at 600 rpm and 37 °C. Bacterial cultures cultivated under these conditions were diluted by cultivation medium to optical density (OD600) = 0.1 AU and used in the following experiments [198]. 2.13. Cultivation of human foreskin fibroblasts The human foreskin fibroblast (HFF) cell line was grown as monolayers in DMEM (high glucose) medium with 10% foetal bovine serum, supplemented with penicillin and streptomycin (1 U per ml) at 37°C in 5% CO2 atmosphere. Approximately 2 × 105 cells at logarithmic growth phase were treated with free and/or encapsulated CisPt or PtNPs in concentrations 0, 12.5, 25, 50, 100 and 200 μg.mL-1 of Pt. The cells were incubated at 37 °C in 5% CO2 for 2h. After the exposition, the cells were harvested using a cell-scraper and resuspended in 200 µl of PBS. All experiments were performed in two replicates. HFF were also used for Comet assay.
2.14. Growth curves Antimicrobial effect of tested compounds and their combinations was analysed by measuring the absorbance using an apparatus Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific, Germany). After dilution of bacterial culture of Staphylococcus aureus (grown for 24
79
hours) with LB medium to absorbance 0.1 (λ = 600 nm) using Specord spectrophotometer 210 (Analytik Jena, Jena, Germany) S. aureus culture in the microplate was mixed with various concentrations of platinum compounds (PtNPs and/or cisplatin) or these compounds encapsulated in liposome or S. aureus without treatment as a control. Concentrations of platinum compounds were 0, 0.5, 1.0, 1.9, 3.8, 7.5, 15, 30 and 60 μg.mL1
of Pt. Total volume in the microplate wells was 300 µL. Measurements were carried out
at time 0, then each 30 min. for 24 hours at 37 °C and a wavelength of 620 nm. The achieved values
were analysed in graphic form as growth curves for each variant
individually.
2.15. Cell growth and proliferation assay of human foreskin fibroblasts (HFF) using impedance measurement with xCELLigence system The xCELLigence system was used according to the instructions of the supplier (Roche Applied Science and ACEA Biosciences). The xCELLigence system consists of four main components: the Real time cell analysis (RTCA) analyser, the RTCA DP station, the RTCA computer with integrated software and disposable E-plate 16. Firstly, the optimal seeding concentration for proliferation and RTCA assay of HFF was determined. After seeding the total number of cells in 200 µL medium to each well in E plate 16, the attachment, proliferation and spreading of the cells was monitored every 15 min. All experiments were carried out for 100 h.
2.16. Preparation of S. aureus lysates for biochemical spectrophotometric measurements Bacterial culture was diluted with Luria Bertani medium (LBM) to absorbance 0.1 AU as in the previous procedure. Then bacterial culture was mixed with the increasing concentrations of platinum compounds (PtNPs and CisPt) or these compounds encapsulated in liposome or S. aureus alone as a control. The concentrations of platinum compounds were 1.9, 3.8, 7.5, 15, 30 and 60 μg.mL-1 of Pt. Then bacterial culture was cultivated on a shaker for 12 hours at 600 rpm and 37 °C. After the incubation with platinum compounds samples were collected by centrifugation (5000 rpm, 15 min). Bacterial cells were washed three times with phosphate buffer (pH = 7). Finally, cells were resuspended in phosphate buffer (pH = 7, volume 1.5 mL) and sonicated using the ultrasound needle (Hielscher, Germany) for 2 minutes. Homogenates were vortexed (5 min, BioSan, Riga, Latvia) and centrifuged (1600 rpm, 30 min.). Obtained supernatants of bacterial lysates were used for spectrophotometric determination of oxidative stress [199].
80
2.17. Spectrophotometric measurements of oxidative stress Spectrophotometric measurements of oxidative stress (using methods ABTS, and DPPH) and total protein content were carried using an automated chemical analyser BS-400 (Mindray, Shenzhen, China). Reagents and samples were placed on cooled sample holder and automatically pipetted directly into plastic cuvettes. Incubation proceeded at 37 °C. For detection itself, the following range of wavelengths can be used – 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740 and 800 nm. The instrument was operated using the BS400 software (Mindray) [200].
2.17.1. Determination of oxidative stress using the DPPH method The DPPH test is based on the ability of the stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical to react with hydrogen donors. The DPPH• radical displays an intense UV-VIS absorption spectrum. In this test, a solution of radical is decolourized after reduction with antioxidant (AH) or a radical (R•) in accordance with the following scheme: DPPH• + AH → DPPH-H + A•,
DPPH• + R• → DPPH-R [201]. Procedure for the
determination was adopted from publications of Sochor et al. [202] and Chudobova et al. [200] and Pohanka et al. [203]. Shortly, a 150 µl volume of reagent (0.095 mM 2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl - DPPH•) is incubated with 15 µl of sample. Absorbance is measured at 505 nm for 6 minutes and output ratio was achieved by difference of absorbance at the 8th minute and second minute of the assay procedure.
2.17.2. Determination of oxidative stress using the ABTS method The ABTS radical method is one of the most used assays for the determination of the concentration of free radicals. It is based on the neutralization of a radical-cation arising from the one-electron oxidation of the synthetic chromophore 2,2’-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS): ABTS – e-
ABTS·+. This reaction is
monitored spectrophotometrically by the change of the absorption value. Procedure for the determination was adopted from publications of Sochor et al. [202] and Chudobova et al. [200] and Pohanka et al. [203]. Shortly, a 150 µl volume of reagent (7 mM ABTS• (2,2´azinobis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid and 4.95 mM potassium peroxodisulphate) is poured with 3 µl of sample. Absorbance is measured at 660 nm. For calculating of the antioxidant activity, difference between absorbance at the last 8th minute and second minute of the assay procedure was used [204].
2.17.3. Determination of total proteins content by the pyrogallol red 81
The pyrogallol red protein assay (Skalab, Czech Republic) is based upon formation of a blue protein-dye complex in the presence of molybdate under acidic conditions (pH = 2.5). A 150 µL volume of reagent mixture (1:1) R1 + R2 (50 mM succinic acid, 3.47 mM sodium benzoate, 0.06 mM sodium molybdate, 1.05 mM sodium oxalate and 0.07 mM pyrogallol red) is pipetted into a plastic cuvette with subsequent addition of 8 µL of sample. Absorbance is measured at λ = 605 nm after 10 minutes long incubation. Resulting value is calculated from the absorbance value of the pure reagent mixture and from the absorbance value after 10 minutes of incubation with the sample [199].
2.18. Preparation of erythrocytes for haematological analysis and determination of glutathione Whole blood of 3 healthy volunteers was collected in tubes with heparin. Blood was centrifuged for 10 minutes at 2000 rpm. After removing of plasma, erythrocytes together with platelets were diluted with phosphate buffer pH 7 in a 1:1 ratio. The number of erythrocytes and platelets was determined using haematology analyser BC – 5800 (Mindray, Shenzhen, China). To the erythrocytes mixture with platelets various concentrations of Pt derivatives (PtNPs, PtNPs encapsulated in liposomes (LipoPtNPs), cisplatin or cisplatin encapsulated in liposomes (LipoCisPt)) were added in a 1:1 ratio to reach the resulting concentrations (12.5, 25, 50, 100, 200 μg.mL-1 of Pt and 0.6, 1.3, 2.5, 5 and 10 mg.mL-1 of liposomes) in the mixture. Erythrocytes treated with platinum compounds were mixed with trifluoroacetic acid (TFA) in a 2:1 ratio (100 µL of erythrocytes + 50 µL of 15% TFA (v/v)). Subsequently, the mixture was homogenized using ultrasonic needle for 2 minutes and vortexed for 10 minutes. After centrifugation of the mixture for 20 minutes at 25 000 rpm, 20 µL of supernatant was used for chromatographic analysis.
2.19. Estimation of selected haematological parameters of erythrocytes mixture with platelets exposed to platinum derivatives Haematology Analyser BC-5800 (Mindray, Shenzen, China) was used for selected haematology analyses of erythrocytes mixture with platelets exposed to platinum derivatives encapsulated in liposomes or alone, which were analysed by flow cytometry. The number of erythrocytes and platelets was determined by the impedance method. Flow cytometry together with fluorescence-activated cell sorting (FACS) was applied to determine the number of leukocytes and differential. Histograms of erythrocytes mixture
82
with platelets and Pt derivatives encapsulated in liposomes or alone were recorded. Liposomes were visualised in the Baso channel as a red rhombus.
2.20. Determination of reduced and oxidized glutathione Reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione were assayed using high performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) according to Kleckerova et al. [205] and Skladanka et al. [206] and Kensova et al. [204]. Two solvent delivery pumps (Model 582 ESA Inc., Chelmsford, MA, USA) operating in a range of 0.001 – 9.999 mL.min-1, column Zorbax eclipse AAA C18 (150 × 4.6; 3.5 µm particle size; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) and a CoulArray electrochemical detector (Model 5600A, ESA, USA) with one flow cell. The cell consists of four working carbon porous electrodes, each one with auxiliary and dry Pd/H2 reference electrodes. Both the detector and the reaction coil/column were thermostated. The 20 μL of sample was injected using autosampler (Model 542 HPLC, ESA, USA). Samples were analysed in the carousel at 8 °C . The column was thermostated at 32 °C. Mobile phase consisted of 80 mM TFA (A) and methanol (B). The compounds of interest were separated by the following linear gradient: 0 → 1 min. (3% B, v/v), 1 → 2 min. (10% B, v/v), 2 → 5 min. (30% B, v/v), 5 → 6 min (98% B, v/v). Flow rate of the mobile phase was 1 mL.min-1 and working electrode potential was set to 900 mV. 2.21 Comet assay The comet assay was performed according to Singh et al. [143] with small modifications [144, 145]. Conventional slides were immersed to 0.5% normal-melting agarose (v/v, CLP, San Diego, USA) and let dry at 50 °C. The cells and slides were handled under dimmed light conditions during the whole process. Briefly, 75 µL of 0.5% low-melting agarose was mixed with approximately 10000 cells suspended in 10 µL of PBS and layered onto the slides and immediately covered with coverslips. After agarose solidification (5 min at 4 °C), the coverslips were removed and the slides were immersed overnight in dark at 4 °C in freshly prepared lysing solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10) containing 1% Triton X-100 and 10% DMSO (v/v) added prior to use. After the lysis, the slides were placed on a horizontal gel electrophoresis unit filled with electrophoretic buffer (300 mM NaOH, 1mM Na2EDTA, pH > 13) and left there for 30 min in dark at 4°C for DNA unwinding. Then, the electrophoresis was performed for 30 min at 1.25 V.cm-1 (300 mA). After the electrophoresis, the slides were washed with neutralizing buffer (0.4 M Tris, pH 7.5) and the slides were stained with 2 µg.mL-1 of ethidium bromide for 5 min in 83
dark at 25 °C. After the staining, the slides were washed with distilled water, covered with coverslips and microscoped using the inverted system fluorescence microscope Olympus IX 71S8F-3 (Tokyo, Japan). The excitation filter 520–550 nm and the emission filter of 580 nm was employed (Magnification: 100×). The images were captured by Camera Olympus DP73 and processed by Stream Basic 1.7 Software with the resolution of 4800 × 3600 pixels. From each slide, 10 fields were photographed and the nuclei were classified in five categories ranging from 0 (no visible tail) to 4 (most DNA in tail). To quantify the effect of the drugs on DNA damage, an Index of damage (ID) was calculated as sum of number of the nuclei in each category multiplied with 0.1 for category 0 and by 1, 2, 3 and 4 for other categories divided by total number of the nuclei. 0.1 × N0 + 1 × N1 + 2 × N2 + 3 × N3 + 4 × N4 N0 + N1 + N 2 + N3 + N4
2.22. Ames test The mutagenicity of PtNPs and cisplatin (CisPt) and their liposomal complexes was determined using the standard Ames test without S9 activation. As the test bacterial strain Salmonella enterica subsp. enterica ser. typhimurium TA 100 was used. Ames test was carried out exactly as described in the methodology [207]. Briefly, the mutagenicity assay was performed by adding 0.1 mL of the overnight grown bacterial culture (109 cells.mL-1) to the Petri dishes that contained 3 mL of top agar with 1 or 16 µg (Pt) of PtNPs or CisPt, respectively. As a reference mutagen ethidium bromide (1 µg.mL-1) was used [208].
84
3. RESULTS 3.1. UV/Vis spectrophotometry and X-ray fluorescence characterization of PtNPs The synthesized PtNPs were characterized by X-ray fluorescence and UV/Vis spectrophotometry to detect the presence of Pt and to identify characteristic colour of PtNPs. Firstly, the X-ray spectrum of the PtNPs was recorded and the two characteristic peaks of Pt Kα (391 keV) and Pt Kβ (457 keV) were observed (Fig.1A). The presence of Pt was also confirmed by atomic absorption spectrometry (AAS) (not shown) and the concentration of Pt ranged from 60 to 440 µg.mL-1 in PtNPs. The colour of PtNPs was brown and no absorption maximum for PtNPs or polyvinylpyrrolidone (PVP) was found in the investigated range of wavelengths (Fig. 1B or C, respectively). The photos of various concentrations of PtNPs are shown in Fig.1D.
85
Figure 1. Spectral characterization of PtNPs. (A) X-ray fluorescence (XRF) spectrum of the platinum nanoparticles (PtNPs). (B) The absorption spectrum of polyvinylpyrrolidone (PVP); in inset: chemical formula of PVP basic unit - pyrrolidone. (C) The absorption spectra of PtNPs (a = 200, b = 100, c = 50, d = 25, e = 12.5, f = 6.3, g = 3.2 and h = 1.6 µg.mL-1 of Pt). (D) PtNPs visualized in ambient light measured in the same concentrations as in Fig. 1C. 3.2. PtNPs and CisPt interactions with DNA fragment from phage λ and Taq DNA polymerase PtNPs and CisPt impact on DNA replication was studied using polymerase chain reaction (PCR) and DNA melting point (Tm) analysis. It was observed that the function of Taq DNA polymerase was blocked by PtNPs. The weaker effect of the blocking of Taq DNA polymerase activity was also observed in the case of CisPt. The suggested scheme of the possible mechanism is shown in Fig. 2A. In the first part of experiment it was observed that PCR was stopped after addition of at least 3.1 µM PtNPs (Fig. 2B). CisPt was studied in the same way and it was found out that the application of 51 µM CisPt disrupted the PCR, which is nearly 17-time higher concentration compared to concentration of PtNPs (Fig 2C). In the second part of the experiment the changes of denaturation temperatures (Tm) were studied. To observe these changes, the DNA fragment from λ bacteriophage (5 µg.mL-1) was mixed with PtNPs or CisPt (0 –1000 µM). CisPt (0.2 µM) caused the decrease in the Tm by 7 °C compared to the control sample (77 °C). The same effect on the Tm was observed after addition of 250 µM PtNPs, which is 1250-times higher dose as in the case of CisPt (Fig. 2D). In the third part of the experiment, the λ bacteriophage DNA fragment (5 µg.mL-1) was added to the CisPt or PtNPs solutions. These mixtures were subsequently dialysed, thus, the particles and molecules, which were not intercalated or bound to DNA structure, were removed. The modified DNA was used for Sanger sequencing reaction and the DNA was further analysed by the capillary gel electrophoresis with laser induced fluorescence detection (CGE-LIF). The fluorescence signals of probed fragments were compared to the control DNA sample (without the addition of CisPt or PtNPs). Figure 2E shows that the addition of 6.25 μM PtNPs induced the increase of the fluorescence signals of fragments terminated with the dideoxynucleotides (ddNTPs) thymine (T), guanine (G) or adenine (A) compared to the control sample. In addition, the increasing concentration of added PtNPs 86
caused the decrease in the fluorescence signals. In the case of DNA fragments terminated with the cytosine (C), the decreasing fluorescence was observed even when 6.25 μM PtNPs were added. After CisPt application the fluorescence signals of DNA fragments terminated with T and G decreased with the increasing concentration of CisPt. At the DNA fragments terminated with C and A, the fluorescence signal firstly increased (at 0.17 μM CisPt) followed by the decrease in the fluorescence signal with the increasing concentration of CisPt (Fig. 2F). Signal decrease by 50 % was reached after application of PtNPs and CisPt in concentrations of 49.3 μM and 0.672 μM, respectively. These concentrations varied approximately 73 times. From the results of the second and third part of the experiment it is clear that it is necessary to apply 1250 times (in the case of Tm change) and 73 times (in the case of sequencing) higher concentration of PtNPs to achieve the same effect of PtNPs interaction with DNA as in the case of CisPt. Conversely, as confirmed first experiment, where the PCR mixture contained together with DNA also Taq DNA polymerase, PCR was stopped by the addition of 3.1 µM PtNPs, which is 16.7 times lower concentration than in the case of CisPt. The results of these analyses have unequivocally demonstrated that PtNPs have a higher affinity for Taq DNA polymerase than for DNA.
87
Figure 2. Effect of Pt-derivatives on polymerase chain reaction (PCR). (A) The suggested effects of Pt-derivatives (PtNPs and CisPt) on polymerase chain reaction (PCR) is based on binding of PtNPs on the Taq DNA polymerase, which leads to ceasing of PCR, (B) whereas CisPt primarily intercalates in DNA structure and stops PCR by this way. The gel electrophoregrams of PCR product mixture with particular concentration of (C) PtNPs (0.04 – 4 200 ng.mL-1 of Pt) and (D) CisPt (0.04 – 42 000 ng.mL-1 of Pt). (E) DNA denaturation temperature affected by the 0 – 200 µg. mL-1 of Pt derivatives. Fluorescence of labelled nucleotides of DNA fragment after sequencing, which was influenced by (F) 0 – 20 µg.mL-1 of PtNPs and (G) 0 – 0.33 µg.mL-1 of CisPt.
3.3. Comet assay The previously obtained results were interesting and based on them it can be concluded that there are great differences in the actions of PtNPs and CisPt. Based on these, we followed with the cell experiments, where we also tested liposomal forms of both drugs to mimic targeted delivery. Therefore, the extent of DNA damage in the individual somatic cells was studied. To assess the effect of both PtNPs and CisPt on nuclear DNA of eukaryotic cell the alkaline comet assay was used. Human foreskin fibroblast (HFF) cell culture in exponential growth phase was exposed to bare and liposome-encapsulated Ptderivates in concentrations 0, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 and 1 mM. Then, the cells were harvested and immobilized into agarose, and lyzed. Later, the nuclei were electrophoresed and stained with ethidium bromide (Fig. 3A). The microphotographies show the evident difference between the effect of CisPt (Fig. 3A – a,b) and PtNPs (Fig. 3A – c,d) on degradation of HFF nuclei. Index of the cell nuclei damage was increased by the encapsulation of CisPt or PtNPs within liposome (Figs. 3 B and C). The liposomeencapsulated PtNPs had clearly the most intensive degradation effects from all studied drugs and formulations. As it is shown in Fig. 3C, the platinum nanoparticles (0.13–1 mM) encapsulated into liposome (LipoPtNPs) exhibited more than two-times higher damage index than bare PtNPs. The comparison of the total index of DNA damage shows that the PtNPs encapsulated within liposome damaged mostly the cell nuclei (Fig. 3D).
88
Figure 3. (A) The alkaline comet assay of nuclear DNA from human fibroblasts treated with (a) cisplatin (0 – 200 µg. mL-1 of Pt) encapsulated in liposome LipoCisPt, (b) same concentration of CisPt only, (c) PtNPs encapsulated in liposome LipoPtNPs and (d) free PtNPs. (B) The index of damage of CisPt and LipocisPt. (C) The index of damage of PtNPs and LipoPtNPs. (D) The nuclear DNA of human fibroblast and summarized theirs total damage.
3.4. Ames test The mutagenic properties of the CisPt and PtNPs were demonstrated by Ames test. At the control sample of Salmonella typhimurium (TA100 strain), no mutagenic compound was used, thus, no reversion mutations and colony growth was observed. The ethidium bromide was used as the reference mutagen and by using it, the ability of reversion mutation of the bacterial strain was confirmed. Two concentrations of both CisPt and PtNPs and their encapsulated forms were used (1 and 16 µg.mL-1 of Pt). In the case of both tested PtNPs concentrations, the revertants were observed. The mutagenity of CisPt was confirmed only at the concentration of 16 µg.mL-1 of Pt. 89
3.5. The assessment of PtNPs and CisPt cytotoxicity and the effect of their encapsulation in liposomes In these experiments we were focused on the assessment of the platinum derivatives cytotoxicity and also on studying of the effect of their encapsulation in liposomes. Both S. aureus and HFF were analysed after the application of PtNPs and CisPt encapsulated in liposomes or alone by the method of growth curves using Multiskan EX (S. aureus) and xCELLigence (HFF) instruments. Firstly, the growth curves of the bacterial culture after the addition of Pt-derivatives encapsulated in liposome or alone in concentrations of 100 μg.mL-1 of Pt were measured. The obtained results were recalculated to relative absorbance value, thus, the control growth curve without addition of platinum derivatives refers to 0 % (Fig. 4A – a). The highest cytostatic effect (100 %) was observed at CisPt (Fig. 4A – c), whereas the similar effect was achieved after addition of LipoPtNPs but with 5 hours delay compared to CisPt (Fig. 4A – d). The effect of LipoCisPt (Fig. 4A – b) was 7 hours delayed and had 60% intensity compared to CisPt. The cytotoxicity of PtNPs was the lowest from all drugs during the first 8 hours of the treatment (Fig. 4A – b), but after 24 hours their cytostatic effect was the third most intensive and its value was by 20 % higher than LipoCisPt and by 30 % lower than CisPt. The results are summarized in Fig. 4B, where cytotoxicity of Ptderivates encapsulated in liposomes or alone are shown. The growth of human foreskin fibroblasts (HFF) was monitored by xCELLigence method in the presence of platinum derivatives (Fig. 4C). The growth of the cells was expressed as % of control, thus, the growth curve of the control cells cultivated without addition of any drug corresponds to 0 %. At all platinum derivatives the monotonous decrease of the cells growth within the cultivation was observed with exception of PtNPs (Fig. 4B – e), which stimulated the HFF growth during the first 50 hours, but after 50 hours the growth inhibition occurred. The highest cytostatic effect (100 %) was recorded for CisPt (Fig. 4B – c), than LipoCisPt (Fig. 4B – b). PtNPs exhibited markedly lower cytotoxic effect compared to CisPt (Fig. 4B – c). After 50 hours long cultivation, the growth decrease was observed, but the inhibition effect was 50% when compared to CisPt after 100 hours of the treatment (Fig. 4B – c). After liposome encapsulation the LipoPtNPs did not exhibit proliferation effect, but the inhibition activity after 100 hours was comparable to bare PtNPs (Fig. 4F – d). Summary of the results obtained is shown in Fig. 4D, where cytotoxicity of Pt-derivatives encapsulated in liposomes or alone is shown. Based on these results, CisPt had the highest cytostatic and cytotoxic effect in both S. 90
aureus and HFF. The encapsulation of cisplatin in liposomes decreased both cytostatic and cytotoxic effects of ciplatin in bacterial cells but not in HFF. PtNPs were more effective in bacterial cells than in HFF. The encapsulation of PtNPs in liposomes increased in both cases cytostatic and cytotoxic effects of PtNPs. Further, in both types of cells (HFF and S. aureus) the antioxidant activity measured by ABTS and DPPH methods as an indicator of oxidative stress were studied (not shown). In HFF lysates, the antioxidant activity did not decrease with the increasing concentration of PtNPs (0 – 100 µg.mL-1) and PtNPs encapsulation into liposomes had no effect on the values of antioxidant activity. On the other hand, the antioxidant activity of HFF lysates treated with CisPt decreased by 25 % at the highest applied concentration. The encapsulation of CisPt into liposome reduced the decrease of antioxidant activity by 15 %. A similar result was also found in the antioxidant activity of cell lysates of S. aureus treated with Pt-derivatives encapsulated in liposome or alone within tested concentration range (0-100 μg.mL-1) with the exception that the encapsulation of CisPt into liposomes did not have any effect on the change of antioxidant activity.
91
Figure 4. The effect of platinum derivatives on both bacterial and human cells after application of platinum derivatives alone or encapsulated in liposomes. Relative change of growth rate of (A) S. aureus bacterial culture and (C) human foreskin fibroblasts (HFF) after treatment with Pt-derivatives (100 μg.mL-1 of Pt) during 24 hours long experiment. (a) Cell culture without any treatment, (b) LipoCisPt, (c) CisPt, (d) LipoPtNPs and (e) PtNPs. Percentage survival of (B) S. aureus bacterial culture and (D) human foreskin fibroblasts (HFF) after 24 hours of treatment with Pt-derivatives (100 μg.mL-1 of Pt) alone and encapsulated in liposomes.
3.6. The influence of Pt derivatives encapsulated in liposomes and alone on erythrocytes mixture with platelets (flow cytometry and GSH/GSSG ratio) The influence of platinum derivatives encapsulated in liposomes or alone on human erythrocytes mixture with platelets was studied by flow cytometry using haematology analyser and the oxidative stress was determined by GSH/GSSG ratio. Mixtures of erythrocytes with platelets were exposed to LipoCisPt, CisPt, LipoPtNPs and PtNPs in concentrations of 0, 12.5, 25, 50, 100 and 200 µg.mL-1 of Pt for 16 hours. The concentration of liposomes in LipoPtNPs and LipoCisPt were as follows 0, 0.6, 1.3, 2.5, 5, and 10 mg.mL-1). Histograms of erythrocytes mixture with platelets and Pt derivatives encapsulated in liposomes or alone were recorded by haematology analyser. Liposomes were visualised in the Baso channel as a red rhombus (Fig. 5A). No significant interaction was shown for any Pt derivative and erythrocytes mixture with platelets (Fig. 5A). The increasing content of liposomes with an increasing concentration of liposomes is shown in Figs. 5A – c. The GSH and GSSG concentrations used for calculation of GSH/GSSG ratio were determined by HPLC-ED (Figs. 5B-E). After exposition to all Pt derivatives the decrease of GSH/GSSG ratio was observed, which indicates the increasing amount of oxidative stress in the erythrocytes (Figs. 5B-E). It clearly follows from the results shown in Fig. 5F that LipoCisPt and CisPt caused higher oxidative stress than LipoPtNPs and PtNPs.
92
Figure 5. Selected haematological parameters of erythrocytes mixture with platelets and oxidative stress (GSH/GSSG) in the mixture after application of Pt derivatives encapsulated in liposomes or alone in concentrations 0, 12.5, 25, 50, 100 and 200 µg.mL-1 of Pt and 0, 0.6, 1.3, 2.5, 5 and 10 mg.mL-1 of liposomes. (A) Histograms of (a) erythrocytes and (b) platelets, and (c) visualisations of liposomes in the Baso channel after application of LipoCisPt, CisPt, LipoPtNPs and PtNPs. GSH/GSSG ratio of erythrocytes mixture with platelets in the same concentrations as in A - (B) LipoCisPt, (C) CisPt, (D) LipoPtNPs, and (E) PtNPs. (F) Mean of GSH/GSSG ratio.
93
4. DISCUSSION Here, the effect of PtNPs, or CisPt alone and encapsulated in liposomes (LipoPtNPs or LipoCisPt) on bacterial cultures (Staphylococcus aureus, Salmonella thyphimurium), human foreskin fibroblasts (HFF), erythrocytes and DNA (PCR product of Xis gene of λ phage) were studied. Platinum complexes are the active substance used as the effective cytostatics [8]. Hundreds of Pt(II) and Pt(IV) complexes have been synthesized since the discovery of platinum antibacterial effects in 1956 [209-211]. The effect of platinum complexes (cisplatin, carboplatin and oxaliplatin) is most probably based on their covalent binding into DNA bases [10, 212] forming intra- and interstrand crosslinks, DNA–protein crosslinks, and monoadducts with DNA [6]. An affecting of DNA secondary structure leads to block transcription, and replication with subsequent apoptosis [213]. Pt drugs enter to the cells mainly via passive diffusion, but some evidence of its active transport by Ctr1 system involved in the maintaining of copper homeostasis was reported [214-217]. Another possibility is the intake of the nanoparticles via endocytosis [218], which is also shown in Fig. 6A. Cisplatin-induced DNA damage activates ATR kinase, which triggers the effector molecules. One of ATR kinase targets is tumour suppressor protein p53, which is phosphorylated by ATR kinase on serine 15. This phosphorylation causes the decrease of p53 affinity to its negative regulator Mdm-2, which leads to an increase p53 concentration. Protein p53 then initiates the transcription of p21 gene, which inhibits the cyclin-dependent kinases Cdk2 and Cdk4 and consequent arrests the cell cycle. Protein p53 also induces the expression of pro-apoptotic members of Bcl-2 family such as Bax, Puma and Noxa responding for the activation of mitochondrial apoptotic pathway.
Figure 6. (A) Effect of CisPt on the somatic cell. (B) Proposed effect of PtNPs on the somatic cell.
94
On the mitochondrial surface these pro-apoptotic proteins meet the anti-apoptotic Bcl-2 family members. The main determinant of cisplatin-induced DNA damage is the ratio of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins. Majority of pro-apoptotic signals leads to the release of cytochrome c from mitochondria followed by the activation of cysteine caspases selectively degrading the target proteins. Initiator caspases (Casp-8, 9 and 10) activate the effector caspases (Casp-3, 6 and 7). Casp 8 is activated by outer pathway through the death receptors and Casp-9 by inner mitochondrial pathway. Both Casp-8 and 9 then activate Casp-3 responsible for intrinsic apoptotic process [130, 218, 219]. Compared to thousands of papers aimed at the mentioned platinum-based cytostatics, only few papers have been published on physiological action of platinum nanoparticles [24, 220]. Some papers inform about the antioxidant properties of PtNPs. Kajita et al. reported that PtNPs eliminated the anion radicals and hydrogen peroxide by a mechanism similar to superoxide-dismutase and catalase action [184]. Antioxidant function of PtNPs was also confirmed by Kim et al. [221], who reduced the oxidative stress in murine osteoclasts and by Onizawa et al. [189], who studied the antioxidant activity of PtNPs in murine lungs after exposition to cigarette smoke. Synthetic PtNPs at ppb levels significantly extended the nematode lifespan and scavenged reactive oxygen species (ROS) induced by paraquat treatment in the nematode [222]. The anti-inflammatory effects of platinum nanoparticles on the lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 macrophages were determined [223]. In papers by Oh et al., PtNPs in diameter of 4.8 nm were synthesized [194], and they were characterized by X-ray and UV/Vis spectrophotometry [224]. In this work it was confirmed by PCR, DNA sequencing and denaturation that the PtNPs inhibit the Taq DNA polymerase and secondary affect DNA structure in higher concentrations. Further papers on the interaction of DNA polymerase and thus inhibition of PCR by heavy metals (Cu, Pb, and Cd) were previously published [225, 226]. Our findings are consistent with earlier reports emphasizing intracellular release of Pt2+ ions from PtNPs, which could block cell division by binding to DNA [227]. Intracellular interactions of PtNPs with bacterial DNA (Salmonella Enteritidis) were also previously visualized [193] and it was shown using DNA-binding fluorochrome that one hour treatment of Salmonella enteritidis with PtNPs removed part of the DNA from the bacterial cell [193]. As it shown by Shukla et al., the nanoparticles tend to aggregate in the liposomes [228]. The aggregation of PtNPs in liposomes structure may be responsible for the observed PtNPs cytotoxicity caused by oxidation of Pt by hydrogen peroxide according equation Pt + H2O2 + 2H+
Pt2+ + 2H2O,
E = 0.592V [228]. The different mechanisms of CisPt and PtNPs action were found by 95
single cell gel electrophoresis (comet assay) in this study (Fig. 6B). This method allows us to detect DNA damage on the single cell level [229]. The different mode of HFF nuclei degradation was observed after exposition to CisPt or PtNPs, whereas PtNPs caused higher degree of DNA degradation compared to CisPt. This finding may be caused by the fact that the alkaline comet assay is more sensitive to dsDNA breakage than to ssDNA breakage. At CisPt, ssDNA breakage [230], and covalent binding to DNA and interstrand crosslink [10] were observed as a result of direct interaction with DNA. dsDNA breakage are caused rather PtNPs induced Pt2+ ions forming during the incubation of PtNPs with DNA [97]. Interactions of Pt-derivatives with DNA may cause the arrest of cell cycle or have mutagenic effect, which was confirmed by Ames test both for CisPt and PtNPs [231]. The results suggest p53 activation in PtNPs treated cells due to genotoxic stress with subsequent activation of p21 leading to a proliferating cell nuclear antigen-mediated growth arrest and apoptosis [191]. An attention is also paid to study the antibacterial effects of nanomaterials [232], and PtNPs seem to be a perspective antibacterial agent [192, 233]. According to Chwalibog et al. PtNPs caused the degradation of cytoplasmic membrane and bacterial cell wall [192]. Our results indicate that the encapsulation of nanoparticles into liposomes may lead to the more effective delivery of the nanoparticles as well as disruption of the cellular membranes and thus to the increasing of their cytotoxicity and antibacterial action [234, 235]. In this work the inhibition of bacterial and HFF growth by PtNPs and CisPt alone and encapsulated in liposome was compared by method of growth curves and it was found that LipoPtNPs inhibition effect on S. aureus cells is higher compared to bare drug PtNPs. The inhibition of both keratinocytes and bacterial growth by PtNPs was found also in work [218], where the authors found increased DNA damage and caspase 9 activity in human keratinocytes and a size-dependent inhibition effect of PtNPs on S. aureus and E. coli using a colony-reduction assay. No differences between PtNPs and CisPt action on human erythrocytes was found by haematological analyser. Both bare and encapsulated PtNPs caused lower oxidative stress in the erythrocytes compared to bare and encapsulated CisPt as measured by GSH/GSSG ratio.
96
5. CONCLUSIONS In this paper we showed that PtNPs primarily inhibit the activity of Taq DNA polymerase and secondary damages DNA structure. We tend to believe that this effect together with the transition of PtNPs to Pt2+ causes mutagenicity and increased DNA damage of PtNPs in comparison to CisPt. The cytotoxic effect of PtNPs may be increased by the encapsulation of PtNPs into the liposome. The results suggest p53 activation in PtNPs treated cells due to genotoxic stress with subsequent activation of p21 leading to a proliferating cell nuclear antigen-mediated growth arrest in S phase and following apoptosis [236]. It is conceivable that PtNPs with effective antitumor activity may provide an alternate treatment for cancer.
Acknowledgements Financial support from CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068 is highly acknowledged. The authors wish to express their thanks to Martina Stankova, Lucie Dostalova and Radek Chmela for perfect technical assistance.
Conflict of interest The authors declare not conflict of interest.
97
6 ZÁVĚR Deoxyribonukleová kyselina patří mezi nejdůleţitější a nejvíce studované biomolekuly. Genetická informace, která je v ní zapsána prostřednictvím jednotlivých bází, ovlivňuje projevy ţivota na všech jeho úrovních. Správný dvoušroubovicový model poprvé představili v roce 1953 v časopise Nature James D. Watson a Francis Crick. Od této doby byly popsány desítky různých zajímavých struktur (konformací), kterých můţe tato molekula nabývat. Platinové léčiva patří mezi nejúčinnější a nejpouţívanější cytostatika. Typickou vlastností těchto léčiv je schopnost vytvořit s DNA kovalentní vazbu (různé typy aduktů), coţ způsobí blokaci důleţitých buněčných procesů a iniciuje apoptózu. Základ teoretické části této dizertační práce tvoří přehled (review), týkající se mechanizmů příjmu a interakcí platinových cytostatik s eukaryotickou buňkou. Přínosem tohoto přehledu je lepší pochopení dějů odehrávajících se v eukaryotické buňce, která byla ovlivněna platinovým agens. V této práci bylo také prokázáno, ţe ionty kovů a nanočástice významně ovlivňují sekundární strukturu DNA. Schopnost monitorovat tyto struktury, detailně je popsat, a vysvětlit jejich vznik a význam poskytuje nové moţnosti pro lepší pochopení biologických dějů. Schopnost extrémofilních bakterií začlenit arsen do svých biomolekul (DNA a proteiny) je několik let vědeckou obcí diskutována. Tento předpoklad, který nebyl doposud spolehlivě potvrzen ani vyvrácen poskytuje nový pohled na rozmanitost ţivota na naší planetě. V této práci se podařilo prokázat, ţe arsen dokáţe s DNA vytvořit stabilní strukturu. Schopnost iontů kovu nebo nanočástic poškodit DNA hraje důleţitou roli v procesu řízené buněčné smrti. U platinových nanočástic (PtNPs) bylo zjištěno, ţe dokáţí efektivněji poškodit DNA v porovnání s cisplatinou a také vykazují afinitu k DNA polymeráze. Této schopnosti PtNPs můţe být vyuţito pro konstrukci nové generace cytostatických léčiv. V budoucnu se předpokládá ověření účinků PtNPs v in vivo experimentech na modelových organizmech. Dále budou syntetizovány a charakterizovány nové arsenové komplexy s cílem najít měně toxickou a účinnější formu arsenu (uzavřenou v nanotransportéru).
98
7 LITERATURA 1.
2.
3. 4.
5.
6. 7. 8. 9.
10. 11.
12. 13. 14.
15.
16. 17.
18.
19.
Sikorova, L., R. Licbinsky, and V. Adamec, Platinum Group Elements from Automobile Catalysts in the Environment. Chemicke Listy, 2011. 105(5): p. 361366. Merget, R. and G. Rosner, Evaluation of the health risk of platinum group metals emitted from automotive catalytic converters. Science of the Total Environment, 2001. 270(1-3): p. 165-173. Cristaudo, A., et al., Occupational hypersensitivity to metal salts, including platinum, in the secondary industry. Allergy, 2005. 60(2): p. 159-164. Theile, D., et al., Cellular Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Relationship of Platinum Cytostatics in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Evaluated by Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2012. 341(1): p. 51-58. Fuertes, M.A., C. Alonso, and J.M. Perez, Biochemical modulation of cisplatin mechanisms of action: Enhancement of antitumor activity and circumvention of drug resistance. Chem. Rev., 2003. 103(3): p. 645-662. Boulikas, T. and M. Vougiouka, Cisplatin and platinum drugs at the molecular level (review). Oncol. Rep., 2003. 10(6): p. 1663-1682. Siddik, Z.H., Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene, 2003. 22(47): p. 7265-7279. Wang, D. and S.J. Lippard, Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery, 2005. 4(4): p. 307-320. Rosenberg, B., L. Van Camp, and T. Krigas, Inhibition of cell division in Escherichia coli by electrolysis products from a platinum electrode. Nature, 1965. 205: p. 698-699. Chang, C.L., et al., Thermal stability of DNA with interstrand crosslinks. Biopolymers, 2012. 97(10): p. 807-817. Brabec, V. and J. Kasparkova, Modifications of DNA by platinum complexes Relation to resistance of tumors to platinum antitumor drugs. Drug Resistance Updates, 2005. 8(3): p. 131-146. Garcia, J.S., C.S. de Magalhaes, and M.A.Z. Arruda, Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta, 2006. 69(1): p. 1-15. Goyer, R.A., Toxic and essential metal interactions. Annual Review of Nutrition, 1997. 17: p. 37-50. Molkentin, J.D., The zinc finger-containing transcription factors GATA-4,-5, and-6 - Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. Journal of Biological Chemistry, 2000. 275(50): p. 38949-38952. Blain, I., et al., Aminoindanes in oxygen transfer reactions, 2 - Copper complexes as functional models for dopamine beta-hydroxylase stereospecific oxygen atom transfer. European Journal of Inorganic Chemistry, 1998(9): p. 1297-1304. Blincoe, C., Simulation of copper-metabolism by mammals. Computers in Biology and Medicine, 1992. 22(1-2): p. 113-122. Gladyshev, V.N., K.T. Jeang, and T.C. Stadtman, Selenocysteine, identified as the penultimate C-terminal residue in human T-cell thioredoxin reductase, corresponds to TGA in the human placental gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996. 93(12): p. 6146-6151. Deichmann, W.B. and E.G. Mergard, Comparative evaluation of methods employed to express the degree of toxicity of a compound. Journal of Industrial Hygiene and Toxicology, 1948. 30(6): p. 373-378. Baron, P. and F. Schweinsberg, A literature-review on concentrations of arsenic, cadmium, lead and mercury in human-body fluids and tissues to localize normal 99
20.
21.
22.
23.
24.
25. 26. 27. 28.
29.
30. 31.
32.
33.
34.
35. 36. 37.
levels and to detect expositions .1. description of analytical procedures, arsenic. Zentralblatt Fur Bakteriologie Mikrobiologie Und Hygiene Serie B-Umwelthygiene Krankenhaushygiene Arbeitshygiene Praventive Medizin, 1988. 186(4): p. 289310. Yang, H., S. Lin, and J.R. Cui, Identifying arsenic trioxide (ATO) functions in leukemia cells by using time series gene expression profiles. Gene, 2014. 535(2): p. 312-317. Yujiri, T., et al., Reactivation of hepatitis B virus in a hepatitis B surface antigennegative patient with acute promyelocytic leukemia treated with arsenic trioxide. Annals of Hematology, 2014. 93(2): p. 351-352. Kim, W.K., et al., Platinum nanoparticles reduce ovariectomy-induced bone loss by decreasing osteoclastogenesis. Experimental and Molecular Medicine, 2012. 44(7): p. 432-439. Porcel, E., et al., Nano-Sensitization under gamma rays and fast ion radiation. 1st Nano-Ibct Conference 2011 - Radiation Damage of Biomolecular Systems: Nanoscale Insights into Ion Beam Cancer Therapy, 2012. 373. Manikandan, M., N. Hasan, and H.F. Wu, Platinum nanoparticles for the photothermal treatment of Neuro 2A cancer cells. Biomaterials, 2013. 34(23): p. 5833-5842. Watson, J.D. and F.H.C. Crick, Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature, 1953. 171(4361): p. 964-967. Garcia-Ramos, J.C., et al., Metal-Based Drug-DNA Interactions. Journal of the Mexican Chemical Society, 2013. 57(3): p. 245-259. Dickerson, R.E., et al., The anatomy of A-DNA, B-DNA, and Z-DNA. Science, 1982. 216(4545): p. 475-485. Shamsi, M. and H.B. Kraatz, Interactions of Metal Ions with DNA and Some Applications. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials, 2013. 23(1): p. 4-23. Maher, L.J., P.B. Dervan, and B. Wold, Analysis of promoter-specific repression by triple-helical dna complexes in a eukaryotic cell-free transcription system. Biochemistry, 1992. 31(1): p. 70-81. Guo, Q., et al., Asymmetric structure of a 3-arm DNA junction. Biochemistry, 1990. 29(49): p. 10927-10934. Premilat, S. and G. Albiser, A new D-DNA form of poly(dA-dT)poly(dA-dT): an ADNA type structure with reversed Hoogsteen pairing. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 2001. 30(6): p. 404-410. van Dam, L. and M.H. Levitt, BII nucleotides in the B and C forms of naturalsequence polymeric DNA: A new model for the C form of DNA. Journal of Molecular Biology, 2000. 304(4): p. 541-560. Lee, J.S., L.J.P. Latimer, and R.S. Reid, A cooperative conformational change in duplex dna induced by Zn2+ and other divalent metal-ions. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire, 1993. 71(3-4): p. 162-168. Aich, P., et al., M-DNA: A complex between divalent metal ions and DNA which behaves as a molecular wire. Journal of Molecular Biology, 1999. 294(2): p. 477485. Wettig, S.D., et al., M-DNA: a self-assembling molecular wire for nanoelectronics and biosensing. Analytical Sciences, 2003. 19(1): p. 23-26. Burge, S., et al., Quadruplex DNA: sequence, topology and structure. Nucleic Acids Research, 2006. 34(19): p. 5402-5415. Wu, Y.L. and R.M. Brosh, G-quadruplex nucleic acids and human disease. Febs Journal, 2010. 277(17): p. 3470-3488. 100
38.
39.
40. 41. 42. 43. 44. 45. 46.
47.
48. 49.
50. 51. 52. 53. 54. 55. 56.
57.
58.
Abrescia, N.G.A., et al., Crystal structure of an antiparallel DNA fragment with Hoogsteen base pairing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. 99(5): p. 2806-2811. Zhang, J., et al., A novel Tb3+-promoted G-quadruplex-hemin DNAzyme for the development of label-free visual biosensors. Biosensors & Bioelectronics, 2011. 26(10): p. 4053-4057. Rothemund, P.W.K., Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature, 2006. 440(7082): p. 297-302. Chichak, K.S., et al., Molecular Borromean rings. Science, 2004. 304(5675): p. 1308-1312. Duckett, D.R., et al., The structure of the holliday junction, and its resolution. Cell, 1988. 55(1): p. 79-89. Vuong, S., et al., Identifying three-way DNA junction-specific small-molecules. Biochimie, 2012. 94(2): p. 442-450. Seeman, N.C., DNA nanotechnology: Novel DNA constructions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 1998. 27: p. 225-248. Goldman, N., et al., Towards practical, high-capacity, low-maintenance information storage in synthesized DNA. Nature, 2013. 494(7435): p. 77-80. Spirin, A.S., L.P. Gavrilova, and A.N. Belozerskii, On the nature and the methods of quantitative evaluation of the hyperchromic effect of nucleic acids. Biochemistry-Moscow, 1959. 24(4): p. 556-565. Felsenfeld, G. and G. Sandeen, Dispersion of hyperchromic effect in thermally induced transitions of nucleic acids. Journal of Molecular Biology, 1962. 5(6): p. 587-&. Kypr, J., et al., Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research, 2009. 37(6): p. 1713-1725. Macaya, R., et al., Proton nuclear-magnetic-resonance assignments and structural characterization of an intramolecular dna triplex. Journal of Molecular Biology, 1992. 225(3): p. 755-773. Franklin, R.E. and R.G. Gosling, Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature, 1953. 171(4356): p. 740-741. Barhoumi, A., et al., Surface-enhanced Raman spectroscopy of DNA. Journal of the American Chemical Society, 2008. 130(16): p. 5523-5529. Pilet, J. and J. Brahms, Investigation of DNA structural changes by infrared spectroscopy. Biopolymers, 1973. 12(2): p. 387-403. Palecek, E., Oscillographic polarography of highly polymerized deoxyribonucleic acid. Nature, 1960. 188(4751): p. 656-657. Fojta, M., Electrochemical sensors for DNA interactions and damage. Electroanalysis, 2002. 14(21): p. 1449-1463. Cummings, J.E. and J.P. Kovacic, The ubiquitous role of zinc in health and disease. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 2009. 19(3): p. 215-240. Zhou, H., Y. Zhang, and D.R. Zhu, DFT studies on some properties of maleonitriledithiolate complexes M(mnt)(2) (2-) (M = Ni, Pd, Pt and Zn, Cd, Hg). Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2012. 86: p. 20-26. Gaither, L.A. and D.J. Eide, The human ZIP1 transporter mediates zinc uptake in human K562 erythroleukemia cells. Journal of Biological Chemistry, 2001. 276(25): p. 22258-22264. Sharif, R., et al., The role of zinc in genomic stability. Mutation ResearchFundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2012. 733(1-2): p. 111121. 101
59. 60. 61. 62.
63. 64. 65. 66.
67.
68. 69.
70. 71.
72.
73. 74.
75.
76.
77. 78.
Takeda, A., Movement of zinc and its functional significance in the brain. Brain Research Reviews, 2000. 34(3): p. 137-148. Coleman, J.E., Zinc proteins - enzymes, storage proteins, transcription factors, and replication proteins. Annual Review of Biochemistry, 1992. 61: p. 897-946. Leclerc, F. and M. Karplus, Two-metal-ion mechanism for hammerhead-ribozyme catalysis. Journal of Physical Chemistry B, 2006. 110(7): p. 3395-3409. Tam, H.H., D. Asthagiri, and M.E. Paulaitis, Coordination state probabilities and the solvation free energy of Zn2+ in aqueous methanol solutions. Journal of Chemical Physics, 2012. 137(16). Vasak, M. and D.W. Hasler, Metallothioneins: new functional and structural insights. Current Opinion in Chemical Biology, 2000. 4(2): p. 177-183. Calesnick, B. and A.M. Dinan, Zinc-deficiency and zinc toxicity American Family Physician, 1988. 37(4): p. 267-270. Prasad, A.S., Zinc: role in immunity, oxidative stress and chronic inflammation. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2009. 12(6): p. 646-652. Heuchel, R., et al., He transcription factor mtf-1 is essential for basal and heavy metal-induced metallothionein gene-expression. Embo Journal, 1994. 13(12): p. 2870-2875. Yan, M., K. Hardin, and E. Ho, Differential response to zinc-induced apoptosis in benign prostate hyperplasia and prostate cancer cells. Journal of Nutritional Biochemistry, 2010. 21(8): p. 687-694. Feng, P., et al., The involvement of bax in zinc-induced mitochondrial apoptogenesis in malignant prostate cells. Molecular Cancer, 2008. 7. Tapiero, H. and K.D. Tew, Trace elements in human physiology and pathology: zinc and metallothioneins. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2003. 57(9): p. 399411. Falchuk, K.H., The molecular basis for the role of zinc in developmental biology. Molecular and Cellular Biochemistry, 1998. 188(1-2): p. 41-48. Klug, A., The discovery of zinc fingers and their development for practical applications in gene regulation and genome manipulation. Quarterly Reviews of Biophysics, 2010. 43(1): p. 1-21. Buck-Koehntop, B.A., et al., Molecular basis for recognition of methylated and specific DNA sequences by the zinc finger protein Kaiso. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012. 109(38): p. 15229-15234. Wu, S.P., et al., Antioxidant and antimicrobial activity of xylan-chitooligomer-zinc complex. Food Chemistry, 2013. 138(2-3): p. 1312-1319. Zalewski, P.D., et al., Video image-analysis of labile zinc in viable pancreatic-islet cells using a specific fluorescent-probe for zinc. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 1994. 42(7): p. 877-884. Fujimoto, S., H. Yasui, and Y. Yoshikawa, Development of a novel antidiabetic zinc complex with an organoselenium ligand at the lowest dosage in KK-A(y) mice. Journal of Inorganic Biochemistry, 2013. 121: p. 10-15. Tabassum, S., et al., Synthesis and characterization of copper(II) and zinc(II)based potential chemotherapeutic compounds: Their biological evaluation viz. DNA binding profile, cleavage and antimicrobial activity. European Journal of Medicinal Chemistry, 2012. 58: p. 308-316. Bujacz, A., et al., X-ray structure of a novel histidine-copper(II) complex. Russian Journal of Coordination Chemistry, 2010. 36(6): p. 430-435. Scarpa, M., et al., Ascorbate oxidation catalyzed by bis(histidine)copper(II). Inorganic Chemistry, 1996. 35(18): p. 5201-5206. 102
79.
80.
81.
82.
83.
84. 85. 86. 87.
88.
89.
90. 91.
92. 93. 94. 95. 96. 97.
Masuda, H., A. Odani, and O. Yamauchi, Structure of an L-tyrosyl-L-histidinecopper complex involving an axial copper(II)-phenol OH bonding - implication for substrate binding at the active-site of tyrosinase Inorganic Chemistry, 1989. 28(4): p. 624-625. Plum, L.M., L. Rink, and H. Haase, The Essential Toxin: Impact of Zinc on Human Health. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2010. 7(4): p. 1342-1365. Yang, Y., et al., High Dose Zinc Supplementation Induces Hippocampal Zinc Deficiency and Memory Impairment with Inhibition of BDNF Signaling. Plos One, 2013. 8(1). Ding, W., L.G. Hudson, and K.J. Liu, Inorganic arsenic compounds cause oxidative damage to DNA and protein by inducing ROS and RNS generation in human keratinocytes. Molecular and Cellular Biochemistry, 2005. 279(1-2): p. 105112. Yu, C.H., et al., Inductively coupled plasma mass spectrometry study of the retention behavior of arsenic species on various solid phase extraction cartridges and its application in arsenic speciation. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 2003. 58(7): p. 1335-1349. Shen, S., et al., Arsenic binding to proteins. Chemical Reviews, 2013. 113(10): p. 7769-7792. Hughes, M.F., et al., Arsenic Exposure and Toxicology: A Historical Perspective. Toxicological Sciences, 2011. 123(2): p. 305-332. Vahter, M., Mechanisms of arsenic biotransformation. Toxicology, 2002. 181: p. 211-217. Bobe, P. and M.K. Chelbi-Alix, New therapeutic perspectives for Arsenic: from acute promyelocytic leukemia to autoimmune diseases. M S-Medecine Sciences, 2008. 24(11): p. 967-971. Izdebska, M., et al., Selected mechanisms of the therapeutic effect of arsenic trioxide in cancer treatment. Postepy Higieny I Medycyny Doswiadczalnej, 2008. 62: p. 463-467. Kumar, P., et al., Arsenic trioxide enhances the therapeutic efficacy of radiation treatment of oral squamous carcinoma while protecting bone. Molecular Cancer Therapeutics, 2008. 7(7): p. 2060-2069. Thomas, X. and J. Troncy, Arsenic: a beneficial therapeutic poison - a historical overview. Adler Museum bulletin, 2009. 35(1): p. 3-13. Zhang, N., et al., Arsenic trioxide and cisplatin synergism increase cytotoxicity in human ovarian cancer cells: Therapeutic potential for ovarian cancer. Cancer Science, 2009. 100(12): p. 2459-2464. Swindell, E.P., et al., Anticancer Activity of Small-Molecule and Nanoparticulate Arsenic(III) Complexes. Inorganic Chemistry, 2013. 52(21): p. 12292-12304. Mukhopadhyay, R., et al., Microbial arsenic: from geocycles to genes and enzymes. Fems Microbiology Reviews, 2002. 26(3): p. 311-325. Khan, M.A.M., et al., Structural and spectroscopic studies of thin film of silver nanoparticles. Applied Surface Science, 2011. 257(24): p. 10607-10612. Banfi, G., V. Degiorgio, and D. Ricard, Nonlinear optical properties of semiconductor nanocrystals. Advances in Physics, 1998. 47(3): p. 447-510. Banyai, L., et al., 2-photon optical nonlinearities in semiconductor quantum dots. J. De Phys., 1988. 49(C-2): p. 225-228. Gehrke, H., et al., Platinum nanoparticles and their cellular uptake and DNA platination at non-cytotoxic concentrations. Arch. Toxicol., 2011. 85(7): p. 799812. 103
98.
99.
100.
101.
102.
103. 104.
105. 106. 107. 108. 109.
110.
111. 112.
113. 114.
115. 116.
Kanmani, P. and J.W. Rhim, Physicochemical properties of gelatin/silver nanoparticle antimicrobial composite films. Food Chemistry, 2014. 148: p. 162169. Liu, S., et al., Antibacterial and anti-adhesion effects of the silver nanoparticlesloaded poly(L-lactide) fibrous membrane. Materials Science & Engineering CMaterials for Biological Applications, 2013. 33(3): p. 1176-1182. Wang, Q. and T.J. Webster, Nanostructured selenium for preventing biofilm formation on polycarbonate medical devices. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2012. 100A(12): p. 3205-3210. Porcel, E., et al., Nano-Sensitization under gamma rays and fast ion radiation, in 1st Nano-Ibct Conference 2011 - Radiation Damage of Biomolecular Systems: Nanoscale Insights into Ion Beam Cancer Therapy, B.A. Huber, et al., Editors. 2012, Iop Publishing Ltd: Bristol. Limbach, L.K., et al., Exposure of engineered nanoparticles to human lung epithelial cells: Influence of chemical composition and catalytic activity on oxidative stress. Environmental Science & Technology, 2007. 41(11): p. 41584163. Bruchez, M., et al., Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science, 1998. 281(5385): p. 2013-2016. Samanta, A., Z.T. Deng, and Y. Liu, Aqueous Synthesis of Glutathione-Capped CdTe/CdS/ZnS and CdTe/CdSe/ZnS Core/Shell/Shell Nanocrystal Heterostructures. Langmuir, 2012. 28(21): p. 8205-8215. Chan, W.C.W., et al., Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Current Opinion in Biotechnology, 2002. 13(1): p. 40-46. Reimann, S.M. and M. Manninen, Electronic structure of quantum dots. Reviews of Modern Physics, 2002. 74(4): p. 1283-1342. Hlaváček, A. and P. Skládal, The application of quantum dots in bioanalytical chemistry. Chemicke Listy, 2011. 105(8): p. 611-615. Yang, S.T., et al., Carbon Dots as Nontoxic and High-Performance Fluorescence Imaging Agents. Journal of Physical Chemistry C, 2009. 113(42): p. 18110-18114. Dong, Y.Q., et al., Polyamine-Functionalized Carbon Quantum Dots as Fluorescent Probes for Selective and Sensitive Detection of Copper Ions. Analytical Chemistry, 2012. 84(14): p. 6220-6224. Li, L.B., et al., Synthesis of nitrogen-doped and amino acid-functionalized graphene quantum dots from glycine, and their application to the fluorometric determination of ferric ion. Microchimica Acta, 2015. 182(3-4): p. 763-770. Hao, Y.L., et al., Emission from Trions in Carbon Quantum Dots. Journal of Physical Chemistry C, 2015. 119(6): p. 2956-2962. Shan, X.Y., et al., B-doped carbon quantum dots as a sensitive fluorescence probe for hydrogen peroxide and glucose detection. Analyst, 2014. 139(10): p. 23222325. Qian, Z.S., et al., DNA nanosensor based on biocompatible graphene quantum dots and carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics, 2014. 60: p. 64-70. Cywinski, P.J., A.J. Moro, and H.G. Lohmannsroben, Cyclic GMP recognition using ratiometric QD-fluorophore conjugate nanosensors. Biosensors & Bioelectronics, 2014. 52: p. 288-292. Skalickova, S., et al., Study of interaction between metallothionein and CdTe quantum dots. Chromatographia, 2013. 76(7-8): p. 345-353. Jie, G.F., et al., A novel quantum dot nanocluster as versatile probe for electrochemiluminescence and electrochemical assays of DNA and cancer cells. Biosensors & Bioelectronics, 2014. 52: p. 69-75. 104
117. 118.
119.
120.
121. 122.
123.
124. 125.
126.
127.
128. 129.
130. 131. 132. 133.
134.
Okubo, K., et al., On-chip processing of droplets for surface plasmon resonance analysis. Sensors and Actuators B-Chemical, 2014. 190: p. 975-981. Sawosz, E., et al., Visualization of gold and platinum nanoparticles interacting with Salmonella Enteritidis and Listeria monocytogenes. International Journal of Nanomedicine, 2010. 5: p. 631-637. Wang, Q.S., et al., Interactions between CdSe/CdS quantum dots and DNA through spectroscopic and electrochemical methods. Applied Surface Science, 2011. 257(23): p. 9747-9751. Mahtab, R., et al., Influence of the nature of quantum dot surface cations on interactions with DNA. Journal of Inorganic Biochemistry, 2007. 101(4): p. 559564. Sun, D. and O. Gang, DNA-Functionalized Quantum Dots: Fabrication, Structural, and Physicochemical Properties. Langmuir, 2013. 29(23): p. 7038-7046. Fuertes, M.A., C. Alonso, and J.M. Perez, Biochemical modulation of cisplatin mechanisms of action: Enhancement of antitumor activity and circumvention of drug resistance. Chemical Reviews, 2003. 103(3): p. 645-662. Mitchell, C., et al., Low-dose BBR3610 toxicity in colon cancer cells is p53independent and enhanced by inhibition of epidermal growth factor receptor (ERBB1)-Phosphatidyl inositol 3 kinase signaling. Molecular Pharmacology, 2007. 72(3): p. 704-714. Summa, N., et al., Possible biotransformation reactions of polynuclear Pt(II) complexes. Inorganic Chemistry, 2007. 46(6): p. 2094-2104. Oehlsen, M.E., et al., Effects of geometric isomerism in dinuclear antitumor platinum complexes on their interactions with N-acetyl-L-methionine. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2005. 10(5): p. 433-442. Williams, J.W., et al., Dinuclear platinum complexes with biological relevance based on the 1,2-diaminocyclohexane carrier ligand. Inorganic Chemistry, 2007. 46(15): p. 5820-5822. Pierceall, W.E., et al., Cisplatin benefit is predicted by immunohistochemical analysis of DNA repair proteins in squamous cell carcinoma but not adenocarcinoma: theranostic modeling by NSCLC constituent histological subclasses. Annals of Oncology, 2012. 23(9): p. 2245-2252. Malina, J., et al., Walking of antitumor bifunctional trinuclear Pt-II complex on double-helical DNA. Nucleic Acids Research, 2011. 39(2): p. 720-728. Brabec, V., et al., Structure and processing of major DNA intrastrand cross-link of antitumor oxaliplatin. The effect of sequence context and comparisons with cisplatin, in Metal Ions in Biology and Medicine, Vol 10, P. Collery, et al., Editors. 2008, John Libbey Eurotext: Montrouge. p. 68-74. Vavrova, M., Vokurkova, Two main routes induction of apoptosis in mammalian cells. Radiation oncology, 2003(cxc): p. 1-9. Jia, J., et al., Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives (vol 8, pg 111, 2009). Nature Reviews Drug Discovery, 2009. 8(6). Konieczny, P., et al., Effects triggered by platinum nanoparticles on primary keratinocytes. International Journal of Nanomedicine, 2013. 8: p. 3963-3975. Garcia-Berrocal, J.R., et al., The anticancer drug cisplatin induces an intrinsic apoptotic pathway inside the inner ear. British Journal of Pharmacology, 2007. 152(7): p. 1012-1020. Hegde, P.S., N.S. Rajasekaran, and T.S. Chandra, Effects of the antioxidant properties of millet species on oxidative stress and glycemic status in alloxaninduced rats. Nutrition Research, 2005. 25(12): p. 1109-1120.
105
135.
136.
137.
138.
139. 140.
141.
142.
143. 144.
145. 146. 147. 148. 149.
150.
151.
152.
Papaharalambus, C.A. and K.K. Griendling, Basic Mechanisms of Oxidative Stress and Reactive Oxygen Species in Cardiovascular Injury. Trends in Cardiovascular Medicine, 2007. 17(2): p. 48-54. Bouayed, J., L. Hoffmann, and T. Bohn, Total phenolics, flavonoids, anthocyanins and antioxidant activity following simulated gastro-intestinal digestion and dialysis of apple varieties: Bioaccessibility and potential uptake. Food Chemistry, 2011. 128(1): p. 14-21. Kaviarasan, S., et al., In vitro studies on antiradical and antioxidant activities of fenugreek (Trigonella foenum graecum) seeds. Food Chemistry, 2007. 103(1): p. 31-37. Kuo, W.-W., et al., Crude extracts of Solanum lyratum protect endothelial cells against oxidized low-density lipoprotein-induced injury by direct antioxidant action. Journal of Vascular Surgery, 2009. 50(4): p. 849-860. Uysal, M., et al., Ethanol-induced changes in lipid peroxidation and glutathione content in rat brain. Drug and Alcohol Dependence, 1989. 23(3): p. 227-230. Re, R., et al., Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 1999. 26(9–10): p. 12311237. Esmaeili, M.A. and A. Sonboli, Antioxidant, free radical scavenging activities of Salvia brachyantha and its protective effect against oxidative cardiac cell injury. Food and Chemical Toxicology, 2010. 48(3): p. 846-853. Reckziegel, P., et al., Oxidative stress and anxiety-like symptoms related to withdrawal of passive cigarette smoke in mice: Beneficial effects of pecan nut shells extract, a by-product of the nut industry. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2011. 74(6): p. 1770-1778. Singh, N.P., et al., A simple technique for quantitation of low-levels of DNA damage in individual cells Exp. Cell Res., 1988. 175(1): p. 184-191. Mouron, S.A., C.D. Golijow, and F.N. Dulout, DNA damage by cadmium and arsenic salts assessed by the single cell gel electrophoresis assay. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 2001. 498(1-2): p. 47-55. Palchoudhury, S., et al., DNA Interaction of Pt-Attached Iron Oxide Nanoparticles. IEEE Trans. Magn., 2013. 49(1): p. 373-376. Farewell, V. and A. Johnson, The first British textbook of medical statistics. Journal of the Royal Society of Medicine, 2012. 105(10): p. 446-448. Wolfe-Simon, F., et al., A Bacterium That Can Grow by Using Arsenic Instead of Phosphorus. Science, 2011. 332(6034): p. 1163-1166. Mladek, A., et al., On the Geometry and Electronic Structure of the As-DNA Backbone. Journal of Physical Chemistry Letters, 2011. 2(5): p. 389-392. Denning, E.J. and A.D. MacKerell, Impact of Arsenic/Phosphorus Substitution on the Intrinsic Conformational Properties of the Phosphodiester Backbone of DNA Investigated Using ab Initio Quantum Mechanical Calculations. Journal of the American Chemical Society, 2011. 133(15): p. 5770-5772. Okamoto, A., K. Kanatani, and I. Saito, Pyrene-labeled base-discriminating fluorescent DNA probes for homogeneous SNP typing. Journal of the American Chemical Society, 2004. 126(15): p. 4820-4827. Bentivoglio, M., et al., Fluorescent retrograde neuronal labeling in rat by means of substances binding specifically to adenine-thymine rich DNA. Neuroscience Letters, 1979. 12(2-3): p. 235-240. Hong, Y.N., et al., Label-free fluorescent probing of G-quadruplex formation and real-time monitoring of DNA folding by a quaternized tetraphenylethene salt with aggregation-induced emission characteristics. Chemistry-a European Journal, 2008. 14(21): p. 6428-6437. 106
153.
154. 155. 156. 157. 158.
159. 160. 161. 162. 163. 164. 165.
166. 167. 168.
169.
170. 171.
172.
173.
174.
Randolph, J.B. and A.S. Waggoner, Stability, specificity and fluorescence brightness of multiply-labeled fluorescent DNA probes. Nucleic Acids Research, 1997. 25(14): p. 2923-2929. Medintz, I.L., et al., Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing. Nature Materials, 2005. 4(6): p. 435-446. Cepeda, V., et al., Biochemical Mechanisms of Cisplatin Cytotoxicity. Anti-Cancer Agents Med. Chem., 2007. 7(1): p. 3-18. Ali, I., et al., Platinum Compounds: A Hope for Future Cancer Chemotherapy. Anti-Cancer Agents Med. Chem., 2013. 13(2): p. 296-306. Zhang, C.X. and S.J. Lippard, New metal complexes as potential therapeutics. Current Opinion in Chemical Biology, 2003. 7(4): p. 481-489. Reedijk, J., New clues for platinum antitumor chemistry: Kinetically controlled metal binding to DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. 100(7): p. 3611-3616. Hambley, T.W., Platinum binding to DNA: structural controls and consequences. J. Chem. Soc.-Dalton Trans., 2001(19): p. 2711-2718. Guo, Z.J. and P.J. Sadler, Metals in medicine. Angew. Chem.-Int. Edit., 1999. 38(11): p. 1513-1531. Wong, E. and C.M. Giandomenico, Current status of platinum-based antitumor drugs. Chem. Rev., 1999. 99(9): p. 2451-2466. Wang, X.Y., Fresh Platinum Complexes with Promising Antitumor Activity. AntiCancer Agents Med. Chem., 2010. 10(5): p. 396-411. Zhang, J.C., et al., Status of Bi- and Multi-Nuclear Platinum Anticancer Drug Development. Anti-Cancer Agents Med. Chem., 2010. 10(4): p. 272-282. Olszewski, U. and G. Hamilton, A Better Platinum-Based Anticancer Drug Yet to Come? Anti-Cancer Agents Med. Chem., 2010. 10(4): p. 293-301. Edwards, K.A., O.R. Bolduc, and A.J. Baeumner, Miniaturized bioanalytical systems: enhanced performance through liposomes. Current Opinion in Chemical Biology, 2012. 16(3-4): p. 444-452. Livney, Y.D., Milk proteins as vehicles for bioactives. Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 2010. 15(1-2): p. 73-83. Sharma, A. and U.S. Sharma, Liposomes in drug delivery: progress and limitations. Int. J. Pharm., 1997. 154(2): p. 123-140. Dos Santos, N., et al., Substantial increases in idarubicin plasma concentration by liposome encapsulation mediates improved antitumor activity. J. Control. Release, 2005. 105(1-2): p. 89-105. Pantos, A., et al., Enhanced drug transport from unilamellar to multilamellar liposomes induced by molecular recognition of their lipid membranes. Langmuir, 2005. 21(15): p. 6696-6702. Boulikas, T., Low toxicity and anticancer activity of a novel liposomal cisplatin (Lipoplatin) in mouse xenografts. Oncol. Rep., 2004. 12(1): p. 3-12. Locascio, L.E., J.S. Hong, and M. Gaitan, Liposomes as signal amplification reagents for bioassays in microfluidic channels. Electrophoresis, 2002. 23(5): p. 799-804. Ho, J.A.A. and H.W. Hsu, Procedures for preparing Escherichia coli O157 : H7 immunoliposome and its application in liposome immunoassay. Anal. Chem., 2003. 75(16): p. 4330-4334. Pelka, J., et al., Cellular Uptake of Platinum Nanoparticles in Human Colon Carcinoma Cells and Their Impact on Cellular Redox Systems and DNA Integrity. Chem. Res. Toxicol., 2009. 22(4): p. 649-659. Nejdl, L., et al., Liposomal nanotransporter for targeted binding based on nucleic acid anchor system. Electrophoresis, 2014. 35(2-3): p. 393-404. 107
175. 176. 177.
178. 179. 180.
181.
182. 183.
184. 185. 186. 187.
188.
189.
190.
191. 192.
193.
194.
Stathopoulos, G.P., et al., Liposomal oxaliplatin in the treatment of advanced cancer: A phase I study. Anticancer Res., 2006. 26(2B): p. 1489-1493. Paraskar, A., et al., Rationally engineered polymeric cisplatin nanoparticles for improved antitumor efficacy. Nanotechnology, 2011. 22(26): p. 1-13. Paraskar, A.S., et al., Harnessing structure-activity relationship to engineer a cisplatin nanoparticle for enhanced antitumor efficacy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010. 107(28): p. 1243512440. Park, E.J., et al., Intratracheal Instillation of Platinum Nanoparticles May Induce Inflammatory Responses in Mice. Arch. Pharm. Res., 2010. 33(5): p. 727-735. Paraskar, A., et al., Rationally designed oxaliplatin-nanoparticle for enhanced antitumor efficacy. Nanotechnology, 2012. 23(7): p. 1-17. Conlin, A.K., et al., Phase II Trial of Weekly Nanoparticle Albumin-Bound Paclitaxel With Carboplatin and Trastuzumab as First-line Therapy for Women With HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer. Clin. Breast Cancer, 2010. 10(4): p. 281-287. Ho, Y.P., S.C.F. Au-Yeung, and K.K.W. To, Platinum-based anticancer agents: Innovative design strategies and biological perspectives. Med. Res. Rev., 2003. 23(5): p. 633-655. Jung, Y.W. and S.J. Lippard, Direct cellular responses to platinum-induced DNA damage. Chem. Rev., 2007. 107(5): p. 1387-1407. Hamasaki, T., et al., Kinetic analysis of superoxide anion radical-scavenging and hydroxyl radical-scavenging activities of platinum nanoparticles. Langmuir, 2008. 24(14): p. 7354-7364. Kajita, M., et al., Platinum nanoparticle is a useful scavenger of superoxide anion and hydrogen peroxide. Free Radic. Res., 2007. 41(6): p. 615-626. Zhang, L.B., et al., Reducing Stress on Cells with Apoferritin-Encapsulated Platinum Nanoparticles. Nano Letters, 2010. 10(1): p. 219-223. Fan, J., et al., Direct evidence for catalase and peroxidase activities of ferritinplatinum nanoparticles. Biomaterials, 2011. 32(6): p. 1611-1618. Takamiya, M., et al., Strong Neuroprotection with a Novel Platinum Nanoparticle against Ischemic Stroke- and Tissue Plasminogen Activator-related Brain Damages in Mice. Neuroscience, 2012. 221: p. 47-55. Takamiya, M., et al., Neurological and Pathological Improvements of Cerebral Infarction in Mice With Platinum Nanoparticles. J. Neurosci. Res., 2011. 89(7): p. 1125-1133. Onizawa, S., et al., Platinum nanoparticle antioxidants inhibit pulmonary inflammation in mice exposed to cigarette smoke. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 2009. 22(4): p. 340-349. Fenske, A.E., et al., Cisplatin resistance induced in germ cell tumour cells is due to reduced susceptibility towards cell death but not to altered DNA damage induction or repair. Cancer Letters, 2012. 324(2): p. 171-178. Asharani, P.V., et al., DNA damage and p53-mediated growth arrest in human cells treated with platinum nanoparticles. Nanomedicine, 2010. 5(1): p. 51-64. Chwalibog, A., et al., Visualization of interaction between inorganic nanoparticles and bacteria or fungi. International Journal of Nanomedicine, 2010. 5: p. 10851094. Sawosz, E., et al., Visualization of gold and platinum nanoparticles interacting with Salmonella Enteritidis and Listeria monocytogenes. Int. J. Nanomed., 2010. 5: p. 631-637. Oh, J.G. and H. Kim, Synthesis of core-shell nanoparticles with a Pt nanoparticle core and a silica shell. Curr. Appl. Phys., 2013. 13(1): p. 130-136. 108
195. 196. 197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
204.
205.
206.
207. 208.
209.
210.
211.
Barabas, R., et al., Comparative study of particle size analysis of hydroxyapatitebased nanomaterials. Chem. Pap., 2013. 67(11): p. 1414-1423. Kunjachan, S., et al., Overcoming cellular multidrug resistance using classical nanomedicine formulations. Eur. J. Pharm. Sci., 2012. 45(4): p. 421-428. Chudobova, D., et al., Effect of Ampicillin, Streptomycin, Penicillin and Tetracycline on Metal Resistant and Non-Resistant Staphylococcus aureus. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2014. 11(3): p. 3233-3255. Chudobova, D., et al., Complexes of Silver(I) Ions and Silver Phosphate Nanoparticles with Hyaluronic Acid and/or Chitosan as Promising Antimicrobial Agents for Vascular Grafts. International Journal of Molecular Sciences, 2013. 14(7): p. 13592-13614. Masarik, M., et al., Monitoring of the prostate tumour cells redox state and realtime proliferation by novel biophysical techniques and fluorescent staining. Integrative Biology, 2012. 4(6): p. 672-684. Chudobova, D., et al., Oxidative Stress in Staphylococcus aureus Treated with Silver(I) Ions Revealed by Spectrometric and Voltammetric Assays. Int. J. Electrochem. Sci., 2013. 8(4): p. 4422-4440. Parejo, L., et al., Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTAinduced luminol chemiluminescence and DPPH center dot (2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl) free radical assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000. 44(3): p. 507-512. Sochor, J., et al., Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages. Molecules, 2010. 15(12): p. 8618-8640. Pohanka, M., et al., Automated assay of the potency of natural antioxidants using pipetting robot and spectrophotometry. Journal of Applied Biomedicine, 2012. 10(3): p. 155-167. Kensova, R., et al., Lead Ions Encapsulated in Liposomes and Their Effect on Staphylococcus aureus. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2013. 10(12): p. 6687-6700. Kleckerova, A., et al., Cadmium(II) and Zinc(II) Ions Effects on Maize Plants revealed by Spectroscopy and Electrochemistry. Int. J. Electrochem. Sci., 2011. 6(12): p. 6011-6031. Skladanka, J., et al., Investigation into the Effect of Molds in Grasses on Their Content of Low Molecular Mass Thiols. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2012. 9(11): p. 3789-3805. Alanyali, F.S., et al., Investigation of Genotoxic Effects of Some Ruthenium Complexes According to Cis-platinum. Int. J. Pharmacol., 2011. 7(1): p. 96-105. Singer, V.L., T.E. Lawlor, and S. Yue, Comparison of SYBR (R) Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 1999. 439(1): p. 37-47. Bednarski, P.J., et al., Effects of light-activated diazido-Pt-IV complexes on cancer cells in vitro. Philos. Trans. R. Soc. A-Math. Phys. Eng. Sci., 2013. 371(1995): p. 1-6. Melnik, M. and P. Mikus, Structural characterization of heterometallic platinum complexes with non-transition metals. Part II: heterotrimeric complexes. Main Group Met. Chem., 2013. 36(1-2): p. 1-10. Sgarbossa, P., et al., Platinum(II) Complexes with Coordinated ElectronWithdrawing Fluoroalkyl and Fluoroaryl Ligands: Synthesis, Reactivity, and Catalytic Activity. Organometallics, 2012. 31(4): p. 1257-1270. 109
212.
213.
214.
215. 216.
217.
218. 219. 220. 221. 222.
223.
224.
225.
226.
227. 228.
229.
230.
Brabec, V. and J. Kasparkova, Modifications of DNA by platinum complexes Relation to resistance of tumors to platinum antitumor drugs. Drug Resist. Update, 2005. 8(3): p. 131-146. Theile, D., et al., Cellular Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Relationship of Platinum Cytostatics in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Evaluated by Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2012. 341(1): p. 51-58. Mitchell, C., et al., Low-dose BBR3610 toxicity in colon cancer cells is p53independent and enhanced by inhibition of epidermal growth factor receptor (ERBB1)-Phosphatidyl inositol 3 kinase signaling. Mol. Pharmacol., 2007. 72(3): p. 704-714. Summa, N., et al., Possible biotransformation reactions of polynuclear Pt(II) complexes. Inorg. Chem., 2007. 46(6): p. 2094-2104. Oehlsen, M.E., et al., Effects of geometric isomerism in dinuclear antitumor platinum complexes on their interactions with N-acetyl-L-methionine. J. Biol. Inorg. Chem., 2005. 10(5): p. 433-442. Williams, J.W., et al., Dinuclear platinum complexes with biological relevance based on the 1,2-diaminocyclohexane carrier ligand. Inorg. Chem., 2007. 46(15): p. 5820-5822. Konieczny, P., et al., Effects triggered by platinum nanoparticles on primary keratinocytes. Int. J. Nanomed., 2013. 8: p. 3963-3975. Jia, J., et al., Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nature Reviews Drug Discovery, 2009. 8(2): p. 111-128. Wahab, R., et al., Platinum Quantum Dots and Their Cytotoxic Effect Towards Myoblast Cancer Cells (C2C12). J. Biomed. Nanotechnol., 2012. 8(3): p. 424-431. Kim, W.K., et al., Platinum nanoparticles reduce ovariectomy-induced bone loss by decreasing osteoclastogenesis. Exp. Mol. Med., 2012. 44(7): p. 432-439. Yan, H.X., et al., Mechanism of the Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans by Electrolyzed Reduced Water-Participation of Pt Nanoparticles. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011. 75(7): p. 1295-1299. Rehman, M.U., et al., The anti-inflammatory effects of platinum nanoparticles on the lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 macrophages. Inflamm. Res., 2012. 61(11): p. 1177-1185. Zolotov, Y.A., et al., Determination of platinum metals by X-ray-fluorescence, atomic emission and atomic-absorption spectrometry after pre-concentration with a polymeric thioether. Analytica Chimica Acta, 1983. 148(APR): p. 135-157. Pelletier, H., et al., A structural basis for metal ion mutagenicity and nucleotide selectivity in human DNA polymerase beta. Biochemistry, 1996. 35(39): p. 1276212777. Popenoe, E.A. and M.A. Schmaeler, Interaction of human DNA polymerase β with ions of copper, lead, and cadmium. Arch. Biochem. Biophys., 1979. 196(1): p. 109120. Gao, J.H., et al., FePt@CoS2 yolk-shell nanocrystals as a potent agent to kill HeLa cells. Journal of the American Chemical Society, 2007. 129(5): p. 1428-1433. Shukla, R., et al., Biocompatibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: A microscopic overview. Langmuir, 2005. 21(23): p. 10644-10654. Fikrova, P., et al., Detection of DNA crosslinks in peripheral lymphocytes isolated from patients treated with platinum derivates using modified comet assay. Neoplasma, 2013. 60(4): p. 413-418. Brabec, V. and J. Kasparkova, Molecular aspects of resistance to antitumor platinum drugs. Drug Resistance Updates, 2002. 5(3-4): p. 147-161. 110
231.
232.
233. 234. 235. 236.
Kosmider, B., et al., Evaluation of the genotoxicity of cis-bis(3aminoflavone)dichloroplatinum(II) in comparison with cis-DDP. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 2004. 558(1-2): p. 93-110. Li, Y., et al., Genotoxicity of silver nanoparticles evaluated using the Ames test and in vitro micronucleus assay. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 2012. 745(1-2): p. 4-10. Gopal, J., et al., Bacterial toxicity/compatibility of platinum nanospheres, nanocuboids and nanoflowers. Scientific Reports, 2013. 3. Paukner, S., et al., Sealed bacterial ghosts - Novel targeting vehicles for advanced drug delivery of water-soluble substances. J. Drug Target., 2003. 11(3): p. 151-161. Mayr, U.B., et al., Bacterial ghosts as antigen delivery vehicles. Adv. Drug Deliv. Rev., 2005. 57(9): p. 1381-1391. Wang, X.Y. and Z.J. Guo, Targeting and delivery of platinum-based anticancer drugs. Chemical Society Reviews, 2013. 42(1): p. 202-224.
111
8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Různé struktury DNA, převzato z [25] a doplněno o [40, 41]. Obr. 2: Difrakční obraz DNA zaznamenaný Rosalindou Franklinovou [50]. Obr. 3: Prostorové DNA útvary (origami), sloţeny z více jak 200 krátkých oligonukleotidů. Výsledný útvar má v průměru přibliţně 100 nm, a = čtvercové plochy, b = obdélníky, c = hvězdy, d = emotikony, e a f = různé typy trojúhelníků. Převzato z [40]. Obr. 4: Schématické znázornění působení zinku na lidský organizmus. Převzato z [80] a doplněno o [81]. Obr. 5: Arsenový cyklus (vlastní návrh) doplněný o [93]. Obr. 6: CdTe-QDs v abmientním (a) a ultrafialovém (b) světle.
112
9 SEZNAM ZKRATEK ABTS
2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina)
AFM
Mikroskopie atomárních sil
AsB
arsenobetain
AsC
arsenocholin
ATR
serin/threoninová kináza
Bax
proteiny řídících apoptozu
CD
cirkulární dichroismus
Cdk2-4
cyklin dependentní kinázy
Ctr1
buněčný transportér mědi
DMA
dimethylarsenitá kyselina
DNA
deoxyribonukleová kyselina
DPPH
1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl
dsDNA dvouřetězcová deoxiribinukleová kyselina GSH
glutathion
MMA
monomethylarsenitá kyselina
MT
metalothioneinu
NK
nukleová kyselina
NMR
nukleární magnetická rezonance
p53
nádorový supresorový protein
PCR
polymerázová řetězová reakce
PML
promyelocytární leukémie
PtNPs
nanočástice platiny
QDs
kvantové tečky
RNA
ribonukleová kyselina
RNS
reaktivní formy dusíku
ROS
reaktivní formy kyslíku
SWV
elektrochemická metoda
XRF
rentgenová fluorescenční analýza
λ
vlnová délka
113
